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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE MEDICINA DIVISIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO SECRETARIA DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE REHABILITACIÓN “LUIS GUILLERMO IBARRA IBARRA” ESPECIALIDAD EN ORTOPEDIA EVALUACIÓN DE BIOSEGURIDAD Y VIABILIDAD CELULAR DE UN CONSTRUCTO REALIZADO MEDIANTE INGENIERÍA DE TEJIDOS A BASE DE CONDROCITOS AUTÓLOGOS CULTIVADOS PARA EL TRATAMIENTO DE LESIONES DE CARTÍLAGO EN ADULTOS JÓVENES EN UN ESCENARIO MULTICÉNTRICO. ESTUDIO PILOTO T E S I S PARA OBTENER EL TÍTULO DE MÉDICO ESPECIALISTA EN: O R T O P E D I A PRESENTA: DR. RICARDO GONZÁLEZ DE ANDA Jefe del Comité de Implante de Condrocitos: Dr. José Clemente Ibarra Ponce de León Director General del Instituto Nacional de Rehabilitación “Luis Guillermo Ibarra Ibarra” Asesor de Tesis y Metodológico: Dr. Félix Enrique Villalobos Córdova Médico Adscrito del Servicio de Ortopedia del Deporte y Artroscopia Ciudad de México, Febrero 2020. UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 2 DEDICATORIA A mi esposa Lucy por su comprensión, amor y apoyo incondicional en mi camino de formación dentro de la Medicina General y posteriormente en mi especialización de Traumatología y Ortopedia. A mis tres hijos Ricardo, Fátima y Diego, Gracias por existir y ser la luz que guía mi camino. A mis padres: Juan y María Eugenia A mis 4 hermanos. Al Dr. J. Jesús González López Q.E.P.D por haberme guiado desde mi infancia por el camino de la Traumatología y Ortopedia. Al Dr. J. Clemente Ibarra Ponce De León, al Dr. Enrique Villalobos Córdova por todas sus atenciones, enseñanza y contribución en mi formación. Al Dr. Tom Minas, Cartilage Repair Center, Paley Institute, West Palm, Florida, EUA por su amable recepción, atenciones, enseñanza y contribución en mi formación en el área de reparación de cartílago y preservación articular. A los médicos adscritos del servicio de cirugía articular del Instituto Nacional de Rehabilitación. A los pacientes que depositarán su confianza en mis manos e inteligencia. 3 ÍNDICE Resumen………………………………………………………………………………………4 Marco teórico…………………………………………………………………………………29 Planteamiento del Problema……………………………………………………………….64 Pregunta de Investigación………………………………………………………………….65 Justificación…………………………………………………………………………………..65 Hipótesis……………………………………………………………………………………….65 Objetivos……………………………………………………………………………………….66 Metodología…………………………………………………………………………………....66 Resultados……………………………………………………………………………………..80 Discusión……………………………………………………………………………………….86 Conclusión……………………………………………………………………………………..87 Bibliografía……………………………………………………………………………………..88 4 RESUMEN La elaboración en el laboratorio de constructos tisulares útiles para la terapéutica constituye el reto más importante de la Ingeniería Tisular. En las últimas décadas se han elaborado en este sentido constructos tisulares de distinta naturaleza con el objeto de reparar o sustituir los tejidos lesionados. Los componentes de los constructos tisulares, células y biomateriales deben cumplir exhaustivos criterios de calidad y bioseguridad para garantizar su uso y efectividad terapéutica. En lo que respecta al constructo de condrocitos, la viabilidad celular es uno de los criterios básicos a cumplir ya que solo una viabilidad elevada asegura la eficacia terapéutica del implante condral. La viabilidad de las células que participan en los constructos se realiza habitualmente con carácter previo a la generación de los mismos, sin que, hasta el momento existan estudios estadísticamente significativos que evalúen la viabilidad celular una vez que las células forman parte del constructo y se realiza esta técnica en un escenario multicéntrico. La razón de la falta de estudios estriba básicamente en la carencia de métodos idóneos para evaluar la viabilidad en tales circunstancias entre los métodos que más se utilizan para evaluación la viabilidad celular destacan: Técnicas que permiten identificar las alteraciones de la membrana y el estado metabólico de las células y el uso de la microscopía electrónica y fluorescencia. Uno de los retos existentes en la actualidad consiste en estandarizar y adaptar esta técnica para su utilización en el constructo de condrocitos ya elaborado con el objeto de evaluar la viabilidad de las células que lo componen. El presente trabajo es un estudio preliminar que propone la adaptación y aplicación de una técnica de evaluación de la viabilidad celular al constructo de condrocitos, con el objeto de disponer de una metodología estandarizada que nos permita realizar dicha técnica en un escenario multicéntrico con el control de calidad de acuerdo con los requerimientos demandados en este tipo de terapia celular. 5 Como antecedentes en el área de viabilidad celular de las células de cartílago la Dra. Olivos y col. 22 demostraron que es posible el aislamiento de condrocitos viables de donantes cadavéricos en muestras procesadas dentro de las primeras 48 horas no encontrando diferencia estadísticamente significativa entre el número de condrocitos aislados de donantes vivos vs. cadavéricos, la criopreservación de los condrocitos primarios cadavéricos no altera la capacidad de formar cartílago como tejido y el co-cultivo de condrocitos primarios mejora la calidad histológica del tejido recién formado en comparación con las células no co-cultivadas. En un estudio preliminar de evaluación de constructor tisulares realizado por el Dr. Fernando Campos y col. 23 realizado en el Laboratorio de Ingeniería Tisular del Instituto de Investigación Sanitaria en Granada, España aplicó la microscopía electrónica analítica por energía dispersiva de rayos X a la evaluación de la viabilidad celular en constructos tisulares de fibrina agarosa para determinar la viabilidad celular en el seno del constructo evaluando fibroblastos aislados y en el seno del constructo a los 7 y 21 días con la técnica LIVE/DEAD demostrando que la aplicación de la técnica es factible y que la viabilidad de la técnica es elevada a los 21 días sin que existan signos de apoptosis en la población celular. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA La viabilidad de las células que se encuentran contenidas en los constructos es uno de los criterios básicos a cumplir ya que un porcentaje (%) de viabilidad elevado asegura la eficacia terapéutica del implante condral. Actualmente no existen estudios significativos que demuestren de forma cuantitativa y cualitativa la evaluación de la viabilidad celular una vez que las células forman parte del constructo y se realiza esta técnica en un escenario multicéntrico 6 ¿Cuáles son los parámetros objetivos de temperatura (°C) y humedad (%) que nos permiten garantizar la bioseguridad y la concentración celular viable máxima en la realización del implante de condrocitos autólogo encapsulados en matriz (ICAME) en diferentes centros de cirugía ortopédica para el tratamiento de lesiones de cartílago articular de rodilla fuera de la Unidad de Tejidos, Terapia Celular y Medicina Regenerativa del INR? ¿Cuál es la Viabilidad Celular de un Implante de condrocitosrealizado con técnicas de Ingeniería Tisular en la Unidad de Tejidos, Terapia Celular y Medicina Regenerativa del INR expuesto a temperatura ambiente a través del paso del tiempo expresado en horas? JUSTIFICACIÓN El presente trabajo es un estudio preliminar que propone la adaptación y aplicación de una técnica de evaluación de la viabilidad celular al constructo de condrocitos, con el objeto de disponer de una metodología estandarizada que nos permita realizar dicha técnica en un escenario multicéntrico con el control de calidad de acuerdo con los requerimientos demandados en este tipo de terapia celular. HIPÓTESIS Mediante la determinación de los objetivos anteriormente descritos se documentará la viabilidad celular > 80% dentro de las primeras 48 hrs. posteriores al implante. Leslie Texto escrito a máquina PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN 7 OBJETIVO GENERAL Demostrar la viabilidad celular del constructo de ICAME de forma cuantitativa y cualitativa a diferentes tiempos para establecer los parámetros de bioseguridad de esta técnica como parte de un estudio multicéntrico. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Determinar la media y desviación estándar de humedad (%), temperatura (°C) y tiempo que transcurre desde la toma de biopsia hasta su entrega en el INR. Determinar la media y desviación estándar de humedad (%), temperatura (°C) y tiempo que transcurre de la salida del constructo de condrocitos del INR hasta su implante. MATERIALES Y METODOLOGÍA DISEÑO DEL ESTUDIO Estudio Experimental Descriptivo Longitudinal Prospectivo TAMAÑO DE LA MUESTRA Muestreo a Conveniencia Pacientes que cuenten con los criterios de inclusión para el presente estudio 8 DESCRIPCIÓN GENERAL DEL ESTUDIO PROCEDIMIENTOS: Toma de suero autólogo El paciente será citado en ayuno para toma de sangre total. Se puncionará vena cefálica o basílica para la obtención de sangre total (450 ml aproximadamente) y se obtendrá suero mediante procedimiento estandarizado de laboratorio. El suero será llevado al laboratorio de biotecnología donde será inactivado a 56° por 30 minutos, posteriormente filtrado (22μm), alicuotado y almacenado a -22°C. 9 Figura 11. Diagrama descriptivo de la técnica de obtención de suero autólogo.19 Evaluación de la lesión del cartílago y recolección de biopsia osteocondral En todos los casos seleccionados los pacientes se incluyeron en un primer procedimiento quirúrgico en el cual se determinaron las características precisas de la lesión condral la cual fue medida con la ayuda de una sonda artroscópica. Se obtuvieron tres biopsias osteocondrales de 4 milímetros de diámetro a partir de una zona de no carga adyacente a la escotadura intercondílea (1 taquete de 4 mm por cada cm de lesión condral) usando un recolector de injerto osteocondral (COR, DePuy Mitek, Raynham, MA). Las biopsias se colocaron inmediatamente en recipientes estériles que contenían medio de cultivo DMEM-F12 más un 10% de antibióticos/antimicóticos. Se enviaron muestras al laboratorio de biotecnología del Instituto Nacional de Rehabilitación para el aislamiento de condrocitos, la expansión in vitro. 