Estudio-de-permeabilidad-de-los-flavonoides-acacetina-y-pinocembrina-a-traves-de-la-monocapa-celular-caco-2--un-modelo-in-vitro-de-absorcion-intestinal

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS QUÍMICAS 
 
 
 
ESUDIO DE PERMEABILIDAD DE LOS FLAVONOIDES ACACETINA Y 
PINOCEMBRINA A TRAVÉS DE LA MONOCAPA CELULAR Caco-2: UN 
MODELO IN VITRO DE ABSORCIÓN INTESTINAL 
 
 
 
TESIS 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
MAESTRA EN CIENCIAS 
 
 
PRESENTA: 
DIANA ALEJANDRA MARTÍNEZ CHÁVEZ 
 
 
TUTORA: DRA. BLANCA ESTELA RIVERO CRUZ 
FACULTAD DE QUÍMICA, UNAM 
 
MÉXICO, D. F. JUNIO 2015 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
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del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
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objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE 
MÉXICO 
 
 
 
 
 
PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS 
QUÍMICAS 
 
 
 
ESTUDIO DE PERMEABILIDAD DE LOS FLAVONOIDES 
 ACACETINA Y PINOCEMBRINA A TRAVÉS DE LA MONOCAPA CELULAR Caco-2: 
UN MODELO IN VITRO DE ABSORCIÓN INTESTINAL 
 
 
 
TESIS 
PARA OPTAR POR EL GRADO DE 
 
MAESTRA EN CIENCIAS 
 
 
 
PRESENTA 
 
QFB DIANA ALEJANDRA MARTÍNEZ CHÁVEZ 
 
 
 
 
 
 
 
 
TUTORA: DRA. BLANCA ESTELA RIVERO CRUZ 
 
 2015 
 
i 
 
Jurado Asignado: 
Presidente Dra. Lilián Yepez Mulia 
Vocal Dr. Ricardo Reyes Chilpa 
Vocal Dra. María Isabel Aguilar Laurents 
Vocal Dra. Flora Adriana Ganem Rondero 
Secretario Dra. Helgi Jung Cook 
 
 
 
El presente trabajo de investigación se realizó en los laboratorios 113 y de Cultivo Celular 
de la Unidad de Estudios Preclínicos (UNIPREC), ambos ubicados en el Conjunto E de la 
Facultad de Química, UNAM. 
 
 
 
Tutora: 
 
 Dra. Blanca Estela Rivero Cruz 
 
 
 
 
 
Sustentante: 
 
 QFB Diana Alejandra Martínez Chávez 
 
 
 
Parte de este trabajo se presentó en la 10ª Reunión Internacional de Investigación de 
Productos Naturales en Mérida, Yucatán. Mayo, 2014. 
 
 
 
 
ii 
 
AGRADECIMIENTOS 
A la Universidad Nacional Autónoma de México por darme el privilegio de 
recibir una educación de calidad y una formación humana, y por permitirme 
nuevamente completar una etapa más en mi vida académica. 
A la Dra. Blanca Estela Rivero Cruz por su apoyo incondicional para lograr la 
realización de este proyecto de investigación, por su gran disposición para 
ayudarme en cualquier momento, por su asesoría y sus consejos que han 
contribuido de manera especial en mi formación. 
Al CONACyT por la beca otorgada para realizar los estudios de Maestría 
(Número de becario 288996). 
A los miembros del jurado: Dra. Helgi Jung Cook, Dra. Adriana Ganem 
Rondero, Dra. Isabel Aguilar Laurents, Dr. Ricardo Reyes Chilpa y Dra. Lilián 
Yépez Mulia por el tiempo dedicado a la revisión de este trabajo y por sus 
valiosas aportaciones para la corrección y mejora de esta tesis. 
A la Dra. Inés Fuentes Noriega por todo el apoyo brindado para la realización 
de este proyecto de investigación. 
Al personal de la UNIPREC, en especial a los M en C Isabel Gracia y Francisco 
Sánchez por permitirme realizar parte del trabajo experimental en el 
laboratorio de cultivo celular; también a Lidia Barrón por sus consejos y la 
asesoría técnica brindada. 
Al Dr. José Pedraza Chaverri por permitirme el uso del fluorómetro para la 
lectura de las muestras. 
A todas las personas que de alguno u otra manera contribuyeron en la 
realización de este trabajo, en especial a Lulú, Pablo, Quetzal, Alí y Jonathan 
gracias por su infinito apoyo, sus consejos, su amistad y su compañerismo. 
 
 
iii 
 
Dedicatoria 
A mi mamá y mi papá, mis abuelitos, Ilse y toda mi familia 
A Alan 
A todos mis amigos 
 
 
iv 
 
ÍNDICE GENERAL 
 Página 
Lista de Figuras viii 
Lista de Gráficas x 
Lista de Tablas xi 
Lista de Siglas, Abreviaturas y Símbolos xiv 
1. Introducción 1 
2. Objetivos 3 
3. Antecedentes 4 
3.1 Propóleo 4 
3.2 Flavonoides 5 
3.2.1 Generalidades 5 
3.2.2 Clasificación de los flavonoides 6 
3.2.3 Biogénesis de los flavonoides 7 
3.2.4 Actividad biológica de los flavonoides 9 
3.3 Pinocembrina 9 
3.3.1 Fuentes naturales de pinocembrina 10 
3.3.2 Actividad biológica de la pinocembrina 11 
3.3.2.1 Actividad antimicrobiana 11 
3.3.2.2 Actividad antiinflamatoria 12 
3.3.2.3 Actividad anticancerosa 12 
3.3.2.4 Actividad neuroprotectora 13 
3.3.2.5 Actividad antiangiogénica 14 
3.3.2.6 Actividad vasorrelajante 14 
3.3.2.7 Actividad como antiagregante plaquetario 14 
3.3.2.8 Actividad antimutagénica 14 
3.4 Acacetina 15 
3.4.1 Fuentes naturales de acacetina 15 
3.4.2 Actividad biológica de la acacetina 16 
3.4.2.1 Actividad anticancerosa 16 
3.4.2.2 Actividad neuroprotectora 17 
3.4.2.3 Actividad antiinflamatoria y antinociceptiva 18 
3.4.2.4 Actividad antiinflamatoria e inmunomoduladora 18 
3.4.2.5 Actividad hepatoprotectora y cardioprotectora 18 
3.4.2.6 Actividad antiplasmódica y antiviral 19 
3.4.2.7 Actividad hipoglicémica e hipouricémica 19 
3.5 Absorción de fármacos 20 
3.5.1 Transporte de fármacos a través de membranas 23 
3.5.1.1 Transporte pasivo transcelular 23 
 
v 
 
3.5.1.2 Transporte pasivo paracelular 24 
3.5.1.3 Transporte mediado por acarreadores 25 
3.5.1.3.1 Transportadores o acarreadores 26 
3.5.1.4 Endocitosis 28 
3.5.2 Sistema de clasificación biofarmacéutica 28 
3.5.3 Modelos para evaluar la permeabilidad 29 
3.5.3.1 Métodos fisicoquímicos 30 
3.5.3.2 Métodos in vitro 31 
3.5.3.2.1 Métodos basados en tejidos animales 31 
3.5.3.2.2 Métodos basados en cultivos celulares 31 
3.5.3.3 Métodos in situ 33 
3.5.3.4 Métodos in vivo 33 
3.5.3.5 Métodos in sillico 33 
4. Metodología 35 
4.1 Determinación de las características fisicoquímicas de la 
pinocembrina y la acacetina 
 
35 
4.2 Método bioanalítico para cuantificar atenolol y propranolol 
(marcadores de permeabilidad) en estudios de transporte in vitro con 
células Caco-2 
 
 
35 
4.2.1 Desarrollo del método 35 
4.2.2 Evaluación del sistema 36 
4.2.2.1 Precisión 36 
4.2.2.2 Linealidad 36 
4.2.3 Validación del método bioanalítico 36 
4.2.3.1 Selectividad 37 
4.2.3.2 Linealidad 37 
4.2.3.3 Exactitud, precisión y recobro 37 
4.2.3.4 Límite de cuantificación 38 
4.2.3.5 Estabilidad de la muestra 38 
4.3 Método bioanalítico para la cuantificación de Acacetina y 
Pinocembrina en estudios de transporte in vitro con células Caco-2 
 
39 
4.3.1 Diseño experimental para el desarrollo del método cromatográfico 39 
4.3.2 Evaluación del sistema 40 
4.3.2.1 Precisión 41 
4.3.2.2 Linealidad 41 
4.3.3 Validación del método 41 
4.3.3.1 Selectividad 41 
4.3.3.2 Linealidad 42 
4.3.3.3 Exactitud, precisión y recobro 42 
4.3.3.4 Límite de cuantificación 42 
 
vi 
 
4.3.3.5 Estabilidad de la muestra 42 
4.4 Cultivo celular 42 
4.4.1 Preparación de medios utilizados para el cultivo celular 43 
4.4.2 Descongelamiento y proliferación celular 43 
4.4.3 Tripsinización y conteo celular 43 
4.4.4 Subcultivo y criopreservación de la línea celular 44 
4.5 Ensayo de citotoxicidad de los flavonoides sobre la línea celular 
Caco-2 
45 
4.6 Estudio de permeabilidad 46 
4.6.1 Preparación de los medios requeridos para el estudio 46 
4.6.2 Formación de la monocapa de la línea celular Caco-2 en las placas 
Transwell 
 
46 
4.6.3 Medición de la Resistencia Transepitelial (TEER) 47 
4.6.4 Adecuabilidad del modelo de permeabilidad 47 
4.6.4.1 Transporte en dirección Apical-Basolateral47 
4.6.4.2 Transporte en dirección Basolateral-Apical 47 
4.6.5 Estudios de transporte de la acacetina y la pinocembrina 48 
4.6.6 Determinación de la integridad de la monocapa 49 
4.6.7 Análisis de las muestras 49 
4.6.8 Cálculo del coeficiente de permeabilidad aparente 49 
5. Resultados y Discusión 50 
5.1 Propiedades fisicoquímicas de la Pinocembrina y la Acacetina 50 
5.2 Método bioanalítico para la cuantificación de Atenolol y Propranolol 
en estudios de transporte in vitro con células Caco-2 
 
51 
5.2.1 Desarrollo del método 51 
5.2.2 Evaluación del sistema 54 
5.2.2.1 Precisión 54 
5.2.2.2 Linealidad 54 
5.2.3 Validación del método 56 
5.2.3.1 Selectividad 57 
5.2.3.2 Linealidad del método 59 
5.2.3.3 Precisión y Exactitud 62 
5.2.3.4 Recobro 63 
5.2.3.5 Límite de cuantificación 64 
5.2.3.6 Estabilidad de la muestra 65 
5.3 Método bioanalítico para la cuantificación de Acacetina y 
Pinocembrina en estudios de transporte in vitro con células Caco-2 
 
