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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
MAESTRÍA EN CIENCIAS (NEUROBIOLOGÍA) 
INSTITUTO DE NEUROBIOLOGÍA 
 
 
ACTIVACIÓN DEL INFLAMASOMA P2X7/NLRP3 EN EL SISTEMA NERVIOSO 
CENTRAL EN RESPUESTA AL DAÑO HEPÁTICO INDUCIDO POR LIGADURA DEL 
CONDUCTO BILIAR 
 
TESIS 
 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
MAESTRA EN CIENCIAS 
 
PRESENTA: 
 
Kathia Georgina Téllez Pimienta 
 
 
TUTORES 
 
Dr. Francisco Gabriel Vázquez Cuevas 
Dra. Anaid Antaramian Salas 
 
Unidad de Proteogenómica 
Laboratorio de Fisiología Celular 
 
 
MIEMBROS DEL COMITÉ TUTORAL 
 
Dra. Verónica Mireya Rodríguez Córdova 
Dra. Rebeca Corona García-Cabral 
 
 
 
 
MÉXICO, septiembre de 2019. 
 
Margarita
Texto escrito a máquina
Instituto de Neurobiología
Margarita
Texto escrito a máquina
Margarita
Texto escrito a máquina
Margarita
Texto escrito a máquina
CIUDAD DE
Margarita
Texto escrito a máquina
Margarita
Texto escrito a máquina
Margarita
Texto escrito a máquina
 
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fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El presente trabajo se desarrolló en el laboratorio de Fisiología Celular (B-11) con el 
apoyo de la Unidad de Proteogenómica del INb, bajo la tutoría del Dr. Francisco G. 
Vázquez Cuevas y la Dra. Anaid Antaramian Salas. El proyecto fue financiado por un 
donativo del programa PAPIIT-UNAM, No. IN201017 para FGVC. Kathia G. Téllez 
recibió una beca del CONACyT-México para estudios de maestría, No. 857232/635391. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Universidad Nacional Autónoma de México 
Instituto de Neurobiología 
Los miembros del Jurado certificamos que la tesis elaborada por: Kathia Georgina 
Téllez Pimienta, cuyo título es: “Activación del inflamasoma P2X7/NLRP3 en el sistema 
nervioso central en respuesta al daño hepático inducido por ligadura del conducto biliar” 
se presenta como uno de los requisitos para obtener el grado de Maestría en Ciencias 
(Neurobiología) y cumple con los criterios de originalidad y calidad requeridos por la 
División de Estudios de Posgrado de la Universidad Nacional Autónoma de México. 
 
 Firma 
 
Presidente 
Dr. Carlos Guillermo Martínez Moreno ____________________ 
 
Secretario (Tutor) 
Dr. Francisco Gabriel Vázquez Cuevas ____________________ 
 
Vocal 
Dra. Laura Cristina Berumen Segura ____________________ 
 
Suplente 
Dra. Rebeca Corona García-Cabral ____________________ 
 
Suplente 
Dr. Adán Hernández Cortés ____________________ 
 
 
 
 
 
Aprobado por el Comité Académico 
 
 
 
 
 
_______________________________ 
Dra. Maricela Luna Muñoz 
Coordinadora del Programa de la Maestría en Ciencias (Neurobiología) 
 
 
 
 
 
 
 
DEDICATORIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Para Omar 
Para Monse, Fer y Amanda 
Para Teresa y Enrique 
Con profundo amor 
 
 
 
 
 
Ningún 
es pequeño 
. / 
y n1ngun 
dueño 
grande 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
Al Dr. Francisco Gabriel Vázquez Cuevas y la Dra. Anaid Antaramian Salas, por confiar 
en mí e incluirme en sus proyectos, permitiéndome aportar conocimiento, aprender 
y brindarme apoyo y paciencia. 
A la Dra. Verónica Mireya Rodríguez Córdova y Dra. Rebeca Corona García-Cabral, por 
ser miembros de mi comité tutor de una manera activa, crítica y con el apoyo 
suficiente y necesario para lograr este proyecto, y por sus aportaciones para 
mejorarlo. 
A la M. en C. Adriana González-Gallardo de la Unidad de Proteogenómica (INB, 
UNAM), por su invaluable apoyo y acompañamiento estos meses. 
A la Dra. Alejandra Castilla León y M.V.Z. José Martín García Servín del Bioterio (INB, 
UNAM) por facilitarme los animales de experimentación. 
A la Dra. Olivia Vázquez-Martínez por el apoyo técnico recibido en el laboratorio de 
fisiología celular. 
A la Biól. María Soledad Mendoza Trejo por el apoyo en los estudios de actividad 
locomotora. 
A la Dra. Xóchitl Zambrano Estrada de la UAQ por su colaboración en el estudio 
histopatológico. 
A la M. en C. Irma A. González Luna por su apoyo técnico. 
A la Dra. Deisy Gasca Martínez, Responsable de la Unidad de Análisis 
Conductual (INB, UNAM). 
Al personal de la Unidad de Microscopía por su invaluable apoyo en el procesamiento 
de los cortes histológicos, especialmente en las tinciones y uso del microscopio: 
Dra. Ericka A. de los Ríos Arellano, ISC. Elsa Nydia Hernández Ríos e IBQ. Ma. De 
Lourdes Palma Tirado. 
Al personal del INB que me apoyó de alguna manera: Dra. Maricela Luna 
(Coordinadora del Programa de Maestría), M. en C. Leonor Casanova, Dra. Nuri 
Aranda, Lic. Lourdes Lara Ayala (audiovisual), Lic. Francisco Valles y demás 
personal de la biblioteca. 
A mis compañeros que me enseñaron alguna técnica o parte de ésta: al Biól. José 
Almonte, la médica Jovana Pastén y a la M. en C. Patricia Juárez. 
A mi familia por el apoyo, el amor, la ternura y la paciencia que contribuyeron a lograr 
este proyecto: Omar, Monse, Fer, Amanda, Madre, Padre, Ani, Yorch, Ainhoa, Aldo 
y Axi. 
 
 
 
 
6 
 
 
ÍNDICE 
 
ÍNDICE ............................................................................................................................ 6 
RESUMEN ....................................................................................................................... 7 
SUMMARY ...................................................................................................................... 8 
MARCO TEÓRICO .......................................................................................................... 9 
OBJETIVOS .................................................................................................................. 27 
1. Modelo experimental: ligadura del conducto biliar en ratón ................................... 28 
2. Diagrama de flujo del diseño experimental............................................................. 29 
3. Registro semanal de peso ...................................................................................... 29 
4. Pruebas conductuales: olfativa y actividad locomotora .......................................... 30 
4.1 Prueba olfativa: habituación y deshabituación .................................................. 30 
4.2 Prueba de actividad locomotora en registro de campo abierto ......................... 32 
5. Concentración de amonio en suero sanguíneo ................................................... 33 
6. Análisis histológico ................................................................................................. 33 
7. Análisis del nivel de expresión de los transcritos de interés ................................... 34 
8. Extracción de ácido ribonucléico mensajero (mRNA) y reacción de transcripción 
reversa ....................................................................................................................... 34 
8.1 Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (cuantitativa) ................. 35 
RESULTADOS .............................................................................................................. 37 
1. La LCB no induce cambios en la ganancia de peso corporal ................................. 37 
2. La LCB conduce a hiperamonemia ........................................................................ 37 
3. Existen alteraciones histopatológicas severas inducidas porla LCB. .................... 38 
4. La ligadura de conducto biliar en ratones indujo cambios conductuales ................ 41 
4.1 La LCB altera la habilidad para discriminar los aromas, pero no la latencia de 
olfateo ..................................................................................................................... 42 
4.2 La LCB modifica la actividad locomotora de ratones C57BL/6J a las 8 semanas 
postcirugía .............................................................................................................. 42 
4.3 La distancia total es diferente entre ambos grupos ........................................... 44 
4.4 El patrón de tiempo en movimiento se modifica en el grupo de ratones LCB ... 44 
4.5 El conteo de episodios de estereotipias es diferente en el grupo experimental 45 
4.6 Los ratones con LCB recorren mayor distancia en el centro a las 18 y a las 21 
horas ....................................................................................................................... 45 
5. Regulación de transcritos de elementos del inflamasoma P2X7/NLRP3 en la 
corteza prefrontal y en el bulbo olfatorio de ratones con LCB. ................................... 46 
DISCUSIÓN ................................................................................................................... 49 
CONCLUSIONES .......................................................................................................... 53 
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 54 
 
 
 
 
 
7 
 
 
RESUMEN 
 
La encefalopatía hepática (EH) es una enfermedad comúnmente derivada de la cirrosis 
biliar, que provoca disfunción cerebral. Se ha propuesto que la inflamación crónica 
contribuye a su desarrollo. La señalización purinérgica está involucrada en el proceso 
inflamatorio, y el ATP, actuando como patrón molecular asociado al daño (DAMP) a 
través el receptor P2X7, modula la inflamación debido a que induce la activación del 
inflamasoma NLRP3, aunque se desconoce si juega un papel en la neuroinflamación 
asociada a la EH. Nuestro objetivo fue determinar si la ligadura de conducto biliar 
(LCB), induce la activación del receptor P2X7 en el sistema nervioso central (SNC), 
induciendo la actividadexpresión de componentes del inflamasoma NLRP3. En ratones 
C57BL/6J se estandarizó un modelo de LCB para inducir fibrosis, hiperamonemia y EH 
temprana. Antes y después de la cirugía, los ratones fueron sometidos a dos pruebas 
conductuales: discriminación olfatoria y actividad locomotora, con el fin de detectar 
alteraciones en el bulbo olfatorio y en la corteza prefrontal. Se evaluó el grado de daño 
hepático por tinción tricrómica de Masson y hematoxilina-eosina y se cuantificó el 
amonio en sangre. En el bulbo olfatorio y la corteza prefrontal se analizó la expresión 
relativa de los genes Casp1, IL-1β y P2X7 por medio de PCR en tiempo real. 
 
En animales con LCB se observó un aumento en la concentración plasmática de 
amonio y diversas alteraciones de la arquitectura hepática, confirmando que la LCB 
induce disfunción del órgano. Los resultados de las pruebas conductuales revelaron 
diferencias significativas en la actividad locomotora y las pruebas olfatorias entre el 
grupo experimental y el grupo con operación simulada (OS), sugiriendo la presencia de 
EH. Así mismo, en los animales con LCB la abundancia relativa de los genes IL-1β y 
P2X7 en la corteza prefrontal fue mayor, no así en el bulbo olfatorio. En conjunto 
nuestros resultados sugieren que la LCB induce la actividad del inflamasoma NLRP3 en 
regiones específicas del SNC. 
 
