Estudio-del-efecto-hormonal-y-de-compuestos-organicos-en-el-cultivo-in-vitro-de-la-orqudea-trichocentrum-pachyphyllum-Hook -R -Jimenez--Carmevali

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES 
ZARAGOZA 
 
 “ESTUDIO DEL EFECTO HORMONAL Y DE 
COMPUESTOS ORGÁNICOS EN EL CULTIVO in vitro 
 DE LA ORQUÍDEA Trichocentrum pachyphyllum 
 (Hook.) R. Jiménez & Carnevali” 
 
 
 
TESIS PROFESIONAL PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
BIÓLOGA 
 
Presenta: 
 
Christian Alejandra Álvarez Juárez 
 
 
 
Directora de tesis: 
 
M. en C. Bárbara Susana Luna Rosales 
 
 
 
 
ABRIL DE 2012
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
DEDICATORIA 
 
A mi madre, Beatriz Juárez Olvera, por ser la persona más maravillosa, tierna y dedicada de este 
mundo, por su apoyo y consejos durante toda mi vida, por comprenderme y dejarme volar tan alto 
como quiera, por estar ahí para levantarme cuando caigo, por tu infinito amor y enorme corazón. 
 
A mi padre Antonio Álvarez Silva porque aunque ya estas en el cielo, siempre vas a ser el mejor papá 
del mundo, por enseñarme a luchar siempre por conseguir mis metas, por hacer de mi una mejor 
persona, por todo tu amor, cariño, dedicación, y la enorme paciencia que me tuviste. 
 
A mis hermanos Diana Beatriz, Anaid Melissa, Ricardo Antonio y Kevin Emmanuelle por todo su 
cariño, sus palabras, por convertir las cosas más sencillas y simples de esta vida en una montaña de 
felicidad, por ser mis mejores amigos y la mejor compañía que puedo tener. 
 
A mi Willy Portocarrero Leyva por estar siempre que te necesito, por darle a mi vida parte de la 
felicidad que le hacia falta, por todos los momentos maravillosos que hemos compartido, por tu amor y 
apoyo durante estos años.
3 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
A la UNAM, por ser una de las mejores Universidades de América Latina, y por tener la oportunidad 
de estudiar en ella. 
A mi asesora, la M. en C. Susana Luna Rosales, por ser una de las mejores maestras que pude tener 
durante la carrera, por su apoyo, tiempo, dedicación y enseñanzas durante todo este proceso. 
Al M. en C. Amadeo Barba Álvarez por su paciencia y ayuda en la elaboración del trabajo histológico y 
por las correcciones realizadas a la tesis. 
A la Dra. Rosalva García Sánchez, la M. en C. Balbina Vázquez Benítez y al Biól. Juan Romero 
Arredondo, por sus comentarios y correcciones para mejorar el trabajo. 
A Leslie Martínez Zaldívar, una de mis mejores amigas y gran compañera, por ir paso a paso conmigo 
durante esta carrera, compartir alegrías, tristezas y muy gratos momentos. 
A mi gran amiga Fanny Menchaca Salmerón por tu apoyo, compañía y todos los buenos recuerdos que 
compartimos, por estar siempre cuando lo necesito y ser parte importante de mi vida. 
A mi sobrina Polly y mi cuñada Nancy Leal Paredes por hacer más alegre, divertida y grande a mi 
familia. 
A todas aquellas personas que estuvieron conmigo y me apoyaron, gracias. 
 
 
 
4 
 
 
5 
 
ÍNDICE 
 PÁGINA 
RESUMEN 
1.- INTRODUCCIÓN………………………………………………………… 2 
2.- ANTECEDENTES………………………………………………………... 4 
2.1 Reproducción………………………………………………………………. 4 
 2.1.1 Cultivo in vitro……………………………...………………………….. 4 
 2.1.2 Cultivo in vitro de orquídeas……………………...……………… 4 
2.2 Rutas de desarrollo………………………………………………………… 6 
2.2.1 Organogénesis…………………………………………………………… 6 
2.2.2 Embriogénesis somática…………………………………………………. 6 
2.3 Tejido indiferenciado……………………………………………………… 7 
2.4 Género Trichocentrum……………………………………………………………. 7 
 2.4.1 Clasificación taxonómica………………………………………… 7 
 2.4.2 Descripción botánica…………………………….……………….. 8 
 2.4.3 Distribución……….……………………………………………… 9 
 2.4.4 Estado de conservación………………….……………………….. 10 
2.5 Reguladores de crecimiento vegetal (RCV)……………………………….. 10 
 2.5.1 Auxinas……………………………………………….………….. 11 
 2.5.2 Citocininas………………………………………….……………. 11 
2.6 Compuestos orgánicos………………………………….………………….. 12 
 2.6.1 Plátano………………….………………………………………… 12 
 2.6.2 Carbón activado………………………………………………….. 12 
2.7 Histología vegetal………………………………………………………….. 13 
2.8 Cultivo in vitro de Trichocentrum………………………………………………. 13 
6 
 
3.- JUSTIFICACIÓN………………………………………………………… 14 
4.- HIPOTESIS……………………………………………………………….. 15 
5.- OBJETIVOS………………………………………………………………. 16 
6.- MATERIAL Y MÉTODO………………………………………………... 17 
6.1 Material biológico…………………………………………………………. 17 
6.2 Medios de cultivo …………………………………………………………. 17 
6.3 Germinación de semillas.……………………………………………..……. 17 
 6.3.1 Desinfestación y siembra in vitro………………………………… 17 
 6.3.2 Evaluación de germinación y desarrollo de T. pachyphyllum...….. 18 
 6.3.3 Índice de desarrollo ……………….……………………………… 19 
6.4 Proliferación y desarrollo y del tejido indiferenciado…………….……… 19 
 6.4.1 Siembra in vitro de tejido indiferenciado ………………………... 19 
 6.4.2. Evaluación de el desarrollo y proliferación …………………….. 20 
6.5 Desarrollo de protocormos ………...……………………………………… 20 
 6.5.1 Siembra in vitro de protocormos ………………….……………... 20 
 6.5.2 Evaluación del desarrollo de protocormos ………...…………….. 20 
6.6 Desarrollo de plántulas ……………………………………..….………….. 21 
 6.6.1 Subcultivo in vitro de plántulas ………………………………….. 21 
 6.6.2 Evaluación del desarrollo de plántulas …………………………... 21 
 6.6.3 Incubación de los medios de cultivo ……………………………... 21 
6.7 Histología de PLB´s y estadios de desarrollo de T. pachyphyllum ……….. 22 
 6.7.1 Fijación ………………………….……………………………….. 22 
 6.7.2 Deshidratación …………………………...………...…………….. 22 
 6.7.3 Infiltración e inclusión en parafina …………..………………………. 22 
 6.7.4 Obtención de cortes histológicos ………………………………… 22 
7 
 
6.8 Análisis estadístico………….…………...……..………………………….. 23 
7.- RESULTADOS……………………………………………………………. 24 
7.1. Germinación de semillas de T. pachyphyllum………………………………... 24 
7.2 Índice de desarrollo de semillas de T. pachyphyllum…………………………. 25 
7.3 Desarrollo de tejido indiferenciado…………………………………...…… 27 
7.4 Proliferación de tejido indiferenciado…………………………………… 30 
7.5 Desarrollo de protocormos………………………………………………… 32 
7.6 Desarrollo de plántulas……………………………………………………. 36 
 7.6.1 Crecimiento de pseudobulbos…………………………………… 36 
 7.6.2 Desarrollo del número de hojas………………………………... 37 
 7.6.3 Longitud de la hoja más larga…………………………………. 38 
 7.6.4 Longitud de la hoja más ancha………………………………….. 40 
 7.6.5 Desarrollo del número de raíces…………………………………. 41 
 7.6.6 Longitud de la raíz más larga……………………………………. 42 
 7.6.7 Longitud de plántulas……………………………………………. 44 
7.7 Análisis histológico……………… …………………………...…………... 46 
 7.7.1 Tejido indiferenciado……………………………………………… 46 
 7.7.2 Cuerpos parecidos a protocormos (PLB´s)………………………... 48 
 7.7.3 PLB´s con primordios foliares…………………………………….. 49 
 7.7.4 PLB´s con hojas…………………………………………………… 51 
 7.7.5 Plántula con raíces………………………………………………… 53 
8.- DISCUSIÓN.................................................................................................. 54 
9.- CONCLUSIONES………………………………………………………. 63 
10.- BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………… 65 
11.- ANEXOS…………………………………………………………………. 74 
8INDICE DE FIGURAS 
Figura 1.- Sistema de germinación y propagación vegetativa en orquídeas……….. 5 
Figura 2.- Inflorescencia de T. pachyphyllum……………………………………… 8 
Figura 3.- Esquema de las partes de T. pachyphyllum…………………………………. 9 
Figura 4.- Distribución en México de T. pachyphyllum………………………….......... 10 
Figura 5.- Protocormos de T. pachyphyllum in vitro a los 60 días de cultivo en 
 dos medios de cultivo…………………………………………………… 
 
24 
Figura 6.- Protocormos con ápice de T. pachyphyllum in vitro a los 135 días 
 de cultivo………………………………………………………..…….... 
 
27 
Figura 7.- Tejido indiferenciado in vitro de T. pachyhyllum perdiendo 
 coloración a 90 días de cultivo…………………………………….…... 
 
31 
Figura 8.- Proliferación in vitro de tejido indiferenciado de T. pachyphyllum a 
 los 180 días de cultivo………………………………………………….. 
 
32 
Figura 9.- Plántula con raíces in vitro de T. pachyphyllum, a los 90 días en 
 medio de cultivo KM………………………………………………...…. 
 
34 
Figura 10.- Longitud de pseudobulbos in vitro de T. pachyphyllum a 90 días 
 de cultivo ………………………………………..…………………….. 
 
36 
Figura 11.- Número de hojas de plántulas in vitro de T. pachyphyllum……………. 38 
Figura 12.- Longitud de la hoja más larga in vitro de T. pachyphyllum. …………. 39 
Figura 13.- Raíces de plántula in vitro de T. pachyphyllum a 90 días de cultivo…. 43 
Figura 14.- Estadios fenológicos obtenidos in vitro, a partir de semillas y de 
 tejido indiferenciado de T. pachyphyllum. ………………………….. 
 
45 
Figura 15.- Cortes histologicos de tejido calloso de T. pachiphyllum………….…. 47 
Figura 16.- Cortes histológicos de tejido calloso de T. pachyphyllum con dos 
 tipos de cristales ………………………………………………………… 
 
48 
Figura 17.- Corte histológico de PLB´s de T. pachyphyllum…………………… 49 
 
 
9 
 
 
 
ÍNDICE DE GRÁFICAS 
 
Gráfica 1.- Prueba de rangos múltiples de Tukey de dos tratamientos para la 
 germinación in vitro de semillas de T. pachyphyllum…………….... 
 
