Analisis-de-la-distribucion-del-receptor-GABAp-en-la-zona-periventricular-del-cerebelo

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
INSTITUTO DE NEUROBIOLOGÍA
“ANÁLISIS DE LA DISTRIBUCIÓN DEL RECEPTOR 
GABAρ EN LA ZONA PERIVENTRICULAR DEL CEREBELO”
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRA EN CIENCIAS
(NEUROBIOLOGÍA)
PRESENTA
QFB MARÍA ALEJANDRA GONZÁLEZ GONZÁLEZ
DIRECCI Ó N DE TESIS:
DR. ATAÚLFO MARTÍNEZ TORRES
DR. LENIN DAVID OCHOA DE LA PAZ
UNAM, CAMPUS JURIQUILLA, QUERÉTARO, 2011.
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
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fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“ANÁLISIS DE LA DISTRIBUCIÓN DEL RECEPTOR GABAρ EN 
LA ZONA PERIVENTRICULAR DEL CEREBELO” 
 
 
Tesis que para obtener el grado de 
Maestra en Ciencias 
(Neurobiología) 
 
 
Presenta: 
QFB María Alejandra González González 
 
 
 
Directores de Tesis: 
 
Dr. Ataúlfo Martínez Torres 
Dr. Lenin David Ochoa de la Paz 
 
 
 
 
UNAM, campus Juriquilla, Querétaro, 2011. 
 
Universidad Nacional Autónoma de México 
 
Instituto de Neurobiología 
 
 
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
INSTITUTO DE NEUROBIOLOGÍA 
 
 
Los miembros del Jurado de examen de grado certificamos que la tesis elaborado por la 
QFB María Alejandra González González cuyo título es: “Análisis de la distribución del 
receptor GABAρ en la zona periventricular del cerebelo”, se presenta como uno de los 
requisitos para obtener el grado de Maestría en Ciencias (Neurobiología) y cumple con 
los criterios de originalidad y calidad requeridos por la División de Estudios de Posgrado 
de la Universidad Nacional Autónoma de México. 
 
 
Presidente: 
Dr. Alfonso Cárabez Trejo _______________________ 
 
 
Secretario (Tutor): 
Dr. Lenin David Ochoa de la Paz _______________________ 
 
 
Vocal: 
Dra. Esther López-Bayghen Patiño _______________________ 
 
 
Suplente: 
Dra. Sofía Yolanda Díaz Miranda _______________________ 
 
 
Suplente: 
Dr. Jorge Antonio Larriva Sahd _______________________ 
 
 
 
 
 
Aprobado por el Comité Académico 
 
 
 
 
 
_____________________________________________ 
 
Dra. Teresa Morales Guzmán 
Coordinadora del Programa de Maestría en Ciencias (Neurobiología) 
 
 
 
 
Resumen 
 
 
El ácido γ-aminobutírico (GABA) es uno de los neurotransmisores inhibitorios más 
importantes en el SNC, en el cerebelo se ha reportado la expresión del receptor 
ionotrópico GABAρ en células de Purkinje y células en canasta. En el presente proyecto 
se reporta su expresión en la zona periventricular del cerebelo (ZPVCb) de ratón adulto, 
esta zona es neurogénica durante el desarrollo y en el adulto aún no es claro su papel 
fisiológico y poco se sabe de la presencia de receptores a neurotransmisores. 
Se analizó la expresión y distribución del RNAm de las subunidades GABAρ por 
RT-PCR e hibridación in situ respectivamente y se emplearon técnicas de 
inmunofluorescencia para determinar la presencia del receptor en la ZPVCb de ratones 
de la cepa CD1 y transgénicos que expresan la proteína verde fluorescente (GFP) en 
células dopaminérgicas D1 o D2. 
Se encontró el RNAm de las subunidades ρ1 y ρ2, pero no de ρ3. Los 
experimentos subsecuentes se realizaron para la subunidad ρ1, cuyo RNAm se 
encontró principalmente en el lóbulo X del cerebelo y en las zonas adyacentes a los 
núcleos cerebelosos medial y vestíbulo cerebeloso. Se encontró que la subunidad ρ1 se 
expresa en células GFAP positivas y su distribución es mayor hacia la luz ventricular. 
Por otra parte se observaron poblaciones celulares que expresan receptores a 
dopamina D1 y D2 hacia la zona subventricular, y que pudieran ser procesos de la glía 
de Bergmann (D1 positivos) o dendritas de las células de Purkinje (D2 positivos), 
ambas GABAérgicas. 
Estos resultados muestran la presencia del RNAm y de la subunidad ρ1 en la 
ZPVCb y su distribución en células GFAP positivas. Aún no se sabe qué papel podrá 
jugar el receptor en esta zona, sin embargo este hallazgo nos permitirá diseñar nuevas 
estrategias experimentales que permitan estudiarlo. 
 