 
 
8 
 
 
SUMMARY 
 
 
Hepatic encephalopathy (HE) is a biliary cirrhosis-derived disease that causes cerebral, 
cognitive, and behavioral alteration. Chronic inflammation has been proposed to 
contribute to the development of HE. ATP, acting as a Damage Associated Molecular 
Pattern, is involved in the neuroinflammation associated with HE, specifically through 
P2X7 receptor that induce the aggregation of the NLRP3 inflammasome. Our objective 
was to determine if the ligation of bile duct (LBD) induces an increment in the expression 
of ATP/P2X7/NLRP3 inflammation in correlation with cognitive and behavioral 
changes. LBD was standardized in C57BL/6J mice to induce fibrosis, 
hyperammonemia, and early HE. Mice were subjected to two behavioral tests, olfactory 
discrimination and locomotor activity, in order to detect alterations in the olfactory bulb 
and in the prefrontal cortex. We assessed the degree of hepatic fibrosis by Masson´s 
trichrome staining and hematoxylin-eosin staining, and quantified the ammonium in 
blood. The relative expression of the genes Casp1, IL-1β, and P2X7 in the olfactory 
bulb and the prefrontal cortex was analyzed by real time PCR. 
In LBD animals, an increase in the plasma concentration of ammonium and 
various alterations of the hepatic architecture were observed, confirming that the LBD 
induces hepatic disease. The results of the behavioral tests revealed significant 
differences in the locomotor activity and the olfactory tests between the LBD and sham 
groups, suggesting the presence of HE. Likewise, in animals with LBD the relative 
abundance of genes IL-1β and P2X7 was greater in the prefrontal cortex but not in the 
olfactory bulb. Overall, our results suggest that LBD induces NLRP3 inflammasome 
activity in specific regions of the CNS. 
 
 
 
 
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MARCO TEÓRICO 
 
ENFERMEDAD CRÓNICA HEPÁTICA 
 
El hígado participa en el procesamiento de nutrientes, en la obtención y 
almacenamiento de energía, y en la eliminación de xenobióticos. Cuando su integridad 
se ve comprometida por diversos factores como consumo excesivo de bebidas 
alcohólicas, absceso hepático amebiano, hepatitis viral o intoxicación farmacológica, el 
hígado experimenta daño, y cuando este daño es crónico, se presenta la Enfermedad 
Crónica Hepática (ECH). 
La primera etapa característica de la ECH es la fibrosis, la cual se caracteriza por 
la acumulación aberrante de fibroblastos y la acumulación de matriz extracelular (MEC), 
con lesiones inflamatorias y alteraciones estructurales (Huang et al., 2017). 
Normalmente, la matriz extracelular se compone de fibras nerviosas, fibras de colágena 
tipo I y III, metaloproteinasas y componentes de la membrana basal y en los espacios 
sinusoidales se encuentran las células estrelladas hepáticas (CEH). En condiciones 
normales, las CEH cumplen varias funciones del hígado, como por ejemplo almacenar 
vitamina A y controlar la comunicación celular al liberar mediadores intercelulares, 
regulando su homeostasis. Cuando ocurre una lesión crónica del tejido hepático 
resultante de cualquier origen, tanto las CEH como las células productoras de la MEC 
sufren un proceso anormal que se denomina “activación”, el cual es un proceso 
patológico que se caracteriza por la pérdida de las típicas gotas de grasa, el aumento 
del número y del tamaño de las células, y la transdiferenciación fenotípica a células 
proliferativas, fibrogénicas y contráctiles muy similares a los miofibroblastos. La MEC 
sufre modificaciones en su composición y señalización celular, dando como resultado 
una serie de diversos estímulos patológicos locales. Dentro de esta compleja 
señalización, los de mayor importancia son los mediadores inductores de la 
proliferación y/o motilidad celulares como factores de crecimiento; mediadores 
fibrogénicos como el factor transformador del crecimiento tipo b1 (TGF-b1) y la 
interleucina 6, así como el aumento en la producción de colágeno tipo IV, laminina y 
entactina; mediadores inductores de la contracción de las CEH tales como la 
 
10 
 
endotelina-1, la trombina, la angiotensina II y la vasopresina; y mediadores con 
actividad antiinflamatoria y antifibrogénica: la interleucina 10 y el inteferón gamma. 
Además,durante este proceso se ven implicadas las especies reactivas de oxígeno 
(ROS), afectando el desarrollo y la progresión de diversas enfermedades debido a que 
son metabolitos tóxicos, conduciendo a la célula a la muerte (Sarem et al., 2006). 
Los hepatocitos son las células más abundantes del hígado, y forman el 
parénquima hepático, donde cumplen sus funciones. En la ECH el parénquima se daña 
y se promueve la apoptosis o la regeneración compensatoria de hepatocitos y al mismo 
tiempo se genera inflamación, fibrogénesis y desarrollo de fibrosis. 
 Debido a la organización de la circulación hepática, los hepatocitos son las 
primeras células que reciben los estímulos dañinos. Como respuesta, estas células 
liberan patrones moleculares de daño o DAMP´s cuya señalización induce la activación 
de las células estelares y estimulan a los miofibroblastos (Zhou et al., 2014). En este 
proceso también participan las células de Kuppfer y las células sinusoidales (Zhou et 
al., 2014). Las células estelares hepáticas, que almacenan vitamina A, secretan matriz 
extracelular y producen colágena, sufren un proceso de transdiferenciación 
transformándose en miofibroblastos (MFB) productores de colágena I, por lo que a 
éstos se les ha atribuido un papel precursor en la fibrosis (Hua-Zhong et al., 2017). Las 
células de Kuppfer son macrófagos especializados que residen sobre las paredes de 
los sinusoides hepáticos, cuya activación contribuye al proceso fibrótico (Zhou et al., 
2014). Las CEH activadas adoptan una estratégica ubicación perisinusoidal; extienden 
a partir de sus cuerpos varias prolongaciones primarias de 20 µm de longitud que 
corren a lo largo de uno o más sinusoides, semejando forma ameboide, revelando que 
su contracción y relajación responde a los mediadores tensoactivos (Sarem et al., 2006) 
El parénquima hepático fibrótico en estado crónico llegará a un punto de no 
retorno, tornándose cirrótico y finalmente se transformará en hepatocarcinoma. El 
cáncer es el resultado de la acción de citocinas, quimiocinas y metabolitos diversos, 
que en conjunto crean un microambiente propicio para la transformación de hepatocitos 
cirróticos en tumorales (Nishida y Kudo, 2017). 
El hígado dañado experimenta la interrupción parcial o total del flujo de bilis del 
hígado hacia el duodeno, condición conocida como colestasis. La bilis se compone de 
 
11 
 
sales biliares que son fuertes detergentes indispensables para la extracción y 
emulsificación de lípidos en el intestino, además de que contiene productos endógenos 
y toxinas resultantes del funcionamiento del hígado, muchos de ellos ricos en amoniaco 
derivado de la descomposición de las proteínas provenientes de la dieta. La 
acumulación de las sales biliares en el parénquima hepático causa daños a nivel 
celular, que inician con una cascada de eventos inflamatorios y fibrogénicos. Según la 
Organización Mundial de la Salud (2018), el hepatocarcinoma es el cáncer con mayor 
número de muertes al año junto con el cáncer de pulmón, estómago, colon y mama. 
 
Encefalopatía hepática 
 
En ocasiones, la enfermedad crónica hepática conduce a la Encefalopatía Hepática 
(EH), que es una disfunción cerebral severa. La EH se manifiesta a través de un amplio 
espectro de anormalidades neurológicas o psiquiátricas en el rango de alteraciones 
subclínicas hasta el coma. Del 5 al 25% de los pacientes con cirrosis desarrollan EH 
durante los siguientes 5 años a su diagnóstico (Cisneros-Garza et al., 2009; Vilstrup et 
al., 2014). El paciente se ve alterado en la atención, la memoria de trabajo, velocidad 
psicomotora y la habilidad visoespacial. Conforme la enfermedad avanza, se aprecian 
cambios en la personalidad como apatía, irritabilidad y desinhibición, además de 
disfunciones motoras (Vilstrup et al., 2014; Luo et al., 2015). 
En México en el año 2018, las principales causas de muerte fueron las 
enfermedades cardiovasculares, seguidas por la diabetes mellitus y los tumores 
malignos (Instituto Nacional de Geografía, Estadística e Informática INEGI, 2018), 
dentro de los cuales se ubica el carcinoma hepatocelular y cuya incidencia ha 
aumentado en las últimas décadas (González-Huezo et al., 2019), prevaleciendo las 
muertes por padecimiento hepático (INEGI, 2018). En etapas avanzadas, la 
enfermedad hepática puede inducir a la encefalopatía hepática en un 28% de los casos 
de cirrosis (Torre-Delgadillo, 2011) lo que representa un riesgo económico potencial por 
manifestarse principalmente en adultos productivos de entre 35 y 55 años de edad 
(Cisneros-Garza et al., 2009) con alteraciones subclínicas hasta en un 84% (Torre-
 
12 
 
Delgadillo, 2011). En México, se ha previsto que hacia el año 2020 existirán 
aproximadamente 1.5 millones de casos de hepatopatía crónica que serán susceptibles 
de EH, lo cual implicará un serio problema de salud pública (Torre-Delgadillo, 2011). 
 
