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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE CIENCIAS Conductancia aniónica permeable a bicarbonato en células del conductor colector de la médula interna renal T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: F Í S I C O P R E S E N T A : CÉSAR OLIVER LARA FIGUEROA DIRECTOR DE TESIS: DR. JUAN JOSÉ BOLíVAR GONZÁLEZ 2012 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Resumen En este trabajo se exploró la presencia de una conductancia aniónica a bicarbonato, en células en cultivo primario del conducto colector de la medula interna renal de ratas, estableciendo así, nuestra hipótesis. Nuestro objetivo fue, evaluar y confirmar la existencia de esta conductancia, usando la técnica de “whole-cell clamp”, mediante parche perforado. Las células se estudiaron en una solución de baño con diferentes composiciones aniónicas. Se observó que mediante una despolarización por encima de los 0 mV, se activó una corriente aniónica dependiente del tiempo (Iovt), sensible a bloqueo por DIDS, y que exhibe una conductividad similar a Cl - y a HCO3 - . Índice Introducción . . . . . . . . . 1 Capítulo 1: Antecedentes de Biología celular . . . . . 3 1.1 Membrana celular . . . . . . . 4 1.2 Proteínas de membrana . . . . . . 6 1.3 Flujo de sustancias a través de la membrana . . . 7 Capítulo 2: Antecedentes de Bioelectricidad . . . . . 16 2.1 Ley Ohm . . . . . . . . 19 2.2 Capacitor . . . . . . . . 20 2.3 Circuitos de resistencia. . . . . . . 22 2.4 Circuito RC: Como modelo de las propiedades eléctricas de la membrana . . . . . . . 23 Capítulo 3: Antecedentes al Desarrollo experimental . . . . 25 3.1 Registro celular . . . . . . . 26 3.2 Fijación de voltaje . . . . . . . 28 3.3 Registro de célula completa . . . . . 29 Materiales y métodos 3.4 Micromanipulación . . . . . . 30 3.5 Cultivo celular . . . . . . . 33 3.6 Soluciones . . . . . . . . 34 3.7 Protocolos experimentales . . . . . . 35 Capítulo 4: Resultados, análisis, comentarios finales . . . . 37 4.1 Resultados y análisis . . . . . . 37 4.2 Comentarios finales . . . . . . 46 Bibliografía . . . . . . . . . 48 1 Introducción En 1989 Stanton, usando la técnica de microelectrodos (registro intracelular), reportó que en las células del conducto colector de la médula interna renal de rata, el potencial de membrana basolateral disminuye (se hace menos negativo) al reducir la concentracion de bicarbonato de la solución en contacto con esta membrana. Esto se interpretó como la existencia de una conductancia a bicarbonato en esta membrana basolateral. En 1990, Imai, usando la misma técnica, pero estudiando células del conducto colector de la médula interna de conejo, obtuvo un resultado similar. Estos estudios, realizados hace más de dos décadas, dieron evidencia de la presencia de una conductancia a bicarbonato en la membrana basolateral de las células del conducto colector de la médula interna de mamífero, sin embargo, hasta el presente, esta conductancia no ha sido estudiada [17][20]. En búsqueda de presentar el mejor escenario que nos permitiera entender la relevancia de la existencia de los canales proteicos para aniones, se ha estructurado este trabajo de la siguiente manera: El capítulo 1 se conforma de la presente introducción. En el capítulo 2, se presentan los antecedentes biológicos celulares, que se consideraron necesarios para entender el comportamiento de la membrana de las células, proteínas de membrana y el flujo a través de estas. En el capítulo 3, se establecen los antecedentes biofísicos básicos para entender los intercambios iónicos que se producen en el exterior, así, como en el interior de las células. En el capítulo 4, se presentan los antecedentes al desarrollo experimental empleados en esta investigación; materiales, métodos y los protocolos establecidos para la estimulación celular. 2 En el capítulo 5, se muestran los resultados obtenidos al aplicar los protocolos experimentales descritos en el capítulo 4, a su vez, se realizan los análisis y se presentan las conclusiones de este estudio más una serie comentarios finales que nos sugieren la realización de otra serie de experimentos para una verificación más evidente. La presente investigación es el resultado de un minucioso trabajo en el cual participaron muchas personas a quienes les tengo un infinito agradecimiento. Por tal razón, quisiera agradecer en primer lugar a mi asesor de tesis, el Doctor Juan José Bolívar González, por su gran apoyo y enseñanzas sin las cuales habría sido imposible el término de este proyecto, y a la M. en C. Gabina Arenas, por la dedicación e interés mostrado hacia este proyecto, en segundo lugar quisiera agradecer a mis sinodales la Dra. Gertrudis Hortensia González Gómez, Dra. Carolina Barriga Montoya, Dr. Jorge Humberto Arce Rincón y M. en I. José Alejandro Jiménez Hernández por todas sus atinadas recomendaciones en la revisión y mejora de este trabajo. De igual manera, agradezco a la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional Autónoma de México, de la cual me siento enormemente orgulloso de pertenecer, a todos mis profesores por sus enseñanzas y conocimientos trasmitidos. Finalmente, quisiera agradecer al Consejo Nacional para la Ciencia y Tecnología (SEP- CONACyT, Grant CB-2007/83356), así como, a la Dirección General Asuntos del Personal Académico (DGAPA,UNAM, Grant IN206609) por su apoyo durante la realización de este trabajo y por permitirme llevar a cabo una de mis grandes aspiraciones, la investigación. 3 Capitulo 1 Antecedentes de Biología celular. Desde el punto de vista de su conductividad eléctrica, las sustancias se dividen en dos clases. La primera se compone de los metales y de otras sustancias por las cuales puede fluir o ser conducida carga. De acuerdo con esto, a estas sustancias se les denomina conductores. Las sustancias de la segunda clase se denominan aislantes y la carga no puede fluir en ellos. La línea divisoria entre estos no está bien definida. Hay sustancias llamadas semiconductores que actúan como aislantes en ciertas condiciones, pero su facultad de conducir carga eléctrica varía notablemente con diversos factores. Cuando se establece una diferencia de potencial entre dos puntos de un conductor, fluye una carga entre estos puntos (corriente eléctrica), aunque los transportadores de carga en los metales son electrones, en los conductores electrolíticos o gaseosos (plasmas), pueden también ser iones positivos, negativos o de ambos tipos [16]. En el átomo, originalmente neutro, cada electrón está fuertemente retenido por la carga positiva del núcleo. Si un átomo o molécula no es eléctricamente neutro es llamada ion. Cuando un átomo pierde uno de sus electrones se dice que se ioniza. En este proceso, el átomo se convierte en un ion positivo o catión, si el átomo gana algún electrón, el átomo se convierte en un ion negativoo anión [10]. Numerosas substancias químicas, al disolverse en el agua, se disocian en átomos o grupos de átomos, cada uno de los cuales lleva una carga neta positiva o negativa. Así, la sal común disuelta en agua, se disocia en iones de Na + e iones Cl - , el sulfato cúprico en iones Cu ++ e iones SO4 -- , el ácido sulfúrico en 2 iones H + e iones SO4 -- , etc. Debido a que en las soluciones, cada carga positiva es compensada por una carga negativa, todas las soluciones son eléctricamente neutras. Las soluciones, en presencia de una diferencia de potencial eléctrico, exponen una corriente consistente en números iguales de cationes y aniones moviéndose en sentidos opuestos (corrientes iónicas). 4 Los compuestos formados por elementos que pueden disociarse electrónicamente en iones se llaman electrolitos, dentro del organismo hay trayectorias de baja resistencia entre la mayoría de los puntos, debido a las soluciones electrolíticas que ocupan la mayor parte del cuerpo, la conducción que tiene lugar a lo largo de estas trayectorias es iónica [10]. 