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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas 
 
 
ESTUDIO DEL EFECTO DE DIFERENTES TIPOS DE ESTRÉS EN EL 
PARÁSITO Trypanosoma cruzi: CONSECUENCIAS EN SU MORFOLOGÍA, 
ULTRAESTRUCTURA, CAPACIDAD INFECTIVA Y EXPRESIÓN DE LA 
PROTEÍNA SHSP16. 
 
 
 
 
TESIS 
 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
Doctora en Ciencias 
 
 
 
PRESENTA: 
DEYANIRA PÉREZ MORALES 
 
 
 
 
TUTOR PRINCIPAL: 
Dra. Bertha Espinoza Gutiérrez 
Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM 
 
MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR: 
Dr. Ruy Pérez Montfort (Instituto de Fisiología Celular, UNAM) 
Dra. Blanca Ruíz Ordaz (Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM) 
 
 
 
MÉXICO, D. F. marzo, 2013. 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
ESTUDIO DEL EFECTO DE DIFERENTES TIPOS DE ESTRÉS EN EL PARÁSITO 
Trypanosoma cruzi: CONSECUENCIAS EN SU MORFOLOGÍA, ULTRAESTRUCTURA, 
CAPACIDAD INFECTIVA Y EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA SHSP16 
 
RECONOCIMIENTOS 
Esta tesis doctoral se realizó bajo la dirección de la Dra. Bertha Espinoza Gutiérrez en el 
laboratorio de Estudios sobre Tripanosomiasis Americana, en el Departamento de Inmunología del 
Instituto de Investigaciones Biomédicas de la Universidad Nacional Autónoma de México. 
 
El Comité Tutoral que asesoró el desarrollo de esta tesis estuvo formado por: 
Dra. Bertha Espinoza Gutiérrez Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM 
Dr. Ruy Pérez Montfort Instituto de Fisiología Celular, UNAM 
Dra. Blanca Ruíz Ordaz Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM 
 
Se reconoce la colaboración de la Dra. Rebeca Manning Cela, del Departamento de Biomedicina 
Molecular del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional 
(CINVESTAV), en cuyo laboratorio se llevaron a cabo los experimentos de generación de mutantes 
sencillas de T. cruzi. 
 
Se reconoce la colaboración del Dr. Luis Felipe Jiménez García y la Dra. Lourdes Teresa Agredano 
Moreno, del Departamento de Biología Celular de la Facultad de Ciencias, UNAM, por su labor en 
la preparación de muestras y adquisición de micrografías de microscopía electrónica de 
transmisión. 
 
Se reconoce la valiosa asesoría técnica del Dr. Miguel Tapia en los experimentos de microscopía de 
luz y fluorescencia. 
 
Se reconoce la asesoría técnica del M. en C. Ignacio Martínez Martínez. 
 
El proyecto fue apoyado parcialmente por DGAPA-UNAM (Proyecto IN206512). Durante los 
estudios de doctorado goce de una beca otorgada por CONACYT y DGAPA-UNAM para la 
realización de la presente tesis. 
 
Esta tesis fue defendida en examen presentado el día de Marzo de 2013. 
 
El Jurado de Examen Doctoral estuvo constituido por: 
Presidente Dr. Luis Felipe Jiménez García Facultad de Ciencias, UNAM 
Vocal Dr. Jorge Luis Folch Mallol Centro de Investigación en Biotecnología, UAEM 
Vocal Dr. Jorge Nieto Sotelo Instituto de Biología, UNAM 
Vocal Dr. Abraham Landa Piedra Facultad de Medicina, UNAM 
Secretario Dra. Ana María Cevallos Gaos Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM 
AGRADECIMIENTOS 
 
A mi tutora, la Dra. Bertha Espinoza Gutiérrez, por permitirme conocer el maravilloso mundo del T. 
cruzi y darme las herramientas para descubrirlo. Por brindarme su confianza en todo momento y 
darme su apoyo constante y con ello, encauzarme a crear pequeñas cosas. Por todo, muchas 
gracias Dra. 
 
Al M. en C. Ignacio Martínez Martínez, por su invaluable apoyo durante todos estos años. 
 
A los miembros de mi Comité Tutoral que durante todo este tiempo me brindaron sus puntos de 
vista. Muy especialmente, a la Dra. Ana María Cevallos Gaos, que formó parte de mi proceso y 
siempre estuvo dispuesta a darme sus observaciones y comentarios, los cuales agradezco 
enormemente. 
 
A los miembros del Jurado de examen, por sus aportaciones que ayudaron a mejorar y enriquecer 
el presente trabajo. 
 
Al Posgrado en Ciencias Bioquímicas. 
 
A la UNAM, nuestra máxima casa de estudios. 
 
1 
 
ÍNDICE 
ÍNDICE ..................................................................................................................................... 1 
RESUMEN ............................................................................................................................... 6 
ABSTRACT ............................................................................................................................... 7 
Abreviaturas ........................................................................................................................... 8 
I. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 10 
1.1. Enfermedad de Chagas .............................................................................................. 10 
1.1.1. Etiología de la enfermedad ............................................................................ 12 
1.1.2. Fases y tratamiento de la enfermedad .......................................................... 12 
1.2. El parásito Trypanosoma cruzi................................................................................... 14 
1.2.1. Taxonomía ...................................................................................................... 14 
1.2.2. Genética.......................................................................................................... 14 
1.2.3. Genómica ........................................................................................................ 14 
1.2.4. Morfología ...................................................................................................... 15 
1.2.5. Ultraestructura celular ................................................................................... 18 
1.2.6. Ciclo de vida .................................................................................................... 20 
1.3. Condiciones de estrés ................................................................................................ 22 
1.3.1. Estrés ácido ..................................................................................................... 23 
1.3.2. Estrés nutricional ............................................................................................ 24 
1.3.3. Estrés oxidante ............................................................................................... 24 
1.3.4. Estrés por calor ............................................................................................... 25 
1.4. Genes de respuesta a estrés ..................................................................................... 25 
2 
 
1.4.1. HSPs ................................................................................................................ 26 
1.4.2. -HSPs ............................................................................................................ 28 
1.4.2.1. -HSPs en parásitos ................................................................................. 32 
II. ANTECEDENTES ................................................................................................................ 34 
III. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................. 36 
IV. HIPÓTESIS........................................................................................................................ 37 
V. OBJETIVOS ........................................................................................................................ 37 
Objetivo general ............................................................................................................... 37 
Objetivos particulares ...................................................................................................... 37 
VI. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................ 38 
6.1. Cultivos celulares ....................................................................................................... 38 
6.1.1. Epimastigotes ................................................................................................. 38 
6.1.2. Tripomastigotes .............................................................................................. 38 
6.1.3. Células Vero .................................................................................................... 38 
6.1.4. Bacterias ......................................................................................................... 39 
6.2. Ensayos de estrés ...................................................................................................... 39 
6.2.1. Estrés en epimastigotes.................................................................................. 39 
6.2.2. Estrés en tripomastigotes ............................................................................... 40 
6.3. Técnicas microscópicas ............................................................................................. 41 
6.3.1. Observación y captura de las imágenes en el microscopio óptico................. 41 
6.3.2. Captura de las imágenes en el microscopio electrónico de transmisión ....... 42 
6.4. Ensayos de infección ................................................................................................. 43 
6.5. Generación de anticuerpos policlonales anti-SHSP16 .............................................. 43 
3 
 
6.6. Extracción de las proteínas totales de los epimastigotes y los tripomastigotes ....... 44 
6.7. Fraccionamiento celular de los epimastigotes .......................................................... 44 
6.8. Cuantificación de las proteínas ................................................................................. 44 
6.9. Electroforesis unidimensional y transferencia de las proteínas ............................... 45 
6.10. Electroforesis bidimensional (2D-PAGE) ................................................................. 45 
6.11. Inmunoblot .............................................................................................................. 46 
6.11.1. Inmunoblot de los ensayos de estrés ........................................................... 46 
6.11.2. Inmunoblot con los sueros de los pacientes con Chagas ............................. 47 
6.11.3. Inmunoblot de las fracciones solubles e insolubles ..................................... 47 
6.11.4. Inmunoblot de los geles de 2-D .................................................................... 47 
6.12. Captura y análisis de los inmunoblots ..................................................................... 47 
6.13. Inmunofluorescencia indirecta para localizar a SHSP16 en los epimastigotes ....... 48 
6.14. Generación de las mutantes sencillas ..................................................................... 48 
6.14.1 Diseño de los primers .................................................................................... 49 
6.14.2. PCR de las regiones intergénicas .................................................................. 50 
6.14.3. Clonación de las regiones intergénicas ........................................................ 50 
6.14.4. Transfección de los parásitos ....................................................................... 52 
6.14.5. Clonación de las poblaciones de parásitos ................................................... 52 
6.14.6. Búsqueda de las mutantes ........................................................................... 53 
6.14.6.1. PCR´s para detectar a las mutantes dobles ........................................... 53 
6.14.6.2. PCR´s para detectar a las mutantes sencillas ........................................ 53 
6.15. Cuantificación de los ácidos nucleicos .................................................................... 54 
6.16. Captura de geles de agarosa ................................................................................... 54 
6.17. Análisis estadístico .................................................................................................. 54 
4 
 
