Analisis-de-la-comunidad-bacteriana-de-la-zona-saturada-de-un-piedemonte-en-un-distrito-de-riego-y-su-potencial-en-la-remocion-de-nitrogeno

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS 
INSTITUTO DE GEOLOGÍA 
BIOLOGÍA EXPERIMENTAL 
 
ANÁLISIS DE LA COMUNIDAD BACTERIANA DE LA ZONA SATURADA DE UN 
PIEDEMONTE EN UN DISTRITO DE RIEGO Y SU POTENCIAL EN LA REMOCIÓN DE 
NITRÓGENO 
 
TESIS 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS 
 
PRESENTA: 
EDUARDO JAVIER AGUILAR RANGEL 
 
TUTOR(A) PRINCIPAL DE TESIS: DRA. ROCÍO JETZABEL ALCÁNTARA HERNÁNDEZ 
INSTITUTO DE GEOLOGÍA, UNAM 
 
COMITÉ TUTOR: DRA. BLANCA LUCIA PRADO PANO 
INSTITUTO DE GEOLOGIA, UNAM 
DRA. MARIA SOLEDAD VÁSQUEZ MURRIETA 
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS, IPN 
 
MÉXICO, CD. MX., ENERO, 2019 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS 
INSTITUTO DE GEOLOGÍA 
BIOLOGÍA EXPERIMENTAL 
 
ANÁLISIS DE LA COMUNIDAD BACTERIANA DE LA ZONA SATURADA DE UN 
PIEDEMONTE EN UN DISTRITO DE RIEGO Y SU POTENCIAL EN LA REMOCIÓN DE 
NITRÓGENO 
 
TESIS 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS 
 
PRESENTA: 
EDUARDO JAVIER AGUILAR RANGEL 
 
TUTOR(A) PRINCIPAL DE TESIS: DRA. ROCÍO JETZABEL ALCÁNTARA HERNÁNDEZ 
INSTITUTO DE GEOLOGÍA, UNAM 
 
COMITÉ TUTOR: DRA. BLANCA LUCIA PRADO PANO 
INSTITUTO DE GEOLOGIA, UNAM 
DRA. MARIA SOLEDAD VÁSQUEZ MURRIETA 
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS, IPN 
 
MÉXICO, CD. MX., ENERO, 2019 
iv 
OFICIO DE EMPASTE 
 
 
UNAl'ó~ 
POSGR DO~~~ 
c· · ~~ ¡ene 1as 10 OglCi'IS 
COORDINACIÓN 
OFICIO CPCB/1149/2018 
Asunto: Oficio de Jurado para Examen de Grado. 
M. en C. Ivonne Ram irez Wence 
Directora General de Administración Escolar, UNAM 
Presente 
Me permito informar a usted, qua el Subcomité de 8 iol091a Experimental y Biomedicina del 
Posgrado en Ciencias Biológicas, en su sesión ordinana del d ie 01 de octubre de 2018, aprobó el 
Jurado para la presentación de su examen para obtener el grado de MAESTRO EN CIENCIAS 
BIOLÓGICAS del alumno AGUILAR RANGEL EDUARDO JAVIER con número de cuenta 
308038761 con la tesis titulada "ANÁLISIS DE LA COMUNIDAD BACTERIANA DE LA ZONA 
SATURADA DE UN PIEDEMONTE EN UN DISTRITO DE RIEGO Y SU POTENCIAL EN LA 
REMOCiÓN DE NITRÓGENO", re31izada bajo la dirección de la DRA. ROCIO JETZABEL 
ALCÁNTARA HERNANOEZ: 
Presidente 
Vocal: 
Secretario' 
Suplente 
Suplente: 
ORA CHRISTlNA DÉSIREÉ SIEBE GRABACH 
DR. ULlSES DURÁN HINOJOSA 
ORA MARíA SOLEDAD VÁSOLJEZ MURRI ETA 
ORA. PAULINA ESTRADA DE LOS SANTOS 
DR. IvAN MORENO ANDRAD E 
Sin otro particu lar, me es grato enviarle un cordial saludo. 
ATENT AMENTE 
" POR MI RAZA HABLARÁ EL EspíRITU" 
Cd , Universitaria, Cd . Mx., a 28 de noviembre de 2018. 
ORo ADOLFO GERAR 
COORDINAD 
NAVARRO SIGÜENZA 
OEL PROGRAMA 
Unidad de PO!'<grad<:> ' Coordinaóón dtd Posgrado en Ciencias Biológk"s Ed ificio o, ler. Pi"o, Circuito de Posgn .. .lo" Cd . Univcnoitaria 
Dde.'\aciÓn Co}'oucan C,p. 04510 México, D.F. Tel. %23 7002 htlp:llpdJiul.p""gr"d'Lun"m .n",: 
v 
AGRADECIMIENTOS INSTITUCIONALES 
 
Agradezco al Posgrado en Ciencias Biológicas de la UNAM, por las herramientas y 
conocimientos otorgados, indispensables en mi formación académica. 
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por la beca otorgada para 
realizar mis estudios de posgrado (CVU: 775174). También doy las gracias a la 
Coordinación General de Estudios de Posgrado por otorgarme el apoyo dentro del 
Programa de Apoyo a los Estudios de Posgrado (PAEP) que me permitió exponer en un 
foro internacional el proyecto de investigación realizado en el posgrado. Así mismo 
agradezco al Instituto de Geología, UNAM por brindarme una beca para la realización de 
esta tesis. 
Esta investigación se realizó gracias al financiamiento otorgado por el Consejo de 
Ciencia y Tecnología (CONACyT), convocatoria de Ciencia Básica “Procesos biológicos 
en la zona crítica: influencia en la remoción de nitratos y otros compuestos contaminantes 
en suelos regados con aguas residuales” SEP-CONACYT No.256332. Así como al 
Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica UNAM-
DGAPA-PAPIIT PAPIIT IA202518. 
A la Dra. Rocío Alcántara por permitirme realizar el presente proyecto en su 
laboratorio, por el sinfín de enseñanzas, los espacios de discusión y reflexión, y facilitarme 
de un lugar y materiales que fueron fundamentales para llevar de forma correcta este 
trabajo. 
A la Dra. Blanca Lucia Prado Pano y la Dra. María Soledad Vásquez Murrieta que 
me guiaron por poco más de dos años para desarrollarme de manera íntegra y por sus 
consejos en las reuniones y tutorales. 
 
 
 
 
 
vi 
AGRADECIMIENTOS A TÍTULO PERSONAL 
 
A la UNAM, que me ha brindado a lo largo de mi licenciatura y maestría sus recursos 
académicos, culturales, sociales y económicos con el fin de desarrollarme como científico, 
académico y sobre todo como persona integral. 
Al Instituto de Geología, por haber colaborado en mi formación como un biólogo mas 
integral. 
A mi familia, que estuvo siempre ahí para mí. Que me brindaron su apoyo, comprensión y 
consejo en todos momentos. Como lo escribí en mi anterior tesis, sin ustedes mi vida no 
sería la misma. 
A todos mis profesores, que se esforzaron por transmitirme su conocimiento. 
A la Dra. Ro Alcántara, por haberme dado una mano cuando la necesite y parte de sus 
conocimientos que me han ayudado a crecer a lo largo de este periodo de mi vida. 
A las Doctoras Blanca Prado, Sol Vásquez y Pau de los Santos por todos sus consejos y 
observaciones durante la realización del proyecto. 
A los Doctores Iván Moreno, Christina Siebe y Ulises Durán por tomarse el tiempo de leer 
este trabajo y aportar desde sus perspectivas opiniones para enriquecerlo. 
A Lucy Mora Palomino, Olivia Zamora Martínez, Osiris Gaona e Iris Suárez Quijada por su 
apoyo técnico en la realización de este proyecto. También a Mario Rodríguez por su 
apoyo en el trabajo de campo y a Fernando Rojas por su asesoría técnica con el equipo 
de qPCR. 
A mi grupo de trabajo (Davo, Jesús, Jazz, Bernie, Kari, Naye, Jess) por haber hecho de 
mi estancia en el laboratorio algo divertido y enriquecedor. 
A mis colegas del cubículo de estudiantes del Posgrado de Ciencias Biológicas (Jair, Eli, 
Chuchin, Kathia, Angel y Juan) por sus consejos, amistad y sobre todo paciencia a lo 
largo de todo este periodo. 
A las personas que fuera de mi vida académica aportaron muchas cosas a mi vida y me 
hicieron mejorar como humano (Vania, Sandra, Yersain, Pancho). 
vii 
A Mario, por haberme ayudado con los muestreos y convertir los trayectos en algo más 
ameno. 
A Jesús Acevedo, por haberme permitido ser parte del equipo de comunicación de la 
ciencia del Instituto de Geología. 
Este trabajo se realizó en coordinación con los siguientes laboratorios: Laboratorio de 
Genómica y Biotecnología del Instituto de Geología, UNAM; Laboratorio de Biotecnología 
Microbiana de la ENCB, IPN; Laboratorio de Ecología Bacteriana del Instituto de Ecología, 
UNAM; y Laboratorio del Cromatografía del Laboratorio Nacional del Geoquímica y 
Mineralogía (LANGEM). 
A todos aquellos que aportaron su granito de arena en mi historia. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A mis padres y mi tío por brindarme suconfianza, amor y soporte. 
viii 
Índice 
RESUMEN .......................................................................................................................................... IX 
ABSTRACT ......................................................................................................................................... X 
1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 1 
1.1. LA ZONA CRÍTICA ..................................................................................................................... 1 
1.1.1. La zona saturada y su microbiota .................................................................................. 2 
1.2. EL NITRÓGENO ........................................................................................................................ 3 
1.2.1. La importancia del N en sistemas bióticos .................................................................... 4 
1.2.2. Los procesos biológicos de fijación y remoción de N .................................................... 5 
1.3. EL EMPLEO DE HERRAMIENTAS MOLECULARES PARA ESTUDIOS AMBIENTALES........................... 10 
1.4. VALLE DEL MEZQUITAL .......................................................................................................... 11 
2. JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................................ 14 
3. OBJETIVOS ............................................................................................................................... 15 
3.1. GENERAL .............................................................................................................................. 15 
3.2. ESPECÍFICOS ........................................................................................................................ 15 
4. HIPÓTESIS ................................................................................................................................ 15 
5. ANTECEDENTES ...................................................................................................................... 16 
6. MATERIAL Y MÉTODOS .......................................................................................................... 18 
6.1. SITIO DE ESTUDIO .................................................................................................................. 18 
6.2. MODELO DE PIEDEMONTE, SITIOS DE MUESTREO Y TOMA DE MUESTRA ..................................... 18 
6.3. DETERMINACIÓN DE IONES MAYORES ..................................................................................... 20 
6.4. EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS ...................................................................................... 21 
6.5. AMPLIFICACIÓN DE MARCADORES MOLECULARES POR PCR..................................................... 21 
6.6. PCR CUANTITATIVO (QPCR) ................................................................................................. 24 
6.7. SECUENCIACIÓN DE MARCADORES MOLECULARES .................................................................. 24 
6.8. ANÁLISIS DE SECUENCIAS Y ANÁLISIS ESTADÍSTICOS ................................................................ 25 
7. RESULTADOS .......................................................................................................................... 26 
7.1. CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA ......................................................................................... 26 
7.2. ANÁLISIS DE LA COMUNIDAD MICROBIANA. ............................................................................... 27 
7.3. POTENCIAL REMOVEDOR DE NITRÓGENO EN LA DIVERSIDAD GENÉTICA 16S RDNA ................... 31 
7.4. ANÁLISIS CUANTITATIVO DE MARCADORES MOLECULARES ....................................................... 33 
7.5. ASOCIACIÓN FILOGENÉTICA DE LOS MICROORGANISMOS TRANSCRIPCIONALMENTE ACTIVOS ...... 37 
8. DISCUSIÓN ............................................................................................................................... 40 
8.1. MODELO ESQUEMÁTICO DE LA REMOCIÓN DE N EN LA ZONA SATURADA DEL VALLE DEL MEZQUITAL
 42 
9. CONCLUSIONES ...................................................................................................................... 45 
10. REFERENCIAS ...................................................................................................................... 46 
 