1.1 Membrana Celular. Existe en la superficie de las células una membrana denominada plasmática o celular, que separa el medio intracelular del medio extracelular, y es la principal responsable del control del ingreso y salida de sustancias en la célula. La membrana plasmática que rodea a la célula, define su extensión y mantiene las diferencias esenciales entre el contenido de la célula y su entorno. Aunque realicen diferentes funciones, todas las membranas biológicas tienen una estructura básica común: una finísima capa de moléculas lipídicas y proteicas (aproximadamente 7Ȧ), que se mantienen unidas fundamentalmente por interacciones no covalentes. Las membranas celulares son estructuras dinámicas, fluidas y la mayoría de sus moléculas son capaces de desplazarse en el plano de la membrana (Figura 1) [1]. Existen unas 5 x 10 6 moléculas lipídicas en una sección de bicapa lipídica de 1µm 2 o aproximadamente 10 9 moléculas lipídicas en la membrana plasmática de una célula de animal. Todas estas moléculas son anfipáticas – es decir tienen un extremo hidrofílico (que es atraído por el agua o polar) y un extremo hidrofóbico (que rehúye al agua o no polar) [1] Figura 1: Membrana celular tomada de http://curtisbiologia.com http://curtisbiologia.com/ 5 Las más abundantes de estas moléculas son los fosfolípidos. Estos tienen una cabeza polar y dos colas hidrofóbicas. Figura 2. Las colas suelen ser ácidos grasos y pueden tener diferente longitud (por lo general contienen de 14 a 24 átomos de carbono). Normalmente una de las colas presenta uno o más dobles enlaces cis (es decir, es insaturada) mientras que la otra normalmente no tiene dobles enlaces (es decir saturadas). Las diferencias de longitud y de grado de saturación entre las colas hidrocarbonadas son muy importantes porque afectan la capacidad de las moléculas de fosfolípidos para empaquetarse una contra otra y, por lo tanto, afectan la fluidez de la membrana. Cuando las moléculas anfipáticas se encuentran rodeadas por un ambiente acuoso tienden a agregarse de tal manera que sus colas hidrofóbicas se esconden en el interior y sus cabezas hidrofílicas quedan expuestas al agua. Pueden formar micelas esféricas con las colas hacia el interior, o pueden formar láminas bimoleculares, o bicapas, con las colas escondidas entre dos capas de cabezas hidrofilicas. Un ejemplo de bicapas sintéticas que son producidas en forma de vesículas esféricas son los llamados liposomas (Figura 3) [1]. Figura 3: Bicapa lipídica tomada de http://bioanafernandez.blogspot.com Figura 2: Fosfolípido tomada de http://www.maph49.galeon.com http://bioanafernandez.blogspot.com/ http://www.maph49.galeon.com/ 6 1.2 Proteínas de Membrana. Aunque la estructura básica de las membranas biológicas está determinada por la bicapa lipídica, la mayoría de sus funciones específicas están desempeñadas por proteínas. Por consiguiente, la cantidad y el tipo de proteínas de una membrana son muy variables. Debido a que las moléculas lipídicas son pequeñas en comparación de las proteicas, hay alrededor de 50 moléculas de lípidos por cada molécula de proteína en una membrana que contenga un 50% de proteína en masa (Ver Figura 4). Existen dos clases mayoritarias de proteínas de transporte de membrana: las proteínas transportadoras y las proteínas de canal. Las proteínas transportadoras (también denominadas transportadores, carriers o permeasas) se unen al soluto específico que va a ser transportado y sufren una serie de cambios conformacionales que permiten la transferencia del soluto a través de la membrana. Por otro lado, las proteínas de canal no se unen al soluto, forman poros hidrofílicos que atraviesan la bicapa lipídica; cuando estos poros están abiertos permiten que determinados solutos (habitualmente iones inorgánicos de tamaño y carga apropiados), puedan pasar a través de la membrana (mediante el uso de cationes orgánicos e inorgánicos de diferentes tamaños se ha podido establecer el volumen aproximado para algunos canales dependientes de voltaje como el canal de Na + (0.3 x 0.5 nm) y el canal de K + (0.3x 0.3 nm) [1][11]. Sin embargo, en ciertas condiciones, la bicapa lipídica puede perforarse formando poros, mismos que pueden actuar como canales lipídicos inespecíficos [14]; pero en condiciones normales las bicapas lipídicas son virtualmente impermeables a los iones [7]. Figura 4: Estructura de la Membrana tomada de http://163.178.103.176/fisiologia http://163.178.103.176/fisiologia 7 1.3 Flujo de sustancias a través de la membrana. La estructura de las membranas las hace bastantes selectivas a las moléculas que las pueden atravesar. El interior hidrófobo de las bicapas lipídicas hace que las membranas sean altamente permeables a la mayoría de las moléculas no polares (solubles en lípidos [1]), pero muy poco permeables a las moléculas polares (solubles en agua [1]).Esto impide que los compuestos hidrosolubles (polares) puedan atravesar fácilmente la membrana. Sin embargo, a veces, tal movimiento es necesario o deseable, así que todas las células han desarrollado mecanismos para transferir estas moléculas a través de las membranas. Las moléculas pueden atravesar las membranas de diversas maneras sin la utilización directa de energía, esto es pasivamente. Para esto, dependen fundamentalmente de un gradiente de concentración o eléctrico a través de la membrana celular, que en algún momento han requerido energía para generarse y mantenerse. La energía almacenada es, a la larga, la responsable de la traslocación de moléculas a través de la membrana. No obstante, es útil y apropiado considerar a estos procesos como pasivos. Esta energía almacenada deriva primariamente, en la mayoría de las células de mamífero, de la actividad de la Na + /K + - ATPasa 1 (transporte activo), la cual mantiene una elevada concentración de K + (~140mM) y una baja concentración de Na + (~10 mM) en el interior celular [3]. Hay tres rutas básicas para los movimientos pasivos transmembrana de solutos (Figura 5). 1. Una molécula de soluto difunde simplemente de un lado a otro de la membrana. Deja la fase acuosa de un lado la membrana, se disuelve directamente en la bicapa lipídica de la membrana, difunde por el espesor de la bicapa de lípido y, finalmente, entra en la fase acuosa del lado opuesto de la membrana. 2. La molécula del soluto se combina con una proteína de membrana que actúa como transportador. Este transportador «media» o «facilita» el movimiento de la molécula de 1 Una de las extensas clase de enzimas que cataliza un proceso que implica la hidrólisis de ATP. El ATP es un nucleósido trifosfato compuesto de adenina,ribosa y tres grupos de fosfato, y es el principal transportador de energía química en las células. La Na + /K + - ATPasa transporta 2 K + hacia adentro y 3 Na + hacia afuera de la célula por cada ATP hidrolisado. 8 soluto a través de la membrana. Esto se denomina transporte mediado (o facilitado) por transportador y puede darse de diversas formas. 3. La molécula de soluto (iones) permanece en la fase acuosa y difunde a través de canales proteicos (canales iónicos) de la membrana [1][11]. Difusión simple. Si una molécula de soluto se pone en contacto con la capa lipídica y su energía térmica es suficientemente elevada, puede entrar y atravesar la fase lipídica y, finalmente, aparecer en la fase acuosa del otro lado de la membrana. Para abandonar la fase acuosa y entrar en la lipídica, un soluto debe romper, en primer lugar, todos sus enlaces de hidrógeno con el agua. Esto requiere aproximadamente 5kcal/mol de energía cinética por enlace de hidrógeno. Además, la molécula de soluto que cruza la fase lipídica de la membrana debe disolverse en la bicapa lipídica. Así, su solubilidad en los lípidos desempeñará también un papel relevante a la hora de determinar si cruzará o no la membrana. En consecuencia, aquellas moléculas que tengan un mínimo de enlaces de hidrógeno con el agua entrarán con más facilidad en la bicapa lipídica, mientras que las moléculas polares tales como los iones inorgánicos casi nunca se disolverán en esta. Figura 5: Mecanismo de transporte de transmembrana tomada de http://lisdiane.blogspot.com http://lisdiane.blogspot.com/ 9 Diversos factores, tales como el peso molecular y la forma de la molécula, influyen en la movilidad de los no-electrólitos en el interior de la membrana, pero el coeficiente de partición 2 (solubilidad lipídica del soluto) medido empíricamente, es el principal determinante de la difusión de un no-electrólito a través de la bicapa lipídica. Los no-electrólitos exhiben un amplio rango de coeficientes de partición. Por ejemplo el valor del uretano es 1,000 veces el del glicerol (ver figura 6). Estas diferencias dependen de las características particulares de la estructura molecular. Como se ilustra en la figura 7, que compara dos moléculas con diferentes solubilidades. El hexanol y el manitol tienen estructuras similares, con la excepción de que el primero contiene sólo un grupo ―OH mientras el segundo contiene seis. Estos grupos facilitan los enlaces de hidrógeno con el agua y, por lo tanto, disminuyen la solubilidad en lípidos. De hecho cada enlace de hidrógeno adicional resulta en una disminución del orden de cuarenta veces en el coeficiente de partición, que se refleja en una disminución en la permeabilidad (Figura 8) [11]. 