76 
Gráfica 2.- Germinación in vitro de semillas de T. pachyphyllum en dos 
 medios de cultivo…………………………………………………. 
 
25 
Gráfica 3.- Prueba de rangos múltiples de Tukey de dos tratamientos para la 
 germinación y desarrollo in vitro de semillas de T. pachyphyllum.. 
 
77 
Gráfica 4.- Desarrollo durante la germinación in vitro de semillas de 
 T. pachyphyllum en 2 medios de cultivo……………………..……. 
 
26 
Gráfica 5.- Prueba de rangos multiples de 9 tratamientos con diferentes 
 concentraciones hormonales de ANA y BAP……………………... 
 
78 
Gráfica 6.- Desarrollo de 9 tratamientos en medio de cultivo KM, con 
 diferentes concentraciones hormonales, ANA y BAP………………. 
 
28 
Gráfica 7.- Porcentaje de estadios diferenciados in vitro a partir de tejido calloso 
 de T. pachyphyllum a 180 días de cultivo en tratamientos con RCV... 
 
 
30 
Figura 18.- Corte histologico longitudinal de PLB´s con primordio foliar de T. 
 pachyphyllum….………………………………………………….. 
 
50 
Figura 19.- Corte histológico longitudinal de PLB con primordio foliar de T. 
 pachyphyllum con células y rafidios ……...……………………….. 
 
 
Figura 20.- Cortes histológicos longitudinales de PLB con hojas de T. 
 pachyphyllum.. ………………………………………………….……… 
 
 
Figura 21.- Corte histológico longitudinal de hojas de T. pachyphyllum con 
 estomas y tejido vascular ……………...………………………….... 
 
 
 
Figura 22.- Corte histológico longitudinal de hojas de T. pachyphyllum con 
 células y epidermis ..………………………………………………….. 
 
Figura 23.- Corte histológico longitudinal de plántula con raíces de T. 
 pachyphyllum…………………………………………………………… 
 
 
51 
 
51 
 
 
 
53 
52
1 
52 
10 
 
Gráfica 8.- Prueba de rangos múltiples de Tukey de proliferación de peso 
 fresco de tejido calloso de T. pachyphylum en tratamientos con RCV 
 
80 
Gráfica 9.- Proliferación in vitro de tejido indiferenciado de T. pachyphylum en 
 el medio de cultivo KM con RCV…………………………………… 
 
32 
Gráfica 10.-Prueba de rangos múltiples de Tukey de 18 tratamientos con 
 diferentes concentraciones de polvo de plátano y carbón activado 
 para el desarrollo de protocormos con una hoja…………………….. 
 
81 
Gráfica 11.- Desarrollo protocormos con una hoja en medio de cultivo KM con 
 diferentes concentraciones de polvo de plátano y carbón activado. 
 
34 
Gráfica 12.- Desarrollo de protocormos con una hoja en medio de cultivo 
 Peters, con diferentes concentraciones de PP y CA………………... 
 
35 
Gráfica 13.- Prueba de rangos múltiples de Tukey para la longitud de 
 pseudobulbos in vitro de T. pachyphyllum en 4 tratamientos…….. 
 
82 
Gráfica 14.- Longitud de pseudobulbos in vitro de T. pachyphyllum en 4 
 tratamientos……………………………………………………….. 
 
37 
Gráfica 15.- Prueba de rangos múltiples de Tukey para el número de hojas en 
 cultivo in vitro de T. pachyphyllum en 4 tratamientos……………. 
 
83 
Gráfica 16.- Desarrollo de hojas de plántulas in vitro de T. pachyphyllum en 4 
 tratamientos……………………………………………………….. 
 
38 
Gráfica 17.- Prueba de rangos múltiples de Tukey para la longitud de la hoja 
 más larga en cultivo in vitro de T. pachyphyllum en 4 tratamientos.. 
 
84 
Gráfica 18.- Crecimiento de la hoja más larga de plántulas in vitro de T. 
 pachyphyllum en 4 tratamientos…………………………………..... 
 
40 
Gráfica 19.- Prueba de rangos múltiples de Tukey para la hoja más ancha en 
 cultivo in vitro de T. pachyphyllum en 4 tratamientos………...……. 
 
85 
Gráfica 20.- Crecimiento de la hoja más ancha de plántulas in vitro de T. 
 pachyphyllum en 4 tratamientos…………………………………..... 
 
41 
Gráfica 21.- Prueba de Rangos múltiples de Tukey para el número de raíces en 
 cultivo in vitro de T. pachyphyllum en 4 tratamientos……………… 
 
86 
Gráfica 22.- Desarrollo de raíces en plántulas in vitro de T. pachyphyllum en 4 
 tratamientos……………………………………………………......... 
 
42 
11 
 
Gráfica 23.- Prueba de Rangos múltiples de Tukey para la longitud de la raíz 
 más larga en cultivo in vitro de T. pachyphyllum en 4 tratamientos.. 
 
87 
Gráfica 24.- Longitud promedio de la raíz más larga de plántulas de T. 
 pachyphyllum cultivadas in vitro en 4 tratamientos. ………………. 
 
43 
Gráfica 25.- Prueba de rangos múltiples de Tukey para la longitud de plántulas 
 en cultivo in vitro de T. pachyphyllum en 4 tratamientos………….. 
 
88 
Gráfica 26.- Longitud promedio de plántulas in vitro de T. pachyphyllum en 4 
 tratamientos…………………..……………………………………. 
45 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
12 
 
ABREVIATURAS 
 
AIA Ácido indol-acético 
ANA Ácido naftalen acético 
ANDEVA Análisis de varianza 
BAP Bencil amino purina 
CA Carbón activado 
KC Knudson C 
K&M Kao y Michayluk 
MS Murashigue y Skoog 
P Peters® 
PLB´s Cuerpos parecidos a protocormos 
PP Polvo de plátano 
RCVReguladores del crecimiento vegetal 
TDZ 1-phenyl-3-(1,2,3-thidiazol-5-yl)-urea 
VW Vacin y Went 
2,4-D Ácido 2,4-diclorofenoxiacético 
 
 
 
 
 
 
1 
 
RESUMEN 
Trichocentrum pachyphyllum (Hook.) R. Jiménez & Carnevali es una orquídea 
epifita endémica de México con flores muy vistosas. Esta especie mantiene una presión de 
colecta moderada; actualmente no esta amenazada pero algunas de sus poblaciones han 
desaparecido por el desmonte derivado de actividades humanas. 
El presente estudio tuvo como objetivo establecer un protocolo de cultivo in vitro de 
T. pachyphyllum a través del efecto hormonal y de compuestos orgánicos. Para ello se 
estableció la germinación y desarrollo de semillas en los medios nutritivos Kao & 
Michayluk (KM) y Peters® (P) durante cinco meses; así mismo, se indujo la proliferación y 
desarrollo de tejido indiferenciado durante seis meses de cultivo en el medio KM 
adicionado con ácido naftalén acético (ANA) y bencil amino purina (BAP), como 
reguladores del crecimiento vegetal en concentraciones de 1 mgL
-1
 y 2 mgL
-1
; se promovió 
el desarrollo de protocormos con una hoja durante tres meses de cultivo en los medio KM y 
P adicionados con diferentes combinaciones de polvo de plátano (1 gL
-1
, 10 gL
-1
 y 20 gL
-1
) 
y de carbón activado (1 gL
-1
, 1.5 gL
-1 
y 2 gL
-1
); y se comparó el desarrollo de las plántulas 
generadas a partir de la germinación de semillas y del tejido indiferenciado, en los medios 
KM y P durante tres meses de cultivo. Finalmente se realizó el análisis histológico de las 
diversas etapas de regeneración a partir del tejido indiferenciado. 
La germinación de las semillas fue mayor al 95% en ambos medios de cultivo. La máxima 
biomasa obtenida durante la proliferación del tejido indiferenciado fue de 5 000 mg. El 
estadio más avanzado de diferenciación inducido en este tejido fue el de protocormo y se 
obtuvo en el medio de cultivo sin hormonas, así como en el tratamiento 9, adicionado con 2 
mgL
-1
 de ANA y BAP, cuyos valores de 163 y 162 respectivamente fueron los índices más 
altos registrados. En general, el medio KM promovió el desarrollo de protocormos con una 
hoja, mientras que en el P los protocormos se necrosaron; el tratamiento 3, adicionado con 
1 gL
-1
 de plátano y 2 gL
-1
 de carbón activado, del medio KM, promovió la mayor 
diferenciación de los protocormos, con un índice de desarrollo de 619, valor que representa 
el estadio de plántulas con dos y tres hojas. El desarrollo de las plántulas obtenidas a partir 
del desarrollo de tejido indiferenciado fue mayor en cuanto al tamaño, a diferencia de 
aquellas obtenidas de la germinación. El análisis histológico determinó que la vía 
morfogénica de diferenciación fue la embriogénesis somática indirecta. 
2 
 
INTRODUCCIÓN 
Las orquídeas están consideradas entre las plantas más especializadas, que presentan 
gran diversidad y variabilidad morfológica. Las modificaciones de sus estructuras 
vegetativas y florales, así como sus mecanismos de polinización, les permiten establecerse 
en los diversos nichos ecológicos donde se distribuyen. Son una familia biológica y 
botánica de gran interés científico. Por su variedad de flores son altamente cotizadas, 
representan un alto valor ornamental y comercial, son plantas atractivas, lo que motiva al 
comercio ilegal de plantas silvestres (Navarro et al., 2001). 
La familia Orchidaceae posee entre 20,000 y 30,000 especies (Hagsater et al., 2005), y 
algo más de 850 géneros (Dressler, 1993), ampliamente distribuidos en el mundo. Esta 
diversidad aumenta hacia el trópico, donde predominan las especies epífitas que 
constituyen casi el 73% de la familia (Atwood, 1986; Benzing, 1990). En México se 
distribuyen cerca de 1,200 especies de esta familia, lo que representa aproximadamente el 
6% del total mundial (Espejo et al., 2002). 
Una de las características más interesantes de esta familia es su alta proporción de 
especies endémicas (Espejo et al., 2002). Sin embargo, la alteración y destrucción del 
hábitat, y la extracción ilegal de orquídeas silvestres para su comercio, hace que varias 
especies estén consideradas en peligro de extinción (Hágsater et al., 2005). 
Las orquídeas presentan problemas serios para su propagación en forma natural debido 
a que la mayor parte de las semillas están escasamente diferenciadas por lo que no se les 
distinguen los cotiledones ni las radículas y carecen de endospermo (Pierik, 1990). 
Las orquídeas proliferaron hasta esparcirse por todo el planeta, con excepción de las 
zonas polares y los desiertos, aunque son más abundantes en las zonas tropicales. Su nivel 
de crecimiento altitudinal está comprendido entre los 100 y 4,800 msnm, por lo que puede 
hablarse de orquídeas de climas cálidos y orquídeas de climas fríos. Respecto a la humedad, 
las hay de climas muy secos como las xerofíticas, de climas intermedios y muy húmedos 
(Bennet, 2000). 
3 
 
Es bien conocido el largo periodo de tiempo que se requiere para la propagación; 
establecimiento, desarrollo y floración de las orquídeas, sin embargo es posible disminuir 
este tiempo e incrementar las poblaciones a través de modernas técnicas biotecnológicas de 
cultivo; suministrando las condiciones óptimas y los nutrimentos necesarios para su 
crecimiento y desarrollo (Francisco, 2008). 
Diversos factores se han estudiado en la industria para la propagación de orquídeas, 
entre ellos el uso mínimo de medios de cultivo, adición de fitohormonas y otros aditivos 
como peptona, carbón activado, puré de plátano, entre otros (Ouyang y Wong, 2006), estas 
sustancias provocan efectos positivos en el desarrollo de algunas orquídeas como el caso de 
Oncidium stramineum (Flores et al, 2008). 
 
