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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA ESTUDIO DEL EFECTO DE CAPSAICINOIDES EN LA TEXTURA Y ESTRUCTURA MICROSCÓPICA DE GELES T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE QUÍMICO DE ALIMENTOS PRESENTA JULIO ADRIAN VAZQUEZ ACOSTA ASESORA: DRA. PATRICIA SEVERIANO PÉREZ MÉXICO, D.F. 2012 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 1 JURADO ASIGNADO: PRESIDENTE: Profesor: HUGO RUBEN CARREÑO ORTIZ VOCAL: Profesor: DULCE MARIA GOMEZ ANDRADE SECRETARIO: Profesor: PATRICIA SEVERIANO PEREZ 1er. SUPLENTE: Profesor: ALBERTO TECANTE CORONEL 2° SUPLENTE: Profesor: MARIANA RAMIREZ GILLY El presente estudio se llevó a cabo en el laboratorio de Evaluación Sensorial de la Facultad de Química de la UNAM Este trabajo de investigación forma parte de los proyectos PAPIME (Programa de Apoyo a Proyectos para la Innovación y Mejoramiento de la Enseñanza): Clave: PE201210 “Mejora de la enseñanza del análisis estadístico de datos provenientes de pruebas sensoriales y análisis fisicoquímico e instrumental de alimentos utilizando el software FIZZ” Y recibió apoyo del PAIP #5490-17 ASESOR DEL TEMA: _____________________________ PATRICIA SEVERIANO PEREZ SUSTENTANTE: ________________________________ JULIO ADRIAN VAZQUEZ ACOSTA 2 AGRADECIMIENTOS A mi papá, mi más grande ejemplo, que a través de los años me mostró lo que significa ser un hombre responsable y que me guió para poder ser un buen profesional, y que con grandes sacrificios forjó mi familia, el tesoro más valioso que poseo, donde él vivirá por siempre. A mi mamá que a través de los años ha sido mi más sabia consejera, y que siempre estuvo ahí para animarme cuando más lo necesité, alentándome a continuar adelante sin importar las adversidades, mostrando a la vida siempre la mejor cara. A mis hermanos, porque juntos hemos aprendido el significado de la unión, y compartieron conmigo la pasión por mi carrera, porque no solo me han ayudado a ser un mejor hermano, sino una mejor persona. A mi abuelita Ady, mi abuelita Ana y a mi tía Maty, por apoyarme con ese cariño tan especial que solo la familia puede mostrar, ayudándome a través de mi carrera profesional a que me sintiera como en casa. A la Dra. Paty Severiano, por ser siempre esa voz alentadora, que te impulsa a dar lo mejor, y que me apoyó a través de mi investigación de tesis. Al equipo de estudiantes del departamento de Evaluación Sensorial; David, Edith, Juliana, Noemí y Sonia, porque ellos están en algunos de mis mejores recuerdos de la facultad. A mis amigos Alexis, Chucho, Dennis, Mariana, Nayeli, Omar, Susana y Tania porque la vida cruzó nuestros caminos durante los días escolares, pero la amistad prevalece a través del tiempo. A mis profesores de la facultad, porque con su conocimiento y experiencia forjan día a día a los profesionales del futuro, ayudando a México a ser un mejor país. A mi equipo de trabajo del CEQAM del periodo 2009 que me enseñaron a poner en práctica mis conocimientos adquiridos. A la Dra. Araceli Patrón del laboratorio de microscopía del Instituto de Fisiología Celular de la UNAM, por el apoyo brindado a este proyecto. Al IQ. Iván Puente del laboratorio de microscopía de la USAI de la Facultad de Química de la UNAM, por el apoyo brindado a este proyecto. 1 1. ÍNDICE 2. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................... 4 3. MARCO TEÓRICO ........................................................................................... 5 3.1. Agentes gelificantes ................................................................................... 5 3.1.1. Relación de la estructura molecular con las propiedades de los hidrocoloides ..................................................................................................... 7 3.1.2. Formación del gel y sinéresis .............................................................. 9 3.1.3. Grenetina ........................................................................................... 10 3.1.4. Pectina ............................................................................................... 12 3.1.5. Carragenina ....................................................................................... 17 3.1.6. Agar ................................................................................................... 21 3.3. Capsaicinoides ......................................................................................... 22 3.4. Textura ..................................................................................................... 23 3.4.1. Análisis del perfil de textura sensorial ................................................ 24 3.4.2. Perfil de textura instrumental ............................................................. 27 3.3. Correlaciones entre evaluaciones sensoriales e instrumentales .............. 30 3.4. Microscopía electrónica en alimentos ...................................................... 32 3.4.1. Técnicas adecuadas para estudios de microestructura ..................... 32 3.4.2. Microscopía Electrónica de Barrido ................................................... 34 3.5. Análisis de Componentes Principales (PCA) ........................................... 36 4. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................... 38 4.1. Materiales ................................................................................................. 38 4.2. Elaboración de los geles .......................................................................... 38 4.3. Evaluación instrumental de la textura....................................................... 46 4.3.1. Preparación de las muestras ............................................................. 47 4.4. Medición del pH de los geles ................................................................... 47 4.5. Evaluación de la microestructura de los geles ......................................... 47 4.6. Análisis estadístico de los datos .............................................................. 49 5. RESULTADOS ............................................................................................... 50 5.1. Comparación por atributos ....................................................................... 50 5.1.1. Formulaciones con alto contenido de azúcares (61%) ...................... 50 2 5.1.2. Formulaciones con bajo contenido de azúcar (6%) ........................... 57 5.2. Evaluación del pH .................................................................................... 64 5.3. Análisis de componentes principales (PCA) ............................................. 66 5.3.1. PCA Textura ...................................................................................... 66 5.3.2. PCA Textura-PH ................................................................................ 70 5.3.3. PCA Sensorial-Instrumental .............................................................. 72 5.4. Evaluación microscópica de la estructura de los geles ............................74 6. ANÁLISIS DE RESULTADOS ........................................................................ 75 6.1. Efecto de los capsaicinoides sobre la textura y la microestructura de las diferentes formulaciones .................................................................................... 75 6.1.1. Formulación 1. Carragenina 0.8% ..................................................... 75 6.1.2. Formulación 3. Grenetina 1.8% ......................................................... 86 6.1.3. Formulación 4. Grenetina 1.5%, pectina 1.5% .................................. 90 6.1.4. Formulación 5. Grenetina 5% ............................................................ 97 6.1.5. Formulación 6. Grenetina 9% ............................................................ 99 6.1.6. Formulación 7. Grenetina 12% ........................................................ 101 6.1.7. Formulación 8. Grenetina 5%, agar 0.4% ........................................ 103 6.2. Comparación general de los perfiles de textura ..................................... 105 6.3. Efecto del pH sobre la textura ................................................................ 107 6.4. Correlación entre evaluaciones sensorial e instrumental ....................... 108 7. CONCLUSIONES. ......................................................................................... 110 8. RECOMENDACIONES ................................................................................. 111 9. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................. 112 10. ANEXOS ................................................................................................... 120 10.1. Anexo 1. Análisis estadístico de los datos .......................................... 120 10.2. Anexo 2. Análisis de Componentes Principales .................................. 124 10.3. Anexo 3. Imágenes de microscopía electrónica de barrido (MEB) ..... 129 10.3.1. F1 Sin capsaicinoides ...................................................................... 129 10.3.2. F1 0.56 ppm Capsaicina .................................................................. 130 10.3.3. F1 1.12 ppm Capsaicina .................................................................. 130 10.3.4. F1 2.80 ppm Capsaicina .................................................................. 131 3 10.3.5. F1 0.56 ppm Dihidrocapsaicina ....................................................... 132 10.3.6. F1 1.12 ppm Dihidrocapsaicina ....................................................... 