2 Para medir esta propiedad, se agita una sustancia prueba en un tubo cerrado que contiene iguales cantidades de agua y aceite de oliva, y se determina el coeficiente K a partir de las solubilidades relativas en agua y aceite, en el equilibrio, utilizando la ecuación : ._ _ _ _ ._ _ _ _ Concent soluto en fase lipídica K concent soluto en fase acuosa Figura 6: Permeabilidad de la membrana tomada de Eker (2002) Fisiologia Animal Figura 7: Estructura molecular tomada de Eker (2002) Fisiologia Animal 10 El agua exhibe una permeabilidad a través de las membranas celulares mucho mayor de la que se predice por su coeficiente de partición. Esto se debe a que el agua puede pasar a través de canales proteicos, selectivos a agua (acuaporinas), que penetran en la bicapa lipídica. Si un soluto existe a ambos lados de una membrana por la que puede difundir, mostrará un flujo unidireccional en cada dirección. El flujo, o tasa de difusión, J es la cantidad de soluto a través de un área unidad de membrana cada segundo en una dirección. El flujo en una dirección (digamos del exterior al interior celular) se considera independiente del flujo en la dirección opuesta. Así, si el flujo de entrada (influjo) y el flujo de salida (eflujo) son iguales, el flujo neto es cero. Si el flujo unidireccional es mayor en una dirección que en la otra, hay un flujo neto, que es la diferencia entre los dos flujos unidireccionales [11]. La permeabilidad de la membrana para una sustancia es la tasa a la que la sustancia penetra la membrana pasivamente en unas condiciones determinadas. Si suponemos que la membrana es una barrera homogénea y que, para una substancia no electrolítica, existe un gradiente continuo de concentración entre el lado de concentración elevada y el de concentración baja, entonces : 21 CCAPJ (1.1) En que J es la cantidad de sustancia s que cruza un área unidad de membrana por unidad de tiempo (p. ej., moles por centímetro cuadrado por segundo), C1 y C2 son las respectivas concentraciones (p. ej., mol∙cm -3 ) de la sustancia en los dos lados de la membrana, y P es la constante de permeabilidad de la sustancia, con las dimensiones de velocidad (cm∙s -1 ). Figura 8: Coeficiente de permeabilidad tomada de Eker (2002) Fisiologia Animal 11 Figura 9: Proteínas transportadoras tomada de http://haydee-yuki-haydee.blogspot.com A partir de la ecuación 1-1, se hace evidente que el flujo de un no electrólito debería ser una función lineal del gradiente de concentración (C1 - C2). Esta relación lineal es característica de la difusión simple, y se puede utilizar en experimentos para distinguir entre la difusión pasiva de una sustancia y cualquier otro mecanismo. La constante de permeabilidad incorpora todos los factores inherentes a la membrana y a la sustancia en cuestión. Estos factores determinarán la probabilidad con la que una molécula de una sustancia particular cruzará la membrana. Esta relación puede expresarse formalmente como: mD K P x (1.2) Donde Dm es el coeficiente de difusión de la sustancia en la membrana, K es la solubilidad lipídica del soluto, y x es el espesor de la membrana. Cuanto más viscosa sea la membrana o mayor la molécula, menor será Dm [2]. Difusión Facilitada. Las membranas son permeables a diversas moléculas polares tales como azucares, aminoácidos, nucleótidos y ciertos metabolitos celulares (que atravesarían las bicapas lipídicas muy lentamente sólo por difusión). Debido al transporte facilitado, el movimiento de moléculas a través de las membranas por la acción de proteínas transportadoras de membrana. El transporte facilitado, al contrario del transporte activo, no requiere energía en forma de ATP. Las proteínas transportadoras de membrana, que existen en muchas formas en todos los tipos de membranas, son exquisitamente selectivas para las moléculas que transportan. Las proteínas transportadoras que transfieren un simple soluto de un lado a otro de la membrana se denominan «unitransportadores», mientras que las que transportan un soluto y, simultáneamente o secuencialmente, transfieren un segundo soluto se llaman http://haydee-yuki-haydee.blogspot.com/ 12 “transportadores acoplados”. Los transportadores acoplados que transfieren dos solutos en la misma dirección, se denominan «cotransportadores», mientras que los que transfieren solutos en direcciones opuestas se denominan «antitransportadores» (Figura 9). Canales iónicos.La mayoría de proteínas de canal de la membrana plasmática de las células animales y vegetales conectan al citosol 3 con el medio extracelular, por lo que necesariamente han de tener poros estrechos altamente selectivos. Estas proteínas están relacionadas específicamente con el transporte de iones inorgánicos, por lo que se denominan canales iónicos. Por otro lado, estos canales estan acopladosa una fuente energética, de forma que el transporte que median siempre es pasivo. Así, la función de los canales iónicos es permitir que iones inorgánicos específicos, mayoritariamente Na + , K + , Ca 2+ , o Cl - , puedan difundir a favor de su gradiente electroquímico a través de la bicapa lipídica. Existen dos propiedades importantes que diferencian los canales iónicos de los simples poros acuosos. En primer lugar, presentan selectividad iónica, es decir, permiten que algunos iones puedan pasar y otros no. Esto sugiere que sus poros deben ser suficientemente estrechos en algunos lugares como para permitir que los iones entren en contacto intimo con las paredes del canal, de tal manera que sólo los iones de tamaño y carga adecuados puedan atravesarlos. La segunda diferencia importante entre los canales iónicos y los simples poros acuosos consiste en que los canales iónicos no están abiertos continuamente. En lugar de ello, tienen “compuertas” que se abren brevemente y luego se cierran de nuevo tal como se muestra en la figura 10. En la mayoría de los casos las compuertas se abren en respuestas a estímulos específicos. Los principales tipos de estímulos que se sabe causan la abertura 3 Solución intracelular. Principal compartimiento del citoplasma, si se excluyen los orgánulos rodeados de membrana como el retículo endoplasmático y las mitocondrias. Figura : 10 Canales iónicos tomada de http://www.genomasur.com http://www.genomasur.com/ 13 de los canales iónicos son cambios en el voltaje a través de la membrana, estimulaciones mecánicas, térmicas y la unión de un ligando. El ligando puede ser un mediador extracelular, específicamente un neurotransmisor, o un mediador intracelular, como un ión. Quizá los canales iónicos más comunes son los permeables principalmente al K + , que se encuentran en la membrana plasmática de casi todas las células animales. Un importante subconjunto de estos canales se abre incluso en células no estimuladas (“en reposo”) por lo que habitualmente se les denomina canales de fuga de K + [1][11]. Las concentraciones de K + en el interior celular es típicamente de 10 a 20 veces más alta que en el exterior, mientras que ocurre lo contrario para el Na + . Estas diferencias de concentración se mantienen mediante la bomba de Na + -K + que se halla en la membrana plasmática de prácticamente todas las células animales. Esta bomba actúa como un transportador de intercambio (antiporte), bombeando de forma activa Na + hacia el exterior de la célula, en contra de su gradiente electroquímico, y K + hacia el interior, también en contra de su gradiente electroquímico [1]. Supongamos que inicialmente no existe una diferencia de potencial a través de la membrana plasmática (el potencial de membrana es cero) pero que la concentración de K + es elevada en el interior de la célula y baja en el exterior (esta condición es mantenida por la actividad Na + /K + - ATPasa antes mencionada). El K + tenderá a salir de la célula a través de los canales de fuga de K + ; impulsado por su gradiente de concentración. A medida que el K + vaya fluyendo hacia el exterior de la célula, dejará detrás suyo una carga neta negativa (debido a que todas las soluciones son por definición eléctricamente neutras), creando así un campo eléctrico o potencial de membrana que tenderá a impulsar de nuevo el K + hacia el interior de la célula. El flujo neto de K + cesará, cuando el potencial de membrana alcance un valor tal que la fuerza eléctrica que genera sobre K + equilibre exactamente la fuerza del gradiente de concentración de este ion, es decir , cuando el gradiente electroquímico de K + sea cero. Al potencial de 14 membrana en el que se alcanza esta condición se le define como potencial de equilibrio del K + , el cual puede ser calculado mediante la ecuación de Nernst. i o K K K zF RT E ][ ][ ln (1.3) Donde EK es el potencial de equilibrio para K + en milivoltios , R es la constante de los gases (8.31 voltios × coulombs por grado Kelvin por mol), z es la valencia (en este caso, más uno), F es la constante de Faraday (9.65 ×10 -4 coulombs por mol) y [K]i y [K]o son concentraciones de K + en los compartimientos intra y extracelulares [3][13]. Puesto que la concentración intracelular de potasio es regulada por la bomba Na + /K + - ATPasa, la actividad de los canales de fuga de potasio hace que el potencial de membrana en reposo se mantenga en un valor cercano al potencial de equilibrio de potasio. Puesto que la membrana en reposos también exhibe una cierta permeabilidad al Na + (mucho menor que su permeabilidad a K + ), y puesto que el potencial de equilibrio del Na + (ENa) es positivo, el potencial de membrana en reposo comúnmente se ubica en un valor ligeramente más positivo que EK. Los iones cloruro se distribuyen pasivamente siguiendo el equilibrio de Donnan. El potencial de membrana en reposos se define como una situación de equilibrio en la que el flujo neto de corriente eléctrica a través de la membrana es igual a cero. Si asumimos que la membrana en reposo sólo muestra permeabilidad a Na + , K + y Cl - , el potencial de membrana en reposo puede calcularse mediante la ecuación de Goldman [3][13] oCliNaiK iCloNaoK m ClPNaPKP ClPNaPKP F RT E ][][][ ][][][ ln (1.4) Donde Em = potencial de membrana , Px = permeabilidad al ion x, [x]o= concentración del ion x en el exterior, [x]i= concentración del ión x en el interior. La diferencia de potencial a través de la membrana plasmática de una célula animal en reposo varía entre -20mV y -200mV, dependiendo del organismo y del tipo celular. A pesar de 15 que el gradiente de K + siempre tiene una influencia principal en este potencial, el gradiente de otros iones también tiene un efecto significativo: cuanto más permeable sea la membrana para un ion, mayor será la tendencia del potencial de membrana a alcanzar el valor de el potencial de equilibrio de este ion. En consecuencia, casi cualquier cambio de la permeabilidad de la membrana provocará un cambio en el potencial de la membrana [1][11][15]. Equilibrio de Donnan Si se considera que en el citoplasma los iones K + son en su mayoria eléctricamente balanceados por aniones orgánicos (A - ) para los que la membrana no es permeable, que existen iones Cl - tanto en el citosol como en el medio extracelular, que las concentraciones del K + y Cl - en el medio extracelular se mantienen constantes, y que la concentración intracelular de K + se mantiene constante por la actividad de la bomba Na + /K + -ATPasa; en una célula cuya membrana sólo es permeable a K + y Cl - , las concentraciones intra y extracelular de Cl - se ajustarán de manera que el ECl sea igual a EK 0 0 ][ ][ ln ][ ][ ln Cl Cl F RT K K F RT E i i K (1.5) iK K ][ ][ 0 = 0][ ][ Cl Cl i (1.6) Entonces iioo ClKClK ][][][][ (1.7) El producto de las concentraciones de los iones permeantes de un lado de la membrana, es igual al producto de las concentraciones de estos iones permeantes al otro lado de la membrana, lo que define al equilibrio de Donnan [3][15]. 