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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE MÉDICINA “ANÁLISIS CUANTITATIVO DE LAS CITOSINAS EN LA PELÍCULA LAGRIMAL DE PACIENTES CON PTERIGIÓN PRIMARIO, PTERIGIÓN RECIDIVANTE Y SUJETOS SANOS" ESPECIALIDAD EN OFTALMOLOGÍA PRESENTA: DALIA NAYELY RANGEL ACOSTA ASESOR: VICTOR MANUEL BAUTISTA DE LUCIO UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Título. "Análisis cuantitativo de las citosinas en la película lagrimal de pacientes con pterigión primario, pterigión recidivante y sujetos sanos" Investigador responsable, investigadores asociados o participantes y Departamentos y/o instituciones participantes. Dalia Nayely Rangel Acosta, Victor Manuel Bautista de Lucio, Dr. Angel Nava Castañeda. Fecha probable de inicio y de finalización de la investigación. 02 mayo del 2012 a 30 julio del 2012. ÍNDICE Introducción Justificación Hipótesis Objetivos Material y Métodos. Diseño del estudio Implicaciones éticas Muestra Variables del estudio Análisis estadístico Resultados Discusión Conclusión Referencias. Introducción. El pterigión representa una de las patologías de superficie ocular más común en países con relativamente alta exposición a la radiación ultravioleta 5, tal como lo es México. El pterigión constituye una hiperplasia fibrovascular de carácter benigno de la conjuntiva bulbar que invade la córnea1,2,3. Esta clasificado dentro de la degeneraciones no involutivas o tumorales epiteliales benignas corneales. Se localiza en la conjuntiva bulbar cerca del limbo corneal en el área interpalpebral, a las 3 o 9 hrs, puede ser nasal, temporal, o bipolar. Así como unilateral o bilateral en un 25%3,4. La patogénesis todavía no es bien comprendida, se sabe que se origina en el limbo y se desarrolla la activación y proliferación de células madre basales limbales epiteliales que migran y disuelven la membrana de Bowman1. Histológicamente consiste en una masa de tejido subepitelial que ha sufrido degeneración elastótica, llamada así porque las fibras de colagenasa degeneradas se tiñen basofílicamente y también positivamente con las tinciones para el tejido elástico, pero no son sensibles a la digestión por elastasa, estos haces fibrosos se disponen sobre un fondo de degeneración hialina 1,5,7. Además de infiltración de células inflamatorias y acumulo de matriz extracelular anormal compuesta de pro elastina y colágeno5,7. La capa de Bowman se muestra engrosada e incluso destruida y el epitelio que lo cubre puede mostrar acantosis, disqueratosis y cambios de naturaleza displásica, observándose también neoformación de vasos sanguíneos junto a cambios inflamatorios1,2,4. Histológicamente se ha divido en tres tipos 4: a. Angiomatoso, en el cual el estroma contiene un número significativo de canales vasculares con edema en el espacio intervascular. b. Fibroso, en el presenta fibrosis de forma predominante con pocos elementos vasculares. c. Mixto, el cual contiene ambos elementos. Epidemiológicamente existe evidencia que sugiere que la exposición a la radiación UV (RUV) puede ser el desencadenante inicial para el desarrollo de esta lesión (Coronoeo,1993; Ciribei et al., 1999). Además se ha reconocido a la radiación UV como factor que puede producir mutaciones en genes supresores de tumores como p53, así como alteraciones en el ADN de las células basales. Debido al bloqueo del mecanismo de muerte celular programada, las mutaciones en otros genes puedan perpetuarse en células basales limbales alteradas 4,6,7,8. Se ha visto además que los mecanismos de apoptosis y proliferación celular en el tejido de pterigión se encuentran alterados. Los fibroblastos presentan características de células transformadas incluyendo pérdida de la heterocigosidad e inestabilidad microsatelital, y aun más en proliferación de la capa de tejido fibrovascular en pterigiones recurrentes9. Se ha mostrado mediante inmunohistoquímica con anticuerpos contra triptasa para mastocitos, que esta se encuentra en cantidades más elevadas en tejido de pterigión. Esta célula puede ser un factor en su patogénesis al tener un papel importante en la hipersensibilidad tipo I. Estos tienen la propiedad de liberar productos altamente tóxicos como la proteína básica mayor y la proteína catiónica eosinofilica además de radicales libres de oxigeno, eicosanoides, citocinas Th2 y factores que inducen el desprendimiento de células epiteliales y aumento de la permeabilidad vascular4. Los fibroblastos también juegan un papel importante en la recurrencia y formación ya que producen factores de crecimiento como el factor de crecimiento fibroblástico (bFGF) y factor transformante ᵦ1 en mastocitos, además promueven la formación de capilares intraepiteliares y epitelio del pterigión 1,4,8. Recientemente se ha