La presente investigación tuvo como finalidad establecer un protocolo de cultivo in 
vitro para Trichocentrum pachyphyllum, por medio del estudio del efecto hormonal y de 
compuestos orgánicos en diferentes medios de cultivo para su conservación y desarrollo 
sostenible. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4 
 
2 ANTECEDENTES 
2.1 Reproducción 
Todas las orquídeas requieren para su germinación y desarrollo una asociación con 
hongos micorrízicos (Otero y Bayman, 2009). La micorriza orquidoide se caracteriza 
porque la mayoría de los hongos que participan en la asociación son del género 
Rhizoctonia, la cual establece una asociación particular con las orquídeas, ya que la planta 
en su estado de semilla es totalmente dependiente de los nutrientes que le suministra el 
micosimbionte para lograr una exitosa germinación (Bernard, 1909; Arditti, 1992; Otero y 
Bayman, 2009). En las células corticales de las raíces el hongo origina una estructura 
denominada “pelotón” que es un enrollamiento hifal (Hadley y Williamson, 1972). 
En un estudio realizado por Knudson (1946), demostró que es posible la 
germinación asimbiótica de embriones de orquídeas in vitro, sin la presencia del hongo, 
mediante el cultivo en un medio que contenga minerales y azúcares. 
La reproducción sexual de las orquídeas por los métodos convencionales de 
propagación presenta problemas ya que la semilla es tan pequeña que contiene muy pocas o 
ninguna reserva alimenticia. 
 
2.1.1 Cultivo in vitro 
 El cultivo in vitro de tejidos vegetales es una definición genérica que incluye el 
cultivo de protoplastos, de células, de tejidos de órganos, órganos y plantas. Estos 
diferentes tipos de cultivo tienen como factor común el crecimiento en condiciones 
asépticas, en un medio nutritivo, generalmente gelificado, y en condiciones ambientales 
controladas y por lo tanto óptimas (Estopa, 2005). 
 
2.1.2 Cultivo in vitro de Orquídeas 
Tradicionalmente las orquídeas se han propagado asexualmente mediante división 
de plantas. Sin embargo, se ha demostrado que es posible obtener un gran número de 
5 
 
plantas a partirde la germinación de semillas utilizando métodos de cultivo in vitro (Arditti 
y Ernest, 1993). 
Diversos medios nutritivos han sido desarrollados para el cultivo in vitro de 
orquídeas, estos han sido ampliamente aplicados en varias especies de esta familia, se han 
enriquecido, mejorado los medios y las condiciones del cultivo, registrándose resultados 
para su propagación. Una producción masiva de orquídeas se justifica con el uso de esta 
técnica ya que las orquídeas tienen un alto valor comercial y mediante este proceso se 
puede mantener una producción anual continua, además de que están libres de patógenos, 
lo cual es muy útil si se piensa en exportación. La propagación in vitro de orquídeas se ha 
establecido a partir de segmentos de plántulas adultas, principalmente en medio de cultivo 
semisólidos (George y Sherrington, 1984). 
Desde que Knudson desarrolló un método de cultivo in vitro asimbiótico para la 
germinación de semillas de orquídeas, este método tuvo un papel muy importante y 
significativo para la propagación de especies de orquídeas y de híbridos (Yoneo, 1991). 
La reproducción vegetativa de especímenes en estado de protocormo es difícil de 
observar en la naturaleza (Fig. 1). Mientras que el cultivo in vitro de protocormos es 
empleados para obtener grandes números de regenerantes (Batigyna et al., 2003). 
 
Figura. 1.- Sistema de germinación natural y propagación vegetativa in vitro en orquídeas (Batigyna et al., 
2003). 
6 
 
2.2 Rutas de desarrollo 
La organogénesis es el proceso por el que las células y tejidos son forzados a sufrir 
una serie de cambios que tiene como resultado final una estructura unipolar, ya sea un 
primordio de brote o de raíz cuyo sistema vascular está a menudo conectado con el tejido 
madre (Pliego y Barceló, 2001), mientras que la embriogénesis somática es la formación de 
un embrión a partir de una célula, sin la necesidad de la fusión de gametos. Los embriones 
somáticos son estructuras bipolares con un eje radical-apical y no poseen conexión vascular 
con el tejido materno. Estas estructuras bipolares son capaces de crecer y formar plantas 
normales (Tisserat et al., 1979). 
2.2.1 Organogénesis 
Litz y Jarrete (1991), clasifican la organogénesis en directa e indirecta, es directa 
cuando los brotes se forman del explante y es indirecta cuando se forman a partir de callos. 
Jiménez (1998), afirma que la organogénesis puede hacerse por dos vías: la formación de 
yemas axilares y yemas adventicias. 
2.2.2 Embriogénesis somática 
Los embriones somáticos son estructuras bipolares, que tienen un eje radial, aislados 
por un tejido epidérmico y no poseen conexión vascular con el tejido materno. De acuerdo 
con Lindsey y Jones (1992), los embriones somáticos pueden desarrollarse y germinar de 
modo análogo a la germinación de los embriones cigóticos, a partir de células, tejidos u 
órganos. 
Similar a la organogénesis, la embriogénesis somática muchos autores la clasifican 
en directa e indirecta. La embriogénesis somática es directa cuando el desarrollo de los 
embriones se produce a partir de células somáticas del explante original, pueden utilizarse 
para la micropropagación de un número limitado de especies, y es indirecta cuando el 
desarrollo del embrión es a partir de callo o suspensiones celulares. Los embriones 
somáticos se pueden obtener de varias fuentes de tejidos tales como: hojas jóvenes, hojas 
inmaduras, inflorescencias, pecíolos, etc. (Gómez, 1998). 
 
7 
 
2.3 Tejido indiferenciado 
El tejido indiferenciado o calloso, es una masa de color verde, verde amarillento y/o 
amarillento; de aspecto granuloso, turgente e indefinido, con protuberancias globosas e 
irregulares que se disgregan fácilmente, el tamaño es desde 5 a 30 mm, en función del 
espacio disponible y tiempo de cultivo; ocasionalmente se presenta vitrificación. Este 
estadio se considera transitorio entre el protocormo y plántula (Batygina et al. 2003). 
Histológicamente, el tejido calloso es una masa de células indiferenciadas, 
compuesta principalmente por células parenquimatosas, que surgen de la desorganización 
de un tejido vegetal. El callo generalmente presenta estructuras en desarrollo, tales como 
zonas meristemáticas, sustancias de desecho, tejido vascular, entre otras; es por ello que se 
dice que el callo es un tejido parcialmente indiferenciado (Taíz y Zeiger, 2007). 
2.4 Género Trichocentrum 
 
El género Trichocentrum se distribuye ampliamente en el Neotrópico desde el sur 
de México a través de Centroamérica y Sudamérica hasta Brasil, Bolivia y Perú y 
comprende 70 especies. La mayor parte son plantas epífitas que habitan bosques húmedos 
de altitudes bajas (Jiménez-Machorro, 2008). 
 
2.4.1 Clasificación Taxonómica de Trichocentrum pachyphyllum 
 
Reino: Plantae 
Subreino: Tracheobionta 
División: Magnoliophyta 
Clase: Liliopsida 
Subclase: Liliidae 
Orden: Asparagales 
Familia: Orchidaceae 
Tribu: Cymbidieae 
Subtribu: Oncidiinae 
Género: Trichocentrum 
Especie: T. pachyphyllum 
8 
 
 
Figura. 2.- Inflorescencia de T. pachyphyllum (Gaudi, 2010). 
 
 
 
2.4.2 Descripción botánica 
 
Hierba de 20-45 cm de alto, sin incluir la inflorescencia. Raíces gruesas 2-3 mm de 
grosor. Rizoma corto, 8 mm de largo. Pseudobulbos agrupados, subcilíndricos, muy 
reducidos, inconspicuos, comprimidos, unifoliados, verde-oscuros, lisos, ásperos, opacos. 
Hoja solitaria, en el ápice del pseudobulbo, tipo “oreja de burro”, erecta, rígida, elíptica a 
oblonga elíptica, aguda, extendida, conduplicada en la base, verde clara, áspera, opaca, 13-
36 x 5.5-7.5 cm. Inflorescencia originada en la base del pseudobulbo maduro, una por 
pseudobulbo, paniculada, rara vez racemosa, erecta, 23-96 cm de largo, densiflora, 6-35 
flores simultaneas; pedúnculo 20-60 cm de largo, rojo-oscuro a verde. Flores vistosas, 
aroma ligero y agradable, 27-35 mm de largo; sépalos y pétalos amarillo-verdosos, con 
manchas rojizas, redondeadas; labelo amarillo con pequeñas manchas rojas alrededor del 
callo y a veces sobre los lóbulos laterales. Sépalos extendidos a reflexos, redondeados, 5-
nervados; el dorsal cóncavo, unguiculado, uña de 3.0-3.5 mm de largo, 11-16 x 8-11 mm. 
Pétalos ligeramente reflexos a extendidos, con la porción apical incurvada, oblongo 
elípticos a oblongo ovados, ápice conduplicado, redondeado al ser extendido, márgenes 
ondulados. Labelo trilobado, la base formando un ángulo de 135º con respecto a la 
columna, 13-19 mm de largo, 15-23 mm entre los lóbulos laterales. Columna gruesa, corta, 
9 
 
7-12 mm de largo, amarilla con manchas rojas en el dorso, alada, con tábula 
infraestigmática prominente, formada por un engrosamiento redondeado, brillante y liso, 
amarilla con manchitas o puntos rojos, alas gruesas y carnosas, descendentes, amarillas con 
manchitas rojas, 4.4 mm de largo, 1.5 mm de grosor (Fig. 3) (Jiménez-Machorro, 2008). 
 
