Estudio-de-macrofagos-alternativamente-activados-por-Taenia-crassiceps-en-coinfeccion-por-Trypanosoma-cruzi

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ESTUDIO DE MACRÓFAGO
ACTIVADOS POR 
 
 
 
 
ESTUDIO DE MACRÓFAGO
ACTIVADOS POR Taenia cra
POR Trypano
 
ESTUDIO DE MACRÓFAGO
LOS REYES IZTACALA, EDO. DE MÉXICO 
 
LOS REYES IZTACALA, EDO. DE MÉXICO LOS REYES IZTACALA, EDO. DE MÉXICO 2010 
DIRECTORA DE TESIS: 
DRA. MIRIAM RODRIGUEZ SOSADRA. MIRIAM RODRIGUEZ SOSA 
T E S I S T E S I S 
 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA 
DE MEXICO 
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA 
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE:
B I O L O G O
P R E S E N T A :
JUAN DE DIOS RUIZ ROSADO
PARA OBTENER EL TITULO DE: 
B I O L O G O 
P R E S E N T A : 
JUAN DE DIOS RUIZ ROSADO 
S ALTERNATIVAMENTE S ALTERNATIVAMENTE 
ssiceps EN COINFECCIÓN 
soma cruzi 
S ALTERNATIVAMENTE 
EN COINFECCIÓN 
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES 
 
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES 
IZTACALA 
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES 
 
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El presente trabajo se realizó en la Unidad de Biomedicina de la Facultad de 
Estudios Superiores Iztacala (UNAM) Laboratorio 5 y en el Laboratorio de la 
Dra. Rebeca Manning Cela del departamento de Biomedicina Molecular en el 
CINVESTAV, bajo la asesoría de la Dra. Miriam Rodríguez Sosa. 
Este proyecto fue financiado en parte por PAPIT IN213009-3. 
DEDICATORIAS 
 