demostrado la importancia de las células epiteliales en el desarrollo del pterigión, debido a que se mostró que este tipo de células expresan abundantes niveles de metaloproteinasas 1,5,6,7. Lee et al 7 también observaron elevados niveles de MMPs en fibroblastos de pterigión en comparación con los fibrobastos de conjuntiva normal. Las metaloproteinasas (MMPs), estas son una familia de endopeptidasas capaces de desnaturalizar la mayor parte de los componente de la matriz extracelular. Se producen fisiológicamente en pequeñas cantidades en fibroblastos y células epiteliales. Se dividen en cuatro grupos; colagenasas, gelatinasas, estromelisinas y MMPs tipo membrana. Estas se regulan en múltiples niveles incluyendo en la transcripción, secreción, activación e inhibición., por las proteínas llamadas inhibidores de tejido de MMPs (TIMPs). El balance entre los niveles enzimas activadas y los TIMPs libres determina la actividad de las MMPs. El mantenimiento de este equilibrio es esencial, y cualquier alteración en el mismo es un determinante critico para la proteólisis e invasión de tejido1,4,5,. Además las citocinas y factores de crecimiento tales con bFGF, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformador (TGF)‐b y factor de necrosis tumoral (TNF)‐ a, se ha localizado en células de pterigión. Por lo tanto no es irracional proponer que ambos tipos de células actúan en conjunto para degradar la BL y otras estructuras del tejido conectivo 1. Se han reportado un gran número de citocinas proinflamatorias, factores de crecimiento y angiogenicos, así como sus receptores en los pterigiones, los cuales actúan paralelo en la cascada de cicatrización de heridas de la cornea (tabla 1)7,8. Tabla 1. Factores y citocinas en pterigión. Citocina/Factor de crecimiento Epitelio Fibroblastos Endotelio Vascular Referencias Factor de crecimiento básico de fibroblastos presente Presente Presente Kría et al (1996,1998), Powers et al (1997) Factor de crecimientode tejido conectivo Presenta y en todo el espesor Presente Presente Van Setten et al (2003) Ligando de heparina EGD Presente Ausente Presente Nolan et al (2003) Interleucina 6 Presente en epitelio Ausente en cel basales No esta descrito Presente Di Girolamo et al. (2002). Interleucina 8 Presente en epitelio Ausente en células basales No esta descrito Presente Di Girolamo et al. (2002). Factor de crecimiento derivado de plaquetas Presente Detectado en tejido y también en cultivos de fibroblastos de pterigión. Presente Kria et al (1996), 1998) Factor de necrosis tumoral alfa Presente Presente No se han reportado detalles Kria et al (1996,1998) Factor de crecimiento Presente Detectado en tejido y Presente Kria et al (1996,1998) transfcormador beta cultivos Factor de crecimiento vascular endotelial Presente Presente Presente Lee et al (2001) Marcovich et al (2002) Van Setten et al (2003) Otros Factores Factor de crecimiento similar a insulina ligador de proteína‐2 Epitelio basal del pterigión y células goblet conjuntivales Cultivos de fibrobastos de pterigión Matriz extracelualr estromal No esta descrito Solomon et al (2003) Factor de celular madre Tinción no especifica Presente y mas fuerte en la tapa No tiñe Nakagami et al (2000) A través de ensayos in vitro se han obtenido datos que sugieren que las citocinas pro inflamatorias pueden modificar la expresión de los componentes de la matriz extracelular9, aunque la función de las citocinas y factores de crecimiento en la patogénesis del pterigión está por establecerse. Varios estudios han documentado la expresión de citocinas en el pterigión y cultivos de células derivadas del mismo (Tabla 1)9. Dentro de las principales citocinas mencionadas en la literatura encontramos: La IL‐8 (interleucina 8), es un producto de monocitos activados, fibroblastos y células epiteliales y endoteliales. Es una citosina proinflamatoria, multifuncional, con actividad angiogénica, quimiotactica de neutrófilos y de actividad proliferativa de queratocitos. Se produce en respuesta a numerosas citocinas. También ha demostrado inducir la producción de MMPs9. La IL‐6 (interleucina 6), es una citocina pleiotrópica proinflamatoria sintetizada por fibroblastos células endoteliales y queratinocitos en respuesta a varias citocinas incluyendo TNF alfa e IL‐ 1, similar a IL‐8, IL‐6 también puede inducir la expresión de MMPs 9. Consistente con su rol angiogénico, existen evidencias de la producción de estas citocinas que puede ser inducida por radiación UV. Con relación a esto, Kennedy et al aplicó a fibroblastos corneales humanos dosis fisiológicas de radiación UV‐B y demostró una expresión significativa de IL‐ 1, IL‐6, IL‐8 y TNF alfa. Ansel demostró una aumento de la expresión de las mismas citocinas en el epitelio corneal después de exposición