132 10.3.7. F1 2.80 ppm Dihidrocapsaicina ....................................................... 133 10.3.8. F3 sin capsaicinoides ...................................................................... 134 10.3.9. F3 0.56 ppm Capsaicina .................................................................. 134 10.3.10. F3 1.12 ppm Capsaicina ............................................................... 135 10.3.11. F3 2.80 ppm Capsaicina ............................................................... 136 10.3.12. F3 0.56 ppm Dihidrocapsaicina .................................................... 136 10.3.13. F3 1.12 ppm Dihidrocapsaicina .................................................... 137 10.3.14. F3 2.80 ppm Dihidrocapsaicina .................................................... 138 10.3.15. F4 sin capsaicinoides ................................................................... 138 10.3.16. F4 0.56 ppm Capsaicina ............................................................... 139 10.3.17. F4 1.12 ppm Capsaicina ............................................................... 140 10.3.18. F4 2.80 ppm Capsaicina ............................................................... 140 10.3.19. F4 0.56 ppm Dihidrocapsaicina .................................................... 141 10.3.20. F4 1.12 ppm Dihidrocapsaicina .................................................... 142 10.3.21. F4 2.80 ppm Dihidrocapsaicina .................................................... 142 4 2. JUSTIFICACIÓN En la cultura mexicana el chile es un elemento importante en los alimentos, esto se puede observar en una gran cantidad de platillos típicos de cada una de las diferentes regiones del país. Conforme han pasado los años y los alimentos han evolucionado, el uso del chile también lo ha hecho, y en la actualidad podemos encontrarlo en una gran cantidad de productos industrializados, platillos fuertes hasta confitería dulce y salada. En la confitería dulce con chile se pueden encontrar “gomitas”, que son productos hechos con algún hidrocoloide, generalmente grenetina, que les da una textura especial. Las gomitas que contienen chile en su formulación están espolvoreadas en su superficie con algún tipo de este, y se pueden encontrar incluso con diferentes formas y sabores dependiendo de la marca y el público al que están dirigidas. Estos productos tienen una gran aceptación por los consumidores, sin embargo, se ha observado que en las “gomitas” con chile frecuentemente se desestabiliza el gel presentando sinéresis. Anteriormente Jardón en 2006 comprobó que esta desestabilización se debe a la capsaicina que está presente naturalmente en la mayoría de los chiles, y realizó una evaluación sensorial del efecto de este compuesto en geles tipo gomitas; sin embargo, traducir la sensación de textura en propiedades estructurales que puedan ser medidas con instrumentos puede proveer información vital sobre la percepción de la textura (Langton 1996), por lo que en el presente trabajo se buscó evaluar instrumentalmente el efecto de la capsaicina por medio de un texturómetro para así poder correlacionar los datos instrumentales y sensoriales. Para complementar este estudio se evaluó también la estructura microscópica de los geles, ya que el entendimiento de la relación entre la percepción de la textura y la estructura de los alimentos es una necesidad que aumenta para las compañías que desean producir alimentos texturalmente atractivos (Wilkinson et al, 2000). 5 Este estudio es importante debido a que en México la industria de confitería tiene una gran importancia económica; tan solo en el primer semestre de 2009 la producción de dulces, chicles y productos de confitería que no sean chocolate tuvo un valor mensual promedio de $1, 634, 224 (INEGI 2010), y en este rubro están incluidas las ya mencionadas “gomitas” en cuya formulación está incluido el chile. 3. MARCO TEÓRICO 3.1. Agentes gelificantes Los hidrocoloides son en su mayoría polisacáridos de alto peso molecular que al ser disueltos en agua, generan propiedades coloidales, como pueden ser la viscosidad o la gelificación. También pueden generar propiedades funcionales secundarias, dentro de estas se encuentra la emulsificación, la suspensión de partículas, la estabilización de emulsiones, formación de películas, etc. La grenetina, a pesar de ser una proteína y no un carbohidrato, también puede presentar algunas de estas propiedades. Las gomas, o hidrocoloides se pueden clasificar como se muestra en la siguiente tabla. Tabla 3.1. Clasificación de los hidrocoloides Naturales Exudados de árboles Goma acacia o arábiga Goma Tragacanto Goma Karaya Goma Ghatti Semillas y raíces Goma Guar Goma de Algarrobo Goma Tara 6 Konjac Goma de Tamarindo Psylumm Plantagum Extractos de algas Algas rojas Agar agar Carragenina Algas cafes Alginatos Otras fuentes naturales Pectina Grenetina Almidón Semisintéticos Gomas de fermentación microbiana Goma Xanthano Goma Gellan Goma Dextrano Derivados de celulosa Carboximetilcelulosa Metilcelulosa Celulosa microcristalina Derivados de almidones Carboximetilalmidon Hidroxietilalmidon Hidroxipropilalmidon Otras Pectina bajo metoxilo Alginato de Propilenglicol Alginatode trietanolamina Carboximetilguar Carboximetilalgarrobo Sintéticos Polímeros vinílicos Polímeros acrílicos 7 3.1.1. Relación de la estructura molecular con las propiedades de los hidrocoloides Es importante estudiar el comportamiento a nivel molecular de los hidrocoloides para así poder comprender e interpretar los resultados que se obtengan a través de la microscopía electrónica, con la que se busca observar las cadenas de los geles, y las diferencias en los comportamientos de estos al agregar diferentes concentraciones de capsaicinoides. Las gomas generalmente están formadas por cadenas lineales o ramificadas compuestas por unidades de azúcares. Las cadenas lineales pueden tener desde varios cientos hasta varios miles de unidades glicosílicas. Si todas las unidades son de un mismo tipo de azúcar, son homogéneas en cuanto a unidades de monómero y se llaman homoglicanos. Ejemplos de homoglicanos son la celulosa, la amilosa y la amilopectina del almidón. Algunas gomas de polisacáridos (glicanos) están ligeramente ramificadas, pero a menudo con una unidad constituyendo la rama (cadena lateral) así como en la goma guar y la goma de algarrobo. Mientras que los polisacáridos lineales son los más abundantes en el mundo debido a la enorme cantidad de celulosa existente como el principal elemento estructural de la pared celular de los vegetales, los polisacáridos ramificados se presentan en una variedad inmensa de formas de ramificación y con gran variedad de unidades glicosílicas en sus estructuras. Es importante reconocer que un glicano lineal producirá soluciones mucho más viscosas que un glicano ramificado con el mismo número de unidades, especialmente que uno con forma de arbusto. Esto es debido a que un glicano ramificado ocupará un menor volumen en el espacio, y por lo tanto la interacción que tendrá en el medio en el que se encuentre será menor que un glicano cuyas cadenas están extendidas y tiene más posibilidades de interactuar con el medio que lo rodea. Un glicano lineal puede visualizarse como un collar de hojas abierto que tiende a girar en sus enlaces manteniéndolos unidos pero a la vez tienden a mantener un arreglo paralelo, plano, más o menos fijo con las demás como resultado de los 8 puentes de hidrógeno que se extienden desde el anillo glicosílico hasta su vecino en la cadena hasta que esta tiene una estructura semejante a una cinta. De esto se puede prever que cuando los segmentos planos de dos moléculas tipo cinta chocan en una solución, se pueden formar fácilmente puentes de hidrógeno secundarios entre los segmentos de la cinta para mantenerlas unidas hasta que más movimientos moleculares traen cadenas adyacentes a las dos moléculas en una superposición de manera paralela. Todos los homoglicanos lineales tienen una tendencia inherente a asociarse para producir una cristalización de las cadenas largas y abultadas. Cuando las moléculas lineales se juntan para formar una asociación de segmentos, la gran longitud de las moléculas y sus enrollamientos inherentes, enrollamientos y tal vez enredos, no permiten que todas las moléculas se unan en asociaciones perfectamente regulares pero permite que algunos segmentos aquí y allá se combinen con segmentos de diferentes moléculas, dejando una gran proporción en una condición amorfa aleatoria. Las regiones en las que las moléculas se ajustan y se asocian se llaman zonas de unión. Mientras más grandes sean las zonas de unión, la asociación intermolecular será más estable. Algunas veces las zonas de unión se forman por el enrollamiento de dos moléculas para formar una doble hélice. Si las cadenas están ionizadas como en las moléculas lineares de pectato de sodio y el alginato de sodio, las moléculas no se van a asociar debido a las cargas negativas en sus aniones carboxílicos. Las repulsiones entre las cargas iguales también causan que las cadenas estén completamente extendidas, produciendo soluciones altamente viscosas, y los segmentos moleculares cargados se repelen cuando se encuentran en una ruta de colisión, resultando así soluciones estables. Pero si el pH de la solución es disminuido a pH 3 donde la ionización del ácido carboxílico es en gran medida disminuida, las moléculas aniónicas se convierten básicamente en moléculas neutras que se asociarán y formarán un gel o precipitarán en la solución. La carragenina es una mezcla de cadenas lineales que tienen cargas negativas como el resultado de numerosos grupos sulfato, unidos 9 como mitades de esferas a lo largo de las cadenas. Naturalmente estos glicanos no precipitarán de la solución a menores pHs debido a la porción aniónica del grupo sulfato que se ionizarán a cualquier valor de pH (Dea, 1993). 