Para mis padres, por ser ambos el más grande ejemplo de amor, sacrificio y 
perseverancia. Los amo y admiro. 
Para Azu y Jaz; mejores hermanas no pude haber tenido, las quiero mucho, 
siempre estaré ahí para ustedes. 
Para mi abuelo Filogonio a quien le había prometido llevar esta tesis a casa 
Para mis tías: Esperanza, Urania y mi abuelita Manuela por su amor 
desmedido y consejos. 
Par a mi abuelita Leonarda; siempre te recordaré. 
Para mi tía Hilda, la mujer más inteligente, determinada y fuerte que he 
conocido, te quiero mucho. 
Para mis grandes amigos: Víctor, Kenia, Adrian, Claudia, Karina, Carmen, 
Cindy, Edith, Liliana, Yahir, Leo, Lalo y Alper; por los mejores momentos 
compartidos en la carrera y mas allá, que me tomaría otra tesis describirlos 
todos, los quiero, algunos de ustedes saben que son y seguirán siendo más 
que amigos para mí. Les deseo la mejor de las suertes en lo que sea que 
emprendan hoy y más adelante y espero que aun cuando tomemos caminos 
diferentes, siempre estemos en contacto. 
Para mis inseparables amigos de Oaxaca Andy, Alan, Pepe, Mada, Alhelí y 
Jenny que a pesar de la distancia siempre se acuerdan de mí y algunos me 
quieren como a un hermano y yo siento lo mismo por ellos, se que nuca los 
perderé de vista, ni ustedes a mí, me da gusto verlos crecer con migo y estar 
ahí para apoyarlos en lo que sea, los quiero mucho. 
Para la gente que conforma la Fundación Roberto Pla Inchausti, al patronato y 
a Rosario por el gran apoyo brindado durante la carrera y los amigos que 
hicieron de las tardes de martes las más amenas, gracias por todo. 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
A Dios por lo bueno que ha sido conmigo 
A mi familia por todo el cariño y apoyo 
A la Doctora Miriam Rodríguez Sosa por su confianza, apoyo y consejos 
dentro y fuera del laboratorio. 
 Al doctor Luis Ignacio Terrazas Valdés por sus, opiniones y observaciones 
acertadas en el desarrollo de este proyecto 
A la doctora Rebeca Manning Cela por abrirme las puertas de su laboratorio y 
contribuir importantemente en este proyecto. 
A mis sinodales por la atención prestada a esta tesis: 
Dr. Luis Ignacio Terrazas Valdés 
Dr. Santiago Martínez Calvillo 
Dra. Miriam Rodríguez Sosa 
M.C. Héctor Barrera Escorcia 
Dr. Marco Aurelio Rodríguez Monroy 
A los compañeros del laboratorio con los que he aprendido y pasado las 
mejores tardes de reflexión y congresos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ÍNDICE……..........................................................................................................5
ABREVIATURAS…..………………………….…..……….…...……………………..8
RESUMEN....…………….……………………………………………………….……9
INTRODUCCIÓN…………………………………………………………….……..10
 1. Las diversas funciones de los Macrófagos…….…………………………...10
 2. Activación de macrófagos………………..…………………………….…….11
 A) MøCA o M1……..…………………………………………….………11
 B) MøAA o M2………………………………..………………..…...……12
 3. Polarización de la respuesta inmune debido a la infección por 
 Helmintos………………………………………………………………………13 
 4. Taenia crassiceps. Características generales………………….……….....15
 A) Inmunología de Taenia crassiceps………………………...…........15
 5. Trypanosoma cruzi. Características generales………………………..…..16
 A) Inmunología de Trypanosoma cruzi……………………………….17
JUSTIFICACIÓN………………………………………………………….………….19
PLANTEAMINTO DE ESTUDIO………………………………………….………...21
HIPÓTESIS………………………………………………………………….……......22
OBJETIVO GENERAL…………………………………………………….……...…22
OBJETIVOS PARTICULARES…………………………………………….…...…..22
MATERIAL Y MÉTODOS……………….…………………………………………..23
 1.- Ratones………………………………………………………………...…...….23
 2.- Parásitos…………………………………………………………………….....23
 3.- Cultivo de T. cruzi…………………………………………………..…………23
 4.- Obtención de Macrófagos de la cavidad peritoneal……………….……...24
 5.- Infección in vitro de macrófagos de la cavidad peritoneal……………….24
 6.- Tinción de células (macrófagos) peritoneales…………………………..…25
 7.- Determinación de la producción in vitro de IL-12 en sobrenadante….25 
 de cultivo de macrófagos por medio de la técnica de ELISA-sándwich 
 8.- Determinación de oxido nítrico (NO) en sobrenadante de cultivo de
 macrófagos ……………………………………...……………………………26
 9.-RT-PCR………..…………………………………………………………....26
 10.- Caracterización de macrófagos y tripomastigotes de T. cruzi; análisis
 por citometría de flujo………………………………………………….…...…..27
RESULTADOS…………………………………………………………….…...…….28
 1.-Determinación de la parasitemia causada por el helminto 
 T. crassiceps……..……………………………………………………….….… 28
 2.-Identificación de Macrófagos Alternativamente Activados (MøAA)……....29
 3.-Porcentaje de macrófagos infectados por T. cruzi, cepa Querétaro…...... 31
 4.-Número de tripanosomas internalizados por macrófago………….........….35 
 5.- Porcentaje de macrófagos infectados por T. cruzi, CL-Brener 
 modificada con Fluorescencia……...…………………………………..….37
 6.-Número de tripanosomas internalizados por macrófago….……………....43
 7.-Determinación del grado de infección por T. cruzi por citometría 
 de flujo………………………………………………………………………...…46
 8.-Determinación de IL-12 en sobrenadantes de cultivos de macrófagos 
 co-infectados……………………………………………………….………...…50
 9.- Determinación de óxido nítrico en sobrenadantes de cultivos de 
 macrófagos co-infectados………………………………………………..…….52
 10.- Determinación de iNOS y Arginasa 1 en macrófagos co-infectados…...54
DISCUSIÓN…………………………………………………………….…………….56
CONCLUSIONES…………………………………………………………………... 62
ANEXO………………………………………………………………………………..63
REFERENCIAS……………………………...…………………………….…………64
ABREVIATURAS
W&G: Wright Giemsa (colorante)
ON: Oxido NítricoMø: Macrófagos
MøAA: Macrófagos alternativamente activados
MøCA: Macrófagos clásicamente activados
TGF-B: Factor de crecimiento transformante beta
IFN-γ: Interferón gamma
TNF-α: Factor de necrosis tumoral alfa
LPS: Lipopolisacaridos
ROS: Especies reactivas del oxigeno
iNOS: Oxido nítrico sintasa inducible
PD-1: Programa de muerte 1
TH1: Linfocitos TCD4+ de tipo 1 (promueven respuestas inmunes proinflamatorias) 
TH2: Linfocitos TCD4+ de tipo 2 (promueven respuestas inmunes antiinflamatorias y 
producción de anticuerpos)
p.i.: post-infección
i.p.: Intraperitoneal
IFN-γR: Interferón gamma recombinante
GFP : Proteína verde fluorescente
CFSE: Ester succinimidil diacetato carboxifluorescein(marcador fluorescente que se 
incorpora al citoplasma)
F4/80: Glicoproteína de 160kD expresada en macrófagos de ratones
APC: Células presentadoras de antígeno
Arg 1: Arginasa 1
Resumen
Los parásitos helmintos han desarrollado complejos mecanismos para evadir y modular 
la inmunidad de su hospedero. Esta inmunomodulación puede alterar la respuesta a 
otros retos patogénicos. La infección persistente con el helminto T. crassiceps induce la 
diferenciación de macrófagos alternativamente activados (MøAA) los cuales se cree 
tienen una menor capacidad de respuesta a patógenos intracelulares, para determinar 
dicha capacidad de los MøAA, se extrajeron Mø de la cavidad peritoneal de ratones 
C57BL/6 ó BALB/c con 0, 2, 4, 6, 8 y 12 semanas post-infección con T. crassiceps. Se 
caracterizaron los estados de activación de los Mø mediante la determinación de 
transcritos de los genes YM1, FIZZ1, iNOS y ARG1 por RT-PCR. Los Mø fueron 
infectados in vitro con tripomastigotes de T. cruzi (cepas Querétaro), estimulados con 
IFN-γ y después de 48 h se tiñeron con W&G y se analizó el No. de células infectadas y 
el No. de parásitos/célula en el microscopio de luz; también se utilizaron 
tripomastigotes marcados con CFSE y anti-F4/80 para analizarlos por citometría de 
flujo. Cultivos similares se hicieron con T. cruzi-fluorescentes (cepa CL-Brener), que se 
analizaron al microscopio de fluorescencia. Se determinaron en el sobrenadante de 
cultivo los niveles IL-12 y óxido nítrico (ON).
 Los Mø provenientes de ratones infectados crónicamente con T. crassiceps tuvieron 
disminuida su capacidad lítica, produjeron bajos niveles de IL-12 y ON, mientras que 
expresaron altos niveles de YM1, FIZZ1 y ARG1 comparados con los Mø de 
infecciones tempranas y sin infección, los cuales produjeron altos niveles de IL-12 y 
ON además de expresar altos niveles de iNOS. Adicionalmente los MøAA obtenidos de 
infecciones crónicas de T. crassiceps, presentaron una capacidad disminuida para 
eliminar la infección in vitro por T. cruzi aún en presencia de IFN-γ que es la citocina 
asociada a protección en tripanosomiasis. Así una posible co-inifección helminto-T. 
cruzi puede favorecer la instalación del protozoario al alterarse una de las principales 
células (Mø) involucradas en su eliminación. 
Introducción
La función fisiológica del sistema inmune consiste en la defensa contra agentes 
infecciosos y no infecciosos. Este sistema está constituido por todas las células y 
moléculas que generan una serie de reacciones en contra de substancias extrañas o 
ajenas al organismo, es decir que generan inmunidad. Así la respuesta colectiva y 
coordinada de estas células y moléculas ante la invasión de dichas substancias ajenas, 
conforman lo que llamamos respuesta inmune [1].
La protección inmunitaria contra los microorganismos está a cargo de reacciones 
tempranas correspondientes a la inmunidad innata y respuestas tardías de la inmunidad 
adaptativa. Los monocitos forman parte del mecanismo de defensa celular de la 
inmunidad innata y derivan de células precursoras de la medula ósea; éstos circulan por 
el torrente sanguíneo por corto tiempo y se extravasan alcanzando órganos y tejidos. 
Una vez que esto ocurre se diferencian a células macrófagos (Mø) [1]. Los Mø están 
ampliamente distribuidos en todos los tejidos del cuerpo y forman junto con otras 
células fagocíticas, como los neutrófilos y células dendríticas, la primera línea de 
defensa contra microorganismos comunes.
Las diversas funciones de los macrófagos
Los macrófagos desempeñan diversas funciones que son cruciales en la respuesta 
inmune, por ejemplo: son células presentadoras de antígeno, es decir, células 
especializadas en la captura de antígenos microbianos o extraños al organismo. En este 
contexto, los Mø tienen una importante participación en la detección temprana de 
diversos patógenos, entre los cuales se encuentran los parásitos protozoos. El 
reconocimiento de estos parásitos se lleva a cabo a través de los receptores expresados 
en la membrana de los macrófagos, conocidos como receptores tipo toll y lectinas tipo 
C, los cuales reconocen patrones moleculares específicos que poseen los patógenos 
invasores [1]. Una vez reconocidos, capturados y procesados los patógenos, sus 
antígenos son exhibidos por los macrófagos a los linfocitos (únicas células capaces de 
reconocer antígenos de manera específica) y posteriormente estos linfocitos se 
diferenciarán a células efectoras promoviendo diferentes respuestas inmunes con son: 
respuestas citotóxicas mediadas por linfocitos T CD8+ para eliminar células infectadas, 
respuestas inflamatorias mediadas por linfocitos TCD4+ tipo Th1, que activarán a los 
macrófagos para matar microbios dentro de los fagosomas de los mismos, o bien 
respuestas antiinflamatorias mediadas por linfocitos TCD4+ tipo Th2 y Th3 [2]; los 
primeros defenderán al organismo contra parásitos extracelulares y estimulará a los 
linfocitos B para la producción de anticuerpos y en conjunto con los Th3 limitaran de 
forma efectiva la respuesta inflamatoria exacerbada que podría llevar a la activación de 
células TCD4+ TH17 las cuales son fuertes potenciadoras de respuestas 
proinflamatorias ligadas a desordenes de autoinmunidad.[3].
Por lo anterior, los macrófagos también son considerados células iniciadoras de la 
respuesta inmune celular, además pueden actuar como células efectoras que participan 
eliminando directamente al patógeno [1]. Otras de las funciones de los Mø encontradas 
recientemente son las actividades reguladoras y supresoras sobre la respuesta inmune, 
así como ayudar en la reparación del daño tisular ocasionado por patógenos [4]. 
Activación de Macrófagos
El antiguo concepto de los Mø activados o inactivados (monocitos) se ha modificado en 
los últimos años como resultado de diversos estudios tanto in vitro como in vivo, sobre 
todo en modelos murínos de infecciones parasitarias por helmintos. En general las 
subpoblaciones mejor caracterizadas de macrófagos activados, con características 
genotípicas y fenotípicas propias, son los siguientes: Los Møs clásicamente activados 
(MøCA), o bien denominados M1 y los macrófagos M2 [5].
MøCA o M1: son inducidos por interferón gama (INF-γ), el factor de necrosis tumoral 
alfa (TNF-α) y productos microbianos como lipopolisacáridos (LPS), estos macrófagos 
pueden ser identificados por su gran habilidad de producir citocinas y quimiocinas 
proinflamatorias como IL-1β, IL-12, IL-23, TNF-α y CXCL-9,-10, -11 y -16 
respectivamente, así como altos niveles de intermediarios de oxígeno y nitrógeno 
reactivos, por ejemplo las especies reactivas de oxigeno (ROS) y óxido nítrico (NO), 
este último producido por un incremento de la expresión de la oxido nítrico sintasa 
(iNOS/NOS2) que es un catalizador del substrato L-arginina. 
Los MøCA producen bajas cantidades de citocinasantiinflamatorias como IL-10. Estos 
macrófagos han sido identificados como células con una gran actividad microbicida y 
son mediadoras en la resistencia a parásitos intracelulares y tumores [4]. 
MøAA o M2. Este término se refiere a todas las otras formas de activación de los Mø 
que no sea la clásica [5]. Esta subpoblación difiere en sus propiedades funcionales de la 
M1 principalmente por una producción disminuida de IL-12 y generalmente están 
involucrados en respuestas tipo Th2, inmunoregulación y remodelación tisular. 
La subpoblación de Møs M2 está subdividida en 3 grupos conforme a los tipos de 
estímulos que activan a los macrófagos, denominados: M2a o Møs alternativamente 
activados (MøAA) los cuales son inducidos por las citocinas IL-4 e IL-13; los Møs M2b 
inducidos por la exposición a inmunocomplejos (IC) y agonistas de IL-1R; y finalmente 
los Møs M2c inducidos por IL-10 y hormonas glucocorticoides [5]. Sin embargo la 
subpoblación mejor caracterizada en modelos murínos en respuestas a helmintos es la 
M2a o MøAA, dicha subpoblación se caracteriza principalmente por su baja producción 
de citocinas proinflamatorias IL-1β, IL-12, IL-23, pero una considerable producción de 
citocinas y quimiocinas anti-infamatorias como IL-10 y CCL 17, 18, 22 y 24 
respectivamente, Además los MøAA también liberan citocinas reguladoras como el 
factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) [4], una alta producción de 
prostaglandina E2 [6] y urea, esta última producida a través del metabolismo de la L-
arginina por la enzima Arginasa 1 (Arg1). En este proceso también es producida L-
ornithina la cual puede ser convertida por la ornitin aminotransferasa (OAT) a prolina, 
molécula importante en la producción de colágeno, mientras que la ornitin 
descarboxilasa (ODC) genera poliaminos, los cuales estimulan la proliferación celular, 
debido a estas acciones se les ha conferido a los MøAA la capacidad de regeneración 
tisular [7, 4, 8]. Por otra parte se ha visto que estos MøAA están frecuentemente 
asociados a infecciones por helmintos con respuestas polarizadas de tipo Th2 [4].
Polarización de la respuesta inmune debido a la infección por helmintos
Los parásitos helmintos son un grupo altamente diversificado de organismos que 
presentan morfologías, estructuras accesorias, estadios de ciclo de vida y 
comportamientos de alimentación y sexual muy diferentes entre ellos. Además estos 
parásitos han desarrollado complejos mecanismos para evadir y modular la inmunidad 
del hospedero a su conveniencia. En relación a esto, estudios recientes sugieren que los 
Mø son el blanco de tal inmunomodulación [4]. En modelos experimentales murínos 
cuando el hospedero experimenta una exposición crónica a parásitos helmintos como 
Taenia crassiceps (o sus productos), se lleva a cabo una polarización de la respuesta 
inmune de tipo Th1 hacia una de tipo Th2. En estadios tempranos de esta infección hay 