a radiación UV. Estos datos sugieren que esta inducción es mediada por un factor proveniente del núcleo (NF‐B). En experimentos similares, la expresión más elevada de IL‐6 mRNA fue de 2 a 6 horas después de la irradiación por UV‐B en queratinocitos humanos10. IL‐1 (interleucina 1), se encuentra normalmente en la piel, epitelio y endotelio corneal, se compone de un sistema de IL‐1ᵅ, IL‐1ᵦ y receptor agonista de IL1 y todos son inducidos por la radiación UV. La liberación de la IL‐1 induce la expresión de otras citocinas proinflamatorias como IL‐6, IL‐8 y TNF ᵅ de los queratinocitos. Además induce migración celular, expresión de colagenasa (MMP‐1) y estringomielina7. Aunque ya se ha descrito la presencia de citocinas en pterigión no existe reporte alguno del perfil de citocinas en lágrima y su papel en la génesis del mismo esta por determinarse. Justificación: El pterigión continúa siendo una de las patologías más comunes en nuestro medio, este involucra un cuadro de inflamación crónica, proliferación del tejido conectivo subconjuntival y la presencia de angiogénesis, provocando un crecimiento de tejido elastótico y de la conjuntiva anormal sobre la córnea. El aumento en su prevalencia y los costos derivados de su atención hacen que sea considerado como un problema de salud publica. En el entendimiento de este proceso hay múltiples estudios considerando evidencias genéticas, patológicas, ambientales, moleculares, sin embargo, no se dilucidado bien la fisiopatología del pterigión, mediante este estudio contribuiremos en el camino para comprender mejor este proceso fisiopatológico. Por lo que el análisis y comparación de las citocinas en lágrima de los pacientes con pterigión primario, recidivante podría ayudar a determinar el papel que tienen las citocinas en lágrima en el desarrollo del pterigión, así como también podría determinar su posible uso como blanco terapéutico. Hipótesis: Existe una expresión diferencial de citocinas en lágrima de pacientes con pterigión primario y pterigión recidivante en comparación de lágrima de pacientes sanos, presentándose un aumento significativo en la expresión de IL‐1, IL‐6, IL‐8 y TNF alfa en lágrima de pacientes con pterigión recidivantes en comparación con sujetos sanos. Objetivo general: Analizar los niveles de expresión de citocinas en la película lagrimal de pacientes con pterigión primario y pterigión recidivante en comparación con sujetos sanos. Material y Métodos: Diseño del estudio Estudio Observacional, prospectivo, transversal, comparativo y abierto. Implicaciones éticas La toma de muestra de lágrima no implica ningún riesgo anatómico ni visual para el paciente así como tampoco es un factor que altere la evolución de su patología ocular. Muestra Se tomara mediante capilaridad una muestra de película lagrimal de 30 pacientes con pterigión primario, 15 pacientes con pterigión recidivante y 30 pacientes sanos de control. Se procesara la muestra y medirán las concentraciones de las diferentes citocinas en los tres diferentes grupos se procederá al análisis estadístico para valora cuales pueden ser importantes en al génesis de esta patología. Criterios de inclusión, exclusión y eliminación. Criterios de inclusión: Pacientes con pterigión primario o recidivante que acepten que se tome una muestra de lagrima, y pacientes sanos que acepten la toma de muestra igualmente, ambos sexos, mayores de 18 años, cualquier ocupación y lugar de residencia, pterigión de tiempo de evolución indeterminado, de topografía nasal, temporal o bilaterales, los pacientes con pterigión recidivante será su primera recidiva. Criterios de exclusión: pacientes con blefaritis, enfermedades que afecten mucosas y conjuntiva (conjuntivitis crónica, Steven Johnson, tracoma), enfermedad ocular que requiera el uso crónico de colirios y uso crónico de medicamentos tópicos excepción de lagrimas artificiales. Criterios de eliminación: muestra insuficiente. Variables del estudio Variables independientes: lagrima de pacientes con pterigión primario, pterigión recidivante, lagrima sana. Pterigión primario: Definición conceptual: hiperplasia fibrovascular de carácter benigno de la conjuntiva bulbar que invade la córnea. Definición operativa: presencia de vasos y tejido fibroso sobre la superficie corneal sin previa resección quirúrgica. Tipo de variable: cualitativa Medición: nominal. Pterigión recidivante: Definición conceptual: recurrencia de tejido fibrovascular posterior a una cirugía de pterigión en la misma zona quirúrgica. Definición operativa: presencia de vasos y tejido fibroso sobre la superficie corneal en el área quirúrgica. Tipo de Variable cualitativaMedición: nominal. Lagrima de sano: Definición conceptual: es lágrima de pacientes sin alteraciones en la superficie ocular, ni