66 
5.3.1 Desarrollo del método 66 
5.3.2 Evaluación del sistema 72 
5.3.2.1 Precisión 72 
 
vii 
 
5.3.2.2 Linealidad 72 
5.3.3 Validación del método 74 
5.3.3.1 Selectividad 75 
5.3.3.2 Linealidad del método 77 
5.3.3.3 Precisión y exactitud 79 
5.3.3.4 Recobro 81 
5.3.3.5 Límite de cuantificación 82 
5.3.3.6 Estabilidad de la muestra 83 
5.4 Cultivo celular 84 
5.5 Ensayo de citotoxicidad 85 
5.6 Estudio de permeabilidad 87 
5.6.1 Adecuabilidad del modelo de permeabilidad 87 
5.6.2 Estudios de permeabilidad de la Pinocembrina y la Acacetina 90 
6. Conclusiones 94 
7. Perspectivas 95 
8. Bibliografía 96 
9. Anexo I 103 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
viii 
 
Lista de Figuras 
 Página 
Figura 3.1 Recolección del material vegetal para la formación del 
propóleo. 4 
Figura 3.2 Fenilbenzopiranos (esqueleto C6-C3-C6): Flavonoides (1), 
Isoflavonoides (2) y Neoflavonoides (3). 7 
Figura 3.3 Principales subgrupos de los flavonoides 7 
Figura 3.4 Formación del 4-coumaroil CoA a partir de los 
aminoácidos L-Fenilalanina y L-Tirosina. 8 
Figura 3.5 Formación de los flavonoides 8 
Figura 3.6 Estructura y fuentes naturales de la pinocembrina (Rasul 
et al., 2013) 10 
Figura 3.7 Estructura y fuentes naturales de la acacetina 15 
Figura 3.8 Características de las células epiteliales intestinales 
(Avdeef, 2003) 22 
Figura 3.9 Estructuras químicas del propranolol (a) y el atenolol (b) 29 
Figura 4.1 Estudio de transporte bidireccional empleando una 
monocapa celular en una placa Transwell 48 
Figura 5.1 Diagramas de solubilidad en función del pH. (a): 
pinocembrina (b): acacetina 50 
Figura 5.2 Diagrama de distribución de especies de la pinocembrina 
(a) y la acacetina (b) 51 
Figura 5.3 Cromatograma obtenido con los estándares de atenolol y 
propranolol a una concentración de 100 µM 53 
Figura 5.4 Cromatogramas obtenidos para evaluar la selectividad del 
método para cuantificar atenolol a 224 nm: HBSS (a), 
blanco de HBSS en contacto con células Caco-2 (b), 
atenolol a una concentración de 100 µM (c) 58 
Figura 5.5 Cromatogramas obtenidos para evaluar la selectividad del 
método para cuantificar propranolol a 290 nm: HBSS (a), 
HBSS en contacto con la monocapa celular Caco-2 (b), 
propranolol a una concentración de 100 µM (c) 59 
Figura 5.6 Cromatograma de acacetina y pinocembrina obtenido con 
MeOH: TFA 0.01% (60:40) y flujo de 1.5 mL/min 67 
Figura 5.7 Diagramas de Pareto de los factores evaluados para cada 
respuesta 69-70 
Figura 5.8 Cromatograma obtenido con el método desarrollado para 
pinocembrina y acacetina a una concentración de 100 
µg/mL 71 
Figura 5.9 Cromatogramas obtenidos para evaluar la selectividad del 
método para cuantificar pinocembrina a 290 nm: HBSS (a), 
HBSS en contacto con la monocapa celular Caco-2 (b), 
pinocembrina a una concentración de 40 µM (c) 76 
Figura 5.10 Cromatogramas obtenidos para evaluar la selectividad del 
método para cuantificar acacetina a 320 nm: HBSS (a), 
HBSS en contacto con la monocapa celular Caco-2 (b), 77 
 
ix 
 
acacetina a una concentración de 40 µM (c) 
Figura 5.11 Células Caco-2 (100X) en proliferación: (a) en 
subconfluencia y (b) en confluencia 
 
85 
 
 
 
x 
 
Lista de Gráficas 
 
 Página 
Gráfica 5.1 Linealidad del sistema para cuantificar atenolol 55 
Gráfica 5.2 Linealidad del sistema para cuantificar propranolol 56 
Gráfica 5.3 Linealidad del método para cuantificar atenolol 60 
Gráfica 5.4 Linealidad del método para cuantificar propranolol 61 
Gráfica 5.5 Superficie de respuesta estimada de los factores 
evaluados para establecer las condiciones 
cromatográficas del método para cuantificar 
pinocembrina y acacetina 70 
Gráfica 5.6 Linealidad del sistema para cuantificar pinocembrina 73 
Gráfica 5.7 Linealidad del sistema para cuantificar acacetina 74 
Gráfica 5.8 Linealidad del método para cuantificar pinocembrina 78 
Gráfica 5.9 Linealidad del método para cuantificar acacetina 79 
Gráfica 5.10 Viabilidad de las células Caco-2 con un tiempo de 
exposición a los compuestos evaluados de 24 h. 87 
Gráfica 5.11 Transporte de propranolol y atenolol en las direcciones 
Apical-Basolateral (a) y Basolateral-Apical (b) 89 
Gráfica 5.12 Correlación entre la fracción absorbida (FA) en humanos 
y la permeabilidad a través de las monocapas celulares 
Caco-2 (Hubatsch et al., 2007) 89 
Gráfica 5.13 Transporte de la pinocembrina en las direcciones Apical-
Basolateral (a) y Basolateral-Apical (b), y de la acacetina 
ne las direcciones Apical-Basolateral (c) y Basolateral-
Apical (d) en la monocapa celular Caco-2 91 
Gráfica 5.14 Coeficientes de permeabilidad aparente de los 
flavonoides y de los marcadores de permeabilidad 93 
 
 
 
xi 
 
Lista de Tablas 
 Página 
Tabla 3.1 Parámetros biológicos y fisicoquímicos del tracto 
gastrointestinal humano (Balimane et al., 2000) 21 
Tabla 3.2 Sistema de Clasificación Biofarmacéutica 28 
Tabla 4.1 Factores evaluados en el diseño experimental 39 
Tabla 4.2 Diseño experimental 23 40 
Tabla 4.3 Condiciones cromatográficas del método para cuantificar 
acacetina y pinocembrina 40 
Tabla 5.1 Propiedades fisicoquímicas de la pinocembrina y la 
acacetina in silico 50 
Tabla 5.2 Parámetros cromatográficos obtenidos para el atenolol y el 
propranolol con el método desarrollado 53 
Tabla 5.3 Precisión del sistema para la cuantificación de atenolol y 
propranolol 54 
Tabla 5.4 Coeficientes e intervalos de confianza del intercepto y la 
pendiente del modelo de linealidad del sistema para 
cuantificar atenolol 55 
Tabla 5.5 Análisis de varianza del modelo para evaluar la linealidad 
del sistema para cuantificar atenolol 55 
Tabla 5.6 Coeficientes e intervalos de confianza del intercepto y la 
pendiente del modelo de linealidad del sistema para 
cuantificar propranolol 56 
Tabla 5.7 Análisis de varianza del modelo para evaluar la linealidad 
del sistema para cuantificar propranolol 56 
Tabla 5.8 Coeficientes e intervalos de confianza del intercepto y la 
pendiente del modelo de linealidad del método para 
cuantificar atenolol 60 
Tabla 5.9 Análisis de varianza del modelo para evaluar la linealidad 
del método para cuantificar atenolol 61 
Tabla 5.10 Coeficientes e intervalos de confianza del intercepto y la 
pendiente del modelo de linealidad del método para 
cuantificar propranolol 61 
Tabla 5.11 Análisis de varianza del modelo para evaluar la linealidad 
del método para cuantificar propranolol 61 
Tabla 5.12 Resultados obtenidos para evaluar la repetibilidad y la 
exactitud del método para cuantificar atenolol y propranolol 62 
Tabla 5.13 Resultados obtenidos para evaluar la precisión intermedia 
del método para cuantificar atenolol 63 
Tabla 5.14 Resultados obtenidos para evaluar la precisión intermedia 
del método para cuantificar propranolol 63 
Tabla 5.15 Resultados obtenidos para evaluar el recobro del método de 
cuantificación del atenolol 64 
Tabla 5.16 Resultados obtenidos para evaluar el recobro del método de 
cuantificación del propranolol 64 
 
xiiTabla 5.17 Precisión y exactitud del límite inferior de cuantificación del 
atenolol y del propranolol 65 
Tabla 5.18 Resultados de estabilidad para las muestras de atenolol 65 
Tabla 5.19 Resultados de estabilidad para las muestras de propranolol 66 
Tabla 5.20 Factores evaluados en el diseño experimental 22 67 
Tabla 5.21 Optimización de respuesta múltiple 68 
Tabla 5.22 Precisión del sistema para cuantificar pinocembrina y 
acacetina 72 
Tabla 5.23 Coeficientes e intervalos de confianza del intercepto y la 
pendiente del modelo de linealidad del sistema para 
cuantificar pinocembrina 73 
Tabla 5.24 Análisis de varianza del modelo para evaluar la linealidad 
del sistema para cuantificar pinocembrina 73 
Tabla 5.25 Coeficientes e intervalos de confianza del intercepto y la 
pendiente del modelo de linealidad del sistema para 
cuantificar acacetina 74 
Tabla 5.26 Análisis de varianza del modelo para evaluar la linealidad 
del sistema para cuantificar acacetina 74 
Tabla 5.27 Coeficientes e intervalos de confianza del intercepto y la 
pendiente del modelo de linealidad del método para 
cuantificar pinocembrina 78 
Tabla 5.28 Análisis de varianza del modelo para evaluar la linealidad 
del método para cuantificar pinocembrina 78 
Tabla 5.29 Coeficientes e intervalos de confianza del intercepto y la 
pendiente del modelo de linealidad del método para 
cuantificar acacetina 79 
Tabla 5.30 Análisis de varianza del modelo para evaluar la linealidad 
del método para cuantificar acacetina 79 
Tabla 5.31 Resultados obtenidos para evaluar la repetibilidad y la 
exactitud del método para cuantificar pinocembrina y 
acacetina 80 
Tabla 5.32 Resultados obtenidos para evaluar la precisión intermedia 
del método para cuantificar pinocembrina 81 
Tabla 5.33 Resultados obtenidos para evaluar la precisión intermedia 
del método para cuantificar acacetina 81 
Tabla 5.34 Resultados obtenidos para evaluar el recobro del método de 
cuantificación de pinocembrina 82 
Tabla 5.35 Resultados obtenidos para evaluar el recobro del método de 
cuantificación de acacetina 82 
Tabla 5.36 Precisión y exactitud del límite inferior de cuantificación de 
la pinocembrina y la acacetina 83 
Tabla 5.37 Resultados de estabilidad para las muestras de 
pinocembrina 83 
Tabla 5.38 Resultados de estabilidad para las muestras de acacetina 84 
Tabla 5.39 Porcentaje de viabilidad promedio obtenido con cada 
muestra 
 