una clara pero transitoria respuesta inmune de tipo Th1 caracterizada por altos niveles 
de IL-2, IFN-γ, IgG2a, hipersensibilidad tipo retardada y predominio de MøCA, todo 
esto asociado a una tasa baja de la reproducción del parásito y una alta respuesta 
proliferativa de linfocitos T [9]. Sin embargo en estadios tardíos (crónicos) de la 
infección se desarrolla eventualmente una respuesta de tipo Th2, caracterizada por altos 
niveles de IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IgE, IgG1, [4] y recientemente IL-21 e IL-25 [3], 
así como un incremento en el número de poblaciones celulares particulares como 
eosinófilos, mastocitos, MøAA y células T reguladoras, todo esto asociado a un 
incremento en la carga parasitaria y un marcado decremento de la respuesta proliferativa 
de linfocitos T [10, 11, 4]. Resulta más que interesante que este decremento en la 
capacidad proliferativa de los linfocitos T es contacto dependiente, es decir, depende de 
la interacción de los linfocitos T con los MøAA a través de la vía de señalización de PD-
1 [12 y 6]. Así, el predominio de la respuesta tipo Th2 en la infección crónica en la 
cisticercosis murína parece favorecer la reproducción del parásito y alojamiento del 
mismo, explicando así el largo tiempo de residencia y la intensa carga parasitaria en 
infecciones crónicas [9]. 
En el caso particular de la infección murína por T. crassiceps el predominio de los 
MøAA y a la respuesta de tipo Th2, están asociados a etapas crónicas de la infección, es 
decir empiezan a aparecer después de 4 semanas de infección, Sin embargo no siempre 
es el caso, ya que en algunas infecciones por otros helmintos, como en la infección 
murína por Nippostrongylus brasiliensis, los MøAA han sido encontrados en etapas 
muy tempranas de la infección, desde los 4 días post-infección [13] y dado que existe 
un retraso de 4 a 7 días antes de que la respuesta inmunitaria adaptativa sea efectora, se 
ha sugerido que las células del sistema inmune innato como eosinófilos y mastocitos 
podrían ser las responsables de aportar las citocinas IL-4/IL-13 para inducir la 
diferenciación de los monocitos a MøAA, sin descartar que los linfocitos Th2 
seguramente son requeridos más adelante para mantener por largo tiempo dicha 
diferenciación. 
En relación al fenómeno de polarización de la respuesta inmune de Th1 a Th2 en las 
infecciones por helmintos, trabajos recientes sugieren que los hospederos infectados de 
manera crónica con este tipo de parásitos se encuentran comprometidos con respuestas 
Th2 sistémicas que pueden incrementar la susceptibilidad a una segunda infección por 
otros agentes patógenos no relacionados, sobre todo aquellos sobre los que se requiere 
una respuesta tipo Th1 para lidiar con la infección, como es el caso de Trypanosoma 
cruzi, donde un incremento significativo en la susceptibilidad a este parásito se ha 
relacionado a ratones infectados crónicamente por el helminto T. crassiceps [14]. Este 
mismo comportamiento se ha observado en otros estudios de coinfecciones como: 
Schistosoma/leishmaniasis [15], Litomosoides/leishmaniasis [16], Filaria/malaria [17]. 
Esto podría explicarse porque la mayoría de los parásitos protozoarios comparten, el 
requerimiento de una internalización macrófaga, donde los patógenos pueden proliferar, 
y para el tiempo en el que el parásito helminto ha cambiado la respuesta inmune del 
hospedero a Th2, la mayoría de los macrófagos han alcanzado el estado de activación 
alternativa (MøAA), caracterizado por un incremento en su habilidad fagocítica, de 
reparación tisular, y un decremento en su habilidad efectora microbicida, por lo tanto, 
los patógenos intracelulares pueden replicarse eficaz y libremente [4]. Sin embargo esta 
sugerencia no ha sido probada, por lo que es necesario hacer estudios in vitro que 
permitan observar si el incremento en la susceptibilidad a una coinfección 
efectivamente está dado por el estado de activación alternativa de los macrófagos, y de 
esta manera observar si estos macrófagos pueden lidiar con una segunda infección por 
parásitos intracelulares o bien si son más susceptibles a éstos.
Taenia crassiceps. Características generales. Las infecciones por helmintos del género Taenia 
generan una enfermedad parasitaria intestinal causada por la forma adulta del céstodo, y 
prevalece en países de África, Asia y América Latina, especialmente en áreas urbanas y rurales 
que carecen de infraestructura sanitaria, donde existe pobreza e higiene deficiente. El ser 
humano es susceptible a la infección de dos especies: T. solium y T. saginata. Las tenias, cuyos 
adultos son hermafroditas, requieren de un huésped intermediario para cumplir su ciclo 
biológico: el cerdo y el jabalí, en el casode la T. solium, y el ganado vacuno para la T. saginata. 
El ser humano puede ser también hospedero accidental del metacéstodo, es decir la forma 
larvaria o intermedia de la T. solium, en cuyo caso se desarrolla la enfermedad conocida como 
cisticercosis. En condiciones experimentales de laboratorio se utiliza la infección por T. 
crassiceps, la cual comparte semejanzas antigénicas con T. solium, con la ventaja de que no es 
infectiva para el hombre. Al igual que las mencionadas arriba requiere de un hospedero 
intermediario, en este caso un roedor, y otro definitivo como es el zorro, en el cual lleva a 
cabo su reproducción sexual (Fig. 1). En condiciones experimentales de laboratorio los 
metacéstodos (cisticercos) de T. crassiceps tienen la capacidad de reproducirse por gemación 
en la cavidad peritoneal del ratón de manera crónica, aparentemente sin causar daño a las 
estructuras vecinas del hospedero generando únicamente inflamación moderada. [18]
Inmunología de Taenia crassiceps
La respuesta inmune efectora en contra del metacéstodo de T. crassiceps es de tipo celular ya 
que, aunque se establece una respuesta inmune humoral específica en contra de los 
antígenos del cisticerco de T. crassiceps [19] ésta es insuficiente para la protección [20 y 
21]. En la respuesta inmune celular se ha establecido que existe un desplazamiento gradual de 
una respuesta inmune protectora tipo Th1 a una “facilitadora” de tipo Th2 [9].
http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Metacestodo&action=edit&redlink=1
Figura 1. Ciclo de vida de Taenia crassiceps e inducción de la cisticercosis en ratones [22]
Trypanosoma cruzi. Características generales. La tripanosomiasis Americana, mejor 
conocida como enfermedad de Chagas ha sido registrada desde el sur de los Estados 
Unidos hasta Argentina y representa un problema de salud pública en Brasil, Argentina, 
Venezuela, Bolivia, Chile, Perú, Uruguay, Paraguay, Panamá, Colombia, Ecuador, el 
Salvador y probablemente en México. La enfermedad es causada por T. cruzi, un 
protozoario flagelado de la familia de Trypanosomatidae, subgénero Schizotrypanum. 
Una parte de su ciclo vital ocurre en artrópodos y otra parte en vertebrados. La 
infección por T cruzi se transmite por picadura de chinches, penetra por la piel o por la 
superficie de las mucosas, casi inmediatamente invade el torrente sanguíneo 
caracterizándose por un gran incremento en la replicación parasitaria (Fig. 2). A este 
período de la infección se le conoce como fase aguda. La fase crónica viene después, 
cuando la infección está bien establecida, puede ser asintomática o presentar una 
serie de signos y síntomas relacionados con cardiomiopatía o dilatación 
irreversible del esófago o colon [23].
La infección en murínos ha sido extensamente usada como modelo experimental de la 
enfermedad ya que no existen prácticamente diferencias con la patología presentada en 
humanos, además de que ofrece la ventaja de que las cepas singénicas de ratones 
pueden ser divididas o clasificadas como genéticamente resistentes o susceptibles 
basándose en su habilidad para controlar la infección, ya sea en el nivel de parasitemia o 
por su letalidad. Dos claros ejemplos de esto son la cepa BALB/c y la C57BL/6 
reconocidas como susceptible y resistente para T. cruzi respectivamente. [14].
Inmunología de Trypanosoma cruzi
La respuesta inmune efectora en contra de T. cruzi parece ser de tipo celular, la 
respuesta humoral parece no tener una participación importante en el control de esta 
parasitosis, los anticuerpos contra T. cruzi se han encontrado altos en todos los 
estados de la infección y persisten a través de la fase crónica, la distribución de los 
diferentes isotipos permanece invariable a lo largo del curso de la infección; se 
caracteriza por la predominancia de IgG2a y en menor grado de IgG2b e IGg1, y al 
parecer no hay ninguna diferencia en la distribución entre las cepas resistentes y 
susceptibles [24]. Por otro lado, al igual que en otras parasitosis, la respuesta inmune 
celular parece participar de manera importante en el control de esta infección [25]. A 
diferencia de otras infecciones parasitarias, en la infección por T. cruzi no está 
claramente definida la predominancia de alguno de los dos perfiles de citocinas, ya que 
durante la fase aguda de la infección, así como durante la fase crónica es posible 
detectar citocinas de ambos tipos (IL-1 , IL-4, IL-5, IL-6, IFN-γ, o TGF–β), con 
excepción de que tanto en humanos como en animales del laboratorio infectados 
con T. cruzi la capacidad para producir IL-2 está disminuida [26]. Existen algunos 
reportes que indican que el IFN-γ es un importante mediador de la resistencia a T. cruzi, 
se ha visto en modelos murínos que la administración de IFN-γ recombinante 
incrementa la resistencia, mientras que la neutralización de la producción endógena del 
IFN-γ incrementa la susceptibilidad en la fase aguda de la infección [27]. Esto está 
reforzado por otros estudios donde se ha visto que las cepas de ratones susceptibles a la 
infección por T. cruzi muestran una aparente disminución de las citocinas tipo Th1 
(IFN-γ) después de 45 días y una temprana aparición de TNF-α [28], relacionado a 
estudios previos que indican que la administración de IL-12 y el incremento de IFN- γ, 
reducen la carga parasitaria y alargan el tiempo de sobrevivencia en los ratones 
infectados [25]. A pesar de que las evidencias demuestran que la participación de la 
respuesta tipo Th1 puede ser la responsable de inducir protección, esto no es realmente 
un dogma, dado que hasta ahora no hay reportes de un solo caso donde la inducción de 
una respuesta tipo Th1 haya resuelto completamente la infección.
Figura 2.- Ciclo de vida de Trypanosoma cruzi [29]
Justificación
Las infecciones provocadas por helmintos son frecuentemente masivas, crónicas y 
fuertes inductoras de respuestas inmunes tipo Th2, lo cual podría ser la causa del 
incremento en la susceptibilidad a otras infecciones causadas por agentes sobre las 
cuales es requerida una respuesta inmune tipo Th1 para su eliminación, por ejemplo 
parásitos intracelulares como Mycobacterium tuberculosis, Toxoplasma gondii, 
Plasmodium sp, y T. cruzi [30-32]. Esta coexistencia natural de dos o más infecciones 
no es rara en países en vías de desarrollo donde los individuos que crecen en 
condiciones de higiene inadecuadas están permanentemente expuestos a este tipo de 
infecciones. 
La implicaciones epidemiológicas en el cambio del patrón de citocinas de tipo Th1 
(proinflamatorio) a tipo Th2 (anti-inflamatorio) por una infección helmíntica que 
favorece la susceptibilidad, han sido observadas en el caso de Leishmania, Toxoplasma 
y mycobacterium [33]. En este contexto, estudios previos [14] han demostrado en 
modelos murínos, que la infección previa con cisticercos del helminto T. crassiceps 
modifica dramáticamente la susceptibilidad a una segunda infección por Trypanosoma 
cruzi (T. cruzi), observando un incremento de la carga parasitaria (tripomastigotes) en 
sangre, de ratones con infección crónica (8-12 semanas post-infección) y predominio de 
respuestas tipo Th2, en contraste con ratones no infectados previamente por T. 
crassiceps o bien, con infecciones tempranas de T. crassiceps (2-4 semanas p.i.), donde 
fue observada una baja cantidad de tripomastigotes en sangre y predominio de 
respuestas tipo Th1. En relación a esto otros estudios de coinfección T. 
crassiceps/Leishmania major y T. crassiceps/Leishmania mexicana [34] establecen 
que ratones coinfectados presentanambas respuestas tipo Th1 y Th2, pero con 
predominio de MøAA y lesiones cutáneas más grandes en comparación con ratones 
solo infectados por Leishmania que presentaron respuestas tipo Th1 con lesiones 
cutáneas menores, predominio de MøCA y menor desarrollo en la parasitemia de 
ambos parásitos L. major y L. mexicana. Sin embargo se desconoce si la activación 
alternativa de los macrófagos provocada por la inmunomodulación (inducción de 
respuestas tipo Th2) del parásito T. crassiceps es el factor determinante que favorece la 
supervivencia y la replicación de parásitos intracelulares como T. cruzi. Es por esto 
que el estudio sobre la participación inmunológica de los MøAA, ayudará al 
entendimiento de su función efectora, mecanismos inmunoreguladores y a comprender 
la respuesta inmune en infecciones crónicas por helmintos y en coinfecciones 
subsecuentes no relacionadas, lo cual posiblemente permita establecer mejores o nuevas 
estrategias terapéuticas en el tratamiento de infecciones parasitarias y/o en el desarrollo 
de vacunas. 
Planteamiento del estudio
Los metacéstodos de T. crassiceps poseen la ventaja de tener una reproducción asexual 
por gemación, dicho fenómeno ha sido de gran ayuda para generar infecciones de larga 
duración (crónicas) en modelos murínos, donde regularmente el parásito es inoculado 
vía intraperitoneal, y después de algunas semanas, cientos de parásitos macroscópicos 
pueden ser obtenidos de la cavidad peritoneal. Por otra parte, los ratones infectados 
desarrollan una rápida pero transitoria respuesta tipo Th1, la cual secuencialmente 
cambia a una respuesta tipo Th2, pasando por un periodo donde hay una respuesta mixta 
Th1/Th2. Así mismo los macrófagos reclutados en la cavidad peritoneal cambian 
conforme la infección progresa, de MøCA a MøAA, pasando por un periodo de 
población de macrófagos mixto MøCA/MøAA [4]. Tomando como base este modelo 
muríno, se buscó establecer si los MøAA provenientes de ratones de cepas BALB/c y 
C57BL/6 con cisticercosis son menos capaces de lidiar con una segunda infección por 
un parasito intracelular como T. cruzi.
Considerando que T. crassiceps induce durante las dos primeras semanas un perfil tipo 
Th1 (IL-2 e IFN-γ) que cambia paulatinamente, observándose alrededor de la 4ª semana 
un perfil mixto Th1/Th2 y posteriormente en la 8a semana un perfil tipo Th2 (IL-4, IL-
10) [9], se espera hallar en estadios tempranos de la infección (2 semanas p.i.) 
macrófagos de la subpoblación Clásicamente activada M1 (MøCA), y, a medida que la 
infección sea crónica (4 semanas p.i.) encontrar macrófagos de ambas subpoblaciones y 
posteriormente cuando la infección sea crónica (8 semanas o más) solo MøAA. 
Para observar la respuesta inmune de los macrófagos a una segunda infección por T. 
cruzi, ratones de las cepas BALB/c y C57BL/6 fueron infectados i.p. con metacéstodos 
de T. crassiceps y posteriormente sacrificados a las 0, 2, 4, 6, 8 y 12 semanas post-
infección para a) determinar la carga parasitaria de T. crassiceps y extraer macrófagos 
de la cavidad peritoneal b) establecer el estado de activación de los macrófagos en los 
diferentes tiempos post-infección de T. crassiceps; finalmente éstos fueron cultivados e 
infectados in-vitro con tripomastigotes de T. cruzi y se determinó c); número de Møs 
infectados, d) cantidad de parásitos por Mø infectado, e) producción de citocinas por los 
Mø y d) citometría de flujo de poblaciones de Mø infectados en relación 5:1 (T. cruzi: 
Mø, respectivamente).
Justificación
Las infecciones provocadas por helmintos son frecuentemente masivas, crónicas y 
fuertes inductoras de respuestas inmunes tipo Th2, lo cual podría ser la causa del 