patología que implique un proceso inflamatorio ocular. Definición operativa: ausencia de patología o proceso inflamatorio en el globo o superficie ocular. Tipo de variable: cualitativa. Medición: nominal. Variables dependientes: Expresión de citosinas en unidades relativas. Citocinas: Definición conceptual: proteínas que regulan la función de las células que las producen u otros tipos celulares; son agentes responsables de la comunicación intercelular, inducen la activación de receptores específicos de membrana, funciones de proliferación y diferenciación celular, quimiotaxis, crecimiento y modulación de la secreción de inmunoglobulinas. Variable cuantitativa, ordinal. Definición operativa: mediante la técnica de microarreglos (descrita abajo), se medirá mediante unidades relativas la concentración de citocinas en las diferentes muestras. Variable: cuantitativa. Medición: ordinal. Técnica de microarreglos de proteínas. La técnica de obtención de lagrima es a través de tubos de capilaridad, se aplicara una gota previa de solución salina, se posterior a tres parpadeos, se colocara el tubo de capilaridad sin tocar bordes palpebrales y se absorbera la lágrima. Se analizaran un total de 30 muestras de lágrima de pacientes con pterigión primario, 15 muestras de pacientes con pterigión recidivante y 30 muestras de pacientes sanos, por medio del arreglo de proteínas humanas de apoptosis (R&D Systems). Para la purificación de proteínas se utilizara el kit Ready prepTM 2‐D cleanup. Brevemente, se tomaran 100 µl de la muestra y se les agreglaran 300 ml de precipitante, así como 300 µl de co‐ precipitante. Se incubaran a 4°C durante 15 minutos. Se centrifugaran durante 5 minutos a 14000 rpm. Se retiraran todo el sobrenadante, cuidando de no dispersar el botón. Al botón se le agregaran 40 µl de co‐precipitante y se incubaran durante 5 minutos en hielo. Se centrifugaran durante 5 minutos a 14000 rpm, enseguida se retirara el sobrenadante. Posteriormente se adicionaran al botón 25 µl de agua desionizada. Se vortexearan durante 5‐10 segundos, asegurándose de que el botón se dispersara. Se agregaran 1 ml de buffer de lavado congelado (‐ 20°C) y se adicionaran 5 µl del aditivo de lavado. Se incubó a ‐20°C durante 60 minutos. Luego, las muestras se centrifugaran durante 5 minutos a 14000 rpm. Se retiró el sobrenadante y se secó el botón a temperatura ambiente. Por último, se resuspendera el botón el 135 uml de buffer de lisis. Las muestras se trataran con un buffer de lisis [20 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.15 mM Na Cl, 50 mM NaF, 4 mM Na3VO4 1% Triton X‐100 e inhibidores de proteasa (Roche, Germany)] y las proteínas obtenidas serán cuantificadas. Se incubaran 200 microgramos de proteínas con los arreglos siguiendo el proceso del fabricante. Después de la incubación y el lavado de las proteínas, los arreglos se analizaran con quimioluminicencia (GE Healdthcare, Uk), y los patrones serán capturados por medio del fotodocumentador Dyversity System (Syngene, UK) y analizados con el software Gene Tools (Syngene, UK). La densitometría del patrón será normalizada con respecto al control interno. Análisis estadístico Se realizara un análisis de varianza en una vía entre los grupo A, B y los controlas para comparar los resultados de concentración de citocina. Se considero valor de p<0.05 como estadísticamente significativo. Se utilizo el programa GraphPad Prism 5.0. Tabla 2 Citocinas a evaluar. Coordinador Objetivo/Control Nomenclatura alterna A1, A2 Punto de referencia ___ A3, A4 C5/C5a Complemento componente 5/5a A5, A6 CD40 Ligando CD154 A7, A8 G‐CSF CSFβ, CSF‐3 A9, A10 GM‐CSF CSFα, CSF‐2 A11, A12 GROα CXCL1 A13, A14 I‐309 CCL1 A15, A16 sICAM‐1 CD54 A17, A18 IFN‐γ tipo II IFN A19, A20 Punto de referencia ___ B3, B4 IL‐1α IL‐1F1 B5, B6 IL‐1β IL‐1F2 B7, B8 IL‐1ra IL‐1F3 B9, B10 IL‐2 ___ B11, B12 IL‐4 ___ B13, B14 IL‐5 ___ B15, B16 IL‐6 ___ B17, B18 IL‐8 CXCL8 C3, C4 IL‐10 ___ C5, C6 IL‐12 p70 ___ C7, C8 IL‐13 ___ C9, C10 IL‐16 LCF C11, C12 IL‐17 ___ C13, C14 IL‐17E ___ C15, C16 IL‐23 ___ C17, C18 IL‐27 ___ D3, D4 IL‐32α ___ D5, D6 IP‐10 CXCL10 D7, D8 I‐TAC CXCL11 D9, D10 MCP‐1 CCL2 D11, D12 MIF GIF, DER6 D13, D14 MIP‐1α CCL3 D15, D16 MIP‐1β CCL4 D17, D18 Serpin E1 PAI‐1 E1, E2 Punto de referencia ___ E3, E4 RANTES CCL5 E5, E6 SDF‐1 CXCL12 E7, E8 TNF‐α TNFSF1A E9, E10 sTREM‐1 ___ E19, E20 Control negativo ___ Resultados Se incluyeron un total de 45 muestras de lágrimas de pacientes con pterigión primario (n=15), pterigión recidivante (n=15) y sujetos sanos (n=15). El promedio de edad de cada grupo fue de 48.66 para pterigión primario, 42.8 para recidivantes y 36.06 para sujetos sanos. Las mujeres representaron el 75.5% y los hombres el 24.5% de los pacientes estudiados. Respecto a la localización