 
ix 
RESUMEN 
La contaminación de acuíferos con nitratos es un problema creciente, por lo que es 
importante entender la diversidad bacteriana de estos sistemas y su papel en la remoción 
de nitrógeno (N). En este estudio, se analizó la diversidad bacteriana nativa de un 
acuífero somero contaminado con NO3- en una zona agrícola, la cual se riega con agua 
residual. También se cuantificó su potencial genético y la transcripción de genes 
relacionados con la desnitrificación (nosZ), la oxidación anaerobia de amonio (anammox, 
hzo) y la oxidación de metano dependiente de nitrito (n-damo, pmoA y nod) mediante 
qPCR. El modelo de estudio fue un piedemonte donde se hizo el muestreo, la principal 
fuente de recarga del acuífero, i.e., el agua residual empleada para riego; y el agua 
subterránea mediante dos piezómetros, tres pozos y un manantial. Se realizaron seis 
muestreos a lo largo de un año, y se extrajo el DNA metagenómico y el RNA total de las 
muestras a estudiar. El análisis de las secuencias 16S rDNA demostró que la estructura 
de la comunidad bacteriana en el agua residual es diferente a la de la zona saturada 
(pozos y piezómetros), y a su vez, a la del agua de manantial. El agua subterránea 
además tiene una mayor diversidad 16S rDNA que el agua residual. También fue posible 
encontrar la huella 16S rDNA de grupos involucrados en la desnitrificación (Proteobacteria 
y Firmicutes), anammox (Brocadiales <3%) y n-damo (Methylomirabiliales <5%). El 
potencial genético de estos grupos se verificó mediante la cuantificación de los genes 
nosZ, hzo, pmoA y nod; donde el gen nosZ tuvo el mayor número de copias, tanto en 
lluvias como en secas. Sin embargo, nod fue el gen con la mayor abundancia en el cDNA 
(RNA) de un piezómetro. A pesar de que es posible establecer las tasas de remoción de 
N por cada ruta a partir del número de transcritos, se demostró que las tres están activas 
y coexisten. La afiliación filogenética de los transcritos mostró que diversas 
betaproteobacterias son las encargadas de llevar a cabo el último paso de la 
desnitrificación, mientras que Candidatus Brocadia spp. y Candidatus Methylomirabilis 
spp. son las encargadas de anammox y n-damo, respectivamente. Estos resultados 
demuestran que el acuífero cuenta con una comunidad bacteriana capaz de remover N 
por desnitrificación, anammox y n-damo en temporada de lluvias y secas. Asimismo, que 
este acuífero tiene un componente bacteriano diverso que está involucrado en la 
remoción de gases con efecto invernadero, como el N2O y el CH4, y posiblemente está 
ligada a otros procesos del ciclo del N como la reducción disimilatoria de nitrato a amonio. 
x 
 
ABSTRACT 
Aquifer pollution with nitrate is an increasing environmental problem, therefore it is 
important to understand the bacterial diversity of these systems and its role in the removal 
of nitrogen (N). In this study, we analyzed the native bacterial diversity of a shallow aquifer 
contaminated with NO3- in an agricultural zone, which is irrigated with wastewater. In 
addition, the genetic potential and transcription of genes related to denitrification (nosZ), 
anaerobic oxidation of ammonium (anammox, hzo), and the oxidation of methane 
dependent of nitrite (n-damo, pmoA and nod) was quantified by qPCR. The study model 
was a piedmont, where we sampled the main recharge source, i.e., the wastewater used 
for irrigation; and thegroundwater in two piezometers, three wells and a spring. Six 
samplings were done in a year, and the metagenomic DNA and the total RNA were 
extracted from the studied samples. The 16S rDNA sequence analyses showed that the 
bacterial community structure of the wastewater is different from that in the saturate zone 
(wells and piezometers), and that from the spring. As well, groundwater showed a higher 
16S rDNA diversity than wastewater. In addition, it was possible to find the 16S rDNA 
fingerprint of groups involved in denitrification (Proteobacteria and Firmicutes), anammox 
(Brocadiales <3%), and n-damo (Methylomirabiliales <5%). The genetic potential of these 
groups was verified with the quantification of nosZ, hzo, pmoA and nod genes; where nosZ 
was the one with the highest number of copies, in both the dry and rainy seasons. 
However, nod was the most abundant gene in the cDNA (RNA) from a piezometer. 
Despite it is not possible to establish the N-removal rates of each pathway from the 
number of transcripts, it was demonstrated that the three pathways are active and co-exist. 
The phylogenetic affiliation of the transcripts showed that diverse betaproteobacteria are in 
charge of the last step of denitrification; while Candidatus Brocadia spp. and Candidatus 
Methylomirabilis spp. are responsible for anammox and n-damo, respectively. These 
results show that the aquifer harbours a bacterial community capable of removing N by 
denitrification, anammox and n-damo in dry and rainy seasons. Furthermore, this aquifer 
has a diverse bacterial component involved in the removal of greenhouse gasses, such as 
N2O and CH4, and which is possibly participating in other N-cycle processes, such as 
dissimilatory nitrate reduction to ammonium. 
 
1 
1. Introducción 
La contaminación de los cuerpos de agua y acuíferos por nitrato (NO3-) es una problemática 
ambiental que pone en riesgo la seguridad hídrica. Se estima que los acuíferos reciben 
aproximadamente 15 Teragramos (Tg) del nitrógeno (N) fijado antrópicamente al año, es decir, 
∼10% del N producido por el proceso Haber-Bosch (Schlesinger 2009). Las sales de NO3- son 
altamente solubles en un amplio intervalo de pH, por lo que tienen una gran movilidad en 
sistemas acuáticos. La presencia de este anión en el agua potable puede causar problemas a la 
salud como la hematohemoglobinemia, y también puede dañar al medio favoreciendo la 
eutrofización de los cuerpos superficiales de agua (Johnson y Kross 1990; Bouchard et al. 1992; 
Bruning-Fann y Kaneene 1993). 
La contaminación de los acuíferos por N puede ser resultado de actividades urbanas como 
las descargas de los tanques sépticos o fugas de los drenajes, de los rellenos sanitarios y de los 
reactores de plantas de tratamiento (Wakida y Lerner 2005). Asimismo, otras actividades 
asociadas a los sistemas de producción agropecuarias como la fertilización de los campos 
agrícolas y los lixiviados de tanques con desechos animales, son una fuente de contaminación. 
Estudios recientes reportan que los microorganismos de los acuíferos, en especial las bacterias, 
son capaces de remover in situ el N y convertirlo en N2, el cual es un gas inerte y no 
contaminante (Moore et al. 2011; Smith et al. 2015). Sin embargo, poco se sabe de la microbiota 
de la zona saturada y de su potencial de conversión de N en acuíferos, especialmente en 
aquellos encontrados en distritos agrícolas. 
 
 
1.1. La zona crítica 
La zona crítica se definió inicialmente como una capa terrestre siperficial que ocupa desde el 
dosel de la vegetación, hasta la zona del agua subterránea (Brantley et al. 2007). Por lo que la 
integra una parte biótica (biosfera) y una abiótica (hidrosfera, pedosfera y litosfera), en una zona 
limitada (Brantley et al. 2006). Su asignación de “crítica” refleja su importancia en los procesos 
que sostienen la vida en el planeta, como lo es la calidad del agua subterránea. Este sistema es 
dinámico con varias interacciones complejas de procesos físicos, biológicos, químicos y 
geológicos (Brantley et al. 2006), y actualmente se reconocen cuatro características básicas que 
definen a la zona crítica: 
• La zona crítica está en constante evolución acumulativa e irreversible en la mayoría de los 
casos. 
2 
• Los procesos que se llevan a cabo dentro de la zona crítica están altamente acoplados. 
• Las capas verticales contenidas en la zona crítica son contrastantes. 
• Las capas horizontales de la zona crítica son altamente heterogéneas. 
Por lo anterior, esta zona es considerada como la región más heterogénea y compleja del 
planeta (Lin, 2010), con procesos biológicos y geológicos que interactúan dinámicamente. 
Actualmente se conocen algunas vías bióticas y abióticas para el reciclaje de ciertos elementos 
de importancia biológica como el carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, fósforo y azufre, entre 
otros (Lin 2010). Estos procesos de interacción impactan en la composición del agua, la 
formación del suelo, disponibilidad de nutrientes, la concentración de ciertos gases, y por lo tanto, 
se relacionan con la estructura de la comunidad biótica del sistema (Amundson et al. 2007; Küsel 
et al. 2016). 
La zona crítica es el mayor reservorio de biomasa en la Tierra, en incluye bacterias, 
arqueas, hongos, virus, animales y plantas (Whitman et al. 1998). Este sistema complejo y 
heterogéneo ejerce una gran influencia en la conformación de las comunidades microbianas, las 
cuales presentan una gran diversidad taxonómica y metabólica regulada por las variaciones en la 
disponibilidad de agua, nutrientes y oxígeno, entre otros; los cuales generan a su vez variaciones 
espacio-temporales en los sistemas de la zona crítica (Akob y Küsel 2011). Los estudios clásicos 
de microbiología ambiental han sido dirigidos de manera particular a sólo ciertos compartimentos 
de esta zona, sin tener en cuenta la dinámica presente entre las diversas capas (Zhu et al. 2018). 
Sin embargo, en los últimos años se ha comenzado a relacionar a la comunidad microbiana con 
el reciclaje biogeoquímico de diversos elementos como el nitrógeno, carbono, azufre o algunos 
metales, y se ha comprobado su participación en las interacciones de la zona crítica (Nicklaus y 
Körner 1996; Chang et al. 2001). Cabe resaltar que los microorganismos cuentan con la 
capacidad adaptativa a cambios en la dinámica del sistema, i.e., biológicos y/o fisicoquímicos, 
incluyendo la presencia de contaminantes o moléculas inhibitorias del crecimiento (Rensing et al. 
2002; Bradford et al. 2008). 
 