16 Capitulo 2 Antecedentes de Bioelectricidad Como se mencionó anteriormente, todos los sistemas biológicos y muchos sistemas químicos contienen soluciones acuosas con diversos iones. La estabilidad de las biomacromoléculas y la rapidez de muchas reacciones bioquímicas dependen en gran medida del tipo y concentración de los iones presentes. Recordemos que un electrolito es una sustancia que, cuando se disuelve en un disolvente (por lo común agua), produce una soluciónque conduce electricidad. Un electrolito puede ser un ácido, una base o una sal. La capacidad de conducción de un electrolito nos proporciona un medio simple y directo para estudiar el comportamiento iónico en las soluciones. Se dice que una carga eléctrica qA produce un campo eléctrico (E) en el espacio que la rodea. Este campo ejerce una fuerza sobre cualquier carga (qB) dentro de ese espacio. Según la ley de Coulomb, la energía potencial (V) entre estas dos cargas, separadas una distancia l en el vacío ésta dada por 2 04 A Bq q V l (2.1) Y la fuerza electromotriz, Fe, entre las cargas es 2 04 l qq F BAe (2.2) 17 El campo eléctrico es la fuerza electrostática sobre una carga positiva unitaria. Entonces, el campo eléctrico sobre qB debido a qA es igual a Fe dividido entre qB 2 2 0 04 4 A B A B q q q E l q l (2.3) Para calcular la diferencia de potencial eléctrico entre dos puntos A y B en un campo eléctrico, una carga de prueba q0 se desplaza desde A hasta B, manteniéndola constantemente en equilibrio, y se mide el trabajo WAB que tiene que realizar el agente externo que mueve la carga. 0 AB B A W V V q (2.4) El trabajo WAB puede ser positivo, negativo o cero, podemos deducir que las unidades de diferencia de potencial en el SI son joule/coulomb, el volt (V); es decir 1 V = 1 J/C. Por lo general el punto A se escoge muy alejado de todas las cargas (de modo estricto en el infinito) y el potencial eléctrico VA para esta distancia infinita se toma arbitrariamente igual a cero. De la Ec. 2.4 se obtiene 0 W V q (2.5) Ahora supongamos un campo eléctrico uniforme E, debido a una distribución de cargas. Presumimos que un agente externo mueve, sin producir aceleraciones, a una carga de prueba positiva q0, desde A hasta B a lo largo de una recta que los une. La fuerza eléctrica sobre la carga es q0E. Para mover la carga, se debe contrarrestar esta fuerza mediante la aplicación de una fuerza externa F de la misma magnitud. El trabajo realizado por el agente externo que proporciona esta fuerza es 0ABW F l q E l (2.6) 18 Sustituyendo en la Ec.2.4 se obtiene 0 AB B A W V V E l q (2.7) Esta ecuación establece la relación entre diferencia de potencial y el campo eléctrico en un caso simple, también nos proporciona una unidad para E en el SI, el volt/metro (V/m). Si el campo eléctrico no es uniforme, éste ejercerá una fuerza q0E sobre la carga de prueba, para evitar que ésta se acelere, un agente externo debe aplicar una fuerza que sea exactamente igual a –q0E en todas las posiciones del cuerpo de prueba. Si el agente externo produce un desplazamiento dl en el cuerpo de prueba a lo largo de la trayectoria que va de A hasta B, el elemento de trabajo realizado por el agente externo es F∙dl. Esto conduce a 0 B B AB A A W F dl q E dl Sustituyendo en la Ec.2.4 2 2 0 0 04 4 B B B AB A A B A A A W q q V V E dl q l l (2.8) Los electrones libres en un conductor metálico aislado, tal como un trozo de alambre de cobre, están moviéndose al azar como las moléculas de un gas encerradas en un recipiente. No tienen una dirección efectiva de movimiento a lo largo de un alambre. Si los extremos de este alambre se conectan a una batería, se establecerá un campo eléctrico en cada punto del interior del conductor. Si la diferencia de potencial se mantiene por medio de una batería, el campo eléctrico E actuará sobre los electrones y les impartirá un movimiento resultante en la dirección de –E. Se dice que se ha establecido una corriente eléctrica i; si la carga neta q pasa a través de la sección transversal del conductor en el tiempo t, la corriente, supuesta constante, es i = q / t (2.9) 19 La unidad apropiada de la corriente i en el SI es el ampere (A), la de q es el coulomb, y la de t es el segundo. Si la rapidez de flujo de carga con el tiempo no es constante, la corriente varía con este y se define mediante el límite diferencial i =dq /dt (2.10) como ya se menciono en el capítulo 2 los transportadores de carga en los metales son electrones, en los conductores electrolíticos (como las soluciones), o en los gaseosos (plasmas), son iones positivos, negativos o de ambos. La corriente i es una característica de un conductor en particular. La densidad de corriente j es una cantidad microscópica relacionada con ella. j = i / A (2.11) donde A es el área de sección transversal del conductor. La relación general entre j e i es que en una superficie de algún conductor, i es el flujo del vector j sobre este conductor o bien [16] dSji (2.12) 2.1 Ley de Ohm La ley de Ohm establece que la corriente (i) que fluye a través de un medio específico es directamente proporcional al voltaje, o a la diferencia de potencial eléctrico (V), a través del medio e indirectamente proporcional a la resistencia (R) del medio. V i R (2.13) Donde i se encuentra en amperios (A), V en voltios (V) y R en ohmios (Ω). La resistencia (R) a través de un medio específico depende de la geometría del mismo; es directamente proporcional a su longitud (l) e inversamente proporcional al área de su sección transversal (A) 20 l l R A A (2.14) Donde la constante de proporcionalidad ρ se llama resistividad. Debido a que las unidades de R son los ohmios (Ω), las de l son centímetros o metros, y las de A en centímetros cuadrados o metros cuadrados, las unidades de resistividad serán Ω /cm o Ω /m. La resistividad es una característica propia del material del medio. La conductancia (C) es el recíproco de la resistencia, es decir 1 1 A A C R l l (2.15) Donde κ es la conductancia específica o conductividad, igual a 1/ρ. La unidad del SI de la conductancia es el siemens (S), donde 1S = 1 Ω -1 . Ahora bien, si entre dos puntos existe una diferencia de potencial la corriente se relaciona con una conductancia C. i V i R C (2.16) Cuando en una membrana N canales, cada uno de conductancia C, están abiertos, la conductancia total de la membrana es NC, la fuerza impulsora electroquímica ΔV (potencial de membrana menos potencial de inversión de la corriente que fluye por los canales) produce una corriente igual a NCΔV. Como los canales abren y cierran, los cambios en el número de canales abiertos (N) producen una variación en la corriente i [16]. 2.2 Capacitor Un capacitor consta de dos conductores aislados a y b, de forma arbitraria. Se supondrá que los conductores están completamente aislados de los objetos que se encuentran en sus vecindades y que tienen cargas iguales y opuestas +q y –q. Toda línea de fuerza que se origina en a terminara en b. 21 El capacitor se caracteriza por la magnitud q de la carga en cualquiera de los conductores (no es la carga total del capacitor, la cual es cero) y por la diferencia de potencial V entre ellos, observamos que q y V en un capacitorson proporcionales entre sí, es decir (2.17) En donde la constante de proporcionalidad , recibe el nombre de capacitancia del capacitor, que depende de la forma, posición relativa de los conductores y del medio en el que están inmersos. La unidad de capacitancia en el SI es el coulomb/volt nombrado faradio (F). La capacitancia puede calcularse utilizando la ley de Gauss, suponiendo una superficie Gaussiana de altura h, cerrada por tapas planas de área A (Figura 11). El flujo de E (campo eléctrico) es cero en la parte de la superficie gaussiana que está dentro de la placa superior del capacitor, debido a que el campo eléctrico interno en un conductor con carga estática es cero. El flujo de E a través de la pared vertical de la superficie gaussiana es cero porque, en tanto que se desprecie la curvatura de las líneas de fuerza se pueden considerar que E es paralelo a la pared. Sólo queda la cara de la superficie gaussiana que se encuentra entre las