Efecto de la hiperamonemia en el sistema nervioso central 
 
Uno de los factores que causan la encefalopatía hepática es la intoxicación cerebral por 
el exceso de amonio (Carrillo et al., 2008). El amonio (NH4+) deriva de la disociación 
del amoniaco (NH3) acumulado en el organismo y que atraviesa la barrera 
hematoencefálica provocando inflamación sistémica, neuroinflamación e intoxicación de 
la sangre (Luo et al., 2015) (figura 1). La inflamación crónica derivada de la 
hiperamonemia puede ser un elemento importante para el establecimiento de la EH 
durante la enfermedad crónica hepática (Abshagen et al., 2015). La muerte por coma 
hepático se presenta comúnmente porque la concentración de amonio en la sangre 
llega a 5 mM, por lo general en etapa cirrótica (Szerb y Butterworth, 1992). 
La principal hipótesis para explicar la toxicidad por amonio propone que en el 
SNC la estabilidad de los astrocitos y las neuronas se afecta cuando se aumentan los 
niveles de amonio (NH4+) en el cerebro. De manera regular la enzima glutamino 
sintetasa de los astrocitos forma glutamina a partir de amonio y glutamato (glu) (Szerb y 
Butterworth, 1992), no obstante, cuando la capacidad metabólica de los astrocitos es 
rebasada, el exceso de amonio eleva la osmolaridad intracelular, causando edema y 
daño a los astrocitos y, por lo tanto, inflamación (Carrillo et al., 2008). El amoniaco NH3 
se convierte en NH4+ a razón del cambio en el pH de la sustancia que lo contiene. En la 
neurona presináptica, el ión amonio (NH4+) inhibe la liberación de glutamato, impidiendo 
la generación del potencial de acción (Szerb y Butterworth, 1992). El efecto es la 
reducción de la efectividad del glutamato liberado al espacio sináptico, alterando el 
metabolismo de neuronas y astrocitos, además de afectar la integridad del ciclo de la 
glutamina. Durante la hiperamonemia persiste el exceso de glutamina y la falta de 
glutamato en los astrocitos, afectándolos ya sea por el exceso de NH3 o de que la 
glutamina sintetasa no sea suficiente porque esta última no se activa en esta condición. 
 
13 
 
Por otra parte, durante la hiperamonemia se disminuye la densidad de receptores a 
glutamato, lo que reduce las entradas excitatorias de las neuronas inhibitorias, 
causando menor liberación de GABA (ácido gama-aminobutírico). El ión amonio (NH4+) 
inhibe la liberación de glutamato por parte de la neurona presináptica y también se 
inhibe la síntesis de glutamina, impidiendo la generación del potencial de acción. Otro 
efecto de la hiperamonemia crónica es que se aumenta la recarga de triptófano y de 
serotonina, y se cree que el exceso de ésta disminuye los niveles de dopamina y de 
noradrenalina, induciendo el coma (Szerb y Butterworth, 1992). 
Por otra parte, el NH3 puede ingresar a la célula a través de los canales de Na+ y 
K+, y en forma de ión amonio NH4+; cuando esto ocurre, induce la despolarización de la 
membrana por la inactivación parcial de los canales de Na+ voltaje-dependientes,facilitado por la pérdida de K+ (Szerb y Butterworth, 1992). 
Otros efectos perjudiciales de la hiperamonemia sobre el SNC ocurren en el 
bulbo olfatorio y en la corteza cerebral, a través de la acumulación de Ca2+. Esta 
acumulación de Ca2+ afecta la actividad del complejo α-cetoglutarato deshidrogenasa, 
cuya mayor actividad se observa en el bulbo olfatorio, seguida por el mesencéfalo y al 
final, por la corteza cerebral. Además, la α-cetoglutarato deshidrogenasa se encarga de 
mediar el daño celular por estrés oxidativo, por lo que su alteración tiene efectos sobre 
los ciclos metabólicos, siendo el bulbo olfatorio una de las primeras estructuras en 
denotarlo (Gibson et al., 2005). 
Las altas concentraciones de amonio en la sangre también tienen efectos a nivel 
molecular en otras estructuras dentro del SNC. El amonio altera la neurotransmisión 
GABAérgica inhibitoria por reducción de la actividad de la enzima glutamato 
decarboxilasa, cuya consecuencia es la sobrerregulación de receptores a GABA, 
aumentando la inhibición neuronal por aumentar el tono GABAérgico. Este hecho 
contribuye a comprender los mecanismos por los cuales se alteran algunas funciones 
cognitivas como la capacidad olfatoria y la actividad locomotora (Zucco et al., 2006; 
Burnstock y Verkhratsky, 2012). 
 
 
 
14 
 
 
Figura 1. Patogenia de la EH en hígado cirrótico. La degradación de proteínas en el 
intestino grueso libera amoniaco el cual es transformado a glutamina por la enzima 
glutamina sintetasa a través de la microbiota colónica. Esta glutamina puede pasar al 
músculo y ser utilizada como glutamato durante la neurotransmisión. El resto del 
amoniaco intestinal que no fue procesado a glutamina, será absorbido por la pared 
intestinal y pasará a la sangre para ser enviado al hígado, donde será metabolizado en 
urea. El hígado sano envía la urea al riñón para eliminarse por la orina, y una parte del 
amoniaco también será llevada al cerebro donde será añadida al glutamato para 
convertirse en glutamina. También el exceso de amoniaco puede ser transformado a 
glutamina en el cerebro, con ayuda de los astrocitos. Finalmente, en la terminal 
presináptica el glutamato será recuperado de la glutamina, y funcionará como 
neurotransmisor, activando alguna señal neuronal. Recuperado de www.epgonline.org 
el 16 de mayo de 2019. 
 
Por otro lado, la inflamación sistémica suele presentarse en el tracto 
gastrointestinal y conducir a sepsis por la mala fagocitosis derivada del exceso de 
amoniaco. En estas condiciones se presentan altos niveles de citocinas proinflamatorias 
(incluyendo factor de necrosis tumoral alfa o TNF-α) e interleucinas (ILs) (Luo et al., 
2015). Aunque estas moléculas no atraviesan la barrera hematoencefálica, sí pueden 
modificar su permeabilidad y entonces las citocinas periféricas podrían enviar sus 
efectos al cerebro por cualquiera de estas tres vías: a) el nervio vago, que transmite 
señales al cerebro desde los tejidos periféricos; b) la vasculatura cerebral, la cual 
manda señales a través de segundos mensajeros producidos en respuesta a las 
CEREBRO 
Astrodto 
GLN- ~ 
BHE 
FLORA 
COLÓNICA 
INTESTINO 
http://www.epgonline.org/
 
15 
 
citocinas, como óxido nítrico (NO) y los prostanoides; y c) por medio de una acción 
directa al parénquima cerebral en regiones donde no existe barrera hematoencefálica. 
(Luo et al., 2015). 
 
EFECTOS INMEDIATOS DE LA EH SOBRE EL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL 
 
La EH y el sistema olfativo 
 
Muchas conductas del ratón incluyendo el aprendizaje, la memoria, la interacción social, 
el miedo y la ansiedad, están estrechamente relacionadas con la función olfatoria (Zou 
et al., 2016). Aunque se sabe que el olfato se daña de manera temprana en las 
enfermedades neurodegenerativas, existen pocos estudios que relacionen la pérdida de 
la capacidad olfatoria con las enfermedades hepáticas que desencadenan desórdenes 
cerebrales (Zucco et al., 2006, Coronas-Sámano et al., 2014). En el caso de la EH, se 
considera que la hiperamonemia tiene un efecto deletéreo en las sinapsis excitatorias e 
inhibitorias, por lo que la función del bulbo olfatorio se ve alterada (Zucco et al., 2006). 
Aunque existe evidencia de anosmia en pacientes humanos con EH temprana (Zucco et 
al., 2006) y que se sabe que la función olfatoria se ve afectada en pacientes humanos 
con cirrosis dependiendo de la gravedad de la encefalopatía hepática (Heiser et al., 
2018), no existen estudios sobre la capacidad olfatoria en modelos de cirrosis e 
hiperamonemia. 
 
La EH afecta la actividad locomotora 
 
Se sabe que la exposición crónica a algún agente neurotóxico modifica los sistemas 
antioxidantes y elementos dopaminérgicos, lo que provoca cambios en la actividad 
locomotora (Rodríguez et al., 2010). En ratones con ligadura de conducto biliar (LCB) y 
en ratas alimentadas con manganeso a los que se ha aplicado la prueba de campo 
 
16 
 
abierto se ha observado que éstos pasan la mayor parte del tiempo en la periferia del 
campo, exhibiendo estado de ansiedad (Ferreira et al., 2017), por lo que esta prueba en 
roedores permite detectar la EH derivada de la hiperamonemia. En estos modelos se 
ha desarrollado hiperamonemia, y se considera que afecta la corteza cerebral 
encargada de las funciones ejecutivas (Ferreira et al., 2017; Li et al., 2017). 
 
COMUNICACIÓN PURINÉRGICA 
 
El sistema purinérgico 
 
Los nucleósidos y los nucleótidos son elementos muy importantes que participan en 
diferentes fenómenos bioquímicos. Un nucleósido se compone de una base 
nitrogenada unida a una ribosa o desoxirribosa. Los nucleótidos resultan de la unión de 
un nucleósido (adenosina, por ejemplo) con uno, dos o tres fosfatos identificados con 
las letras griegas α, β o γ, y se llamarán adenosina monofosfato (AMP), adenosina 
bifosfato (ADP) y adenosina trifosfato (ATP) respectivamente. De acuerdo con el tipo 
de base nitrogenada que posean, los nucleósidos y sus nucleótidos se denominan 
purinas o pirimidinas. Los nucleósidos adenosina (ADO) y guanosina son purinas, 
mientras que la uridina, la timidina, y la citocina son pirimidinas (Lazarowski y 
Schwarzbaum, 2009; Burnstock y Verkhratsky, 2012). Los nucleótidos se encuentran en 
la célula casi siempre libres en forma de nucleósido trifosfato, el más abundante de los 
cuales es el ATP (Lazarowski y Schwarzbaum, 2009). 
El ATP es un mensajero autócrino y parácrino en diversos procesos celulares. 
Un incremento de cualquier magnitud en la permeabilidad de la membrana resulta en la 
salida de ATP, y este aumento en la concentración extracelular del nucleótido es capaz 
de iniciar una cascada de señalización al activar receptores específicos (Roman y Fitz, 
1999). De hecho, algunos receptores purinérgicos son activados bajo concentraciones 
nanomolares en condiciones fisiológicas (Roman y Fitz, 1999; Adinolfi et al., 2018). El 
ATP intracelular puede ser liberado por células dañadas, también por daños mecánicos, 
deformación de la membrana o a través de proteínas de la membrana como panexinas 
 
17 
 
o conexinas, así como por el receptor purinérgico P2X7 (Adinolfi et al., 2018; 
Thorstenberg et al., 2018; Giuliani et al., 2019). 
Una vez en el espacio extracelular, el ATP puede convertirse en adenosina por 
acción de las ectonucleotidasas, de las cuales se conocen 4 familias: (1) ENTPD/CD39 
(ectonucleotidasa trifosfato difosfohidrolasa) que forma AMP de ATP/ADP; (2) ENPP 
(ectonucleotido pirofosfatasa) forma AMP de ATP/ADP-ribosa; (3) fosfatasa alcalina, 
que hidroliza diferentes nucleótidos para ser transformados en ADO; y (4) NT5E (ecto-
5´-nucleotidasa) que forma la ADO a partir de AMP (Diaz-Muñoz et al., 2018; Giuliani et 
al., 2019). 
 