87 
 
xiii 
 
Tabla 5.40 Permeabilidad aparente de los compuestos marcadores 
para evaluar la adecuabilidad del modelo 88 
Tabla 5.41 Coeficientes de permeabilidad aparente (Papp) de los 
flavonoides y de los marcadores de permeabilidad 90 
Tabla 5.42 Análisis de varianza de los coeficientes de Papp de 
pinocembrina obtenidos en la dirección A-B a diferentes 
concentraciones 92 
Tabla 5.43 Análisis de varianza de los coeficientes de Papp de acacetina 
obtenidos en la dirección A-B a diferentes concentraciones 92 
 
 
 
xiv 
 
Lista de siglas, abreviaturas y símbolos 
Å Ångström 
ABC ATP-binding cassette 
A-B Apical-Basolateral 
ADP Adenosin Difosfato 
ATCC American Type Culture Collection 
ATP Adenosin Trifosfato 
B-A Basolateral-Apical 
BCPR Proteína de resistencia de cáncer de mama 
BSC Sistema de Clasificación Biofarmacéutica 
°C Grados celcius 
CI50 Concentración Inhibitoria 50 
cm Centímetro 
CMI Concentración Mínima Inhibitoria 
CoA Coenzima A 
ConA Concavalina A 
CV Coeficiente de variación 
Da Dalton 
DI50 Dosis Inhibitoria 50 
DMSO Dimetilsulfóxido 
ECA Enzima convertidora de angiotensina 
EMEM Eagle’s Minimum Essential Medium 
FA Fracción absorbida 
FADH2 Flavín Adenin dinucleótido 
FDA Food and Drug Administration 
g Gramos 
GI Gastrointestinal 
GL Grados de libertad 
h Horas 
HBSS Solución Amortiguadora de Hank 
HEPES Ácido 4-(2-Hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico 
HPLC/CLAR Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución 
IP Intraperitoneal 
IAM Membrana artificial inmovilizada 
IL-6 Interleucina 6 
ISO Interntational Organization for Standardization 
IVIVC Correlaciones in vivo-in vitro 
kg Kilogramo 
LC Límite de cuantificación 
LDH Lactato deshidrogenasa 
 
xv 
 
L Litro 
MeCN Acetonitrilo 
MeOH Metanol 
M Molar 
m Metro 
mAU/mUA Miliunidades de absorbancia 
µg Microgramo 
min Minuto 
µL Microlitro 
mg Miligramo 
mL Mililitro 
mm Milímetro 
µmol Micromol 
µM Micromolar 
N Normal 
MPR2 Proteína asociada a la multiresistencia a fármacos 
NADH Nicotinamida adenina dinucleotido 
nm Nanómetro 
Ω Ohm 
OATP Polipéptido transportador de aniones orgánicos 
OCT Transportador de cationes orgánicos 
PAMPA Permeabilidad en una membrana artificial paralela 
Papp Permeabilidad aparente 
PepT Transportador peptídico 
P-gp Glicoproteína P 
QC Control de calidad 
rpm Revoluciones por minuto 
S Desviación estándar 
s Segundo 
SLC Solute carrier 
SFB Suero Fetal Bovino 
TEER Resistencia Transepitelial 
TFA Ácido Trifluoroacético 
TFN-α Factor de necrosis tumoral α 
TLR4 Receptor tipo toll 4 
TPA 12-O-tetradecanoil forbol-13-acetato) 
U Unidades 
UV Ultravioleta 
VO Vía oral 
 ̅ Promedio 
 
 
Introducción 
 
1 
1. INTRODUCCIÓN 
En los países desarrollados existe un marcado interés por los organismos 
regulatorios para incluir formulaciones de medicina tradicional en sus programas 
de salud. La seguridad, la eficacia y la calidad de estos insumos dependen de 
factores como la formulación y su proceso de manufactura. De manera general, 
los factores de la formulación que afectan la biodisponibilidad de los fármacos se 
clasifican en dos categorías: factores que afectan la disolución o liberación de los 
fármacos a partir de su forma farmacéutica y; factores relacionados con los 
excipientes que afectan la estabilidad del fármaco, su absorción y/o sus procesos 
metabólicos. Sí bien, para los medicamentos alopáticos se encuentran bien 
establecidos los factores en la formulación que afectan la biodisponibilidad, para 
los productos vegetales esta información no se conoce aún. Por lo tanto, para 
establecer cómo las diferentes formulaciones afectan la biodisponibilidad de los 
fármacos de origen natural se necesita conocer la relación que guardan sus 
propiedades fisicoquímicas y farmacológicas con sus propiedades 
farmacocinéticas y el desempeño in vitro del producto farmacéutico. 
En este marco de referencia, el sistema de clasificación biofarmacéutica (BCS) es 
una base científica que permite clasificar a los fármacos dependiendo de su 
solubilidad acuosa y su permeabilidad intestinal (FDA, 2000). Para clasificar a los 
fármacos de acuerdo con su permeabilidad, la FDA, aprueba el empleo de 
estudios farmacocinéticos de balance de masa, de biodisponibilidad absoluta y 
métodos de permeabilidad intestinal (perfusión intestinal, in vivo, en humanos; 
perfusión intestinal, en animales, in vivo o in situ; en tejidos intestinales aislados 
de humano o animales y en monocapas celulares epiteliales in vitro). Debido a que 
los estudios de biodisponibilidad absoluta o de perfusión intestinal en humanos 
son costosos y difíciles de realizar, la guía emitida por la FDA proporciona, 
además, una alternativa para extrapolar la velocidad de absorción del fármaco 
utilizando correlaciones in vivo-in vitro (IVIVC) (Thiel-Demby, 2008). 
Entre las numerosas técnicas descritas para evaluar la permeabilidad intestinal, la 
línea celular Caco-2, representa el modelo de barrera intestinal más empleado y 
mejor caracterizado para predecir la absorción de fármacos (Kratz, 2011). Las 
células Caco-2 derivan del carcinoma del colon humano y durante su cultivo, van 
adquiriendo y/o expresando algunas características de las células intestinales 
como son las microvellosidades; los transportadores de proteínas, las proteínas de 
eflujo, los sistemas enzimáticos de conjugación correspondientes a la fase II del 
metabolismo y los sistemas de transformación metabólico de fármacos. A 
diferencia de las células normales, la línea Caco-2 no expresa la isoenzima del 
citocromo P450 denominada CYP3A4; la cual seexpresa en una alta 
concentración en el intestino. Sin embargo, durante el cultivo puede inducirse su 
 
Introducción 
 
2 
expresión adicionando vitamina D3 al medio de cultivo. La línea celular Caco-2 
también, posee similitud morfológica y bioquímica con las células intestinales 
(Sevin, et al., 2013; Thomas, et al., 2008). En otras palabras, la permeabilidad de 
los fármacos a través de la monocapa de células Caco-2 se correlaciona con la 
absorción de la membrana intestinal in vivo haciendo posible los estudios de 
relación estructura-absorción (Hubatsch, et al., 2007; Ma, et al., 2009). 
Para demostrar la adecuabilidad de un método enfocado a determinar la BCS de 
fármacos se requiere establecer una relación orden-categoría entre los valores de 
permeabilidad y el grado de absorción del fármaco en humanos. Para establecer 
esta relación, la FDA recomienda utilizar veinte fármacos modelo para métodos in 
vitro con células epiteliales. De acuerdo con la variabilidad del estudio se deberá 
justificar el número de sujetos y de monocapas celulares empleadas que 
proporcione un cálculo confiable de la permeabilidad del fármaco. Una vez 
demostrada la aptitud del método se puede emplear para clasificar fármacos 
utilizando como patrones internos un fármaco modelo de alta y baja 
permeabilidad. 
En el marco de los productos naturales se ha descrito el mecanismo de difusión 
pasiva de la partenólida utilizando como modelo de permeabilidad las células 
Caco-2 (Khan et al., 2003). También, se ha investigado la permeabilidad de las 
antraquinonas emodina y crisofanol (Zeng-hui et al., 2007) y de las diantronas 
mayoritarias presentes en las especies Cassia angustifolia y Cassia senna 
(Waltenberger et al., 2008); el transporte de los alcaloides derivados de las 
semillas de la nuez vómica y de la especie Stemona tuberosa; la absorción de las 
alcamidas contenidas en los preparados de algunas especies de Equinacea; de 
las antocianinas aisladas de Ribes nigrum y del ginkgólido B (Ma, et al., 2009; Hua 
et al., 2008; Steinert et al., 2008). Asimismo, se ha caracterizado el transporte del 
astragalósido IV, de la quercetina y la crisina y sus metabolitos conjugados (Walle 
et al., 1998 y 1999; Gu et al., 2004). 
Con base en estas consideraciones, el presente trabajo fue diseñado para 
determinar la permeabilidad aparente de la acacetina y la pinocembrina 
(compuestos aislados del propóleo) mediante un modelo in vitro utilizando la línea 
celular Caco-2, y empleando el atenolol y el propranolol como marcadores de alta 
y baja permeabilidad, respectivamente, para determinar la adecuabilidad del 
modelo. Para ello, se definieron las condiciones experimentales de cultivo de la 
línea celular Caco-2 para la formación de la monocapa, asimismo los parámetros 
experimentales del estudio de transporte en las direcciones apical-basolateral y 
basolateral-apical y, finalmente, las concentraciones a las que se evaluó la 
permeabilidad de los compuestos. 
 
Objetivos 
 
3 
2. OBJETIVOS 
El objetivo primordial del presente trabajo de investigación consistió en 
determinar la permeabilidad aparente de la pinocembrina y la acacetina, dos 
flavonoides aislados del propóleo proveniente de la región del altiplano mexicano, 
utilizando como modelo una monocapa formada con la línea celular Caco-2. 
Para el cumplimiento del objetivo principal se formularon los siguientes objetivos 
específicos: 
 Desarrollar y validar un método bioanalítico apropiado para cuantificar a los 
marcadores de alta y baja permeabilidad en la matriz biológica, mediante la 
evaluación de la linealidad, la precisión; la selectividad, la exactitud, el recobro y 
la estabilidad de la muestra como parámetros de desempeño. 
 
 Desarrollar y validar un método bioanalítico apropiado para cuantificar a los 
flavonoides en la matriz biológica. Para establecer las condiciones de 
separación óptimas entre los flavonoides se empleó un diseño de experimentos. 
Los parámetros de desempeño del método que se evaluaron fueron: linealidad, 
precisión, selectividad, exactitud, recobro y estabilidad de la muestra. 
 
 Generar un banco celular maestro y uno de trabajo para la línea celular Caco-2 
para asegurar el suministro uniforme y adecuado de las células. 
 