anatómica del pterigión el 87.8% fueron de localización nasal, 9.09% localización temporal y bilaterales el 6.06%. Se analizó la expresión de 37 citocinas en las muestras de lágrima de los pacientes de los tres grupos. Esta se realizó mediante arreglo de proteínas. Las citocinas analizadas se encuentran descritas en la tabla 1. Al analizar y comparar la expresión de estas citocinas en las lágrimas de pterigión primario con respecto a las de los sujetos sanos se obtuvieron las expresiones relativas y se agruparon de acuerdo a la función de las citocinas (Figura 1) . En el g cambio pterigi Dentro sobree negativ En el g sobree En el g signific Dentro sobree dismin Y por u no se p grupo de las c o significativo ón primario. o del grupo d expresaron (m va, ya que su grupo de Th expresión (4.5 grupo de ant cativos en la e o del grupo de expresión de uyo 4.8 vece ultimo en la f presento ning citocinas con o en la expr de las quimio más de 2 ve expresión dis 1, el cual inc 5 veces) de e tiinflamatoria expresión. e citocinas in SICAM 1 (6 v es (figuras 1 y familia de IL‐ gún cambio si función Th2 resión de es ocinas, se ob ces); por otr sminuyó más cluye IFN‐g, sta última int as compuesto flamatorias y veces más), y y 2). 12 e IL 17 co gnificativo. , el cual inclu stas interleuc bservó que G ro lado IP‐10 de dos veces IL1a, IL1b, IL terleucina; el o por IL‐1ra, y de diferenci una regulaci mpuesta por uye a IL‐4, IL‐ cinas en las RO‐alfa, IL‐8, 0 y serpina p s (figura 2). L32a, TNFa e resto no pres IL‐2 e IL10 iación celular ión negativa r IL‐6, IL‐12p7 ‐5 e IL‐13, no lágrimas de , I‐TAC, MCP presentaron e IL‐16 solo s sento cambio no se presen r encontramo de MIF ya qu 70, IL17, IL17 o se observó pacientes c P‐1 y MIP‐1b una regulaci se observo u os significativ ntaron camb os una marca ue su expresi E, IL‐23, e IL‐ un con se ión una os. ios ada ión ‐27 Figura 1 de lágri Figura 2 Ahora recidiv se agru . Expresión difer ma de pacientes . Expresión difer al analizar vante con resp upan a contin rencias por grup s sano. rencial de citocin y comparar pecto a las de nuación (figur pos de citocinas nas en lágrima d la expresió e los sujetos a 3 y 4). de lágrima de p de pacientes con n de estassanos se obtu pacientes con pte n pterigión prima citocinas en uvieron las ex erigión primario ario vs lagrima d n las lágrima xpresiones di o en comparació de sujetos sanos as de pterigi iferenciales q ón s. ión que Figura 3 con los s Figura 4 En el g 32a y ( En las q las cito Dentro al igua Del gru C5/C5a En el g mayor Por últ primar diferen En el p de la IL En el g (150 ve menos En el g mas). . Expresión difer sanos. . Expresión difer grupo de Th1 2 veces mas) quimiocinas s ocinas no mos o de las citoci l que en el gr upo de citoc a (4 veces ma grupo de la f de IL‐17. timo al anali rio con respec nciales que se primer grupo L‐1b (3 veces grupo de qui eces mas), de s. rupo de citoc rencial por grup rencial de citocin se encontró la IL‐1b. se observo un straron camb nas antiinflam upo Th2, don inas inflamat as) y G‐CSF (do familia de IL1 izar y compa cto a la de los e agrupan a co Th1, se obser mas). miocinas enc e serpin (8 ve cinas antiinfla os de citocinas d nas en lágrima d una sobreex na expresión bios significati matorias no s nde tampoco torias y difer os veces mas 12 e IL‐17, so arar la expres s pacientes co ontinuación ( rvo una sobre contramos de eces) y ya exp amatorias se p de lágrima de pa de pacientes con xpresión (5 ve 5 veces mas a ivos. se presento n se presentaro renciación ce ). olo encontram sión de esta on pterigión r (figuras 5 y 6) eexpresión de e gran releva presión negat presento una acientes con pte n pterigión recid eces mas) de alta de IP10 y ninguna expre on cambios im lular se obse mos una expr s citocinas e recidivante se ). e dos interleu ancia la sobre tiva de MCP a sobreexpres erigión recidivan ivante versus su e IL‐16, (4 ve y 2.5 veces GR esión diferen mportantes. ervo una sob resión difere en las lágrima e obtuvieron ucinas IL‐32a e todo la exp P‐1 presentán sión al doble d nte en comparac ujetos sanos. eces mas) de ROa. El resto cial significat breexpresión ncial seis vec as de pterigi las expresion (7 veces mas presión de IP ndose dos vec de IL10 (2 vec ción IL‐ de iva de ces ión nes s) y P10 ces ces Y en e veces m En la fa Y en Th Figura 5 con lágr Figura 6 con pter Discusi el grupo de in mas), además amilia de IL12 h2 no se pres . Expresión difer ima de paciente . Expresión difer rgión primario. ión: nflamatorias s de C5/C5a ( 2 e IL17, solo ento una exp rencial por grup es con pterigión rencial de citocin y diferenciac 5 veces) y GM se presento u presión signifi os de citocinas d primario. nas en lágrima d ción celular l MCSF (2 veces una expresión cativa de algu de lágrima de pa de