21 10 Figura 12. Toma de Biopsia de 1 taquete de 4 mm por cada cm de lesión condral. 19 11 Figura 12. Recepción de la biopsia e inclusión de medio de cultivo DMEM-F12 con 10% de suero autólogo del paciente y 1% de antibióticos y antimicóticos (estreptomicina, anfotericina, gentamicina).19 12 Aislamiento de condrocitos y expansión in vitro Bajo condiciones estériles en una campana de flujo laminar, el cartílago fue disecado y separado del tejido óseo. Los fragmentos de cartílago se digirieron en colagenasa de tipo II (worthington) durante 4 a 5 horas a 37° C en una máquina de digestión mecánica-enzimática a agitación constante 200 rpm aproximadamente. Posteriormente se realizó conteo celular y se evaluó la viabilidad mediante tinción con azul de tripano. Los condrocitos se sembraron en un matraz de cultivo T-25 a una densidad de 250.000 células (10,000/cm2 en cajas de cultivo de 25 cm2), se añadió medio de cultivo (medio Eagle modificado por Dulbecco F12 GIBCO, Grand Island, NY) suplementado con 1% de agentes antibióticos-antimicóticos y suero autólogo del paciente al 10%, se mantiene el cultivo a 37° C 5% CO2 y aproximadamente el 80% de humedad realizando cambio de medio cada dos o tres días. Los condrocitos se expandieron hasta una confluencia del 100% y después se tripsinizaron y volvieron a sembrarse para la expansión celular hasta el pase 2. Al comienzo del segundo paso, el 33% de las células se sembraron en placas de petri con medios convencionales suplementados con ácido ascórbico (60 g /ml) para inducir la formación de monocapa (66% de células). Figura 13. Técnica de aislamiento de células de cartílago.19 13 Figura 14. Técnica de expanción de células de cartílago.19 Figura 15. Técnica de preparación del constructo.19 14 Figura 16. Técnica de expanción de células de cartílago, confluencia de 100% y formación de la monocapa.19 Formación del constructo de condrocitos encapsulados en matriz Una vez que los condrocitos en el pase-2 alcanzaron una confluencia del 90% al 100%, las células en un matraz de cultivo T-25 se tripsinizaron con colágeno tipo I, y luego se centrifugaron a 1500 GPM para obtener los sedimentos. Los condrocitos expandidos en monocapa se liberaron de las placas de Petri, se colocó una pieza de 8 mm de diámetro del andamio de PGA sobre esta monocapa y luego se añadió un sedimento de condrocitos a este armazón, finalmente se envolvió el PGA y los condrocitos con los bordes de una monocapa y se conformó un constructo (8mm). Este constructo se cultivó una semana para permitir la adherencia celular al andamio PGA y la producción de matriz extracelular. 15 Figura 17. Siembra en el polímero y encapsulamiento con técnica de la crepa.19 Implantación Artroscópica de Constructos de Condrocitos Encapsulados en Matriz Los constructos fueron transportados a la sala de operaciones en recipientes estériles con medios de cultivo incluidos en una hielera y fueron transportados a temperatura ambiente. Se realizó un segundo procedimiento artroscópico y los constructos fueron implantados para tratar las lesiones del cartílago previamente diagnosticadas. Con el paciente en decúbito supino sobre la mesa de operaciones y bajo anestesia regional, la rodilla se preparó realizando asepsia y antisepsia convencionales. Se colocó un torniquete alrededor del muslo proximal, aunque normalmente no se insufló. Se realizó un portal anterolateral longitudinal 16 convencional para el examen artroscópico de la articulación y se utilizó un portal superolateral para irrigación. La lesión del cartílago articular fue identificada, medida y preparada para la implantación de constructo. Implante de condrocitos en tróclea/cóndilos Cuando la lesión estaba en tróclea/cóndilos, se realizó un portal anteromedial oblicuo sobre la lesión para tener acceso perpendicular. Se insertó un ancla bioabsorbible (MINILOK, Depuy Synthes Mitek, Raynham, MA) con sutura PDS No. 2-0 (Ethicon, Somerville, NJ) a través del portal anteromedial o anterolateral. La estabilidad se probó tirando de las suturas. Al mismo tiempo, el constructo de célula- andamio fue preparado en la mesa lateral. A continuación, se insertó una cánula transparente de 8 mm a través del portal directamente sobre la lesión y las suturas del anclaje se extrajeron fuera de la articulación a través de la cánula artroscópica. Las suturas de anclaje se hicieron pasar a través del constructo antes de entrar en la cánula. Se realizó un nudo deslizante artroscópico autobloqueante, se eliminó la bomba de flujo de agua y se insertó el constructo a través de lacánula en la articulación simplemente tirando del poste bajo visión directa. Una vez que el constructo estaba asentado en el lugar apropiado en la lesión condral previamente preparada, el nudo se tensó tirando del extremo de la sutura, y 2 nudos de enganche adicionales fueron atados con la ayuda de un baja-nudos. Las suturas se cortaron a la altura del nudo y se extrajo la cánula. Luego se demostró la estabilidad del implante con la sonda artroscópica y se exploró la rodilla a través de un intervalo de movimiento para verificar la estabilidad y permanencia del implante en el sitio de reparación. 17 Figura 18. Técnica de realización de ICAME Artroscópico.19 EVALUACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE VIABILIDAD CELULAR MÁXIMA DEL IMPLANTE Durante el primer procedimiento quirúrgico previamente descrito correspondiente a la toma de biopsia de cartílago, se documentó la hora de realización de toma de biopsia y las celular fueron incluidas en un recipiente estéril con medio de cultivo celular DMEM-F12 adicionado con antibióticos y antimicóticos y fueron expuestas a temperatura ambiente documentando durante el traslado Temperatura (°C) y Humedad (%), durante su traslado del centro de cirugía ortopédica previamente designado hasta la Unidad de Ingeniería de Tejidos, Terapia celular y Medicina Regenerativa del Instituto Nacional de Rehabilitación para su posterior aislamiento, cultivo, expansión y formación del constructo mediante técnicas de ingeniería tisular. En lo que respecta a la segunda cirugía correspondiente a la realización de ICAME Artroscópico se realizó la extracción del constructo de la Unidad de Ingeniería de 18 Tejidos, Terapia celular y Medicina Regenerativa del Instituto Nacional de Rehabilitación y se transportó hasta los diferentes centros de cirugía ortopédica incluidos en este estudio multicéntrico, se transportaron 4 constructos de 8 mm de diámetro incluidos en recipientes estériles con medio de cultivo celular DMEM-F12 expuestos a temperatura ambiente y se registró la temperatura (°C) y humedad (%) dentro de un contenedor de transporte durante el recorrido hasta el centro de cirugía ortopédica previamente designado, se documentó la hora en que el implante fue realizado, tiempo de traslado, kilómetros recorridos durante el traslado y posteriormente los constructos que no fueron implantados regresaron a la Unidad de Ingeniería de Tejidos, Terapia celular y Medicina Regenerativa del Instituto Nacional de Rehabilitación dentro del mismo recipiente estéril con medio de cultivo celular DMEM-F12 incluido en la hielera de transporte, se registró de igual manera la humedad y temperatura durante el trayecto de regreso al INR y se evaluó la viabilidad celular a las 24, 48 y 72 horas postimplante. Se evaluó la viabilidad celular del constructo postimplante utilizando el kit LIVE/DEAD® (calceína AM/homodímero de etidio-1, Molecular Probes, Invitrogen), de acuerdo a las especificaciones del proveedor, se incluyó el constructo en el sistema LIVE/DEAD® con 1 l de calceína y 0.5 l de homodímero de etidio la muestra fue incubada a 37°C / 5% CO2 y 80% de húmedad durante 40 minutos, se realizó lavado con PBS y posteriormente se realizó evaluación de fluorescencia a través de microscopio confocal ZEISS® utilizando los filtros de acuerdo al proveedor, documentando las células vivas las cuales son distinguidas por la presencia de actividad ubiquitina, la calceína es bien retenida dentro de las células vivas produciendo una intensa fluorescencia color verde (ex/em -495 nm/-515 nm), el homodímero de etidio, ingresa dentro de las células con daño membranal hasta el núcleo celular produciendo una intensa fluorescencia color rojo, al mismo tiempo que es excluido por las células que mantienen la integridad de la membrana celular, se realizó la toma de micrografías en microscopio de fluorescencia las cuales fueron documentadas y almacenadas, mediante este método se demostró de forma cualitativa la viabilidad celular del constructo de condrocitos a las 24, 48 Y 72 horas 19 posteriores a la realización del implante, además cada una de las micrografías fueron analizadas con el software ImageJ® para documentar de forma cuantitativa la viabilidad celular del constructo de condrocitos a las 24, 48 Y 72 horas posteriores a la realización del implante. La misma metodología previamente descrita para la evaluación