 Demostrar la adecuabilidad de un modelo in vitro con la línea celular Caco-2 
enfocado a determinar la permeabilidad aparente de la pinocembrina y la 
acacetina, estableciendo una relación orden-categoría entre los valores de 
permeabilidad obtenidos experimentalmente con dos fármacos modelo (atenolol 
y propanolol) y sus correspondientes valores reportados en la literatura. 
 
 Evaluar la citotoxicidad de la acacetina y la pinocembrina sobre la línea celular 
Caco-2 en un intervalo que considere las concentraciones de exposición de los 
compuestos durante el estudio de permeabilidad. 
 
 Evaluar el transporte apical-basolateral y basolateral-apical para ambos 
flavonoides empleando tres diferentes concentraciones. 
 
 Determinar el coeficiente de permeabilidad aparente de la pinocembrina y la 
acacetina. 
 
 
Antecedentes 
 
4 
3. ANTECEDENTES 
 3.1 Propóleo 
El propóleo en su estado natural es una sustancia resinosa de color amarillo 
verdoso o pardo rojizo (según su origen) y es generado por las abejas a partir del 
material vegetal que colectan de diferentes plantas (Figura 3.1) (Bankova, 2005; 
Salatino, 2011). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3.1 Recolección del material vegetal para la formación del propóleo 
 
El propóleo es la mezcla de sustancias más importante que tienen las abejas en 
contra de los microorganismos patógenos, protege a la colmena de enfermedades 
microbianas y es usado para fortalecer las paredes dentro del panal y sellar los 
agujeros (Gómez-Caravaca et al., 2006; Sforcin y Bankova, 2011). 
Por otra parte, el propóleo ha sido usado por el hombre en la medicina tradicional 
desde la época antigua, donde se describe su uso como agente antiséptico y 
cicatrizante, entre otros. Actualmente, en la literatura científica se ha documentado 
que el propóleo posee algunos efectos farmacológicos que han sido confirmados 
mediante estudios in vitro y/o in vivo, donde se ha demostrado su actividad 
antimicrobiana, antiviral, antiséptica, antiinflamatoria, antioxidante, 
inmunomoduladora y antitumoral (Kumazawa, 2004; Sforcin y Bankova, 2011). 
Hoy en día, el propóleo se comercializa para consumo humano en preparados y 
jarabes para tratar la tos, el reumatismo y los esguinces; también se utiliza en 
productos de higiene como la pasta dental y el enjuague bucal; ambos son de 
utilidad para el tratamiento contra la gingivitis y la estomatitis. Finalmente, en 
dermatología, se emplea para elaborar productos farmacéuticos y cosméticos como 
cremas faciales, ungüentos y lociones debido a sus propiedades para regenerar 
tejidos, tratar quemaduras y enfermedades de la piel (Salatino, 2011). 
De manera general, el propóleo se compone aproximadamente de un 50% de 
resinas, 30% de ceras, 10% de aceites esenciales, 5% de polen y 5% de otras 
 
Antecedentes 
 
5 
sustancias orgánicas. De ellos, la resina es la de mayor interés ya que es la fuente 
natural de los compuestos activos, entre los que destacan los compuestos fenólicos 
(flavonoides, ácidos fenólicos y sus ésteres). Estos compuestos se consideran las 
moléculas farmacológicamente más importantes del propóleo debido a que son 
capaces de inhibir enzimas específicas, estimular algunas hormonas y 
neurotransmisores y capturar radicales libres (Gómez-Caravaca et al., 2006; 
Hrbonorá et al., 2009). 
Sin embargo, la composición del propóleo varía de acuerdo con la vegetación local 
donde las abejas realizan la recolección, así como también de su especie, de la 
época del año y de las características geográficas y climáticas de estos sitios 
(Gómez, et al., 2006; Salatino, 2011). 
A pesar de las numerosas investigaciones realizadas sobre propóleos colectados 
en diferentes países conclimas templados y tropicales existe un número limitado 
de publicaciones sobre la composición química y la actividad biológica de 
propóleos provenientes México. En este marco de referencia en el año 2007 
Hernández y colaboradores estudiaron tres propóleos del estado de Sonora, 
México. En esta investigación, los autores identificaron y cuantificaron a la 
pinocembrina, la crisina y el 3-acetato de la pinobanksina como los metabolitos 
secundarios mayoritarios presentes en los propóleos estudiados. En el año 2010, 
Lotti y colaboradores describieron la presencia de isoflavonoides, flavanonas y 
pterocarpanos en una muestra de propóleo rojo recolectada en el estado de 
Yucatán. Recientemente, en el año 2014 Rivero y Martínez realizaron un estudio 
con propóleos provenientes de diferentes apiarios de la región del altiplano 
mexicano, en donde la acacetina, la 4’,7-dimetilnaringenina y la 4’,7-
dimetilapigenina fueron identificadas en varias muestras y, en algunas, también 
fueron cuantificados. En estudios posteriores realizados por el mismo grupo de 
investigación con propóleos pertenecientes a esta región también se identificó a la 
pinocembrina como uno de los compuestos mayoritarios del propóleo (Granados, 
2014). 
 
 3.2 Flavonoides 
 3.2.1 Generalidades 
 Las plantas sintetizan una gran cantidad de metabolitos secundarios, de 
los cuales una parte considerable pertenecen a las categorías de compuestos 
fenólicos y flavonoides. Estos fitoquímicos presentan gran diversidad estructural y 
algunos de ellos están distribuidos en un número limitado de especies dentro del 
reino plantae, permitiendo así, su empleo como compuestos marcadores en 
 
Antecedentes 
 
6 
estudios quimiotaxonómicos. Los flavonoides, al parecer, llevan a cabo funciones 
suplementarias en el ciclo de vida de las plantas, tienen un papel importante en su 
protección y están involucrados en estrategias de defensa, también sirven como 
atrayentes de polinizadores y como agentes alelopáticos, además de proteger a la 
planta contra la luz UV y de las interacciones con el medio ambiente (Fraga, 2009). 
Algunos metabolitos secundarios, además de ser para las plantas un arma para la 
supervivencia y la adaptación, son de gran significancia para la humanidad, ya que 
han sido utilizados como colorantes, fibras, pegamentos, aceites, ceras, 
saborizantes, fármacos, antibióticos, insecticidas y herbicidas. En los últimos años 
el estudio de los flavonoides ha sido de gran importancia, ya que se ha encontrado 
que su consumo regular está asociado con la prevención de enfermedades 
crónicas incluyendo el cáncer, enfermedades cardiovasculares y desórdenes 
neurodegenerativos (Kozłowska y Szostak-Wegierek, 2014). 
Se encuentran distribuidos en una gran diversidad de plantas especialmente en las 
angiospermas, sin embargo se ha descrito su presencia en algunos hongos y 
algas. Los flavonoides se localizan principalmente en los tejidos superficiales de las 
partes aéreas de las plantas (hojas, frutos y flores), en forma de agliconas y de 
glicósidos (Kozłowska, 2014; Törrönen, 1997). 
 
 3.2.2 Clasificación de los flavonoides 
 El término flavonoide se usa generalmente para describir a una amplia 
agrupación de productos naturales que incluyen en su estructura un esqueleto de 
carbono de tipo C6-C3-C6; dicha estructura consiste en dos anillos aromáticos 
conectados por un puente de 3 carbonos conocido como fenilbenzopirano. 
Dependiendo de la posición en la que se une el anillo aromático al benzopirano se 
dividen en tres clases: los flavonoides (2-fenilbenzopiranos), los isoflavonoides (3-
fenilbenzopiranos) y los neoflavonoides (4-fenilbenzopiranos) (Figura 3.2). Estos 
compuestos se relacionan estructural y biogenéticamente debido a que comparten 
como precursor a la chalcona (Grotewold, 2006). 
Por otra parte, los 2-fenilbenzopiranos o flavonoides se subdividen en grupos 
dependiendo del grado de oxidación y de saturación presente en el anillo 
heterocíclico (Figura 3.3). 
 
Antecedentes 
 
7 
 
Figrua 3.2 Fenilbenzopiranos (esqueleto C6-C3-C6): Flavonoides (1), Isoflavonoides (2) y 
Neoflavonoides (3) 
 
 
Figura 3.3 Principales subgrupos de los flavonoides. 
 3.2.3 Biogénesis de los flavonoides 
 Los flavonoides se producen por una biogénesis mixta en donde 
participan las rutas del ácido siquímico y de los policétidos. La primera inicia con la 
condensación del fosfoenolpiruvato y la eritrosa-4-fosfato, ambos provenientes de 
vías metabólicas primarias, cuyo producto resultante, a través de una serie de 
reacciones enzimáticas, forma el ácido siquímico: intermediario central de la ruta. 
Enseguida, una molécula de fosfoenolpiruvato se incorpora al ácido siquímico y 
después de un par de reacciones se forma el ácido corísmico; metabolito necesario 
para la formación de los aminoácidos tirosina y fenilalanina. Luego, éstos sufren 
una desaminación y otras reacciones para formar 4-hidroxicinamoil CoA (Figura 
3.4); éste último se une con 3 moléculas de malonil CoA (ruta de los policétidos). 
 
Antecedentes 
 
8 
Una vez incorporadas las moléculas de malonil CoA, ocurre una condensación para 
formar el anillo aromático B. Finalmente, ocurre una ciclación formando el 
heterociclo y de esta manera es como ocurre la biogénesis de los flavonoides 
(Figura 3.5) (Dewick, 2009). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3.4. Formación del 4-coumaroil CoA a partir de los aminoácidos L-Fenilalanina y L-
Tirosina. E1: Fenilalanina amonia liasa (PAL), E2: Tirosina amonia liasa (TAL), E3: Cinamato 4-
hidroxilasa y E4: CoA ligasa (Dewick, 2009). 
Figura 3.5 Formación de los flavonoides. CHS: chalcona sintasa, SS: estilbeno sintasa, CHR: 
chalcona reductasa, CHI: chalcona isomerasa, IFS: isoflavona sintasa, FNS: flavona sintasa, 
F3H: flavanona 3-hidroxilasa, FLS: flavonol sintasa. 
 