3.1.2. Formación del gel y sinéresis Cuando segmentos de moléculas lineales en una solución chocan, forman una asociación a lo largo de varias unidades de las cadenas. Esta zona de unión formada tiene una estabilidad que depende principalmente de su longitud, que es el número de enlaces intermoleculares que se formaron. Estos enlaces son de varios tipos, pero los puentes de hidrógeno contribuyen a las mayores fuerzas asociativas. Cuando dos cadenas forman una zona de unión en un punto a lo largo de sus cadenas, otro quizá distante de cada cadena puede llegar a chocar y formar una zona de unión con otras moléculas. Este proceso de formación de zonas de unión al azar entre moléculas diferentes puede continuar hasta que muchas, sino es que la mayoría, de las moléculas del polisacárido se ven envueltas en una gran red tridimensional que puede llenar el contenedor completo. El gel tendrá una fuerza dependiente de la fuerza de los enlaces intermoleculares en las zonas de unión. Si los enlaces son débiles, entonces podrán romperse y toda la estructura del gel se quebrará con una leve agitación. En este caso, al gel débil se le llama tixotrópico. Las fuerzas de la agitación proveerán de suficiente energía para romper muchas, o la mayoría, de las zonas de unión y la viscosidad de la dispersión disminuye. Cuando la agitación se detiene, las moléculas pueden de nuevo chocar en al traslado normal, o movimientos brownianos, y las zonas de unión se restablecerán. Cuando las zonas de unión son de una fuerza mayor, se forma un gel más identificable que puede no ser roto tan fácilmente por agitación, y puede ser suficientemente fuerte, que con el esfuerzo mecánico el gel se separará o se partirá como se observa con los geles de grenetina. Este tipo de gel se puede volver líquido si las energías de las zonas de unión son suficientemente bajas que 10 un calentamiento simple pueda energizar las moléculas lo suficiente para causar que se separen entre ellas. Una vez que el gel se ha formado puede someterse a prolongación de sus zonas de unión al deslizarse sus moléculas sobre ellas o simplemente moviéndose juntas hacia los extremos de las zonas de unión para incrementar la longitud de la zona. Esto causará un endurecimiento de la estructura general de la red y una disminución en los espacios llenos de agua entre las moléculas. Por lo tanto, el agua es exudada del gel y se produce sinéresis, como se puede observar comúnmente (Whistler, 1993). 3.1.3. Grenetina La grenetina es una proteína natural pura que se obtiene de los tejidos de los animales ricos en colágeno, como la piel, tendones y hueso, mediante una hidrolisis controlada del colágeno. Sus funciones más comunes son las que se mencionan a continuación: gelificante, espesante, formación de espuma, estabilizante, clarificante y aglutinante de agua. La estructura general de la grenetina se observa en la figura 3.1 Figura 3.1. Estructura general de la grenetina La grenetina se puede obtener mediante dos procesos diferentes, ya sea por hidrólisis ácida, o por hidrólisis básica, dependiendo de la fuente de la quese obtiene la materia prima. Si se obtiene del cerdo entonces se realiza una hidrólisis 11 ácida en la que la grenetina resultante tendrá un punto isoeléctrico de 9. En cambio si la materia prima de la que se parte proviene de reses entonces se deberá realizar una hidrólisis alcalina, en la que la grenetina resultante tendrá un punto isoeléctrico de 5; sin embargo en México solo se produce grenetina a partir del cerdo. Después de la hidrólisis, para la obtención de la grenetina son necesarios un lavado, que permite obtener un pH adecuado para el siguiente paso que es la extracción, que se lleva a cabo en agua caliente y tiene el fin de romper los enlaces de hidrógeno que están sosteniendo débilmente las cadenas en la configuración de triple hélice. Posteriormente se procede con una filtración en la que se retira materia suspendida insoluble y restos de grasa. Luego se procede con un intercambio iónico para retirar las sales orgánicas que pudieran estar presentes. A continuación siguen los pasos de concentración, gelificación y secado y un molido y mezclado en el que se pretende estandarizar los lotes de grenetina. La grenetina tiene la capacidad de humectarse con agua y absorber de 5 a 10 veces su peso. Los geles de grenetina se derriten a 27-34 °C. La fuerza de los geles se determina mediante los °Bloom que son la fuerza que se requiere aplicar a la superficie de un gel por medio de un pistón de 12.7 mm de diámetro para producir una depresión de 4 mm en un frasco estandarizado a una concentración de 6.67 % del agente gelificante y madurado a 10°C por 16-18 horas. Los grados Bloom generalmente se clasifican como alto que van de 250 a 300, medio que va de 150 a 200 y bajo, que va de 50 a 100; mientras más grados Bloom tenga una grenetina, mayor será su fuerza de gel. Las hebras moleculares flexibles situadas entre los entrecruzamientos de las cadenas peptídicas de la grenetina son largas, convirtiendo los geles hechos con este material en geles muy extensibles. Son predominantemente elásticos, porque los entrecruzamientos son bastante estables (al menos a bajas temperaturas). A pesar de que durante la obtención de la grenetina se ha sometido al colágeno a un tratamiento intenso, las moléculas siguen siendo largas y dan disoluciones muy viscosas. Al enfriarse, las moléculas tienden a formar triples hélices (hélices de 12 prolina), como ocurre en el colágeno, pero sólo a lo largo de una parte de la molécula; las regiones helicoidales son relativamente cortas. Probablemente las moléculas de grenetina se doblen formando un ángulo agudo, en los llamados giros beta y se formen así dobles hélices cortas. Posteriormente en tormo a esta doble hélice se pueda enrollar una tercera cadena que complete la triple hélice. Si esta tercera hebra de la triple hélice es parte de otra molécula distinta, se habrá formado un entrecruzamiento. Independientemente de cómo se desarrollen, las triples hélices tienden a agruparse alineándose en paralelo y formando regiones microcristalinas, entre las que se establecen entrecruzamientos. Como era esperable de ese mecanismo, la cinética de gelificación es compleja. Las propiedades reológicas también son muy dependientes del historial térmico (Fennema, 1993). Figura 3.2. Estructura molecular de los geles de grenetina 3.1.4. Pectina La pectina es un polisacárido estructural que se encuentra presente en todas las plantas superiores. Por esto es parte de la dieta natural de los humanos. Las preparaciones comerciales de la pectina usualmente se derivan de la cáscara de cítricos y de manzana, subproductos de la manufactura de jugos. Su producción implica extracción acuosa bajo condiciones de acidez leve, seguida por la precipitación por medio de la adición de alcohol o iones metálicos di o trivalentes. 13 La mayor parte de la producción de pectina a nivel mundial se emplea para la preparación de jaleas y mermeladas, pero una parte que está incrementando se utiliza en productos de confitería, bebidas, y bebidas de leche acidificadas. La pectina es muy adecuada para aplicaciones en productos alimenticios ácidos debido a su buena estabilidad en valores bajos de pH. La pectina es un polisacárido heterogéneo complejo. Su composición varía con la fuente de la que se obtiene y las condiciones aplicadas durante su aislamiento. En cualquier muestra de pectina, los parámetros como el peso molecular o el contenido particular de subunidades serán diferentes de molécula a molécula. Las cadenas de pectina están formadas por segmentos lineales ácido D-galacturónico con algunos de los grupos carboxilo esterificados con un grupo metilo. En las pectinas de algunas fuentes, los grupos hidroxilo las unidades de ácido galacturónico están esterificadas con ácido acético. En la figura 3.3 se muestra la representación de una cadena de pectina. Figura 3.3. Sección de una molécula de pectina con grupos carboxilo metil esterificados y sin esterificar. El grupo O-2 acetilo en la flecha es raro o está ausente en las pectinas comerciales El peso promedio para una molécula típica de una muestra comercial de pectina es del orden de 100,000 daltons, pero pueden existir grandes diferencias entre las muestras y entre las moléculas de una misma muestra, y las estimaciones pueden variar dependiendo de los métodos con los que se midan. Las pectinas se subdividen dependiendo de su grado de esterificación (DE), por ejemplo, el porcentaje de grupos carboxilo que están esterificados con grupos 14 metilo. Las pectinas con un DE> 50 son llamadas pectinas de alto metoxilo (HM), mientras que aquellas con un DE<50 son pectinas de bajo metoxilo (LM). Es importante notar que las pectinas pueden gelificar por dos mecanismos diferentes. Uno de estos mecanismos es característico de las pectinas de alto metoxilo y requiere una concentración relativamente alta de solidos solubles y un pH bajo. El otro es característico de las pectinas de bajo metoxilo y requiere solamente de la presencia de cationes divalentes (Rolin, 1993). Para participar en la formación del gel, un módulo de pectina debe, en una o más áreas locales a lo largo de su estructura lineal, juntarse con una o más moléculas de pectina. Estas zonas de unión debes ser de tamaño limitado debido a que las moléculas de