El ATP como neurotransmisor 
 
El estudio de las purinas inició hace más de 200 años. En 1776 se aisló ácido úrico a 
partir de piedras biliares, y fue muchos años después, a finalesdel siglo XIX cuando se 
descubrieron las purinas principales (adenina, xantina e hipoxantina), y las pirimidinas 
(timina, citosina y uracilo) por Ludwig Karl Martin Leonhard Albrecht Kossel (1853-
1927). 
En 1929, el ATP (adenosina 5-trifosfato) fue descubierto por dos grupos 
científicos de manera independiente: por Karl Lohmann en Alemania y por Cyrus 
Hartwell Fiske y Yellagaprada SubbaRow en los Estados Unidos (Burnstock y 
Verkhratsky, 2012). Para 1949, ya se tenía la idea de que el ATP es una molécula 
energética, y desde 1914 se conoce que la adenina provoca efectos hipotensivos en el 
sistema cardiovascular. En las siguientes décadas se hicieron experimentos en el 
músculo esquelético de rana y en el corazón de cerdo, con el fin de conocer los efectos 
de la adenina sobre los tejidos. 
La primera indicación de que el ATP actúa como neurotransmisor en el SNP 
(sistema nervioso periférico) fue cuando Holton y Holton propusieron que el ATP 
liberado de nervios sensoriales durante la estimulación antidrómica del nervio auricular, 
causaba vasodilatación en la arteria auditiva del conejo (Burnstock y Verkhratsky, 
2012). Desde 1948 se ha reportado que la inyección de ATP tiene efectos fisiológicos 
 
18 
 
excitatorios en diversos tejidos, y en pacientes esquizofrénicos y con depresión 
neurótica se observó que tienen niveles altos de ATP en sangre y de AMPc (adenosín 
monofosfato cíclico) en orina, lo que sugiere que las purinas juegan un papel importante 
en las funciones cognitivas y emocionales del cerebro. En 1972, Burnstock et al. 
presentaron evidencia de que, en preparaciones de intestino de varios mamíferos 
mediante aplicaciones de ATP exógeno se observó una respuesta similar a la 
estimulación en nervios no-adrenérgicos no-colinérgicos (NANC), demostrando la 
hipótesis de que una purina actúa como neurotransmisor en estos nervios ya sea de 
manera excitatoria o inhibitoria. Esta purina resultó ser un nucleótido de adenina, el 
ATP (Burnstock et al., 1972). 
 
Los receptores purinérgicos 
 
Los receptores purinérgicos son proteínas de la membrana plasmática que unen con 
alta afinidad a nucleósidos y nucleótidos. Se conocen 2 familias principales, P1 y los 
P2. Los P1 o ADORA son afines a la adenosina y pertenecen a la superfamilia de 
receptores acoplados a proteínas G (GPCR). Los receptores P2 unen nucleótidos de 
adenina y uridina y se subdividen en P2Y, que son receptores acoplados a proteínas G 
GPCR y P2X que son canales iónicos activados por ligando (figura 2) (Roman y Fitz, 
1999; Díaz-Muñoz et al., 2018). 
Los receptores P2X funcionales se conforman de 3 subunidades, y a la fecha se 
conocen 7 genes que codifican para las subunidades P2X1 a P2X7, cada subunidad 
posee dos dominios hidrofóbicos que cruzan la membrana plasmática (figura 3), 
formados por 20-30 aminoácidos mayoritariamente no polares. Ambos dominios 
hidrofóbicos están unidos entre sí por una extensa cadena extracelular de aminoácidos 
predominantemente polares. Dos dominios hidrofílicos relativamente pequeños se 
expanden hacia el interior de la célula formando los segmentos amino- (NH3+) y carboxi- 
(COO-) terminales de estos receptores. Como mencionamos los receptores funcionales 
son homo- o hetero-trímeros de estas subunidades. La unión con su agonista resulta en 
 
19 
 
la apertura de un poro selectivo, el influjo de iones de Na+ y Ca2+ y el eflujo de K+ 
(Lazarouski y Schwarzbaum, 2009). 
 
 
Figura 2. Clasificación de los receptores purinérgicos. Los receptores purinérgicos se 
subdividen en dos tipos: P1 y P2. Los P1 también llamados ADORA son receptores 
acoplados a proteínas G (GPCR), y son afínes a la adenosina. Los receptores P2 
tienen afinidad por ATP, ADP, UTP y UDP, y se subdividen en P2X y P2Y. Los P2Y 
son GPCR mientras que los P2X son canales iónicos activados por ligando. Modificado 
de Roman y Fitz (1999) con base en Giuliani et al. (2019). 
 
Los transcritos de las subunidades de P2X (1 a 7) se han descrito en diversos 
órganos como el intestino delgado, el intestino grueso y el hígado fetal (Vázquez-
Cuevas, 2006). También se ha reportado su expresión en células inmunitarias 
incluyendo monocitos, macrófagos, neutrófilos, linfocitos y mastocitos (Savio et al., 
2018; Roman y Fitz, 1999, Valdez-Morales, 2011). Por otra parte, la expresión y 
función citotóxica del receptor P2X7 está altamente relacionada con el desarrollo de 
procesos neurodegenerativos que incluyen inflamación (Wen et al., 2017). En células 
gliales e inmunes, se ha visto que la activación por altas dosis de ATP provoca entradas 
importantes de Ca2+ y salidas de K+. También se ha encontrado la presencia del 
Receptores purinérgicos 
Receptores Pl 
Agonist as: adenosina 
Antagonist as: xantinas 
Recept ores P2 
ATP, ADP, UTP, UDP 
ninguno 
~ ~ 
A1 A 2a A 2b A3 P2X1_7 P2Y 1, 2, 4, 6, 11-14 
Adeni lilciclasa 0 (±) 
~ 
(±) 0 • • Estructura: GPCR Cana l iónico GPCR 
acoplado a ligando 
 
20 
 
receptor P2X7 en terminales presinápticas donde parece tener un papel importante en 
la modulación de la liberación de neurotransmisores, incluyendo GABA y glutamato, 
pero es necesario agregar estudios sobre el papel de este receptor en neuronas 
(Valdez-Morales, 2011; Sperlágh et al., 2014). 
 
El receptor purinérgico P2X7 
 
P2X7 es un receptor canal catiónico no selectivo activado por ATP extracelular (eATP). 
con la capacidad de regular el flujo de Na+, K+ y Ca2+. Su activación induce diversos 
eventos río abajo, incluyendo la liberación de moléculas inflamatorias, proliferación 
celular y muerte, eventos metabólicos y fagocitosis. De manera muy particular, este 
receptor requiere concentraciones mayores a 100 µM de eATP para ser activado, y se 
sabe que este receptor se encuentra en muchos tipos celulares. Específicamente en el 
SNC, se ha demostrado la presencia de este receptor en células gliales y neuronas 
(Sluyter, 2017). El receptor P2X7 ha cobrado especial interés porque su extremo 
citoplásmico carboxilo terminal posee regiones homólogas al factor de necrosis tumoral 
y dominios de muerte (Di Virgilio et al., 2017; Savio et al., 2018) (figura 3). 
Notablemente el receptor P2X7 puede ser activado por ATP en concentraciones 
altas (EC50 ≥ 1 mM bajo condiciones fisiológicas), lo que lo asocia a condiciones 
patológicas (Toki et al., 2015; Karasawa y Kawate, 2016). En lo que se refiere a su 
farmacología, el receptor P2X7 puede ser activado eficientemente con 2, 3-O-(4-
benzoylbenzoyl)-ATP (BzATP), el cual es 30 veces más potente que el ATP, y es 
antagonizado por los cationes divalentes Ca++>Mg++>Zn++>Cu++, el ácido piridoxal-
fostato-6-azofenil-17 2´, 4´- disulfónico (PPADS), y más selectivamente por el ATP 
oxidado (oATP 100 µM), el 18 derivado de isoquinolona KN-62, y Azul brillante G (BBG, 
por sus siglas en inglés 19 Brilliant Blue G), el calmidazolium (10nM) y el KN-62 (North, 
2002; Valdez, 2011). Si se estimula con concentraciones bajas de agonistas (BzATP 
3.2 μM o ATP 320 μM), el receptor P2X7 genera una corriente monofásica, con una 
amplitud máxima que oscila entre 10 y 100 pA, y bajo estas condiciones experimentales 
el receptor se desensibiliza lentamente (hasta 147 s) (Khadra et al., 2013). 
 
21 
 
 
Figura 3. Estructura de la subunidad P2X. Topología de la subunidad del receptor 
P2X7 en una vista hipotética, basada en estudios hechos con receptores P2X1 y P2X2. 
Tomado de Valdez-Morales, 2011). 
 