VII. RESULTADOS .................................................................................................................. 55 
7.1. Estudio del efecto del estrés en los parásitos ........................................................... 55 
7.2. Efecto del estrés sobre la movilidad de los parásitos ............................................... 55 
7.2.1. Movilidad de los epimastigotes ...................................................................... 55 
7.2.2. Movilidad de los tripomastigotes ................................................................... 56 
7.3. Efecto del estrés sobre la morfología de los parásitos.............................................. 57 
7.3.1. Morfología de los epimastigotes .................................................................... 57 
7.3.2. Morfología de los tripomastigotes ................................................................. 63 
7.4. Ultraestructura de los epimastigotes expuestos a condiciones de estrés ................ 66 
7.5. Recuperación en el crecimiento de los parásitos sometidos a estrés....................... 71 
7.6. Efecto del estrés por calor ......................................................................................... 72 
7.6.1. Expresión diferencial de proteínas en epimastigotes .................................... 73 
7.6.2. Capacidad infectiva de tripomastigotes ......................................................... 74 
7.7. Caracterización de la proteína SHSP16 en T. cruzi .................................................... 78 
7.8. Nivel de la proteína SHSP16 en parásitos sometidos a estrés .................................. 82 
7.8.1. Nivel de la proteína SHSP16 en respuesta a distintos tipos de estrés en los 
epimastigotes ........................................................................................................................ 82 
7.8.2. Nivel de la proteína SHSP16 en distintos tipos de estrés en los 
tripomastigotes ..................................................................................................................... 86 
7.9. Generación de mutantes para el gen SHSP16 ........................................................... 89 
7.9.1. Amplificación de UTRs-5’ y -3’ ........................................................................ 91 
7.9.2. Clonación de los amplicones de las UTRs ....................................................... 92 
7.9.3. Transfección de parásitos con los vectores construidos ................................ 95 
7.9.4. Obtención de clonas resistentes .................................................................... 96 
5 
 
7.9.5. Análisis de clonas ............................................................................................ 97 
7.9.5.1. Búsqueda de mutantes nulas .................................................................. 97 
7.9.5.2. Búsqueda de mutantes sencillas ............................................................. 98 
7.10. Caracterización de la proteína SHSP16 ................................................................. 104 
7.10.1.Localización subcelular de la proteína SHSP16 .......................................... 104 
7.10.2. Localización de SHSP16 en fracciones subcelulares ................................... 104 
7.10.3. Detección de SHSP16 en 2D-PAGE ............................................................. 105 
7.10.4. Inmunogenicidad de la proteína SHSP16 en pacientes chagásicos ............ 105 
VIII. DISCUSIÓN ................................................................................................................... 107 
8.1. La respuesta al estrés en los epimastigotes ............................................................ 109 
8.1.1. Estrés ácido ................................................................................................... 109 
8.1.2. Estrés nutricional .......................................................................................... 112 
8.1.3. Estrés oxidante ............................................................................................. 114 
8.1.4. Estrés por calor ............................................................................................. 116 
8.2. La respuesta al estrés en los tripomastigotes ......................................................... 119 
8.3. Caracterización de la proteína SHSP16 ................................................................... 120 
8.4. Distribución subcelular de SHSP16 .......................................................................... 123 
8.5. Inmunogenicidad de la proteína SHSP16 ................................................................ 125 
IX. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 127 
X. PERSPECTIVAS ................................................................................................................ 128 
XI. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................ 129 
XII. Anexo I (Producción científica) ..................................................................................... 139 
6 
 
RESUMEN 
La exposición constante a diversos tipos de estrés celular forma parte del ciclo de vida 
natural de muchos parásitos de importancia médica, entre ellos, Trypanosoma cruzi, causante de 
la Enfermedad de Chagas. La adaptación a estas condiciones de estrés es necesaria para la 
supervivencia, reproducción y transmisión del parásito. Entender los efectos, así como las 
respuestas que ha desarrollado T. cruzi para contender con dichas adversidades, permitirá ampliar 
el conocimiento acerca de la biología básica del parásito, con el fin de encontrar posibles blancos 
terapéuticos. En el presente trabajo, se estudió una parte de los efectos y la respuesta que T. cruzi 
exhibe en diferentes condiciones de estrés. Cuatro tipos de estrés se estudiaron: ácido, 
nutricional, oxidante y por calor. Cada tipo de estrés provocó en los parásitos alteraciones y 
respuestas diferenciales, tanto a nivel morfológico como a nivel bioquímico. Interesantemente, al 
comparar la respuesta a estrés entre dos de los principales estadios del parásito, se observaron 
diferencias importantes, siendo el estadio de epimastigotes más sensible que los tripomastigotes, 
sugiriendo un tipo de adaptación finamente regulada. Asimismo, se caracterizó por primera vez la 
ultraestructura de parásitos sometidos a estrés ácido, oxidante y por calor, encontrándose que 
uno de los principales organelos afectados fue la mitocondria, distinguiéndose también la 
presencia de estructuras típicas de procesos de muerte celular, entre ellos, la autofagia. También, 
se caracterizó por primera vez a una proteína del grupo de las proteínas de estrés por calor en el 
parásito, nombrada SHSP16, de acuerdo a su peso molecular. Al analizar la abundancia de dicha 
proteína en condiciones de estrés, se determinó que únicamente aumentó en condiciones de 
estrés oxidante y por calor en el estadio de epimastigotes. Con el fin de caracterizar a la proteína 
SHSP16 in vivo, se generó una mutante sencilla para el gen SHSP16 en parásitos de T. cruzi, la cual 
no presentó ningún fenotipo asociado a la disminución en la resistencia a estrés como 
consecuencia de una copia menos del gen SHSP16. Se analizó el proteoma de parásitos sometidos 
a estrés por calor, encontrándose la expresión diferencial de 24 proteínas involucradas en el 
metabolismo, defensa celular, síntesis de proteínas, destino de proteínas, transporte celular, ciclo 
celular e interacción con el ambiente. Todos los aspectos estudiados contribuyen a la 
caracterización de la respuesta a estrés en T. cruzi. 
7 
 
ABSTRACT 
Constant exposure to different types of cellular stress is part of the natural life cycle of 
many parasites of medical importance, including Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas 
disease. Adaptation to stress conditions is necessary for survival, reproduction and transmission of 
the parasite. If we understand the effects, as well as the responses that T. cruzi has developed to 
deal with such adversity, we will expand our knowledge about the basic biology of the parasite, in 
order to find possible therapeutic targets. In the present work, morphological alterations and 
stress response in different stress conditions were studied. We analyzed four types of stress: acid, 
nutritional, oxidative and heat shock. Each type of stress produced different alterations and 
responses, either at morphological or biochemical level. Interestingly, when comparing stress 
response between two of the three main stages of the parasite, significant differences were 
observed, being epimastigotes more sensitive than tripomastigotes stage, suggesting a kind of 
adaptation finely regulated. Also, we reported for the first time the characterization of parasites 
ultrastructure under acid, oxidative and heat stress, being mitochondria, the most affected 
organelle. In addition, we found autophagic structures. We characterized, for the first time a heat 
shock protein, named SHSP16, according to its molecular weight. By analyzing the level of SHSP16 
under stress conditions, it was determined that it was only augmented under oxidative and heat 
stress in the epimastigote stage. In order to characterize the SHSP16 protein in vivo, we generated 
a single gene knockout for the SHSP16 gene in T. cruzi, which did not give any phenotype 
associated with the decrease in resistance to stress as a result of one less copy of SHSP16 gene. 
We analyzed the proteome of parasites subjected to heat shock, being the differential expression 
of 24 proteins involved in metabolism, cell defense, protein synthesis, protein fate, cellular 
transport, cell cycle and interaction with the environment. These aspects contribute to the study 
of stress response in T. cruzi. 
8 
 
Abreviaturas 
2D-PAGE Electroforesis bidimensional (2D-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 
aa Aminoácido 
ADN Ácido Desoxiribonucleico 
AI Amortiguador de Incubación 
Amp Ampicilina 
ANOVA Análisis de varianza (Analysis Of Variance) 
ARN Ácido Ribonucleico 
ARNm Ácido Ribonucleico mensajero 
ATP Trifosfato De adenosina (Adenosine Triphosphate) 
BSA Albúmina de suero bovina (Bovine Serum Albumin) 
CHAPS 3-[(3-Colamidopropil) dimetilamonio]-1-propanesulfonato 
DALYs Años de vida saludable perdidos causados por enfermedad (Disability Adjusted 
 Life Years) 
DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole 
D-MEM Dulbecco´s Modified Eagle Medium 
DMSO Dimetil Sulfóxido 
dNTP Dinucleótido trifosfato (Dinucloetide Tri-Phosphate) 
DTUs Unidades de tipificación discretas (Discrete Typing Units) 
EDTA Ácido etilendiamino tetraacético (Ethylenediamine Tetraacetic Acid) 
EROs Especies Reactivas de Oxígeno 
Fw Primer sentido (Forward) 
HRP Peroxidasa de rábano (Horseradish Peroxidase) 
HSPs Proteínas de choque de calor (Heat Shock Proteins) 
Hyg Higromicina 
IEF Isoelectroenfoque 
IgG InmunoglubulinaG 
IPG Gradientes de pH inmovilizados (Immobilized pH Gradients) 
kDa KiloDaltons 
LB Medio Luria-Bertani 
LIT Medio de infusión de hígado y triptosa (Liver Infusion Tryptose) 
MDH Malato Deshidrogenasa 
MET Microscopía Electrónica de Transmisión 
MP Marcador de Peso 
NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato(Nicotinamide adenine dinucleotide 
 Phosphate) 
Neo Neomicina 
OMS Organización Mundial de la Salud 
pb Pares de bases 
PBS Amortiguador de fosfato de sodio (Phosphate Buffer Saline) 
PCR Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction) 
pI Punto Isoeléctrico 
PM Peso Molecular 
9 
 