dos placas. En este caso E es constante y el flujo E es simplemente EA. La ley de Gauss da 0 0E EA q (2.18) El trabajo necesario para llevar a una carga de prueba q0 de una placa a la otra puede expresarse como q0V o como el producto de la fuerza q0E por la distancia d dlEdEV (2.19) Figura 11: Capacitor de placas paralelas 22 A Figura 12 : Circuitos Sustituyendo en la relación C = q / V se obtiene (2.20) Podemos considerar a la membrana como un capacitor, ya que ésta separa a dos materiales conductores (soluciones) mediante un material dieléctrico (la bicapa lipídica). De acuerdo a Michel Faraday quien investigó el efecto de llenar el espacio, con un dieléctrico, entre dos placas conductoras con una diferencia de potencial constante, que la carga aumentaba al añadir el dieléctrico. Como q es mayor, para un mismo valor de V, si existe un dieléctrico, la relación = q / V indica que la capacitancia de un capacitador aumenta si se coloca un dieléctrico entre sus placas. La relación de la capacitancia con el dieléctrico a aquella sin dieléctrico, se llama constante dieléctrica del material. Esto obliga a afirmar, de la relación = q / V, que el efecto del dieléctrico es el aumentar la capacitancia por un factor de [16] [15]. (2.21) 2.3 Circuitos de resistencia Se le llama circuito en serie cuando los elementos del circuito se conectan en sucesión, en particular cuando estos elementos en serie son resistencias podemos interpretar el circuito entero con un circuito equivalente considerando una sola resistencia cuyo valor es la suma de resistencias del sistema original (Figura 2.4). Otra configuración importante es el circuito en paralelo que se define como aquella configuración en la que todas las entradas de los elementos del circuito coinciden en un solo nodo y lo mismo para las salidas. En particular en el caso de las resistencias http://mx.wrs.yahoo.com/_ylt=A0S0uD01REVPpy4AwJ7O8Qt.;_ylu=X3oDMTBpcGszamw0BHNlYwNmcC1pbWcEc2xrA2ltZw--/SIG=12e8ti55d/EXP=1329968309/**http:/www.modelo.edu.mx/univ/virtech/electro/circui01.htm 23 podemos obtener un circuito equivalente cambiando el circuito con una sola resistencia en la cual el inverso de esta resistencia sea igual a la suma de los inversos de las resistencias del sistema completo (Figura 12) [16]. 2.4 Circuito RC como modelo de las propiedades eléctricas de la membrana celular Podemos modelar a la membrana celular como un elemento electrónico. Para ello consideramos lo siguiente: 1. El potencial de equilibrio para cada ión se representa mediante una batería, escogiendo la polaridad adecuada, a través de la membrana. 2. La permeabilidad está relacionada la conductancia, que es el inverso de la resistencia. De aquí que para representar la permeabilidad de las diferentes especies iónicas, en serie con cada una de las baterías se coloca una resistencia que varía en función del voltaje. Con esta representación se está considerando que los canales para cada especie iónica (por lo consiguiente, las corrientes iónicas) son independientes unos de otros. 3. Los lípidos de la membrana tienen la capacidad de almacenar cargas eléctricas a cada lado de la membrana (de hecho el potencial transmembranal se debe a estas cargas almacenadas). Esta es la razón para poner un capacitor en paralelo con las resistencias y las baterías. Cuando el potencial de la membrana es el del reposo (ver proteínas de membrana), ninguna de las corrientes iónicas está en equilibrio. Están sometidas a una fuerza –debido a las baterías- que las impulsa en direcciones opuestas. El tamaño de la fuerza –llamada fuerza impulsora del ion- que empuja a cada especie iónica, es la diferencia entre el potencial Figura 13: Cursos temporales de voltaje 24 de membrana y el potencial de equilibrio del ion. Sólo cuando Em = Ei (con i =Na + o K + ), deja de haber un flujo neto de tales iones. La figura 13 nos muestra los cursos temporales del voltaje transmembranal y de un circuito RC, cuando son perturbados con un pulso de corriente. La respuesta del potencial de membrana ante un flujo de carga (corriente) es idéntica a la de un circuito RC [6][15][16]. Un resistor y un capacitor en serie son llamados circuito RC. Si aplicamos un voltaje inicial Vin como se muestra en la figura 14 la diferencia de potencial en el capacitor comenzará a crecer VC =Vin (1- t e ) (2-22) donde = RC. Esto último nos permite inferir la capacitancia conociendo el perfil de crecimiento de voltaje en un circuito RC. En la figura 15 podemos ver el esquema electrónico de una membrana en donde se consideran sólo dos iones (Na + y K + ). Figura 14 : Circuito RC Figura 15 : Análogo membranal 25 Capitulo 3 Antecedentes al desarrollo experimental La mayor parte de nuestro conocimiento actual sobre los canales iónicos procede de la implementación de la técnica de “fijación de voltaje en parches de membrana” ("patch-clamp", en inglés), introducida en 1976 por Erwin Neher y Bert Sakmann (lo que les valió a ambos el Premio Nobel de Medicina y Fisiología en 1991). Esta técnica permite el registro de las corrientes iónicas a través de zonas minúsculas de membranas celulares. La técnica consiste, esencialmente, en presionar la punta de un micropipeta en cuyo interior se encuentra un electrodo, contra la superficie de la membrana con ayuda de un microscopio y un micromanipulador, formándose un cierre hermético (Figura 16). Hacia 1982 ya se habían desarrollado técnicas para sellar el fragmento de membrana contra la punta de la pipeta, obteniéndose resistencias del orden de gigaohmios, lo cual permitía registrar corrientes tan pequeñas como 0.1 pA. Este elevadísimo grado de sensibilidad permitió detectar las corrientes iónicas debidas a canales iónicos aislados. La técnica de fijación de voltaje en parches de membrana admite diversas variantes. Si después de sellar la punta del microelectrodo contra la membrana se aplica una pequeña succión, el parche de membrana se rompe, con lo que se consigue el registro de la célula completa ("whole-cell recording", en inglés), que permite cuantificar la corriente que atraviesa toda la superficie de una célula individual. Separando la pipeta de la célula a partir de esta configuración, los bordes de la membrana unidos a la punta de la pipeta se sellan, permitiendo así el registro exterior-afuera ("outside-out patch recording", en inglés), en el que se pueden 26 determinarlas corrientes iónicas que atraviesan los canales presentes en el fragmento de membrana atrapado. Como el diámetro de la micropipeta empleada es extremadamente pequeño (aproximadamente de 0.5 µm), la corriente detectada corresponde a apenas uno o pocos canales proteicos. Por último, separando la micropipeta de la célula antes de aplicar la pequeña succión, se puede obtener el registro interior-afuera ("inside-out patch recording", en inglés), ya que el parche de membrana queda con la superficie intracelular en contacto con la solución extracelular. El interior de una célula en reposo tiene un potencial eléctrico de unos -50mV. Como ya se había mencionado, esta diferencia de potencial puede parecer pequeña, pero dado que se produce a través de una membrana plasmática de tan solo 5nm de grosor, el gradiente de voltaje es de aproximadamente 100,000 V/cm; por lo tanto, las proteínas de la membrana están sujetas a un campo eléctrico muy grande. Estas proteínas, como todas las demás, presentan en su superficie varios grupos cargados y diversas uniones polarizadas entre sus átomos. Por consiguiente, el campo eléctrico genera fuerzas sobre su estructura molecular. Probablemente las variaciones del campo eléctrico de la membrana afectan de forma insignificante a muchas de las proteínas de membrana. Sin embargo, los canales iónicos regulados por voltaje pueden adoptar varias conformaciones alternativas cuyas estabilidades dependen de la intensidad del campo eléctrico. Cada conformación es estable frente a pequeñas alteraciones, pero puede saltar (“flip”) a otra conformación si sufre una sacudida suficiente por los movimientos térmicos aleatorios del entorno, afectándose la estabilidad de las conformaciones abierta, cerrada e inactiva [15]. 3.1 Registro intracelular A pesar de que en este trabajo usamos la técnica de registro de célula completa es conveniente primero hablar sobre el registro intracelular para introducir terminología y dejar en claro algunas ideas básicas. 27 Figura 17: Se indica la resistencia de la membrana Rm, la capacitancia de membrana Cm y el potencial de membrana dado por Em. Tenemos además la tierra indicando que el electrodo se encuentra en el baño y los amplificadores encargados de registrar, amplificar y procesar la señal. (Modificado de Molleman). Para realizar el registro intracelular, es necesario pinchar la membrana celular con la punta de una micropipeta en cuyo interior se encuentra un electrodo con una solución salina; otro electrodo estará en contacto con el baño en el que esté inmersa nuestra célula, lo que nos permitirá medir directamente el potencial de la membrana. Es necesario que la punta de esta micropipeta sea muy aguda para ocasionar el menor daño a nuestra célula, la dimensión de la punta limita tanto la conductividad como la velocidad de difusión del fluido de la pipeta al citoplasma (figura 17). Resistencia de la pipeta Rp. Debido al pequeño tamaño de la punta de la pipeta, se produce una resistencia muy alta, que es minimizada utilizando una solución altamente conductiva dentro de la misma (solución itracelular). Capacitancia de la pipeta Cp. El vidrio es un aislante y la pipeta se encuentra entre dos soluciones conductoras (la solución intracelular y extracelular) por lo tanto tendremos un capacitor. Los capacitores tienden a retrasar los cambios en el potencial (esto es debido al tiempo de carga y descarga del capacitor) muchos amplificadores tienen en sus circuitos métodos para eliminar o compensar esta capacitancia. 