pacientes con la marcada s s). n 4 veces may una interleuc acientes con pte n pterigión recid sobreexpresió yor de IL17. cina. erigión recidivan ivante versus lag ón de MIF (2 nte en comparac grima de pacien 200 ción ntes Se ha visto a través de los diferentes estudios de pterigion que múltiples factores influyen tanto en su aparición como desarrollo. Un factor importante para su génesis es también el microambiente de la superficie ocular y la lágrima, que forma parte de este microambiente. Como podemos observar en nuestros resultados los factores y citocinas expresados en lágrima de los diferentes grupos son bastante distintos, lo que nos sugiere que esta es otra pieza del rompecabezas en la génesis y desarrollo del pterigion. En lágrima de pacientes con pterigión primario hubo una expresión estadísticamente significativa en el grupo de quimiocinas de la proteína quimiotáctica de monocitos‐1 (MCP‐1) también conocida como CCL2. Esta citocina tiene actividad quimiotáctica para monocitos y basófilos, células T de memoria y células dentriticas11,13. Clínicamente ha sido implicada en la patogénesis de enfermedades caracterizadas por infiltrados monociticos como psoriasis, artritis reumatoide, aterosclerosis, además es un quimioatrayente de leucocitos a través de las barreras hematorretiniana y hematoencefalica pues ha sido implicada en procesos inflamatorios y angioproliferativos en cerebro y retina12. Lo que nos hace pensar que también podría en el pterigión contribuir de forma importante en el proceso angioproliferativo del pterigión primario. Dentro de este grupo también encontramos elevada a IL‐8, la cual también actúa como factor quimiotáctico de n<eutrófilos y otros linfocitos, se ha encontrado en capas superficiales del epitelio del pterigión y es inducida por la radiación ultravioleta. Esta citocina es un inductor directo de la angiogénesis corneal, puede actuar como un mitogeno y quimiotrayente de células endoteliales vasculares7. El quimiotrayente de interferón inducible de células T alpha (I‐TAC o CXCL11) el cual es producido por neutrófilos y atrocitos en respuesta a inteferon gama en combinación con interferón alfa o lipopolisacaridos bacterianos 14. Importante mencionar que este factor es inhibido por IL 10 la cual dio mediciones bajas en comparación con IL1 y IL2. La proteína inflamatoria del macrófago (MIP), de la cual existen dos grupo MIP‐1α (CCL3) y MIP1‐ᵦ (CCL4) en humanos. Estas son producidas por macrófagos y estimuladas por endotoxinas bacterianas y procesos inflamatorios, e incluso virus15. Esta activa a los granulocitos e induce la liberación de citocinas proinflamatorias como IL‐1, TNF e IL6.; la cual se encuentra expresada 6 veces más en lágrima de pacientes con pterigión. La IL‐16 la cual también la encontramos elevada es una citocina proinflamatoria, quioatrayente de linfocitos CD4, mocitos y eosinofilos, esta tambien ha sido implicada como inhibidor de la expresión de RNAm viral del virus de inmunodeficiencia humana23 ;el oncogen regulador de crecimiento α (GROα, CXCL1) es una citocina con actividad oncogénica, la cual es un factor importante para la angiogénesis inducida por trombina la cual esta tambien altamente relacionada con el factor de crecimiento endotelial (VEGF), encontradose una amplia asociación de GRO‐α en el crecimiento, quimiotaxis y metástasis de multiples línea tumorales16.; por ultimo en este grupo la molecula‐1 de adhesión intercelular soluble (sICAM‐1) presentó una expresión 6 veces mayor, esta ha relacionado con la angiogénesis y alteraciones en el tejido conectivo; incluso se ha relacionado como factor adicional para la formación de vitreoretinopatia proliferativa17 y como un marcador de inflamación para pacientes con oftalmopatía de Graves18. Lo que nos podría hacer pensar que tambien existen alteraciones por lipopolisacaridos bacterianos o partículas virales que induscan este péptidos antimicrobianos y contribuyan a la formación del pterigión, sin embargo tambien observamos que encontramos factores proangiogenicos e incluso oncogénicos lo que no podría hacer llevar a una hacia rama mas inmunológica y tumoral. En el grupo de lágrima de pterigión recidivante comparado con lágrima de pacientes sanos podemos observar (figura3) que existe una notable diferencia en la expresión de las siguientes citocinas: IP‐10 (CXCL‐10) proteína inducida por INFγ la cual se expresó 5 veces mas en lagrima de pacientes con pterigión, esta proteína es quimiotrayente de monocitos/macrófagos, células T, células NK y células dendriticas, promueve la adhesión de células T a células endoteliales, tiene actividad antitumoral y es un inhibidor de angiogénesis. Lo que nos pudiera estar hablando de un mecanismo que intentadisminuir el proceso proliferativo en estos pacientes. En