Antecedentes 
 
9 
 3.2.4 Actividad biológica de los flavonoides 
 La primera evidencia de la actividad biológica de los flavonoides fue 
presentada por el fisiólogo Albert Szent-Gyorgyii, galardonado en 1937 con el 
Premio Nobel de Medicina, quien reportó la eficacia de los flavonoides de la 
cáscara de los cítricos en la prevención de la hemorragia capilar y la fragilidad 
asociada con el escorbuto. Desde entonces, una gran cantidad de efectos 
biológicos han sido atribuidos a los flavonoides (Romano et al., 2013). 
Se ha especulado que las células responden a los fitoquímicos a través de 
interacciones directas con receptores o enzimas involucradas en señales de 
transducción. El efecto protector de los flavonoides en los sistemas biológicos se 
ha atribuido a su capacidad para transferir radicales libres, activar enzimas 
antioxidantes, reducir los radicales alfa-tocoferol e inhibir a las enzimas oxidasas, 
por tan solo mencionar los más importantes (Grotewold, 2006). 
En general, se ha encontrado que los flavonoides son inhibidores enzimáticos. De 
acuerdo con los estudios realizados in vitro, los flavonoides inhiben de manera no 
específica a la catecol-O-metiltransferasa, incrementando la cantidad de 
catecolaminas disponibles y ocasionando una disminución de la fragilidad vascular. 
También, inhiben a la fosfodiesterasa, explicando, entre otras, su efecto sobre la 
inhibición de la agregación plaquetaria (Bruneton, 1999). 
Desde el punto de vista farmacológico la literatura científica describe las 
propiedades antiinflamatorias, antilipidémicas, antihiperglicémicas, antivirales, 
hepatoprotectoras, antiulcéricas, cardioprotectoras, neuroprotectoras, antioxidantes 
y anticancerosas, aunque se ha encontrado que esta última depende de factores, 
tales como la estructura química y la concentración de los flavonoides, así como 
del tipo de cáncer y la sensibilidad de las células cancerosas (Romano et al., 2013; 
Sak, 2014). 
A pesar de los numerosos efectos farmacológicos descritos en el párrafo anterior, 
es necesario determinar la relación entre la concentración de los flavonoidescon su 
actividad biológica para poder establecer su potencial como agentes terapéuticos; 
también es necesario evaluar la calidad de las plantas medicinales que los 
contienen para poder predecir su seguridad y eficacia (Ghasemzadeh, 2011). 
 
 3.3 Pinocembrina 
 La pinocembrina (5,7-hidroxiflavanona) es uno de los flavonoides con 
importantes efectos farmacológicos que incluyen: su actividad antiinflamatoria, 
 
Antecedentes 
 
10 
antioxidante, antimicrobiana, vasorrelajante, antimutagénica, antiagregante 
plaquetaria y antiangiogénica (Yan et al., 2014). 
Por otra parte, la pinocembrina es un compuesto bioactivo que está presente en 
algunos preparados herbolarios y suplementos alimenticios, particularmente 
aquellos elaborados con propóleo (Sayre et al., 2013; Rasul et al., 2013). 
 3.3.1 Fuentes naturales de pinocembrina 
 
Figura 3.6 Estructura y fuentes naturales de la pinocembrina (Rasul et al., 2013) 
La familia Piperaceae comprende 1950 especies agrupadas en 14 géneros. Esta 
familia se caracteriza por contener pinocembrina como metabolito secundario. 
Entre los géneros con mayor concentración de esta flavanona destacan Peperomia 
y Piper con 600 y 700 especies, respectivamente. También, se ha aislado de 
especies pertenecientes a las familias Lauraceae y Asteraceae, por ejemplo de las 
partes aéreas de la planta Flourensia oolepis (SF Blake) (Rasul et al., 2013). 
Finalmente, se ha descrito su presencia en la familia Verbenaceae, en las especies 
Lippia graveolens y Lippia origanoides, así como en Oxytropis falcate y Dalea 
elegans de la familia Fabaceae. También se ha identificado en las especies Alpinia 
mutica, Litchi chinensis, Glycirrhiza glabra L., Sparattosperma leucanthum, Cleome 
droserifolia, Lychnophora markgravii, Helichrysum gymnocoum, Sysygium 
samarangense, Centaurea eryginoides, Cistus incanus, Turnera diffusa y 
Eriodictyon californicum (Figura 3.6) (Rasul et al., 2013). 
 
Antecedentes 
 
11 
La pinocembrina, presente en frutas, vegetales, nueces, semillas, hierbas, 
especias, té y vino tinto, se consume a través de la dieta. Adicionalmente, es 
considerada como el principal flavonoide encontrado en la miel y en los propóleos 
de diferentes regiones (Rasul et al., 2013; Yan et al., 2014). 
Además de las fuentes naturales de pinocembrina, en los últimos años, se 
desarrolló un método biotecnológico para su producción empleando un plásmido 
pET de E. coli en el que se han incorporado genes de algunas plantas para 
codificar las siguientes enzimas: la fenilalanina amonia liasa (PAL) de la levadura 
Rhodotorula rubra, la 4-cumarato CoA ligasa (4CL) del actinomiceto S. coelicolor, la 
chalcona sintasa (CHS) de Glycirrhiza echinata y la chalcona isomerasa (CHI) de la 
especie Pueraria lobata (Rasul et al., 2013). 
 
 3.3.2 Actividad biológica de la pinocembrina 
3.3.2.1 Actividad antimicrobiana 
 La pinocembrina es una flavanona bien reconocida por sus potentes 
propiedades antimicrobianas. En el 2011, Ruddock y colaboradores evaluaron el 
potencial antibacteriano de la pinocembrina en 26 cepas de Neisseria gonorrhoeae, 
agrupadas en 13 fenotipos. Los resultados obtenidos permitieron evidenciar que a 
una concentración de 32 g/mL, la flavona inhibió el 100% del crecimiento de la 
mayoría de las cepas y, a 64 g/mL inhibió el crecimiento de todas las cepas 
evaluadas (Ruddock, 2011). 
También, se ha evaluado la actividad antimicrobiana de la pinocembrina en cepas 
de S. aureus resistentes a la meticilina. La CMI (Concentración Mínima Inhibitoria) 
calculada fue de 128 g/mL (Alcaráz et al., 2000). Finalmente, Park y 
colaboradores demostraron la actividad cariostática de una extracto de propóleo, 
cuyo componente mayoritario fue la pinocembrina, mediante la inhibición de la 
actividad de la enzima glucosiltransferasa de Streptococcus mutans. 
Por otra parte, los ensayos para evaluar la actividad antifúngica de la pinocembrina 
revelaron que la flavanona inhibe el crecimiento de Penicillium italicum y Candida 
albicans con una CI50 (Concentración inhibitoria 50) de 100 g/mL. Además, se 
observó que también inhibe el crecimiento micelial de P. italicum, ocasionando un 
daño a la membrana celular del patógeno (Rasul et al., 2013). 
Por último, se sugiere que la actividad antimicrobiana de la pinocembrina puede 
deberse a su capacidad para ocasionar cambios en la composición de la 
 
Antecedentes 
 
12 
membrana bacteriana, induciendo la lisis celular, además de inhibir de manera 
considerable la actividad enzimática (Rasul et al., 2013). 
3.3.2.2 Actividad antiinflamatoria 
 La actividad antiinflamatoria de la pinocembrina ha sido demostrada por 
varios investigadores utilizando diversos modelos in vivo e in vitro. 
Así, en un estudio de edema inducido, por la administración de sangre bovina en la 
extremidad de ratones, se estableció que la pinocembrina (administrada vía IP) a 
una dosis de 15 mg/kg redujo en un 48% el proceso inflamatorio. En otro modelo 
de edema inducido por la fosfolipasa A2, empleando una dosis de 80 mg/kg de 
pinocembrina administrada también por vía intraperitoneal, se observó una 
inhibición del 63% y una DI50 (Dosis inhibitoria 50) de 58.9 mg/kg. Asimismo, en 
modelos in vivo, empleando edemas inducidos con TPA (12-O-tetradecanoil forbol 
13-acetato) en la oreja de la misma especie de animales se observó que, después 
de la administración de pinocembrina en el sitio afectado por vía tópica, en 
intervalos de dosificación de 15 a 500 g/oreja, se redujo el edema inducido de 
manera significativa. La DI50 calculada (61 g/oreja) fue menor a la de la 
indometacina empleada como control positivo (DI50 125 g/oreja) y el efecto 
observado fue dosis-dependiente. 
Por último, en otro modelo in vivo donde se indujo un proceso inflamatorio en la 
oreja del ratón mediante la aplicación continua de TPA se evaluó el efecto sobre 
algunas respuestas inmunológicas. El ensayo permitió evidenciar que la 
administración de pinocembrina, a una dosis de 0.5 mg vía tópica reduce la 
infiltración de neutrófilos. Además, se observó en un modelo in vitro que el 
flavonoide, a una concentración de 100 M, suprime la producción de leucotrienos 
B4, ya que no estimula el metabolismo del ácido araquidónico. De acuerdo con los 
resultados obtenidos los autores concluyen que la pinocembrina es capaz de 
regular la respuesta alérgica a nivel celular (Sala et al., 2003). 
3.3.2.3 Actividad anticancerosa 
 A pesar de que varios estudios revelan la capacidad de la pinocembrina 
para inhibir, retrasar, bloquear o revertir el inicio de la carcinogénesis, la prevención 
de esta enfermedad requiere del empleo de otros factores (Rasul et al., 2013). 
En este sentido, la pinocembrina ha mostrado actividad citotóxica contra la línea 
celular HCT116 (carcinoma colorrectal) incrementando la actividad de las caspasas 
3 y 9. Las CI50 calculadas para esta línea celular oscilan entre los 26.33 y los 
143.09 g/mL. La pinocembrina también es activa sobre la línea HT-29 (cáncer de 
colon), reportando valores de CI50 entre 0.41 y 3.49 g/mL, y la HL-60 (leucemia) 
 
Antecedentes 
 
13 
con CI50 menores a 0.10 g/mL. En esta última línea celular se encontró que la 
flavanona también aumenta la actividad de las caspasas 3, 8 y 9 (Rasul et al., 
2013). 
Los estudios realizados hasta la fecha permiten concluir que la pinocembrina 
induce la apoptosis en varios tipos de células cancerosas sin embargo, los 
mecanismos de acción aún no han sido elucidados. 
Finalmente, se ha encontrado que la pinocembrina presenta un efecto protector 
sobre la hapatocarcinogénesis inducida (Rasul et al., 2013). 
3.3.2.4 Actividad neuroprotectora 
 De acuerdo con la literatura científica la pinocembrina tiene un papel 
importante en la prevención y el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, 
como el Alzheimer, el Parkinson y otras disfunciones neuronales. Actualmente, es 
considerada como un agente terapéutico novedoso para reducir el daño causadopor la isquemia cerebral (Yan et al., 2014). 
En un estudio reciente conducente a evaluar el efecto de la pinocembrina en un 
cuadro de isquemia cerebral global/reperfusión y oclusión en ratas se demostró que 
la flavanona mejoró la actividad respiratoria cerebral a través de un aumento en las 
velocidades del índice de la respiración y de la fosforilación oxidativa por 
NADH/FADH2 en la cadena respiratoria. Asimismo, la pinocembrina aumentó el 
contenido de ATP en la mitocondria cerebral de acuerdo con un modelo in vitro con 
células SH-5Y5Y. Estos efectos pueden ser atribuidos a una disminución en la 
liberación de LDH, de especies reactivas de oxígeno, y de la óxido nítrico sintasa 
(Liu et al., 2008; Guang et al., 2006; Rasul et al., 2013). 
En otro estudio realizado por Meng y colaboradores (2011) se evaluó el efecto 
protector del flavonoide sobre el deterioro de la barrera sanguínea cerebral; una de 
las principales consecuencias de la isquemia cerebral. Esta prueba se fundamenta 
en la cuantificación del colorante Azul de Evans y la fluoresceína sódica en el tejido 
cerebral. El ensayo permitió evidenciar que la pinocembrina reduce la 
concentración de ambas sustancias en dicho tejido, debido a una disminución en la 
permeabilidad de la barrera sanguínea cerebral. También, se encontró que reduce 
los daños ultraestructurales producidos en los microvasos cerebrales y en las 
neuronas. Asimismo, durante este estudio, se evidenció que la pinocembrina 
aumenta el flujo sanguíneo cerebral mejorando, en cierta medida, el daño de la 
barrera sanguínea cerebral inducido por el modelo experimental. Por último, se 
realizó un ensayo para medir el puntaje neurológico en ratas, el cual muestra el 
grado de los déficits neurológicos generados; los hallazgos demostraron que la 
 