El receptor P2X7 y su papel en el ensamblaje del inflamasoma NLRP3 
 
Cuando el ATP extracelular (eATP) se une al receptor P2X7 se abren conductancias 
que corresponden al influjo de Na+ y Ca2+, y eflujo de K+. El eflujo de K+ intracelular 
induce la activación de la cinasa NEK7. Esta es la señal que gatilla la agregación del 
inflamasoma NLRP3 (NOD-like receptor; nucleotide binding oligomerization domain – 
containing protein). El ensamblaje del inflamasomarealiza la maduración de citocinas 
Aminoácidos gllcosllados 
Puentes disutfuro o 
o Clst nas conservadas o 
Sitio proteína clnasa C 
• Amino cidos arom ticos o 
Dominio 
extracelular 
1 
Dominio 
transmembranal 
Dominio 
intracelular 
Pu d n coordinar fosfatos del A TP 
Mot1vo YXXXK 
Involucrado en unión de protones 
Involucrado en la unión d z 
 
22 
 
inflamatorias y la secreción de IL-1β e IL-18 (figura 4). Así, el eATP actuando a través 
del receptor P2X7 es una señal para la activación del inflamasoma NLRP3, induciendo 
tanto la maduración como la liberación de citocinas proinflamatorias, por ejemplo, de IL-
1β y de IL-18 (Vázquez-Cuevas, en prensa) 
 En varios tipos celulares el eATP se considera parte de la respuesta inflamatoria 
pues al actuar sobre el receptor P2X7 activa por una interacción directa al inflamasoma 
NLRP3, y en una concentración de entre 0.5 a 1 mM es capaz de inducir necrosis y 
daño extensivo, por lo que el receptor P2X7 es un sensor de daño celular y un iniciador 
del inflamasoma (Haanes et al., 2012; Adinolfi, 2018). 
El inflamasoma NLRP3 se compone de proteínas responsables de mediar la 
transducción de la señal de caspasas inflamatorias por medio de un dominio de 
reclutamiento (dominio CARD, caspase activation and recruitment domain), un dominio 
pirina (PYD) y un dominio IAP (inhibitor of apoptyosis domain). En la región 
carboxiterminal tiene una secuencia repetitiva rica en leucinas (LRR) (Hernández y 
Urcuqui, 2012). El inflamasoma pertenece la superfamilia de proteínas de muerte 
(Suárez y Buelvas, 2015; Redondo-Castro et al., 2018), e interactúa con el receptor 
P2X7 (Adinolfi et al., 2018). 
El inflamasoma es un complejo multiproteico que promueve la maduración de 
citocinas proinflamatorias, particularmente las interleucinas IL-6, IL-1α, IL-18 y la IL-1β, 
por medio de la activación de la enzima Caspasa 1 (Casp1) y que da lugar al 
ensamblaje del inflamasoma, que puede ser finamente mediado por la proteína NLRP3 
(Chen et al., 2018; Adinolfi et al., 2018). De estas moléculas, se considera que la IL-18 
es un mediador del inflamasoma, de modo que influye en el establecimiento y 
permanencia de la inflamación (Amores-Iniesta et al., 2018). 
 
 
 
 
 
 
23 
 
 
 
Figura 4. Esquema que muestra el ensamblaje del inflamasoma NLRP3 y la cascada 
de señalización que madura las interleucinas proinflamatorias IL-18 e IL-1β. El ATP 
extracelular en concentración mM se acopla al sitio de unión del receptor P2X7, 
abriendo un megaporo y permitiendo de manera descontrolada la salida de K+ y la 
entrada de Na+ y Ca2+, alterando la conductancia de la membrana celular por un tiempo 
prolongado. El eflujo de K+ es sensado por NEK7, que activa el ensamblaje del 
inflamasoma NLRP3 por medio de los sitios ASC y CARD pertenecientes al 
inflamasoma, que son acopladores del ensamblaje. Una vez ensamblado el 
inflamasoma, la forma inmadura de la Casp1, proCasp1, se escinde y permite la 
maduración de la enzima Casp1, cuyo efecto será un aumento en la maduración de 
proIL-18 y proIL-1β, favoreciendo su liberación y modulando la respuesta inflamatoria 
en el tejido (Basado en Amores-Iniesta et al., 2017). 
 
El inflamasoma es un regulador muy fino de la maduración de interleucinas y por 
lo tanto del programa de inflamación del sistema inmunitario innato (Chen et al., 2018). 
Cuando el estado de producción de interleucinas inflamatorias es crónico, ocurre 
piroptosis de manera sostenida, provocando un estado permanente y cíclico de 
inflamación y muerte, dando como consecuencia la necrosis del tejido (Haanes et al., 
2012; Amores-Iniesta et al., 2017; Adinolfi et al., 2018; Chen et al., 2018). 
 
--
Ca2• 
e· J ~ --·· ~ 
 
24 
 
 
Activación del receptor P2X7 durante la neuroinflamación 
 
La microglía es la estirpe celular de macrófagos residentes en el cerebro (Purves et al., 
2018), y pertenecen a un grupo de fagocitos mononucleares que comprenden 
macrófagos tisulares periféricos, macrófagos asociados al SNC, células dendríticas y 
células derivadas de monocitos, de origen mieloide (Prinz y Priller., 2014). La 
activación del receptor P2X7 juega un papel muy importante en el procesamiento y la 
liberación de IL-1β en la microglía, que es un paso en la inducción de la respuesta 
inflamatoria. En células microgliales de ratón, el ATP permite la rápida maduración de 
IL-1β y de IL-18 por medio de la Casp1, que a su vez es parte del inflamasoma NLRP3 
(Scheiblich et al., 2017). 
En un modelo de ratón con microglía activada por inyección de lipopolisacáridos 
periféricos se observó una inducción significativa en la expresión de mRNA tanto de IL-
1β como de IL-10 en la corteza cerebral motora. También se incrementó la producción 
de TNF-α y de IL-1β en el hipocampo, induciendo una reducción de la memoria sin 
muerte neuronal (Luo et al., 2015). En modelos de rata con colestasis inducida por 
ligadura del conducto biliar (LCB) se activó la microglía en el cerebro, se incrementaron 
los niveles de NO sintasa inducible, IL-1β y prostaglandina E2, y se dañaron las 
funciones motoras y cognitivas de la rata (Luo et al., 2015). 
Observando de manera integrativa la EH, se puede afirmar que la exposición 
crónica al amonio induce una respuesta inflamatoria que conduce a la 
neurodegeneración que caracteriza a esta enfermedad (Luo et al., 2015). La 
hiperamonemia dirige la acumulación de lactato en el cerebro y por tanto la activación 
de la microglía y el incremento en la producción de interleucinas inflamatorias. También 
se considera que la hiperamonemia actúa en sinergia con la inflamación en la EH. La 
hiperamonemia o la inflamación por sí solas no resultan en daños cognitivos, pero los 
efectos sinergísticos y crónicos de ambos son suficientes para inducir daños cognitivos 
en pacientes cirróticos con EH temprana (Luo et al., 2015), lo que sugiere que la 
inflamación es un modulador del efecto del amonio sobre el cerebro. 
 
25 
 
 
JUSTIFICACIÓN 
 
La encefalopatía hepática es un padecimiento que se desarrolla como consecuencia de 
la incapacidad metabólica del hígado fibrótico-cirrótico para procesar compuestos 
nitrogenados, condición que conduce a la acumulación sistémica de amonio teniendo 
un efecto altamente tóxico que en el SNC (McDermott, 1958). Este daño se observa en 
diversas alteraciones fisiológicas que reflejan un desbalance en las señales excitatorias 
e inhibitorias en el SNC. Desde el punto de vista neuroquímico y metabólico se han 
propuesto mecanismos que explican las alteraciones características de la EH, 
básicamente atribuidas a una disminución del tono glutamatérgico y un aumento en la 
transmisión GABAérgica (Albrecht y Jones, 1999), sin embargo, hacen falta modelos 
que permitan determinar los mecanismos implicados a nivel del SNC. 
En las últimas décadas se han sumado nuevos elementos a la descripción de los 
eventos celulares que participan en el establecimiento de la EH. Uno de ellos es el 
componente inflamatorio sistémico y del SNC; así, se ha documentado que los 
pacientes con Enfermedad Crónica Hepática presentan niveles elevados del TNF-α, IL-
1β e IL-6 en el suero sanguíneo (Tilg et al., 1992). Además, se ha descrito que existe 
correlación entre la severidad de la EH y las concentraciones circulantes de las IL-6 e 
IL-18 (Montoliu et al., 2009). Dado lo anterior, es necesario desarrollar modelos 
moleculares asociados a un proceso neuroinflamatorio a nivel del SNC derivado del 
daño hepático por obstrucción biliar. 
 
 
 
 
 
 
 
26 
 
 
HIPÓTESIS 
 
El receptor P2X7 participa en la inducción de la neuroinflamación en la EH inducida por 
la ligadura del conducto biliar. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
27 
 
 
OBJETIVOS 
 
Inducir la fibrosis hepática en ratones macho de la cepa C57BL/6J a través de la 
ligadura del conducto biliar (LCB). 
Detectar cambiosconductuales que revelen el establecimiento de la encefalopatía 
hepática. 
Analizar el nivel de expresión de los transcritos de P2X7, de la interleucina 
proinflamatoria IL-1β y de la enzima Casp1 en animales en los que se ha inducido la 
enfermedad hepática. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
28 
 
 
MATERIALES Y MÉTODOS 
 
1. Modelo experimental: ligadura del conducto biliar en ratón 
 
El modelo experimental de LCB se estandarizó en ratones macho de la cepa C57BL/6J 
especie Mus musculus L., debido a que se cuenta con su mapa genético completo 
desde 2002, lo cual ha favorecido al estudio de diversas enfermedades humanas. Los 
ratones con 8 semanas de edad se alojaron en el bioterio durante dos semanas dentro 
de la habitación con el horario invertido, con periodo de oscuridad de 9 a 21 hrs. Para 
iniciar la cirugía, se anestesiaron con 200 L de ketamina-xilacina 4:1 (8 mL/kg) por vía 
intraperitoneal. Antes de iniciar la cirugía, se realizó la prueba de dolor, pinchando la 
cola o una pata del ratón, sabiendo que no reflejará dolor para entonces proceder. La 
composición de la muestra fue de 12 individuos con operación simulada (OS) y 16 con 
LCB. Los animales con ligadura del conducto biliar se denominaron grupo LCB y los 
animales con operación simulada (sin ligadura de colédoco pero con anestesia, incisión 
abdominal y sutura) se denominaron grupo OS. La cirugía se realizó 3 semanas 
después de que los animales ingresaron al bioterio, contando con 11 semanas de edad 
y 28 ± 2.4 gr de peso en promedio para ambos grupos. 
 En el quirófano, bajo condiciones asépticas se cortó en línea media la piel y la 
musculatura del abdomen. Con pinzas se levantó el apéndice xifoides y se reveló la 
vesícula biliar, debajo del hígado. Con ayuda de agujas y pinzas de disección se 
levantó el conducto biliar que aparece como un filamento debajo de la vesícula y 
conectando hacia el estómago. El conducto se ligó con 2 vueltas de seda de gusano 
quirúrgica de calibre 4-0 asegurando la obstrucción de la salida de los jugos biliares 
hacia el peritoneo. Se regresaron los órganos a su lugar y se suturaron el abdomen y la 
piel con seda quirúrgica de gusano calibre 3-0. El ratón despertó de 30 a 40 minutos 
después de la aplicación de la anestesia (Butterworth et al., 2009). Todos los 
experimentos se hicieron de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana de la Secretaría de 
Agricultura (SAGARPA NOM-062-ZOO-1999), la cual cumple con los lineamientos del 
Institutional Animal Care and Use Committee Guidebook NIH Publication 80-23, 
 
29 
 
Bethesda, MD, USA, 1996 y fue aprobado por el Comité de Bioética del INB de la 
UNAM bajo el número de protocolo 85.A. Una vez realizada la cirugía, el ratón volvió a 
su jaula y fue alimentado ad libitum y agua corriente. Se dejaron transcurrir 5 días de 
recuperación. 
 