PMSF Fluoruro fenilmetilsulfonil (Phenylmethylsulphonyl fluoride) 
Qro Cepa Querétaro de T. cruzi 
Rv Primer anti-sentido (Reverse) 
DS Desviación Estándard 
SDS-PAGE Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (Sodium Dodecyl Sulphate 
 Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 
SFB Suero Fetal Bovino 
SHSP16r Proteína SHSP16 recombinante 
sHSPs Proteínas de choque de calor de bajo peso molecular (Small Heat Shock 
 Proteins) 
TAU Medio artificial de orina de triatomino (Triatomine Artificial Urine) 
TBE Amortiguador tris-borato-EDTA (Tris Borate-EDTA) 
TEMED N, N, N’, N’-tetrametilen-diamina 
Tm Temperatura de alineamiento (Melting Temperature) 
UTRs Regiones no traducibles (UnTranslated Regions) 
UV Luz Ultravioleta 
-HSPs Proteínas de choque de calor de bajo peso molecular con un dominio - 
 cristalino (-Heat Shock Proteins) 
10 
 
I. INTRODUCCIÓN 
Desde hace cientos de años, las enfermedades producidas por parásitos han incidido de 
manera importante tanto en la salud como en la economía global y hoy continúan siendo un 
problema de salud pública sin resolver, principalmente en países en desarrollo. En el 2004, la 
Organización Mundial de la Salud (OMS), reportó que las enfermedades infecciosas y parasitarias 
provocaron la muerte de 10.9 millones de personas, representando un 19.1% del total de muertes 
registradas. Aunado a las defunciones, en términos de carga de la enfermedad medida en años de 
vida saludable perdidos causados por enfermedad o DALYs, por sus siglas en inglés (Disability 
Adjusted Life Years), los datos indican que sólo algunas de las principales enfermedades 
parasitarias causaron aproximadamente 58 millones de DALYs durante el 2004. Asimismo, la suma 
de capital calculada en millones de dólares perdida por ausentismo, tratamiento de la enfermedad 
y baja productividad de la población es enorme (WHO, 2004). Todo esto, hace del estudio de las 
enfermedades parasitarias un tema de gran relevancia, especialmente en países como México. 
Una de estas importantes enfermedades producidas por un parásito es la Enfermedad de Chagas, 
también conocida como Tripanosomiasis Americana. Dicho padecimiento constituye la 
enfermedad parasitaria de mayor importancia en América Latina, tanto por la morbi-mortalidad 
que genera, como por su importancia económica (WHO, 2000). Además, la OMS la ha clasificado 
como una de las trece enfermedades tropicales desatendidas (WHO, 2007). 
1.1. Enfermedad de Chagas 
La enfermedad de Chagas es un padecimiento potencialmente mortal causado por el 
parásito protozoario Trypanosoma cruzi. La enfermedad lleva el nombre de Carlos Ribeiro 
11 
 
Justiniano Chagas, médico brasileño que la descubrió en 1909. Es endémica de América Latina, 
donde los vectores, así como los reservorios silvestres del parásito, tienen una amplia distribución 
desde el norte de México hasta el sur de Argentina y Chile (WHO, 2010). No obstante, en las 
últimas décadas se ha observado una mayor incidencia de personas infectadas con el parásito en 
países no endémicos como Estados Unidos de América, Canadá, muchos países europeos y 
algunos del Pacífico Occidental (Figura 1.1). Lo anterior debido principalmente, a la migración de la 
población de América Latina hacia el resto del mundo (Schmunis y Yadon, 2010). 
 
Figura 1.1. Mapa de distribución mundial de la Enfermedad de Chagas. Población global estimada a estar 
infectada con T. cruzi en el año 2009. Los países muestran diferentes coloraciones dependiendo del número 
de casos reportados. Modificado de http://dndi.org/diseases/chagas/global-view.html. 
 
 
En años recientes, se calculó que 10-15 millones de personas se encuentran infectadas en 
todo el mundo, principalmente en Latinoamérica, y que 90 millones se encuentran en riesgo de 
contraer la enfermedad (Coura y Dias, 2009; WHO, 2010). De las personas infectadas, 10 000 
mueren anualmente (WHO, 2010). Los DALYs provocados por dicho padecimiento en el 
Continente Americano suman 426 000 (WHO, 2010, Zingales et al., 2012). 
12 
 
1.1.1. Etiología de la enfermedad 
De manera natural, el parásito se transmite al ser humano y otras más de 150 especies de 
animales domésticos (perros, gatos, cobayos, ratas y ratones domésticos, entre otros) y silvestres 
(diversos mamíferos como roedores, armadillos, murciélagos, marsupiales, entre otros), por las 
heces infectadas de hemípteros hematófagos de la familia Reduviidae, subfamilia Triatominae, de 
los cuales se han descrito aproximadamente 140 especies como vectores potenciales del parásito 
(Coura y Dias, 2009; Bellini et al., 2012), aunque sólo algunas especies como vectores competentes 
(Rassi et al., 2010), siendo ésta la principal forma de transmisión de parásito. Otras formas de 
infección menos frecuentes son las siguientes: ingesta de alimentos contaminados con el parásito 
(transmisión oral); transmisión de madre a hijo (congénita); transfusión sanguínea con sangre 
infectada; trasplante de órganos de personas infectadas; accidentes de laboratorio (WHO, 2010). 
1.1.2. Fases y tratamiento de la enfermedad 
Una vez que el ser humano se infecta con el parásito, el curso de la enfermedad puede 
derivar en un amplio espectro de manifestaciones clínicas, que van desde infecciones subclínicas, 
hasta severos cuadros de enfermedad y en ocasiones la muerte (WHO, 2010; Zingales et al., 2012). 
Se distinguen 2 fases principales: aguda y crónica, cada una con sintomatología y características 
propias, las cuales son resumidas en el diagrama de flujo de la Figura 1.2. Hasta el momento, no 
existe vacuna alguna contra la enfermedad, así como tampoco ningún tratamiento efectivo. Los 
fármacos existentes (benznidazol o nifurtimox) sólo son efectivos durante la etapa aguda de la 
infección y en algunos casos de reactivación de la enfermedad, presentando severos efectos 
colaterales en un alto porcentaje de los individuos tratados (WHO, 2010). 
13 
 
Figura 1.2. Diagrama de flujo del curso de la enfermedad de Chagas. Una vez que el ser humano se infecta 
con el parásito por cualquier vía, se desarrollarán dos fases principales: aguda y crónica. Además, durante el 
curso de la enfermedad, pueden presentarse diversas patologías. Los números en el texto (en superíndice) 
hacen referencia a la imagen correspondiente. Imágenes tomadas de Kinoshita-Yanaga et al., 2009; Rassi Jr. 
et al., 2010; Rodrigues y Borges-Pereira, 2010. Fuente de la información: Rassi Jr. et al., 2010; Zingales et al., 
2010; WHO, 2010. 
14 
 
1.2. El parásito Trypanosoma cruzi 
1.2.1. Taxonomía 
La clasificación taxonómica del parásito es la siguiente (Rassi et al., 2012): 
Dominio Eucarya 
Reino Protista 
Subreino Protozoa 
Phylum Sarcomastigophora 
Subphylum Mastigophora 
Clase Zoomastigophorea 
Orden Kinetoplastida 
Familia Tripanosomatidae 
Género Trypanosoma 
Especie cruzi 
1.2.2. Genética 
La especie Trypanosoma cruzi está integrada por una población heterogénea de cepas o 
aislados, los cuales presentan una alta diversidad genotípica y fenotípica. En un intento por 
demarcar grupos ecológica y epidemiológicamente relevantes, la población de T. cruzi se agrupó 
en unidades de tipificación discretas o DTUs (por sus siglas en inglés, Discrete Typing Units) (Brisse 
et al., 2000), las cuales fueron renombradas en años recientes y tras un consenso internacional,se 
decidió reconocer la existencia de seis principales DTUs: TcI, TcII, TcIII, TcIV, TcV y TcVI (Zingales at 
al., 2009). 
1.2.3. Genómica 
El genoma de T. cruzi se encuentra totalmente secuenciado (El-Sayed et al., 2005b). La 
primer cepa utilizada para este propósito fue CL-Brener, la cual es una cepa híbrida perteneciente 
al grupo TcVI y que se originó como resultado de dos eventos de fusión entre genotipos antiguos 
de cepas pertenecientes a los grupos TcII y TcIII (Westenberger et al., 2005; de Freitas et al., 2006). 
Dicha cepa posee un genoma haploide de 55 Mb, altamente repetitivo y polimórfico (El-Sayed et 
al., 2005a), ensamblado en 41 pares de cromosomas (Weatherly et al., 2009). Debido a la 
15 
 
naturaleza híbrida y polimórfica de la cepa CL-Brener, los datos generados de su secuencia 
genómica se anotaron en dos grupos de datos, cada uno correspondiendo a uno de los haplotipos, 
constituidos por regiones homólogas altamente polimórficas (Teixeira et al., 2012). Un haplotipo 
es denominado Esmeraldo-like (Esmeraldo, cepa que pertenece a uno de los grupos parentales de 
CL-Brener) y el otro Non-Esmeraldo-like (Aslett et al., 2010). 
1.2.4. Morfología 
El parásito presenta una gran variedad de formas morfológicas a lo largo de su ciclo de 
vida, tanto en el hospedero mamífero como en el invertebrado, reconociéndose cuatro formas 
principales: epimastigotes, tripomastigotes metacíclicos, tripomastigotes sanguíneos y 
amastigotes (Brener, 1992), las cuales son relativamente fáciles de identificar y presentan 
características particulares, descritas a continuación. 
Amastigotes: forma intracelular encontrada en los mamíferos. Tras la infección de células, 
los tripomastigotes metacíclicos se diferencian a amastigotes, proceso conocido como 
amastigogénesis. Los amastigotes pueden replicarse por fisión binaria e incluso infectar nuevas 
células (De Souza, 2002a). Poseen una forma esférica, con muy poca movilidad (Figura 1.3). Miden 
de 2-4 m. El cinetoplasto se observa como un cuerpo oscuro cerca del núcleo. No poseen flagelo 
libre y carecen de membrana ondulante (González Cappa y Durante de Isola, 1994) (Figura 1.4). In 
vitro, la amastigogénesis se favorece al incubar tripomastigotes derivados de cultivo en medio 
ácido (Tomlinson et al., 1995). 
Tripomastigotes sanguíneos: generados a partir de la transformación de amastigotes 
intracelulares, tras varios ciclos de replicación en las células de mamíferos. Se localizan en los 
tejidos o en la sangre de hospederos vertebrados infectados (Figura 1.3). Poseen capacidad 
infectiva y carecen del proceso de división celular. El cinetoplasto se localiza en la parte posterior 
16 
 