incremento en la susceptibilidad a otras infecciones causadas por agentes sobre las 
cuales es requerida una respuesta inmune tipo Th1 para su eliminación, por ejemplo 
parásitos intracelulares como Mycobacterium tuberculosis, Toxoplasma gondii, 
Plasmodium sp, y T. cruzi [30-32]. Esta coexistencia natural de dos o más infecciones 
no es rara en países en vías de desarrollo donde los individuos que crecen en 
condiciones de higiene inadecuadas están permanentemente expuestos a este tipo de 
infecciones. 
La implicaciones epidemiológicas en el cambio del patrón de citocinas de tipo Th1 
(proinflamatorio) a tipo Th2 (anti-inflamatorio) por una infección helmíntica que 
favorece la susceptibilidad, han sido observadas en el caso de Leishmania, Toxoplasma 
y mycobacterium [33]. En este contexto, estudios previos [14] han demostrado en 
modelos murínos, que la infección previa con cisticercos del helminto T. crassiceps 
modifica dramáticamente la susceptibilidad a una segunda infección por Trypanosoma 
cruzi (T. cruzi), observando un incremento de la carga parasitaria (tripomastigotes) en 
sangre, de ratones con infección crónica (8-12 semanas post-infección) y predominio de 
respuestas tipo Th2, en contraste con ratones no infectados previamente por T. 
crassiceps o bien, con infecciones tempranas de T. crassiceps (2-4 semanas p.i.), donde 
fue observada una baja cantidad de tripomastigotes en sangre y predominio de 
respuestas tipo Th1. En relación a esto otros estudios de coinfección T. 
crassiceps/Leishmania major y T. crassiceps/Leishmania mexicana [34] establecen 
que ratones coinfectados presentan ambas respuestas tipo Th1 y Th2, pero con 
predominio de MøAA y lesiones cutáneas más grandes en comparación con ratones 
solo infectados por Leishmania que presentaron respuestas tipo Th1 con lesiones 
cutáneas menores, predominio de MøCA y menor desarrollo en la parasitemia de 
ambos parásitos L. major y L. mexicana. Sin embargo se desconoce si la activación 
alternativa de los macrófagos provocada por la inmunomodulación (inducción de 
respuestas tipo Th2) del parásito T. crassiceps es el factor determinante que favorece la 
supervivencia y la replicación de parásitos intracelulares como T. cruzi. Es por esto 
que el estudio sobre la participación inmunológica de los MøAA, ayudará al 
entendimiento de su función efectora, mecanismos inmunoreguladores y a comprender 
la respuesta inmune en infecciones crónicas por helmintos y en coinfecciones 
subsecuentes no relacionadas, lo cual posiblemente permita establecer mejores o nuevas 
estrategias terapéuticas en el tratamiento de infecciones parasitarias y/o en el desarrollo 
de vacunas. 
HIPOTESIS
La activación de los Mø a un estado alternativo, causada por la infección por T. 
crassiceps, los hace menos capaces de lidiar con una segunda infección in vitro por el 
parásito intracelular T. cruzi.
Objetivo general
Determinar si los MøAA generados por la infección previa con T. crassiceps son más 
susceptible a la infección in vitro con T. cruzi.
Objetivos particulares
1.-Inducir cisticercosis en cepas de ratones C57BL/6 y BALB/c
2.-Determinar el estado de activación de los Mø provenientes de la infección con T. 
crassiceps para relacionarlas a la susceptibilidad o resistencia en la infección in vitro 
por T. cruzi.
3.-Demostrar si los macrófagos extraídos de ratones con cisticercosis a las 0, 2, 4, 6, 8 y 
12 semanas p.i, son susceptibles a una segunda infección in vitro por el parásito T. cruzi.
4.- Determinar si el perfil de citocinas producidos por los Mø post-infección está 
relacionado a la susceptibilidad o resistencia de éstos a la infección in vitro por T. cruzi
Materiales y métodos
Ratones: Ratones hembras de 6 a 8 semanas de edad de las cepas BALB/c (susceptibles 
a T. crassiceps y a T.cruzi) y C57BL/6 (susceptibles a T. crassiceps y resistentes a T. 
cruzi) de los laboratorios Jackson (BarHarbor, Maine) fueron mantenidos en un 
ambiente libre de patógenos en la Facultad de Estudios Superiores Iztacala (UNAM) de 
acuerdo a las directrices de la institución. 
Parásitos
Taenia crassiceps: Los metacéstodos de T. crassiceps (cepa ORF) fueron extraídos de la 
cavidad peritoneal de ratones hembras BALB/c después de 2 o 4 meses de infección. 
Los parásitos se lavaron 3 veces con solución salina balanceada de Hank´s estéril. Las 
infecciones experimentales fueron realizadas por una inyección intraperitoneal (i.p.) con 
10 pequeños cisticercos (diámetro 2mm) de T. crassiceps suspendidos en 0.3 ml de 
solución salina por ratón. 
Trypanosoma cruzi: Se utilizaron tripomastigotes sanguíneos del protozoario T. cruzi 
cepa Querétaro, donada por la Dra. Bertha Espinoza del Instituto de Investigaciones 
Biomédicas (UNAM) y la cepa de CL-Brener, donada por la Dra. Rebeca Manning 
Cela del departamento de Biomedicina Molecular (CINVESTAV).
Cultivo de parásitos de T. cruzi
Se utilizaron 2 cepas de T. cruzi (CL-Brener y Queretaro) La cepa de T. cruzi Queretaro 
fue mantenida en medio de cultivo bifásico de infusión cerebro corazón (BHI) 
enriquecido con 10% de suero fetal bovino inactivado (Gibco-BLR) con solución 
salina al 0.85% y 1.7 ml de antibiótico como fase líquida. El agar se preparó de la 
siguiente forma: BHI 3.7 grs., Agar Nutritivo 2.3 grs., Dextrosa 1.0 gr., Agua 
Destilada 100 ml. El medio de cultivo, la solución salina, material de vidrio y 
pipetas se esterilizaron en autoclave por calor húmedo a 15 lbs de presión durante 
15 min con enfriamiento lento. Se resembraron 500 μl del parásito cada 20 días en 
medios de cultivo previamente esterilizados y suplementado con 1.7 ml de 
antibiótico (Penicilin Streptomicin Glutamina (invitrogen)) observando entre cada 
resiembra la viabilidad y estado axénico por medio de microscopía óptica. La cepa 
CL-Brener fue mantenida en cultivos celulares de fibroblastos en el laboratorio de 
la Dra. Rebeca Manning en el CINVESTAV.
Obtención de macrófagos de la cavidad peritoneal.
Se sacrificaron los ratones después de 0, 2, 4, 6, 8 y 12 semanas de infección con T. 
crassiceps, se usaron ratones no infectados como control (semana 0). Se inyectaron 5 
ml de solución salina estéril fría en la cavidad peritoneal de los ratones dando un 
ligero masaje a fin de remover la mayor cantidad de macrófagos, posteriormente se 
hizo una pequeña incisión en la piel dejando expuesta la cavidad peritoneal para extraer 
las células del exhudado peritoneal (PECs) contenidas en la solución salina, la cual se 
colocó en tubos cónicos estériles de 15 ml. Las células se centrifugaron a 3500 rpm 
durante 10 min., una vez centrifugadas, se resuspendieron en solución hemolizante 
(cloruro de amonio 0.16 M y TRIS Base 0.17 M) durante 10 min; para lisar los 
eritrocitos mediante un choque hipotónico. Seguido de 2 lavados, fueron 
resuspendidas en 1 ml de medio DMEM/High Glucose, suplementado al 5% con 
suero fetal bovino y 100 unidades de penicilina/streptomicina. Las células se cultivaron 
en placas de 24 pozos y cajas Petri de 6 cm de diámetro. Después de 2 hr a 37ºC y 5% 
de CO2 las células no adheridas fueron removidas por 2 lavados con medio DMEM 
suplementado. Las células adheridas (Mø) fueron removidas con EDTA (0.02%) a 37°c 
con un raspador. Una vez obtenidas fueron centrifugadas nuevamente a 3500 rpm y 
resuspendidas en medio DMEM antes mencionado. Los macrófagos viables fueron 
contados por la exclusión azul de trypano (la viabilidad fue usualmente mayor a 95%) y 
reajustados a 1X106 Mø/ml [6], una vez ajustados fueron cultivados nuevamente en 
placas de 24 pozos y cajas petri de 6 cm de diámetro.
Infección in vitro de macrófagos de la cavidad peritoneal
Una vez hechos los cultivos y ajustados los macrófagos a 1x106, éstos fueron infectados 
con 5x106 parásitos de T. cruzi, quedando la relación 5 parásitos/macrófago, las placas 
de cultivo fueron centrifugadas a 1500 rpm por 5 min para favorecer la interacción de 
los parásitos y macrófagos en el fondo de los pozos. Después de 2 hr de incubación a 
37º C y 5% de CO2 los parásitos no internalizados en los cultivos fueron removidos 
lavando 2 veces con medio DMEM las placas, quedando así solo los macrófagos 
adheridos a la placa con los parásitos internalizados.
Tinción de células (macrófagos) peritoneales.
Para determinar el número de macrófagos infectados, así como el número de 
parásitos por macrófago, los macrófagos adheridos a las placas de cultivo fueron 
fijados con alcohol metílico durante 5 min y una vez secos, se tiñeron con el colorante 
de Write Giemsa durante 30 a 60 min para su observación al microscopio de luz. En el 
caso de la cepa CL-Brener no hubo necesidad de fijarlos puesto que expresan GFP 
(proteína verde fluorescente) que permite identificar a los tripanosomas dentro de los 
macrófagos en el microscopio de fluorescencia (Olympus 1x50), en este caso solo hubo 
que esperar 48 h antes de poder detectarlos claramente, realizar un conteo de 200 
células y capturarlos con cámara (evolution UVF culet color de Media cybernetics) y 
el programa Image-p8-plus 5.1. Cada ensayo se realizó por duplicado.
Determinación de la producción in vitro de IL-12 en sobrenadante de cultivo de 
macrófagos por medio de la técnica de ELISA-sándwich.
En los cultivos de macrófagos infectados con las cepas Querétaro y CL-Brener del 
parásito de T. cruzi, se extrajeron los sobrenadantes a las 48 hr post-infección, de los 
cuales se evaluó la producción de las citocinas IL-12 (invitrogen) por medio de la 
técnica de ELISA sandwich. Brevemente, las placas de 96 pozos (High binding, Costar) 
se sensibilizaron con 50 μl por pozo del anticuerpo de captura (purified anti-mouse IFN-
γ, IL-4, IL-10, IL-12) diluido en buffer de bicarbonato de Na 0.1 M pH 8.2, 
concentración 2 μg/ml. Se dejaron incubar toda la noche a 4º C. Transcurrida la 
incubación se lavaron 3 veces con PBS-Tween al 0.05% (PBS-T). Posteriormente se 
bloqueó con PBS-BSA 1% (100μl por pozo), y se incubaron dos horas a temperatura 
ambiente. Después de lavarse 3 veces con PBS-T, se procedió a poner la curva de 
interleucinas (con IL recombinante murína) por duplicado en los primeros pozos de la 
placa. La curva se comenzó con una concentración de 2000 pg/ml y se fueron haciendo 
diluciones a la mitad, (al menos 10 pozos), al resto de los pozos se les añadió por 
duplicado 50 μl de las muestras de los sobrenadantes (dilución 1:2). Se incubaron a 
temperatura ambiente 30 min, eventualmente se lavó 4 veces con PBS-T y se reveló por 
30 min. con el sustrato para peroxidasa (100μl por pozo). Se detuvo la reacción con 50 
μl de acido sulfúrico 4 N y se leyó en el lector de ELISA (Mertertech, S 960) a 405 nm. 
Determinación de oxido nítrico (NO) en sobrenadante de cultivo de macrófagos
La determinación de oxido nítrico se realizo en los sobrenadantes de los macrófagos 
cultivados ín vitro de los ratones BALB/c y C57BL/6 sin T. cruzi, con T. cruzi y con T. 
cruzi mas IFN-γ.
 El ensayo consiste en preparar dos soluciones por separado.
Solución A, 0.1 % de dihidrocloruro de naftilenodiamina en agua destilada.
Solución B, Sulfanilamida 5 % en H3PO4 al 5 %. 
Minutos antes de realizar el ensayo las soluciones se mezclaron vol/vol, para obtener el 
reactivo el reactivo de Griess. En una placa para ELISA de fondo plano de 96 pozos se 
colocó una curva (empezando en 100 mM diluciones dobles) de nitrito de sodio (Na 
NO2) como control y referencia para intrapolar las concentraciones (Densidad 
óptica) de las muestras. Tanto la curva como las muestras se colocaron en volúmenes 
de 100 µl y 100 µl de reactivo de Griess. Se incubaron a temperatura ambiente por 10 
min. y se leyeron a 550-620 nm en un lectorde ELISA (Metertech S960).
RT-PCR. 
Se extrajo el RNA total de macrófagos peritoneales obtenidos de ratones no infectados 
e infectados de 0, 2, 4, 6 y 8 semanas p.i. Los macrófagos fueron obtenidos como ya se 
describió anteriormente y se les agregó 1ml de Trizol (invitrogen) por cada 1x106 
células en un tubo eppendorf de 1.8ml, posteriormente se les agregó 200μl de 
cloroformo por cada ml de trizol y se incubaron por 15 min. Se centrifugaron a 13500 
rpm durante 15 min. Se extrajo la fase acuosa donde está el contenido de RNA con una 
micropipeta. Se depositó en otro tubo eppendorf con 500μl de isopropanol frío, se 
incubó durante 15 min a temperatura ambiente, y se centrifugó a 12000 rpm durante 15 
min. Se decantó y resuspendió la pastilla, se lavó con etanol al 75% y se centrifugó a 
13500 rpm durante 5 min. La pastilla se dejó secar a temperatura ambiente durante 30 
min., finalmente se resuspendió en 20μl de agua grado molecular. El cDNA fue 
preparado utilizando el kit First strand sythesis superscript II (Invitrogen) a partir de 5 
μg de RNA total. Las muestras de cDNA fueron estandarizadas basándose en el 
contenido de cDNA de GAPDH. Los oligonucleotidos fueron para: GAPDH F-
TCGGTGTGAACGGATTTGGC y R-CTCTTGCTCAGTGTCCTTGC 
(MATSUMURA). Sintasa de oxido nítrico inducible (iNOS): F-
CTGGAGGAACTCCTGCCTCATG Y R-GCAGCATCCCCTCTGATGGTG [35]. Fizz 
1 fueron F-GGTCCCAGTGCATATGGATGAGACCATAGA Y R-
CACCTCTTCACTCGAGGGACAGTTGGAGC. Sintasa Ym1: F-
TCACAGGTCTGGCAATTCTTCTG Y R-TTTGTCCTTAGGAGGGCTTCCTCG y 
para arginasa-1: F-CAGAAGAATGGAAGAGTCAG y R-
CAGATATGCAGGGAGTCACC [36].
El PCR se realizó en un volumen total de 50 μl de buffer PCR en presencia de dNTP 0.2 
M, 0.2 mM de cada primer y 2.5 U de Taq Polimerasa platinium (Invitrogen), utilizando 
un termociclador (Corvett Research, Australia). Después de 30 ciclos de amplificación, 
los productos del PCR fueron separados por electroforesis (100 volts) en un gel de 
agarosa al 1.5% y visualizados con tinción de bromuro de etidio (0.5μg/ml) en el 
sistema documentador de geles Biosens SC 645; el análisis se realizó con el programa 
PSRemote.
Caracterización de macrófagos y tripomastigotes de T. cruzi; análisis por 
citometría de flujo
Los macrófagos peritoneales se resuspendieron en buffer para FACS (PBS con 1% de 
suero fetal bovino y 0.1% de Azida de sodio) y se incubaron por 30 min con anticuerpos 
monoclonales conjugados con ficoeritrina contra F4/80 (Caltag laboratorios, CA, USA). 
Se centrifugaron, resuspendieron y ajustaron a 1x106/ml en medio DMEM con suero 
fetal bovino al 5% y se cultivaron en placas de 24 pozos. Por otra parte los 
tripomastigotes de T. cruzi fueron resuspendidos en buffer para FACS e incubados con 
ester succinimidil diacetato carboxifluorescein (CFSE) (marcador fluorescente que se 
incorpora al citoplasma), se centrifugaron, resuspendieron y ajustaron a 5x106/ml para 
infectar con estos los cultivos de macrófagos. Se incubaron 24 hrs y se lavó la placa 2 
veces, se despegaron los macrófagos adheridos a la placa con EDTA 0.02% durante 10 
min, y las células fueron analizadas en un equipo FACs Calibur, utilizando el software 
Cell Quest (Becton Dickinson).
RESULTADOS 
Determinación de la parasitemia causada por el helminto T. crassiceps 
Con el propósito de establecer una cinética de crecimiento parasitario en la infección 
por el helminto T. crassiceps, se infectaron intraperitonealmente ratones hembras de las 
cepas BALB/c y C57BL/6 con 10 metacéstodos de T. crassiceps, después de 2, 4, 6, 8 y 
12 semanas de iniciada la infección se determinó la evolución de la parasitemia (número 
de cisticercos) en ambas cepas de ratones. En las figuras 3(A) y 3(B) se muestra la 
cinética del crecimiento del parásito T. crassiceps en las cepas de ratones BALB/c y 
C57BL/6, respectivamente. En ambas cepas durante las primeras 2 y 4 semanas post-
infección se observó un crecimiento mínimo de la parasitemia, sin embargo a las 6, 8 y 
12 semanas post infección se observó un incremento significativo y constante en el 
número de cisticercos, siendo la cepa BALB/c la que presentó al final de las 12 semanas 
p.i. un número mayor de cisticercos en comparación con la cepa C57BL/6 en el 
peritoneo (1769 parásitos y 1610 parásitos respectivamente). 
BALB/c
Sano 2 4 6 8 12 
0
500
1000
1500
2000
2500
Semanas post-infeccion con T. crassiceps
A)
*
N
o.
 d
e 
ci
st
ic
er
co
s
 