2. Diagrama de flujo del diseño experimental 
 
 
Figura 5. Diagrama de flujo del diseño experimental 
 
3. Registro semanal de peso 
 
Cada ratón fue pesado una vez por semana (figura 5). Al final se analizaron los datos 
por medio de un análisis de varianzas (ANDEVA) de medidas repetidas y t-student no 
apareada para determinar si existen diferencias en los diferentes momentos del 
registro. 
Disección de 
hígado -
Registro semanal de peso corporal 
• Cirugía de ligación de conducto 
biliar para inducir la enfermedad 
hepática crónica 
• Identificar encefalopatía hepática a 
partir de cambios conductuales: 
análisis de discriminación olfatoria y 
de actividad locomotora • Disección de bulbo olfatorio y 
corteza prefrontal para cuantificar la 
expresión genética 
• Determinación de la expresión 
relativa de los transcritos de los 
componentes del inflamasoma 
P2X7/NLRP3 
Concentración de amonio 
en suero sanguíneo 
 
30 
 
4. Pruebas conductuales: olfativa y actividad locomotora 
4.1 Prueba olfativa: habituación y deshabituación 
 
En estudios recientes se ha investigado el impacto que las enfermedades hepáticas 
agudas, crónicas y en la etapa final tienen sobre el sentido del olfato, cuyos resultados 
sugieren que la función olfatoria se daña en diversos grados en la enfermedad hepática, 
siendo la disosmia y la hiposmia los síntomas más comunes. La hiperamonemia 
conduce a la neuroinflamación y ésta contribuye a daños cognitivos en ratas con 
encefalopatía hepática (Cauli et al., 2007; Cauli et al., 2019) más aún, la falta de 
umbrales en la habilidad para identificar los olores se asocia con la cirrosis hepática por 
daño en el SNC y no en el sistema nervioso periférico (SNP), pues la identificación del 
aroma se asocia con procesamiento de información en estructuras de alto orden como 
la neocorteza (Chen et al., 2016). 
En muchas enfermedades neurodegenerativas, de manera temprana se afecta la 
función del bulbo olfatorio, cuya detección la convierte en una potente herramienta para 
la pronta atención de una enfermedad del sistema nervioso central (Lehmkul et al., 
2014). El bulbo olfatorio se compone por las células, que proyectan a la corteza 
cerebral, y su excitablidad es mediada por la vía del glutamato actuando a través de los 
receptores a glutamato-amino-3-hidroxi-5-methil-isoxazol-4-ácido propiónico (AMPA) y 
N-metil- d-aspartato (NMDA). El ácido gama-aminobutírico (GABA), que es liberado de 
las interneuronas inhibitorias, de las células periglomerulares y de las células 
granulares, también regulan la transmisión sináptica en el bulbo olfatorio. Los 
neurotransmisores GABA y glutamato, crean un sistema de procesamiento de 
información en el bulbo olfatorio principal, por lo que su concentración y movimiento a 
través de la sinapsis determinará la capacidad olfatoria. Se ha descrito que el exceso 
de glutamato hiperexcita a las células mitrales, las responsables de decodificar la 
información de los aromas, aumentando su tasa de disparo pero no la amplitud del 
potencial de acción (Chen et al., 2016). En el mismo estudio encontraron que la 
excitotoxicidad por bilirrubina facilita la transmisión sináptica glutamatérgica y el disparo 
intrínseco en las células mitrales, lo que puede contribuir a la hiperexcitación por 
bilirrubina, por lo cual sugieren que se trata de un posible mecanismo celular que 
explica la pérdida de la habilidad para identificar olores en pacientes con enfermedad 
 
31 
 
hepática. De ser así, es una gran herramienta para detectar el grado de daño en el 
bulbo olfatorio por la enfermedad hepática, que podría indicar daño en el SNC. 
Una prueba para conocer el estado funcional del bulbo olfatorio es la de 
habituación / deshabituación, y permite conocer la tendencia del animal para explorar 
nuevos estímulos y la permanencia del olfateo. Esta prueba se usa para saber si el 
ratón detecta y discrimina diferentes aromas, pudiendo usar estímulos sociales y no-
sociales (Yang y Crawley, 2009). La habituación se define como el decremento 
progresivo normal de la exploración olfativa, siempre y cuando el estímulo se presente 
de manera constante. La deshabituación se define como la restauración en la 
exploración y la latencia de exploración cuando se presenta la novedad del estímulo 
olfatorio (Yang y Crawley, 2009). Los animales con olfacción normal reducirán 
significativamente su tiempo de olfateo cuando el estímulo es reintroducido por segunda 
y tercera vez (habituación) y se va a restaurar el primer tiempo de olfacción ante un olor 
novedoso, por lo que esta prueba de habituación/deshabituación nos indica si la 
olfacción es normal (Yang y Crawley, 2009). 
Como parte del diseño experimental de nuestro trabajo (figura 5), se aplicó esta 
prueba a los animales experimentales antes de la cirugía de ligación y tras haber 
transcurrido 6 semanas posteriores a ésta. La prueba consistió en presentar al ratón un 
aroma neutro (agua corriente) y dos aromas sociales (vainilla 10% y ácido acético 10%) 
en intervalosde 2 minutos de duración y con intervalo de 1 min entre un aroma y otro 
(Yang y Crawley, 2009). Se colocaron 10µL del aroma en un papel filtro adherido al 
fondo de un recipiente metálico que funcionó como vehículo para presentar el estímulo 
olfatorio sobre la jaula en el espacio del alimento, y así el ratón accede al aroma sin la 
posibilidad de tocarlo. La jaula que se utilizó fue de plástico, para ratón de bioterio, con 
cama nueva de aserrín y con restricción de alimento y agua. Esta prueba se repitió a 
las 48 horas con la variante de presentar los aromas sociales en orden invertido. Se 
registraron: a) la latencia, la cual se define como el tiempo que transcurre para que el 
ratón identifique un nuevo aroma en la jaula, y b) la permanencia de olfateo que se 
define como el tiempo que el animal olfatea y explora el estímulo olfatorio. Los tiempos 
se reportan en segundos y milisegundos. Estos datos se analizaron con la prueba 
estadística Wilcoxon para datos no paramétricos con un intervalo de confianza del 95%. 
 
32 
 
 
4.2 Prueba de actividad locomotora en registro de campo abierto 
 
Evaluar la actividad locomotora en un animal es la prueba más básica que permite 
explorar el estado funcional del cerebro y se ha visto que en enfermedades 
neurodegenerativas existen desórdenes del movimiento (Baltazar et al., 2014), como 
disfunción psicomotora, daños en la memoria, alteraciones sensoriales y confusión 
general (Ferreria et al., 2017). La actividad locomotora se evalúa para elucidar 
preguntas básicas, como los efectos de diferentes clases de drogas en el circuito que 
regula este tipo de conducta, o para evaluar las bases neurales de los ritmos etológicos 
o biológicos (Pierce y Kaliwas, 2007). 
Como parte de nuestro diseño experimental (figura 5), la actividad locomotora fue 
evaluada en cajas con fotoceldas horizontales que registran: a) la distancia total (cm) 
que el animal recorrió en la caja; b) la distancia que recorre en la región central de la 
caja (cm); c) la cantidad de veces que manifiesta conductas estereotipadas; y d) el 
tiempo que pasa en movimiento (s). El registro se realizó a las 8 semanas después de 
la ligadura de conducto biliar, ya que fue el tiempo suficiente para permitir que los 
ratones se relajaran después de la cirugía de LCB y de las pruebas olfatorias. 
La actividad locomotora se registró durante 25 horas, la primera de las cuales se 
consideró de exploración y se eliminó del análisis de datos. Se tomaron las medidas 
necesarias para asegurar las condiciones de luz y temperatura habituales, y el registro 
fue individual para cada ratón. El ratón fue alimentado ad libitum y con agua corriente 
mientras permaneció en su caja (Rodríguez et al., 2010). Para registrar y evaluar la 
actividad locomotora del ratón en campo abierto se usó el equipo Digiscan Animal 
Activity Monitors, Accuscan Inc. (Colombus, Ohaio, E.U.A.) y el software es Fusion 
4.8.0.0. VersaMax. Como prueba estadística se hizo un ANDEVA para muestras 
repetidas con software StatView, seguida por t de student como posthoc, considerando 
los datos de las 24 horas promediados en 8 segmentos de 3 horas cada uno. 
 
33 
 
 
 
5. Concentración de amonio en suero sanguíneo 
 
Con el objetivo de confirmar ligadura de conducto genera la hiperamonemia, al 
momento de la eutanasia por decapitación, se obtuvo la sangre del ratón, la cual se 
centrifugó a 4000 rpm durante 10 min para separar el suero sanguíneo, y se procedió a 
utilizar el protocolo para ensayo de amonio con un kit de Sigma-Aldrich (número de 
catálogo AA0100, St Louis, EU). En este ensayo, el amonio reacciona al ácido α-
cetoglutárico (KGA) y se reduce a fosfato dinucleótido de adenina nicotinamida 
(NADPH) en presencia de L-glutamato deshidrogenasa (GDH) y se convierte en L-
glutamato y fosfato dinucleótido de adenina nicotinamida oxidada (NADP+) como se 
muestra a continuación: 
 
 GDH+ 
KGA + NH4+ + NADPH NADP + L-Glutamato + H2O 
 
El decremento en la absorbancia a 340nm es debido a la oxidación de NADPH, 
la cual es proporcional a la concentración de amonio (mg/mL). Los datos se analizaron 
con una prueba de t-student (p< 0.05). 
 
6. Análisis histológico 
 
Con el fin de identificar el efecto que la ligadura de conducto biliar provoca en el hígado 
(figura 5), los ratones con LCB a las (10 semanas post cirugía), fueron perfundidos con 
PBS 1x (solución amortiguadora salina de fosfatos 1x) para lavar los tejidos y eliminar la 
sangre pues sus células expresan los genes de interés. Posteriormente se 
perfundieron con PFA 4% (paraformaldehído al 4%) para fijar los tejidos y preservarlos. 
El hígado fue disecado y almacenado en formalina hasta su procesamiento. Se 
realizaron dos tinciones en diferentes porciones de tejido de hígado (5 µm de grosor), 
 
34 
 
determinando el grado de fibrosis o cirrosis: a) hematoxilina-eosina (HE) para teñir los 
núcleos y el citoplasma, y b) tricrómica de Masson (TricM) para teñir colágena. Esta 
etapa del trabajo se hizo en colaboración con la Dra. Xóchitl Zambrano, quien es 
docente investigadora de la facultad de ciencias naturales (UAQ). 
 