1.1.1. La zona saturada y su microbiota 
La zona saturada está contenida en la zona crítica, y está definida como aquella donde todos los 
poros del suelo están ocupados por agua. Es considerada como la segunda gran reserva de 
agua dulce del planeta y cerca de una quinta parte del agua usada en el mundo es obtenida de 
esta fuente (Raghunath 1987). El agua subterránea es importante para una gran cantidad de 
3 
procesos, sobre todo aquellos que influyen en la dinámica de ecosistemas terrestres. Esta zona 
interacciona de forma constante con varias capas de la columna, entre ellas la atmosfera, la 
biosfera, el suelo (pedosfera) y la litosfera (Fan 2015). 
Esta zona alberga distintas comunidades microbianas complejas y diferentes entre sí, las 
cuales suelen definir la dinámica biológica del sistema. Se estima que actualmente cerca del 40% 
de la biomasa procarióntica se encuentra por debajo de la superficie terrestre, involucrando a los 
acuíferos en gran medida (Griebler y Lueders 2009). La influencia de la microbiota en los 
acuíferos suele estar determinada por los parámetros fisicoquímicos que este alberga, sobre todo 
si algún contaminante está presente en la zona (Meckenstock et al. 2015). Actualmente se han 
podido identificar un sinnúmero de procesos donde las bacterias que habitan en el agua 
subterránea pueden utilizar una amplia gama de sustratoscomo hidrocarburos, diversas formas 
de nitrógeno, metales, entre otros; todo ellos empleados para generar energía y biomasa (Fang y 
Barcelona 1998; Korom, 1992; Hemme et al. 2010; Meckenstock et al. 2015). 
Las bacterias y arqueas son un componente muy importante de la vida subsuperficial, 
porque pueden colonizar los poros del subsuelo y poseen diferentes capacidades metabólicas 
que las ayudan a vivir en el contexto ambiental, geoquímico y geológico que éste demanda (Long 
et al. 2016). Consecuentemente, la microbiota del subsuelo se conoce principalmente por 
estudios metagenómicos (dirigidos o no-dirigidos) que han demostrado que existe una diversidad 
procarióntica mayor de la esperada (Anantharaman et al. 2016; Long et al 2016), y con una 
diversidad metabólica altamente interconectada (Anantharaman et al. 2016, Hernsdorf et al. 
2017, Starke et al. 2017), la cual está involucrada en los procesos de transformación de la 
materia y energía en el agua subterránea. 
 
1.2. El nitrógeno 
El nitrógeno (N) fue descubierto por Daniel Rutherford en 1772. Es un elemento sin olor, sabor o 
color, ligeramente soluble en agua, no metálico, cuyo número atómico es 7 y su peso atómico es 
14 (Wiberg et al. 2001). Se puede encontrar en forma de gas diatómico (N2), sobre todo en la 
atmósfera donde ocupa un 78% del volumen total, y es posible condensarlo sólo bajo 
condiciones extremas de presión (3.432 MPa) y temperatura (77.2 ºK) (solidificación: 62.5 ºK) 
(Garg y Singh 2015). 
Existen diversas especies de este elemento en la naturaleza debido a sus diferentes 
estados de oxidación, que van desde -III hasta +V. La forma diatómica (N≡N) es la más estable 
4 
debido a su triple enlace que no permite una disociación espontánea bajo condiciones 
ambientales. Sus formas químicas inorgánicas más comunes son el resultado de enlaces con el 
oxígeno o con el hidrógeno, que van desde solutos hasta gases. No obstante, existen también 
otras formas de N asociadas covalente o iónicamente a metales, o covalentemente a moléculas 
de carbono (N-orgánico) (Chang 2010). Las reservas más grandes de N en el planeta son como 
N2 molecular en la atmosfera (3.7 × 109 Tg) y/o disuelto en el océano (1.46 × 106 Tg), y el N 
sedimentario (secuestrado en la corteza continental (1.3 × 109 Tg) (Ward 2012). 
Consecuentemente, la geobiología del N está regida por una gran reserva inerte y pequeños 
flujos biológicos. 
 
1.2.1. La importancia del N en sistemas bióticos 
El N es un elemento indispensable para cualquier organismo vivo, debido a que se requiere en la 
síntesis de biopolímeros necesarios para la vida, como las moléculas hereditarias (RNA y el 
DNA) y las unidades catalíticas (las proteínas). La formación de biomasa es una de las 
principales causas de demanda de N por las células, donde por cada 100 moléculas de carbono 
hay 2-20 moléculas de N, aunque esta relación varía conforme a los organismos y su estado 
trófico (Sterner y Elser 2002; Canfield et al. 2010). Asimismo, existen otras moléculas importantes 
como las clorofilas, los osmolitos, moléculas de quorum sensing, o los metabolitos secundarios 
como los antibióticos (v.g., la penicilina) y alcaloides que contienen N (Sangster, 1960; Gossauer 
y Engel 1966; Grover et al. 2000). Todas estas biomoléculas comparten la característica de tener 
N en su estado más reducido (-III). 
Otros microorganismos, como las bacterias y arqueas, también emplean las formas 
inorgánicas solubles (NH4+, NO2-, NO3-) o gaseosas (NO, N2O) de N, como aceptores o 
donadores electrónicos para la generación de energía (Kuypers et al. 2018). Lo que vuelve al N 
una molécula no sólo importante para el anabolismo, sino también para el catabolismo celular. A 
pesar de su abundancia en la atmosfera, se ha observado que éste es un elemento limitante para 
la productividad en varios sistemas biológicos, debido a que sólo alrededor del 2% es disponible 
para los organismos vivos (Mackenzie 1998). Incluso se sugiere que este elemento ha restringido 
la productividad primaria en escalas de tiempos geológicos (Falkowski 1997). 
 
 
5 
1.2.2. Los procesos biológicos de fijación y remoción de N 
 
Dada la importancia de este elemento en los procesos anabólicos y catabólicos, y sus diversos 
estados redox, los organismos han desarrollado una serie de rutas para su conversión que se 
entrelazan en el ciclo biogeoquímico del N. Los flujos hacia adentro y hacia afuera de las 
reservas de nitrógeno fijado se controlan principalmente por la biosfera. Actualmente hay un 
factor antrópico de entrada de N importante por la fijación industrial mediante el proceso Haber-
Bosch (para la producción de fertilizantes) y por la quema de combustibles fósiles, que resulta en 
un total de ~160 Tg N por año (Gruber y Galloway 2008). Donde cerca del 50% de los 
fertilizantes generados son empleados en cultivos de maíz, trigo y arroz (Canfield 2010). 
Biológicamente hablando, en los flujos hacia adentro del ciclo del N se encuentra la fijación 
biológica. En este proceso los microorganismos pueden obtener una fuente de N (como NH4+) a 
partir del almacén inerte (N2) empleando la enzima nitrogenasa (Ward 2012). Las rutas biológicas 
de fijación se llevan a cabo por una amplia variedad de bacterias y arqueas diazotróficas, 
mientras que los reportes de fijación en organismos eucarióticos responden a sistemas 
simbióticos con algún procarionte diazotrófico (Howarth et al. 1988). Se estima que la fijación 
biológica en sistemas terrestres y acuáticos es de ~250 Tg al año (Gruber y Galloway 2008). 
Contrariamente a los procesos de fijación, existen procesos que retornan el N fijado a la 
atmosfera, principalmente como N2. Estos procesos se consideran como de pérdida o remoción 
de N. En sistemas naturales, los procesos de pérdida se consideran negativos; mientras que, el 
marco del tratamiento de aguas residuales se considera algo deseable, ya que remueve el N 
fijado y se transforma a N2, el cual es casi inerte biológicamente hablando. A la fecha, existen 
tres procesos biológicos que transforman especies de N a N2 y son tema de estudio en esta tesis 
i) la reducción de óxido nitroso (en el proceso de desnitrificación), ii) la oxidación anaerobia de 
amonio (anammox) y iii) la oxidación anaerobia de metano dependiente de nitrito (n-damo); por lo 
que se describen a continuación (Fig.1). 
 