Sano 2 4 5 8 12
0
500
1000
1500
2000
2500
C57BL/6
Semanas post-infección con T. crassiceps
*
N
o.
 d
e 
ci
st
ic
er
co
s
B)
 
Figura 3.- Evolución de la parasitemia en cepas de ratones A) BALB/c y B) C57BL/6, 
después de infectarlos i. p. con 10 cisticercos de T. crassiceps. Los valores mostrados 
son la media de 5 ratones por grupo y son representativas de 2 experimentos. * P<0.05 
respecto a los grupos infectados, prueba “t” de student. 
 
Identificación de Macrófagos 
Para demostrar el estado de activación de los macrófagos obtenidos de la cavidad 
peritoneal de ratones infectados con 
cultivos de macrófagos obtenidos de ratones sanos e infectados previamente con 
crassiceps a diferentes semanas p.i., buscando los marcadores que indican la presencia 
de MøAA [37]. 
En la figura 4 se observa que los Mø de ratones BALB/c de 2 semanas p.i. y C57BL/6 
de 5 semanas p.i. con T. crassiceps
mRNA del gen Ym1 (característico de MøAA) en comparación con los Mø 
provenientes de ratones sanos de las cepas
(0.009), prueba “t” de student; P= 0.0088, P= 0.0225, respectivamente. Es de llamar la 
atención que, los Mø de ratones BALB/c de 2 semanas p.i. presentaron niveles mayores 
del transcrito YM1 en comparación con los Møs
p.i. con T. crassiceps. Lo cual sugiere que el fondo genético de los ratones BALB/c 
favorece una pronta y franca diferenciación de los MøAA en comparación con el fondo 
genético C57/BL6. 
Figura 4. Niveles de expresión de transcritos de mRNA del gen Ym1 en ratones de las 
cepas BALB/c y C57BL/6 a diferentes tiempos post
sano, a entre BALB/c y C57BL/6. Los valores mostrados son la media de 5 ratones por 
grupo. 
 