Antecedentes 
 
14 
pinocembrina disminuye los puntajes neurológicos ocasionando con ello una 
mejora en el proceso cognitivo. 
3.3.2.5 Actividad antiangiogénica 
 En un trabajo realizado por Ahn y colaboradores (2009) se demostró la 
actividad antiangiogénica de la pinocembrina en un modelo in vitro. Para ello, se 
indujo la formación de tubos capilares en un gel de colágena tipo I y se observó 
que este flavonoide, a una concentración de 50 g/mL, tiene efectos inhibitorios en 
la formación de los túbulos de células endoteliales. Sin embargo, esta actividad no 
mostró correlación con su capacidad antioxidante. 
3.3.2.6 Actividad vasorrelajante 
 Calderone y colaboradores (2004) evaluaron la actividad vasorrelajante 
de la pinocembrina en aorta aislada de rata. Los resultados observados indicaron 
una respuesta vasodilatadora máxima de 88 ± 12 por ciento sobre las 
contracciones inducidas con KCl 20 mM y un nivel de potencia (pCI50) de 4.80 ± 
0.09. Además, se demostró que el mecanismo del efecto vasorrelajante de la 
flavanona no está involucrado con el canal KATP; estos experimentos se realizaron 
empleando un bloqueador no selectivo como el cloruro de tetraetilamonio (TEA) 10 
mM y un bloqueador selectivo como la glibenclamida 1 M. 
3.3.2.7 Actividad como antiagregante plaquetario 
 La pinocembrina, a una concentración de 100 g/mL, presentó un efecto 
inhibitorio en la agregación plaquetaria de sangre total humana en dos modelos in 
vitro: el primero induciendo la agregación plaquetaria con ácido araquidónico 0.5 
mM y el segundo con ADP (adenosin difosfato) 10 M. Los porcentajes de 
inhibición encontrados fueron de 100.0% y 78.6 ± 0.7%, respectivamente (Jantan et 
al., 2008). 
3.3.2.8 Actividad antimutagénica 
 La actividad antimutagénica de la pinocembrina se evaluó empleando una 
cepa de Euglena gracilis Z con una mutagénesis inducida por ofloxacino. Los 
resultados generados indican que la pinocembrina, a una concentración de 20 µM, 
posee una actividad antimutagénica significativa. El efecto se midió calculando la 
potencia antimutagénica de la flavanona con respecto a la mutagenicidad inducida 
por el ofloxacino en concentraciones de 43 y 86 M; los porcentajes de inhibición 
calculados fueron de 56.43 ± 14 y 32.53 ± 22 por ciento, respectivamente (Križková 
et al., 1998). 
 
 
Antecedentes 
 
15 
Eupatorium sp 
Linaria sp 
Leucas sp 
Agastache 
mexicana 
Agastache 
rugosa Calamintha sp 
Chrysantemum 
morifolium 
Chrysantemum 
sinense 
Robinia 
pseudoacacia Turnera 
diffusa 
Centaurea 
macrocephalea 
Perganum 
harmala 
 3.4 Acacetina 
 La acacetina (4’-metoxi-5,7-dihidroxiflavona) es un flavonoide de tipo 
flavona que ha sido aislado e identificado en varias especies vegetales (Figura 
3.7), también ha sido objeto de diversos estudios científicos en los que se ha 
demostrado que posee algunos efectos farmacológicos, destacando su actividad 
anticancerosa. 
3.4.1 Fuentes naturales de acacetina 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3.7 Estructura y fuentes naturales de la acacetina 
Dentro de la familia Lamiaceae, la acacetina ha sido identificada en algunas 
especies del género Leucas, en A. mexicana y A. rugosa del género Agastache. 
También, ha sido aislada de Clerodendrum inerme y de la parte aérea de 
Ziziphora clinopodioides, además, es considerada como uno de los marcadores 
del género Calamintha (Figura 3.7) (Carballo-Villalobos et al., 2014; González-
Trujano et al., 2012; Monforte et al., 2012; Zielińska y Matkowski, 2014). 
En la familia Asteraceae, se ha descrito su presencia en especies del género 
Eupatorium; en las flores de dos especies del género Chrysanthemum: C. 
morifolium Ramat y C. sinense y en Centaurea macrocephala. Además, ha sido 
aislada de dos especies del género Artemisia: A. vestitia y A. agra, especies 
 
Antecedentes 
 
16 
utilizadas contra el agente causal de la malaria (Kraft et al., 2003; Lin et al., 2010; 
Wollenweber, 1991; Yin et al., 2008; Zhang et al., 2008). 
Por último, se ha identificado en Robinia pseudoacacia, Turnera diffusa, Peganum 
harmala, Scoparia dulcis y en algunas especies de los géneros Alnus y Linaria, 
también ha sido aislada de Anoda crisata (Juárez-Reyes et al., 2015; Mishra et al., 
2011; Sharaf, 1996; Smirnova et al., 1975). La acacetina es uno de los flavonoides 
que se encuentran con mayor frecuencia y en altas concentraciones en los 
propóleos (Bankova, 2000). 
Estudios recientes han logrado producir acacetina por un proceso de semisíntesis 
partiendo del flavonoide diosmina (Quintin y Lewin, 2004). En el 2011 
Pandurangan reportó un método para su síntesis por transformación de Baker-
Venkataram. 
 
3.4.2 Actividad biológica de la acacetina 
3.4.2.1 Actividad anticancerosa 
Diversos grupos de investigación han evaluado el efecto antiproliferativo de 
la acacetina sobre algunas líneas celulares cancerosas. En las células HepG2 
(cáncer hepático humano) presentó un efecto máximo inhibitorio del 72%, a una 
concentración de 20 g/mL, durante un tiempo de exposición de 48 h. La CI50 
calculada fue de 10.44 g/mL. De acuerdo con el análisis celular por citometría de 
flujo, el tratamiento durante 48 h empleando concentraciones de 10 y 20 µg/mL, 
propició un incremento en la fase celular G1 del 31.1% al 61.6% y del 31.1% al 
76.5%, respectivamente. También, se observó bajo las mismas condiciones de 
ensayo un incremento de 4 y 8 veces más el número de células apoptóticas; 
debido probablemente al aumento en la producción de la proteína proapoptótica 
Bax. 
En las células A549 (carcinoma humano pulmonar), la acacetina, mostró un efecto 
antiproliferativo dosis-dependiente con una CI50 de 9.46 M. De nueva cuenta, el 
análisis del ciclo celular a las concentraciones de 5 y 10 M, ocasionó un 
incremento del 34.7% al 42.6% y al 61.2% de células en la fase G1, 
respectivamente. A la concentración 5 M las células apoptóticas aumentaron 3.2 
veces su cantidad mientras que, a una concentración 10 M aumentaron 8.1 
veces después de 48 h de tratamiento. Además, se encontró que la acacetina 
tiene un efecto antimetastásico en esta línea celular inducido con TPA 
(Jaganathan y Mandal, 2009). 
 
Antecedentes17 
Por otra parte, en el 2009 Szliszka y colaboradores evaluaron el efecto citotóxico 
de la acacetina en la línea celular HeLa (cáncer cervical humano). Los autores 
emplearon una concentración de 50 M y un tiempo de exposición de 48 h. El 
porcentaje de citotoxicidad obtenido fue menor al 15%. Sin embargo, se observó 
que esta flavona es capaz de inducir, una vez más, la apoptosis por diferentes 
rutas como: la activación de la cascada de las caspasas, la generación de 
especies reactivas de oxígeno y la señalización de muerte celular mediada por la 
mitocondria. 
En la línea celular AG5 (carcinoma gástrico humano) se demostró que la acacetina 
inhibe la proliferación celular e induce la apoptosis de una manera dependiente de 
la concentración y del tiempo de exposición; en el estudio también se encontró 
que la acacetina indujo la apoptosis de las células a través de la activación de la 
caspasa 3 y la regulación de las proteínas Bax y p53 (Pan et al., 2005). 
En el 2012, Watanabe y su grupo investigaron el efecto de la acacetina en células 
Jurkat, provenientes de los linfocitos T de un paciente con leucemia. Los autores 
encontraron un efecto inhibitorio de la proliferación celular mediante la inducción 
de la apoptosis a través de las caspasas 3, 8 y 9 de manera dependiente de la 
concentración. 
Por último, se ha demostrado que la acacetina puede inhibir la invasión y la 
migración de las células DU-145 (cáncer de próstata humano antimetastásico) 
(Shen et al., 2010). 
3.4.2.2 Actividad neuroprotectora 
En el 2010 Lin y colaboradores (2010) realizaron un estudio para determinar 
el efecto de la acacetina sobre un modelo de neurotoxicidad in vivo; el daño 
neurológico en ratas fue inducido mediante la administración de ácido kaínico. Los 
resultados obtenidos indicaron que a una dosis de 50 mg/kg, la acacetina, inhibió 
la liberación del glutamato en los sinapotosomas del hipocampo previniendo la 
excitotoxicidad, un proceso por el cual las neuronas son dañadas y destruidas por 
la sobreactivación de receptores de glutamato; el exceso de glutamato ocasiona 
daño neuronal y está asociado con enfermedades neurológicas. 
Para demostrar que la acacetina protege las neuronas dopaminérgicas se empleó 
un modelo en el que se administró a las ratas una dosis de 10 mg/kg (VO) previa 
administración del agente neuroinflamatorio 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-
tetrahidropiridina. Además de disminuir la degradación de las neuronas 
dopaminérgicas, se observó que la acacetina inhibe la producción de algunos 
factores proinflamatorios de manera dosis-dependiente. Debido a su acción 
antiinflamatoria, la acacetina podría servir como un agente para disminuir la 
 