6 
 
Figura 1. Metabolismos implicados en la remoción de nitrógeno. A. Desnitrificación. B. Anammox. C. n-damo 
(*ecuaciones no balanceadas) 
 
1.2.3. Desnitrificación 
La desnitrificación es un proceso descubierto por Ulysse Gayon y Gabriel Dupetit en 1886. Esta 
ruta metabólica marcó la contraparte del proceso de nitrificación descubierto unos años antes, y 
que concluiría con el cierre del ciclo del N (Payne 1986). Esta vía es un proceso de respiración 
celular facultativo llevado a cabo en anoxia y microoxia por numerosos grupos bacterianos, y en 
menor cantidad por arqueas (Philippot 2002). Actualmente, existen registros de la presencia de 
desnitrificadores en una gran variedad de sistemas marinos y terrestres. Cabe resaltar que 
muchos de éstos se han encontrado en ambientes extremos como el caso de Aquifex (termófila) 
o Haloarcula (halofílica). Inclusive se han observado géneros patógenos con especies que 
pueden llevar a cabo dicho metabolismo como Neisseria y Campylobacter (Zumft 1997). 
De manera general, la desnitrificación se refiere a un proceso donde las especies oxidadas 
de nitrógeno, como el nitrato (NO3-) y el nitrito (NO2-), se reducen a gases como el óxido nitroso 
(N2O) o nitrógeno diatómico (N2), mediante vías heterotróficas o autotróficas; es decir, 
dependiente o independientemente de una fuente de carbono orgánico (Korom 1992; Sánchez y 
Sanabria 2009). La desnitrificación es una ruta lineal y secuencial, en la que participan diferentes 
reductasas (Fig.1A). Este proceso es modular, es decir, no hay un microorganismocon la ruta de 
desnitrificación completa, sino que diferentes procariontes tienen una o dos reductasas. Por lo 
que los microorganismos se deben acoplar o estar en contacto con el sustrato que necesitan 
para llevar a cabo el proceso hasta N2. 
La primera enzima de la ruta transforma el NO3- a NO2- y es una enzima nitrato reductasa, 
que puede ser de dos tipos: Nar (unidas a membrana) o Nap (periplásmicas). El siguiente paso 
se lleva a cabo por una nitrito reductasa, que lleva a cabo la transformación de NO2- a NO. Se 
7 
reconocen actualmente dos tipos de nitrito reductasas: las de tipo citocromo cd1 (codificadas en 
el gen nirS) que contienen cuatro grupos hemo y las que tienen al cobre (Cu) como grupo 
prostético (codificadas en el gen nirK) (Smith et al. 2007). De manera natural, ambas enzimas no 
coexisten en un mismo organismo, aunque se han encontrado excepciones (Graf et al. 2014). Se 
conoce también la existencia de otra nitrito reductasa diferente a las anteriores, que transforma el 
nitrito a amonio. Esta enzima (codificada en el gen nrfA) es parte primordial de otro proceso 
llamado reducción deasimilatoria de nitrato a amonio (DNRA), que puede coexistir junto a la 
desnitrificación en algunos ambientes (van den Berg et al. 2016). 
La siguiente reducción se lleva a cabo por la reductasa de óxido nítrico. Esta enzima es un 
heterodímero compuesto por dos subunidades: un citocromo tipo C con anclaje a membrana 
(codificado por el gen norC) y un citrocromo b (codificado por el gen norB) de doce regiones 
transmembranales que lleva a cabo la conversión a óxido nitroso (Zumft et al. 1994). Se ha 
reportado que algunas especies bacterianas llevan a cabo una desnitrificación semi-completa, 
por ejemplo, los estreptomicetos. Estos organismos sólo generan óxido nítrico y nitroso a partir 
de nitrato (Albrecht et al. 1997). 
El paso final que lleva a la formación de N2 a partir de N2O, es mediante la metaloenzima 
reductasa de óxido nitroso, que contiene ocho átomos de cobre (Coyle et al. 1985). La unidad 
catalítica esta codificada en el gen nosZ, acompañada de otras 2 unidades transcripciones 
definidas por nosR y nosDFYL (Hoeren et al. 1993). 
 
1.2.4. Oxidación anaerobia de amonio (anammox) 
La oxidación anaerobia de amonio (anammox) fue descubierta a mediados de la década de los 
1990s en un reactor de lecho fluidizado, como una ruta oxidativa de amonio dependiente de 
nitritos (Mulder et al. 1995). Dicho metabolismo fue caracterizado y atribuido a una masa de 
origen biológico, que más tarde fue identificado como de carácter bacteriano (van de Graaf et al. 
1995). La reacción consiste en el empleo de NH4+ como donador electrónico y al NO2- como 
aceptor, para formar N2 en un proceso catabólico o generador de energía. 
A la fecha, este metabolismo ha sido sólo encontrado en un sólo orden bacteriano: 
Candidatus Brocadiales, el cual se localiza en el filo Planctomycetes. Dentro de este orden se 
encuentran cinco géneros reportados a la fecha capaces de llevar a cabo anammox, entre los 
que se incluyen Candidatus Kuenenia, Candidatus Brocadia, Candidatus Jettenia, Candidatus 
Anammoxoglobus y Candidatus Scalindua (Schmid et al. 2000; Park et al. 2017). Estos 
8 
microorganismos, son bacterias cocoides de menos de 1 µm de diámetro, crecimiento lento, que 
tienen una distribución limitada en zonas microaerofílicas, con pH cercanos a 7 y temperaturas 
máximas de 40°C (Strous et al. 1999). Se han encontrado en diversos ambientes que van desde 
sistemas artificiales como biorreactores y plantas de tratamiento de aguas; hasta sistemas 
naturales como ambientes terrestres, de aguadulce, hielo y marinos. En sistemas marinos es una 
pieza fundamental de la remoción de nitrógeno, ya que se ha reportado que puede llegar a 
consumir desde el 40% del nitrógeno fijado en sitios anóxicos del Mar Negro, y hasta casi el 80% 
en el estrecho de Skagerrak (Kuypers et al. 2003; Dalsgaard et al. 2005; Jin et al. 2012). 
Esta ruta de oxidación de amonio es llevada a cabo en una inclusión citoplasmática 
membranal llamada el anammoxosoma, que funciona como centro de reacción, ya que se 
encuentran las proteínas que llevan a cabo el proceso, además de estar acoplado a un sistema 
de síntesis de ATP (van Niftrik y Jetten 2012). Dicha inclusión es catalogada como un análogo a 
las mitocondrias, ya que es una bicapa lipídica en la que se puede formar un gradiente 
electroquímico que la célula utiliza para la generación de energía (van Niftrik et al. 2004). 
En la figura 1B se muestra de manera general cómo se llevan a cabo las transformaciones 
de los sustratos mediante reacciones redox acopladas y consecutivas, donde el nitrito es usado 
como aceptor electrónico para la conversión de NH4+ a N2. La primera reacción es realizada por 
la enzima NirS (codificada por el gen nirS), que reduce una molécula de nitrito (NO2-) a óxido 
nítrico (NO), un componente esencial en la ruta. El siguiente paso es la formación de un 
intermediario volátil y extremadamente reactivo llamado hidrazina (N2H4), mediante la enzima 
hidrazina sintasa o HZS condensa al NO con NH4+. El paso final de la ruta es la oxidación de la 
hidrazina mediante una deshidrogenasa de hidrazina (codificada por el gen hzo), teniendo como 
resultado nitrógeno atmosférico (N2). También se generan cuatro protones que son dirigidos a un 
citocromo c (fracción soluble) que los acarreará para generar fuerza protón motriz (PMF) que 
será necesaria para la generación de ATP mediante la ATP sintetasa (Dalsgaard et al. 2005; 
Kartal et al. 2012; Kartal y Keltjens 2016). 
 
1.2.5. Oxidación anaerobia de metano dependiente de nitrito (n-damo) 
La oxidación anaerobia de metano dependiente de nitrito (n-damo) es un proceso descubierto 
recientemente en sedimentos de un canal de agua dulce en Países Bajos (Raghoebarsing et al. 
2006). Esta ruta acopla procesos de oxidación de metano (CH4 → CO2) y la reducción de nitrito 
(desnitrificación), ya que ocupa este último como un primer aceptor electrónico. 
9 
Este metabolismo se restringe al filo bacteriano NC10 que sólo ha sido definido a partir de 
secuencias de rDNA 16S, debido a la dificultad en el aislamiento y caracterización de los cultivos 
(Ettwig et al. 2009). Posteriormente se descubrió que sólo una especie del filo es la que lleva a 
cabo dicho proceso: Candidatus Methylomirabilis oxyfera (Ettwig, et al. 2010). Aunque a la fecha, 
se han reportado tres especies más del género C. Methylomirabilis: C. Methylomirabilis sínica, C. 
Methylomirabilis limnetica, C. Methylomirabilis lanthanidiphila (He et al. 2015; Graf et al. 2018; 
Versantvoort et al. 2018). Los principales nichos de estos microorganismos suelen ser zonas 
mínimas de oxígeno con presencia de metano, como se ha comprobado en hábitats de aguas 
dulces asociado a sedimentos (Padilla et al. 2016; Shen et al. 2016; Graf et al 2018). 
La ruta canónica de n-damo está definida por una desnitrificación parcial llevada a cabo por 
reductasas de nitrito (codificadas en genes nirS), que transformarán el NO2- en NO (Fig. 1C). 
Posteriormente, 2 moléculas de NO serán transformadas en N2 y O2 mediante una dismutasa de 
óxido nítrico, codificada por el gen nod. En este caso, el N2 es liberado y el O2 se queda atrapado 
intracelularmente para ser empleado por la metano monooxigenasa pMMO (codificada por el gen 
pmoA) para oxidar una molécula de CH4 y convertirla en CO2 (Ettwig et al. 2010). Aunque el 
proceso es llevado a cabo en sistemas anaerobios/microóxicos, la enzima pMMO trabaja en un 
sistema aerobio intracelular como aquel de sus símiles en Alfaproteobacteria y 
Gamaproteobacteria. 
De igual forma existe una ruta alterna llevada a cabo por una arquea llamada Candidatus 
Methanoperedens nitroreducens. En este caso oxidación de metano se lleva a cabo por un 
proceso inverso a la metanogénesis (por la presencia del clúster génico mcrABCDG) y 
empleando NO2- comoaceptor electrónico, aunque son necesarios más estudios para esclarecer 
la ruta exacta de oxidación de metano (Haroon et al. 2013). A diferencia la ruta canónica de n-
damo, esta ruta emplea otro tipo de enzima oxidante de metano que es estrictamente anaerobia 
y sólo se ha descrito en estas arqueas ubicadas dentro del grupo ANME-2d de Euryarchaeota. 
Existen varios procesos de oxidación anaerobia de metano, donde el aceptor de electrones es 
diferente de NO2-. Por ejemplo, acopladas a sulfato (SO4-2) (S-damo) o iones metálicos de Mn4+ y 
Fe3+ (M-damo). De hecho, S-damo fue el primero en descubrirse (Reeburgh 1980; Iversen y 
Jorgensen 1985). Estos procesos pueden ser encontrados en ambientes de agua dulce y 
marinos, por lo que sus nichos son más amplios (Cui et al. 2015). 
 