Identificación de Macrófagos Alternativamente Activados (MøAA). 
Para demostrar el estado de activación de los macrófagos obtenidos de la cavidad 
peritoneal de ratones infectados con T. crassiceps, realizamos ensayos de RT
cultivos de macrófagos obtenidos de ratones sanos e infectados previamente con 
a diferentes semanas p.i., buscando los marcadores que indican la presencia 
a que los Mø de ratones BALB/c de 2 semanas p.i. y C57BL/6 
T. crassiceps expresaron una mayor cantidad de transcritos de 
mRNA del gen Ym1 (característico de MøAA) en comparación con los Mø 
provenientes de ratones sanos de las cepas BALB/c (no detectados, ND) y C57BL/6 
” de student; P= 0.0088, P= 0.0225, respectivamente. Es de llamar la 
atención que, los Mø de ratones BALB/c de 2 semanas p.i. presentaron niveles mayores 
del transcrito YM1 en comparación con los Møs de ratones de C57BL/6 a las 5 semanas 
Lo cual sugiere que el fondo genético de los ratones BALB/c 
favorece una pronta y franca diferenciación de los MøAA en comparación con el fondo 
Figura 4. Niveles de expresión de transcritos de mRNA del gen Ym1 en ratones de las 
cepas BALB/c y C57BL/6 a diferentes tiempos post-infección. * P< 0.05 respecto al 
entre BALB/c y C57BL/6. Los valores mostrados son la media de 5 ratones por 
 
Para demostrar el estado de activación de los macrófagos obtenidos de la cavidad 
, realizamos ensayos de RT-PCR en 
cultivos de macrófagos obtenidos de ratones sanos e infectados previamente con T. 
a diferentes semanas p.i., buscando los marcadores que indican la presencia 
a que los Mø de ratones BALB/c de 2 semanas p.i. y C57BL/6 
expresaron una mayor cantidad de transcritos de 
mRNA del gen Ym1 (característico deMøAA) en comparación con los Mø 
BALB/c (no detectados, ND) y C57BL/6 
” de student; P= 0.0088, P= 0.0225, respectivamente. Es de llamar la 
atención que, los Mø de ratones BALB/c de 2 semanas p.i. presentaron niveles mayores 
de ratones de C57BL/6 a las 5 semanas 
Lo cual sugiere que el fondo genético de los ratones BALB/c 
favorece una pronta y franca diferenciación de los MøAA en comparación con el fondo 
Figura 4. Niveles de expresión de transcritos de mRNA del gen Ym1 en ratones de las 
infección. * P< 0.05 respecto al 
entre BALB/c y C57BL/6. Los valores mostrados son la media de 5 ratones por 
En la figura 5 se muestran los niveles de transcritos de mRNA del gen FIZZ1, el cual es 
también es un marcador de MøAA; observamos que los Møs provenientes de ratones de 
la cepa BALB/c a las 2 y 16 semanas p.i. con 
significativamente mayores de transcritos en comparación con los ratones sanos que no 
expresaron el transcrito FIZZ1 (no detectados, ND), (prueba “
P= 0.0088, respectivamente). De manera interesante, los Mø provenientes de ratones de 
16 semanas p.i. expresaron niveles mayores de estos transcritos en comparación con los 
ratones de 2 semanas p.i. (prueba “
Por otro lado, los Mø de ratones de la cepa C57BL/6 a las 2 y 8 semanas p.i., con 
crassiceps presentaron niveles mayores de estos transcritos en comparación con ratones 
sanos (ND) (prueba “t” de student P= 0.0041 y P= 0.0236 respectivamente). 
Nuevamente, de manera interesante observamos que los Møs de ratones de 8 semanas 
p.i. presentaron niveles mayores de
2 semanas p.i. con T. crassiceps
Figura 5. Niveles de expresión de transcritos de mRNA del gen FIZZ1 en ratones de las 
cepas BALB/c y C57BL/6 a diferentes tiempos post
sano, ** respecto a las 2 semanas p.i., 
student. Los valores mostrados son la media de 5 ratones por grupo.
 
 
En la figura 5 se muestran los niveles de transcritos de mRNA del gen FIZZ1, el cual es 
también es un marcador de MøAA; observamos que los Møs provenientes de ratones de 
la cepa BALB/c a las 2 y 16 semanas p.i. con T. crassiceps presentaron niveles 
ificativamente mayores de transcritos en comparación con los ratones sanos que no 
expresaron el transcrito FIZZ1 (no detectados, ND), (prueba “t” de student, P= 0.0429 y 
P= 0.0088, respectivamente). De manera interesante, los Mø provenientes de ratones de 
16 semanas p.i. expresaron niveles mayores de estos transcritos en comparación con los 
ratones de 2 semanas p.i. (prueba “t” de student P= 0.0072). 
Por otro lado, los Mø de ratones de la cepa C57BL/6 a las 2 y 8 semanas p.i., con 
n niveles mayores de estos transcritos en comparación con ratones 
” de student P= 0.0041 y P= 0.0236 respectivamente). 
Nuevamente, de manera interesante observamos que los Møs de ratones de 8 semanas 
p.i. presentaron niveles mayores de transcritos en comparación con los Mø de ratones de 
T. crassiceps (prueba “t” de student P= 0.0077) (Fig. 
 
Figura 5. Niveles de expresión de transcritos de mRNA del gen FIZZ1 en ratones de las 
cepas BALB/c y C57BL/6 a diferentes tiempos post-infección. *P< 0.05 respecto al 
sano, ** respecto a las 2 semanas p.i., a entre BALB/c y C57BL/6. Prueba “
Los valores mostrados son la media de 5 ratones por grupo. 
En la figura 5 se muestran los niveles de transcritos de mRNA del gen FIZZ1, el cual es 
también es un marcador de MøAA; observamos que los Møs provenientes de ratones de 
presentaron niveles 
ificativamente mayores de transcritos en comparación con los ratones sanos que no 
” de student, P= 0.0429 y 
P= 0.0088, respectivamente). De manera interesante, los Mø provenientes de ratones de 
16 semanas p.i. expresaron niveles mayores de estos transcritos en comparación con los 
Por otro lado, los Mø de ratones de la cepa C57BL/6 a las 2 y 8 semanas p.i., con T. 
n niveles mayores de estos transcritos en comparación con ratones 
” de student P= 0.0041 y P= 0.0236 respectivamente). 
Nuevamente, de manera interesante observamos que los Møs de ratones de 8 semanas 
transcritos en comparación con los Mø de ratones de 
. 3). 
Figura 5. Niveles de expresión de transcritos de mRNA del gen FIZZ1 en ratones de las 
infección. *P< 0.05 respecto al 
entre BALB/c y C57BL/6. Prueba “t” de 
Porcentaje de macrófagos infectado
Con el objetivo de determinar si el estado de activación alternativo de los macrófagos
los hacía susceptibles o resistentes a una segunda infección por 
vitro macrófagos provenientes de diferentes tiempos de infección con 
tripomastigotes de T. cruzi
Giemsa, y se observaron 100 macrófagos en el microscopio de luz 
análisis (Fotos 1, 2 y 3). Además, réplicas de estos cultivos fueron tratadas con 
interferón gamma recombinante (IFN
macrófagos para la eliminación de los parásitos y de este modo observar reducciones en 
el porcentaje de macrófagos infectados. 
Foto 1.- Macr
Queretaro (rela
 
 
 
 
Amastigote
macrófagos infectados por T. cruzi, cepa Querétaro 
Con el objetivo de determinar si el estado de activación alternativo de los macrófagos
los hacía susceptibles o resistentes a una segunda infección por T. cruzi, 
macrófagos provenientes de diferentes tiempos de infección con T.
T. cruzi, cepa Querétaro. Se tiñeron con el colorante de
observaron 100 macrófagos en el microscopio de luz 
análisis (Fotos 1, 2 y 3). Además, réplicas de estos cultivos fueron tratadas con 
interferón gamma recombinante (IFN-γR) para determinar si éste podía activar a los 
macrófagos para la eliminación de los parásitos y de este modo observar reducciones en 
el porcentaje de macrófagos infectados. 
Macr
Queretaro (rela
Amastigote
Amastigote 
Con el objetivo de determinar si el estado de activación alternativo de los macrófagos, 
, se infectaron in 
T. crassiceps con 
, cepa Querétaro. Se tiñeron con el colorante de Wright-
observaron 100 macrófagos en el microscopio de luz (40x) para su 
análisis (Fotos 1, 2 y 3). Además, réplicas de estos cultivos fueron tratadas con 
R) para determinar si éste podía activar a los 
macrófagos para la eliminación de los parásitos y de este modo observar reducciones en 
Amastigote 
ófagos peritoneales de ratones sanos infec
ción 1:5). BALB/c (A) y C57BL/6 (B) a 72 h
ófagos peritoneales de ratones sanos infec
ción 1:5). BALB/c (A) y C57BL/6 (B) a 72 h
tados 
 post
tados in vitro
 post-infección. 
 
in vitro con T. cruzi 
infección. 
 