al núcleo, usualmente en la porción más posterior del parásito. El flagelo sale del extremo 
posterior y se dobla hacia delante a lo largo del cuerpo del parásito, formando una membrana 
ondulante a lo largo de todo el organismo y emerge en forma libre en su extremo anterior (Figura 
1.4). In vitro, se encuentran en la fase estacionaria de crecimiento de cultivos axénicos del parásito 
(epimastigotes) y en la fase líquida de cultivos celulares (De Souza, 2002b). 
Epimastigotes: encontrados en el tracto digestivo del insecto vector, con capacidad de 
replicación y no infectivos. Tras alimentarse el vector con tripomastigotes sanguíneos encontrados 
en el hospedero mamífero, estas formas pasan a través del intestino del insecto y ahí se 
diferencian a epimastigotes (Figura 1.3). Tienen forma de huso, miden de 20-40 m de largo, su 
cinetoplasto se localiza en la parte anterior al núcleo y se replican mediante fisión binaria. El 
flagelo emerge de la parte media del parásito y forma una membrana ondulante más pequeña que 
la observada en los tripomastigotes (Figura 1.4). In vitro, proliferan logarítmicamente en cultivos 
axénicos (De Souza, 2002a) (Figura 1.3). Estas formas son por mucho las más ampliamente usadas 
en los experimentos de laboratorio (Fernandes et al., 2005; Finzi et al., 2004; Olson et al., 1994; 
Requena et al., 1988), debido en parte a la facilidad de obtener un gran número de células y a la 
menor infraestructura requerida. 
Tripomastigotes metacíclicos: se desarrollan en el intestino posterior (recto) del insecto 
vector tras un proceso de diferenciación a partir de epimastigotes (metaciclogénesis). Son la forma 
infectiva de las células de los vertebrados en los que se introducen. Morfológicamente, son casi 
indistinguibles de los tripomastigotes sanguíneos (Figura 1.3), sin embargo, poseen una 
importante diferencia en la expresión de sus proteínas (Atwood III et al., 2005). In vitro, la 
metaciclogénesis puede ser inducida en epimastigotes sometidos a condiciones de estrés 
nutricional (Contreras et al., 1985). 
17 
 
 
Figura 1.3. Estadios de desarrollo de T. cruzi. El parásito se diferencia en cuatro estadios principales a lo 
lardo de su ciclo de vida, en su paso de un hospedero a otro. Modificado de Atwood III et al., 2005 y 
http://www.fiocruz.br/chagas_esp/cgi/cgilua.exe/sys/start.htm?sid=13. 
 
 
Figura 1.4. Localización característica de algunas estructuras en los diferentes estadios de desarrollo de T. 
cruzi. Se señalan para cada estadio: núcleo (N), cinetoplasto (C), flagelo (F) y bolsa flagelar (BF). Modificado 
de de Souza, 2002a. 
18 
 
1.2.5. Ultraestructura celular 
El estudio de la estructura subcelular de T. cruzi mediante técnicas de microscopía 
electrónica inició tempranamente a principios de la década de los 50. Con el avance y 
perfeccionamiento de las técnicas, estructuras del parásito antes desconocidas, pudieron ser 
observadas y descritas (de Souza, 2008). A continuación, se mencionan algunas de las estructuras 
más relevantes en la biología del parásito (Figura 1.5), algunas de ellas específicas del orden 
Kinetoplastida, otras, específicas de estadios. 
Superficie celular: compuesta por la membrana celular y debajo de ella, por una capa 
constituida de microtúbulos, denominados microtúbulos subpeliculares, los cuales se conectan 
entre ellos y a la membrana, por filamentos cortos. En los tripanosomátidos (incluyendo a T. cruzi), 
la asociación de estos dos componentes es tan fuerte, como en ninguna otra célula eucarionte 
descrita (de Souza, 2002b). 
Flagelo: emerge a partir de la bolsa flagelar y su longitud depende del estadio de 
desarrollo. Posee una estructura clásica de 9+2 microtúbulos (de Souza, 2002a). 
Bolsa flagelar: depresión encontrada en la región anterior del parásito, formada por una 
invaginación de la membrana plasmática. Constituye una región altamente especializada de la 
superficie de los tripanosomátidos, siendo la única región que no presenta la capa de 
microtúbulos; presenta una actividad endo y exocítica intensa (de Souza, 2009). 
Complejo cinetoplasto-mitocondria: posee una sola mitocondria que se extiende a lo largo 
del cuerpo. Localizado en una porción especializada de la matriz mitocondrial y cercano al cuerpo 
basal se encuentra el cinetoplasto, estructura compuesta de un conjunto de fibras de DNA 
(minicírculos) y algunas proteínas asociadas. El cinetoplasto se sitúa cercano al núcleo y su forma y 
19 
 
organización estructural varían de acuerdo al estadio del parásito. Es una estructura diagnóstica 
del orden Kinetoplastida (de Souza, 2009). 
Núcleo: su organización estructural es similar a la observada en otros eucariontes, 
presentando una membrana nuclear típica provista de poros. Existe una evidente continuidad 
entre la membrana nuclear externa y el retículo endoplasmático. En tripomastigotes, el núcleo es 
elongado y se localiza en la porción central de la célula, en epimastigotes posee una forma 
redonda (de Souza, 2002b). 
Nucléolo: cuerpo fibrogranular de forma esférica que se localiza centralmente o 
ligeramente polarizado en el nucleoplasma del núcleo. Posee muy poca cantidad de ADN en 
comparación con el núcleo. Está compuesto de elementos fibrogranulares,dentro de los cuales 
destaca la presencia de ribonucleoproteínas (López-Velázquez et al., 2005). 
Citostoma: estructura específica de los estadios de epimastigote y amastigote cuya función 
es internalizar ciertas macromoléculas (de Souza, 2009). 
Glicosoma: estructura esférica delimitada por una membrana que se distribuye 
azarosamente por todo el citoplasma de la célula. De manera general, exhibe una matriz 
homogénea y ligeramente densa. En dicho organelo se lleva a cabo la glicólisis, entre otras rutas 
metabólicas (de Souza, 2002a). 
Reservosoma: característico de epimastigotes. A pesar de que su morfología puede variar 
dependiendo de las condiciones de cultivo y la cepa utilizada, generalmente es un organelo 
esférico rodeado por una membrana. Caracterizado porque en dicho organelo se acumulan todas 
las macromoléculas que fueron ingeridas por el parásito a través de un proceso endocítico y el 
cual desaparece gradualmente cuando los epimastigotes son incubados en un medio de cultivo 
pobre en nutrientes (de Souza, 2002a). 
 
20 
 
 
Figura 1.5. Ultraestructura de T. cruzi. Se muestran las principales estructuras subcelulares del estadio de 
epimastigote. Modificado de de Souza, 2008. 
 
 
1.2.6. Ciclo de vida 
Al ser un organismo digenético, T. cruzi presenta un complejo ciclo de vida (Figura 1.6). El 
ciclo comienza cuando un vector sin infectar se alimenta de un mamífero infectado, que al tener 
tripomastigotes circulando en su torrente sanguíneo, son ingeridos por el vector (De Souza, 
2002a). Dentro de la chinche, y a lo largo de su tracto digestivo, el parásito sufre una serie de 
transformaciones antes de ser expulsado en las heces (Brener, 1992). En el estómago del insecto, 
la mayoría de los tripomastigotes ingeridos se transforman a epimastigotes y algunos se 
redondean formando amastigotes. A mitad del intestino, los epimastigotes se replican mediante 
fisión binaria, los cuales se adhieren a las células del intestino mediante hemidesmosomas (De 
Souza, 2002b). Finalmente, aproximadamente 2 semanas después llegan al recto, donde una cierta 
21 
 
proporción de los epimastigotes se convierten en tripomastigotes metacíclicos, los cuales son 
eliminados en las heces y la orina del vector. De esta forma, el ciclo se cierra cuando el vector 
infectado es ahora capaz de transmitir el parásito a un hospedero vertebrado. 
La transmisión se produce mientras el vector se alimenta, en general, pican en una zona 
expuesta de la piel como la cara, piernas o manos. Al estarse alimentando, las chinches defecan 
cerca de la picadura, depositando en las heces y orina a los tripomastigotes metacíclicos, los cuales 
son incapaces de atravesar la piel intacta, por lo que entran en el organismo a través de 
excoriaciones de la piel o a través de las mucosas. Generalmente, las excoriaciones son formadas 
por el proceso de rascado en el sitio de la picadura. Así, un individuo se infecta cuando se frota 
instintivamente y empuja las heces hacia la picadura, los ojos, la boca o alguna lesión cutánea 
abierta. Una vez dentro del hospedero vertebrado, los tripomastigotes pueden invadir 
prácticamente cualquier tipo de célula nucleada (fagocítica y no fagocítica) (González Cappa y 
Durante de Isola, 1994). En el proceso de invasión hay una fase de reconocimiento y una de 
penetración. Seguido el reconocimiento, los tripomastigotes capaces de entrar a la célula 
parasitada son encapsulados en una vacuola parasitófora, de la cual escapan después de un 
tiempo (hasta varias horas) hacia el citosol (Hall, 1993). Una vez en el citoplasma, los 
tripomastigotes pierden su flagelo y se transforman a amastigotes, los cuales se multiplican 
intracelularmente por fisión binaria. Cuando los amastigotes casi llenan la célula, se transforman a 
tripomastigotes y tras romper la célula, son liberados a los espacios intersticiales y al torrente 
sanguíneo, donde tienen la capacidad de invadir otras células, en las que se transformarán de 
nuevo en amastigotes, repitiéndose indefinidamente el ciclo de infección (Brener, 1992). 
22 
 
 
Figura 1.6. Ciclo de vida de T. cruzi. Al alternar su ciclo de vida en dos hospederos distintos, el invertebrado y 
el vertebrado, es un organismo digenético. El ciclo comienza cuando una chinche no infectada se alimenta 
de un vertebrado infectado (1), ingiriendo tripomastigotes, los cuales después de una serie de 
transformaciones se convierten en tripomastigotes metacíclicos (2). Éstos últimos son depositados en las 
heces (3) y el ciclo finaliza cuando ésta chinche infectada transmite el parásito a un vertebrado no infectado 
(4), en el cual los tripomastigotes metacíclicos se diferencían a amastigotes (5) y nuevamente a 
tripomastigotes, que pueden invadir otras células indefinidamente (6). Modificado de 
http://www.who.int/tdr/diseases/chagas/lifecycle/htm. 
 