cuantitativa y cualitativa de la viabilidad celular del constructo de condrocitos fue realizada para 1 injerto cadavérico viable preservado, importado desde EUA en cadena en Frío aprobado por la FDA (Cortesía del Dr. Victor Raúl Guevara Sánchez) en este caso se documentó de forma cualitativa y cuantitativa la viabilidad celular a las 1, 24 y 48 hrs. Se consideró viable un constructo de condrocitos cuando se obtuvo al menos 80% de células vivas. Figura 18. Metodología del sistema LIVE/DEAD® 20 Figura 19. Preparación del constructo para su inclusión en el sistema LIVE/DEAD® Figura 20. Inclusión del constructo en el sistema LIVE/DEAD® A B Figura 21. Prueba de Viabilidad cualitativa y cuantitativa del constructo de condrocitos, la imagen A representa la prueba de viabilidad cualitativa previamente descrita utilizando el sistema LIVE/DEAD®, la imagen B representa la determinación cuantitativa obtenida al evaluar con el software IMAGE J® las micrografías obtenidas a través de microscopio confocal ZEISS® 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 CELULAS VIVAS % CELULAS MUERTAS % CELULAS VIVAS % CELULAS MUERTAS % 21 RESULTADOS Se incluyeron en el estudio 8 pacientes de los cuales 2 fueron mujeres y 6 hombres, con una media de edad de 32 años ± 8.78 DE. La media de edad por género fue de 25.5 años ± 7.77 para mujeres y 34.1 años ± 8.56 DE para hombres. La media índice de masa corporal (IMC, por sus siglas en español) fue de 24.02 ± 3.11 DE. La media del IMC por género fue de 19.85 ± 0.35 DE para mujeres y 25.5 ± 1.71 DE para hombres. La localización de la lesión condral fue en 4 casos en cóndilo femoral medial y en 4 casos en articulación patelofemoral, la media para el tamaño de la lesión fue de 1.51 cm2 ± 0.39 DE para lo cual de implantaron de 1 a 4 constructos de 8 mm de diámetro, la clasificación ICRS para las lesiones condrales reportadas fue de Grado IV en 6 casos y Grado III en 2 casos. Figura 22. Aspectos Demográficos del estudio 22 Figura 23. Localización de Lesiones Condrales N=8 23 CENTROS DE CIRUGÍA ORTOPÉDICA PARTICIPANTES Figura 23. Diagrama representativo de la realización de ICAME Artroscópico en un escenario multicéntrico en diferentes centros de cirugía ortopédica previamente designados y la documentación de los parámetros de viabilidad celular y bioseguridad previamente descritos en la metodología. DISTANCIA INR-CENTROS DE CIRUGÍA ORTOPÉDICA PARTICIPANTES KM Hospital Ángeles del Pedregal 8.7 Hospital San Ángel Inn Universidad 10.9 Hospital ABC Santa Fe 66.7 Médica Sur 1.9 Tabla 5. Distancia entre el Instituto Nacional de Rehabilitación y los diferentes Centros de Cirugía Ortopédica participantes. 24 En la realización del ICAME en su fase multicéntrico en este estudio se documentó la distancia mínima del traslado del constructo de condrocitos la cual fue de 17.4 km hasta una distancia máxima de traslado del constructo de condrocitos la cual fue de 133.4 km, con un tiempo de traslado mínimo de 3 horas 18 minutos hasta un tiempo de traslado máximo de 5 horas 12 minutos considerando como punto de partida la salida del constructo de condrocitos de la Unidad de Tejidos, Terapia Celular y Medicina Regenerativa del INR y su traslado hasta el centro de cirugía ortopédica correspondiente, el tiempoquirúrgico de la biopsia y/o implante y el regreso de los constructos no utilizados a la Unidad de Tejidos, Terapia Celular y Medicina Regenerativa del INR considerado como el punto de término del traslado, como se representa a continuación: Figura 22. Gráfico representativo de la documentación de los parámetros de viabilidad y bioseguridad previamente descritos en la metodología para la cirugía de toma de biopsia y el segundo procedimiento quirúrgico consistente en ICAME Artroscópico. 25 La media de Temperatura documentada en este estudio en el traslado del constructo de condrocitos fue de 19.69°C ± 4.7 DE. La media para el porcentaje de humedad documentado en este estudio en el traslado del constructo de condrocitos fue de 50.06 ± 15.5 DE RESULTADO DE VIABILIDAD CELULAR CUANTITATIVA Y CUALITATIVA PARA 1 PACIENTE AL QUE SE REALIZÓ ICAME ARTROSCÓPICO EN EL HOSPITAL MÉDICA SUR. PANEL 1. VIABILIDAD DEL CONSTRUCTO DE UN PACIENTE. En A) Se muestra las células viables (en verde) y las células muertas (en rojo) en un constructo a 24, 48 y 72 hrs, en B) En la gráfica se muestra el % de viabilidad de las células contenidas en el andamio a 24, 48 y 72 hrs. Se realizó una t- student. P < 0.05 26 RESULTADO DE VIABILIDAD CELULAR CUANTITATIVA Y CUALITATIVA PARA 1 CONSTRUCTO DE CADAVER. PANEL 2. VIABILIDAD DEL CONSTRUCTO DE CADAVER. En A) Se muestra las células teñidas con calceína (en verde) que denotan la viabilidad, en B) se muestra la gráfica correspondiente a la viabilidad celular del constructo a 1, 24 y 48 hrs la cual es de 80%, Al realizar la t-student, no muestra una diferencia significativa 27 DISCUSIÓN La eficacia terapéutica de los constructos elaborados por ingeniería tisular depende de factores muy diversos como por ejemplo la naturaleza del biomaterial utilizado y las propiedades reológicas del mismo o del tipo de célula seleccionado, así como de los distintos parámetros de bioseguridad y viabilidad celular documentados y utilizados en la práctica médica. Como se documentó previamente Olivos y col. 22 demostraron que es posible el aislamiento de condrocitos viables de donantes cadavéricos en muestras procesadas dentro de las primeras 48 horas no encontrando diferencia estadísticamente significativa entre el número de condrocitos aislados de donantes vivos vs. cadavéricos, la criopreservación de los condrocitos primarios cadavéricos no altera la capacidad de formar cartílago como tejido y el co-cultivo de condrocitos primarios mejora la calidad histológica del tejido recién formado en comparación con las células no co-cultivadas, así mismo se ha realizado Campos y col.23 realizaron otro estudio preliminar de evaluación celular de constructo de fibroblastos donde se ha demostrado una viabilidad elevada a los 21 días posteriores a la formación del constructo. La evaluación de la viabilidad celular de los protocolos actualmente existentes se realiza con anterioridad a la utilización del constructo sin que existan datos fidedignos sobre las variaciones que pueden sufrir las células en el seno del constructo, por otro lado en lo que respecta a la viabilidad celular del constructo de condrocitos no existe en nuestro país un estudio con evidencia estadísticamente significativa que exponga los resultados de viabilidad celular del constructo de condrocitos y garantice de forma cualitativa y cuantitativa la realización de dicha técnica en un escenario multicéntrico por lo que ha través de la realización del presente estudio preliminar hemos podido documentar la viabilidad celular del constructo de condrocitos > 80% dentro de las primeras 24 horas posteriores a su implante y exposición a temperatura ambiente con parámetros de bioseguridad y viabilidad celular correspondientes a temperatura 19.69°C ± 4.7 DE y humedad de 50.06 ± 15.5 DE durante su traslado, con una distancia máxima recorrida de 133.4 km y un tiempo máximo de traslado de 5 horas 12 minutos lo que nos permite estandarizar dicha técnica así como garantizar desde el punto de vista de Calidad y Bioseguridad su realización en un escenario 28 multicéntrico tomando en cuenta dichos parámetros presentados en nuestros resultados. CONCLUSIÓN En consecuencia, a través de los resultados del presente estudio preliminar en base a los parámetros de bioseguridad y viabilidad celular documentados es factible garantizar la realización del Implante de Condrocitos Autólogos Encapsulados en Matriz realizado dentro de las primeras 24 horas posteriores a su salida de la Unidad de Tejidos y Terapia Celular del Instituto Nacional de Rehabilitación de forma Artroscópica y en un Escenario Multicéntrico. 29 MARCO TEÓRICO El Condrocito como célula anabólica / catabólica Los condrocitos son células altamente especializadas que se diferencian de los grupos de células mesenquimales durante la embriogénesis esquelética. El condrocito sintetiza y secreta los componentes de la matriz extracelular principalmente proteoglicanos y colágeno tipo II. La mayor parte del cartílago inmaduro es temporal y se reemplaza por hueso durante el desarrollo epifisario, mientras que las regiones más cercanas a la cavidad sinovial permanecen como el cartílago articular permanente del adulto. Durante el crecimiento y desarrollo el cartílago inmaduro experimenta la replicación celular en las zonas superficiales y profundas. Sin embargo, a medida que se acerca la madurez esquelética, la replicación solo ocurre en la zona profunda. La replicación celular después de la madurez esquelética es rara. El contenido de células de cartílago articular es bajo, y no ocupa más del 10% del volumen de tejido en los seres humanos. La densidad celular se ha estimado en 105 células /mm3 en recién nacidos y en el cartílago adulto. Los valores son más altos en la zona superficial que en la más profunda. Los animales experimentales tienen una celularidad mucho mayor. Por ejemplo, los conejos adultos tienen una densidad celular casi 10 veces mayor que el cartílago humano, y los ratones tienen una densidad celular 25 veces mayor. La morfología celular general varía desde aplanada y discoidal en las zonas más superficiales hasta ovoide en las zonas más profundas. Las células ovoides presentan aparatos de Golgi agrandados, una característica de las células que secretan proteínas de forma activa, y los procesos celulares que se extienden hacia la matriz