 
Foto 2.- Macrófagos peritoneales de ratones con 2 semanas p.i. con T. crassiceps 
BALB/c (A) y C57BL/6 (B) a 72 h después de la co-infección in vitro con T. cruzi 
Queretaro. 
 
Foto 3.- Macrófagos peritoneales de ratones BALB/c (B) y C5
p.i. con T. crassicep, a 72 h p.i. con T. cruzi Queretaro. 
 
Amastigote 
Amastigote 
Amastigote 
Amastigote 
 
7BL/6 (B) de 6 semanas 
La figura 6 (A) muestra el porcentaje de macrófagos infectados de la cepa de ratones 
BALB/c, después de una infección in vitro con parásitos de T. cruzi Querétaro. 
Observamos que los macrófagos provenientes de ratones del grupo control (no 
infectados previamente con T. crassiceps) y los macrófagos provenientes de ratones de 
2 semanas p.i. con T. crassiceps, prácticamente se infectaron en la misma proporción 
(p=0.6914); tampoco presentaron diferencias estadísticamente significativas en cuanto a 
una reducción en el porcentaje de macrófagos infectados, al ser tratados con IFN-γR 
(P= 1.0 para control y P= 0.1817 para 2 sem p.i.). Por el contrario, los macrófagos 
provenientes de ratones con 6 semanas p.i. con T. crassiceps se infectaron 
significativamente más que los macrófagos provenientes de ratones del grupo control 
(P= 0.0225), y que los macrófagos provenientes de ratones de 2 semanas p.i. con T. 
crassiceps (P= 0.0339). Sin embargo, tampoco observamos reducción en el grado de 
infección al ser tratados con IFN-γR (P= 0.5286). 
Por otra parte, en la figura 6 (B) se muestran los porcentajes de macrófagos infectados 
de ratones de la cepa C57BL/6posterior a la infección in vitro con tripomastigotes de T. 
cruzi Querétaro. Observamos que los macrófagos extraídos de ratones control y los 
macrófagos provenientes de ratones de 2 semanas p.i. con T. crassiceps se infectaron en 
la misma proporción ( P=0.8240). Respecto a los macrófagos provenientes de ratones de 
6 semanas p.i. con T. crassiceps, éstos se infectaron con T. cruzi significativamente más 
que los macrófagos control y que los de 2 semanas p.i. con T. crassiceps (P= 0.0016 y 
P= 0.0073, respectivamente). 
Los macrófagos de ratones control tratados con IFN-γR tuvieron una reducción 
significativa en el porcentaje de infección (P=0.0006). Sin embargo, este efecto no se 
observó en los macrófagos provenientes de ratones de 2 y 6 semanas p.i. con T. 
crassiceps (P= 0.6220; P = 0.0577; respectivamente). 
 
 
 
 
 
Figura 6.- Porcentaje de macrófagos infectados in vitro con T. cruzi Querétaro, de las 
cepas de ratones A) BALB/c y B) C57BL/6. * P< 0.05 respecto al sano, a respecto a las 
2 semanas p.i.; ** respecto al mismo grupo no tratado con IFN-γ. Prueba “t” de student. 
Los valores mostrados son la media de 5 ratones por grupo. 
 
 
 
 
 
 
 
0
10
20
30 a
*
Semanas post-infección con T. crassiceps
sano 2 6
T. cruzi + IFN
T. cruzi
BALB/c
A)
%
 d
e 
M
Ø
 in
fe
ct
ad
os
 Sano Sano + IFN 2 2 + IFN 6 6 + IFN
0
10
20
30
Semanas post-infeccion con T. crassiceps
a
*
0
10
20
30
sano 2 6
T. cruzi + IFN
T. cruzi
C57BL/6B)
%
 d
e 
M
Ø
 in
fe
ct
ad
os
*
*
Número de tripanosomas internalizados por macrófago. 
Con el propósito de conocer en qué medida se infectan los macrófagos (Mø) por el 
parásito T. cruzi, se realizó una observación en la infección in vitro de macrófagos, de 
100 células (macrófagos), donde, con las condiciones antes mencionadas, se contó el 
total de tripanosomas de las cepa Querétaro internalizados en el citoplasma de los Mø. 
Es importante resaltar que las graficas muestran el promedio del total de tripanosomas 
internalizados por cada célula de 100 células contadas, cada ensayo se realizó por 
duplicado. 
En la figura 7 (A) se observa, que los Mø extraídos de ratones sanos (no infectados 
previamente con T. crassiceps) después de la infección in vitro con T. cruzi mostraron 
un promedio de 1.59 tripanosomas internalizados por Mø, mientras que los macrófagos 
de 2 semanas post-infección con T. crassiceps mostraron en promedio 2.35 
tripanosomas por macrófago siendo estadísticamente significativo respecto al control 
(P=0.0098). De igual manera, los macrófagos de ratones de 6 semanas p.i. con T. 
crassiceps tuvieron mayor numero de tripanosomas internalizados (2.3) respecto al 
control (P=0.0441), pero no hubo diferencias respecto al de 2 semanas de infección con 
T. crassiceps (P=0.7817). 
El tratamiento con IFN-γR no tuvo ningún efecto sobre la capacidad efectora de los 
macrófagos para eliminar los tripanosomas internalizados en el grupo de macrófagos 
control (1.45), P= 0.1817; los de 2 semanas p.i. (2.25), P= 0.6042y los de 6 sem. p.i. 
(2.4), P= 0.4060; respecto a los mismos grupos no tratados con IFN-γR. 
La figura 7 (B) muestra el promedio de tripanosomas internalizados por Mø de ratones 
C57BL/6. Se puede observar que los Møs extraídos de ratones sanos (no infectados 
previamente con T. crassiceps) presentaron en promedio 1.96 tripanosomas por 
macrófago; sin embargo, los Mø provenientes de ratones de 2 semanas p.i. con T. 
crassiceps tuvieron más tripanosomas por macrófago (2.95) que el grupo sano (P= 
0.0098). Por otra parte Mø provenientes de ratones de 6 semanas p.i. con T. crassiceps, 
presentaron un numero de mayor de tripanosomas internalizados (2.8), respecto a los 
Mø infectados del grupo sano (P=0.0441), no así respecto a los macrófagos 
provenientes de ratones de 2 semanas p.i. con T. crassiceps (P= 0.1820). 
Nuevamente, el tratamiento con IFN-γR no tuvo ningún efecto sobre la capacidad 
efectora de los macrófagos para eliminar los tripanosomas internalizados por macrófago 
en ninguno de los grupos tratados: el grupo control (1.75), P= 0.6220; los de 2 sem. p.i. 
(2.95), P= 0.4502 y los de 6 sem. p.i. (3.05), P= 0.4950; respecto a los mismos grupos 
no tratados con IFN-γR. 
 BALB/c
 S
an
o
 S
an
o 
+ 
IF
N 2
2 .
+ 
IF
N 6 
6 +
 IF
N
0
1
2
3
4
* *
0
Sano 2 6
1
2
3
4
T. cruzi
T. cruzi + IFN
A)
Semanas p.i. con Taenia Crassiceps
N
o.
 d
e 
tr
ip
om
as
tig
ot
es
C57BL/6
 S
an
o
Sa
no
 +
 IF
N 2 
2 
+ 
IF
N 6 
6 +
 IF
N
0
1
2
3
4
* *
0
1
2
3
4
sano 2 6
T. cruzi
T. cruzi + IFN
B)
Semanas p.i. con Taenia Crassiceps
N
o.
 d
e 
tr
ip
om
as
tig
ot
es
 
Figura 7. Numero de tripanosomas internalizados por macrófago en los tratamientos de 
macrófagos de las cepas A) BALB/c y B) C57BL/6 a las 0, 2 y 6 semanas p.i. con T. 
crassiceps. * P< 0.05 respecto al sano, a respecto a las 2 semanas p.i.; ** respecto al 
mismo grupo no tratado con IFN-γ. Prueba “t” de student. Los valores mostrados son la 
media de 5 ratones por grupo y son representativas de 2 experimentos 
 
 
 
 
Porcentaje de macrófagos infectado
Fluorescencia. 
Para confirmar nuestras observaciones hechas en el microscopio de luz, co
in vitro macrófagos de diferentes tiempos post
tripomastigotes de T. cruzi
producción de GFP (proteína verde fluorescente) y se observaron 100 células al 
microscopio de fluorescencia (Foto 4
 
 
 
 
 
 
 
Foto 4.- Macrófagos peritoneales de ratones sanos (sin infecci
crassiceps) BALB/c (A y B) y C57BL/6 (C y D) a 72 h después de l
con T. cruzi CL-Brener. 
 
 
macrófagos infectados por T. cruzi, CL-Brener modificada con 
Para confirmar nuestras observaciones hechas en el microscopio de luz, co
macrófagos de diferentes tiempos post-infección de T. crassiceps
T. cruzi cepa CL-Brener modificados con el plásmido para la 
(proteína verde fluorescente) y se observaron 100 células al 
microscopio de fluorescencia (Foto 4-14.). 
Macrófagos peritoneales de ratones sanos (sin infecci
) BALB/c (A y B) y C57BL/6 (C y D) a 72 h después de l
D 
100 x
100 x
Brener modificada con 
Para confirmar nuestras observaciones hechas en el microscopio de luz, co-infectamos 
T. crassiceps con 
modificados con el plásmido para la 
(proteína verde fluorescente) y se observaron 100 células al 
Macrófagos peritoneales de ratones sanos (sin infecci
) BALB/c (A y B) y C57BL/6 (C y D) a 72 h después de l
100 x 
100 x 
ón previa con 
a infección 
ón previa con 
a infección 
ón previa con T. 
a infección in vitro 
Macrófagos peritoneales de ratones BALB/c (A y B) y C57BL/6 (C y D) con 2 semanas 
p.i. por T. crassiceps a 72 h p.i. con 
Foto 6. Macrófagos peritoneales de ratones BALB/c (A y B) y C
semanas p.i. por T. crassiceps
 
Macrófagos peritoneales de ratones BALB/c (A y B) y C57BL/6 (C y D) con 2 semanas 
a 72 h p.i. con T. cruzi CL-Brener. 
Foto 6. Macrófagos peritoneales de ratones BALB/c (A y B) y C
T. crassiceps a 72 h p.i. con T. cruzi CL-Brener. 
100 x 
100 x 
100 x 
100 x 
 
 
 
 
 
 
Foto 5. 
Macrófagos peritoneales de ratones BALB/c (A y B) y C57BL/6 (C y D) con 2 semanas 
 
 
 
 
 
 
Foto 6. Macrófagos peritoneales de ratones BALB/c (A y B) y C
 
 
 
 
57BL/6 (C y D) con 4 57BL/6 (C y D) con 4 57BL/6 (C y D) con 4 
Foto 7. Macrófagos peritoneales de ratones BALB/c (A y B) y C57BL/6 (C y D) con 20 
semanas p.i. por T. crassiceps
 
Foto 8.- Macrófagos extraídos de ratones sanos (sin infección prev
BALB/c (A y B) y C57BL/6 (C y D) a 120 h p.i. con 
Foto 7. Macrófagos peritoneales de ratones BALB/c (A y B) y C57BL/6 (C y D) con 20 
T. crassiceps a 100x, 72 h p.i. con T. cruzi CL-Brener. 
Macrófagos extraídos de ratones sanos (sin infección prev
BALB/c (A y B) y C57BL/6 (C y D) a 120 h p.i. con T. cruzi CL-B
100 x
100 x
10 x 
10 xFoto 7. Macrófagos peritoneales de ratones BALB/c (A y B) y C57BL/6 (C y D) con 20 
 
 
 
 
 
 
 
Macrófagos extraídos de ratones sanos (sin infección prev
B
100 x 
100 x 
 
 
ia con ia con 
rener. 
ia con T. crassiceps) 
rener. 
 