otra manera formarían un precipitado en vez de un gel. Los grupos -L-rhamnopiranosil 2-O- sustituidos que están presentes en la columna vertebral galacturónica doblan la cadena galacturónica y probablemente limiten el tamaño de las zonas de un ión. Estudios pioneros de difracción de rayos x llevados a cabo en 1945 por Palmer y Hartzog demostraron que el pectato de sodio forma hélices. Los estudios de difracción de rayos x de Walkinshaw y Arnott (1981) de pectatos de sodio, ácido péctico y ácido pectínico indicaron que la misma estructura helicoidal está presente en todos, pero las maneras en las que las hélices se acomodan con respecto a las demás en los cristales son diferentes. Ellos sugirieron que las moléculas helicoidales del ácido pectínico se empaquetan en un arreglo paralelo mientras que los pectatos se empaquetan como hojas corrugadas de hélices antiparalelas. Estos modelos para el empaquetamiento de las moléculas del ácido pectínico y el pectato de sodio sólidos también sirven como modelos para las zonas de unión en los geles de ácido pectínico (pectina HM, azúcar) y el pectato de calcio (pectina LM). El empaquetamiento del ácido pectínico incluye columnas de apilamiento de grupos éster metílico que forman áreas hidrofóbicas cilíndricas paralelas el eje de las hélices como se muestra en la figura. De esta manera el área de contacto 15 entre los grupos hidrofóbicos del éster metílico y el agua es minimizada. Es decir, la agregación de las cadenas es estabilizada por enlaces hidrofóbicos. Laestructura también se puede estabilizar por puentes de hidrógeno en las áreas que no están ocupadas por los cilindros hidrofóbicos. Posteriormente Oakenfull y Scott (1985) brindaron más evidencia que sugiere la combinación de puentes de hidrógeno y los efectos hidrofóbicos en la gelificación de las pectinas HM. Figura 3.4. Modelo de las zonas de unión en un gel de pectina con alta concentración de sólidos, vista a lo largo de los ejes de las hélices. Los círculos rellenos representan las regiones hidrofóbicas formadas por el apilamiento de los grupos éster metílico. Estos grupos éster metílico sobresalen de las hélices como esquinas en un triángulo equilátero. Las líneas punteadas representan los puentes de hidrógeno. 16 Figura 3.5. Modelo de una zona de unión de un pectato de calcio vista a lo largo del eje de las hélices. Los círculos sombreados representan las hélices. Los círculos sombreados verticalmente son antiparalelos a las hélices sombreadas horizontalmente. Los círculos rellenados pequeños representan iones Ca++ coordinados con tres átomos de oxígeno de una cadena y dos átomos de oxígeno en una cadena adyacente antiparalelas. Las posiciones restantes en la capa de coordinación del Ca++ son ocupados por moléculas de agua. 17 3.1.5. Carragenina El uso de la carragenina de las algas probablemente se remonte varios cientos de años y probablemente se originó en Irlanda, donde las especies de algas Chondrus crispus se utilizaba como un espesante para alimentos y se le nombraba como Musgo Irlandés. Durante el siglo XIX el musgo irlandés se extendió en el mercado para la clarificación industrial de cerveza y la industria textil. A principios del siglo XX se industrializó la producción en Inglaterra y el comercio del extracto refinado en lugar del alga completa como se había comercializado antes ganó importancia. Sin embargo no fue sino hasta la segunda Guerra Mundial cuando se dio un auge real a causa de las dificultades para comercializar el agar. La carragenina no está compuesta por un solo polisacárido sino por un conjunto de galactanos sulfatados extraídos de algunas especies de algas rojas (Rhodophyceae). Las carrageninas constituyen los principales polisacáridos estructurales de algunas algas marinas. El contenido de carragenina de las algas marinas comerciales es normalmente del 30-60% de su peso seco, sin embargo puede llegar a ser de hasta 70-80%. La manufactura de la carragenina consiste de la extracción, purificación, concentración, precipitación y secado. La extracción generalmente se lleva a cabo con una solución altamente alcalina a una temperatura cercana a su punto de ebullición por 10-30 hr. Para la purificación se separan los residuos de alga marina de la solución por medio de filtración o centrifugación y la solución resultante se puede concentrar por medio de evaporadores con vacío para obtener una concentración final de carragenina de entre 2-3%. Para precipitar la carragenina se adiciona alcohol, normalmente 2-propanol, obteniendo así un coagulo fibroso de carragenina que se separa y presiona para remover la humedad residual. La carragenina contiene en su estructura entre 15-40% de grupos éster sulfato y contiene alternativamente enlaces glicosídicos (1→ 3)--D y (1→ 4)--D. 18 La carragenina natural es una mezcla de polisacáridos no homólogos, por lo que cuando se aplica el término unidad de repetición para carrageninas, se refiere a la unidad de disacárido principal que aparece dentro de la estructura. Las unidades de repetición que se muestran en la siguiente figura son las que se han encontrado que prevalecen en las carrageninas, dando lugar a tres fracciones mayoritarias, (kappa), (iota) y (lambda). También se pueden encontrar cuatro fracciones mayores, (mu), (nu), (teta) y (xi). Figura 3.6. Estructuras de las unidades de repetición básicas de la carragenina. Por conveniencia la unidad con el enlace -D-(1-3) (a la derecha en el dibujo) es designada como A y la unidad con el enlace -D-(1-4) (a la izquierda) es designada como B. Esta estructura medular de unidades alternadas parece existir 19 en todas las carrageninas, mientras que la sulfatación puede variar en cantidad y posición. Las unidades de repetición a la izquierda de la flecha en la figura son consideradas como precursoras de las unidades de repetición de la derecha. Las carrageninas e poseen la capacidad de gelificar lo que las convierte en los dos tipos de carragenina con una mayor importancia comercial. La capacidad de estas carrageninas para formar un gel es conferida por la unidad 3,6-anhidro-D- galactopiranosil (3,6-AG) de la unidad B que le da regularidad a la molécula y permite que se forme una estructura terciaria helicoidal. La presencia de unidades de disacáridos sin el anillo 3,6-anhidro en las carrageninas e hace que se presenten pliegues en una hélice que de otra manera sería totalmente regular. Solo los anillos 3,6-anhidro-D-galactopiranosil tienen la habilidad de participar en la formación de estructuras helicoidales y por lo tanto formar un gel. Una falta de homogeneidad adicional puede ser impartida a las cadenas moleculares por la ocurrencia de unidades A sin el grupo 6-0-sulfato y los anillos 3,6-anhidro. Estas irregularidades, así como las estructuras precursoras, impedirán la formación de hélices y por lo tanto la formación del gel. Como la única diferencia entre las estructuras de la carragenina ees el grupo 2-O-sulfato en la unidad A, los dos tipos tienen diferentes contenidos de sulfato, por lo que la carragenina contiene entre 25-30% de sulfato (idealmente 23%) y la carragenina contiene 28-35% de sulfato (idealmente 37%). Los datos obtenidos por difracción de rayos X para la carragenina e son consistentes para ambas estructuras, observándose que forman hélices de tres pliegues con giro hacia la derecha. La construcción de modelos para la doble hélice de la carragenina sugiere que las hebras entrelazadas de las hélices se mantienen juntas por puentes de hidrógeno entre el O-2 y el O-6 de las respectivas unidades B adyacentes. Un patrón similar se indica para la doble hélice de la carragenina . Los grupos sulfato se localizan en la parte exterior de la doble hélice. 20 Cada una de las carrageninas debe tener asociada a ella contra iones cargados positivamente. Los cationes que proveen las cargas de apantallamiento de los grupos sulfato tienen habilidades muy diferentes para estabilizar la doble hélice. Los iones potasio tienen propiedades excelentes para estabilizar la doble hélice, mientras que los iones Na+, y más aún el Li+ inhiben la formación de la hélice. El papel que juegan los cationes en la gelificación de la carragenina se cree que es la construcción de puentes electrostáticos en una manera ordenada entre los dímeros cargados negativamente de las dobles hélices lo que tiene como causa su agregación. La fuerza de los agregados helicoidales o zonas de unión, está directamente relacionada con la fuerza del gel macroscópico y está determinada por la longitud más que por el número de zonas de unión. También las conexiones entre las uniones ejercen una influencia en la fuerza del gel. Un tratamiento extendido de tiempo/temperatura efectúa una ruptura gradual de las cadenas moleculares. La depolimerización es grandemente acelerada por un pH bajo en presencia de oxígeno disuelto. La carragenina puede formar geles cohesivos a concentraciones del polímero de 0.5% en sistemas acuosos y 0.1-0.2% en sistemas biocoloidales así como la leche. La fuerza de los geles de carragenina es dependiente en gran medida de su concentración y el tipo y concentración de cationes monovalentes. De todas las carrageninas, la carragenina genera los geles más fuertes. Estos son, sin embargo, susceptiblesa la sinéresis debida a la agregación de la red del polímero. La sinéresis puede volverse particularmente significativa con bajos niveles de polímero o altos niveles de cationes gelificantes, o ambos, y cuando la carragenina es muy pura. La sinéresis se puede contrarrestar con la influencia de retención de agua y modificación de la textura de sustancias añadidas, incluyendo otras gomas. Postres gelificados a base de agua generalmente tienen un pH de alrededor de 3.8 por cuestiones de sabor, ya que generalmente se incorporan constituyentes de 21 frutas o sabores frutales. Como la carragenina es poco estable a pH bajo, es importante que su tiempo de residencia en la solución de bajo pH sea minimizado. Usualmente esto se logra añadiendo el ácido justo antes de un rápido enfriamiento, llenado y gelificación (Therkelsen, 1993). 