pericelular adyacente. Los condrocitos son células normalmente longevas y no son reemplazados por células nuevas como ocurre en la rotación de otros tejidos. Sin embargo, la capacidad de división celular se manifiesta cuando se compromete la integridad de la matriz, como en la osteoartritis. La fibrilación del cartílago se asocia con necrosis en la zona superficial y con grupos de células en zonas profundas. Los estudios 30 metabólicos muestran una mayor incorporación de sulfato por las células en los grupos rodeados por una matriz pobre en proteoglicanos. Si se ve como un intento de reparación, las células en los grupos están activas en la síntesis de la matriz, pero no son capaces de reemplazar la matriz a distancia de los grupos previamente mencionados. Por lo tanto, el contenido total de proteoglicano es bajo en el cartílago fibrilado. Los condrocitos están inmersos en una matriz avascular en la que los nutrientes y los productos de desecho deben difundirse. La tensión de oxígeno es aproximadamente 1/3 de la medida en los capilares de los tejidos blandos humanos. En función de cada célula, la captación de oxígeno representa 1/50 con respecto a la del riñón, pero son comparables las tasas de glucólisis entre los condrocitos y el riñón. Por lo tanto, los condrocitos participan en un metabolismo relativamente anaeróbico.Los condrocitos son células dinámicas con actividad anabólica y catabólica; median tanto la síntesis como la degradación de la matriz. El metabolismo de los proteoglicanos se ha estudiado ampliamente. Como es típico de otras células, los componentes proteicos se sintetizan en el retículo endoplásmico rugoso del citoplasma, y la sulfatación de los polisacáridos se produce en el aparato de Golgi. Estudios ex vivo con isótopo trazador radioactivo de 35 S-sulfato muestran la incorporación en glucosaminoglicanos por células intermedias y profundas y su posterior movimiento en la matriz. El colágeno tipo II se sintetiza y secreta como cadenas separadas de procolágeno con extensiones en sus extremos, se convierte en tropocolágeno y se organiza en fibrillas con pequeñas cantidades de colágeno tipo IX y tipo XI. En contraste con las densas, gruesas y altamente orientadas fibras de colágeno del hueso, las fibrillas de cartílago son delgadas y entrecruzadas en una malla abierta. Las fibrillas contienen cantidades variables de macromoléculas no colágenas, especialmente la decorina. La vida media del colágeno tipo II es de más de 200 años en humanos. Por lo tanto, el componente principal de las fibrillas nativas no parece ser renovado o reparable en el entorno normal. La red fibrilar de colágeno está bajo tensión y sirve para contener los glucosaminoglicanos en un 31 estado comprimido. Es difícil imaginar cómo se puede girar esa red sin comprometer la integridad mecánica del tejido o cómo se pueden reparar los focos desnaturalizados. La evidencia muestra daño a la red fibrilar en la osteoartritis. La osteoartritis afecta drásticamente las propiedades mecánicas del cartílago. La inflamación excesiva de las muestras osteoartríticas en solución salina diluida se toma como evidencia de la pérdida de resistencia proporcionada por la red fibrilar a la absorción de agua por los polisacáridos. Aunque parece haber poca rotación de la red fibrilar, los proteoglicanos atrapados sufren una rotación que puede ser acelerada por las citoquinas locales. Los condrocitos son responsables de mantener el entorno de la matriz en la que están inmersos y, por lo tanto, garantizan las características biomecánicas del tejido. Están protegidos del daño osmótico y mecánico por la matriz pericelular rígida, llamada chondron. El mantenimiento de la matriz implica la degradación de proteinasas y radicales libres generados por el condrocito. Las metalproteinasas de la matriz y la agrecanasa catalizan el recambio de la matriz del cartílago tanto en el cartílago normal como en el enfermo. Debido a que muchos de los componentes de la matriz en el cartílago son específicos de ese tejido, existe un gran interés en desarrollar y validar ensayos para sus productos de degradación en el plasma o líquidos sinovial como marcadores de recambio. En la visión moderna, se considera que la osteoartritis es el resultado de un desequilibrio entre las actividades dinámicas anabólicas y catabólicas que normalmente están bien equilibradas. El condrocito funciona como el agente de estos dos procesos. Esto contrasta con el tejido óseo, por ejemplo, en el que las actividades anabólicas se atribuyen al osteoblasto y las actividades catabólicas y osteolíticas al osteoclasto. Aunque normalmente la interacción entre los dos tipos de células mantiene constante la masa esquelética dentro del proceso de remodelación, el desequilibrio se produce con el envejecimiento, la osteoporosis y la infección. La situación en el cartílago es distinta. La evidencia sugiere que las etapas más tempranas de la osteoartritis están equilibradas por una regulación al alza de los procesos biosintéticos. El líquido sinovial recolecta un subproducto del 32 procesamiento de procolágeno II, llamado condrocalcina o propéptido C, cuyos niveles se elevan en la osteoartritis traumática y primaria. Anteriormente, el cartílago se consideraba inmunológicamente privilegiado debido a la ausencia de antígenos de trasplante o al efecto protector de la matriz. Estos estados se invocaron para explicar la resistencia de los aloinjertos en sitios heterotópicos. Ahora se aprecia que los condrocitos muestran importantes antígenos de trasplante y que los componentes de la matriz son débilmente antigénicos. En el cartílago intacto sano, estos determinantes probablemente están protegidos de los anticuerpos debido a un impedimento estérico debido a los proteoglicanos en la matriz. La preservación de la integridad de la matriz parece ser esencial para prevenir la exposición de las células y el rechazo del tejido. El grupo heterogéneo de enfermedades inflamatorias de las articulaciones involucra trastornos subyacentes en la regulación autoinmune. En la artritis reumatoide, el revestimiento sinovial es el objetivo inicial de la patología inflamatoria. La proliferación de células de revestimiento sinovial y la infiltración de los linfocitos y macrófagos activados producen una masa de tejido llamada pannus. El pannus puede invadir y destruir la integridad del cartílago articular. Los productos del pannus actúan como mediadores de citoquinas tanto de la condrólisis como de la osteólisis. Los principales agentes son la interleucina-1 (IL-1) y el factor de necrosis tumoral-α (FNT- α). Estos agentes señalan la cascada de liberación de IL-6, IL-8, IL-17, ciclooxigenasa-2 y óxido nítrico, los cuales son objetivos reales o potenciales de manejo farmacológico. Los modelos in vitro han sido útiles para describir los mecanismos por los cuales estas citoquinas inmunomoduladoras cambian la expresión génica en los condrocitos, promoviendo así la condrólisis.1 33 Propiedades Mecánicas del Cartílago Articular El cartílago articular del ser humano tiene 3 funciones principales: 1) distribuir las fuerzas resultantes de las cargas recibidas en dirección al hueso subcondral 2) proveer de un coeficiente de fricción bajo dando lubricación a las superficies articulares y 3) absorber los impactos recibidos en las articulaciones. El componente principal del cartílago es agua, formando 65-80% de su peso total. En su forma deshidratada, el cartílago se compone de colágena tipo II en un 45%, proteoglicanos en un 35% y el resto está compuesto por glicoproteínas y células. La porción celular (condrocitos) representa menos del 10% de su volumen total. El cartílago es un tejido avascular, aneural y alinfático por lo que los condrocitos reciben sus nutrientes mediante difusión desde el líquido sinovial.2 El cartílago articular es un tejido hipocelular y viscoelástico que recubre las articulaciones sinoviales y les proporciona un entorno cercano sin fricción. Las articulaciones del cartílago sinovial proporcionan un coeficiente de fricción para el movimiento de la articulación que es menor que el del hielo sobre hielo. Las propiedades mecánicas del cartílago articular dependen de su composición y arquitectura. Normalmente, los proteoglicanos hidrófilos y el colágeno constituyen el 30% de la masa tisular, el resto es agua. La matriz de colágeno puede verse como material bifásico en el que la fase líquida fluye por deformación mecánica de su fase sólida. Aunque el agua está restringida por las moléculas de proteoglicanos, la fase líquida también se puede llamar la “porosidad” del cartílago. El alto contenido de agua del tejido también genera su alta viscoelasticidad. Sus módulos elásticos son bajos a velocidades de carga lentas, pero son dos órdenes mayores a velocidades fisiológicas. La capa de cartílago superficial o “piel” es resistente a las cargas de compresión o penetración. Las fibras de colágeno dispuestas verticalmente de las zonas radial y calcificada son resistentes al corte. Al aplicar presión al cartílago articular a través de soporte de peso, el agua contenida dentro del cartílago exuda a la presión. Con lapresión disminuida el agua regresa al agrecano. La proteína de superficie dermatán sulfato también actúa como una sustancia antiadherente. Los filamentos 34 finos de la zona superficial se combinan con el agua, de modo que la articulación con la superficie de la articulación opuesta también se produce con el agua combinada y los filamentos de la zona superficial. Por lo tanto, la barrera lubricante entre las superficies de la articulación es principalmente agua. El agua se libera durante la presión con peso de los proteoglicanos con carga negativa hiperhidratada en el cartílago articular. En presencia de daño o proceso degenerativo, la pérdida de proteoglicanos y agua produce deterioro de las propiedades mecánicas y la función articular. 