Foto 9.- Macrófagos peritoneales de ratones BALB/c (A y B) y C57BL/6 
semanas p.i. con T. crassiceps
Macrófagos peritoneales de ratones BALB/c (A y B) y C57BL/6 (C
p.i. con T. crassiceps a 120 h p.i. con 
 
Macrófagos peritoneales de ratones BALB/c (A y B) y C57BL/6 
T. crassiceps a 120 h p.i. con T. cruzi CL-Brener. 
Macrófagos peritoneales de ratones BALB/c (A y B) y C57BL/6 (C
a 120 h p.i. con T. cruzi CL-Brener. 
10 x 
10 x 
 
Macrófagos peritoneales de ratones BALB/c (A y B) y C57BL/6 (C y D) de 2 
 
 
 
 
 
 
Macrófagos peritoneales de ratones BALB/c (A y B) y C57BL/6 (C
 
 
10 xx 
10 xx 
 y D) y D)
Foto 10.- 
 y D) de 20 semanas 
La figura 8 (A) presenta los porcentajes de macrófagos co-infectados con la cepa CL 
Brener; observando que los macrófagos extraídos de ratones BALB/c no infectados con 
T. crassiceps (grupo control), presentaron una tasa baja de infección por T. cruzi CL-
Brener (1.67%), mientras que los de macrófagos de ratones de 2, y 4 semanas p.i. con T. 
crassiceps fueron ligeramente más susceptibles a la infección por T. cruzi (4%, P= 
0.0198; 3.34%, P=0.0377, respectivamente). En relación a esto los macrófagos de 6 
semanas p.i. con T. crassiceps fueron un poco más susceptibles a la infección por T. 
cruzi que el grupo control (P= 0.0202) y que los macrófagos de 2 y 4 semanas (P= 
0.0377, P= 0.0198, respectivamente), mientras que los macrófagos de 12 semanas p.i. 
con T. crassiceps fueron francamente más susceptibles a la infección por T. cruzi que el 
resto de los grupos, respecto al control (P= .0016), 2 (P= 0.0091), 4 (P= 0.0025) y 6 (P= 
0.0059) semanas p.i. con T. crassiceps. 
Fue de llamar la atención que en ninguno de los casos la adición de IFN-γR tuvo un 
efecto reductor en el porcentaje de Mø infectados (Figura 6A barras en gris). 
La figura 8 (B) muestra los porcentajes de macrófagos co-infectados in vitro por T. 
cruzi CL-Brener-Fluorescente de ratones de la cepa C57BL/6. Observamos que los Mø 
de ratones sanos tuvieron una tasa de infección del 2.67% mientras que los Mø 
obtenidos de ratones de 2 semanas p.i. con T. crassiceps fueron ligeramente más 
susceptibles a la infección 3.4%, sin embargo no fue estadísticamente significativa esta 
diferencia (P= 0.6914). Por el contrario, los Mø provenientes de ratones de 8 semanas 
p.i. con T. crassiceps si mostraron un franco incremento en la susceptibilidad a la 
infección por los tripanosomas fluorescentes (7%), respecto al grupo de macrófagos 
sanos (P= 0.0202) y el de 2 semanas de infección con T. crassiceps (P= 0.0012). 
Nuevamente, pudimos observar que la adición de IFN-γR no tuvo efecto alguno sobre la 
capacidad efectora de los macrófagos provenientes de ratones sanos (2.34%, P= 1.0) y 
tampoco sobre los macrófagos provenientes de ratones con 2 sem. de infección con T. 
crassiceps (4.5%., P= 0.1817). Sin embargo los macrófagos provenientes de 8 semanas 
de infección con T. crassiceps, si tuvieron una reducción significativa en el grado de 
infección (5.50 %) por tripanosomas, respecto al mismo grupo no tratado con IFN-γ 
(P= 0.0138). 
BALB/c
Sa
no
Sa
no
 +
 IF
N 2
2 
+ 
IF
N 4
4 
+ 
IF
N 6
6 
+ 
IF
N 12
12
 +
 IF
N
0
3
6
9
12
* *
*
*
a
a
0
3
6
9
12
sano 2 4 6 8
T. cruzi
T. cruzi + IFN
A)
Semanas post-infección con T. crassiceps
%
 d
e 
M
Ø
 in
fe
ct
ad
os
 
Figura 8.-Porcentaje de macrófagos infectados in vitro por T. cruzi CL-Brener, de las 
cepas de ratones A) BALB/c y B) C57BL/6. * P< 0.05 respecto al sano, a respecto a las 
2 semanas p.i. ** respecto al mismo grupo no tratado con IFN-γ. Prueba “t” de student. 
Los valores mostrados son la media de 5 ratones por grupo y son representativas de 3 
experimentos 
 
 
 
 
 
 
 
C57BL/6
Sa
no
Sa
no
 +
 IF
N 2 
2 +
 IF
N 8
8 +
 IF
N
0
3
6
9
12
Semanas post-infeccion con T. crassiceps
*
*
a
0
3
6
9
12
sano 2 8
T. cruzi + IFN
T. cruzi
B)
%
 d
e 
M
Ø
 in
fe
ct
ad
os
*
*
 
Número de tripanosomas internalizados por macrófago. 
La figura 9 (A) muestra el promedio de tripanosomas internalizados por Mø de ratones 
BALB/c, después de la infección in vitro con T. cruzi CL-Brener, observando que los 
Mø extraídos de ratones sanos se infectaron en una tasa de 2.83%, mientras que los Mø 
infectados provenientes de ratones con 2 y 4 semanas p.i. con T. crassiceps, tuvieron un 
porcentaje mayor de tripanosomas internalizados (5%; P= 0.0089 para 2 sem p.i. y 
3.1%, P=0.0377 para 4 sem p.i.) respecto al control. Fue de llamar la atención que los 
Mø de ratones de 2 semanas p.i. con T. crassiceps presentaron un mayor número de 
tripanosomas por macrófago que los de 12 sem p.i. con T. crassiceps (P= 0.0485). 
Por otro lado, no hubo diferencias significativas entre los Mø provenientes de ratones de 
4 sem. p.i., 8 sem p.i. y 12 sem. p.i. con T. crassiceps, (P= 0.8359 para el grupo de 8 
semanas vs 4 sem p.i. ; P = 0.0742 para el grupo de 12 semanas vs 4 sem p.i.; P= 0.1994 
para el grupo de 12 semanas vs 8 sem p.i.). Así mismo no hubo diferencias entre los 
grupos antes mencionados con respecto a los Mø del grupo sano (4 sem. p.i.(P= 0.4802) 
8 sem p.i. (P= 0.5688) y 12 semanas (P= 0.1230) p.i.). No así, respecto a los Møs 
provenientes de ratones de 2 semanas p.i., teniendo estos últimos un mayor número de 
tripanosomas internalizados (P= 0.0296, para macrófagos 8 sem p.i. vs 2 sem p.i.; P= 
0.0016, para macrófagos de 12 sem . p.i. vs macrófagos de 2 sem p.in.). 
Por otra parte los Mø del grupo sano al ser tratados con IFN-γR presentaron reducciones 
significativas en el número de tripanosomas internalizados por Mø, (1.33), P= 0.0485. 
Los Mø de 2 semanas p.i. con T. crassiceps al ser tratados con IFN-γR, también 
redujeron significativamente el número de estos parásitos, (3.75), P=0.0123. Por el 
contrario, los Mø infectados in vitro del grupo de 4 semanas p.i. con T. crassiceps, no 
mostraron una disminución significativa en su carga parasitaria al ser tratados con IFN-
γR, (3.22), sin embargo los Mø de 8 sem p.i. si presentaron diferencias significativas al 
ser tratados con IFN-γR (2.1) P= 0.0094, y finalmente los Mø infectados del grupo de 
12 semanas p.i. con T. crassiceps, no presentaron diferencias significativas al ser 
tratados con IFN-γR (2) P= 0.9284. 
 
La figura 9 (B) muestra el promedio de tripanosomas internalizados por Mø de ratones 
C57BL/6. Observamos que los Mø extraídos de ratones sanos (2.25), presentaron 
diferencias significativas con respecto a los Mø infectados provenientes de ratones de 2 
semanas p.i. con T. crassiceps (2.96), P= 0.0296, estos últimos con mayor numero de 
tripanosomas internalizados, por otra parte, no se encontraron diferencias significativas 
entre los Mø infectados provenientes de ratones de 8 semanas p.i. con T. crassiceps 
(1.85) con respecto a los Mø provenientes de ratones sanos, P=0.0983, no así, con el 
tratamiento de Mø infectados provenientes de ratones de 2 semanas p.i. que presentó un 
mayor número de tripanosomas por macrófago, P= 0.0175. 
Los Mø extraídos de ratones sanos (2.25), presentaron reducciones significativas en el 
promedio de tripanosomas internalizados por macrófago al ser tratados con IFN-γR 
(1.51), P= 0.0106, los macrófagos de 2 semanas p.i. al ser tratados con IFN-γR también 
presentaron reducciones significativas (1.9), P=0.0250, sin embargo, los Møs infectados 
del grupo de 8 semanas p.i. con T. crassiceps, no mostraron una disminución 
significativa en la carga parasitaria al ser tratados con IFN-γR, (1.6), P= 0.1817. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9. Porcentaje de tripanosomas internalizados por Mø después de la infección in 
vitro por T. cruzi