28 Resistencia de fuga Rt. Esta consiste en un corto circuito entre el citosol y el baño, creado por el hecho del pinchar la membrana celular y causarle un daño. Lo ideal es que este resistencia sea lo más grande posible, que equivale a que la célula sea dañada lo menos posible [19][21] . 3.2 Fijación de voltaje La actividad de los canales iónicos pude ser registrada en forma de cambios de potencial de membrana ya que estos reflejan la respuesta de la membrana a los iones saliendo o entrando a la célula [21][22]. Por otro lado estudiar el comportamiento de los canales iónicos directamente es complejo debido a que los cambios en el potencial de membrana retroalimentan cambios en los canales iónicos en al menos tres maneras independientes [19]. El flujo iónico a través de los canales cambia debido a la alteración de la fuerza impulsora que a su vez tiene que ver con el potencial de membrana imi EEFI (3.1) donde la fuerza impulsora del ion FIi depende del potencial de membrana Em y del potencial de equilibrio del ion Ei. Muchos canales iónicos son dependientes del voltaje. Algunos canales iónicos restringen sus flujos iónicos a ciertos potenciales de membrana. Para registrar las corrientes de membrana directamente, es necesario controlar el potencial de membrana; esta técnica es conocida como fijación de voltaje (voltage clamp). La fijación de voltaje se logra usualmente mediante circuitos de retroalimentación, que en respuesta a cualquier desviación de un potencial dado, suministran una corriente que compensa el cambio. Debido a que la medición de voltaje y la corriente suministrada emplean la misma pipeta y la retroalimentación mencionada debe ser instantánea, una pipeta con una punta demasiado aguda, no es útil, sin embargo, con pipetas de mayor diámetro en las puntas es más factible [19][18]. 29 Figura 18 : Circuito equivalente para el regsitro de célula completa (Modificado de Molleman). 3.3 Registro de célula completa En el registro de célula completa tenemos que el electrodo que se encuentra dentro de la pipeta hace contacto directo con el citosol. Este escenario es muy parecido al registro intracelular que se bosquejo con anterioridad, sin embargo, la diferencia reside en el hecho de usar pipetas con una punta no tan aguda, lo que permite suministrar corrientes mayores, lo que a su vez permite fijar el voltaje por retroalimentación. Además, la punta de la pipeta es lo suficientemente ancha para permitir que el liquido en el interior de la pipeta sustituya completamente el del interior de la célula (debido a que el volumen de la célula es demasiado pequeño en comparación con el volumen de la pipeta) por lo que se pueden controlar las condiciones interiores de la célula, preparando una solución adecuada para el interior. En la figura 18 se presenta el circuito equivalente al registro de célula completa. Rm representa la resistencia de membrana, Cm la capacitancia de la membrana, Rl la resistencia de fuga, derivada del corto circuito establecido al presionar la membrana de la célula con la pipeta, Rp es la resistencia de la pipeta y Cp la capacitancia de la pipeta descrita con anterioridad, también agregamos una resistencia llamada de acceso que representa la dificultad con la cual los componentes de la pipeta se filtran al citosol, para el registro de célula completa este valor es muy bajo y se denota por Ra. En ciertas situaciones no es conveniente que se sustituya totalmente el citosol, ya que se pueden perder algunos factores desconocidos que pueden ser relevantes para la investigación que se está realizando. En estos casos se emplea la técnica de parche perforado donde el contacto eléctrico con el citosol se establece usando un agente perforante (usualmente nistatina o amfotericina B). Este agente perfora la membrana, permitiendo sólo a los iones más pequeños 30 pasar, permitiendo así, que los contenidos del citoplasma queden relativamente intactos [19]. Esta variante del registro de célula completa fue el empleado en la realización de este trabajo [19][22]. Materiales y métodos Micromanipulación. Para el manejo micro instrumental la función de un micromanipulador es fundamental,para acercar la punta de la micropipeta a la preparación (10 -3 m), encontrar el lugar perfecto sobre la membrana celular (10 -5 m), hasta hacer contacto con la misma (10 -7 m). Debido a esto, los micromanipuladores contienen tres escalas. La primera permite el fácil cambio de pipetas y su colocación sobre las muestras. La segunda consiste en un mando que puede controlar el movimiento en un espacio tridimensional, permitiendo cambiar la posición de la mejor manera posible, para acercarnos a la célula a un rango de 100μm, donde la punta de la pipeta y la célula casi se encuentran en el mismo plano. Por último, la tercera escala es un ajuste hidráulico para llevar a cabo la aproximación final a la membrana celular. Métodos ópticos. El tejido vivo es usualmente transparente ante las fuentes de luz convencionales [19]. En esta clase de experimentos es fundamental tener visión clara de la membrana, esto lleva a que en estos experimentos se usen microscopios con ópticas especiales. La modulación de contraste Hoffman es una técnica de iluminación oblicua que aumenta el contraste, convirtiendo los gradientes ópticos en variaciones de intensidad de luz. Nuestro estudio empleó la modulación de contraste Hoffman. La Modulación de Contraste Hoffman fue inventada por Robert Hoffman en 1975. Esta es útil para la generación de imágenes con pseudo-relieve de muestras sin tinción y birrefringentes (por ejemplo, células en cajas de cultivo de plástico). La técnica consiste en 31 colocar un diafragma con una ranura fuera del eje frente al plano focal del condensador. Esto ilumina efectivamente la muestra con iluminación oblicua. En la parte posterior del plano focal del objetivo hay una placa (el modulador Hoffman) con tres regiones de tamaño diferente de densidad neutra – transparente (100% de transmisión de la luz), gris (15% de transmisión) y gris oscuro (transmisión del 1%). Esta se coloca para que la rejilla de apertura se alinee con la región de transmisión de 15%. Cuando la luz pasa a través de las varias regiones de la muestra, la luz se refracta a grados diferentes pasando ya sea a través de las regiones transparentes, grises, o grises oscuras del modulador. Esto tiene el efecto de acentuar las diferencias en contraste. Los filtros polarizadores también se pueden usar en los sistemas de Modulación de Contraste Hoffman para mejorar más el contraste. Las imágenes de Modulación de Contraste Hoffman también evitan los halos que algunas veces se observan en las imágenes de contraste de fases. Microscopio invertido: Opuesto a la configuración estándar del microscopio biológico vertical en la cual el ocular y el objetivo están ubicado sobre la platina de la muestra (por lo que interferiría con la manipulación del microelectrodo), los lentes de un microscopio invertido se encuentran ubicados bajo una platina de observación transparente, con la fuente de luz iluminando el objeto desde arriba. La muestra se coloca con la línea de observación, directamente hacia arriba a través del objetivo al objeto, para examinar las muestras que típicamente se asientan en la base de los platos de observación. Presión en la micropipeta Mientras la micropipeta de registro se acerca a la célula es necesario mantener una pequeña presión positiva sobre el fluido dentro de la pipeta para evitar la contaminación del borde de la micropipeta por micropartículas suspendidas en el baño. Así también, en la formación del sello se aplica una pequeña succión para maximizar la resistencia del sello. Baño En el contexto de los experimentos electrofisiológicos se le nombra cámara de superfusión al recipiente donde se colocan las células, y baño a la solución en el que las células se 32 encuentran inmersas. Esta estructura cuenta con un sistema que permite el cambio del baño y la incorporación de otras sustancias al exterior de la célula, además de su drenado. Superfusión Un sistema de supefusión consta de dos partes. Un conjunto de contenedores conectados al baño, conexiones cuyo flujo puede ser controlado. La segunda parte consiste en un sistema de drenaje. Electrodos En este trabajo se emplearon dos tipos de electrodo. a) un electrodo explorador, que consiste en un alambre de plata clorurada ubicado dentro de la pipeta; y b) un electrodo de referencia, que consiste en un electrodo de calomel conectado con el baño mediante un puente salino. Las reacciones de óxido-reducción entre metales y soluciones iónicas provocan la creación de una diferencia de potencial entre los medios [19]. Por otro lado también ocurre que los electrodos se