 
 
Abstract 
 
γ-aminobutyric acid (GABA) is one of the most important inhibitory neurotransmitter in 
the CNS, in the cerebellum has been reported the expression of ionotropic GABAρ 
receptors in Purkinje and basket cells. In this research thesis we report the expression 
of the GABAρ in the periventricular zone of the cerebellum (ZPVCb) of adult mice. This 
is neurogenic during development and in adults is still unclear its functional role and little 
is known about the presence of receptors to neurotransmitters. 
We analyzed the presence and distribution of mRNA of GABAρ subunits by 
means of RT-PCR and in situ hybridization, respectively, and immunofluorescence was 
used to analyze the presence of the receptor in the ZPVCb of mice strain CD1 and 
transgenic mice expressing GFP in D1 Or D2 dopaminergic cells. 
mRNA for ρ1 and ρ2 subunits were amplified but not for ρ3. The subsequent 
experiments were performed for the ρ1 subunit whose mRNA was found mainly in the X 
lobule of the cerebellum and in areas adjacent to the medial cerebellar nuclei and 
vestibule cerebellar nuclei. We found that the ρ1 subunit is distributed in GFAP positive 
cells and is mainly detected towards the ventricular lumen. On the other hand we 
observed populations expressing D1 and D2 receptors in the subventricular zone, that 
could be processes of the Bergmann glia (D1 positive) or dendrites of Purkinje cells (D2 
positive). 
The results show the presence of mRNA and the ρ1 receptor, it is not known yet 
the functional role played by this receptor in this zone. Nevertheless, these new findings 
paved the way to design new experiments. 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
Agradezco a la Universidad Nacional Autónoma de México por permitirme ser parte 
de ella y con ello poder hacer crecer y fortalecer mis conocimientos y mi espíritu de 
lucha continua. 
 
Tutores 
Dr. Ataúlfo Martínez Torres: Por permitirme ser parte de su muy valioso grupo de 
investigación y porque a pesar del tiempo que estuvo lejos, siempre tuve su apoyo en 
cada parte del proyecto y de mi formación. 
 
Dr. Lenin David Ochoa de la Paz: Por su apoyo en el desarrollo del presente proyecto y 
por sus consejos que me ayudaron a crecer profesionalmente. 
 
Comité Tutelar 
Dr. Carlos Manuel Valverde Rodríguez 
Dra. Sofía Yolanda Díaz Miranda 
 
Jurado de Examen 
Dr. Lenin David Ochoa de la Paz 
Dr. Jorge Larriva Sahd 
Dr. Alfonso Cárabez Trejo 
Dra. Esther Ivonne López-Bayghen Patiño 
Dra. Sofía Yolanda Díaz Miranda 
 
Personal de apoyo en el Laboratorio de 
Neurobiología Molecular y Celular (D15) 
Técnico Académico M. en C. Angeles Edith Espino Saldaña 
Auxiliar de laboratorio Lic. Efrén Ruíz Alcibar 
 
Compañeros de Laboratorio 
Adriana Pétriz Reyes 
Jazmin Castellanos González 
Abraham Rosas Arellano 
Salomé Elizondo 
Argel Estrada Mondragón 
Fernando Rosas Sánchez 
Patricia Juárez Mercado 
Arturo Machuca Parra 
Ernesto Mora Loyola 
Elizabeth Cabrera Ruíz 
Gustavo Martínez Delgado 
 