1 Morfológicamente el cartílago se divide en 4 zonas: Figura 1. Principales zonas de organización del cartílago articular. Reproducido de: Minas, T. (2011). A Primer in Cartilage Repair and Joint Preservation of the Knee. Philadelphia: Saunders Elsevier. 35 La zona superficial representa el 10-20% del espesor total; las fibras de colágena se encuentran dispuestas en dirección paralela a la superficie, los condrocitos, enlongados, sintetizan altas concentraciones de colágena y baja concentración de proteoglicanos. El contenido de agua es el más alto de las 4 zonas. La zona transicional o zona media representa el 40-60% del espesor total; las fibras de colágena se encuentran dispuestas en dirección aleatoria y la concentración de proteoglicanos es mayor. La zona profunda representa el 30% del espesor total, el contenido de agua es el más bajo mientras que los proteoglicanos se encuentran en su más alta concentración y las fibras de colágena se dirigen perpendicularmente a la superficie articular mientras que los condrocitos son redondos y forman columnas paralelas a las fibras de colágena. En este nivel también existen fibras gruesas de colágena que cruzan hacia el hueso subcondral, permitiendo una unión estable entre la zona profunda y el cartílago calcificado. La zona calcificada es una capa delgada por encima del hueso subcondral y sobre la cual existe una región denominada zona ondulada la cual representa una zona estructural de función crucial en el mecanismo de transferencia de cargas desde el cartílago hacia el hueso subcondral 2. En esta zona calcificada los condrocitos expresan un fenotipo hipertrófico y se encuentran envueltos en matriz calcificada. El hueso subcondral se compone a su vez de una placa terminal cortical, una delgada capa de hueso haversiano y de hueso trabecular esponjoso. La composición de la matriz extracelular es variable, dependiendo de su proximidad en el condrocito.3 El modelo bifásico propuesto por Mow y colaboradores4, es determinado por la interacción entre una fase sólida, representada por la matriz cartilaginosa, y una fase líquida representada por el agua. El complejo reticular (proteoglicanos y colágena tipo II) de la matriz cartilaginosa (fase sólida) provee al cartílago de: 1) resistencia ante fuerzas compresivas, así como 2) alta elasticidad; estableciendo además una porosidad de 60 Armstrongs en condiciones de reposo misma que se reduce a 20 Armstrongs durante la compresión. Cuando una carga es aplicada, el agua fluye muy lentamente fuera del tejido; este flujo “lento” se debe a: a) la baja porosidad y b) la presencia de cargas 36 electronegativas contenidas en las moléculas de glicosoaminoglicanos o GAG´s (queratán sulfato y condroitin sulfato) las cuales aumentan el efecto Donnan de presión osmótica; se ejerce así una gran fuerza de resistencia a la reducción de volumen. Esta resistencia dependiente de flujo (fase líquida) ante el estrés compresivo se debe a que el agua es incomprensible y se retiene protegiendo a los componentes sólidos de la matriz cartilaginosa 5. Figura 2. Composición de la Matriz Cartilaginosa. Reproducido de: Minas, T. (2011). A Primer in Cartilage Repair and Joint Preservation of the Knee. Philadelphia: Saunders Elsevier. 37 Incidencia de las lesiones de Cartílago La verdadera incidencia de las lesiones de cartílago y su historia natural son desconocidas. Se ha propuesto que entre el 5% y el 10% de las hemartrosis agudas de rodilla después de una lesión relacionada con el trabajo o deportiva se asocia con una lesión condral aguda. En una revisión retrospectiva realizada por Curl y col. de 31,516 artroscopias de rodilla 7, la prevalencia de lesiones condrales fue del 63%. Sin embargo, los defectos condrales unipolares aislados en pacientes menores de 40 años fueron raros, y ocurrieron en solo el 5% de esta población de pacientes. Tanto la evidencia clínica como la experimental mostraron que con el tiempo las lesiones focales de cartílago articular aumentarán y progresarán a la osteoartritis.1 La lesión mecánica del cartílago articular durante las lesiones deportivas puede ocurrir con fuerzas de cizallamiento secundarias a la rotura del ligamento cruzado anterior. Se han observado fracturas osteocondrales por cizallamiento que se producen en el momento de la rotura del ligamento. La lesión de tipo “blunt” de la superficie articular puede causar lesiones y muerte de los condrocitos articulares. Si el condrocito articular no puede continuar sintetizando y remodelando sus macromoléculas de matriz, la matriz pericelular eventualmente se degenerará. Esto puede explicar la alta incidencia de osteoartritis que se encuentra con las lesiones del ligamento cruzado anterior. En forma aguda, la incidencia de lesiones condrales es aproximadamente del 2%, pero a largo plazo puede acercarse al 20%. 1 En un estudio realizado por Repo y Finlay 1, la fuerza contundente a los condrocitos articulares por encima de 25 MPa produjo la muerte de los condrocitos articulares. Por lo tanto, parece haber un umbral en el que los condrocitos articulares pueden soportar traumatismos contundentes. Este puede ser un factor importante para comprender la degeneración del cartílago articular después de una lesión y puede ser un factor técnico importante durante las nuevas técnicas de reparación, como las transferencias de injertos osteocondrales. Las grandes fuerzas de impacto necesarias para introducir injertos osteocondrales en los sitios receptores pueden provocar lesiones y la muerte celular en la cobertura del cartílago de los injertos osteocondrales, lo que lleva a resultados fallidos a largo plazo. Imágenes por 38 resonancia magnética demostraron hematomas en el tejido óseo después de lesiones contundentes sostenidas durante actividades deportivas y relacionadas con el trabajo. Las biopsias de cartílago artroscópicas tomadas en la región de las lesiones óseas demostraron muerte de la región superficial de condrocitos y deshidratación de la matriz. A partir de estos hallazgos se propone que la muerte celular del cartílago se origine directamente de un trauma contuso que exceda este umbral. 1 La historia natural de la osteoartritis en sí misma es desconocida. En un estudio longitudinal en Suecia se observó que la progresión radiográfica de la osteoartritis en la rodilla ocurre durante un curso de tiempo de 20 años cuando se presenta un estrechamiento del espacio articular superior al 50% en la evaluación inicial (estadios Ahlback 2-4). Sin embargo, solo el 60% de los pacientes con estadio 0 de Ahlback (osteofitos periféricos y espacio articular normal) o la etapa 1 de Ahlback (<50% de disminución del espacio articular) en la presentación inicial progresarán radiográficamente. No toda la osteoartritis radiográfica progresará. En los Estados Unidos, se realizan más de 450,000 reemplazos totales de rodilla por año. La osteoartrosis ocasiona discapacidad y repercusiones a nivel económico importantes, esto es especialmente verdadero si una lesión de cartílago ocurre a tempranaedad cuando la productividad socioeconómica y las actividades recreativas se ven especialmente afectadas. El problema surge a partir de la estructura, función y mecanismos únicos de reparación del cartílago articular.1 Lesión de Cartílago y Reparación El cartílago articular es un tejido aneural. El cartílago cubre y protege la placa de hueso subcondral ricamente inervado, una vez que se daña el cartílago articular puede producirse dolor por el contacto de la capa de hueso subcondral. Si no se desarrolla una respuesta de reparación la carga será soportada por el hueso subcondral expuesto. Esta situación resultará en una sobrecarga que dará como resultado la ampliación del defecto. La articulación opuesta se expondría a una 39 superficie de hueso desnudo con la degradación erosiva resultante de su superficie de cartílago. La articulación resultante hueso con hueso es, por definición, la osteoartritis. Se pueden presentar síntomas de la estimulación directa de la placa ósea subcondral o de la estimulación indirecta al hueso a través de un colgajo de cartílago adherido. Los productos de degradación del cartílago junto con las enzimas liberadas pueden causar derrames en la articulación, distensión capsular o sinovitis como otros mecanismos del dolor. A medida que la región subcondral se esclerosa, se produce una congestión vascular secundaria en la cavidad medular que puede causar un dolor intenso. La reparación del cartílago sería beneficiosa a corto plazo para aliviar los síntomas y, a largo plazo, para prevenir la degradación progresiva de las superficies articulares de la articulación y el desarrollo de la osteoartritis. Por lo tanto, el objetivo de la reparación del cartílago es producir un tejido que llene el defecto, se integre con el cartílago articular adyacente y la placa ósea subcondral, tenga las mismas propiedades mecánicas, viscoelásticas y mantenga su matriz a lo largo del tiempo sin descomponerse. Es decir, el objetivo es restaurar la unidad funcional osteocondral con un tejido de reparación que se aproxime a la regeneración. La evidencia clínica y experimental muestra que el daño que involucra la superficie del cartílago sufre poca restauración. El cartílago tiene poca capacidad instrínseca para sanar. Los condrocitos en el cartílago articular