Antecedentes 
 
18 
neurotoxicidad generada en la enfermedad de Parkinson, ya que uno de sus 
mecanismos patológicos es la neuroinflamación (Kim et al., 2012). 
3.4.2.3 Actividad antiinflamatoria y antinociceptiva 
Se demostró que la acacetina tiene un efecto antinociceptivo y 
antiinflamatorio a través de un modelo en el que se empleó formalina para inducir 
el edema. El pretratamiento con la flavona inhibió parcialmente la formación del 
edema en una forma dosis-dependiente. Los resultados obtenidos permitieron 
concluir que los receptores 5HT1A, GABA/BZDs y los opioides están involucrados 
en el mecanismo de acción (Carballo-Villalobos et al., 2014) 
3.4.2.4 Actividad antiinflamatoria e inmunomoduladora 
La hipersensibilidad de tipo retardada o tipo 4 es una reacción inmune 
mediada por células T, las cuales juegan un papel esencial en la patogénesis y 
cronicidad de varios desórdenes inflamatorios debido a la producción de citosinas 
proinflamatorias. Para determinar el efecto inmunosupresor de la acacetina sobre 
la proliferación y activación de linfocitos T se empleó como inductor de la 
proliferación el mitógeno ConA (concavalina A) en un modelo in vitro. Los 
resultados indicaron que la flavona inhibe la proliferación de linfocitos T con una 
IC50 mayor a 10 M (Yin et al., 2008). 
En concordancia con estos resultados la acacetina podría contribuir al tratamiento 
de enfermedades relacionadas con reacciones de hipersensibilidad tipo 4 o tardía, 
tales como la esclerosis múltiple, el reumatismo y la artritis, entre otras. 
3.4.2.5 Actividad hepatoprotectora y cardioprotectora 
En un trabajo realizado por Cho y colaboradores (2014) se demostró que la 
acacetina fue el flavonoide más activo, como agente hepatoprotector, de la 
especie Agastache rugosa. Para demostrar este efecto se utilizó un modelo in vivo 
en donde se indujo una lesión hepática aguda, clínicamente similar a una falla 
hepática fulminante, mediante la administración de lipopolisacáridos con D-
galactosamina sintetizada (GAIN/LPS). La administración de estas sustancias 
ocasiona la sobreexpresión de TLR4, estimulando la respuesta inflamatoria y 
provocando de esta manera la lesión hepática. Los resultados obtenidos revelaron 
que el pretratamiento con acacetina, a las dosis de 25, 50 y 100 mg/kg, disminuyó 
la mortalidad de los animales de manera dosis-dependiente; es decir a la dosis 
más alta la tasa de supervivencia fue del 80%. Como marcador del daño 
hepatocelular se cuantificaron los niveles de la enzima alanina aminotransferasa; 
los resultados obtenidos indicaron que al inducir el daño hepático la enzima 
aumentó de 49.6 ± 9.9 U/L a 618.4 ± 43.7 U/L su concentración. Sin embargo, el 
 
Antecedentes 
 
19 
aumento no fue tan grande en los grupos pretratados con acacetina, en donde, a 
una dosis de 100 mg/kg los niveles de la enzima fueron de 361.3 ± 48.1 U/L. 
Finalmente, el efecto protector de la acacetina se confirmó mediante análisis 
histológicos observándose una disminución de la inflamación y de la necrosis 
hepática. También, la acacetina disminuyó los niveles de TFN-α, molécula 
asociada al proceso inflamatorio, y aumentó los niveles de IL-6; una citocina que 
puede actuar como proinflamatoria o antiinflamatoria para mantener la 
homeostasis y es esencial para la regeneración hepática. 
Por otro lado, el estudio realizado por Monforte y colaboradores en el 2012 
evidenció que la acacetina protege a los cardiomiocitos neonatales inducidos a 
estrés por hipoxia/reoxigenación, debido a la reducción de la peroxidación de 
lípidos y a su actividad antioxidante. A las dosis de 5, 10 y 25 g/mL, la acacetina 
disminuyó significativamente el contenido de malondialdehído en la lesión inducida 
por el modelo. 
Por último, en el mismo estudio descrito en la sección 3.3.2.6 se determinó el 
efecto vasorrelajante de la acacetina obteniéndose una potencia (pIC50) de 4.99 ± 
0.08 y una respuesta máxima vasodilatadora de 81 ± 10 por ciento (Calderone et 
al., 2004). 
3.4.2.6 Actividad antiplasmódica y antiviral 
El potencial antipalúdico de la acacetina se evaluó utilizando dos cepas de 
Plasmodium flaciparum, agente etiológico de la malaria, en un modelo in vitro. La 
CI50 calculada fue de 5.5 g/mL para la cepa sensible a la cloroquina y de 12.6 
µg/mL en la cepa resistente al mismo fármaco (Kraft et al., 2003). 
La actividad antiviral de la flavona se evaluó contra el virus del herpes simple tipo 
1 (VSH-1). El tratamiento realizado en un modelo in vitro permitió determinar que 
la acacetina inhibe la replicación del virus de manera dosis-dependiente; el 
mecanismo de acción es selectivo debido a que inhibe la síntesis de proteínas en 
las células infectadas por el virus, pero no en las células normales (Hayashi et al., 
1993). 
3.4.2.7 Actividad hipoglicémica e hipouricémica 
El potencial antidiabético de la acacetina se evaluó mediante un modelo in 
vivo con ratones normoglucémicos y diabéticos. El modelo de diabetes mellitus 
tipo II empleado involucra la administración (IP) de 30 mg/kg de estreptozotocina y 
50 mg/kg de nicotinamida. La flavona ocasionó una disminución en los niveles de 
glucosa sanguínea en ambas condiciones, siendo más significativa, en los ratones 
hiperglicémicos a las dosis de 3, 10 y 31.6 mg/kg; esta actividad sepuede deber a 
 
Antecedentes 
 
20 
la capacidad que tiene la acacetina de inhibir las enzimas α-glicosidasas (Juárez-
Reyes et al., 2015). 
Por otra parte, en un modelo animal inducido con hiperuricemia se observó que la 
acacetina administrada por vía oral, a las dosis de 10 mg/kg y 50 mg/kg, redujo el 
nivel de ácido úrico en un 49.9% y 63.9%, respectivamente. Las mismas dosis 
fueron administradas por vía intraperitoneal obteniendo una reducción sérica del 
63% y 95% en los niveles de ácido úrico. Por último, se demostró que la acacetina 
inhibe a la enzima xantina oxidasa con una CI50 de 2.22 M; mecanismo al cual 
puede deberse su actividad hipouricémica (Nguyen et al., 2005). 
 
3.5 Absorción de fármacos 
A pesar de las innovaciones en los métodos de liberación de fármacos, la 
vía oral, sigue siendo la ruta más utilizada para administrar los fármacos debido a 
su bajo costo de producción y la gran aceptación que tiene por los pacientes. Se 
estima que cerca del 80% de los medicamentos son administrados por esta vía 
(Balimane et al., 2000). 
Uno de los pre-requisitos para que un fármaco, administrado de forma oral, 
presente un efecto sistémico es su absorción en el tracto gastrointestinal (Blaser, 
2007). Este proceso implica generalmente, el paso del fármaco desde el tracto 
gastrointestinal, a través de una barrera fisiológica, hacia la circulación sanguínea. 
Para que este fenómeno ocurra el fármaco debe liberarse de la forma 
farmacéutica y disolverse en los fluidos fisiológicos (Herrera et al., 2012). Así, la 
absorción de un compuesto depende principalmente de dos parámetros: la 
solubilidad y la permeabilidad gastrointestinal; factores críticos que determinan la 
biodisponibilidad in vivo (Russel, 2010). 
Por otra parte, los fármacos que son administrados vía oral deben presentar 
propiedades compatibles con esta vía. Factores importantes que se deben tomar 
en cuenta son: la acidez del estómago y las enzimas que pueden metabolizar a los 
fármacos en la membrana intestinal para facilitar su eliminación. Ambas 
situaciones son consideradas como el primer obstáculo en el proceso de 
absorción (Blaser, 2007; Avdeef, 2003) debido a la degradación del fármaco. El 
tiempo de tránsito, el pH y el nivel de expresión de transportadores y enzimas son 
variables en el tracto gastrointestinal que, junto con las propiedades del fármaco, 
determinan la solubilidad, la penetrabilidad y la afinidad a los transportadores y 
enzimas (Hellinger y Vastag, 2011). 
 
Antecedentes 
 
21 
En la Tabla 3.1 se resumen algunas de las características del tracto 
gastrointestinal que son relevantes en el proceso de absorción. Como se deduce 
de la información presentada, el pH varía desde 1 hasta 7.5 influyendo en la 
solubilidad de moléculas ionizables. Asimismo, el área superficial disponible para 
la absorción es mayor en el yeyuno y el íleon con más del 98% del área total 
(Avdeef, 2003). 
Tabla 3.1 Parámetros biológicos y fisicoquímicos del tracto gastrointestinal humano (Balimane et 
al., 2000) 
Segmento 
gastrointestinal 
Área superficial 
(m2) 
Longitud 
(cm) 
Tiempo de 
residencia 
pH 
Cavidad oral 0.01 m2 Segundos a 
minutos 
6.5 
Esófago 0.02 m2 23-25 Segundos 
Estómago 3.5 m2 25 1.5 h 1-2 
Duodeno 1.9 m2 35 0.5-0.75 h 4.0-5.5 
Yeyuno 184 m2 280 1.5-2 h 5.5-7.0 
Íleon 276 m2 420 5-7 h 7.0-7.5 
Colon y recto 1.3 m2 150 1-60 h 7.0-7.5 
 
La pared del intestino delgado consta de 4 capas: serosa, muscular, submucosa y 
mucosa. Esta última se encuentra en contacto con el lumen intestinal y su 
estructura constituye una enorme amplificación de la superficie debido a los 
pliegues circulares, también conocidos como válvulas de Kerckring, que rodean el 
interior de la luz intestinal e incrementan 3 veces el área superficial del intestino 
delgado. La superficie de estos pliegues circulares está recubierta por 
vellosidades, pequeñas prolongaciones de la mucosa de 1 mm, que están 
cubiertas por una capa de epitelio y son responsables de aumentar 30 veces el 
área superficial. Finalmente, los bordes libres de las células epiteliales contienen 
numerosas microvellosidades que forman un borde de cepillo, las cuales 
incrementan el área superficial 600 veces. En consecuencia, la absorción de un 
fármaco administrado por vía oral ocurre principalmente en el intestino delgado 
(Avdeef, 2003; Balimane et al., 2000; Segarra, 2006). 
Asimismo, la mucosa es la capa en donde se lleva a cabo la absorción y, a su vez, 
está constituida por tres capas: la mucosa muscularis, la lámina propia y las 
células epiteliales. La mucosa muscularis es una lámina de músculo uniforme y se 
encuentra en la unión entre la mucosa y la submucosa. La lámina propia es un 
tejido conectivo dentro de las vellosidades y provee soporte estructural a la capa 
de células epiteliales; esta estructura, a través de sus capilares, aporta 
nutrimentos a los enterocitos y permite el transporte de las sustancias absorbidas 
hacia la circulación sistémica. La capa de células epiteliales es considerada la 
 