10 
1.3. El empleo de herramientas moleculares para estudios ambientales 
El estudio de la ecología microbiana sufrió una revolución en las últimas décadas debido a los 
avances en las técnicas moleculares, el software y tecnologías de secuenciación que permitió 
abrir la posibilidad a generar una gran cantidad de información de organismos totalmente 
conocidos. Esta revolución abrió las puertas al estudio de organismos no cultivados bajo los 
estándares de la microbiología clásica, ya que los microorganismos aislados en la actualidad son 
alrededor del 1% (Hugenholtz 2002; Schmeisser et al. 2007). Las herramientas más utilizadas 
actualmente se encuentran englobadas en las “ómicas”. Éstas son un conjunto de técnicas que 
involucran estudiar a nivel particular o plural las células bacterianas a diferentes niveles como 
genético, proteico, transcripcional, etc. (Desai et al. 2010). 
La genómica se encarga del estudio holístico a nivel genómico de las células. Esta técnica 
es útil en el estudio de genes de manera individual, sobre todo para reconocer su función. La 
ecología microbiana se ha valido de estos métodos para el análisis de genes funcionales, el 
ensamblado de genomas y pangenomas o inclusive para filogenias a partir de marcadores 
moleculares nativos y distribuidos ampliamente (Tettelin et al. 2008). Otra herramienta es la 
metagenómica, que estudia los genomas colectivos por lo regular de muestras ambientales. Lo 
anterior involucra el análisis de genomas de múltiples especies al mismo tiempo, de forma no 
dependiente de cultivo, por lo que especies de diferentes ambientes pueden analizarse de la 
misma forma. Los estudios metagenómicos a la fecha han logrado identificar nuevas especies, 
como se refleja en las nuevas filogenias donde se propone un nuevo filo llamado “radiation” (Hug 
et al. 2016). Además de identificar nuevos organismos, la metagenómica ha permitido la 
identificación de genes pertenecientes a rutas metabólicas incompletas o aun no descritas, como 
algunas involucradas en la adquisición de energía o el ciclaje de C y N (Xu 2006). 
El marcador molecular para bacterias más utilizado en la actualidad es el gen que codifica 
para la subunidad pequeña del RNA ribosomal (16S rDNA). Esta molécula contiene nueve 
regiones variables identificadas como V1-V9, que cumplen con los estándares de variabilidad y 
distribución ideales para un marcador molecular universal; sin embargo, las regiones V3 y V4 son 
las más comúnmente empleadas en estudios (Yarza et al. 2014). Este marcador se puede utilizar 
para realizar la identificación de organismos y algunos casos para su tipificación, filogenias, etc. 
(Albertsen et al. 2013). A su vez existen otro tipo de marcadores moleculares universales como 
rpoB que codifica para la subunidad β de la RNA polimerasa que se han desarrollado en menor 
medida (Case et al. 2006). Sin embargo, existen marcadores moleculares específicos para 
procesos determinados, que son usados regularmente en el estudio de metabolismos o 
11 
tipificación, como es el caso de soxB para el ciclo del azufre o mutS para la distinción de cepas 
patógenas de Escherichia coli (Li et al. 2003). 
El ciclo del N es uno de los más estudiados a nivel molecular, ya que sus enzimas redox las 
codifican genes que pueden ser distinguidos de una muestra metagenómica empleando los 
oligonucleótidos universales degenerados apropiados. Por ejemplo, los genes nirK y nirS son 
ampliamente usados para la desnitrificación (Throbäck et al. 2004), ya que ambos codifican para 
las enzimas nitrito reductasas que se consideran clave en la desnitrificación. Para observar la 
desnitrificación completa se emplea el gen codificante para la última enzima del proceso, la óxido 
nitroso reductasa, nosZ (Kloos et al. 2001). También hay oligonucleótidos especializados para 
detectar los genes codificantes para enzimas clave de anammox como la hidroxilamina 
oxidorreductasa (hao) y la hidrazina deshidrogenada (hzo) (Li y Gu 2011); y para n-damo, la 
metano monooxigenasa (pmoA) y la óxido nítrico dismutasa (nod) (Han y Gu 2013; Bhattacharjee 
et al. 2016; Zhu et al. 2016). 
La ventaja de usar genes codificantes para subunidades enzimáticas de un proceso 
metabólico (v.g. sox, nirK, hzo, pmoA, etc) en lugar de 16S rRNA, es que los marcadores 
funcionales son más certeros para confirmar el proceso en estudio (Junier et al. 2010). Asimismo, 
se puede detectar la presencia de estos grupos aun cuando están en <1% en la muestra 
ambiental, y también se puede cuantificar su actividad transcripcional (Kartal et al. 2011). 
Además, algunos marcadores funcionales también permiten hacer identificaciones filogenéticas 
cuando son secuenciados. Entre sus desventajas está que pueden subestimar algunos grupos, 
debido a que su diseño se basa en lo reportado en las bases de datos, lo cual puede dejar afuera 
a varios genes de especies no reportadas o con variantes del gen aún no registradas. 
 
1.4. Valle del Mezquital 
El Valle del Mezquital se localiza en el estado de Hidalgo, en la zona de contacto entre la Faja 
Neovolcánica Transmexicana y la Sierra Madre Oriental. Es una región delimitada por los 
parteaguas de las cuencas de los cauces de los ríos Tula y San Juan, que ocupa alrededor de 
7000 km2 (López Aguilar y Fournier 2009). La zona presenta un clima semidesértico con escasa 
precipitación (precipitación anual promedio es de 409 mm). La temperatura promedio varía entre 
los 13 y los 21 °C (Instituto Nacional de Estadística, Geografía e Informática, 1992). Actualmente, 
un piedemonte de la zona está registrado como un observatorio de la zona crítica 
(www.czen.org). 
12 
El Valle ha cambiado a lo largo del tiempo, ya que pasó de ser una zona minera durante el 
periodo Colonial y años subsecuentes, a una región agrícola a partir de principios del siglo XX. 
De igual manera, se llevan a cabo actividades de explotación maderera y pastoreo (Moreno et al. 
2006). Cabe recalcar que este cambio hacia la agricultura se ha impulsado por el riego de los 
campos de cultivo con aguas residuales provenientes de la Ciudad de México y sus suburbios. 
Se estima que este flujo es de alrededor de 50 m3/s de agua residual no tratada en promedio, las 
cuales se distribuyen a más de 45,000 ha dedicadas principalmente al cultivo de alfalfa, maíz, 
frijol, pasto forrajero, entre otros (Medel y Armienta 2004). Dichas aguas residuales son 
apreciadas realmente por los productores locales debido al aporte de agua y su capacidad de 
mejorar el suelo, ya que contienen una gran serie de nutrimentos, permitiendo así incrementar la 
productividad agrícola de manera considerable (Helmer et al. 1997; Romero-Alvárez 1997). 
Un nutrimento importante para la producción agrícola es el N. Con la adición de agua 
residual se ha favorecido la productividad primaria del Valle del Mezquital, pero también se ha 
detectado un incremento en la concentración de NO3- en el agua de pozos de la zona (N-NO3-, 
13-29 mg/L) (Jiménez y Chávez 2004). Hernández-Martínez et al. (2014; 2018) reportaron la 
presencia de varias formas de nitrógeno inorgánico soluble como amonio, nitrato y nitritoen la 
zona no saturada del suelo y en la zona saturada. Finalmente, se determinó que el NH4+ 
proveniente del agua residual durante eventos de riego era transformado a NO3- por los 
microrganismos del suelo, y que este último llegaba al acuífero. Sin embargo, se notó que 
existían una disminución notable en la concentración de N al llegar al acuífero, ya que éste sólo 
se presentaba en 18-27 mg/L de N-NO3-, con lo que sugirió que sucedían procesos de 
desnitrificación en la zona vadosa y la saturada (Hernández-Martínez et al. 2018). A la fecha, no 
se han estudiado a los microorganismos involucrados en estos procesos y ni confirmado su 
presencia en estos compartimentos de la zona crítica. 
 
1.4.1. Microbiología y estudios metagenómicos en el Valle del Mezquital 
El cambio de uso de suelo es un fenómeno global referido a la conversión de ambientes 
naturales por la actividad humana, comúnmente para actividades agrícolas, ganaderas y 
habitacionales (Paul y Rashid 2016). Diversos estudios han reportado un impacto crítico en la 
disponibilidad de nutrientes y por lo tanto en las diferentes comunidades microbianas (Sharma et 
al. 2004). El Valle del Mezquital sufrió un cambio drástico en el ambiente, pasando de un matorral 
xerófilo a una zona con alta actividad agrícola; debido principalmente al uso de agua residual. 
Dicha estrategia ha sido usada ampliamente alrededor del mundo sobre todo en regiones con 
13 
escasés de agua como el norte de África o con grandes demandas de agua para la agricultura 
como China, México y Estados Unidos (Jiménez y Asano 2008). 
En numerosos reportes se ha demostrado que el cambio del uso del suelo modifica la 
comunidad bacteriana por diversos factores, sobre todo por la disponibilidad de nutrientes como 
C, N y P (Gou y Gifford, 2002; Sharma et al. 2004). Estudios previos en el Valle del Mezquital 
demostraron que la comunidad bacteriana del suelo regado con agua residual se modificó debido 
al cambio del uso del suelo; sobre todo por el aumento de la cantidad de agua y los componentes 
de ésta (como el Na+) al compararse con muestras de suelo nativo, e inclusive con suelo de la 
zona regado con agua de pozos (Lüneberg et al. 2018b). 
Asimismo, un problema latente en el uso de agua residual para el riego de cultivos es la 
presencia de patógenos transportados por el agua que pueden resultar nocivos para la salud 
humana (Qadir et al. 2010; Mara et al. 2007). En el Valle del Mezquital se encontró un incremento 
en la concentración de coliformes fecales en áreas irrigadas con agua residual (Gallegos et al. 
1999). También, se ha observado aumento en la abundancia de especies de 
Gammaproteobacteria, entre las que destacan patógenos potenciales como Pseudomonas, 
Stenotrophomonas y Acinetobacter (Broszat et al. 2014). Asimismo, se determinó un aumento en 
la presencia de antibióticos en el suelo por irrigación con agua residual (Dalkmann et al. 2012), y 
se ha correlacionado con un mayor número genes de resistencia sul, que generan resistencia a 
sulfonamidas (Jechalke et al. 2015; Lüneberg et al. 2018a). 
De forma reciente se han llevado han cabo estudios metagenómicos para observar el 
efecto del agua residual sobre la comunidad microbiana del suelo (Broszat et al. 2014; Lüneberg 
et al. 2018a). Los cuales han aportado al conocimiento de la diversidad microbiana en el suelo 
sensu stricto en muestras tomadas de 0 a 30 cm de profundidad. Sin embargo, a la fecha no 
existen estudios sobre la diversidad microbiana en la zona saturada y su participación en la 
transformación de compuestos provenientes del agua residual, en especial del N. 
 