7. Análisis del nivel de expresión de los transcritos de interés 
 
En este trabajo se analizó la expresión genética de Casp1 e IL-1β por ser factores 
proinflamatorios producidos tras el ensamblaje del inflamasoma NLRP3, y también se 
analizó la expresión del transcrito P2X7 por ser el gatillador de esta cascada de 
señalización. Para extraer el mRNA del cerebro se perfundió al ratón con solución 
salina (PBS 1x) previamente anestesiado con ketamina-xilacina 4:1. Los tejidos y 
órganos de interés que se disecaron para este protocolo son el bulbo olfatorio y la 
corteza prefrontal. 
 
8. Extracción de ácido ribonucléico mensajero (mRNA) y reacción de 
transcripción reversa 
 
Las muestras de bulbo olfatorio y corteza prefrontal se homogenizaron en TRIzol® 
(Ambion, Van Allen Way, CA, EU) para extraer el RNA total bajo las indicaciones del 
proveedor. Para verificar la integridad del RNA total se preparó gel de agarosa 3% (30 
mL de tampón trisborato-EDTA 1x con 0.3 gr de agarosa y 2 µL de GelRed®), se 
colocaron 2 µL de muestra con 2 µL de GelRed® (Biotium 41001, CA, EU) y se corrió la 
muestra por electroforesis durante 30 min a 100 voltios. Se sintetizó el ácido 
desoxirribonucléico complementario (cDNA) por medio de transcripción reversa (RT) 
(Tamay de Dios et al., 2013). Se siguieron las especificaciones del proveedor 
(Promega, Maddison, WI, EU). 
 
 
 
 
35 
 
8.1 Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (cuantitativa) 
 
 Con los genes seleccionados se diseñaron los oligonucleótidos para obtener las 
moléculas de DNA cuya secuencia es la expresión de los mRNA de interés. La 
secuencia de los cDNA de interés se recuperaron del sitio web del National Center and 
Biotechnology Information https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, y para diseñar los 
oligonucleótidos cuya secuencia se utilizó como templado se usó la plataforma de 
Integrated DNA Technologies https://www.idtdna.com/pages. Las secuencias de los 
oligonucleótidos se encuentran en la figura 6. 
 
Gen Secuencia de oligonucleótidos Tamaño 
 
Tm oC NCBI 
 
P2X7 F TGACGAAGTTAGGACACAGC 
R GGATACTCAGGACACAGCG 
129 42.8 NM_011027.3 
 
Caspasa 1 
 
F AGTAGCTCTGCGGTGTAGAA 
R GCCAGGTAGCAGTCTTCATTAC 
281 63 NM_009807.2 
IL-1β 
 
F CCA CCT CAA TGG ACA GAA TAT CA 
R CCC AAG GCC ACA GGT ATT T 
95 54.4 NM_008361.4 
Sod2 
(Constitutitvo) 
R GACCCAAAGTCACGCTTGATA 
F TGGACAAACCTGAGGCCTAA 
154 55 XM_015275354.1 
Figura 6. Tabla en la que se muestra el diseño de las secuencias de los 
oligonucleótidos que se usaron como templados para determinar la expresión relativa 
de los genes de interés. Tamaño: número de pares de bases; Tm °C: temperatura de 
fusión del ADN, y NCBI: número de identificación del gen. F: forwardprimer; R: reverse 
primer. 
 
Se determinó la expresión relativa de los genes Caspasa 1 (Casp 1), IL-1β y 
P2x7, utilizando SOD 2 como gen constitutivo (superóxido dismutasa tipo 2) (figura 6 - 
tabla) en tejido de corteza prefrontal y bulbo olfatorio. Se estableció una curva de 
eficiencia para cada gen con el fin de estimar la concentración (µg/µL) de DNA de doble 
cadena que se forma durante la qPCR. El siguiente paso fue desarrollar la qPCR para 
cada gen dentro de cada muestra siguiendo las instrucciones del proveedor 
(LightCycler® FastStart DNA Master SYBR Green I Ref 12239264001, Roche, 
Mannheim, Germany). Para cada gen en un conjunto de muestras del mismo tejido, se 
obtuvo el valor de punto de cruce o CP, que indica el momento en que la muestra inicia 
la generación de DNA de doble cadena a partir de los templados de oligonucleótidos de 
cada gen y de su codificación a partir del mRNA de la muestra. Por lo tanto, a mayor 
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
https://www.idtdna.com/pages
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/XM_015275354?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=7VYK80ZF015
 
36 
 
CP, menor cantidad de mRNA para el gen en cuestión, teniendo como intervalo de 
cuantificación un CP de 15 a 35 por el rango de detección del equipo (LightCycler 2.0 
Roche). 
Los CP de las muestras se normalizan de acuerdo con el método de doble delta 
CP para analizar la expresión genética de los datos obtenidos en qPCR (Livak y 
Schmittgen, 2001). Una vez normalizados, se analizan estadísticamente comparando 
cada tejido y cada gen para ambos grupos; usando la prueba t-student para datos 
normales y U de Mann-Whitney para datos no paramétricos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
37 
 
 
RESULTADOS 
 
1. La LCB no induce cambios en el de peso corporal 
 
No se observaron diferencias en el peso corporal durante el tiempo de registro entre los 
grupos de LCB y OS (ANDEVA, [F(1, 26)= 0.008, p= 0.9286]). No obstante, en la semana 
4, que es la posterior a la cirugía, los animales LCB mostraron una disminución 
significativa de su peso en un 5%, diferencia que desapareció a partir de la semana 5. 
Estos resultados nos permiten concluir que la LCB no indujo cambios en el peso 
corporal de los animales (figura 7). 
 
Figura 7. Registro semanal del peso corporal de ratones OS (28.04 ± 0.2358 gr) y 
ratones con LCB (27.95 ± 27.54 gr). La cirugía de ligadura de conducto biliar se realizó 
en la semana 3, y sólo existe diferencia en el peso de los grupos experimentales en la 
semana 4 (p< 0.001). *Denota diferencias significativas entre el grupo LCB y el OS. 
 
2. La LCB conduce a hiperamonemia 
 
Como mencionamos antes, la disfunción hepática inducida por la LCB se ve reflejada 
en la concentración plasmática de amonio. Con el fin de analizar este fenómeno en 
.--.. 
L. 
32 
O> 30 -
~ 28 o 
Q. 
L. 
8 26 
o 
~ 24 
o.. 
Registro de peso corporal 
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 
Tiempo (semanas) 
..... os 
-■· LCB 
 
38 
 
nuestros grupos experimentales, realizamos la cuantificación de este metabolito. 
Observamos que el grupo de ratones con LCB tienen hasta 3.5 veces más amonio en la 
sangre que los animales OS (0.002 vs 0.007 mg de NH3/mL, figura 8) 
 
Figura 8. Gráfica de concentración de amonio en el suero sanguíneo en la que se 
observa que los animales con LCB (0.002 ± 0.00033 NH3 mg/mL; n=16) alcanzan una 
concentración hasta 3.5 veces mayor que los ratones OS (0.0067 ± 0.0004 NH3 mg/mL; 
n=12) (p< 0.05). *Denota diferencias significativas entre el grupo LCB y OS. 
 
3. Existen alteraciones histopatológicas severas inducidas por la LCB. 
 
Con el fin de corroborar si la LCB induce daño hepático, se realizaron cortes 
histológicos de 5 µm de grosor del hígado de animales tanto con LCB como OS en la 
semana 10 postcirugía. Estos cortes fueron procesados con las técnicas de 
hematoxilina-eosina (figura 9) o tricrómica de Masson (figura 10). 
Las observaciones principales del análisis histopatológico en el grupo LCB son el 
crecimiento y proliferación de conductos biliares (hiperplasia) con acumulación de sales 
biliares formando cristales, inclusiones de glucógeno y degeneración del tejido 
periférico de la vena central (degeneración centrolobulillar) en el 75% de las muestras 
(figura 9 c, d). 
0.008 
~ 0.006 
E -O) E 0.004 
----(") 
I 
Z 0.002 
Concentración de amonio 
* 
0.000..._-
os LCB 
 
39 
 
 
 
Figura 9. Fotomicrografías de cortes histológicos que exhiben la arquitectura del hígado 
en ratones con OS (a y b, n = 12) o con LCB (c-f, n = 16), teñidos con hematoxilina y 
eosina. En los ratones OS se aprecia la tríada portal (a, flecha azul), con hepatocitos 
binucleados y sinusoides regulares (b). En los animales con LCB se aprecia la 
degeneración centrolobulillar como una decoloración de la zona perivascular (c flecha 
azul) y aumento en su diámetro e inclusión glucogénica leve, y los hepatocitos 
modifican su estructura tornándose redondeados, lo que conduce a la deformación de 
los sinusoides (d), denotando proceso de necrosis. De manera importante existe 
proliferación y displasia de los conductos biliares (e, f), y aumento considerable de su 
diámetro (f). La presencia mayoritaria de hepatocitos mononucleados indica la rápida 
regeneración del tejido (e). La barra de la escala representa 500 µm. 
Vl o 
 
40 
 
 
 
FIGURA 10. Fotomicrografías de tejido hepático teñido con tricrómica de Masson, de 
ratones con OS (a y b) y con LCB (c-f). Se observa la triada portal (a, flecha amarilla) y 
los sinusoides regulares (b, flecha amarilla). En los animales con LCB se aprecia la 
degeneración centrolobulillar (c, flecha amarilla) y proliferación de conductos biliares (c 
y d). En las figuras e y f, con flechas amarillas se indica la excesiva formación de fibras 
de colágena teñidas en azul, los cristales de sales biliares y hepatocitos 
mononucleados. En la figura e, la estructura fibrosa en azul es un nódulo precirrótico, 
que nos indica la transformación del hígado fibrótico en cirrótico. La barra de la escala 
representa 500 µm. 
V) 
o 
 
41 
 
La inclusión glucogénica es una acumulación de glucógeno que podría indicar 
necrosis cuando se vuelve crónica, siendo un fenómeno subyacente a la muerte celular 
por hipoxia y falta de nutrientes (degeneración centrolobulillar), y cuya presencia 
representa daño hepático irreversible. 
Por otra parte, la proliferación de conductos biliares se ve aumentada hacia la 
región portal y se asocia a la obstrucción del conducto biliar, provocando inflamación 
local y fibrosis en el 75% de las muestras. Los rasgos anteriores son manifestaciones 
de que el parénquima hepático está luchando por regenerarse, pero en este momento 
del daño ha perdido dicha capacidad, además de que este proceso implica la 
generación de fibras de colágena, la acumulación de concreciones biliares, alteraciones 
en la arquitectura del parénquima hepático, cambios morfológicos en los tipos celulares 
hepáticos, generación de hepatocitos mononucleados y necrosis. Estas observaciones 
son indicativas de que la enfermedad crónica hepática se ha instalado en el hígado y 
que existe fibrosis. 
 