 
 
 
 Figura 3.- Esquema de las partes de T. pachyphyllum (Jiménez-Machorro, 2008). 
 A) Planta. B) Flor vista de frente. C) Flor vista de perfil. D) Flor disecada. E) Columna. F) Callo. 
 G) Poliniario. H) Antera. I) Columna mostrando el clinandrio. 
 
 
 
2.4.3 Distribución 
 
Endémica de México, Eje Volcánico y Sierra Madre del Sur; Nayarit, Jalisco, 
Colima, Michoacán, Guerrero, Morelos, Estado de México, Oaxaca y Veracruz (Fig. 4) 
(Jiménez-Machorro, 2008). 
I 
10 
 
 
 
Figura. 4.- Distribución en México de Trichocentrum pachyphyllum (Hook.) R. Jiménez & Carnevali 
 (Jiménez-Machorro, 2008). 
 
2.4.4 Estado de conservación 
 
No amenazada. Es una especie de flores muy vistosas, con presión de colecta 
moderada. Es abundante en el campo, a pesar de que algunaspoblaciones han desaparecido 
por el desmonte derivado de actividades humanas. 
 
2.5 Reguladores del crecimiento vegetal (RCV) 
 
Las hormonas vegetales se consideran reguladores de crecimiento que existen de 
manera natural, sin embargo, también existe un grupo de compuestos sintéticos que han 
demostrado efecto sobre la fisiología de las plantas y son comúnmente usados en el cultivo 
de tejidos por ser termoestables y más baratos. 
Los RCV desempeñan un papel importante en el crecimiento y desarrollo de la 
planta. Se conocen cinco grupos principales de hormonas vegetales: auxinas, citocininas, 
giberelinas, el etileno y el ácido abscísico (Salisbury y Ross, 1994). 
Las plantas cultivadas se caracterizan por tener una respuesta determinada a la luz y 
a la temperatura a nivel fisiológico. Existen grupos reguladores clave en el crecimiento 
11 
 
vegetal, las auxinas y citocininas, fuertemente asociados al desarrollo del sistema de cultivo 
de células vegetales. Tienen un papel esencial en la inducción de división y diferenciación 
celular. Sin embargo la proliferación celular y respuesta morfogénica en cultivos, es 
frecuentemente difícil de inducir en varias especies vegetales (Kobayashi et al., 2001). 
 
2.5.1 Auxinas 
Son un grupo de compuestos caracterizados por su capacidad para inducir la 
extensión de las células de los brotes, entre estos se encuentran el ácido indol-butírico 
(AIB), ácido indol-acético (AIA), ácido naftalen-acético (ANA) y ácido 2,4-dicloro-
fenoxiacético (2,4-D). 
Un factor importante en la embriogénesis somática son las auxinas, especialmente 
el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). Las células embriogénicas se generan 
comúnmente en medios que contienen 2,4-D, proliferando como grupos celulares 
desorganizados. La transferencia de estos grupos celulares a medio libre de reguladores del 
crecimiento vegetal conduce al desarrollo de embriones somáticos (Kobayashi et al., 2001). 
Las auxinas se generan principalmente en las partes jóvenes de la planta; ápices, 
frutos tiernos y hojas en desarrollo. Estimulan el crecimiento por alargamiento de los tallos 
y participan en la formación de las curvaturas fototrópicas y gravitrópicas. Promueven la 
formación de raíces laterales y adventicias. En el mecanismo de la acción de las auxinas se 
ha distinguido la percepción de la expresión de genes (Jackiewicz, 2003). Se sabe que la 
auxina incrementa la plasticidad de la pared celular, cuando la pared celular se ablanda, la 
célula se dilata debido a la presión del agua dentro de su vacuola (Salisbury y Ross, 1994). 
 
2.5.2 Citocininas 
Las citocininas son sustancias que en combinación con las auxinas estimulan la 
división celular en las plantas, intervienen directamente en la regulación de la 
morfogénesis, rompimiento de la dominancia apical, retrasan la senescencia foliar y 
promueven la maduración de los cloroplastos. Las citocininas estimulan la división celular 
en tejidos no meristemáticos (Flores y Abdelnour, 2000). 
12 
 
Afectan diversos procesos fisiológicos: estimulan la germinación de las semillas que 
necesitan luz y acortan el periodo de latencia de las yemas. Regulan la morfogénesis, por 
suprimir la dominancia apical en las plantas, lo que causa la brotación de las yemas 
laterales, y la inhibición de la formación y crecimiento de las raíces (Jankiewicz, 2003). 
La presencia de altos niveles de citocininas actúa como una fuente demandante de 
nutrientes (Flores y Abdelnour, 2000; Salibury y Ross, 1994; Taiz y Zaiger, 2007). 
2.6 Compuestos orgánicos 
Una de las variantes dentro del cultivo in vitro es la adición de compuestos 
orgánicos al medio basal (Pierick, 1990; Arditti y Ernest, 1993; Hicks, 2004). 
Entre los más utilizados en la micropropagación de orquídeas destacan la pulpa de 
plátano y el agua de coco debido al alto contenido de azúcares, aminoácidos, antioxidantes, 
minerales, ácidos orgánicos y agentes promotores del crecimiento que contienen (Arditti y 
Ernest, 1993). Otro factor importante observado con la adición de compuestos orgánicos es 
el aumento porcentual de la sobrevivencia ex vitro, una de las etapas más difíciles después 
del cultivo in vitro. 
2.6.1 Plátano 
El polvo de plátano contiene grandes cantidades de hidratos de carbono complejos, 
tales como el almidón, además de ser rico en minerales como potasio y magnesio. Los 
tratamientos adicionados con pulpa de plátano aumentan considerablemente la longitud de 
las plántulas, además de estimular la formación de numerosas y vigorosas raíces (Moreno y 
Menchaca, 2007). 
2.6.2 Carbón activado 
 
El carbón activado es un agente antioxidante, que influye en todo proceso del 
cultivo así como en la aclimatización exitosa de las plantas. El carbón activado se 
caracteriza por una alta proporción de área-peso, esto le confiere alta adsorción de 
substancias. Provee aireación y adsorbe el etileno, adsorbe e inactiva el 5-
13 
 
hidroximetilfurfural, inhibe compuestos fenólicos y carboxílicos producidos por los 
cultivos (Arditti y Ernest, 1993). 
 
2.7 Histología vegetal 
 
Para estudiar la estructura de las células, tejidos y órganos que constituyen los 
organismos, se han desarrollado diversos métodos y técnicas, y se han perfeccionando los 
instrumentos necesarios para conocer con más profundidad la morfología y función de los 
diferentes niveles de organización de la materia (Iglesias y Rodríguez, 2011). 
Todas las plantas están formadas por los mismos tejidos -dérmico, vascular y 
fundamental-, sin embargo, la manera cómo están organizadas sus células dentro de cada 
uno es muy variable, haciendo que las diferencias estructurales entre las plantas sean 
notables y, por lo tanto, los métodos histológicos para procesarlas sean variados. 
Las diferencias estructurales de las plantas son en gran parte por la naturaleza del 
material vegetal, así que de esto dependen los métodos a seguir, de tal modo que las 
técnicas o reactivos no serán utilizados siempre de la misma manera o con los mismos 
tiempos especificados en la bibliografía (Sandoval, 2005). 
 
2.8 Cultivo in vitro de Trichocentrum 
 
Francisco (2008), reporta la propagación in vitro para T. carthagenense, en donde 
usó diferentes concentraciones de RCV para germinar esta especie; mientras que, Flores y 
colaboradores (2008) obtienen la propagación in vitro de la especie T. stramineum usando 
diferentes medios de cultivo adicionados con compuestos orgánicos. 
 
 
 
 
 
 
14 
 
3 JUSTIFICACIÓN 
 
Las actividades humanas y asentamientos urbanos han provocado un uso 
indiscriminado de recursos naturales, generando efectos negativos en la biodiversidad, con 
la destrucción de los hábitats. El deterioro de la cubierta vegetal, ha provocado entre otros 
efectos la perdida y disminución de especies vegetales (Ramamoorthy et al., 1998). 
 
Actualmente algunas especies de la familia Orchidaceae están en grave riesgo y en 
peligro de extinción, y es importante desde varios puntos de vista: 1) ecológica y 
biológicamente porque es una familia altamente especializada y 2) la belleza de sus flores, 
ha motivado al comercio ilegal de especies. 
 
Debido a la dificultad que presentan las semillas de las orquídeas para germinar en 
forma natural, se han desarrollado metodologías de germinación asimbiótica bajo 
condiciones in vitro (Damon et al., 2004; Pedroza et al., 2005; Yamazaki y Kasumitzu, 
2006; Pedroza y Mican, 2006; Haddix et al., 2006; Steele, 2007). Sin embargo, cada 
especie de orquídea tiene diferentes necesidades de nutrientes para germinar, por lo que hay 
que investigar cual es el medio de germinación adecuado para cada una de ellas. 
 
Hasta la fecha no existe ningún reporte en las bases de datos, acerca del cultivo in 
vitro de Trichocentrum pachyphyllum por lo que es necesario realizar un estudio detallado 
acerca de la especie. 
 
Por tanto, dado que las orquídeas son plantas enriesgo constante, raras y de difícil 
reproducción natural, es importante la realización de estudios relacionados con su biología, 
capacidad de germinación, propagación in vitro, reproducción y cultivo para buscar la 
manera de preservarlas y encontrar los medios para reproducirlas de una forma más rápida 
y eficiente. 
 
 
 
 
15 
 
4 HIPOTESIS 
 
La proliferación de tejido indiferenciado como la diferenciación de plántulas de 
Trichocentrum carthagenense y T. stramineum se promueve con reguladores del 
crecimiento vegetal y compuestos orgánicos adicionados al medio de cultivo por lo que se 
espera que al suplementarlos en el cultivo in vitro de la especie T. pachyphyllum se 
promueva el potencial proliferativo de tejido indiferenciado, así como la diferenciación de 
protocormos y el desarrollo de plántulas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
16 
 
 
5 OBJETIVO GENERAL 
 
Evaluar el efecto hormonal y de compuestos orgánicos en T. pachyphyllum para establecer 
un protocolo de cultivo in vitro. 
 