maduro rara vez se dividen, y su densidad disminuye con la edad. En contraste, las lesiones que se extienden a la médula subcondral pueden curarse clínicamente. Por lo tanto, una fuente celular para la regeneración o reparación del cartílago debe surgir de la médula ósea subcondral subyacente, el tejido sinovial adyacente o una fuente exógena. La ausencia de suministro de sangre y la fuente endógena de nuevas células contribuyen a la incapacidad de reparación del cartílago. La respuesta típica de cicatrización de heridas de hemorragia, formación de coágulos de fibrina y movilización de células y factores de crecimiento está ausente. La única reacción de reparación espontánea puede ocurrir en el borde de las lesiones superficiales 40 del cartílago articular. El cartílago articular se aísla de las células de la médula ósea subcondral por la densa matriz subcondral y del cartílago. La reparación del cartílago depende de la movilización de células derivadas de la médula ósea subcondral, que incluye células multipotenciales, osteoblastos, condroblastos, fibroblastos y células hematoprogenitoras. Por lo tanto, el tejido de reparación resultante puede ser variable dependiendo de la línea celular predominante que prolifera y su modulación por factores de crecimiento locales, citoquinas y entorno médico local. El espectro de tejido de reparación clínicamente es variable, dependiendo de la técnica clínica utilizada, así como de los factores intrínsecos y locales. El tejido de reparación puede ser tejido fibroso, tejido de transición, fibrocartílago, cartílago hialino, cartílago articular, hueso o una mezcla de estos tejidos. El tejido fibroso consiste en fibrocitos y una matriz fibrosa de colágeno tipo I, el tejido de transición consiste en células ovoides que pueden producir proteoglicanos, así como una matriz fibrosa. La matriz puede teñirse positivamente con safranina O para la producción de proteoglicanos. El fibrocartílago consiste en células redondas de condrocitos con una matriz fibrosa de colágeno tipo I. El cartílago hialino consiste en condrocitos en una matriz de colágeno tipo II y proteoglicanos, con un aspecto hialino de vidrio esmerilado mediante microscopía óptica. La organización celular y de la matriz puede ser diferente del cartílago articular normal. El cartílago hialino se asemeja al cartílago articular normal. El cartílago hialino es esencialmente un tejido regenerador con condrocitos articulares, dispuesto en las columnas de empalme habituales que se encuentran en el cartílago articular normal, con marcadores de la matriz del cartílago articular normal, que incluye colágeno tipo II, proteoglicanos, etc., puede haber una mezcla de todos estos componentes en un sitio de reparación único. El tipo de reparación predominante determinará el resultado a largo plazo del paciente. Si la mayor parte del tejido de reparación es hialino o cartílago articular, entonces las propiedades viscoelásticas que se encuentran con un marco de colágeno tipo II y proteoglicanos darán una reparación duradera y generalmente un resultado clínico superior. Las reparaciones de fibrocartílago y fibrosas consisten en 41 colágeno tipo I, que generalmente no es tan fuerte como el colágeno tipo II y que a menudo contiene proteoglicanos de cadena corta. Las reparaciones de fibrocartílago y fibrosas no mantienen una densidad de carga negativa alta, son suaves y se descomponen. Los factores que pueden influir en la calidad de la reparación del tejido observado clínicamente incluyen la agudeza de la lesión, la edad, el tamaño del defecto, la estabilidad ligamentaria, la alineación axial y la presencia o ausencia de menisco. 1 Clasificación de las Lesiones Condrales El cartílago articular puede ser sujeto a diferentes tipos de lesión los cuales evocan respuestas distintas.6 Figura 3. Tipos y profundidad de las lesiones condrales: A Cartílago sano, B. Lesión superficial (espesor parcial), C. Lesión profunda (espesor total), D. Lesión osteocondral (inductora de fibrocartílago). Reproducido de: Simon, T. (2010). Cartilage Regeneration and Repair Testing in a Surrogate Large Animal Model, Tissue Engineering: Part B, Volume 16, Number 1 En las lesiones superficiales (espesor parcial) el defecto penetra hasta la zona intermedia; estas lesiones se encuentran aisladas de flujo vascular y del espacio medular óseo. No inducen respuesta de reparación. En las lesiones profundas 42 (espesor total) el defecto se extiende hasta la zona calcificada y el hueso subcondral, pero sin penetrarlo, razón por la cual no inducen la reparación desde el espacio medular óseo. Las lesiones osteocondrales penetran las 4 zonas del cartílago extendiéndose hasta el hueso subcondral, permeabilizando el espacio medular hacia la articulación, razón por la cual inducen una respuesta de reparación de fibrocartílago. CLASIFICACION DE LAS LESIONES CONDRALES Y ESCALA DE LA SOCIEDAD INTERNACIONAL DE REPARACIÓN DE CARTÍLAGO (ICRS) PARA LA EVALUACIÓN ARTROSCÓPICA DEL TEJIDO DE REPARACIÓN DEL CARTÍLAGO ARTICULAR La Sociedad Internacional de Reparación de Cartílago (ICRS por sus siglas en inglés), fue fundada en el año de 1997 en Friburgo, Suiza durante el Simposio Internacional de Reparación Condral. Actualmente está constituida por 1100 miembros activos de mas de 60 países y representa la sociedad reguladora más importante en conceptos y actualizaciones en el campo de la reparación condral. Figura 4. Tipos y profundidad de las lesiones condrales de acuerdo con la clasificación ICRS(International Cartilage Repair Society). 43 GRADO DESCRIPCIÓN 0 NORMAL 1 CERCANO A LO NORMAL. 1A. FIBRILACIÓN SUPERFICIAL O REBLANDECIMIENTO DEL CARTÍLAGO 1B. FISURAS SUPERFICIALES Y LACERACIONES 2 ANORMAL LESIONES MENORES DEL 50% DE LA PROFUNDIDAD DEL CARTÍLAGO. 3 SEVERAMENTE ANORMAL 3A. LESIONES MAYORES DEL 50% DE LA PROFUNDIDAD DEL CARTÍLAGO, SIN ALCANZAR LA LÁMINA CALCIFICADA. 3B. LESIONES MAYORES DEL 50% DEL CARTÍLAGO ABARCANDO LA LÁMINA CALCIFICADA. 3C. DEFECTO TOTAL CON COMPROMISO DE LA PLACA ÓSEA SUBCONDRAL. 3D. SE INCLUYEN AMPOLLAS 4 SEVERAMENTE ANORMAL 4A. LESIONES OSTEOCONDRALES QUE SE EXTIENDEN HASTA LA PLACA ÓSEA SUBCONDRAL. 4B. DEFECTOS PROFUNDOS QUE ABARCAN EL HUESO TRABECULAR Tabla 1. Descrición de los tipos y profundidad de las lesiones condrales de acuerdo con la clasificación ICRS (International Cartilage Repair Society). En el año 2000 la sociedad publicó su Escala de Reparación de Tejido Condral, la cual consiste en una evaluación artroscópica de las siguientes características en el tejido reparado mediante cualquier técnica de reparación de cartílago: 44 Tabla 2. Se muestran los diferentes ítems evaluados de la reparación del Tejido Condral de acuerdo con la ICRS (International Cartilage Repair Society), 2000. Tabla 3. Estadificación por Grado de acuerdo con el puntaje obtenido, ICRS (International Cartilage Repair Society), 2000. 45 Evaluación del Cartílago Articular por Imagen Radiografía Simple La evaluación radiológica de la rodilla puede proporcionar una gran cantidad de información cuando se realizan las radiografías adecuadas y se reconocen los patrones de desgaste. Una serie estándar de radiografías digitales debe incluir una radiografía de alineación axial anteroposterior (AP) de 54 pulgadas (con marcadores radiográficos para aumento), AP (anteroposterior) bilateral, PA (postero anterior) de pie en flexión de rodilla de 45° (PA; Proyección de Rosenberg) y una “skyview” tangencial a 45° en supino. Las radiografías en posición supina AP de la rodilla no deben realizarse porque no son útiles para determinar el espacio de la articulación del cartílago y, por lo tanto, el potencial de la cirugía de preservación de la articulación. Los pacientes referidos para el tratamiento con frecuencia tienen imágenes por resonancia magnética de alta resolución y fotografías de artroscopia disponibles. Sin embargo, no tienen radiografías de pie, lo que demostraría si tienen osteoartritis hueso sobre hueso preexistente. Las radiografías simples nos informan que estos pacientes no son adecuados para la reparación de cartílago en función de sus cambios hueso sobre hueso, pero aún pueden ser adecuados para osteotomía o posiblemente un reemplazo uni o bicompartimental lo que representa la realización de intervenciones tempranas en osteoartritis. La osteoartritis tricompartimental avanzada es extremadamente rara, excepto en presencia de enfermedad unicompartamental avanzada con subluxación tibio femoral. Ahlback1 revisó una población sueca de la región de Estocolmo y publicó su informe en 1968. Revisó radiografías con pesas de 1,800 rodillas de aproximadamente 1,200 pacientes. Una serie que examinó presentaba estrechamiento del espacio articular comprometiendo 370 rodillas de 281 pacientes. Se tomaron proyecciones AP (pero no proyecciones PA) de pie, axiales patelofemorales con 20° de flexión y laterales en supino. 