1.3. Condiciones de estrés 
Para completar su ciclo de vida, T. cruzi tiene que adaptarse a ambientes diversos y 
fluctuantes al pasar de un hospedero a otro (Requena et al., 1992), así como a cambios asociados 
con el paso de un ambiente extracelular a uno intracelular (Zilberstein y Shapira, 1994). Debido a 
que cada hospedero tiene una fisiología particular, existe una clara heterogeneidad en las 
condiciones de crecimiento del parásito. Así, se encuentra expuesto a condiciones fisicoquímicas 
que difieren significativamente entre el hospedero invertebrado y el vertebrado, generándole con 
ello, un estrés celular. El estrés celular ha sido definido como cualquier modificación en los 
parámetros ambientales que lleva a la generación de una respuesta adaptativa (fisiológica, 
23 
 
genética o epigenética) en los organismos. Actualmente, se le clasifica en dos grandes grupos: 
estrés abiótico (incluyendo el físico y el químico) y estrés biótico (Thammavongs et al., 2008). 
Algunos de los principales tipos de estrés a los que está expuesto T. cruzi a lo largo de su ciclo de 
vida se mencionan en la Figura 1.7. 
 
Figura 1.7. Factores de estrés celular a los que se enfrenta T. cruzi durante su ciclo de vida. En esta 
ilustración se ejemplifican algunos de los tipos de estrés más comunes, los cuales están señalados por una 
estrella. Ver texto para referencias. 
 
 
1.3.1. Estrés ácido 
En la célula mamífera, T. cruzi experimenta una exposición a pH ácido, pues la vacuola 
parasitófora (estructura donde se aloja el parásito tras su introducción en la célula), se acidifica 
con el tiempo (Hall, 1993). Por otro lado, en el insecto vector, el parásito también está expuesto a 
pH ácido debido a que el pH del material excretado (heces y orina), en donde hay tripomastigotes 
24 
 
metacíclicos y epimastogotes, varía entre 5.7-8.9, dependiendo del estado de alimentación del 
insecto (Kollien et al., 2001). 
1.3.2. Estrés nutricional 
Otro tipo de estrés encontrado por el parásito a lo largo de su ciclo de vida, 
particularmente en el tracto digestivo del insecto es el estrés nutricional. Se ha demostrado, que el 
estado nutricional del vector promueve la aparición de distintos estados de desarrollo del parásito, 
de tal forma que la falta de alimento, induce la metaciclogénesis (Contreras et al., 1985; Kollien y 
Schaub, 1998). 
1.3.3. Estrés oxidante 
El parásito puede estar expuesto a este tipo de estrés al invadir a cada uno de sus dos 
hospederos, ya que estos últimos montan una respuesta celular para defenderse de los 
patógenos. En el hospedero mamífero, se producen distintas especies reactivas de oxígeno (EROs) 
como consecuencia de la activación de la enzima NADPH oxidasa en aquéllos macrófagos que 
internalizaron dentro de su fagosoma a tripomastigotes metacíclicos. Durante el proceso de 
fagocitosis, la enzima produce grandes cantidades del radical superóxido (O2
-), el cual puede, ya 
sea espontáneamente o por actividad enzimática, dismutar a peróxido de hidrógeno (H2O2). 
Además, en la presencia de iones metálicos, el H2O2genera al radical hidroxilo (
-OH) (Piacenza et 
al., 2009). Por esta razón, T. cruzi experimenta una exposición a distintos radicales libres durante 
su estancia en el vertebrado. En el caso de los invertebrados, como parte de la respuesta inmune 
contra patógenos se ha descrito la producción de péptidos antimicrobianos, así como la 
generación de procesos de melanización y encapsulación, mecanismos asociados con la 
producción de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, entre otros (Castillo et al., 2011). En el 
caso de T. cruzi, hay evidencia de la producción de péptidos antimicrobianos en respuesta a la 
25 
 
entrada del parásito (Waniek et al., 2011), sin embargo, no se ha demostrado la producción de 
EROs por parte del insecto vector en presencia de T. cruzi. 
1.3.4. Estrés por calor 
El paso de un hospedero a otro expone a T. cruzi a distintas temperaturas de crecimiento. 
En el caso de los insectos, al ser organismos poiquilotermos, no son capaces de regular su 
temperatura, por lo que ésta puede variar dependiendo de la temperatura del ambiente (Feder, 
1999). En el hospedero mamífero, el rango de temperatura que puede encontrar el parásito va de 
37 °C (humano) a 40.5 °C en animales domésticos (bovinos, cerdo) y silvestres (armadillo) (Escobar 
y Amezcua, 1981). Asimismo, ciertos mamíferos pueden presentar estados febriles agudos como 
consecuencia de la enfermedad de Chagas, lo que lleva a un aumento significativo en la 
temperatura corporal interna. Así, uno de los principales factores ambientales a los que tiene que 
exponerse el parásito durante el transcurso de su ciclo de vida es al aumento brusco en la 
temperatura, la cual pasa de 22-28 °C cuando está en el vector, a temperaturas superiores a los 37 
°C una vez que ha entrado al hospedero mamífero, generándose en éste proceso un estrés por 
calor o choque térmico (Olson et al., 1994). 
1.4. Genes de respuesta a estrés 
A lo largo de su historia evolutiva, la tierra ha sufrido cambios considerables en sus 
ambientes físico, químico y/o biológico. A la par de las fluctuaciones ambientales, las formas de 
vida antiguas tuvieron que experimentar una serie de adaptaciones que les permitiera subsistir a 
las nuevas condiciones (a veces hostiles) de la tierra, evolucionando finalmente a las formas de 
vida actuales. Para lograrlo, los organismos experimentaron una serie de modificaciones en su 
estructura genómica, siendo una de ellas, la evolución de los genes de respuesta a estrés, los 
26 
 
cuales representan una de las secuencias genómicas más conservadas y abundantes en la 
naturaleza. Distintas condiciones de estrés inducen la transcripción de estos genes, llevando a la 
expresión de proteínas específicas responsables de contrarrestar los efectos adversos provocados 
por ambientes hostiles o desfavorables para la viabilidad celular. Dichas proteínas pueden tener 
una gran variedad de funciones y mecanismos de acción. Un grupo particular de estas proteínas 
expresadas en respuesta a diversos tipos de estrés son las proteínas de choque de calor o HSPs, 
por sus siglas en inglés (Heat Shock Proteins) (Ray, 1999). 
1.4.1. HSPs 
Constituyen un grupo de proteínas muy conservadas en todos los organismos y cuya 
función principal es la de actuar como chaperonas moleculares. Básicamente, las chaperonas han 
sido definidas como una familia de proteínas celulares que participan en el correcto plegamiento 
de otros polipéptidos y en algunos casos en su multimerización en estructuras oligoméricas, y cuya 
interacción con otras proteínas es sólo transitoria, pues las HSPs no son componentes de las 
estructuras funcionales finales de las proteínas (Narberhaus, 2002). Se unen a proteínas sustrato 
no nativas o parcialmente plegadas para promover su renaturalización, plegamiento correcto, para 
prevenir su agregación irreversible o para desagregarlas cuando se agregan. También pueden 
mantener a proteínas sustrato en una conformación no plegada con el fin de facilitar su 
traslocación a través de las membranas celulares (Waters et al., 1996). Asimismo, al término 
chaperona se le ha ampliado la clase de sustratos a los cuales puede transportar y/o plegar 
correctamente, el cual abarca desde iones metálicos hasta ácidos nucleicos (Lund et al., 2003). 
Durante condiciones de crecimiento normales, un evento crítico en la biogénesis de las proteínas 
es el de generar una estructura tri-dimensional funcional a través del plegamiento apropiado de la 
secuencia primaria. Dentro de estas condiciones, las chaperonas moleculares actúan en el sistema 
27 
 
de control de calidad de las proteínas tanto co-traduccionalmente como post-traduccionalmente. 
Sin embargo, en condiciones de estrés de calor, la gran parte de las proteínas que están siendo 
sintetizadas necesitan ahora ser plegadas con la ayuda de las chaperonas. Además, en dicha 
condición, debido a que muchas de las proteínas pre-existentes son lábiles al calor, y por lo tanto 
propensas a desnaturalizarse, la síntesis de proteínas de estrés calórico tiene que ser aumentada 
para asistir en la renaturalización de todas esas proteínas, por lo que el control de calidad de las 
proteínas en éstas circunstancias se vuelve crucial para mantener el metabolismo y viabilidad 
celulares (Narberhaus, 2002). Así, las HSPs pueden ser expresadas tanto constitutivamente como 
en respuesta a estrés, siendo inducidas en una variedad de condiciones que pueden ser divididas 
en tres tipos: fisiológicas (ciclo celular, desarrollo, diferenciación celular, etc.); patológicas 
(infecciones, autoinmunidad, etc.); y medioambientales (estrés por aumento en calor, estrés por 
frío, estrés oxidativo, entre otros) (Prohászka y Füst, 2004). 
De acuerdo con su aparente masa molecular estimada a través de su corrimiento en geles 
desnaturalizantes de poliacrilamida, las HSPs han sido tradicionalmente agrupadas en cinco 
familias principales: HSP100, HSP90, HSP70, HSP60 y small-HSPs (sHSPs) (Lindquist y Craig, 1988). 
Las primeras cuatro familias son también conocidas como HSPs de alto peso molecular (40 ≥ 100 
kDa), mientras que las sHSPs son frecuentemente denominadas como proteínas de bajo peso 
molecular (<40 kDa). En bacterias existen dos familias adicionales: HSP33 y las charoninas de una 
sola cadena. A pesar de formar un conjunto de familias de proteínas separadas por características 
estructurales y mecanismos de acción, comparten la misma función general de chaperonas 
moleculares (Narberhaus, 2002). Algunos miembros de la familia de HSPs de pesos moleculares 
bajos están evolutivamente relacionados a la proteína -cristalino de los vertebrados (Ingolia y 
Craig, 1982) mientras que otros, como la Hsp12 y Hsp9 de levadura, no lo están (de Jong et al., 
28 
 