3.1.6. Agar De acuerdo con la Farmacopea de los Estados Unidos, el agar es un coloide hidrofílico extraído de ciertas algas marinas de la clase Rhodophyceae. El agar es insoluble en agua fía, pero soluble en agua hirviendo. Una solución al 1.5% es clara y cuando se enfría a 32-39 °C forma un gel firme que no se funde sino hasta los 85 °C. El agar se obtiene de varios géneros y especies de las algas marinas rojo-violetas de la clase Rhodophyceae, donde se encuentra presente como un carbohidrato estructural en las paredes celulares y probablemente también efectúa una función en el intercambio iónico y el proceso de diálisis. La mayor parte del agar comercial es producido por extracción con agua caliente, seguida de una congelación para su purificación. En Estados Unidos se emplea la siguiente secuencia de operaciones 1) Limpieza de la materia prima, 2) pre tratamiento químico, 3) extracción con presión, 4) post tratamiento químico, 5) filtración, 6) gelificación 7) congelación, 8) post tratamiento, 9) lavado, 10) secado, 11) esterilización, 12) blanqueamiento 13) lavado 14) secado. Los trabajos que se han hecho con respecto a la estructura del agar han mostrado que contiene dos componentes, uno formado por un gel fuerte llamado agarosa y una fracción que no gelifica llamada agaropectina. En la manufactura del agar, el componente que forma geles, la agarosa, es parcialmente liberada de la agaropectina por congelación y descongelación en donde se permite que los polisacáridos más solubles, más sulfatados, se drenen o se laven (Selby, 1993). 22 3.3. Capsaicinoides La pungencia de los alimentos se define como la intensidad total y la duración en la garganta y en la boca (lengua, paladar y la mucosa de las mejillas) percibida durante y después de la ingestión (Reinbach et al. 2007). La pungencia es evocada por la presencia de irritantes que inducen esta sensación, como la capsaicina (en los chiles), piperina (en la pimienta negra) o el aldehído cinámico (en la canela). Aunque todos ellos inducen una sensación de quemadura (pungencia), cada uno tiene diferentes características cualitativas y temporales de esta sensación (Cliff & Heyman, 1992, 1993). La sensación de pungencia o la pungencia de los chiles (capsicum spp.) es un efecto sensorial producido por moléculas naturales conocidas como capsaicinoides. Entre estos compuestos pungentes naturales, la capsaicina E-N- (4-hidroxi-3-metoxibencil)-8-metil-6-nonenamida es conocida como una de las moléculas más pungentes. Sin embargo, algunas de sus estructuras análogas más parecidas, dihidrocapsaicina (6,7-dihidro derivado de la capsaicina) y nordihidrocapsaicina (7-metil-N-vainillil-octamida) exhiben sensaciones pungentes similares (Castillo, 2007). La estructura molecular de la capsaicina y la dihidrocapsaicina se muestra en la figura 3.10 Figura 3.7. Estructura molecular de la capsaicina (izquierda) y de la dihidrocapsaicina (derecha) Además de la pungencia, se han reportado una gran variedad de actividades fisiológicas y biológicas de los capsaicinoides; Estas incluyen la estimulación de los sistemas cardiovascular y respiratorio (Govindarajan & Sathyanarayana, 1991), aplicación como analgésico, antinocioceptivo y antiinflamatorio (Sancho et el, 2002), y su uso como droga neurótica o potenciadores de la secreción de catecolamina adrenal (Kobata, Toyoshima, Kawamura & Watanabe, 1998). 23 3.4. Textura La textura es la manifestación sensorial y funcional de las propiedades estructurales, mecánicas y de superficie de los alimentos, detectada a través de los sentidos de la vista, oído, tacto y kinestésico (Szczesniak 2002). La definición de la textura de los alimentos puede llegar a ser hasta cierto punto ambigua, y no totalmente satisfactoria, sin embargo, se puede decir que la textura posee ciertas características: Se trata de un grupo de propiedades físicas que derivan de la estructura del alimento; Están relacionadas con la mecánica y la reología; No se trata de una propiedad sino de un conjunto de propiedades; No está directamente relacionada con el olor o el gusto. Los cambios en la textura hacen que la precepción de sabor y la apariencia de un alimento puedan ser diferentes. Generalmente cuando se cambia la intensidad de un parámetro de textura habrá algunos otros parámetros texturales que también cambien, por lo que no se puede hacer dicho cambio sin evitar que esto altere otras características del producto y la percepción del sabor (Szczesniak, 1990). La textura también es ampliamente reconocida como un atributo de calidad importante para la aceptación del producto afectando la percepción del consumidor. 24 3.4.1. Análisis del perfil de textura sensorial La evaluación del perfil de textura, es un método descriptivo, donde su meta específica es la de mejorar la interpretación de la relación entre los principios reológicos y la nomenclatura popular utilizada para describir las características texturales. Este método fue desarrollado por la “General Foods Corporation” en los años 60’s, donde la textura empezó a ser estudiada como un atributo importante de la calidad de los alimentos. Para elaborar un perfil sensorial es necesario llevar a cabo un proceso de varias etapas que se mencionan en el siguiente diagrama. Figura 3.8. Etapas para la elaboración de un perfil sensorial La elaboración de un perfil sensorial de un alimento puede tener varias aplicaciones: Definición de un estándar de fabricación que puede ser utilizado como especificación de calidad de un producto. El desarrollo de un perfil sensorial puede servir para desarrollar un producto con características deseadas. Para mejorar uno ya existente, que a su vez puede ser comparado con otros productos del mismo tipo. 1. • Formación de un panel de jueces 2. • Elaboración de una lista de términos descriptivos 3 • Reducción de la lista de términos 4. • Elección de los productos de referencia 5. • Entrenamiento 6. • Elaboración y utilización del perfil sensorial y seguimiento del panel 25 Es importante tener en consideración que pueden haber varios factores que llegan a afectar el perfil de un producto. Estos factores también se pueden encontrar y evaluar mediante el desarrollo del perfil sensorial. Debido al reconocimiento de la naturaleza multidimensional de la textura desde el inicio de su estudio se desarrolló una clasificación genérica de las características texturales, las cuales se dividieron en tres grupos (Szczeniak, 1963): Figura 3.9. Clasificación de las características texturales Con la anterior clasificación se desarrolló un vocabulario de textura basado en las propiedades físicas de los alimentos, en un intento de brindar una terminología técnica y común. Esto fue después desarrollado por Brandt, et al. (1963) y Szczesniak et al. (1975) para formar así el Análisis de Perfil de Textura (TPA). En este método un grupo de atributos relacionados de forma y fuerza, sonusados por un grupo de panelistas para evaluar los parámetros texturales de los alimentos. Las escalas utilizadas están relacionadas a productos estándar. Una definición del perfil de textura es dada por Brandt et al. (1963) y dice que es: “el análisis sensorial de la textura de un alimento en términos de sus características mecánicas, geométricas, contenido de grasa y humedad, el grado C ar ac te rí st ic as t ex tu ra le s Características mecánicas Relacionadas a la reacción del alimento al estrés mecánico Dureza Cohesividad Viscosidad Elasticidad Adhesividad Características geométricas Relacionadas al tamaño, forma y orientación de las partículas en los alimentos Otras características Ralacionadas a la percepción de la jugosidad y el contenido de grasa de los alimentos 26 en que se presentan y el orden en el que aparecen desde la primera mordida y a través de la completa masticación”. A continuación se muestran algunas de las definiciones para ciertos atributos de textura sensorial que fueron planteados originalmente por Szczesniak (1986) y posteriormente fueron modificados por Brennan (1989) Tabla 3.2 Definiciones de los atributos de textura Dureza La fuerza requerida para comprimir una sustancia entre los molares (para sólidos) o entre la lengua y el paladar (para semisólidos) para lograr una cierta deformación o penetración Cohesividad La extensión en la que cierto material puede ser deformado después de que se fractura Viscosidad La fuerza requerida para llevar a un líquido de una cuchara sobre la lengua Elasticidad El rango en que un material deformado regresa a su condición no deformada después de que se remueve la fuerza que lo deformó Adhesividad La fuerza requerida para remover el material que se adhiere a la boca (generalmente al paladar) durante el proceso normal de masticación Fracturabilidad La fuerza con la cual una muestra se desmorona, se rompe o se destroza; la fuerza horizontal con la cual los fragmentos se mueven lejos del punto donde la fuerza vertical es aplicada. La fracturabilidad es el resultado de un alto nivel de dureza y un bajo nivel de adhesividad Masticabilidad El tiempo o el número de masticaciones requeridas para masticar un alimento sólido hasta el punto de tragarlo. La masticabilidad es un producto de la dureza y cohesividad Gomosidad La densidad que persiste a través de la masticación, la energía requerida para desintegrar un alimento semisólido hasta poder tragarlo. La gomosidad es un producto de un bajo nivel de dureza y un alto nivel de cohesividad 27 3.4.2. Perfil de textura instrumental El análisis de perfil de textura (TPA) está basado en el reconocimiento de la textura como una propiedad multiparamétrica y en la clasificación de algunas de sus características. Se sabe que es imposible hacer modelos para una textura alimentaria real a partir de una sola medida, tanto si es sensorial como instrumental. En consecuencia, ha parecido lógico caracterizar la textura de un alimento a partir de varias medidas. Por esto la evaluación multivariante de textura se ha desarrollado en dos direcciones principales: el análisis sensorial, con los métodos de perfil sensorial y el análisis instrumental con el perfil de textura. Las medidas instrumentales de la textura se pueden dividir en tres pruebas principalmente; 1. Los ensayos fundamentales que miden propiedades físicas como la viscosidad y difícilmente se relacionan con las medidas sensoriales. 