46 Figura 5. Diagrama de Venn que representa los patrones de desgaste articular encontrados, Ahlback, 1968. Los patrones de desgaste artrítico predominantes en las articulaciones medial y patelofemoral ocurren en 80% de los pacientes. El compartimento lateral generalmente se desgasta en la región posterior. Estos números pueden cambiar ligeramente si se incluyen las vistas de PA en pie. En cualquier caso, los diagramas de Venn demuestran que el desgaste unicompartamental y bicompartamental son más comunes que el desgaste tricompartimental. Por lo tanto, la artroplastia total de rodilla puede ser una solución demasiado agresiva para la osteoartritis en una población de pacientes más jóvenes. La reparación del cartílago, posiblemente combinada con osteotomía, o artroplastia uni o bicompartamental cuando existen cambios hueso sobre hueso, puede ser más adecuada en un intento de preservar la articulación el mayor tiempo posible.1 47 Resonancia Magnética La sospecha clínica de un defecto del cartílago articular puede confirmarse mediante imágenes de resonancia magnética (RMN) o artroscopia. Aunque la artroscopia es el estándar de oro para la evaluación de las lesiones de la superficie articular, la RMN se considera actualmente el mejor medio de diagnóstico no invasivo, con alto contraste y capacidad multiplanar. En el primer estudio in vitro dedicado a correlacionar la apariencia de imágenes de cartílago bovino obtenidas mediante Resonancia Magnética con la histología del mismo, Lehner y col.8 en el año de 1989 demostraron la existencia de dos zonas de cartílago con diferentes tiempos de relajación en las secuencias T1 y T2. Con el uso de secuencias de pulso más intensas (en T2), el comportamiento magnético de estas dos zonas demostraba dos diferentes intensidades, una capa hipotensa superficial y una capa profunda que demostraba una mayor intensidad de la señal, conformándose así una estructura de apariencia bilaminar. Las técnicas actuales de reparación condral, incluyendo el implante de condrocitos autólogos, requieren de un método de evaluación no-invasivo tanto para el diagnóstico preciso de la lesión, como para la monitorización postoperatoria del tejido de reparación; esto con la finalidad de detectar complicaciones tempranas relacionadas a la técnica de reparación, así como para poder observar el proceso de maduración normal del tejido en cualquier fase del seguimiento. La toma artroscópica de biopsias del tejido reparado representa un método invasivo asociado además a la morbilidad postquirúrgica lo cual limita su uso; no obstante la resonancia magnética con mapeo T2 permite una evaluación in-vitro del cartílago articular, convirtiéndola en una herramienta potencial muy poderosa para la evaluación no-invasiva del estado del cartílago reparado.9 El rendimiento de la RMN en la detección de lesiones condrales, dependerá del equipo que se use, siendo necesario para la evaluación de cartílago articular contar con resonadores de alto campo, de 1.5 ó 3 Tesla. La sensibilidad de la RMN es directamente proporcional a la magnitud en cuanto a superficie condral comprometida y profundidad de la lesión. Por otro lado, los cartílagos de mayor 48 grosor como los de la rodilla son más fáciles de evaluar que los cartílagos de aquellas articulaciones más pequeñas. Es importante, siempre y en todos los exámenes de RMN articular, buscar en forma dirigida las lesiones condrales, pues es habitual que, al revisar retrospectivamente y comparar con hallazgos quirúrgicos, se vean lesiones que pasaron desapercibidas en la primera lectura. Las características de las lesiones condrales, especialmente cuando son focales y únicas, que debemos precisar en el informe de la RMN se resumen a continuación: 1. Extensión en superficie midiendo extensión AP y transversal. 2. Profundidad de la lesión (porcentaje del espesor del cartílago comprometido). 3. Ubicación en la superficie articular (compromiso de zona de carga). 4. Alteraciones del hueso subcondral (edema, quistes) 5. Cuerpos condrales u osteocondrales intraarticulares.10 49 Figura 6. Cortes sagitales del compartimento femorotibial lateral de la rodilla, potenciado en DP con saturación de grasa (a) y T2 (b). Se puede ver una lesión condral focal de espesor total, de origen traumático.10 Recientemente, han sido desarrolladas numerosastécnicas cuantitativas de resonancia magnética incluyendo el Tiempo de Relajación T2, el retraso en la resonancia magnética mejorada del cartílago con gadolinio (dGEMRIC por sus siglas en inglés) proyección de reconstrucción de tiempo corto por eco y espectroscopia de cartílago con sodio (Na23); todas con la finalidad de evaluar diferentes aspectos de la matriz extracelular del cartílago articular. El Refuerzo retardado con gadolinio consiste en inyectar por vía intravenosa gadolinio iónico, que tiene cargas negativas, y efectuar movilidad activa y ejercicio de la articulación en estudio lo que permitiría paso de contraste hacia el líquido sinovial. Este método permite evaluar la concentración de proteoglicanos en el cartílago articular. Este estudio se basa en las cargas negativas que tienen los 50 glicosoaminoglicanos, que son las subunidades de proteoglicanos. Se conoce que con los procesos degenerativos y de envejecimiento del cartílago articular, disminuye la cantidad de glicosoaminoglicanos (carga negativa), el contraste (carga negativa) será repelido y no penetrará por difusión al cartílago. Cuando la cantidad de glicosoaminoglicanos está disminuida, permite que el contraste penetre e impregne el cartílago en zonas alteradas. Esta mayor captación se puede representar en imagen color. 1-10 El mapeo del tiempo de relación en T2 es una de las técnicas más investigadas pues provee información sobre la integridad estructural de la matriz extracelular, específicamente de la red de colágena y la proporción de agua del cartílago. 11 Los tiempos de relajación T2 en el cartílago normal, son menores en las capas más profundas donde el entrelazado de fibras de cartílago es más compacto y hay menos cantidad de agua. Los tiempos de relajación T2, aumentan hacia las proporciones más superficiales del cartílago. Este método se basa fundamentalmente en que las alteraciones degenerativas producen desorganización de la matriz de colágeno, la que se hace más laxa permitiendo mayor contenido de protones de H2O los que además están más libres, lo que produce aumento de los valores de relajación T2, por sobre niveles normales, por lo tanto, cuando las fibras de colágeno se rompen, se produce mayor motilidad del agua, de manera que se incrementa el tiempo de relajación. El tiempo de relajación se expresa en milisegundos (MS). Existe un software que automáticamente genera mapas de color, basados en una escala de valores de las secuencias de pulso (T2). Se obtiene así un mapa de valores T2 de los tejidos incluidos en un plano, con rangos de colores de equivalentes numéricos elegidos por el operador. El valor numérico de un área específica (área de la lesión condral), se puede obtener al delimitar espacios geométricos que enmarcan la lesión.10 51 Figura 7. Se muestra un ejemplo de la imagen y la escala de colores, de los valores obtenidos del mapeo T2 del cartílago del cóndilo femoral medial de un paciente asintomático. El color azul en este caso está predeterminado a 80 milisegundos y el color rojo a 20 milisegundos. Los colores intermedios representan el rango entre los 2 parámetros de milisegundos establecidos.10 Figura 8. Mapa T2 con escala de colores de cartílago rotuliano normal, donde la parte más profunda muestra coloración roja, indicando niveles más bajos de tiempos de relajación T2, la parte central coloración amarilla y la zona más superficial coloración verde indicando niveles más altos de T2. 10 52 Figura 9. Mapa T2 color en dos pacientes distintos, mostrando zonas alteradas (flechas) con aumento de niveles T2 en el espesor del cartílago articular. 10 TRATAMIENTO DE LAS LESIONES DEL CARTÍLAGO ARTICULAR DE RODILLA En términos generales, los objetivos del tratamiento de la reparación del cartílago articular son: la reducción del dolor, la mejoría de los síntomas, la funcionalidad a largo plazo, la prevención de osteoartritis (OA) con la subsecuente prevención de reemplazo articular, así como la reestructuración de cartílago hialino y no de tejido fibroso. En general, el tratamiento se divide en tratamiento conservador y tratamiento quirúrgico. 12 53 Tabla 4. Distintos Tipos de tratamiento Conservador y quirúrgico para lesiones de cartílago articular de rodilla. 12 En una reciente actualización Brittberg y col. 12 describen la importancia de determinar la etiología de la lesión del cartílago como se describe a continuación: I. Defectos Traumáticos Agudos con más o menos cartílago íntegro en la periferia. II. Lesiones Degenerativas secundarias a traumatismos repetitivos donde el cartílago circundante es de menor calidad. III. Lesión Celular y de la Matriz, Osteoartrosis → Enfermedad Articular De la misma forma Brittberg y col. 12 representan dos escenarios, el primero cuando se diagnostica una lesión condral aislada sin progresión y el segundo cuando se diagnóstica una lesión de cartílago más lesiones concomitantes (meniscales y ligamentarias) que pueden precipitar el desarrollo de OA 54 TRATAMIENTO DE ACUERO A LA CLASIFICACIÓN DE ICRS I y II – Desbridamiento en presencia de síntomas Mecánicos III y IV- Técnicas en reparación de Cartílago TRATAMIENTO CONSERVADOR (FISIOTERAPIA) No existen estudios para comparar solo fisioterapia vs Reparación del Cartílago. Helmar y col. Ejercicio físico induce aumento concentración perisinovial de IL-10 lo que induce un efecto antiinflamatorio y condroprotector, en base a lo anterior se pude asumir que la fisioterapia presenta un efecto beneficioso en OA y Reparación de Cartílago. TRATAMIENTO CONSERVADOR (PRP-Stem Cells) Se piensa que estimulan la reparación del cartílago dañado. La mayoría de los estudios clínicos se han realizado en OA – enfermedad orgánica. No se ha demostrado una reparación completa en lesiones de cartílago localizadas. Shi y col. realizaron una búsqueda en PUBMED, Embase y Cochrane, con las siguientes palabras clave “Terapia Biológica en lesiones osteocondrales”, incluyeron 21 Estudios, Ensayos Clínicos con al menos 3 meses de seguimiento, Lesiones