4. La ligadura de conducto biliar en ratones indujo cambios conductuales 
 
Para estandarizar la prueba de discriminación olfatoria, se realizó un experimento piloto 
con 3 ratones intactos con el fin de determinar los aromas y la concentración de los 
aromas que se utilizarían en la prueba. En esta prueba se utilizaron los aromas vainilla, 
ácido acético, canela y cítrico en tres concentraciones: 5%, 10% y 20%. Los ratones 
mostraron una clara discriminación de los aromas vainilla y a ácido acético, y no de 
canela y cítrico. Ante las presentaciones de aroma cítrico, los animales lo rechazaron 
en sus tres concentraciones. Ante la presentación de la canela, más del 50% de los 
ratones mostraron rechazo por la canelaen esas concentraciones. Así mismo, se 
determinó que los ratones prefieren el aroma a vainilla y a ácido acético en 
concentración de 10%, con tiempo de olfateo de 9.8 s y latencia 14.1 s en promedio. La 
latencia es el tiempo en que el ratón tarda en detectar el estímulo olfatorio, mientras 
que el tiempo o permanencia de olfateo es el tiempo que el animal permanece 
alrededor de 1 cm de distancia de la localización estímulo, olfateando. Con base en 
estas observaciones, se determinó utilizar los aromas vainilla y ácido acético en una 
concentración de 10% para realizar la prueba de discriminación olfatoria. 
 
42 
 
 
4.1 La LCB altera la habilidad para discriminar los aromas, pero no la latencia de 
olfateo 
 
Dos días antes de la LCB, y 6 semanas posteriores a ésta, se realizó la prueba de 
habituación y deshabituación de aromas para determinar la discriminación olfatoria 
tanto en el grupo OS (n= 12) como en el grupo LCB (n= 16), con el fin de detectar si la 
hiperamonemia derivada de la LCB ha generado alteraciones olfativas (figura 11), lo 
cual podría reflejar la existencia de la EH. Antes de la cirugía, los grupos se 
comportaron bajo los mismos patrones de discriminación olfatoria y latencia de olfateo 
(figura 11 a y c). La prueba Wilcoxon reveló que a las 6 semanas postcirugía existieron 
diferencias entre ambos grupos en la discriminación olfatoria (figura 11 b), siendo mayor 
el tiempo de olfateo para el grupo OS durante las exposiciones a la vainilla y al ácido 
acético, pero el tiempo de habituación al aroma es menor en el grupo LCB. En el 
tiempo de latencia no hubo diferencias entre los grupos (figura 11 c y d). 
 
4.2 La LCB modifica la actividad locomotora de ratones C57BL/6J a las 8 semanas 
postcirugía 
 
Con el fin de analizar si la LCB induce alteraciones en el SNC que se reflejen en 
alteraciones motrices, se realizó la evaluación de la actividad locomotora en cajas con 
fotoceldas a las 8 semanas posteriores a la cirugía de ligadura de conducto biliar. 
Las variables que se registraron fueron: distancia total, tiempo de movimiento, 
conteo de episodios de estereotipias y distancia en el centro. Los datos se registraron 
durante 60 minutos por 24 horas la sumatoria dentro del lapso de cada hora es un dato, 
de modo que se tienen 24 datos para cada animal. En las gráficas (figura 12) se 
representan las 24 horas iniciando por el periodo de descanso que va de las 21 a las 9 
horas en la fase luminosa, y por el periodo de actividad durante la fase oscura que va 
de las 9 a las 21 horas. Los datos se agruparon en 8 segmentos de 3 horas cada uno, 
dando 8 puntos de la gráfica y que representa los promedios de cada grupo. 
 
 
43 
 
 
Figura 11. Prueba de discriminación olfatoria antes (a y c) y en la semana 6 posterior 
de la cirugía (b y d). El patrón normal de discriminación está representado por la 
disminución del tiempo ante la segunda y tercera presentación del estímulo olfativo a 
partir de la primera presentación (a). El patrón normal de latencia se observa con 
aumento de tiempo ante la segunda y tercera presentación de cada estímulo (c). Los 
animales con OS tardan más tiempo (0.99 ± 0.11s) en discriminar los aromas (b) que 
los animales LCB (0.66 ± 0.089s) resultando significativamente diferentes (Wilcoxon, P= 
0.0078). No existen diferencias en la latencia de olfateo antes (c) y después (d) de la 
cirugía. Los datos están expresados en media ± error estándar de la media. 
 
 
-•· os 
.... LCB 
a Discriminación olfatoria precx 
15 
o 
Q) 
!§ 10 
o 
Q) 
"'O 
g_ 5 
E 
Q) 
¡= 
\ 
\ 
'i* r'i 
o_.__-~---~---~--
11 2 31 11 2 31 11 2 31 
agua vainilla vinagre 
Presentación de estímulos 
C Latencia de olfateo precx 
50 
40 -en 
';° 30 
o. 
~ 20 
¡= 
10 
agua vainilla vinagre 
Presentación de estímulos 
b 
d 
40 
_30 
~ 
o 
o. 20 
E 
Q) 
i= 10 
Discriminación olfatoria postcx 
11 2 31 11 2 31 11 2 31 
agua va inilla vinagre 
Presentación de estímulos 
Latencia de olfateo postcx 
11 2 31 11 2 31 11 2 31 
agua vainilla vinagre 
Presentación de estímulos 
 
44 
 
 
4.3 La distancia total es diferente entre ambos grupos 
 
Esta variable es el registro de la distancia total (figura 12 a), medida en centímetros, 
que un ratón recorre en la caja de fotoceldas durante 24 horas; los animales estuvieron 
sujetos al ciclo de luz invertido. Se encontró el efecto del tiempo [F(7, 182)= 63.735, p< 
0.0001], y también diferencias en la interacción tiempo vs tratamiento [F(7, 182)= 6.448, 
p< 0.0001], lo que se traduce en que la LCB tiene un efecto sobre la distancia recorrida 
por los ratones durante las 24 horas. 
Los análisis posthoc muestran que de 9 a 12 horas (ciclo de oscuridad) el grupo 
LCB presentó mayor actividad (P= 0.042) y de 18 a 21 horas fue el grupo OS el que 
tuvo mayor actividad (P= 0.0003). Además, se indicaron diferencias entre los grupos 
entre las 21 y 24 horas con el grupo LCB con mayor actividad (p= 0.0035), y las 6 y 9 
horas con el grupo OS con mayor actividad (p= 0.0367). 
La diferencia más importante es que la distancia que los animales recorren 
durante la etapa de oscuridad disminuye para el grupo LCB, mientras que en el grupo 
OS la actividad aumenta en este periodo y tiene un pico significativamente mayor entre 
las 18 y 21 horas, equivalente a un incremento de 120% en su actividad comparando la 
cantidad de movimientos entre ambos grupos en ese segmento de tiempo. 
 
4.4 El patrón de tiempo en movimiento se modifica en el grupo de ratones LCB 
 
Esta prueba registra la variable que mide el tiempo en segundos que el animal se 
mueve en la horizontal de la caja de fotoceldas. La prueba t-student mostró diferencia 
entre grupos de las 21 a las 24 horas (p= 0.0018), con respecto al grupo OS que 
presenta mayor actividad (figura 12 b). El tiempo de movimiento es diferente para 
ambos grupos de las 9 a las 12 horas (p= 0.0255) siendo mayor para el grupo LCB y de 
las 18 a las 21 horas (p< 0.001) siendo notablemente mayor para el grupo OS. 
También en el registro de esta variable se observa que el grupo OS presenta un pico de 
mayor actividad hacia las 18 horas (p< 0.001) equivalente a un 50%, mientras que el 
pico de actividad del grupo LCB ocurre a las 15 horas. 
 
45 
 
 
4.5 El conteo de episodios de estereotipias es diferente en el grupo experimental 
 
Esta variable cuenta el número de veces que el ratón manifestó alguna estereotipia, 
como acicalarse, lamerse las vibrisas, entre otros (figura 12 c). Las diferencias 
significativas ocurren a las 9 horas (p= 0.0283), a las 18 (p= 0.0002) y a las 21 horas 
(p= 0.0114), siendo estos dos últimos con mayor conteo de episodios de estereotipias 
para el grupo OS. Se observa notablemente que esta variable va disminuyendo 
conforme transcurren las horas para el grupo LCB, contrario al grupo OS, en el que su 
conteo es 40% mayor a las 18 horas. El ANDEVA reveló que los grupos son diferentes 
debido al tratamiento [F(1, 26)= 0.218, p= 0.0001], para el tiempo de muestreo [F(7, 182)= 
114.025, p= 0.0001] y para la interacción tiempo vs tratamiento [F(7, 182)= 7.236, P= 
0.0001]. 
 
4.6 Los ratones con LCB recorren mayor distancia en el centro a las 18 y a las 21 
horas 
 
Esta variable mide la distancia en centímetros que el ratón recorre en el centro de la 
caja de fotoceldas, bajo la premisa de en estado de ansiedad, el animal se ubicaría en 
los márgenes de la caja (Ferreira et al., 2017) (figura 12 d). Esta variable, igual que las 
anteriores, presenta una actividad desfasada entre los grupos, ya que el LCB tiene su 
mayor actividad a las 9 horas (p= 0.0214) mientras que el grupo OS la tiene a las 18 
horas (p< 0.0001), este último con una diferencia mayor del 150%. Se observaron 
diferencias en la distancia durante el tiempo de muestreo [F(7, 182)= 61.341, p< 0.0001] y 
en la interacción tiempo de muestreo con tratamiento [F(7, 182)= 8.744, p< 0.0001].