2. Los ensayos empíricos que no tienen ninguna base científica real, están basados únicamente en la intuición del manipulador y buscan medir características vagas como la firmeza o la consistencia. 3. Los ensayos imitativos intentan recrear, de un modo experimental, la práctica real efectuada sobre los productos. Uno de los instrumentos más representativos de estos ensayos es el Texturómetro. El primer aparato desarrollado para imitar la masticación es el tenderómetro del MIT (Massachussetts Institute of Technology). A partir de este se creó uno que no solo imita la masticación sino que permite registrar datos confiables y suficientes para poder obtener el perfil de textura. Este aparato, el General Foods Texturometer®, realiza una compresión inicial, hasta un 75 % de la altura de la muestra, con una sonda superior. Posteriormente hay un aflojamiento del esfuerzo, relajación y posteriormente de nuevo compresión. El resultado se obtiene con la forma de una curva de fuerza aplicada en función del tiempo. Desde que se creó este ensayo, la curva obtenida ha sido utilizada para definir varios parámetros de textura del alimento estudiado, bien por medida directa o por 28 cálculo de superficies. Estos parámetros han evolucionado poco desde el origen y pueden ser considerados prácticamente como normas de facto (Roudot, 2004). El análisis de Perfil de Textura instrumental ha sido utilizado durante varios años para la medición de las propiedades de textura de los alimentos (Bourne, 1982; Sanderson 1990). Desde que se creó este ensayo, la curva obtenida ha sido utilizada para definir varios parámetros de textura del alimento estudiado, bien por medida directa, bien por cálculo de superficies. Estos parámetros han evolucionado poco desde el origen y pueden ser considerados prácticamente como normas de facto. La curva típica obtenida es de la forma que se representa en la figura. Figura 3.10. Curva obtenida en un perfil de textura De esta curva se obtienen 8 parámetros: - La fracturabilidad, que corresponde a la fuerza necesaria para la primera ruptura (pico 1); - La dureza, también llamada firmeza, es el valor de la fuerza máxima obtenida después de la primera compresión (pico 2); - La adherencia, que corresponde al área de la curva situada bajo el eje de abscisas, es el trabajo necesario para despegar el producto de la placa de compresión (A3); - La cohesión mide la fuerza de los enlaces internos del producto, se obtiene como el cociente entre el área del segundo pico y primer pico (A4/A5); 29 - La elasticidad es la diferencia entre la distancia B medida entre el contacto inicial y el contacto en la segunda masticación y la misma medida C efectuada sobre un material inelástico (B-C) - El carácter frágil, que no se mide directamente sino que se evalúa a partir de la forma de los picos; - El carácter masticatorio es el producto dureza*cohesión*elasticidad - El carácter gomoso es el producto dureza*cohesión Estas definiciones de criterios pueden parecer poco pertinentes o tener a priori muy poca relación con las experiencias de degustación. De hecho, estas definiciones se han elegido después de ensayos de correlación entre los resultados de los ensayos sensoriales y de ensayos de perfil de textura. Es evidente que el perfil de textura aporta una ayuda indiscutible en la apreciación de la textura de los productos alimentarios. Sin embargo, es necesario tener cuidado en no considerar los resultados más que en el marco de las comparaciones y como relativos. En efecto, incluso si el método es imitativo y si los criterios han sido comparados con criterios sensoriales, es necesario tener en cuenta varios elementos limitadores. Primero, las relaciones entre criterios sensoriales y los criterios instrumentales no son lineales: se ha podido demostrar, por ejemplo, que entre dos valores sucesivos de la dureza sensorial, el texturómetro mide 10 para las pequeñas durezas y 70 para las durezas elevadas. Además, siendo viscosos los productos en ensayo, la velocidad de avance de la placa de compresión tiene influencia sobre el resultado y, por lo tanto, sobre los parámetros, al igual que el tiempo de relajación elegido o el porcentaje de compresión inicial. Todos estos elementos conducen a proponer este método tan sólo en el marco de las medidas relativas, sinembargo también se ha visto, en evaluación de geles, que la información del TPA va más allá de las mediciones de la fuerza del gel y es útil para el análisis de rutina de la textura de estos (Sanderson 1990). 30 3.3. Correlaciones entre evaluaciones sensoriales e instrumentales Métodos instrumentales como el análisis de perfil de textura (TPA) han sido desarrollados para medir las propiedades texturales de muchos productos, incluyendo chícharos congelados (Martens 1986), arroz (Rousset et al. 1995), manzanas (Abbott et al. 1984), quesos (Breuil and Meullenet 2001; Xiong et al. 2002; Everard et al. 2006), tomates procesados (Lee et al. 1999), mariscos (Perez- Won et al. 2006), papas (Thybo et al. 2000), camote (Truong et al. 1997), galletas (Perry et al. 2003) y panes (Gambaro et al. 2002), y se han realizado intentos de relacionar los resultados obtenidos con datos sensoriales. Yuan y Chang (2007) correlacionaron del TPA la dureza y elasticidad del tofu con los parámetros sensoriales y encontraron correlaciones lineales, mientras que Szczeniak et al. (1963) reportó relaciones no lineales entre los valores de la dureza sensorial e instrumental. Meullenet y Gross (1999) evaluaron seis atributos texturales en 24 alimentos diferentes por medio de un panel experimentado. Su estudio tenía como objetivo definir un modelo predictivo para evaluar características sensoriales de textura, basándose en parámetros instrumentales obtenidos a través de ensayos de compresión uniaxial y doble compresión. Encontraron que la dureza, cohesividad y la fracturabilidad se predijeron con precisión mientras que la elasticidad, cohesividad de la masa y la masticabilidad se predijeron de manera poco satisfactoria. En 2009 Kim et al. Buscaron las relaciones entre los atributos de textura sensoriales y las mediciones físicas e instrumentales de muestras de barras de cereal. Estas relaciones se determinaron por medio de un análisis simple de regresión. Muchas de las mediciones instrumentales mostraron un alto grado de correlación (r0.85, p< 0.001) con alguno de los atributos sensoriales de textura. Los atributos que mejor se correlacionaron fueron firmeza, masticabilidad y desmoronabilidad. La relación entre otros atributos sensoriales de textura (recuperación de la muestra, tiempo de retorno para la elasticidad, humedad, 31 palatabilidad, adhesividad a los dientes) y mediciones físicas e instrumentales de las barras fueron menos claras. 32 3.4. Microscopía electrónica en alimentos La calidad de un producto alimentario está relacionada a sus características sensoriales y mecánicas. Estas características son afectadas por la organización estructural del alimento (Stanley 1987) que de acuerdo a Fardet et al. (1998) pueden ser estudiadas a niveles moleculares, microscópicos y macroscópicos. En particular la microestructura y las interacciones de los componentes tales como proteínas, almidón y grasas determinan la textura de un alimento que podría definirse como la “manifestación externa de esta estructura” (Allan-Wojtas et al., 2001). En 1996 Langton et al., estudiaron las correlaciones que existen entre la microestructura y la textura de geles de partículas proteicas (partículas esféricas unidas para formar cadenas). En este estudio se dividieron los atributos medidos según el método de evaluación, destructivo o no destructivo. Los atributos que se midieron por métodos destructivos fueron aspecto granulado, fracturabilidad, y textura cremosa y arenosa. Los atributos que se midieron por métodos no destructivos fueron suavidad y elasticidad. Ellos encontraron que la textura, medida con métodos destructivos dependía del tamaño del poro y el tamaño de partícula, mientras que era dependiente de las características de agrupamiento si se medía con métodos no destructivos. 