14 
2. Justificación 
 
El valle del Mezquital en Hidalgo, México, es un sistema agrícola regado con aguas residuales 
provenientes de los canales de desagüe de la Ciudad de México y sus alrededores. Esta extensa 
superficie de 90,000 ha recibe aproximadamente entre 40-65 m3/s de aguas residuales no 
tratadas, que se usan predominantemente en campos de cultivo de maíz y pastos forrajeros 
(Hernández-Martínez et al. 2014). El agua residual es una fuente de N-orgánico y N-NH4+, que 
después de 4 h de irrigación son nitrificados por los microorganismos del suelo y generan 
lixiviados de NO3- (40-42 mg/L de N-NO3-), los cuales viajan a través de la zona de raíces (0-30 
cm) y migran hacia el acuífero (Hernández-Martínez et al. 2018). Sin embargo, la zona saturada 
sólo muestra concentraciones entre 18 y 27 mg/L de N-NO3-. 
Se ha sugerido que los procesos de nitrificación/desnitrificación en el suelo sensu stricto, la 
zona no saturada y saturada del subsuelo, pueden ser los principales responsables de estas 
modificaciones (Hernández-Martínez et al. 2014; 2018). Sin embargo, faltan estudios para 
confirmar los mecanismos biológicos involucrados en la remoción de N en la zona saturada del 
Valle del Mezquital. 
Estudios recientes reportan que las bacterias de los acuíferos contaminados con nitratos 
son capaces de remover in situ el N y convertirlo en N2, el cual es un gas inerte y no 
contaminante (Moore et al. 2011; Smith et al. 2015). Estos procesos involucran metabolismos 
quimiolitotróficos como la oxidación anaerobia de amonio y la oxidación de metano dependiente 
de nitrito, los cuales coexisten con la desnitrificación. Sin embargo, poco se sabe de esta 
conversión en acuíferos, especialmente en aquellos de los distritos agrícolas que reciben 
grandes aportes de nitrógeno. 
15 
3. Objetivos 
 
 
3.1. General 
Analizar la comunidad bacteriana y los procesos involucrados en la remoción de 
formas oxidadas de nitrógeno en la zona saturada de un piedemonte de un distrito de 
riego irrigado con aguas residuales. 
 
3.2. Específicos 
• Caracterizar el ambiente fisicoquímico y las formas de nitrógeno disuelto en el agua 
subterránea de la zona saturada de un piedemonte. 
• Determinar la diversidad bacteriana 16S rDNA en diferentes meses en el agua 
residual y subterránea. 
• Identificar a las bacterias transcripcionalmente activas mediante la expresión de 
genes relacionados con la desnitrificación, anammox y n-damo. 
 
 
4. Hipótesis 
• La zona saturada de un piedemonte del Valle del Mezquital cuenta con una 
microbiota quimiolitotrófica (anammox y n-damo) capaz de transformar compuestos 
nitrogenados, la cual coexiste con bacterias con el potencial de reducir el óxido 
nitroso (desnitrificación). 
• La oxidación anaerobia de amonio es un proceso activo en la zona saturada de un 
piedemonte y es llevada a cabo principalmente por bacterias del género Candidatus 
Brocadia. 
 
16 
5. Antecedentes 
5.1.1. El nitrógeno en el Valle del Mezquital 
El Valle del Mezquital sufrió un cambio en el uso de suelo que convirtió la región en un área con 
actividad agrícola. Dicho cambio implicó un aumento en la entrada de N al sistema, superando de 
dos a diez veces el requerido por los cultivos (Hernández-Martínez et al. 2018). La dinámica del 
N empieza con la introducción de nitrógeno en formas orgánicas (Norg) y amoniacal (N-NH4+) al 
suelo. Esto se debe a la carga propia de N-NH4+ y Norg contenida en el agua residual, aunado al 
contenido en los fertilizantes ricos en especies reducidas de N, que se aplican en la zona. Una 
pequeña fracción de éste se pierde en forma gaseosa, mientras que el resto se oxida 
probablemente por nitrificadores para formar N-NO2- y N-NO3- en los primeros 30 cm del suelo 
(Hernández-Martínez et al. 2018). Parte de las formas oxidadas de N se transportan en solución 
a lo largo del suelo hasta llegar a la zona saturada. Esta zona es reconocida por mostrar 
concentraciones de N, ligeramente superiores a la Norma Oficial Mexicana (NOM-127-SSA1-
1994); sin embargo, estas concentraciones son menores a la esperadas en la solución del suelo 
pocos centímetros por debajo de la zona de influencia de las raíces por lo menos 50 horas 
después de la infiltración de agua (~20-50 N-NO3-) (Hernández-Martínezet al. 2018). 
Consecuentemente, se asumió que la desnitrificación era el principal mecanismo de remoción de 
N en la zona saturada por posiblemente los altos niveles de carbono orgánico disuelto (COD) y la 
ausencia de oxígeno que pudieran existir (Ramirez-Fuentes et al. 2002; Hernández-Martínez et 
al. 2014; 2018). 
 
5.1.2. Los procesos de remoción de N en acuíferos 
La contaminación por especies de nitrógeno es un problema emergente que surgió 
primordialmente por el uso excesivo de N en la agricultura y ganadería en el siglo XX. 
Numerosos sitios contaminados se han estudiado a lo largo de los últimos años, siendo los 
cuerpos de agua particularmente susceptibles (Spalding y Exner 1993; Chen et al. 2000; Ju et al. 
2006). Los acuíferos son especialmente vulnerables a la contaminación debido a la lixiviación de 
especies oxidadas de N, sobre todo aquellos que no están confinados y se encuentran por 
debajo de las zonas de cultivo (Puckett et al. 2010). 
Una gran variedad de microorganismos, entre los que se incluyen bacterias y arqueas, 
participan en el ciclaje del N y se han estudiado para explotar su potencial biotecnológico con 
fines de biorremediación (Jetten 2008). Debido a la dificultad de aislamiento de los grupos 
bacterianos involucrados en la remoción, la estrategia actual más usada es su estudio in vitro en 
17 
reactores (Chen et al. 2009; Hu et al. 2010). Sin embargo, la introducción de herramientas 
moleculares ha permitido el análisis de muestras ambientales metagenómicas, y con ello 
dilucidar el papel en la comunidad microbiana en los procesos de transformación. 
La desnitrificación es el proceso más conocido de los involucrados en la remoción de 
formas de N. Éste ha sido descrito en una amplia variedad de ambientes entre los que se 
incluyen los acuíferos, sobre todo en aquellos con una fuente de carbono orgánico suficiente. Sin 
embargo, los procesos naturales no suelen remover grandes cantidades de NO3-, por lo que 
estos procesos de manera nativa en acuíferos colaboran con bajos rendimientos (Hiscock et al. 
1991). Anammox es un proceso reconocido por su influencia en la pérdida de nitrógeno en zonas 
mínimas de oxígeno en los océanos; y se ha encontrado también en sistemas terrestres 
(sedimentos) o acuáticos de agua dulce. Sin embargo, también ha sido posible detectar 
anammox en sistemas de agua subterránea contaminados y prístinos (Moore et al. 2011; 
Sonthiphand et al. 2014; Smith et al. 2015; Kumar et al. 2017). N-damo es el proceso de 
remoción más desconocido, sobre todo porque se ha sido descrito más recientemente. Este 
metabolismo ha sido encontrado en zonas más restringidas, sobre todo por la necesidad de la 
presencia de metano para llevar a cabo el proceso completo; sin embargo, ha sido encontrado en 
acuíferos, aunque son necesarios más estudios (Hanson y Madsen 2015). Los procesos 
bacterianos de remoción de nitrógeno suelen encontrarse en coexistencia entre sí y acoplados a 
otros metabolismos, por lo que suelen estudiarse en consorcio (Luesken et al. 2011; Wenk et al. 
2013). En el presente proyecto se propone el estudio de los tres mecanismos de remoción de N 
que podrían estar involucrados en la zona saturada de un piedemonte del Valle del Mezquital. 
 
18 
6. Material y métodos 
6.1. Sitio de estudio 
El Valle del Mezquital es una región que se localiza en la zona central de México, en el altiplano 
mexicano en el estado de Hidalgo, México. Se encuentra entre los 1700 – 2100 m s.n.m. dentro 
de las coordenadas 20°07’ N, 99°14’ O. Este valle es una región semiárida con una precipitación 
anual promedio de 450 mm, restringida principalmente a cuatro meses (junio a septiembre). La 
temperatura promedio anual varía entre los 13 y 21 °C (Instituto Nacional de Estadística, 
Geografía e Informática, 1992; Jiménez y Chávez, 2004). El Valle del Mezquital ha sufrido una 
transformación radical en el uso del suelo, pasando de una flora xerofítica nativa a campos de 
uso agrícola, donde los principales cultivos producidos en la zona son maíz, frijol, avena, forraje y 
alfalfa. 
El presente estudio fue realizado en un piedemonte localizado dentro del Valle del 
Mezquital, Hidalgo. Este se encuentra a una altura de 2070 a 2090 msnm con una pendiente 
entre los 2° y 5°. Los procesos de infiltración derivados del riego, almacén y distribución de agua 
residual han derivado en la formación de un acuífero somero debajo de los campos de cultivo 
entre los 22 – 33 m de profundidad en las partes más altas, y hasta menos de 1 m en las zonas 
más bajas del valle. En las partes altas, este cuerpo de agua subterránea fluye de este a oeste 
hasta alcanzar el manantial de “Cerro Colorado” (Hernández-Martínez et al. 2014). Este modelo 
de piedemonte ha sido empleado recientemente para estudios de remoción de contaminantes y 
calidad de agua en los retornos producidos por la irrigación con agua residual (Hernández-
Martínez et al. 2014; Alcántara-Hernández et al., en revisión), ya que se sabe que, el agua 
residual es la principal fuente de agua en esta zona de recarga. 
 
6.2. Modelo de piedemonte, sitios de muestreo y toma de muestra 
Para esta tesis se seleccionó la escala de piedemonte como sistema de estudio (Fig. 2A). Los 
puntos de muestreo se seleccionaron con base en el conocimiento previo del flujo de agua 
subterránea con el fin de obtener información de la principal fuente de recarga (agua residual), 
distintos puntos internos del acuífero y finalmente el manantial que forman (zona de descarga) 
(Hernández-Martínez et al. 2014). En la figura 2B se muestran los puntos de muestreo 
seleccionados para el presente estudio, entre los que se integran el agua residual transportada 
por el canal Tlamaco-Juandhó (Canal), tres pozos localizados en diferentes casas del pueblo de 
19 
Tlahuelilpan (Pozo1, Pozo2 y Pozo3), dos piezómetros localizados en los campos de cultivo 
(Piezómetro 2 y Piezómetro 3) y el manantial “Cerro Colorado” (Manantial). 
 