 
 
OBJETIVOS PARTICULARES 
 
 Comparar dos medios nutritivos, uno con fertilizante comercial y otro con reactivos 
analíticos para la germinación de semillas de Trichocentrum pachyphyllum. 
 Determinar el efecto hormonal del ácido naftalen acético (ANA) y de la bencil 
amino purina (BAP) para la proliferación de tejido indiferenciado y la 
diferenciación por regeneración. 
 Evaluar el efecto del polvo de plátano y del carbón activado como compuestos 
orgánicos adicionados a dos medios nutritivos para el desarrollo de plántulas a partir 
de protocormos con una hoja. 
 Comparar el desarrollo de plántulas in vitro obtenidas a través de la germinación de 
semillas y vía indirecta por tejido indiferenciado. 
 Caracterizar histológicamente la secuencia de regeneración, a partir del tejido 
indiferenciado de T. pachyphyllum. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
17 
 
6 MATERIAL Y METODO 
 
6.1 Material biológico 
Para la germinación de semillas y desarrollo de plántulas fue utilizada una cápsula 
inmadura de T. pachyphyllum, colectada en el Parque Nacional El Tepozteco, mientras que 
para la proliferación, diferenciación y análisis histológico, tejido indiferenciado de seis 
meses de cultivo, donado por la Unidad de Investigación en Biología Vegetal de la FES 
Zaragoza. 
 
6.2 Medios de cultivo 
Los medios de cultivo utilizados consistieron en dos, uno con las sales basales de 
Kao y Michayluk (KM) y el otro con las sales del fertilizante foliar Peters® (Ver Anexo, 
Tabla 1). El pH de los medios de cultivo fue ajustado a 5.7, una vez preparado el medio se 
vacío a los frascos de cultivo y esterilizó en autoclave durante 20 min a 120°C, a una 
presión de 20 lbs/pulg
-1
. Todos los tratamientos empleados, con sus respectivas 
repeticiones, fueron preparados para realizar subcultivos mensuales. Cada frasco se 
consideró como una repetición. 
 
6.3 Germinación de Semillas 
En la germinación de las semillas provenientes de la cápsula colectada de T. 
pachyphyllum, se utilizaron los medios de cultivo KM y P como tratamientos, en frascos 
de vidrio de 125ml, con 25 ml de medio de cultivo, con 5 repeticiones por cada tratamiento. 
 
6.3.1 Desinfestación y siembra in vitro 
La cápsula fue tallada con un cepillo con jabón y enjuagada en agua corriente del 
grifo, después, en la campana de flujo laminar sumergida en una solución de hipoclorito de 
sodio al 0.5% adicionado con una gota de jabón y se mantuvo en agitación durante 10 min. 
Después se hizo una serie de enjuagues con agua destilada estéril para eliminar restos del 
cloro y del jabón. La cápsula fue sumergida en etanol al 70% por 3 min y con ayuda de 
18 
 
unas pinzas flameada en el mechero hasta consumir el fuego de la cápsula. Posteriormente, 
la cápsula fue colocada en una caja Petri estéril, con un bisturí y pinzas de disección 
esterilizadas, se disecó a lo largo en tres partes, para distribuir las semillas contenidas en los 
carpelos de forma homogénea dentro de cada uno los recipientes con medio de cultivo, los 
cuales se sellaron con plástico autoadherible. 
 
6.3.2 Evaluación de germinación y desarrollo de T. pachyphyllum 
Para evaluar la germinación y el desarrollo de los diferentes estadios se considero la 
descripción A de estadios descritos y propuestos por Batigyna y colaboradores (2003), 
Espinosa (2004) y Shimura y Koda (2004); mientras que, la descripción B fue utilizada 
para evaluar el desarrollo de tejido indiferenciado: 
ESTADIO 
o VALOR 
INDICE DE 
DESARROLLO 
DESCRIPCION A DESCRIPCION B 
1 100 Semilla sin germinar 
Tejido indiferenciado 
 
2 200 Semilla hinchada y verde 
Protocormo 
 
3 300 Protocormo 
Protocormo con primordio 
foliar 
4 400 Protocormo con primordio 
foliar 
Protocormo con una hoja 
 
5 500 Protocormo con una hoja 
 
Protocormo con dos hojas 
 
6 600 Protocormo con dos hojas 
 
Protocormo con tres hojas 
 
7 700 Protocormo con tres hojas Plántula con raíces 
8 800 Plántula con raíces 
 
 
 
 
 
El criterio para establecer que se inicio la germinación fue a partir del estadio 2 ó 
semilla hinchada y verde. Durante cinco meses se registró quincenalmente el porcentaje de 
estadios para cada replica, la suma de los porcentajes de cada réplica dió el total o 100% de 
los individuos evaluados. 
 
 
19 
 
6.3.3 Índice de desarrollo 
 
Para seguir el desarrollo de forma cuantitativa y establecer la diferencia de 
respuestas morfogénicas entre los tratamientos, cada 15 días durante cinco meses fueron 
registrados los porcentajes de cada estadio de desarrollo de cada replica y se le asignó un 
valor a cada estadio de desarrollo del embrión. En cada repetición fue registrada la 
frecuencia de cada valor expresado como un porcentaje del número total de individuos. El 
porcentaje obtenido fue multiplicado por el valor de sus respectivos estadios asignados, 
para finalmente sumarlos y el total se consideró como el valor del índice de desarrollo. 
 
6.4 Proliferación y desarrollo del tejido indiferenciado 
El medio utilizado fue el KM, adicionado con dos RCV (ANA y BAP), en 
diferentes combinaciones a excepción del control (Tabla 2), los que se consideraron como 
los tratamientos para la proliferación del tejido indiferenciado y su regeneración. Cinco 
repeticiones fueron empleadas por cada tratamiento, cada frasco con 25 ml de medio. 
Tabla 2. Tratamientos con RCV para la proliferación y desarrollo de T. pachyphyllum 
 ANA mgL
-1
 
BAP mgL
-1
 
0 1 2 
0 Tratamiento 1 (T1) Tratamiento 2 (T2) Tratamiento 3 (T3) 
1 Tratamiento 4 (T4) Tratamiento 5 (T5) Tratamiento 6 (T6) 
2 Tratamiento 7 (T7) Tratamiento 8 (T8) Tratamiento 9 (T9) 
 ANA: ácido naftalen acético, BAP: bencil amino purina. 
 
6.4.1. Siembra in vitro de tejido indiferenciado 
Bajo condiciones asépticas, 0.500 g de tejido indiferenciado de T. pachyphyllum 
fueron colocados sobre el medio de cultivo para cada uno de los tratamientos con RCV. 
6.4.2. Evaluación de la proliferación y regeneración de tejido indiferenciado 
Para determinar el efecto hormonal del ANA y BAP se registró mensualmente, 
durante cinco meses, la proliferación de biomasa mediante el peso fresco del tejido 
indiferenciado en cada uno de los tratamientos con RCV. 
20 
 
Además, cada 15 días durante seis meses de cultivo, fue calculado el porcentaje de 
cada uno de los estadios diferenciados a partir del tejido indiferenciado. El porcentaje 
obtenido se multiplicó por el valor de sus respectivos estadios asignados, según la 
descripción B de estadios propuestos, para finalmente sumarlosy el total, considerarlo 
como el valor del índice de desarrollo. 
 
6.5 Desarrollo de protocormos 
Los protocormos con una hoja, generados a partir de la germinación in vitro de las 
semillas, fueron usados para inducir el desarrollo de plántulas. Se emplearon los medios de 
cultivo KM y Peters®, por cada medio se prepararon 9 tratamientos adicionados con 
diferentes concentraciones de compuestos orgánicos como el polvo de plátano y el carbón 
activado (Tabla 3), cada tratamiento consistió de 3 repeticiones con 25 ml de medio en 
frascos de 125ml. 
Tabla 3. Tratamientos con compuestos orgánicos para el desarrollo de protocormos de T. 
pachyphyllum. 
 
 
 
 
 C.A: Carbón activado, P.P: Polvo de plátano. 
 
6.5.1 Siembra in vitro de protocormos 
Bajo condiciones de asepsia y con ayuda de una pinza estéril se seleccionaron y 
colocaron 10 protocormos por repetición en cada uno de los tratamientos con medio de 
cultivo. 
 
6.5.2 Evaluación del desarrollo protocormos 
Para evaluar el efecto de los medios adicionados con compuestos orgánicos, durante 
el desarrollo de los protocormos con una hoja, seis evaluaciones quincenales fueron 
realizadas y se registró el porcentaje de estadios presentado en cada uno de los 
 P.P (gL
-1
) 
C.A(gL
-1
) 
1 10 20 
1 Tratamiento 1(T1) Tratamiento 2(T2) Tratamiento 3(T3) 
1.5 Tratamiento 4(T4) Tratamiento 5(T5) Tratamiento 6(T6) 
2 Tratamiento 7(T7) Tratamiento 8(T8) Tratamiento 9(T9) 
21 
 
tratamientos. El porcentaje obtenido fue multiplicado por el valor de sus respectivos 
estadios asignados según la descripción A de los estadios propuestos, para finalmente 
sumarlos y el total se consideró como el valor del índice de desarrollo. 
 
6.6 Desarrollo de plántulas 
Para comparar diferencias en el crecimiento y desarrollo de las plántulas obtenidas 
por la germinación de semillas inmaduras o vía indirecta por tejido indiferenciado, fueron 
seleccionaron aquellas con un rango de 0.3 a 0.5 cm de altura para las primeras y de 0.51 a 
0.8 cm para las segundas. 
Se utilizaron los medios de cultivo KM y Peters cada uno con 5 repeticiones. 
 
6.6.1 Subcultivo in vitro de plántulas 
Se colocó una plántula por frasco con ayuda de pinzas de disección previamente 
esterilizadas, todo el procedimiento se realizo en la campana de flujo laminar bajo 
condiciones de asepsia. 
 
6.6.2 Evaluación del desarrollo de plántulas 
Se registraron durante 6 quincenas los siguientes parámetros: longitud de la 
plántula; longitud de pseudobulbo; longitud y ancho de la hoja más larga y número de 
hojas; longitud y número de raíces. 
 
6.6.3 Incubación de los medios de cultivo 
El material biológico en los diferentes tratamientos con medios de cultivo se 
mantuvieron en el cuarto de incubación con iluminación proporcionada por 4 lámparas de 
luz fluorescente de 40 watts, con fotoperiodo de 16 horas luz por 8 horas de obscuridad y a 
una temperatura de 25 ± 3ºC. 
 