1998). El -cristalino es una de las proteínas más abundantes del ojo (cristalino) de los 
vertebrados, donde tiene un papel estructural, garantizando una refracción y transparencia 
adecuadas (Horwitz, 2003). Las proteínas de bajo peso molecular relacionadas con el -cristalino 
de los vertebrados son, por lo tanto, conocidas como -HSPs o -cristalino-sHSPs (de Jong et al., 
1998) y son de las que nos ocuparemos en adelante. 
1.4.2. -HSPs 
Las -HSPs poseen masas moleculares monoméricas pequeñas, las cuales van de 12 a 43 
kDa, la mayoría teniendo de 14 a 27 kDa (Narberhaus, 2002), sin embargo, una de las 
características distintivas de la gran mayoría de los miembros de este grupo de proteínas es su 
capacidad para organizarse en grandes estructuras multiméricas u oligómeros, los cuales pueden 
tener entre 9 a 50 subunidades, alcanzando una masa de 800 kDa o más (Haslbeck, 2002; MacRae, 
2000). Existen algunas excepciones, como son tres -HSPs de Caenorhabditis elegans, las cuales 
forman únicamente tetrámeros y un monómero (Nakamoto y Vígh, 2007). 
En condiciones de estrés celular, donde se genera la desnaturalización de proteínas 
nativas, las -HSPsposeen un papel fundamental en la defensa del organismo y su función de 
chaperona molecular se diferencia de las HSPs de alto peso molecular, en que las -HSPs no 
requieren de energía para llevar a cabo su función y tampoco renaturalizan por completo a las 
proteínas no nativas. En situaciones de estrés, las -HSPs se unen y forman complejos muy 
estables con proteínas desnaturalizadas, con lo cual mantienen a éstas últimas en un estado 
competente de plegamiento, evitando su agregación irreversible. Tras desaparecer la condición de 
estrés, dichas proteínas desnaturalizadas unidas a las -HSPs son liberadas, ya sea 
espontáneamente, o por la acción de sistemas de chaperonas dependientes de energía como 
HSP60, HSP70 o HSP100, las cuales renaturalizarán a las proteínas liberadas, formando parte por 
29 
 
lo tanto, de una red multichaperona (Nakamoto y Vígh, 2007; Sun y MacRae, 2005). El mecanismo 
por el cual las -HSPs se unen a proteínas desnaturalizadas muy probablemente esté basado en 
interacciones hidrofóbicas, pues muchas -HSPs exponen residuos hidrofóbicos a la superficie tras 
un estrés de calor, los cuales se tornan disponibles para la unión de las proteínas blanco (MacRae, 
2000). En cuanto a la preferencia por el sustrato, estas proteínas parecen ser más bien 
promiscuas, pues pueden unirse a una amplia variedad de proteínas, con intervalos de masa de 4 a 
100 kDa. Asimismo, las -HSPs representan el grupo de chaperonas con la más alta eficiencia por 
la unión al sustrato (Haslbeck, 2002). 
Respecto al mecanismo de activación de las -HSPs se han identificado dos modelos, el 
primero parece estar regulado por la disociación de los oligómeros y el otro en el rearreglo de 
éstos, en una manera dependiente de temperatura. En el primer modelo, en condiciones normales 
las -HSPs existen como oligómeros inactivos, tras un estrés térmico, los oligómeros se disocian 
en dímeros activos, los cuales son ahora capaces de unirse a las proteínas desnaturalizadas. En el 
segundo modelo, en condiciones normales las -HSPs se encuentran en forma de oligómeros 
inactivos; después de un estrés térmico, dichos oligómeros sufren cambios conformacionales que 
provocan que éstos pasen de un estado de baja afinidad por el sustrato (condiciones normales) a 
un estado de alta afinidad (estrés térmico) o activo, con capacidad para unirse a proteínas 
desnaturalizadas (Nakamoto y Vígh, 2007). 
Las -HSPs constituyen un grupo de chaperonas moleculares ampliamente distribuidas en 
la escala filogenética, como lo demuestra su ubicua presencia en organismos pertenecientes a los 
tres dominios (Bacteria, Arquea y Eucaria) y, aunque se les ha encontrado en la gran mayoría, 
existen algunos seres vivos que no contienen genes que codifiquen para este clase de proteínas 
(Narberhaus, 2002). Los estudios filogenéticos indican una divergencia muy temprana en la 
30 
 
evolución de este grupo de proteínas (Waters et al., 1996). La mayor parte de los procariontes, así 
como los eucariontes unicelulares, tienen usualmente de uno a dos genes que codifican para -
HSPs; en contraste, es frecuente encontrar un número mayor de genes, a veces considerable, en la 
mayoría de los eucariontes superiores (Haslbeck et al., 2005). La similitud de secuencia entre los 
miembros de este grupo de proteínas es muy baja en comparación con otras familias de HSPs que 
han divergido a una tasa mucho menor, como la HSP70 y la HSP90 (Plesofsky-Vig et al., 1992; 
Waters et al., 1996), por lo que, estrictamente, constituyen una superfamilia, ya que la identidad 
de secuencia general entre sus miembros es de aproximadamente ≤50% (de Jong et al., 1998). A 
pesar de la gran variación en sus secuencias poseen 2 ó 3 dominios estructurales, de los cuales el 
más conservado tiene de 80-100 residuos de aminoácidos y es conocido como el dominio -
cristalino. Este dominio es determinante del grupo de las -HSPs y está localizado en el extremo 
carboxilo terminal. Precediendo al -cristalino se encuentra el dominio amino terminal, 
hidrofóbico y pobremente conservado, variando extremadamente en longitud (desde 24-246 
aminoácidos) y secuencia (de Jong et al., 1998). Adyacente al dominio -cristalino se encuentra 
frecuentemente una extensión carboxilo terminal flexible, de longitud (generalmente corta) y 
secuencia variable (Haslbeck, 2002; MacRae, 2000). Esta extensión puede estar prácticamente 
ausente en algunos organismos (con 1-2 residuos de aminoácidos) y en otros puede tener hasta 49 
residuos (de Jong et al., 1998) (Figura 1.8). 
A pesar de la diversidad en la estructura primaria, la estructura secundaria de las -HSPs 
es conservada, siendo rica en hojas -plegadas en el domino -cristalino (de Jong et al., 1998). Lo 
anterior se refleja en la estructura terciaria de las proteínas, pues el dominio -cristalino forma 
una estructura -sandwich compacta conservada compuesta de dos hojas beta antiparalelas y que 
además posee la capacidad de dimerizarse (Figura 1.9). Éste dímero representa el bloque de 
31 
 
construcción de los oligómeros y la unidad intercambiable más pequeña de muchas -HSPs 
(Haslbeck, 2002). 
 
Figura 1.8. Dominios estructurales de las -HSPs. A) Estructura general representada por el dominio amino 
terminal (N), el dominio -cristalino y el dominio carboxilo terminal (C). B) Comparación esquemática de la 
longitud (mínima y máxima) en residuos de aminoácidos (aa) reportada para cada uno de estos dominios en 
distintos organismos, siendo la región más conservada en longitud y secuencia, el dominio -cristalino. Para 
el dominio N, la longitud de 24 aa corresponde a la Hsp12.3 de C. elegans y la de 246 aa corresponde a 
Hsp42p de Saccharomyces cerevisiae. Para el dominio C, la longitud mínima de 1 aa corresponde a una 
familia de cuatro -HSPs presente en C. elegans y la longitud de 49 aa corresponde a dos -HSPs: p26 de 
Artemia y Hsp27 de Drosophila. Información tomada de de Jong et al., 1998. 
 