Grado I – III de la clasificación ICRS, todos los estudios donde se realizó tratamiento con PRP demostraron mejoría clínica con respecto a satisfacción del paciente, dolor y función, un estudio donde se realizó tratamiento con PRP publicó 2da. Vista Artroscópica y reportó aumento de tejido de reparación de cartílago. Todos los estudios con MSC (terapia con células madre) y seguimiento con RMN y 7 estudios MSC con 2ª. vista artroscópica reportaron mejoría en términos de cobertura, relleno del defecto y firmeza. Los autores concluyen que los dos tratamientos muestran efecto modificador de la enfermedad significativo “Aún así la eficacia de la Terapia PRP sigue siendo impredecible debido a la heterogenicidad, naturaleza de los estudios publicados y 55 la composición variable de los preparados de PRP, esto es similar en MCS debido a la alta variabilidad celular y estudios reportados”. TRATAMIENTO COSERVADOR (CORTICOESTEROIDES) Diversos estudios han reportado su intervención en la OA postraumática en el momento de la lesión articular donde se presentan de forma temprana cambios sustanciales en la matriz. Sin embargo, Latterman y Col. demuestra que la intervención temprana con corticoesteroides fue capaz de afectar los biomarcadores de cartílago en comparación con un grupo control (solución salina). Los corticoides se utilizan principalmente en la OA con sinovitis, pero el estudio publicado por Latterman y col. puede representar una alternativa donde los corticoesteroides pueden prevenir el daño del cartílago postraumático. TRATAMIENTO CONSERVADOR (BOTOX) En un estudio controlado aleatorizado reciente no hubo diferencia estadísticamente significativa entre inyecciones de toxina botulínica para reducir el dolor en la 8va. semana en comparacióncon el inicio en pacientes con OA de rodilla, de igual manera se indentificaron problemas de seguridad. TRATAMIENTO CONSERVADOR (ÁCIDO HIALURONICO-CONDROITIN SULFATO Y GLUCOSAMINA) En una revisión reciente, Gallagher et al. concluyeron que para los pacientes con riesgo de osteoartritis, el uso de la glucosamina y el sulfato de condroitina pueden servir como un medio de protección del cartílago y retrasar la progresión de la OA. Inyecciones de ácido hialurónico mostraron eficacia variable, mientras que los AINE y las vitaminas E y D no mostraron ningún efecto sobre la progresión de la osteoartritis, en la mayoría de los casos esos tratamientos se utilizan para el alivio del dolor. TRATAMIENTO QUIRÚRGICO (TÉCNICAS DE ESTIMULACIÓN DE MÉDULA ÓSEA) Técnicas de Estimulación de Médula Ósea + Andamios: 56 AMIC (Condrogénesis Autóloga inducida por Matriz). Membrana de Colágeno I y III. Membrana de Ácido Hialurónico (Hyaff-11) Gobbi y Whyte publicaron que el Hyaff-11 también se ha combinado con Concentrados de Aspirados de Médula Ósea, produciendo mejores resultados a largo plazo en un seguimiento a 5 años vs microfracturas. Otros biomateriales como Membranas Bifásicas Colágeno e Hidroxiapatita combinados con Magnesio han sido probadas en un estudio multicéntrico vs. microfracturas obteniendo mejores resultados en lesiones osteocondrales deportivas. Bioandamios líquidos, inyecciones de termogel de combinados de Quitosana y sangre venosa que inyectadas en la zona de lesión creando un “superclot” para la quimiotaxis de células de la médula ósea + MFX demostraron mejores resultados que MFX aisladas.12 El tratamiento quirúrgico de las lesiones de cartílago articular de rodilla, menores a 2 cm2 comprende: a) microfracturas (MFX), b) la transferencia autóloga de injertos osteocondrales y c) el implante de condrocitos autólogos (ACI, por sus siglas en inglés). MICROFRACTURAS. Son el tratamiento de primera elección para los pacientes con defectos de cartílago articular de rodilla con superficie delimitada y espesor total. El propósito de esta técnica es crear un coágulo rico en plaquetas, factores de crecimiento y células totipotenciales derivadas de la médula ósea del paciente en el sitio del defecto condral. Esto se logra a través de perforaciones realizadas en el fondo del mismo. En una revisión sistemática reciente, se resumieron 28 trabajos que incluían 3122 pacientes. El seguimiento promedio fue de 41 meses con solo 5 estudios que reportaron 5 años o más. La técnica de MFX fue electiva en la evaluación clínica después de los primeros 24 meses de la intervención, sin embargo, los reportes en la actualidad no son consistentes. En un estudio previo realizado por el Servicio de Ortopedia del Deporte y Artroscopia del Instituto Nacional de Rehabilitación, 57 Villalobos y col.13 realizaron seguimiento clínico de 5 años a los pacientes operados mediante microfracturas, encontrando disminución significativa en la funcionalidad de la rodilla así como aumento del dolor a partir de los 3 años del postoperatorio. En cuanto al tejido de reparación obtenido con la técnica de MFX desde el punto de vista artroscópico, se espera que haya tejido de reparación en el 45% a 77% después de 8 a 24 meses de la intervención. Sin embargo, en la evaluación histológica del tejido de estudios humanos solo se ha reportado en 6 estudios. Se ha encontrado fibrocartílago en el 33 a 57% de las biopsias. En 1999 Steadman y col.24 documentaron que la fractura no alcanza la profundidad suficiente para llegar a grandes vasos, pericitos y células mesenquimales podrían ser atraídos y migrar a área del defecto para iniciar un proceso de reparación, las perforaciones profundas han demostrado que producen más reparación que las microfracturas, actualmente las nanoperforaciones se encuentran en estudio para mejores resultados.12 Comparado con técnicas que involucran cultivos celulares, la histología presenta menor cantidad de colágeno tipo II y de proteoglicanos propios del cartílago articular.14 Las guías quirúrgicas actuales recomiendan las microfracturas para defectos menores de 2 cm2 de superficie. 15 AUTOINJERTO OSTEOCONDRAL Esta técnica de tratamiento para las lesiones de cartílago articular consiste en la transferencia autóloga de cilindros de cartílago y hueso desde zonas de no- carga al sitio de la lesión. Su uso se puede extender a zonas articulares distintas a la rodilla. La técnica está indicada para lesiones menores a 2 cm2. Se ha reportado hemartrosis que persiste y puede recurrir, proviniendo de la zona donadora. Existe crecimiento de tejido fibroso entre los cilindros implantados e inevitablemente se produce una incongruencia de la superficie articular entre la zona sana y los injertos además de que existe irregularidad entre la convexidad de ambas zonas. Se ha reportado pérdidad de viabilidad celular en los bordes del cilindro osteocondral. 15 58 Implante de Condrocitos Autólogos (ACI por sus siglas en inglés) Inicialmente en Suecia, el Dr. Lars Petterson, Mats Brittberg y col.14 pioneros en esta técnica desarrollaron un protocolo de investigación aprobado por el comité de ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Götenborg y de acuerdo con la legislación vigente en Suecia, (brittberg,1994 NEJM) y en el año de 1994 publicaron los resultados del tratamiento de defectos profundos de cartílago en la rodilla con el denominado Trasplante de condrocitos autólogos, donde describen la realización de esta técnica en 23 pacientes con edades de 14 a 48 años de edad lo cuales presentaban defectos de cartílago de espesor total con medidas de 1.6 a 6.5 cm2, obtuvieron condrocitos de vía artroscópica de una zona de cartílago sano los cuales fueron aislados y cultivados en laboratorio por 14 a 21 días, posteriormente el cultivo de condrocitos fue implantado de en el área de cartílago previamente dañado y cubierto con un flap de periostio tomado de la región proximal medial de la tibia, se realizó evaluación clínica y artroscópica posterior al implante tomando biopsia de la región implantada, los paciente tuvieron un seguimiento de 16 a 66 meses (media 39), de forma inicial dicho tratamiento eliminó el bloqueo articular, disminuyó el dolor y la inflamación en todos los pacientes, tres meses después la artroscopía demostró que los implantes estaban al nivel del tejido circundante, esponjosos y con bordes visibles cuando éstos fueron examinados, una segunda evaluación artroscópica demostró que los implantes tenían la misma apariencia macroscópica observada previamente pero con una consistencia firme y una apariencia similar al cartílago circundante, 2 años después de los implantes 14 de 16 pacientes tuvieron resultados buenos a excelentes, dos pacientes requirieron de una segunda intervención porque desarrollaron un defecto central severo en los implantes acompañándose de bloqueo y dolor, en una media de 36 meses lo resultados fueron buenos a excelentes en 2 de 7 pacientes con implantes en región patelar, razonables en tres y pobres en 2 pacientes los cuales requirieron una segunda intervención debido a que presentaban una condromalacia severa, las biopsias demostraron que 11 de 15 implantes femorales y 1 de 7 implantes patelares tenían apariencia de cartílago hialino, lo anterior representa la 1era. Generación del implante de condrocitos autólogo, donde los autores concluyeron que trasplante de 59 condrocitos autólogo puede ser usado como tratamiento para defectos profundos de cartílago en el compartimento femorotibial. Figura 10. Diagrama descriptivo de la técnica original descrita por Peterson y col.16 El trasplante de condrocitos autólogo es conocido como Autologous Chondrocyte Implantation (ACI, por sus siglas en inglés) en Norte América. El Dr. Tom Minas formó parte del equipo de trabajo
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