 
22 
 
6.7 Histología de tejido indiferenciado y estadios de desarrollo de T. pachyphyllum 
6.7.1 Fijación 
Para caracterizar histológicamente el tejido indiferenciado y la secuencia de 
regeneración de los diversos estadios por los que transita T. pachyphyllum se utilizó el 
manual de Técnicas para el estudio del desarrollo en angiospermas de López y 
colaboradores (1998). El material biológico fue fijado en una solución 1:1:1 de FAA 
(formaldehido-ácido acético- alcohol etílico), durante 48 horas, para después lavar con agua 
corriente. 
 
6.7.2 Deshidratación 
El tejido se colocó en una serie de etanoles graduales al 30%, 50%, 70%, 85%, 96% 
y 100%, cada uno durante 2 horas. Posteriormente fue transferido a una solución de etanol 
absoluto-xilol 1:1 por dos horas y finalmente a xilol puro durante media hora. 
 
6.7.3 Infiltración e inclusión en parafina 
El tejido fue colocado en una mezcla de parafina pura-xilol 2:1, 1:2 y 1:1, cada una 
por 12 horas para su infiltración. Para la inclusión, la parafina pura se colocó en cubos de 
papel encerado y antes de que ésta solidificara, las muestras de tejido fueron acomodadas. 
 
6.7.4 Obtención de cortes histológicos de tejidos vegetales incluidos en parafina 
Los bloques de parafina se pegaron a una base de madera y montaron en el 
portamuestras del microtomo para realizar una serie de cortes de 15 y 20 micras de grosor. 
Los cortes fueron extendidos sobre un litro de agua con dos cucharadas de grenetina a 50ºC 
y colocados en portaobjetos para posteriormente hacer una desparafinación con tres 
cambios de xilol absoluto durante 10 minutos cada uno y una rehidratación en los etanoles 
graduales por 3 minutos, para después teñir con safranina durante una hora y verde rápido 
por un minuto. A cada laminilla se le agregó una gota de bálsamo de Canadá sobre el corte 
y se colocó un cubreobjetos sobre el, para dejar secar por 20 días en la estufa a 50ºC, 
posteriormente se limpiaron con xilol y etiquetaron para su observación al microscopio. 
23 
 
6.8 Análisis estadístico 
A los datos obtenidos del porcentaje de germinación, del índice de desarrollo 
durante la germinación de semillas, desarrollo y peso fresco de tejido indiferenciado, 
desarrollo de protocormos y de plántulas, se les aplicó un análisis de varianza (ANDEVA), 
utilizando el programa estadístico computarizado Statgraphics Plus 5.0, para conocer si 
existieron diferencias significativas entre los tratamientos empleados. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
24 
 
7 RESULTADOS 
 
7.1. Germinación de semillas de T. Pachyphyllum 
 
Durante el proceso de germinación hubo diferencias significativas (P<0.05), entre 
los tratamientos, medio KM y Peters, y a través del tiempo ya que el valor de P fue igual a 
0 (Ver anexo, tabla 4). 
 
De forma global, el porcentaje promedio de germinación fue del 86% en el medio 
Peters, a diferencia del medio KM que fue del 56% (Ver anexo, gráfica 1 y tabla 5). 
Para los tres últimos tiempos de evaluación, correspondientes a los 120, 135 y 150 
días de cultivo, se obtuvo 97.5% de germinación (Ver anexo, tabla 6). 
 
Las semillas que germinaron en el medio KM presentaron características 
morfológicas diferentes a las germinadas en el medio Peters, debido a que la coloración, 
tanto de los protocormos como de los embriones, fue de un tono verde más intenso, así 
como el grosor de los protocormos que fue del doble de tamaño (Fig. 5). 
 
La germinación de las semillas en el medio de cultivo Peters a los 15 días fue del 
1%; sin embargo 30 días después, se obtuvo 100% de germinación. Mientras que en el 
medio KM hasta los 60 días se obtuvo el 46% de germinación y para los 105 la 
germinación fue del 95%, la que persistió hasta los 150 días (Gráfica 2). 
 
 
 
 Figura 5.- Protocormos de T. pachyphyllum in vitro a los 60 días de cultivo en dos 
 medios de cultivo: A)Peters y B) KM 
B) 
 1 mm 
A) 
 
 0.5 mm 
25 
 
GRÁFICA 2.- Germinación in vitro de semillas de T. pachyphyllum en dos medios de cultivo. 
 
 
7.2 Índice de desarrollo de semillas de T. pachyphyllum 
 
Durante el proceso de germinación, en el índice de desarrollo de las semillas de T. 
pachyphyllum existieron diferencias significativas (P<0.05) entre los tratamientos y para los 
tiempos de cultivo (ver anexo, Tabla 7). El índice de desarrollo promedio durante la 
germinación en el medio Peters fue de 350, lo que indica el desarrollo tanto de protocormos 
como de protocormos con ápice, mientras que en el medio KM el índice promedio obtenido 
fue de 300, correspondiente al estadio de protocormos (ver anexo, tabla 8). 
 
Para los días de cultivo, en promedio, a los 15 días de cultivo el índice de desarrollose mantuvo en 100, el cual corresponde a semillas sin germinar, mientras que a los 150 
días, el promedio del índice fue igual a 500, estadio perteneciente a protocormo con una 
hoja (ver anexo, tabla 9). 
 
En la gráfica 4 se puede apreciar que a los 15 días de cultivo, en ambos medios, 
Peters y KM, el índice de desarrollo fue igual a 100, correspondiente al estadio de semillas 
sin germinar. Posteriormente a los 30 días, el índice se incrementó a 160 en el medio 
Peters, lo que indica la presencia tanto de semillas sin germinar como de semillas con el 
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
15 30 45 60 75 90 105 120 135 150
KM
Peters
Desarrollo in vitro de semillas de T. pachyphyllum
Días de cultivo
In
d
ic
e
 d
e
 d
e
sa
rr
o
llo
Medio
KM
Peters
0
100
200
300
400
500
600
15 30 45 60 75 90 105 120 135 150
26 
 
embrión hinchado; a diferencia de las semillas en el medio KM cuyo índice se mantuvo en 
100 y fue a los 60 días que se observó el incremento del índice a 200, correspondiente a 
semillas con embrión hinchado, índice que persistió hasta los 75 días de cultivo y fue hasta 
los 90 días que se alcanzó el índice de 300, correspondiente al estadio fenológico de 
protocormo; mientras, que a los 105 días de cultivo se observó un índice de 400, 
perteneciente al estadio de protocormos con ápice, éste se mantuvo hasta los 120 días. Para 
los 135 y 150 días, los valores del índice de desarrollo fueron de 530 y 540 
respectivamente, representando estadios de protocormos con una hoja y protocormos con 2 
hojas; sin embargo, aunque no se ve reflejado en el índice de desarrollo, se pudo apreciar a 
los 150 días de cultivo, la presencia de plántulas con tres hojas y raíces, los cuales 
representan índices de 700 a 800. 
 
En el medio de cultivo Peters el índice de desarrollo desde los 45 hasta los 75 días 
de cultivo se mantuvo en 300, es decir, en estadio de protocormo, y fue hasta los 95 días 
que el índice aumentó a 400 observando protocormos con ápice y se incrementó este valor 
a 480 a los 150 días de cultivo, momento en que los protocormos habían desarrollado 
además del ápice, una hoja (Gráfica 4). 
 
 
Gráfica 4.- Desarrollo durante la germinación in vitro de semillas de T. pachyphyllum en 2 medios 
 de cultivo. A) Medio de cultivo KM, B) Medio de cultivo Peters. 
Días de cultivo
In
di
ce
 d
e 
de
sa
rro
llo
KM
Peters
0
100
200
300
400
500
600
700
800
15 30 45 60 75 90 105 120 135 150
A) 
B) 
27 
 
Aunque en el medio de cultivo Peters se obtuvo un promedio mayor del índice de 
desarrollo que en KM (ver anexo gráfica 3), las características morfológicas de los 
protocormos y de las plántulas en éste último medio fueron superiores, ya que a partir de 
los 120 días hasta los 150 días de cultivo tuvieron el doble de tamaño y un color verde 
mucho más intenso que los obtenidos en el medio Peters, en donde perdían la clorofila 
tornándose finalmente amarillentas (Fig. 6). 
 
 
 
 Figura 6.- Protocormos con ápice a) Peters y protocormos con 2 y 3 hojas b) KM de T. 
 pachyphyllum in vitro a los 135 días de cultivo. 
 
 
 
 
7.3 Desarrollo de tejido indiferenciado 
 
 
Durante el desarrollo del tejido indiferenciado existieron diferencias significativas 
(P<0.05) entre los tratamientos y a traves del tiempo (ver anexo tabla 10). 
 
El índice de desarrollo promedio, en los 9 tratamientos, se mantuvo por debajo de 
200 o estadio de protocormo (ver anexo, gráfica 5). 
 
Los tratamientos que indujeron el mayor desarrollo del tejido calloso fueron el T9, 
con 2mgL
-1
 de ANA y de BAP, y el T1, sin reguladores del crecimiento vegetal, con un 
índice de desarrollo de 163 y 162 respectivamente; mientras que los tratamientos con el 
menor índice fueron el T2 con 1mgL
-1
 de ANA, y el T4 con 1mgL
-1
 BAP, con 120 y 122 
respectivamente, en donde la mayor parte del tejido continuaba sin diferenciarse, pero se 
0.8mm 
A) 
1.5mm 
B) 
28 
 
observaron algunos protocormos, aunque en menor cantidad que en los tratamientos 9 y 1 
(ver anexo, Tabla 11). 
 
El mayor indice de desarrollo promedio para el tiempo registrado fue de 200 y se 
obtuvo a los 180 días de cultivo (ver anexo, tabla 12). Mientras que durante las 
evaluaciones quincenales, el indice de desarrollo más alto fue en el tratamiento 9, con 270 y 
T1 con 260 (Gráfica 6). 
 
 
Gráfica 6.- Desarrollo del tejido indiferenciado en el medio de cultivo KM adicionado con diferentes 
 concentraciones de ANA y BAP. 
T1.-ANA y BAP=0mg; T2.- ANA=1mg; T3.- ANA=2mg; T4.- BAP=1mg; T5.-ANA y BAP= 1mg; 
T6.- ANA=2mg, BAP=1mg; T7.- BAP=2mg; T8.- ANA=1mg, BAP=2mg; T9.- ANA y BAP=2mg. 
 