polarizan, esto último sucede debido a la acumulación de iones cerca de los electrodos que poseen una diferencia de potencial entre ellos. La polarización tiene un efecto parecido al de las capacitancias sobre el experimento: retrasa los cambios que se llevan a cabo en el potencial. Dado esto, es necesario tomar medidas contra los efectos negativos que estos fenómenos pueden tener en nuestro experimento. Para mitigar los efectos del potencial de unión se emplearon materiales con bajos potenciales de óxido-reducción, mientras que para evitar la polarización se usan materiales poco polarizantes. En nuestro experimento, se manejó plata clorurada (Ag-AgCl) para el electrodo de la pipeta; para el baño se usó un electrodo de calomel, el cual se compone de tres fases: 1) mercurio; 2) una pasta formada con mercurio y calomel (cloruro mercuroso: Hg2Cl2) mezclada con solución de KCl 3M; y 3) solución de KCl 3M. Este electrodo de calomel (la 3ª fase) se colocó en contacto con el baño mediante un puente salino de agar disuelto y gelificado en una solución de KCl 3M. 33 Micropipetas Las pipetas que contienen el electrodo de Ag-AgCl y permiten aislar la solución que tendrá contacto con la membrana celular están hechas a partir de tubos capilares de vidrio de borosilicato. Para conseguir que la punta sea la adecuada para el experimento se emplea un estirador de micropipetas. Este aparato actúa aplicando fuerzas en sentidos contrarios a los extremos del tubo capilar y calentando al rojo vivo el centro del mismo, el capilar sufre un estiramiento hasta que sólo queda una delgada porción del mismo entre los dos extremos. Un último estirón divide el tubo obteniendo dos micropipetas idénticas. La fuerza que se aplica, el calor y el tiempo de los pasos se determinan por rutinas internas del programa del estirador. Como es de esperarse, las puntas de las micropipetas son bastante irregulares, situación que podría dañar la membrana celular. Para resolver este problema, se flamean las puntas mediante una microforja. Esta consta de un microscopio, un micromanipulador y una resistencia. Mediante el micromanipulador se aproxima la punta de la micropipeta hasta una distancia conveniente de la resistencia. Al calentarse la resistencia, el calor emitido elimina las irregularidades de la punta. 3.5 Cultivo celular Se utilizaron ratas Wistar (175-225g) para este estudio, fueron crecidas y manipuladas de acuerdo con las directrices y principios del Comité de Atención de Uso de Animales, U.S.A. y con la aprobación del Comité de Atención Institucional de Animales de la Universidad Nacional Autónoma de México. Los cultivos primarios de células del conducto colector de la médula interna renal fueron obtenidos mediante el método de lisis hipotónica modificado [12]. Las células fueron crecidas sobre cubre-objetos contenidos en cajas de Petrie de 35 mm y cultivadas en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, GIBCO) suplementado con 10 % de suero bovino fetal (GIBCO), antibióticos e insulina, a 37 °C con una atmosfera de aire-5% CO2 como se describe [4][10]. Las células fueron estudiadas de 6-11 días después de la siembra en 34 medio. En este momento las células forman monocapas de células confluentes y exhibenformación de ampollas. 3.6 Soluciones Solución de la micropipeta La solución de la micropipeta tuvo la siguiente composición: (mM) KCL 114, NaCl 7.5, NaH2PO4 2.5, K2HPO4 10, CaCl2 1.54, MgCl2 1, glucosa 10 y EGTA 2.5; pH 7.4. Soluciones de baño Usamos una solución de baño control con la siguiente composición: (mM) NaCl 45.5, KCl 5, NaH2PO4 2.5, Na2HPO4 10, citrato de calcio 0.4, MgCl2 1, glucosa 10, alanina 1, NaHCO3 17.5, Na-HEPES 54; amilorida 3 x 10 -7 , rojo de fenol 16 mg/l; el pH fue ajustado a 7.4 después de burbujear con una mezcla de aire 5% CO2 (PCO2 29.25 mmHg). Se emplearon otros cinco tipos de solución de baño: 1) una “solución bajo Cl - /bajo HCO3 - ” con 1 mM NaCl (8 mM Cl - ), 3 mM NaHCO3 - y 113 mM Na-HEPES; 2) una “solución bajo HCO3 - ” con 3 mM NaHCO3 y 68.5 Na-HEPES (en estas soluciones con bajo HCO3 - la PCO2 fue disminuida a unos 5 mmHg para alcanzar un pH de 7.4); 3) una “solución bajo Cl - ” con 1 mM NaCl (8 mM Cl - ) y 98.5 mM Na-HEPES; 4) una “solución alto Cl - ” con 95.5 mM NaCl (102.5 mM Cl - ) y 4 mM HEPES-Na; y 5) una “solución alto HCO3 - ” con NaHCO3 52.5 mM y HEPES-Na 19 mM, el pH de esta última solución se ajustó a 7.4 mediante burbujeo con una mezcla aire 15% CO2 (PCO2 87.75 mm Hg). En todas las soluciones, la osmolaridad se ajustó, mediante urea, a 300 mOsm. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente (24 a 25 °C) [7]. 35 3.7 Protocolos experimentales Los protocolos de fijación de voltaje y de lectura de corrientes fueron llevados a cabo con el instrumento Axopatch 1D y CV-4 1/100 HEADSTAGE bajo el control del software pclamp (v.6; Axon Inst.) a través de una PC Pentium I empleando el convertidor A/D Digitadata 1200 (Axon Inst.). Las corrientes de membrana fueron procesadas con un filtro pasa bajos (5KHz) digitalizadas y guardadas en el disco duro para su análisis posterior. El análisis de datos fue llevado a cabo usando el módulo Clampfit del programa pClamp y el ajuste de curvas se realizó con Sigmaplot (Jandel Scientific). Protocolo básico de estimulación Iniciando con un potencial fijado en -50mV (cercano al potencial de membrana reportado para estas células [16][stanton y mai, se aplican una serie de pulsos cuadrados que duran 720 ms desde -160 mV a 80 mV en incrementos de 20 en 20 mV con un intervalo de 8 segundos entre un pulso y el siguiente; después de cada pulso, el potencial de membrana fue fijado a -150 mV durante 80 ms, para poder registrar las corrientes de cola. Protocolo de constante de tiempo de corrientes de cola Desde un potencial fijado en -50 mV se activa la corriente con un prepulso a 80mV durante 1.1 segundos, las corrientes de cola se evocan mediante una serie de pulsos cuadrados, de 880 ms, entre -60 y 60 mV en aumentos de 20 en 20 mV con un intervalo de 16 segundos entre cada pulso. Las corrientes instantáneas (Iins; definidas como las corrientes que se presentan durante los primeros 0.4 ms) son restadas cuando es necesario. El resultado es ajustado mediante la ecuación: ])[]1([ sf tt t eaeAI (4.2) 36 Donde It es la corriente medida en el tiempo igual a t, A es una constante relacionada con el valor máximo que puede ser alcanzado por la corriente, τf y τs son las constantes de tiempo de activación, siendo, τf mas rápida que τs Protocolo de rampas de fijación de voltaje Desde un potencial fijado en -50 mV se activa la corriente dependiente de voltaje y de tiempo, mediante un prepulso a 80 mV durante 1.1segundos. Posteriormente, el voltaje es llevado a -60 mV durante 3 ms, permitiendo que ocurra la corriente capacitiva. En seguida, mediante una rampa de voltaje (es decir un perfil lineal) de 30 ms de duración, se lleva el voltaje a 60 mV. A la corriente registrada durante la rampa, se le resta la corriente lineal, la cual se obtiene mediante un protocolo similar, pero sin el prepulso inicial de activación (prepulso a - 80 mV). La corriente resultante de esta substracción, se grafica en función del voltaje, y su conductancia pendiente se obtiene mediante regresión lineal. Análisis estadístico Todos los resultados experimentales se expresan como media ± error estándar, la comparación entre los valores medios de los valores, fue realizada por la t de Student-test para datos emparejados y no emparejados. Los valores de p <0,05 se consideraron como indicación de una diferencia significativa. 37 Capitulo 4 Resultados, análisis y comentarios finales 4.1 Resultados y análisis. Iniciamos los experimentos manteniendo a las células en la solución de baño control. Las células fueron estudiadas mediante el protocolo básico anteriormente descrito. En aproximadamente 30% de las células estudiadas en estas condiciones, se presentaron registros como los que se muestran en la figura 19 A, en la que podemos observar una corriente saliente activada por despolarización, en forma dependiente del tiempo (a la que llamamos Iovt). Esta Iovt, se activa a potenciales cercanos a 20mV, requiere más de 720 ms para completar su activación a potenciales entre 20 y 80 mV, y se aprecia que se activa más rápidamente conforme aumenta el nivel de despolarización. En la figura 19 B se ilustran las corrientes observadas en las células que expresan Iovt. Esta son: una corriente instantánea (Iins) que exhibe un componente lineal y un componente que rectifica hacia afuera, y Iovt, cuya activación produce prominentes corrientes de cola a -150 mV. Iins presenta una desactivación que depende del tiempo a potenciales más negativos que -60 mV (ver figura 19 A, 5 registros de la parte inferior). Figura 19 A: Gráficas superpuestas de corrientes registradas de una célula que expresa Iovt.La flecha indica el nivel de corriente cero y las corrientes salientes se grafican hacia arriba. B: Dos de las corrientes mostradas en A (las evocadas a los potenciales de -160 y 60 mV). 