competencia con los mecanismos proliferativos representados por la expresión elevada de GROα, IL‐16, IL32α, y la marcada sobreexpresión de C5/C5α (las cuales son enzimas que participan en la activación de complemento) e IL 17 expresada 4 veces más, la cual es un potente mediador de la inflamación, asociado comúnmente a reacciones alérgica, induce citocinas como IL‐6, G‐CSF (el cual también esta sobreexpresado en nuestro estudio), GM‐CSF, IL‐1ᵦ, TGF‐ᵦ, TNF‐α, quimiocinas IL‐8, GRO‐α y MCP‐1 además de prostaglandinas de muchos tipos celulares, fibroblastos, células endoteliales, células epiteliales, queratinocitos y macrófagos20. Ahora el patrón de expresión de citocinas en lágrima de pacientes con pterigión primario versus recidivante nos muestra diferencias muy interesantes (figura 5 y 6). La expresión diferencial principal esta dada por MIF la cual se expresa 200 veces más, este factor inhibidor de migración de macrófagos es una potente citocina con actividad proinflamatoria ya que tiene la capacidad de inducir la secreción de moléculas como TNFα, IFNγ, IL‐1β, IL‐6, moléculas de adhesión, quimiocinas y metaloproteinasas de matriz (MMPs)21. Asimismo, se ha comprobado que MIF es capaz de inhibir la apoptosis dependiente de p53 y favorecer la activación y proliferación de células T. Y con esto inactivar la función anticancerígena de P53 alterando el equilibrio de multiplicación y muerte celular, permitiendo así la perpetuación del daño al DNA que ocurre en los procesos inflamatorios crónicos22. Esto nos esta hablando de una citocina que bloquea los factores anticancerígenos, y que induce con ello la proliferación celular expresada 200 veces mas en lagrima de pacientes con pterigión recidivante los que nos hace pensar que el pterigión presenta efectivamente datos característicos de una neoplasia. Se ha encontrado además una amplia relación en proceso inflamatorio de la artritis reumatoide y MIF, incluso se ha postulado a esta citocina como un blanco terapéutico21. Todo esto además acompañado de una activación del complemento con C5/C5a mostrado por una elevación 5 veces mayor y además de una estimulación de granulocitos y macrofagos por el factor estimulantes de colonias granulocitias‐macrofagos (GMCSF) el cual se expresa al doble. Dentro de este proceso inflamatorio los inhibidores de proteínas séricas (serpina) también esta presente 8 veces más aumentando el proceso inflamatorio. Además de IL‐32 expresada 7 veces mas, estimula la atracción de macrófagos, junto con la IL‐17 que se encuentra 4 veces mas expresada e IL 10 y serpin tambien sobreexpresadas al doble. Otra ci antiang mecan negativ de la n Analiza citocin a su ve células citocin TAC, es cual in los linf forma Figura 7 En el g produc TNFα, relacio células pero p círculo m Linfocito tocina con un giogenicas y ismos inflam va de MCP‐1 eovasculariza ando el pano as de los pac ez tiene una r s tales como as las cuales sta ultima la duce más I‐TA focitos con p el círculo infl 7. Relación de grupo de rec cción de IL‐16 IL‐8, estas últ ona con VEGF s T, células N or supuesto c inflamatorio macrófago na expresión antineoplas atorios previa lo cual nos h ación. rama genera cientes con pt relación estre monocitos cé continuar en IL‐16. Los ma AC, y por los producen IL‐1 amatorio en quimicionas en cidivantes la 6 por eosinóf timas dos tam . Además se o K, células den con todo lo p o (Figura 8). MIP‐1ᵦ Eosinóf IL‐16 importante sicas podemo amente descr habla de una l podemos o terigión prim echa con GRO élulas t, célul n proceso infl acrófagos com monocitos M 16 que estimu la lágrima de n el proceso in IL 17 juega filos y linfocit mbién son ind observo un au ndríticas, con previo una ac MC Mono ilo es IP 10 (150 os pensar q ritos. Además actividad dis bservar la ex ario, iniciamo Oα. Dentro de las dendrítica lamatorio, es mo tal produc MCP‐1ᵦ el cual ula a los eos pterigión pri nflamatorio en un papel mu tos T, ademá ductores de IL umento de IP n actividad an tivación del c IL‐6 I CP 1‐ᵦ ocito S 0 veces mas), que esta tra s en este grup sminuida en s xistencia de u os con sicam el proceso in as y macrófag s como la IL‐8 cen MIP‐1ᵦ el l es estimulad sinófilos. Así imario (Figura lagrima de pac uy important ás de G‐CSF, I L‐32 y por ult P‐10 la cual at ntitumoral e complemento I‐TAC TNFα SICAM GRO‐α , la cual por s atando de c po se observo sus actividade una conexión la cual induc flamatorio te gos como tal 8 la cual tam cual también do por TNFα, con todos es a 7). cientes con pte e pues ella d IL‐1ᵦ por mac imo GROα q trae monocito inhibidor de o con C5/C5a IL‐8 INFγ sus propiedad ontrarestar o una expresi es de inducci entre todas e a VEGF y es enemos much es producien bién induce a n induce INFγ aunado a est stos factores erigión primar desencadena