 
Como respuesta a la aplicación de reguladores del crecimiento vegetal durante los 
primeros 15 y 30 días, el tejido comenzó a diferenciarse, presentando algunos cuerpos 
parecidos a protocormos en la mayoría de los tratamientos, a excepción del T1,T3 y T5, 
también se observó que el tejido adquiría un color verde claro. 
 
Durante los 45 días de cultivo el T7 y el T9 mostraron un incremento del 7% y 4% 
de protocormos con ápice respectivamente. A los 60 días de subcultivo el T1 y el T7 
mostraron el 1% de protocormos con una hoja, mientras que el T2 el 1% de protocormos 
con ápice, 8% de protocormos y el resto seguía siendo tejido calloso, también se observó el 
Días de cultivo
In
d
ic
e
 d
e
 d
e
s
a
rr
o
ll
o
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180
29 
 
tejido calloso color amarillo. 
 
Para los 75 días, el T3 presentó el 2% protocormos con 2 hojas, de igual manera el 
T7 y T9 presentaron el 1% de protocormos con dos hojas; el T2 continuo sin cambios. A 
los 90 días de cultivo, la mayor parte del tejido indiferenciado estaba clorotico, necrosado, 
y las pocos hojas que se desarrollaron se secaron, por lo tanto se subcultivo el tejido al 
medio KM carente de hormonas, para continuar con las evaluciones. 
 
Para los 105 días, se desarrollaron protocormos con una hoja en el T1, T3, T7, y T9, 
con 2%, 7%, 2% y 6% respectivamente; mientras que el T2 presentó el 24% de 
protocormos. El T2, a los 120 días, presentó 1% de protocormos con una hoja. Los 
tratamientos que mostraron protocormos con dos hojas son T1, T3, y T9, con el 2%, 3%, y 
6%. 
 
A los 135 días de cultivo, el T9 presentó el 6.4% de protocormos con dos hojas, 
seguido de T3 con 3.6%. Más del 50% del tejido de T9 se observó clorotico. Durante los 
150 días se observó el 2% de protocormos con tres hojas en el T3; mientras que el T2 y el 
T7 fueron los menos diferenciados con 1.4% de protocormos con una hoja. El T9 no 
presentó ningún cambio, excepto que el 100% de tejido estaba clorotico y se comenzaba a 
necrosar. 
 
Los tratamientos más representativos a los 180 días de cultivo, fueron T1, T3 y T9, 
ya que hubo una mayor diferenciacion de tejido indiferenciado que permitió el desarrollo 
de protocormos, protocormos con ápice y protocormos con una, dos y tres hojas (Gráfica 
7). 
 
30 
 
Gráfica 7.- Porcentaje de estadios diferenciados in vitro a partir de tejido indiferenciado de T. pachyphyllum 
 a los 180 días de cultivo en 3 tratamientos con RCV. 
T1.-ANA y BAP=0mg; T3.- ANA=2mg; T9.- ANA y BAP=2mg. 
 
 
7.4 Proliferación de tejido indiferenciado 
 
 
En la proliferación del tejido indiferenciado existieron diferencias significativas 
(P<0.05) del peso fresco, entre tratamientos y a través del tiempo (ver anexo, tabla 13). 
 
El tratamiento en donde se registró el menor peso fresco promedio de tejido calloso 
fue el T4, con 3,000 mg de tejido, a diferencia de T1, tratamiento control, en dondehubo 
una proliferación de tejido de 5,000 mg (ver anexo, tabla 14), mientras que el peso fresco 
promedio para los días de cultivo, muestran que a los 180 días, se obtuvo la mayor 
proliferación, siendo esta de 8,000 mg (ver anexo, tabla 15 y gráfica 8). 
 
A los 30 días de cultivo, los tratamientos que indujeron una mayor proliferación de 
callo fueron el T1 y el T3 con 2,000 mg de tejido, mientras que el de menor proliferación 
fue el T4 con 500 mg de tejido indiferenciado. Para los 60 días de cultivo, en el T1 el peso 
del tejido proliferó un poco más del doble, con 4,200 mg, seguido por el T6 con 3,700 mg; 
mientras que, el T4 presentó la menor proliferación con 2,100 mg. A los 90 días de cultivo 
el tejido indiferenciado, en la mayoría de los tratamientos, comenzó a presentar tejido 
amarillento, clorofílico y necrosado, hasta obtener una coloración negra (Fig. 7), por lo que 
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Protocormos P+ápice P+1 hoja P+2 hojas P+3 hojas
T1
T3
T9
% 
31 
 
cada tratamiento adicionado con reguladores del crecimiento vegetal fue subcultivado al 
medio KM sin reguladores, así solo tendrían el estímulo exógeno que adquirieron al estar 
en contacto con ANA y/o BAP durante los tres meses anteriores. Hasta este tiempo (90 
días) en el T6 se obtuvo el mayor peso de tejido con 4,800 mg, seguido por los tratamientos 
1 y 8 con 4,700 mg. En el T4 se mantuvo con el menor peso, que fue de 3,100 mg. 
 
 
 
 Figura 7.- Tejido indiferenciado in vitro de Trichocentrum pachyhyllum, perdiendo coloración a 
 los 90 días de cultivo en tratamientos con hormonas. 
 
 
 
A los 120 días de cultivo, proliferó una mayor cantidad de tejido en el T6 y T8 con 
un peso fresco de 7,400 mg y 6,800 mg respectivamente, a diferencia del T4, T3 y T2, en 
donde se obtuvieron la menor cantidad de tejido, con 4,600 mg, 5,000 mg y 5,900 mg 
respectivamente. Al llegar a 150 días de cultivo, nuevamente la mayor proliferación de 
tejido fue en T1 con 7,800 mg. Sin embargo, el tejido en el T3 tuvo un incremento de 2,800 
mg en 30 días. 
 
La mayor proliferación de tejido indiferenciado continuó a los 180 días, 
principalmente en el T1, con 9,300 mg de tejido calloso (Figura 8), seguido por el T3 con 
8,800 mg, T6 con 8,400 mg y el T9 con 8,000 mg, aunque el tejido en este último 
tratamiento perdió la clorofila y se comenzaba a necrosar; mientras que, el tejido que 
menos proliferación tuvo durante los 180 días fue el cultivado en el T4 ya que el peso 
fresco obtenido fue de 5,400 mg, (Gráfica 9). En T9 también se observaba el tejido de color 
blanco (Fig. 8). 
32 
 
 
 
 
Figura 8.- Proliferación in vitro de tejido indiferenciado de T. pachyphyllum a los 180 días de 
 cultivo. A) Tejido con clorofila en el tratamiento control (sin hormonas), B) Tejido sin 
 clorofila en el tratamiento 9 (2mg de ANA y BAP). 
 
 
 
Gráfica 9.- Proliferación in vitro de tejido indiferenciado de T. pachyphylum en el medio de cultivo KM 
con reguladores del crecimiento vegetal. 
T1.-ANA y BAP=0mg; T2.- ANA=1mg; T3.- ANA=2mg; T4.- BAP=1mg; T5.-ANA y BAP= 1mg; 
T6.- ANA=2mg, BAP=1mg; T7.- BAP=2mg; T8.- ANA=1mg, BAP=2mg; T9.- ANA y BAP=2mg. 
 
7.5 Desarrollo de protocormos 
 
 
Durante el desarrollo de los protocormos, obtenidos a partir de la germinación de 
semillas, existieron diferencias significativas (P<0.05) entre los tratamientos y a través del 
tiempo (ver anexo, tabla 16). 
 
El índice de desarrollo promedio de los protocormos, fue diferente en todos los 
Días de cultivo
P
e
s
o
 f
re
s
c
o
 e
n
 m
g
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
0
2
4
6
8
10
(X 10 00)
0 30 60 90 12 0 15 0 18 0
A) B) 
33 
 
tratamientos, excepto el T3 (1 gL
-1
 de polvo de plátano y 2 gL
-1
 de carbón activado) y el T5 
(10 gL
-1
 de polvo de plátano y 1.5 gL
-1
 de carbón activado) con medio Peters, ya que en 
ambos se obtuvo un índice de 323, lo que indica la presencia tanto de protocormos como de 
protocormos con ápice (ver anexo, tabla 17). Los tratamientos en donde se obtuvo el menor 
índice de desarrollo fue con el medio Peters, con un valor de 478, lo que indica la presencia 
tanto de protocormos con ápice como de protocormos con una hoja; mientras que, el mayor 
índice de desarrollo fue en la mayoría de los tratamientos con medio KM, en especial en el 
T3 con un índice de 619, que es el estadio perteneciente a protocormos con 2 hojas (ver 
anexo, gráfica 10). 
 
En cuanto al tiempo de cultivo el mayor índice de desarrollo promedio fue de 543, 
éste se obtuvo a los 30 días de cultivo y en él se observaron protocormos con una y dos 
hojas (ver anexo, tabla 18). 
 
 
Inicialmente se cultivaron protocormos con una hoja, indicé de desarrollo 500; sin 
embargo, a los 15 y 30 días de su cultivo, algunos de estos protocormos en los tratamientos 
con el medio Peters perdieron la clorofila y se necrosaron, como en el T1 (1 gL
-1
 de polvo 
de plátano y 1 gL
-1
 de carbón activado) lo que causó la disminución del valor del índice de 
desarrollo a 200, es importante mencionar que este estadio indicaría que son semillas 
hinchadas, pero al morir los protocormos, el índice disminuyó, sin embargo el resto de los 
protocormos con una hoja iniciaron cambios morfológicos notables, se diferenció la 
segunda hoja; mientras que, en la mayoría de los tratamientos con medio KM, a los 30 días 
de cultivo, el índice se incrementó, desarrollándose la segunda hoja en el protocormo 
(Gráfica 10). 
 
A los 45 y 60 días de cultivo, más del 50% de los protocormos en medio Peters ya 
había muerto, a diferencia del medio KM en donde se observó el desarrollo de una tercera 
hoja. Se observaron plántulas con raíces (Fig. 9), índice de desarrollo de 700, a los 75 y 90 
días de cultivo en el medio KM. 
 
 
34 
 
 
 Figura 9.- Plántula con raíces in vitro de T. pachyphyllum, a los 90 días, en medio de cultivo KM 
 (A), protocormos con 2 hojas y protocormos muertos en medio Peters (B). 
 pm=protocormos muertos 
 
 
 
Al final del cultivo, 90 días, el T3 del medio KM fue el mejor tratamiento con un 
índice de desarrollo de 716, equivalente a protocormos con tres hojas y algunas plántulas 
con raíces (Grafica 11). A diferencia del T3 del medio Peters que fue de 100 (Grafica 12). 
En la mayoría de los tratamientos con medio de cultivo Peters el índice de desarrollo 
disminuyó debido a la muerte de los protocormos. Mientras que en los tratamientos del 
medio KM se observó la presencia de tejido indiferenciado. 
 