3.4.1. Técnicas adecuadas para estudios de microestructura Los estudios de la estructura de alimentos a nivel microscópico se pueden llevar a cabo utilizado una gran variedad de técnicas microscópicas incluyendo microscopía óptica (MO), microscopía electrónica de barrido (MEB), microscopía electrónica de transmisión (MET) y microscopía de barrido láser confocal (MBLC), y cada una de estas técnicas presenta diferentes ventajas. Aunque la microscopía óptica no permite grandes amplificaciones comparada con las técnicas de microscopía electrónica, ésta permite la tinción específica de 33 diferentes componentes químicos de un alimento (proteínas, glóbulos de grasa, etc.). Por este motivo esta técnica es adecuada para estudiar alimentos con muchos componentes o diferentes fases así como alimentos a base de cereal (Autio y Salmenkallio-Marttila 2001). Utilizando diferentes técnicas de microscopía se pueden poner en evidencia diferentes aspectos de estructuras de partículas. Por ejemplo, en un estudio con geles de partículas microporosas (Langton et al, 1996), la MO se empleó para visualizar los poros, se utilizó MET para evaluar los tamaños de partícula, y para observar el arreglo que tenían las partículas se utilizó MEB, aprovechado que con esta se logran observar las estructuras en tres dimensiones. La MEBLC representa un método alternativo adecuado e la evaluación de la microestructura de alimentos debido a que requiere una preparación mínima de la muestra. De hecho, la técnica de MEBLC incluye el rebanado óptico de la muestra (Autio y Laurikainen, 1997; Rao et al., 1992). La MEBLC puede ser utilizada para observar la estructura en 3D de redes proteicas de muestras de pasta (Fardet et al., 1998), masa (Thorvaldsson et al., 1999), o alimentos altos en grasa (Wendin et al., 2000) que no pueden ser preparados para microscopía convencional sin la pérdida de grasa (Autio y Laurikainen, 1997). Entre las técnicas de obtención de imágenes, la microscopía de fuerza atómica (MFA) y la imagen por resonancia magnética (IRM) se han introducido a la ciencia de los alimentos como técnicas no destructivas. La primera es particularmente apta para estudiar la aspereza de una superficie, especialmente en alimentos frescos (Kaláb et al., 1995). La segunda puede ser aplicada exitosamente para estudiar procesamientos tales como freído, drenado de espuma, cristalización de grasas, y otras operaciones en las que un estudio dinámico del alimento es necesario (Kaláb et al., 1995). Otros métodos que se comienzan a utilizar para estudiar la estructura de los alimentos son la resonancia magnética nuclear, ultrasonido, difracción de rayos x, 34 microscopía electrónica con transformada de Fourier, dispersión de neutrones a bajos ángulos (Falcone et al., 2006). Como muchas de las características de los alimentos dependen en gran medida de la microestructura, es posible obtener información microestructural estudiando las propiedades mecánicas y viscoelásticas de los alimentos. Una muestra alimenticia sometida a pruebas mecánicas da lugar a una curva de fuerza-tiempo de la que se pueden extrapolar varios parámetros relacionados con la microestructura: dureza, cohesividad, elasticidad, masticabilidad, gomosidad y adhesividad (Martínez et al., 2004). Como las propiedades sensoriales y mecánicas de los alimentos dependen de su microestructura, el conocimiento de esta debe preceder cualquier operación que tenga el fin de obtener una textura específica. 3.4.2. Microscopía Electrónica de Barrido La microscopía electrónica permite la obtención de información sobre la topografía (características de superficie de un objeto), morfología (forma y tamaño de las partículas y la relación entre estas estructuras y las propiedades de los materiales), y la composición (elementos, compuestos, y sus cantidades relativas, relaciones entre la composición y las propiedades de los materiales). Como en la microscopía electrónica la fuente de iluminación no es representadapor luz sino por un haz enfocado de electrones, las micrografías resultantes no pueden estar en color sino en varios tonos de gris. En un microscopio electrónico, un haz de electrones es formado por la fuente de electrones y es acelerado hacia la muestra utilizando un potencial eléctrico positivo. La corriente es enfocada en un rayo delgado monocromático utilizando aperturas metálicas y lentes magnéticos. El haz de electrones interactúa con la muestra y los efectos de esta interacción son detectados y transformados en una imagen. 35 La microscopía electrónica trabaja bajo condiciones de vacío debido a que el aire absorbe los electrones. Por este motivo, las muestras húmedas no se pueden analizar por microscopía electrónica sin una previa deshidratación, congelación, o liofilización debido al fenómeno de sublimación (Bache and Donald, 1998). La microscopía electrónica de barrido, que es la que se empleó para este estudio, permite la detección de la superficie de la muestra que emite o refleja el haz de electrones (Hermansson et al., 2000). Para proveer de conductividad electrónica, un recubrimiento de entre 5 y 20 nm se aplica a la superficie de la muestra (Kaláb et al., 1995). 36 3.5. Análisis de Componentes Principales (PCA) El análisis de componentes principales (PCA) es la herramienta de estadística multivariante más ampliamente utilizada en el análisis sensorial. Si es aplicada a estudios de aceptación, los datos de entrada consisten en una matriz de muestras (filas) por consumidor (columnas), y el resultado es conocido como mapa interno de preferencia (Greenhoff & MacFie, 1994). Cuando es aplicado al análisis descriptivo, los datos de entrada son una matriz de muestras (filas) por descriptor (columnas), usualmente construida por los valores promedio de las evaluaciones. El PCA reduce el número de variables originales p (columnas) en un pequeño número de variables no observables k (componentes principales) que son combinaciones lineales de las originales. El objetivo principal del PCA es la explicación de la mayor cantidad de la variabilidad de los datos originales como sea posible con tan pocos de estos componentes principales como sea posible (aunque es posible obtener tantos de ellos como variables originales). El primer componente principal (CP) corresponde a al primer “eigenvalue” y por lo tanto explica el mayor porcentaje de la variabilidad total en los datos, el segundo CP sigue en el porcentaje de varianza explicada y no se correlaciona con el primero. (Borgognone, 2001). Hay dos maneras matemáticas de realizar el PCA, por medio de matrices de correlación, o por medio de matrices de covarianza. El uso de la matriz de covarianza implica que solamente las diferencias debidas a medias diferentes son removidas de las variables originales, pero las varianzas no se consideran iguales. Aquellas variables con mayores varianzas tendrán un mayor impacto en los pesos de los CP. Si las variables estudiadas son medidas utilizando la misma escala parece razonable utilizar la matriz de covarianza para obtener los CP. Por el otro lado, si las variables son medidas en escalas diferentes entonces se recomienda la matriz de correlación ya que todas las variables originales son estandarizadas a una varianza unitaria. Los atributos texturales en el TPA son definidos frecuentemente por las curvas de fuerza-tiempo incluyendo la dureza, elasticidad, cohesividad, masticabilidad, etc. 37 Por otro lado, en el análisis estadístico, cuando el número de variables son muchas en un proceso, el análisis de componentes principales es utilizado generalmente pare reducir el número de variables combinando o expresando dos o más variables con un solo factor. Además, el PCA es utilizado para detectar la estructura en las relaciones entre las variables (Rahman and Al-Farsi 2005). Algunos estudios previos sobre la textura de alimentos tendieron a aplicar el PCA para reducir el número de atributos texturales (Toda et al., 1971; Paoletti et al., 1993; Myhara et al., 2000; Ordoñez et al., 2001; Rahman and Al-Farsi, 2005 y Probola and Zander, 2007). Como conclusiones de estas investigaciones, dos o tres componentes principales pueden agrupar todas las variables medidas, y el PCA mostró ser un buen método estadístico para reducir y explicar factores de textura. 38 4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1. Materiales Para la elaboración de los geles se empleó azúcar refinada Great Value, jarabe de maíz pasteurizado para bebé Carlota®. El ácido cítrico que se utilizó fue monohidratado granular de J.T. Baker, el saborizante fue de la casa SODEXIM, Sabores y Perfumes. Es. Artif Sabor Fresa AS-58822 y como color se utilizó el colorante rojo de los colores comerciales de McCormik. En las formulaciones con agar se empleó el de la empresa Ragar S.A. de C.V. cuya venta es a granel. Las formulaciones con carragenina fueron elaboradas con Carragenina GC50 del lote 040813-B de Gomas Naturales S.A de C.V. y en ellas también se empleó cloruro de potasio de venta a granel. En las formulaciones con grenetina, se empleó la de la marca Duche de 290 Bloom, que contiene mínimo 83% de proteína. La pectina utilizada fue Pectina cítrica rapid set 150 cuya venta es a granel; para esta misma formulación se empleó citrato de sodio deshidratado, también de venta a granel. 4.2. Elaboración de los geles Se evaluaron ocho formulaciones distintas de geles tratando de simular gomitas comerciales. Este trabajo es continuación de proyecto de tesis “Estudio del efecto de la capsaicina en la textura en geles”, Jardón, 2006. Las formulaciones desarrolladas en ese estudio y que fueron evaluadas sensorialmente, son las que se evaluarán instrumentalmente en este trabajo. Estas se encuentran divididas en dos grupos, las que tienen un alto contenido de azúcar y las que tienen un bajo contenido de este ingrediente. Las formulaciones de los geles se muestran en la tabla 4.1. 