Figura 2. Sitios de muestreo del presente estudio. A. Modelo de piedemonte. B. Mapa de los sitios de estudio. 
 
Para el presente trabajo se llevaron a cabo seis muestreos en diferentes meses de 2017 
(febrero, mayo, agosto, octubre y noviembre) y 2018 (enero). Las muestras superficiales (Canal y 
Manantial) se tomaron con un contenedor limpio (~3 L) y para las muestras de pozos y 
20 
piezómetros (Pozo1, Pozo2, Pozo3, Pizómetro2, Piezómetro3) se empleó un bailer de PVC (Ø 10 
cm, longitud 1.2 m). En los sitios Pozo1, Pozo2, Pozo3 y el Piezómetro3 se consideraron las 
primeras muestras obtenidas con el bailer, mientras que para muestrear el Piezómetro2, se purgó 
primero el pozo de observación para después tomar una muestra representativa. Cabe 
mencionar que para el Piezómetro3 sólo pudo recuperarse una muestra de agosto 2017, debido 
a los bajos niveles de agua en el mismo; y también en algunos pozos no fue posible colectar 
muestra durante algunos meses por la accesibilidad a las casas particulares (Anexo 1). 
También se determinaron algunos parámetros fisicoquímicos in situ (pH, temperatura, 
potencial de óxido-reducción y conductividad eléctrica) utilizando la sonda multiparamétrica 
HI9218 (Hanna Instruments); para lo cual, la muestra se colocó en un contenedor 
inmediatamente después de colectarse, evitando su perturbación. Se tomaron muestras para 
análisis de formas de N y otros iones. Para la obtención de la concentración de los iones 
mayores (i.e. presentes en concentraciones >0.2 mg/L) se filtraron 10 mL de muestra a través de 
membranas de 0.45 µm. Para el caso del nitrito y amonio, los cuales se encontraban en 
concentraciones <0.2 mg/L en el agua subterránea, se emplearon los colorímetros de mano 
HI707 y HI715 Checkers (Hanna Instruments), los cuales requerían igualmente 10 mL de muestra 
filtrada por 0.45 µm en campo y los reactivos sugeridos por el fabricante. 
Para la obtención de las muestras microbiológicas,se tomaron de 1 a 2 L de agua 
subterránea (pozos, piezómetros y manantial), y se colocaron en botellas estériles. Para las 
muestras de agua residual, se tomaron tres muestras de 1.5 mL en tubos Eppendorf estériles. 
Todo el material colectado en campo (para análisis microbiológico o de iones) se llevó al 
laboratorio en hielera a 4 °C y con bolsas obscuras para evitar efectos de fotoinhibición. Una vez 
en el laboratorio, las muestras de material microbiológico se filtraron por membranas Durapore 
PVDF de 0.22 µm (400 mL para extracción de DNA, y 800 mL para RNA), las membranas se 
guardaron en tubos estériles y preservaron para su procesamiento (a -20 °C para DNA, a -80 °C 
para RNA). 
 
6.3. Determinación de iones mayores 
Los iones nitrogenados solubles (NO3-, NO2-, NH4+) se determinaron en el cromatógrafo 1525 
(Waters) equipado con una bomba binaria. La fase estacionaria usada para la determinación de 
aniones se separó por la columna IC-PaK (Waters) y para cationes por la columna Metrosep C4 
(Metrohm) siguiendo el protocolo de Zamora Martínez et al. (2016). Estos análisis se realizaron 
21 
en el laboratorio de cromatografía del LANGEM (Laboratorio Nacional de Geoquímica y 
Mineralogía). 
 
6.4. Extracción de ácidos nucleicos 
Para el presente estudio fueron extraídos de manera independiente RNA y DNA para análisis 
posteriores. La extracción de DNA metagenómico (mgDNA) se realizó directamente de las 
membranas usando el kit de extracción DNeasy PowerWater Kit (Qiagen) siguiendo las 
instrucciones del fabricante y en los primeros tres días posteriores al muestreo. Cada muestra de 
mgDNA obtenido se cuantificó con el fluorómetro Qubit 4 (ThermoFisher Scientific), y se 
conservó a -20 °C hasta su procesamiento. La concentración de mgDNA obtenido varió entre 1 y 
40 ng/µL. 
El RNA total se extrajo directamente de las membranas de PVDF con el kit RNeasy 
PowerWater (Qiagen), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras obtenidas se 
trataron con DNasa (RQ1 RNase-Free DNase de Promega) para asegurar que estuviera libres de 
mgDNA y evitar la sobreestimación de los genes transcritos. Luego, las muestras se purificaron 
nuevamente con el mini kit RNeasy (Qiagen) para retirar las sales que adicionaba el tratamiento 
anterior. Para comprobar que las muestras de RNA estaban libre de DNA, se realizaron 
reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) con primers para rpoB (Tabla 1) y posteriormente 
una electroforesis en gel de agarosa 1%. Aquí se esperaba un resultado negativo, ya que una 
amplificación positiva, era señal de mgDNA presente. Una vez asegurado que la muestra no 
contuviera DNA, se sintetizaba DNA complementario (cDNA) mediante el kit GoScript Reverse 
Transcription Mix (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. La solución total de cDNA 
se cuantificó con el fluorómetro Qubit 4 (ThermoFisher Scientific) y almacenada a -20 °C hasta su 
procesamiento. La concentración de cDNA obtenido fue entre 0.5 y 36 ng/µL 
 
6.5. Amplificación de marcadores moleculares por PCR 
En el presente trabajo se seleccionaron los marcadores moleculares contenidos en la tabla 1 
para analizar al componente Bacteria/Arquea, y estudiar a los grupos involucrados en la 
remoción de nitrógeno (desnitrificación, anammox y n-damo). El gen 16S rDNA se utilizó para 
analizar la composición y estructura del componente Bacteria/Arquea en todas las muestras. 
Mientras que nosZ, hzo, pmoA y nod fueron los genes funcionales seleccionados para identificar 
22 
los metabolismos microbianos de remoción de N por qPCR, empleando rpoB como control 
constitutivo. 
Las reacciones de PCR de tipo punto final (end-point) se realizaron i) para obtener las 
librerías 16S rDNA para identificar a la comunidad procaróntica, y ii) para establecer las 
condiciones de trabajo de los genes rpoB, nosZ, hzo, pmoA y nod para los subsecuentes 
ensayos de PCR cuantitativa, qPCR. Las reacciones de PCR de punto final (25 µL) se realizaron 
usando mgDNA (~10 ng por reacción), 1X buffer de PCR (libre de Mg2+), 0.4 µM de cada 
oligonucleótido iniciador (primer), 200 µM de cada desoxirribonucleótido trifosfato (dATP, dCTP, 
dTTP y dGTP), 5% de DMSO (dimetil sulfóxido), 1.5 mM de MgCl2 y 1 U de DNA polimerasa 
TaKaRa Taq (Takara Bio Inc.). El programa de amplificación fue similar para todos los genes, con 
adaptaciones de la temperatura de alineamiento y el tiempo de amplificación que es específica 
para cada juego de cebadores (primers) (Tabla 1). El protocolo del termociclador consistió en una 
fase inicial de desnaturalización de 95°C por 5 minutos, seguido de 35 ciclos de amplificación de 
95°C por 1 minuto, seguido de la temperatura y el tiempo óptimos para cada juego de 
oligonucleótidos y 72°C por el tiempo necesario también para cada gen. Finalmente, un ciclo de 
extensión final de 72°C por 10 minutos. 
23 
 
Tabla 1. Oligonucleótidos usados durante el presente estudio 
Gen 
Oligonucleótidos 
Secuencia 
Amplicón 
(bp) 
Tm 
(ºC) 
Referencia 
rrn-16S rRNA 
515F GTGCCAGCMGCCGCGGTAA 
290 50 Caporaso et al. 2012 
806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT 
rpoB, RNApol 
rpoB1698f AACATCGGTTTGATCAAC 
350 53 Dahllöf et al. 2000 
rpoB2041r CGTTGCATGTTGGTACCCAT 
hzo, Deshidrogenasa de hidrazina (anammox) 
hzocl1F1 TGYAAGACYTGYCAYTGG 
470 50 Schmid et al. 2008 
hzocl1R2 ACTCCAGATRTGCTGACC 
nod, Dismutasa de óxido nítrico (n-damo) 
nod1446F GGTGBYBTTCCTGTTCTTYRG 
261 57 Zhu et al. 2017 
nod1706Rv2 GATRTTCCAGAAGTTRACGSC 
pmoA, Metano monooxigenasa (Oxidación de metano/n-damo) 
HP3F1 CCCAGTACTTCATGTGGGARAARAT 
274 54 Han and Gu 2013 
HP3R1 GGGGGCCAGCCANRYCCARTT 
nosZ, Reductasa de óxido nitroso (denitrification) 
nosZ-F CGYTGTTCMTCGACAGCCAG 
700 57 Kloos et al. 2001 
nosZ-R CATGTGCAGNGCRTGGCAGAA 
 
Los amplicones obtenidos se verificaron mediante electroforesis en gel de agarosa 1-2% (el 
porcentaje dependió del tamaño de fragmento amplificado), tinción con SYBR-safe (Invitrogen) y 
visualización con el equipo SmartDoc (Accuris Instruments). 
 