 
Gráfica 11.- Desarrollo protocormos con una hoja en medio de cultivo KM con diferentes concentraciones 
de Polvo de plátano (PP) y carbón activado (C.A). 
T1.- PP=1g, C.A=1g; T2.- PP=1g, C.A= 1.5g; T3.- PP=1g, C.A=2g; T4.-PP=10g, C.A=1g; 
T5.- PP= 10g, C.A=1.5g;T6.- PP=10g, C.A=2g; T7.-PP= 20g, C.A=1g; T8.- PP=20g, C.A= 1.5g; T9.-PP=20g,C.A=2g. 
Días de cultivo
In
d
ic
e
 d
e
 d
e
s
a
rr
o
llo T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 15 30 45 60 75 90
A) B) pm 
35 
 
 
Gráfica 12.- Desarrollo de protocormos con una hoja en medio de cultivo Peters, con diferentes 
 concentraciones de Polvo de plátano (PP) y carbón activado (C.A). 
T1.- PP=1g, C.A=1g; T2.- PP=1g, C.A= 1.5g; T3.- PP=1g, C.A=2g; T4.-PP=10g, C.A=1g; T5.- PP= 10g, C.A=1.5g; 
T6.- PP=10g, C.A=2g; T7.-PP= 20g, C.A=1g; T8.-PP=20g, C.A= 1.5g; T9.-PP=20g,C.A=2g. 
 
Los tratamientos del medio KM, en el que se obtuvo la mayor cantidad de plántulas 
con raíces fueron el T1 y el T7, ambos con 40%, a diferencia del medio P, donde se obtuvo 
en el T7, a los 90 días de cultivo, únicamente el 10% plántulas de raíces (Tabla 19). 
 
Tabla 19.- Porcentaje de plántulas con raíces de T. pachyphyllum diferenciadas in vitro en dos 
medios de cultivo adicionados con compuestos orgánicos. 
T1.- PP=1g, C.A=1g; T2.- PP=1g, C.A= 1.5g; T3.- PP=1g, C.A=2g; T4.-PP=10g, C.A=1g; T5.- PP= 10g, C.A=1.5g; 
T6.- PP=10g, C.A=2g; T7.-PP= 20g, C.A=1g; T8.- PP=20g, C.A= 1.5g; T9.-PP=20g,C.A=2g. 
 
 
Días de cultivo
In
d
ic
e
 d
e
 d
e
s
a
rr
o
ll
o
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 15 30 45 60 75 90
 Tratamiento 
Días con KM 
de cultivo 
1 2 3 4 5 6 7 8 9 
15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 
30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 
45 0 0 0 0 0 0 0 5 0 
60 0 0 0 5 5 0 0 5 5 
75 25 10 30 20 5 0 40 15 35 
90 40 20 30 30 20 0 40 30 35 
 Tratamiento 
Días con P 
de cultivo 
1 2 3 4 5 6 7 8 9 
15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 
30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 
45 0 0 0 0 0 0 0 0 0 
60 0 0 0 3 0 0 3 0 0 
75 0 0 0 7 0 0 10 3 7 
90 3 3 0 0 0 7 10 7 7 
36 
 
7.6 Desarrollo de plántulas 
 
 
7.6.1 Crecimiento de pseudobulbos 
 
Durante el desarrollo de las plántulas se obtuvieron diferencias significativas 
(P<0.05) en la longitud de los pseudobulbos entre los tratamientos como a través del tiempo 
(ver anexo, tabla 20). 
 
La mayor longitud promedio alcanzada por los pseudobulbos fue de 5 mm en el T2 
sobre el medio de cultivo Peters; mientras que, los de menor crecimiento fueron en el T1 
sobre el medio KM con 4 mm de longitud; ambos tratamientos con plántulas originadas a 
partir de semillas (ver anexo, tabla 21 y gráfica 13). A los 90 días de cultivo la mayor 
longitud promedio de los pseudobulbos fue de 5 mm (ver anexo, tabla 22). 
 
Las evaluaciones quincenales mostraron que efectivamente el tratamiento que 
presentó los pseudobulbos de mayor tamaño fue el T2, con plántulas procedentes de 
semillas, en donde se obtuvieron pseudobulbos de 5.5 mm de longitud a los 90 días de 
cultivo); así como los de menor tamaño se obtuvieron en el T1 con 4.8 mm (Gráfica 14 y 
figura 10). 
 
 
 
Figura 10.- Longitud de pseudobulbos in vitro de T. pachyphyllum a 90 días de cultivo 
 A) medio de cultivo KM, B) medio de cultivo Peters 
 
 
 
A) B) 
4.8 mm 5.5 mm 
37 
 
 
Gráfica 14.- Longitud de pseudobulbos de T. pachyphyllum durante el desarrollo de plántulas in vitro a partir 
de la germinación y del tejido indiferenciado en los medios de cultivo KM y P. 
T1= Medio KM con plántulas procedentes de semilla; T2= Medio Peters con plántulas procedentes de semilla; 
T3= Medio KM con plántulas procedentes de tejido indiferenciado; T4= Medio Peters con plántulas procedentes de tejido indiferenciado. 
 
 
7.6.2 Desarrollo del número de hojas 
 
Existieron diferencias significativas (P<0.05) entre los tratamientos y los días de 
cultivo en cuanto al número de hojas (ver anexo, tabla 23). 
 
El mayor número de hojas promedio fue de 4 en el T3 el cual contiene plántulas 
originadas a partir de tejido indiferenciado, a diferencia de las 2 hojas desarrolladas en el 
T1, el cual contiene plántulas originadas a partir de semillas, ambos con medio de cultivo 
KM (ver anexo, tabla 24 y gráfica 15); mientras que para los días de cultivo, el promedio 
máximo de hojas es de 3, a los 90 días (ver anexo, tabla 25). 
 
 
Durante las evaluaciones quincenales, en promedio, el T3 presentó el mayor número 
de hojas; inicialmente presentó 3, a diferencia de las 4 hojas que obtuvo a los 90 días de 
cultivo (Figura 11), seguido del T4 que presentó 3.1 hojas desde los 45 días de cultivo y 
persistió hasta los 75 días, fue a los 90 días que obtuvo 3.4 hojas (Gráfica 16). 
 
Días de cultivo
L
o
n
g
it
u
d
 d
e
 p
s
e
u
d
o
b
u
lb
o
s
 (
m
m
)
T1
T2
T3
T4
0
5
10
15
20
25
15 30 45 60 75 90
38 
 
El menor número de hojas a los 90 días es de 3.2 y 2.4 en el T2 y el T1 
respectivamente (Fig. 11). 
 
 
Figura 11.- Número de hojas en plántulas desarrolladas in vitro de T. pachyphyllum 
 A) Plántula con 4 hojas en medio de cultivo KM, B) Plántula con 2 hojas en medio P 
 
 
 
Gráfica 16.- Generación de hojas de T. pachyphyllum durante el desarrollo de plántulas in vitro a partir de la 
germinación y del tejido indiferenciado en los medios de cultivo KM y P. 
T1= Medio KM con plántulas procedentes de semillas; T2= Medio Peters con plántulas procedentes de semillas; 
T3= Medio KM con plántulas procedentes de tejido indiferenciado; T4= Medio Peters con plántulas procedentes de tejido indiferenciado. 
 
7.6.3 Longitud de la hoja más larga 
 
Existieron diferencias significativas (P<0.05) entre los días de cultivo pero no para 
los tratamientos durante el crecimiento de la hoja más larga (ver anexo, tabla 26). 
Días de cultivo
N
ú
m
e
ro
 d
e
 h
o
ja
s
T1
T2
T3
T4
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
15 30 45 60 75 90
 A) B) 
39 
 
 
 
La menor longitud de hoja promedio que se obtuvo es de 10.5 mm en el T3, con 
plántulas originadas de tejido calloso y de 10.8 mm el T1, con plántulas obtenidas a partir 
de la germinación de semillas, ambos tratamientos con medio de cultivo KM; mientras que 
las mayores longitudes fueron de 13 mm en el T2 con plántulas procedentes de semillas y 
de 13.2 mm el T4 con plántulas originadas a partir de tejido calloso, los dos tratamientos 
compuestos por medio de cultivo Peters (ver anexo, tabla 27 y gráfica 17). La mayor 
longitud de hoja, se registro a los 90 días de cultivo, esta fue de 16 mm de largo (ver anexo, 
tabla 28). 
 
En la observacion al estereoscopio, a los 15 días de cultivo, la hoja más larga midio 
6 mm en el T4; mientras que para los 90 días, la hoja midio 18 mm (Fig. 12). En el T2, a 
los 15 días, la longitud de las hojas era de 9 mm y despues de 75 días de cultivo (90 días) la 
longitud fue de 15 mm (Fig. 12). Las hojas más largas de las plantulas cultivadas para su 
desarrollo en el T3 y el T1, a los 15 días, median 8mm de longitud y para los 90 días de 
cultivo alcanzaron una longitud de 14 mm y 13 mm respectivamente y fueron por lo tanto 
los tratamientos en donde hubo una menor elongación de las hojas, ambos tratamientos 
compuestos por medio de cultivo KM (Gráfica 18). 
 
 
 
Figura 12.- Longitud de la hoja más larga durante el desarrollo de plántulas in vitro de T. pachyphyllum. 
A)Plántula con la hoja más elongada en T4; B) Plántula con la hoja más elongada T3. 
A) B) 
18 mm 
15 mm 
40 
 
 
Gráfica 18.- Crecimiento de la hoja más larga de T. pachyphyllum durante el desarrollo de plántulas in vitro a 
partir de la germinación y del tejido indiferenciado en los medios de cultivo KM y P. 
T1= Medio KM con plántulas procedentes de semillas; T2= Medio Peters con plántulas procedentes de semillas; 
T3= Medio KM con plántulas procedentes de tejido indiferenciado; T4= Medio Peters con plántulas procedentes de tejido indiferenciado. 
 
 
 7.6.4 Longitud de la hoja más ancha 
 
En cuanto al crecimiento de la hoja más ancha no existieron diferencias 
significativas (P<0.05) entre los días de cultivo, pero si para los tratamientos (ver anexo, 
tabla 29). 
 
El tamaño de la hoja más ancha, en promedio, fue de 6.4 mm en el T3 compuesto 
por medio de cultivo KM, hasta 8.8 mm en el T4 con medio de cultivo Peters, ambos 
tratamientos con plántulas originadas a partir de tejido calloso (ver anexo, tabla 30,