Antecedentes 
 
22 
barrera más significativa para la absorción, ya que constituye una monocapa 
formada a partir de células que proliferan y migran a lo largo del eje cripta-villus, 
unidad funcional del epitelio intestinal (Herrera et al., 2012; Segarra, 2006). 
Además de las células madre, la monocapa está formada por cuatro tipos de 
células diferenciadas: las células de Paneth, las células epiteliales columnares o 
enterocitos, las células de goblet y las células enteroendócrinas. Las células de 
Paneth se encuentran en la parte más profunda de las criptas del intestino delgado 
y, principalmente, se encargan de sintetizar y secretar proteínas. Por su parte, las 
células de goblet, también llamadas calciformes, secretan mucina, mientras que 
las enteroendócrinas se localizan en la profundidad de las glándulas intestinales y 
secretan serotonina. Finalmente, los enterocitos constituyen el grupo celular más 
abundante de la monocapa (con un porcentaje del 80 al 90%) y su principal 
función es llevar a cabo el proceso de absorción; éstos se encuentran polarizados 
por las diferencias entre su membrana apical y basolateral (Figura 3.8). La 
membrana apical es la que presenta las microvellosidades, cuya superficie está 
recubierta por el glicocálix (glicoproteínas sobresalientes del fluido luminal con 
carga negativa) el cual es recubierto por una capa de mucina. La capa de mucina 
se compone de un oligosacárido de alto peso molecular que es rico en residuos de 
ácido salicílico (Figura 3.8). El glicocálix y la capa de mucina conforman una capa 
acuosa entre 30 y 100 µm y se ha encontrado que puede retrasar la difusión de 
fármacos lipofílicos (Avdeef, 2003; Balimane et al., 2000; McCracken y Lorenz, 
2001; Segarra, 2006). 
 
Figura 3.8 Características de las células epiteliales (Avdeef, 2003) 
Capa acuosa (mucina) 
Glicocálix 
mucosa 
Membrana 
basal 
Microvello 
 
Uniones estrechas 
 
Intersticio 
 
Antecedentes 
 
23 
3.5.1 Transporte de fármacos a través de membranas 
Una de las características más importantes que tienen los fármacos para 
transportarse y distribuirse en el cuerpo humano es la capacidad de atravesar las 
membranas biológicas. El transporte a través de las membranas celulares se lleva 
a cabo principalmente por tres mecanismos: difusión transcelular, difusión 
paracelular y transporte mediado por un acarreador; aunque también se ha 
descrito la endocitosis como uno de ellos (Blaser, 2007). 
Las propiedades más importantes de un fármaco que influyen en su difusión a 
través de las membranas biológicas son la lipofilicidad, la estructura química, la 
naturaleza ácida o básica, la capacidad para formar puentes de hidrógeno, la 
carga y el tamaño o peso molecular. En general, se ha observado que los 
compuestos lipofílicos se absorben por difusión pasiva, mientras que los 
hidrofílicos se absorben a través de un acarreador y algunos compuestos 
pequeños pueden ser transportadosa través de las uniones paracelulares 
(Blaser,2007). 
3.5.1.1 Transporte pasivo transcelular 
La difusión pasiva transcelular, a través de la membrana, es considerada 
como el principal mecanismo de absorción intestinal in vivo para fármacos. Las 
células epiteliales poseen una membrana apical distinta a la membrana 
basolateral (están polarizadas) debido a que están compuestas por diferentes 
lípidos y proteínas. Por consiguiente, presentan diferentes características para su 
permeabilidad. De manera general, se ha observado que la membrana apical 
contiene menos esfingolípidos que la basolateral (Blaser, 2007). 
La naturaleza lipídica de la membrana celular restringe el transporte de iones y 
moléculas hidrofílicas pero permite que los fármacos lipofílicos sean capaces de 
atravesar las bicapas lipídicas de las membranas celulares. El transporte pasivo 
transcelular inicia cuando el soluto penetra en la membrana apical y se difunde a 
través del citoplasma. Si el soluto es muy lipofílico el transporte a través de la 
célula involucra una difusión lateral en la bicapa lipídica. Finalmente, la molécula 
sale de la célula a través de la membrana basolateral. La difusión de moléculas 
pequeñas a través del citoplasma es un proceso rápido, por lo que, en este 
mecanismo de transporte, la velocidad está determinada por la difusión a través 
de la membrana apical. Aunque la difusión transcelular esta descrita para 
moléculas lipofílicas de tamaño moderado, numerosos estudios indican que la 
mayoría de los fármacos con alta permeabilidad se transportan atravesando las 
membranas de manera pasiva (Blaser, 2007). 
 
Antecedentes 
 
24 
Por otra parte y de acuerdo con la teoría del reparto en función pH, se sabe que 
solo las moléculas sin carga o no ionizadas podrán penetrar a través de la 
membrana; si una molécula se encuentra ionizada su transporte se altera, sin 
embargo, no se detiene por completo. Asimismo, entre mayor sea el tamaño 
molecular, la difusión disminuye, y entre mayor número de hidrógenos presente la 
molécula, la penetración a través de la membrana decrece (Hellinger y Vastag, 
2012; Stenberg et al., 2002). 
Este tipo de transporte se lleva a cabo por difusión pasiva, por lo que la dirección 
de transferencia de masa depende del gradiente de concentración en ambos lados 
de la membrana. Además, presenta una cinética no saturable y no requiere de 
energía metabólica. El transporte pasivo está determinado por la primera Ley de 
Fick: 
 
 
 
Donde dm/Adt es el flujo por unidad de área, Pm es la constante de permeabilidad, 
y Ce y Ci son las concentraciones respectivas en los compartimentos exterior e 
interior (Herrera, et al., 2012; Cao et al., 2008). 
3.5.1.2 Transporte pasivo paracelular 
Los enterocitos se agrupan entre sí por medio de cargas negativas 
formando uniones estrechas; el paso de los compuestos a través del espacio 
intercelular que existe entre los enterocitos se conoce como transporte 
paracelular. Las dimensiones del espacio paracelular generalmente miden entre 
10 y 50 Å. Se ha calculado que el área superficial para el transporte intestinal 
paracelular es aproximadamente del 0.01% del área total de la membrana del 
intestino delgado, siendo una restricción para que ocurra este tipo de transporte 
(Blaser, 2007; Lennernäs, 2007). 
La difusión transcelular de compuestos hidrofílicos está restringida o depende del 
pka de cada molécula y del pH fisiológico. Su absorción, entonces, puede llevarse 
a cabo de la misma manera que la filtración del agua a través de los espacios 
paracelulares, si se trata de moléculas pequeñas (<200 Da) (Blaser, 2007). De la 
misma manera que el transporte transcelular, el paracelular se lleva a cabo por 
una difusión pasiva. 
De acuerdo con estudios realizados in vitro la vía paracelular es una importante 
vía para la absorción intestinal de varios fármacos hidrofílicos con un tamaño 
reducido (<200 Da). Sin embargo, estudios in vivo revelaron que este tipo de 
 
Antecedentes 
 
25 
transporte representa una contribución minoritaria para la absorción intestinal de 
fármacos (Blaser, 2007; Lennernäs, 2007). 
3.5.1.3 Transporte mediado por acarreadores 
Los enterocitos presentan proteínas que están embebidas en sus 
membranas celulares apicales y basolaterales, siendo las primeras las que 
presentan un mayor número de transportadores debido a las microvellosidades 
que aumentan el área superficial. La función fisiológica de algunas de estas 
proteínas es extraer del lumen intestinal nutrimentos, vitaminas y otros 
compuestos esenciales para la vida, o bien, evitar la entrada de sustratos tóxicos a 
la circulación sistémica y facilitar su excreción (Blaser, 2007). 
Dentro de las características más notables del transporte mediado por 
acarreadores se encuentran: la especificidad hacia el sustrato, la saturabilidad y la 
variabilidad en la expresión de los transportadores entre diferentes regiones del 
tracto gastrointestinal. Los fármacos que se transportan por este mecanismo 
deben presentar gran afinidad hacia las proteínas transportadoras intestinales. Por 
lo tanto, está limitado a los fármacos cuya estructura es similar a los sustratos 
naturales como los antibióticos β-lactámicos, los inhibidores de la ECA (enzima 
convertidora de angiotensina) y los análogos de fosfato. Por otra parte, la 
saturabilidad se presenta cuando existen grandes concentraciones de sustrato 
(Blaser, 2007; Lennernäs, 2007; Stenberg et al., 2002). 
Dependiendo de la dirección y el número de solutos el transporte regulado por 
acarreadores se puede clasificar en: uniporte, simporte y antiporte. El uniporte es 
cuando se transporta un soluto; en el simporte se facilita el transporte de dos 
solutos en la misma dirección y, en el antiporte se facilita el transporte de dos 
solutos con direcciones opuestas (Cao et al., 2008). 
De acuerdo con el gradiente de concentración de los solutos y con la energía 
involucrada en el proceso, el transporte mediado por acarreadores también se 
puede clasificar en difusión facilitada y en transporte activo. La difusión facilitada 
es un proceso que no requiere energía y la dirección del transporte depende del 
gradiente de concentración de los solutos (similar a la difusión pasiva). Por otra 
parte, en el transporte activo las moléculas son transportadas en contra de un 
gradiente de concentración eléctrico o químico; presenta una cinética saturable y 
requiere energía. El transporte activo involucra la formación de un complejo 
formado por la unión reversible del sustrato y la proteína acarreadora, este 
complejo se une a un sitio específico y ocasiona un cambio conformacional que 
permite traslocar a la molécula hacia el otro lado de la membrana; además el 
 
Antecedentes 
 
26 
transporte del fármaco puede ser inhibido competitivamente por otros sustratos 
(Cao et al., 2008; Tavelin et al., 2002). 
3.5.1.3.1 Transportadores o acarreadores 
De manera general, las proteínas transportadoras que tienen un papel 
importante en la absorción de fármacos se clasifican en dos grupos importantes: 
los acarreadores de soluto (SLC) y ABC (ATP-binding cassette). A pesar de que 
estos transportadores se expresan principalmente en el intestino, el hígado y el 
riñón, también se distribuyen ampliamente en todo el cuerpo (Russel, 2010). 
Por otra parte, dependiendo de la dirección en la que las proteínas acarreadoras 
traslocan al sustrato a través de la membrana celular, se pueden dividir en 
transportadores de influjo o de eflujo. Los acarreadores ABC son, por definición, 
transportadores de eflujo debido a que usan energía derivada de la hidrólisis de 
ATP para mediar la exportación de fármacos del medio intracelular al extracelular, 
limitando su proceso de absorción. En cambio, los acarreadores SLC facilitan a 
captura de sustratos o el influjo, ya sea por difusión facilitada a través de un 
gradiente electroquímico por medio de un proceso uniporte, o bien, por un 
transporte activo