crófagos, TGF uien a su ves os, macrófag la angiogéne cerrando así Fi q VEGF des los ión ión las ste has ndo a I‐ γ el tos se io. la F‐ᵦ, se os, esis í el ibroblastos, ueratinocitos Figura 8 Por últ previam cuales tambié mas GR Figura recidiva INF‐γ 8. Relación de timo en el gr mente menc también se én son induci RO‐α, MCP‐1, 9. Relación d ante versus pri IL‐32 IP‐1 citocinas en el rupo de recid ionadas con relacionan c dos por la IL , GMCSF entr de citocinas e mario. Granulocitos TNF IL‐ 10 proceso inflam divantes vs pr la expresión con IL‐32, M L‐17 la cual ju re otros, cerra expresadas di ‐α ‐8 IL‐17 C5/ matorio de lág rimarios se o n importante IF además in uega un pape ando así el cír iferencialment MIF IL‐6 IL‐1ᵦ IFNγ /C5α rima en pacien observaron in de MIF el c nduce INFγ, el crucial pue rculo inflama te en lágrima IL‐17 MC GMCSF G‐CSF IL‐1ᵦ TGF‐ᵦ TNF‐α Il‐8 GRO‐α ntes con pterig volucradas to cual induce T IL1‐ᵦ, IL‐6 qu es induce a to torio (figura 9 a de paciente TG CP‐1 gión recidivant odas las célu TNFα e IL‐8, uienes a su v odas las prev 9). es con pterig Fᵦ GRO IL‐16 VEGF IL‐32 e. las las ves vias ión F Conclusiones: En lágrima de pacientes con pterigión primario encontramos una respuesta inflamatoria mediada principalmente por quimiocinas (GRO‐α, IL‐8, I‐TAC, MCP‐1, MIP1ᵦ, IP10, SERPINA), lo que nos sugiere que existe reclutamiento célular de macrófagos, eosinofitos, células T, etc. En lágrima de pacientes con pterigión recidivante la reacción inflamatoria es mediada principalmente por citocinas, lo que nos habla ya de la presencia de células inflamatorias en este microambiente. Cuando comparamos los dos patrones de lágrima de pacientes con pterigión primario vs recidivante observamos la gran sobreexpresión de MIF lo que indica un mediador para perpetuar, el proceso inflamatorio y también la sobreexpresión de IP‐10 la cual pensamos intenta compensar el proceso inflamatorio y angioproliferativo. Anexos: Hoja de recolección de datos. Consentimiento informado. Bibliografía. 1. Nick Di Girolamo,1 Denis Wakefield,1 and Minas T. Coroneo. Differential Expression of Matrix Metalloproteinases and Their Tissue Inhibitors at the Advancing Pterygium Head. Investigative Ophthalmology & Visual Science, December 2000, Vol. 41, No. 13. 2. Adamis AP,StarkT, Kenyon KR. The management of pterygium. Ophtamol Clin north Am 1990; 3(4):611. 3. Bosniak Stephen. Ophthalmic Plastic and Reconstructiva Surgery.W.B Saunders Company. Philadelphia. Pg.208. 4. Eduardo Rojas Álvarez, Ariadna Pérez Ruiz, Aspectos anatomopatologicos del Pterigion Primario. 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Primarios Nombre del paciente Edad Sexo Localización del pterigion Bernardino Morales 42 M Nasal Beatriz Barrera 53 F Nasal Graciela Flores 39 F Nasal Rosa García 51 F Nasal Dolores Padierna 56 F Nasal y temporal Rosa Méndez 47 F Nasal Maria Lopez 47 F Nasal Concepción N. 39 F Nasal Rosalinda 38 F Nasal Sixto 62 M Nasal y temporal Bernal 42 M Temporal Neri Jimenez 54 F Nasal Noralia 59 F Nasal Melinda 39 F Nasal Sixto 62 M Nasal Recidivantes: Alejandro Escobar 31 M Nasal José Luis Gorostieta 54 M Nasal Ma Concepción 64 F Nasal Carmen Rivera 42 F Nasal Araceli Resendiz 50 F Nasal Ma Alberto Espinosa 39 F Nasal. Alejandra Escobar 41 F Temporal. Teresa Sánchez 40 F Nasal Alejandro Montes 39 M Nasal María Almazar 42 F Nasal Carmen Rivera 44 F Nasal Luciana Cruz 46 F Nasal Rosal Linda M 39 F Nasal Ma Amada 41 F Nasal Jose Garcia 30 M Temporal Sanos: Ana Paola 31 F Francisco 36 M Daniela 25 F Alfredo 41 M Daniela 38 F Ma Jose 57 F Francisco 23 M Dalia 22 F Nayely 45 F Vanessa 25 F Aureliano 25 M Sharon 26 F Valeria 46 F Alfredo 53 M Nestor 48 M FORMA DE CONSENTIMIENTO He sido invitado a participar en el estudio de "Análisis cuantitativo de las citosinas en la película lagrimal de pacientes con pterigión primario, pterigión recidivante y sujetos sanos" Se me ha informado de la naturaleza de mi padecimiento y su evolución. El estudio consistirá en la toma de una muestra de lagrima mediante un tubo de capilaridad. En la cual no se me dañara en ningún sentido mi ojo dado que no es algo invasivo. No recibiré remuneración ninguna y estaré en libertad de retirarme del estudio cuando así lo decida. Toda la información que se recabe será confidencial, a menos que el paciente lo solicite sus datos estos se le proporcionaran. El protocolo corresponde al Instituto de Oftalmología Conde de Valenciana, a cargo de la Dra. Nayely Rangel Acosta. Ubicado en Chimalpopoca 14 colonia obrera, Teléfono 54421700. El instituto solo cubrirá los costos del material para la toma de muestra de lagrima. Acepto participar en el estudio. Firma del paciente: TESTIGOS. Portada Índice Texto
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