39 Tabla 4.1. Formulaciones de los distintos geles utilizados para el estudio. Ingrediente (g) Formulación Formulaciones con alto contenido de azúcar Formulaciones con bajo contenido de azúcar 1 2 3 4 5 6 7 8 Agar - - - - - - - 0.4 Carragenina 0.8 - - - - - - - Grenetina - - 1.8 1.5 5 9 12 5 Pectina - 1.0 - 1.5 - - - - Sacarosa 37.0 37.0 37.0 37.0 6 6 6 6 Jarabe de maíz 24.0 24.0 24.0 24.0 - - - - Ácido cítrico 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 Citrato de sodio - 0.4 0.4 - - - - - Cloruro de potasio 0.4 - - - - - - - Agua 36.6 36.5 36.1 34.5 87.9 83.9 80.9 87.5 Saborizante 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 Colorante 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 Las concentraciones evaluadas tanto de capsaicina como de dihidrocapsaicina fueron las siguientes: 0.56, 0.84, 1.12, 1.68, y 2.80 ppm Para esto, a la cantidad de agua adicionada para cada formulación (Tabla 4.1) se le restó la cantidad de solución de capsaicina que se requirió para llegar a la cantidad deseada, para así completar el peso final. Para ello se utilizaron soluciones stock de cada uno de los capsaicinoides preparados como se menciona a continuación. Solución stock de capsaicina Se pesa la cantidad necesaria de capsaicina y se disuelve en 15 mL de etanol y posteriormente se lleva a la marca de aforo en un matraz de 1 L. Solución stock de dihidrocapsaicina Se pesa la cantidad necesaria de capsaicina y se disuelve en 50 mL de etanol y posteriormente se lleva a la marca de aforo en un matraz de 1 L. 40 La metodología empleada para la elaboración de los geles se muestra en las figuras 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5 y 4.6. Figura 4.1. Diagrama para la elaboración de los geles de carragenina al 0.8% (F1) Mezclar la sacarosa y la miel de maíz calentando hasta que se disuelva la sacarosa Mezclar la carragenina con la sacarosa y la mielAgregar el agua necesaria para compensar la pérdida por evaporación y añadir el ácido cítrico Dejar enfriar hasta 50°C y agergar saborizante y colorante Vaciar en moldes y refrigerar a 4°C por 24 h previas a su evaluación Mezclar la carragenina con 0.05% de KCl y con 5 g de sacarosa antes de disolver en agua fría Disolver la mezcla en baño de agua a ebulición mezclando continuamente 2 min. a 85 °C agitación constante 2 min. a 85 °C agitación constante 41 Figura 4.2. Diagrama para la elaboración de los geles de pectina al 1% (F2) Mezclar la sacarosa y la miel de maíz calentando hasta que se disuelva la sacarosa Mezclar la pectina con la sacarosa y la miel Agregar el agua necesaria para compensar la pérdida por evaporación y añadir el ácido cítrico Dejar enfriar hasta 50°C y agergar saborizante y colorante Vaciar en moldes y refrigerar a 4°C por 24 h previas a su evaluación Mezclar la pectina con 5 g de sacarosa y el citrato de sodio antes de disolver en agua fría Disolver la pectina en baño de agua a 85 °C 2 min. a 85 °C agitación constante 2 min. a 85 °C agitación constante 42 Figura 4.3. Diagrama para la elaboración de los geles de grenetina al 1.8% (F3) Mezclar grenetina con agua Fría Disolver la grenetina en baño de agua a 60 °C Mezclar grenetina con la sacarosa y la miel Mezclar la sacarosa y la miel de maíz calentando hasta que se disuelva la sacarosa Añadir el agua necesaria para compensar la pérdida por evaporación y añadir ácido cítrico 2 min. a 60°C agitación constante Dejar enfriar hasta 50 °C y agregar saborizante y colorante 2 min. a 60°C agitación constante Vaciar en moldes y refrigerar a 4°C por 24 horas previas a su evaluación 43 Figura 4.4. Diagrama para la elaboración de los geles de grenetina 1.5% y pectina al 1.5% (F4) Mezlar pectina con 5 g de sacarosa y el citrato de sodio antes de disolver con agua fría Disolver la grenetina junto con la pectina en baño de agua a 85 °C mezclando continuamente Mezclar la grenetina con agua fría (la suficiente para humedecerla por completo). Esperar a que se forme un gel (aprox. 10 min) Mezclar la sacarosa y la miel de maíz calentando hasta que se disuelva la sacarosa Mezclar la pectina y la grenetina con la sacarosa y la miel Agregar el agua necesaria para compensar la pérdida por evaporación y añadir el ácido cítrico Dejar enfriar hasta 50°C y agergar saborizante y colorante Vaciar en moldes y refrigerar a 4°C por 24 h previas a su evaluación 2 min. a 85 °C agitación constante 2 min. a 85 °C agitación constante 44 Figura 4.5. Diagrama para la elaboración de los geles de grenetina al 5, 9 y 12% (F5, F6, F7) Disolver el azúcar con el agua calentando hasta su completa disolución Mezclar el azúcar disuelta con la grenetina disuelta Mezclar la grenetina con agua fría (la suficiente para humedecerla por completo). Esperar a que se forme un gel (aprox. 10 min) Agregar el agua necesaria para compensar la pérdida por evaporación y añadir el ácido cítrico Dejar enfriar hasta 50°C y agergar saborizante y colorante Vaciar en moldes y refrigerar a 4°C por 24 h previas a su evaluación 2 min. a 85 °C agitación constante 2 min. a 85 °C agitación constante Disolver la grenetina en baño de agua a 60 °C 45 Figura 4.6. Diagrama para la elaboración de los geles de grenetina al 5% y agar al 0.4% (F8) Disolver el agar con sufiente agua calentando a ebullición hasta que se obtenga una solución cristalina Mezclar el agar disuelto con la grenetina disuelta Mezclar la grenetina con agua fría (la suficiente para humedecerla por completo). Esperar a que se forme un gel (aprox. 10 min) Agregar el agua necesaria para compensar la pérdida por evaporación y añadir el ácido cítrico Dejar enfriar hasta 50°C y agergar saborizante y colorante Vaciar en moldes y refrigerar a 4°C por 24 h previas a su evaluación 2 min. a 85 °C agitación constante 2 min. a 85 °C agitación constante Disolver la grenetina en baño de agua a 60 °C 46 4.3. Evaluación instrumental de la textura Se realizó la evaluación instrumental de la textura de las diferentes formulaciones con la ayuda de un Texturómetro (Stable Micro Systems) TA-XT2 Plus (Haslemere, Inglaterra), utilizando una sonda cilíndrica de aluminio con un diámetro de 50 mm (P50) para llevar a cabo la prueba de TPA. Los parámetros que se obtuvieron por medio de este ensayo fueron: Dureza, Adhesividad, Elasticidad, Cohesividad y Masticabilidad. Las condiciones de velocidad de ensayo y porcentaje de compresión de las muestras fueron determinadas por Daniel León bajo la tutoría de la Dra. Patricia Severiano durante la estancia corta titulada “SELECCIÓN DE LAS CONDICIONES DE EVALUACIÓN INSTRUMENTAL DE TEXTURA EN GELES TIPO “GOMITA”. En este estudio se buscó encontrar las condiciones de evaluación a las que las diferentes formulaciones mostraran una diferencia estadísticamente significativa entre los distintos atributos de textura. En este estudio se evaluaron tres distintas formulaciones de geles con porcentajes de compresión de 45 y 55% y velocidades de ensayo de 1, 1.4, 1.8, 2.0 y 2.2 mm/s. Como conclusiones de este trabajo se encontró entre otras cosas, que el porcentaje de compresión y velocidad de ensayo aplicada en la evaluación de los atributos de textura (dureza, adhesividad, masticabilidad, cohesividad y elasticidad), influyen en los valores obtenidos y que las condiciones ideales para evaluar las formulaciones de este estudio son las siguientes: Tabla 4.2. Parámetros empleados para la evaluación instrumental de la textura. Parámetro Valor Velocidad de ensayo 2mm/s % de Compresión 55% 47 4.3.1. Preparación de las muestras Las muestras elaboradas para evaluar el efecto de los capsaicinoides en la textura de los geles tenían las siguientes dimensiones: 3.5 x 4.5 cm de base, 3 cm de alto x 3 cm x 2 cm de superficie. Las muestras fueron medidas una a una, colocando la muestra sobre un plato y cuidando que ésta quede en el centro de la sonda justo debajo de ella a una distancia de 1 cm. El análisis instrumental se realizó sobre 9 réplicas de cada muestra. Figura 4. 7 Imágenes de los geles evaluados. 4.4. Medición del pH de los geles Para medir el pH de los geles se utilizó un potenciómetro (OAKTON instruments pH/mV/ion/°C meter ion 50 series) introduciendo el electrodo al gel a temperatura ambiente. 4.5. Evaluación de la microestructura de los geles El tratamiento de las muestras para su observación al microscopio se realizó en la unidad de Microscopía del Instituto de Fisiología Celular de la UNAM, y la observación de las muestras se realizó en el laboratorio de Microscopía de la Unidad de Servicio de Apoyo a la Investigación de la Facultad de Química de la UNAM. 48 En la siguiente figura se muestra el procedimiento que se siguió para la observación de las muestras bajo el microscopio electrónico de barrido. Figura 4.8. Procedimiento para la evaluación microscópica de los geles. Los equipos empleados para la evaluación microscópica de la textura de los geles fueron los siguientes: - Secadora al punto crítico (Tousimis Samdri-700) - Microscopio Electrónico de Barrido JEOL 5900-LV - Ionizador de oro (Jeol JFC1100) Elaboración de los geles Fijación del gel en solución de glutaraldehído Deshidratación gradual en series de etanol Secado al punto crítico del CO2 Recubrimiento con Au/Pd mediante un diodo de recubrimiento por pulverización catódica Observación al alto vacío en el microscopio electrónico de barrido (20 KV, 1 500, 2 500 y 5 000 X) 49 4.6. Análisis estadístico de los datos Todos los análisis estadísticos de los datos se llevaron a cabo utilizando el Software estadístico Fizz Calculations 3.0 (Biosystems). Se realizaron ANOVAS a los datos obtenidos
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