24 
6.6. PCR cuantitativo (qPCR) 
Los genes rpoB, nosZ, hzo, pmoA y nod se cuantificaron por qPCR en ensayos dependientes de 
SYBR Green, y con el equipo StepOne System (Thermo Fisher Scientific). Para este ensayo sólo 
se consideraron muestras de mgDNA o cDNA obtenidas en dos meses representativos de 
periodos de: i) lluvias (agosto 2017) y ii) secas (mayo/octubre 2017). Para cada gen (rpoB, nosZ, 
hzo, pmoA y nod) se construyó una curva estándar a partir de diluciones seriales de un producto 
de PCR purificado y generado con las muestras de mgDNA. En cada una de las cuantificaciones 
se incluyeron controles negativos y se calculó el número de copias contenidas en base a la 
concentración, la masa molar por pares de bases y la longitud de los fragmentos, con el software 
online DNA Copy Number and Dilution Calculator (Thermo Fisher Scientific) 
(www.thermofisher.com/mx). 
Cada reacción de qPCR (10 µL) se preparó con 1X de Premix Ex Taq Bulk (Takara Bio 
Inc.), 1X de colorante de referencia Rox, 0.2 µM de cada oligonucleótido y 1 ng de templado 
(cDNA o mgDNA). El protocolo de amplificación consistió en un ciclo de 95°C por 5 min, seguido 
de 40 ciclos de amplificación de 95°C por 1 min, la temperatura y el tiempo de alineamiento 
específica para cada uno de los cebadores y 72°C por 30 o 60 s (nuevamente, dependiendo del 
amplicón). Al final del proceso se programó un protocolo para generar una curva de fusión y 
verificar que la amplificación sólo generara una banda (prueba de especificidad). El paso inicial 
fue de 95°C por 15 segundos y posteriormente un ciclo continuo con aumentos de 0.3°C cada 15 
s, iniciando en 60°C y finalizado en 95°C para cada amplicón. Todas las muestras y controles se 
colocaron por duplicado. 
 
 
6.7. Secuenciación de marcadores moleculares 
Los amplicones gen 16S rDNA generados se purificaron mediante perlas magnéticas del kit 
Agencourt AMPureXP PCR Purification System (Beckman Coulter). Una vez cuantificados y 
purificados fueron enviados a secuenciar (~20 ng por muestras) en la plataforma Illumina MiSeq 
en el Yale Center for Genome Analysis de la Universidad de Yale, Estados Unidos. 
Los amplicones nosZ, pmoA, hzo y nod obtenidos a partir de cDNA del Pizezómetro2 se 
purificaron mediante el kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). Éstos se ligaron 
al vector pCR 2.1 usando el kit de clonación TOPO TA Cloning Kit for Sequencing TA Cloning 
(Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los vectores construidos se 
25 
emplearon para transformar células quimiocompetentes One Shot TOP10 de Escherichia coli 
(Invitrogen). Las células transformadas fueron seleccionadas por α-complementación usando 
cajas de Petri con medio LB con ampicilina (50 µg/mL) y X-gal (1.6 mg esparcido en la 
superficie). La obtención de los insertos deseados se confirmó por PCR-colonia, empleando los 
cebadores M13F y M13R. Los fragmentos de PCR-colonia se enviaron a secuenciar a la 
República de Corea del Sur, a la empresa Macrogen en un a 3730X DNA Analyzer (Applied 
Biosystems, Foster City, CA). 
 
6.8. Análisis de secuencias y análisis estadísticos 
Las secuencias de 16S rDNA obtenidas fueron filtradas y demultiplexadas usando QIIME2 de 
acuerdo con el método de Caporaso (Caporaso et al., 2012) y la guía de la página web 
(https://qiime2.org). Las secuencias filtradas se asignaron taxonómicamente usando la base de 
datos de Greengenes, cuya última actualización fue de mayo del 2013 
(http://greengenes.secondgenome.com). Para los análisis de rarefacción y diversidad se realizó 
un corte a 6500 secuencias. 
Para el análisis de nosZ, hzo, nod y pmoA del Piezómetro2, se siguieron los protocolos 
referenciados en Alcántara-Hernández et al. (2017). Las secuencias se compararon con las del 
NCBI mediante BLAST (BLASTn 2.2.27) para obtener aquellas de referencia. Y se realizaron 
árboles filogenéticos con with PhyML 3.0 (Guindon et al. 2010) empleando un modelo GTR. La 
robustez de las ramas se obtuvo mediante un análisis bootstrap con 1000 réplicas. Las 
secuencias generadas se depositaron en las bases de datos del NCBI bajo el BioProject 
PRJNA488796 (16S rRNA) y las secuencias funcionales en el GenBank con los números 
MH802435 (hzo), MH802436-MH802461 (nod), MH802462-MH802473 (nosZ) y MH802474-
MH802488 (pmoA). 
Para establecer el análisis de componentes principales (PCA) entre las muestras, se 
consideraron las tablas de abundancia relativa a nivel género. Los análisis se realizaron en la 
plataforma R (R Development Core Team 2012) bajo el ambiente integrado RStudio (versión 
1.0.143). Para los análisis de componente principales (PCA) se empleó la función ‘fviz_pca’ en 
‘factoextra’ (‘ggvegan’, ‘ggplot2’ y ‘factoextra’). 
 
https://qiime2.org/
26 
7. Resultados 
 
7.1. Caracterización fisicoquímica 
Los sitios de muestreo incluyeron diversos puntos del acuífero (piezómetros, pozos y un 
manantial) y su principal fuente de recarga (agua residual). Todos ellos se analizaron in situ con 
el fin de conocer la variabilidad de su composición fisicoquímica a lo largo del tiempo (Tabla 2). 
La temperatura promedio de los diferentes sitios de muestreo de agua subterránea fue estable y 
muy similar entre sí (~19.5°C). La temperatura del agua superficial del canal mostró variaciones 
más notables sobre todo en mayo cuando rondó los 23°C y en enero cuando descendió hasta 
casi 17°C. El pH tanto del agua subterránea como del agua residual fue neutral (cercano a 7.1), 
con ligeras variaciones de un máximo de 0.5 unidades. 
 
Tabla 2. Promedio de los parámetros fisicoquímicos de los sitios de muestreo de agua subterránea y 
superficial*. 
 Temperatura 
(°C) 
pH ORP 
(mV) 
CE 
(dS/m) 
Canal 20.9±1.8 7.3±0.5 -88±99.5 1.4186±0.5017 
Piezómetro2 18.7±1.0 7.1±0.1 144.7±50.0 1.3727±0.1498 
Pozo1 19.5±0.3 7.1±0.1 177.5±24.8 1.4082±0.1654 
Pozo2 19.4±0.5 7.1±0.2 158.7±45.1 1.888±1.0937 
Pozo3 20.0±1.0 7.3±0.1 170.2±42.9 1.863±1.0644 
Manantial 19.5±0.7 7.2±0.1 165.9±33.1 1.6992±0.6748 
* Muestras obtenidas en febrero, mayo, agosto, octubre y noviembre del 2017 y enero del 2018. 
 
El agua residual muestreada en el canal fue el único sitio de muestreo con carácter 
altamente reductor, ya que todas las mediciones mostraron valores negativos (en promedio de -
88 mV), y con un pico cercano a -300 mV en febrero. En el caso del agua subterránea, todos los 
puntos de muestreo (piezómetros, pozos y manantial) mostraron valores positivos de ORP (140 
mV en promedio). La conductividad eléctrica de todos los puntos de muestreo fue variable en los 
27 
meses analizados (~1.4-1.9 dS/m), siendo Pozo2 y Pozo3 los que registraron los valores más 
altos en promedio (~1.8 dS/m). 
Las especies de nitrógeno inorgánicas disueltas (NH4+, NO3- y NO2-) también se 
determinaron en todas las muestras. Con el cromatógrafo de iones, el amonio (NH4+) se detectó 
sólo en el agua residual (Canal) y en pequeñas trazas en algunos pozos y el Piezómetro2 (Tabla 
3). En cuanto a las especies oxidadas de N, el NO3- fue el más abundante en el agua subterránea 
(78.2 -180 mg/L), mientras en el agua residual estuvo por debajo de nivel de detección del 
equipo. El nitrito se detectó solamente con el colorímetro de mano y en campo, siendo el de 
mayor concentración el Piezómetro2 (0.04 ± 0.01 µg N-NO2−/L), y con pequeñas trazas en el 
agua residual, pozos y manantial. 
 
Tabla 3. Promedio de las concentraciones de las formas de N inorgánico disuelto en las 
diferentes muestras de agua superficial y subterránea*. 
 NO3- (mg N/L) NO2- (µg N/L) NH4+ (mg N/L) 
Canal 1.1±1.5 ND 27.7±5.3 
Piezómetro2 17.7±4 0.04±0.01 ND 
Pozo1 40.75±1.98 0.004±0.004 ND 
Pozo2 20.06±3.2 0.006±0.001 ND 
Pozo3 19.72±3.81 0.01±0.014 ND 
Manantial 22.5±2.9 0.007±0.007 ND 
*Promedio de muestras en febrero, mayo, agosto, octubre y noviembre de 2017 y enero de 2018. 
ND: No detectado, debajo de los límites de detección. NO2- 0.01 µg/L. 
 
Los datos completos están presentados en el anexo 2. 
 
 
7.2. Análisis de la comunidad microbiana. 
Con el propósito de conocer cómo se conformaba la comunidad microbiana desde la principal 
fuente de recarga hasta el manantial se llevó a cabo un análisis exploratorio usando 16S rDNA 
como marcador molecular. Se obtuvieron un total de 2,127,848 secuencias, las cuales se 
redujeron a 1,186,202 después del filtro de calidad con DADA2. Las muestras tuvieron entre 
6,670 y 130,738 secuencias, por lo que los análisis de rarefacción se realizaron a un corte de 
6500 secuencias. En promedio, las muestras de los pozos y piezómetros fueron aquellas con 
28 
mayor número de Unidades Taxonómicas Operacionales (u OTUs, por sus siglas en inglés y 
definidas al 97% de identidad de secuencia nucleotídica) (Fig. 3). Se observó que en la mayoría 
de los sitios analizados se alcanza a colectar casi el total de los OTUs, mientras que el Pozo2 y 
Pozo3, queda una diversidad bacteriana por detectar a este corte. 
 
 
Figura 3. Curva de rarefacción de las muestras de agua residual y subterránea. 
 
Sin embargo, se observó también que en los diferentes meses analizados existieron 
variaciones en la diversidad (índice de Shannon, H’) y el número de OTUs detectados. En 
general, se mantuvo la tendencia donde el Canal y el Piezómetro3 fueron los del menor número 
de OTUs y con menor diversidad (H’). Mientras que el Piezómetro2 tuvo un amplio margen de 
variación, así como los Pozos1-3 y el Manantial; sin poder verse una tendencia en el tiempo y su 
relación con el número de los OTUs observados (Fig. 4). 
29 
 
Figura 4. Índice de diversidad Shannon-Waever (H’) y OTUs observados por sitio en los diferentes tiempos de 
muestreo. 
 
Cuando las secuencias se asignaron taxonómicamente, se pudieron notar diferencias 
desde nivel fila, siendo más notable los cambios entre el