 
 
Figura 1.9. Estructura terciaria de la proteína HSP16.9 de trigo. Diagrama en listones mostrando el 
monómero de HSP16.9, donde el dominio -cristalino conforma una estructura -sandwich compuesta de 
dos hojas beta antiparalelas. El dominio amino terminal (N) es mostrado en verde, mientras que el carboxilo 
terminal (C) y el -cristalino son mostrados en rojo. Tomado de van Montfort et al., 2001. 
32 
 
1.4.2.1. -HSPs en parásitos 
Desde la descripción de que las HSPs formaban parte de la respuesta al choque de calor 
inducida en ciertas condiciones en una gran variedad de organismos (Lindquist y Craig, 1988), se 
encontró que los parásitos no eran la excepción. El interés por el conocimiento de la expresión de 
HSPs en patógenos se debió en parte a que muchos de los principales parásitos de importancia 
médica poseen ciclos de vida complejos, los cuales implican el paso por distintos hospederos y la 
transformación hacia distintos estadios de desarrollo. 
De todas las familias de HSPs, la de las -HSPs ha sido la que menos atención ha recibido 
en el estudio de la expresión de HSPs en parásitos, quizá en parte por la dificultad de encontrarlas 
dada su baja similitud de secuencia, en comparación con las HSPs de altos pesos moleculares. No 
obstante, se ha logrado determinar la expresión y/o actividad de algunas -HSPs en poco menos 
de una veintena de distintas especies de parásitos; en otros, aunque no se ha podido comprobar 
ninguna actividad específica, los estudios realizados dan cuenta de su secuencia y/o localización. 
En la Tabla 1.1 se enlistan las -HSPs que hasta el momento han sido descritas en 
parásitos pertenecientes a distintos grupos taxonómicos, en los cuales se ha sugerido o 
demostrado el papel de algún miembro de esta familia de proteínas en la biología del parásito. Las 
principales actividades que se han reportado son: sobreexpresión en condiciones de estrés o en 
estadios de desarrollo específicos; antígenoen la enfermedad; estimuladoras de la respuesta 
inmune; e inmunidad protectora. 
33 
 
Tabla 1.1. Lista de -HSPs descritas en parásitos. 
 
Organismo Enfermedad a-HSP Actividad en e l parásito Referencia 
Antí¡:eno en Estimulador Inmunidad Otra 
Sobreexpresión 
enfermedad respuesta protectora 
Estrés / Estadio 
inmune 
FLAGELADOS 
G;ard;a /amblia Giardiosis ORF-C4 + 122 
Le;shmon;o omazonens;s Leishmaniosis HSP20 + 112 
Trypanosoma cruz; Chagas SHSP16 + 128 
APICOMPlEXA 
Babes;a b;gem;na Babesiosis bovina Bbg20 + 17 
Bobes;o bov;s Babesiosis bovina Bb020 + + 17, 91 
Babes;a d;vergens Babesiosis BdHSP-20 + + + + 70, 113, 161 
Toxop/osma gondii Toxoplasmosis HSP20 + 35 
Toxop/asma gondii Toxoplasrnosis HSP21 + 35 
Toxop/osma gondii Toxoplasmosis HSP28 + + 35 
Toxop/asma gondii Toxoplasrnosis HSP29 + 35 
Toxop/osmo gondii Toxoplasmosis HSP30 + + 12, 13, 111, 
116, 181 
PLATHElMINTOS 
Ech;nococcus mu/tilocu/or;s Hidatidosis HSP20 + 87 
Fasc;o/a hepat;ca Fasciolosis Fh-HSP3Sa + + 115 
5ch;stosoma manson; Esquistosomosis p40 + + + 18, 120 
5ch;stosoma manson; Esquistosornosis p40-2 + 21 
Toen;o sog;nato Cisticercosis/ Tsp36 + 9 
Teniosis 
Taen;a solium Cisticercosis/ Tsol- + 57 
Teniosis SHSP3S.6 
NEM ÁTODOS 
Brug;a ma/ay; Filariasis Brn-HSP-s1 + + 133 
Brug;o m%y; Filariasis Bm - + + 68 
HSP12.6 
Brug;a pahang; Afecta felino s BpHSP7 + + 42,81, lSS 
D;rofilor;o ;mm;t;s Dirofil ariasis p27 + 91 
Haemonchus contortus Afecta ganado HSP20 + 75 
N;ppostrongy/u s brosiliens;s Afecta roedores Nb-HSP20 + 159 
N;ppostrongyfus brasiliens;s Afe cta roedores Nb- + + 4 
HSP12.6 
Ostertog;o ostertog; Afecta ganado OoHSP18 + + + 167 
Tr;ch;nella sp;ralis Triquinelosis Ts-sHSP + + 180 
34 
 
II. ANTECEDENTES 
La respuesta a estrés se ha estudiado extensivamente y de manera general, en organismos 
que tienen una sola temperatura óptima de crecimiento, sin embargo, existe menor información 
sobre dicha respuesta en organismos digenéticos, que cambian constantemente de condiciones 
ambientales para completar su ciclo de vida, como sería T. cruzi. 
El estudio de la respuesta al estrés ácido, nutricional, oxidante o por calor en T. cruzi, ha 
sido abordado desde distintos enfoques: 1) determinando la transcripción o expresión de genes 
que codifican para proteínas de la familia de las HSPs en respuesta a estrés (Alcina et al., 1998; 
Campos et al., 2012; de Carvalho at al., 1990; de Carvalho et al.; 1994; Fernandes et al., 2005; 
Giambiagi-deMarval et al., 1996; Graefe et al., 2002; Martin et al., 1993; Olson et al., 1994; 
Requena et al., 1992; Tibbetts et al., 1998; Schmidt et al., 2011); 2) identificando la expresión y/o 
participación de proteínas o enzimas distintas a las HSPs, así como de metabolitos, en condiciones 
post-estrés (Campos et al., 2011; Finzi et al., 2004; Giese et al., 2008; Pereira et al., 2003); 3) 
determinando vías metabólicas implicadas en la resistencia al estrés celular (Magdaleno et al., 
2009; Magdaleno et al., 2011); 4) definiendo respuestas bioquímicas específicas generadas como 
consecuencia del estrés (Cassola et al., 2007; Martínez-Espinosa, 2010; Názer et al., 2012); y 5) 
determinando que ciertos tipos de estrés celular llevan a la diferenciación del parásito, 
principalmente en el estadio de tripomastigotes (Contreras et al., 1985; Tomlinson et al., 1995; 
Kollien y Schaub, 1998). Sin embargo, en la mayoría de estos trabajos no se describen los efectos 
que los diferentes tipos de estrés tienen en la biología celular de los parásitos y en sólo unos pocos 
estudios se ha determinado la ultraestructura de parásitos sometidos a alguno de estos tipos de 
estrés (Figueiredo et al., 2000; Alvarez et al., 2008). Además, de la caracterización de las 
35 
 
respuestas moleculares generadas como consecuencia del estrés, se deben determinar también 
los efectos fisiológicos producidos en el parásito, lo que permitirá tener un panorama más 
completo en el entendimiento de cómo el parásito se adapta a diversas condiciones hostiles. 
Respecto a las proteínas de la familia de HSPs que se han caracterizado a nivel genético o 
de proteína en T. cruzi se encuentran las siguientes: HSP104 (Campos et al., 2012); HSP90 (Dragon 
et al., 1987; Graefe et al., 2002); HSP70 (Giambiagi-de Marval et al., 1996; Martin et al., 1993; 
Olson et al., 1994; Requena et al., 1988, Requena et al., 1992) y su co-chaperona HSP40 (Tibbetts 
et al., 1998); HSP60 (Giambiagi-de Marval et al., 1993; Giambiagi-de Marval et al., 1996) y su co-
chaperona HSP10 (Fernandes et al., 2005). Todas las proteínas anteriores pertenecen a familias de 
HSPs de pesos moleculares altos, sin embargo, nada había sido descrito sobre las proteínas de 
pesos moleculares bajos, en particular las -HSPs, hasta antes del presente estudio. Ya que las -
HSPs llevan a cabo su función de chaperona molecular de manera diferencial en comparación con 
las HSPs de pesos moleculares altos, su estudio en T. cruzi es relevante, ya que no han sido 
estudiadas extensivamente en parásitos digenéticos que constantemente se enfrentan a estrés 
celular. 
36 
 
III. JUSTIFICACIÓN 
En la naturaleza, el parásito T. cruzi se enfrenta constantemente a condiciones fluctuantes 
de crecimiento durante el transcurso de su ciclo de vida. Sin embargo, las respuestas fisiológicas o 
moleculares inducidas como consecuencia de dichos cambios medioambientales no han sido 
completamente caracterizadas o son desconocidas en su totalidad, a pesar de que constituyen 
estudios básicos sobre la biología de parásito. El estudio del efecto que diversos tipos de estrés 
producen en T. cruzi, ayudará al mejor entendimiento de su adaptación, que finalmente deriva en 
su supervivencia y éxito en la transmisión. Asimismo, el descubrimiento de moléculas y/o procesos 
implicados en este proceso biológico del parásito, aumentará la probabilidad de encontrar alguna 
alternativa terapéutica. Unas de las moléculas de interés para estudiar en el parásito son las 
proteínas de estrés, ya que su papel puede ser fundamental en las condicoines adversas a las que 
se enfrenta el parásito de manera asidua. 
37 
 
IV. HIPÓTESIS 
Cada condición particular de estrés celular, producirá alteraciones diferentes y 
distinguibles en la biología de los parásitos. Además, la proteína SHSP16 se expresará en 
condiciones de estrés. 
 