38 La figura 20 A se muestra la relación corriente voltaje (i-V) de los valores medios de 35 células que presentaron Iovt. La línea recta es el ajuste extrapolado a los valores más positivos, para señalar la rectificación hacia afuera. A fin de determinar si la corriente Iins estaba relacionada con la corriente Iovt. buscamos una correlación entre ellas. En la figura 20 B se muestra una gráfica de distribución de 35 células, donde la conductancia pendiente 4 correspondiente a Iins de cada célula, es graficada como función de la correspondiente conductancia cuerda 5 de la corriente Iovt a 80 mV, la que se calculó asumiendo un potencial de inversión (Erev) de 10 mV. La línea recta corresponde a un ajuste por regresión lineal. Esta grafica nos revela un correlación significativa entre las dos corrientes (r=0.75, pendiente =0.69 p<0.0001, n=35). Esta correlación sugiere que los canales de Iovt tienen una actividad no dependiente del voltaje que contribuye a la corriente lineal. Esta actividad no dependiente de voltaje también es sugerida por la desactivación dependiente del tiempo que ocurre a potenciales más negativos que -60mV. 4 La conductancia pendiente se calculo como el valor de la pendiente (ajustada por mínimos cuadrados) que traza una serie de puntos que presentan un comportamiento lineal. 5 La conductancia cuerda la definimos como la amplitud de Iovt dividido entre la fuerza impulsora, misma que se define como el potencial al cual inicio el pulso (80mV) menos el potencial de inversión (aproximadamente 10mV) Figura 20 A: Relación i-V de los valores medios (n=35) de la corriente máxima (círculos); la línea recta es el ajuste de Iins extrapolado a los valores más positivos, para mostrar la rectificación hacia afuera. B: La conductancia pendiente de la corriente Iins de cadacélula (g lineal) es graficada como función de la correspondiente conductancia cuerda de la corriente Iovt (g ovt) a 80 mV. La línea recta corresponde a un ajuste por regresión lineal. 39 En estudios previamente publicados, realizados en ausencia de cualquier anión permeable [5][10], nunca se observó la corriente Iovt, por lo que se presumió que ésta es una corriente aniónica. Para probar esta hipótesis, se analizaron, en diversas condiciones iónicas, las corrientes registradas en respuesta a una rampa de fijación de voltaje de -60 a 60 mV (en adelante denominadas respuestas de corriente a la v-rampa). En la Figura 21 A, se muestran las corrientes registradas durante los prepulsos y las rampas, cuando la corriente Iovt fue activada (prepulso a 80 mV; trazo a) y cuando la corriente no fue activada (prepulso a -80 mV; trazo b). En la figura 21 B se muestran, separadamente, las respuestas de corriente a la v-rampa, en ambas condiciones, para ilustrar la resta (a-b), que se define como la respuesta de Iovt a la V- rampa (trazo c). Para validar el uso de estas rampas en el estudio de las propiedades de conductividad de los canales Iovt, se analizó el curso temporal de corrientes de cola, registradas después de 1.1 s de prepulso a 80 mV, a potenciales de membrana entre -60 y -20 mV. La dependencia de tiempo de las corrientes de cola se ajustó mediante una suma de dos funciones exponenciales (ecuación 4-1), como se muestra en la figura 22 A. Los valores de τf fueron 174.6 ± 25.5, 225.7 ± 35.5 y 283.9 ± 48.7 ms (n = 20) a -60, -40 y -20 mV respectivamente. Estos valores son mucho mayores que la duración de 30 ms de nuestra rampa Figura 21 A: Respuestas de corriente a una rampa de voltaje (de -60 a 60 mV durante 30 ms) obtenidas cuando Iovt fue activada con un prepulso a 80 mV durante 1.1s (a) y cuando no fue activada (b; prepulso -80 mV). La línea punteada indica el nivel de corriente cero. B: Los registros de rampa de la figura A son presentados, separadamente, para ilustrar la sustracción (a-b), definida como la respuesta de Iovt a la rampa de voltaje (c). 40 de fijación de voltaje. El uso de estas rampas de fijación de voltaje también se valida mediante la gráfica que se muestra en la figura 22 B. Esta muestra los valores de la conductancia pendiente de la respuesta de Iovt a la v-rampa graficados como función de la conductancia cuerda Iovt (determinada a 80 mV). El ajuste lineal obtenido (r = 0.97, pendiente = 1.037, p <0.0001, n = 28) corrobora la correlación esperada entre ambas conductancias. Por lo tanto, la duración de 30 ms de las rampas de fijación de voltaje de -60 a 60 mV, es adecuada para estudiar las propiedades de conductividad de Iovt. En la Figura 23A se muestran las corrientes que se registraron, durante los prepulsos, en una misma célula, en dos condiciones iónicas de la solución de baño: solución control (trazos negros) y solución con baja concentración Cl - y baja concentración HCO3 - (trazo gris). La corriente Iovt presente en la primera condición, se pierde en la segunda condición, y se sustituye por una corriente de lenta desactivación. También se muestra (línea de trazo discontinuo) la corriente saliente suprimida por esta maniobra, para ilustrar la corriente mediada por canales Iovt. En la figura 23 B se muestran la respuestas de Iovt a la v-rampa correspondientes al Figura 22 A: Corrientes de cola de Iovt (a las que se restó la corriente instantánea) correspondientes a (de abajo hacia arriba) -20, -40 y -60 mV. Las líneas superpuestas a los registros corresponden a los mejores ajustes exponenciales. La constante de tiempo a -60 mV fue del orden de 200 ms. B: La conductancia pendiente de Iovt, determinada mediante su respuesta a la rampa (g pendiente), en cada célula, es graficada como una función de su correspondiente conductancia cuerda a 80 mV. La línea recta muestra el ajuste por regresión lineal de los datos. 41 experimento ilustrado en A. Nótese que en la condición de control, la respuesta de Iovt a la v- rampa invierte en un potencial cercano a 12 mV (11.8 ± 1.1 mV, n = 9), y que en la segunda condición, esta respuesta tiene una menor conductancia pendiente (que se reduce de 9.02 ± 0.12 a 0.64 nS ± 0.07. p <0.0004, n = 9) y parece que invierte cerca de 60 mV. Sin embargo, este potencial de inversión aparente debe tomarse con cautela, debido a la desactivación observada en la corriente saliente dependiente del tiempo. Los resultados mostrados en las Figuras 21 A y B sugieren que Iovt es una corriente aniónica. Muchas corrientes aniónicas son bloqueados por 4,4-diisothiocyanatostilbene-2, 2- disulfónico (DIDS [18]), por lo tanto, realizamos experimentos para investigar si Iovt es una corriente sensible a DIDS. En la figura 24 A se muestran las corrientes registradas, durante los prepulsos, cuando la célula se bañó en solución de control (trazo negro), y cuando esta solución contiene 1 mM (DIDS trazo gris), el trazo discontinuo muestra la corriente suprimida por DIDS. En presencia de DIDS, Iovt fue inhibida en 59.8 ± 7.2 % (n = 12, p <0.0001), e Iins también fue inhibida por 48.5 ± 3.3% (n = 12, p <0,0001). En la figura 24 B se muestran las respuestas de Iovt a la v-rampa correspondientes al experimento ilustrado en C. Nótese que, en la condición DIDS, esta respuesta exhibió una conductancia pendiente disminuida. La conductancia pendiente se redujo de 16.8 ± 1.4 ns, en la condición de control, a 4.6 ± 0.6 ns, en la condición DIDS (n = 12, p <0,0001), sin cambio en su potencial de inversión. Figura 23 A: Registros de corrientes obtenidos durante los prepulsos (a 80 y a -80 mV), en una misma célula, en condición control (negro) y en una condición con baja concentración de Cl- y HCO3- (gris), nótese la reducción en la amplitud de la corriente saliente . La diferencia entre las corrientes en el prepulso a 80mV es mostrada por la línea punteada. B: Respuestas de Iovt a la v-rampa correspondientes al experimento descrito en A. 42 Con el fin de estudiar la permeabilidad relativa de la conductancia Iovt a Cl - y HCO3 - , se cambiaron las concentraciones de estos aniones, uno la vez. Cuando a la solución de baño se le redujo la concentración de Cl - de 52.5 mm a 8 mm, la amplitud de Iovt durante el prepulso a 80 mV disminuyó (Fig. 25 A) de 833.8 ± 63.0 pA en la condición de control a 544.8 ± 36.0 pA en la condición de bajo Cl - (p <0,0001, n = 23). Esta figura también muestra lo que parece una reducción de la rectificación hacia afuera de Iins, pero el protocolo de voltaje usado en estos experimentos no es adecuado para estimar la amplitud de esta rectificación. La reducción de la concentración Cl - en el baño indujo una disminución en la conductancia pendiente de la respuesta de Iovt a la v-rampa (fig. 25 B), de 12.19 ± 0.94 nS, en la condición control, a 8.31 ± 0.51 nS, en la condición bajo Cl - (P <0.0001, n = 23), así como un ligero cambio en su potencial de inversión, de 8.13 ± 0.65 mV, en la condición control, a 10.22 ± 1.06 mV, en la condición bajo Cl - (p <0,001). Estos resultados sugieren que Iovt es portada por Cl - . Una disminución de la amplitud de Iovt durante los prepulsos a 80 mV, desde 862.3 ± 527pA a 681.5 ± 48. 7pA (p<0,0001; n = 24). Figura 24 A: Registros de corrientes durante los prepulsos, obtenidos en la misma célula, en condición control (negro) y en presencia de 1mM DIDS (gris). B: Respuestas de Iovt a la v-rampa correspondientes a los experimentos descritos en A 43 Se observó, también, cuando en la solución del baño la concentración de HCO3 - se redujo desde 17.5 mM a 3.0 mM (fig. 26 A). Esta reducción en la concentración de bicarbonato también indujo una disminución en la conductancia pendiente de la respuesta de Iovt a la v- rampa
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