 
V. OBJETIVOS 
Objetivo general 
 Describir el efecto de distintas condiciones de estrés en la biología del parásito 
Trypanosoma cruzi, incluyendo la caracterización de la proteína SHSP16. 
Objetivos particulares 
 Determinar los efectos del estrés sobre la movilidad de los parásitos. 
 Definir si el estrés induce cambios en la morfología de los parásitos. 
 Caracterizar la ultraestructura de los parásitos en condiciones de estrés. 
 Determinar la cantidad de la proteína SHSP16 en parásitos enfrentados a estrés. 
 Identificar la localización subcelular de la proteína SHSP16. 
 Determinar la relevancia de la proteína SHSP16 en el curso de la enfermedad de Chagas. 
 Generar una mutante nula para el gen SHSP16 en T. cruzi. 
38 
 
VI. MATERIALES Y MÉTODOS 
6.1. Cultivos celulares 
6.1.1. Epimastigotes 
Los epimastigotes de la cepa Querétaro (Qro) de T. cruzi (Espinoza et al., 1998) se 
mantuvieron rutinariamente en medio de infusión de hígado y triptosa o LIT, por sus siglas en 
inglés (Liver Infusion Tryptose) (Chiari y Camargo, 1984), pH 7.2, suplementado con 5 g/ml de 
hemina y suero fetal bovino (SFB) al 10 % e inactivado (56 °C por 1 hora), en una incubadora a 
28°C. Los epimastigotes de la cepa CL-Brener (Brener y Chiari, 1963), proporcionados en el 
laboratorio de la Dra. Rebeca Manning Cela, ubicado en el Departamento de Biomedicina 
Molecular del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional 
(CINVESTAV) Unidad Zacatenco, se mantuvieron a la misma temperatura y el mismo medio de 
cultivo, exceptoporque el último se suplementó con 25 g/ml de hemina. 
6.1.2. Tripomastigotes 
Se obtuvieron al infectar cultivos de células Vero (células epiteliales de riñón de mono 
verde Africano) sanas, con tripomastigotes sanguíneos provenientes de ratones infectados con la 
cepa Querétaro. Tras el establecimiento y la consumación de un ciclo de infección en las células 
Vero, en el que se transformaron a amastigotes y de nuevo a tripomastigotes, éstos se obtuvieron 
por la centrifugación de dichos cultivos a 3,000 g a 4 °C durante 10 minutos. 
6.1.3. Células Vero 
Los cultivos en monocapa de células Vero se mantuvieron de manera habitual en medio D-
MEM, por sus siglas en inglés (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) (GIBCO, 12100-038), pH 7.2, 
39 
 
suplementado con L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, solución de vitaminas 1 %, solución 
de aminoácidos no esenciales 1 %, penicilina-estreptomicina (1,000 U/ml-1 mg/ml) y SFB al 10 %, a 
37 °C y una atmósfera húmeda de 5 % de CO2. 
6.1.4. Bacterias 
Las células transformadas de Escherichia coli (One Shot MAX Efficiency) DH5-T1 
(Invitrogen, 12297-016) fueron incubadas en medio Luria-Bertani (LB) sólido o líquido (Sambrook 
et al., 1989), suplementado con ampicilina (Amp) (Sigma-Aldrich, A0166) (100 g/ml) a 37 °C. 
6.2. Ensayos de estrés 
Las condiciones usadas para estudiar el efecto del estrés en los epimastigotes y 
tripomastigotes de T. cruzi se detallan en las Tablas 6.1 y 6.2, respectivamente, donde se indican 
los medios de cultivo (tratamiento) utilizados para inducir el estrés, así como la duración de la 
exposición a dicho tratamiento. 
6.2.1. Estrés en epimastigotes 
Todos los ensayos de estrés se realizaron con cultivos de epimastigotes en fase 
exponencial de crecimiento (30x106 células/ml  5x106 células/ml). El número de parásitos de cada 
cultivo se contó con ayuda de un hemocitómetro y dicho cultivo se dividió en partes iguales para 
cada una de las condiciones experimentales, es decir, el control y los distintos tratamientos. 
Transcurrido el tiempo de incubación de cada estrés, los cultivos tratados, así como el cultivo 
control, se centrifugaron a 3,000 g a 4 °C por 10 minutos y se lavaron 2 veces con amortiguador 
fosfato salino o PBS, por sus siglas en inglés (Phosphate Buffer Saline) (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, 
10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4), pH 7.2. Finalmente, se desechó el sobrenadante y se determinó 
el peso húmedo del botón de células obtenido. En todos los casos, los epimastigotes control 
40 
 
fueron aquéllos incubados en medio LIT a 28 °C. En la Tabla 6.1 se resumen las distintas 
condiciones usadas en este estadio del parásito. 
6.2.2. Estrés en tripomastigotes 
Todos los ensayos de estrés se realizaron con tripomastigotes obtenidos de cultivos 
celulares de células Vero resembradas 2-3 días antes. Los cultivos fueron contados cada vez con un 
hemocitómetro y divididos con un número igual de parásitos para su crecimiento en condiciones 
control y en condiciones de estrés. Antes de someterlos a la condición de estrés, los parásitos se 
lavaron de la misma forma como se describe en la sección 6.2.1. En todos los casos, los 
tripomastigotes control se incubaron en medio D-MEM a 37 °C y 5 % de CO2. En la Tabla 6.2 se 
resumen las distintas condiciones usadas para los tripomastigotes. 
 
Tabla 6.1. Condiciones de estrés celular en cultivos de epimastigotes de T. cruzi. 
 
LIT, Medio de infusión de hígado; TAU, Medio de orina artificial de Triatomino, por sus siglas en inglés 
(Triatomine Artificial Urine) estéril (NaCl 190 mM, KCl 17 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 2 mM, amortiguador de 
fosfatos pH 6.0) (Contreras et al., 1985). AI, amortiguador de incubación (KCl 5 mM, NaCl 80 mM, MgCl2 2 
mM, Na2HPO4 16.2 mM, NaH2PO4 3.8 mM, albúmina de suero bovino o BSA, por sus siglas en inglés (Bovine 
Serum Albumin) al 0.15 %) (Carnieri et al., 1993) adicionado con 80 ó 160 M de H2O2 al 30 %. 
 
 
41 
 
Tabla 6.2. Condiciones de estrés celular en cultivos de tripomastigotes de T. cruzi. 
 
DMEM, Dulbecco´s Modified Eagle Medium (GIBCO). TAU, Medio de orina artificial de Triatomino, por sus 
siglas en inglés (Triatomine Artificial Urine) estéril (NaCl 190 mM, KCl 17 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 2 mM, 
amortiguador de fosfatos pH 6.0) (Contreras et al., 1985). AI, amortiguador de incubación (KCl 5 mM, NaCl 
80 mM, MgCl2 2 mM, Na2HPO4 16.2 mM, NaH2PO4 3.8 mM, albúmina de suero bovino o BSA, por sus siglas 
en inglés (Bovine Serum Albumin) al 0.15 %) (Carnieri et al., 1993) adicionado con 80 ó 160 M de H2O2 al 30 
%. 
6.3. Técnicas microscópicas 
6.3.1. Observación y captura de las imágenes en el microscopio óptico 
El conteo de las formas de los parásitos, así como el número de móviles e inmóviles, se 
realizaron en preparaciones en fresco con ayuda de un hemocitómetro. 
Las preparaciones permanentes se obtuvieron al colocar una gota de 20 l de los 
diferentes cultivos, sobre pozos de portaobjetos Teflon Printed Slide de 10 pozos (6 mm de 
diámetro/pozo) (Electron Microscopy Sciences, 63424-06), permitiéndoles adherirse a temperatura 
ambiente durante 20 minutos. Los parásitos adheridos se fijaron con metanol absoluto durante 5 
minutos y se tiñeron con el colorante Giemsa por 15 minutos. Se montaron con la resina 
Organo/Limonene Mount (Santa Cruz Biotechnology, sc-45087), colocando un cubreobjetos 
encima. 
42 
 
Las fotografías de las preparaciones permanentes fueron tomadas con una cámara digital 
Nikon Coolpix 4300 acoplada a un microscopio Nikon Optiphot 2 y usando el objetivo 100 X con luz 
de campo claro. 
Con las fotografías, se calculó el área de los parásitos en m2, aplicando la herramienta 
“Analyze particles”, después de establecer una escala, convertir la imagen a 8 bit, eliminar el fondo 
y determinar el umbral de detección. 
6.3.2. Captura de las imágenes en el microscopio electrónico de transmisión 
Los ensayos correspondientes a la microscopía electrónica de transmisión (MET) fueron 
llevados a cabo en el laboratorio del Dr. Luis Felipe Jiménez del Departamento de Biología Celular 
ubicado en la Facultad de Ciencias, UNAM, por la Dra. Lourdes Teresa Agredano. Las muestras se 
fijaron en una mezcla de paraformaldehído 4 %-glutaraldehído 2.5 % en PBS durante 3 horas, 
después de lo cual se lavaron con PBS y se post-fijaron con tetraóxido de osmio al 1 % durante 2 
horas. Las muestras se lavaron con PBS haciendo tres cambios de 10 minutos cada uno. Se 
procedió a la deshidrataron en etanoles graduales del 30, 50, 70, 80, 90 y 96 % durante 10 
minutos cada uno y tres cambios en etanol absoluto de 5 minutos cada uno. Las muestras se 
colocaron en óxido de propileno haciendo tres cambios de 5 minutos cada uno y posteriormente 
se colocaron en una mezcla de óxido de propileno-resina epóxica en una proporción 1:1 durante 
18 horas a temperatura ambiente y finalmente se procedió a su inclusión en tubos eppendorf y a 
la polimerización de las mismas en una estufa a 60 °C durante 48 horas. Se realizaron cortes 
ultrafinos de 40-60 nanómetros de grosor, los cuales se montaron sobre rejillas de cobre cubiertas 
con formvar y finalmente se procedió al contraste de los cortes con acetato de uranilo al 5 % y 
citrato de plomo al 0.5 % durante 20 y 10 minutos, respectivamente. Las rejillas se observaron en 
43 
 
un microscopio electrónico de transmisión (JEOL 1010, JEOL, Peabody, MA) operando 80 kV. Las 
imágenes se obtuvieron con una cámara acoplada al microscopio. 
6.4. Ensayos de infección 
Células Vero (3,000 células/30 l D-MEM) se adhirieron en cada pozo de portaobjetos Cel-
Line de 18 pozos (4mm de diámetro/pozo) (Thermo Scientific, 30-441) durante 3 horas a 37 °C y 5 
% de CO2. Los tripomastigotes control o estresados (39 ó 42 °C durante 3 horas), obtenidos del 
mismo cultivo de células Vero se incubaron con las células adheridas, en una relación 1:10 (células 
Vero:parásitos) durante 3 ó 24 horas, para permitir infectarlas. Transcurrido