Unidad de enseñanza 
M. en C. Leonor Casanova Rico 
 
 
 
Unidad de Microscopía 
Ing. Elsa Nydia Hernández Ríos 
IBQ Ma. de Lourdes Palma Tirado 
 
Unidad de Proteogenómica 
Dra. Anaid Antaramian 
 
Biblioteca 
Dr Francisco Javier Valles Valenzuela 
MVZ Román Pacheco Barrita 
 
Bioterio 
MVZ José Martín García ServínCómputo 
Ing. Ramón Martínez Olvera 
 
Fotografía 
Laura Sánchez Carballo 
 
Videoconferencia 
Lic. Psic. Ma. de Lourdes Lara Ayala 
 
El presente proyecto fue financiado por: 
 
Fondos para la Investigación del CONACYT No. 101851 
Proyecto PAPIIT-DGAPA IN202609 
Proyecto PAPIIT-DGAPA IN206411 
 
Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología 
Becario No: 333703 
 
Dirección General de Estudios de Posgrado de la UNAM 
Becario No. 51000192-0 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A Dios: por darme las fuerzas
necesarias para seguir en pie
durante el maravilloso andar
de esta vida llena de flores y
de espinas... por seguir
mandando ángeles a mi
camino...
A mis padres: por su amor
incondicional, por seguir
siendo mi modelo a seguir en
cuanto a fortaleza y lucha
continua...
A mis hermanos Víctor, Alma y 
Octavio: por creer en mí y por 
llevar en el corazón raíces de 
una misma tierra... 
A mi Padi: no hay palabras suficientes...
por las fuerzas compartidas, por tu
hombro que ha recibido mis lagrimas
de felicidad y de tristeza, por creer en
mi y porque con base en el amor
hemos visto en cada día una
oportunidad de seguir siendo felices...
A mi hija Yanni: por enseñarme lo
grandioso que es ser madre, porque
ha traído a mi vida alegría
indescriptible y porque su voz de
ángel me llena de inmensa
felicidad...
A mi bebé: que pronto
llegara a mi vida como una
nueva bendición y que ya es
parte de mis motivaciones...
Al Dr. Ataúlfo Martínez Torres:
porque sus consejos y su apoyo han
sido fundamentales en mi
desarrollo profesional, y sin lugar a
dudas es una persona que admiro y
respeto.
DEDICATORIAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Mientras el cerebro sea un misterio,
el universo continuará siendo un misterio.....
Santiago Ramón y Cajal
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ABREVIATURAS 
 
BCIP 5-bromo-4-cloro-3‟-indolfosfato 
BLBP Proteína de unión a lípidos cerebrales 
CA Célula amácrina 
CACA Ácido-cis-amino-crotónico 
CAMP Ácido-cis-2-amino-metil ciclopropanóico 
CB Célula bipolar 
CD24 Molécula de adhesión conocida como cluster de diferenciación 24 
CGP27492 Ácido 3-amino-propil-fosfínico 
CH Célula horizontal 
CM Capa molecular 
CPOs Célula progenitora de oligodendrocitos 
CVO Órgano circunventricular 
D1 Receptor de dopamina tipo D1 
D2 Receptor de dopamina tipo D2 
DAPI 4',6-diamidino-2-fenilindol 
dATP Desoxiadenosin trifosfato 
dCTP Desoxicitidin trifosfato 
DEPC Dietil pirocarbonato 
dGTP Desoxiguanosin trifosfato 
DIG Digoxigenina 
DNA Ácido desoxirribonucléico 
dNTPs Desoxinucleótidos trifosfato 
dTTP Deoxitimidina trifosfato 
dUTP Deoxiuridina trifosfato 
E Embrionario 
EC50 Concentración media máxima efectiva 
EDTA Ácido etilendiaminotetraacético 
FR Fotorreceptor 
GABA Ácido gamma aminobutiírico 
GABAA Receptor de ácido gamma aminobutírico tipo A 
GABAB Receptor de ácido gamma aminobutírico tipo B 
GABAρ Receptor de ácido gamma aminobutírico tipo rho 
GFAP Proteína glial ácida fibrilar 
GFP Proteína verde fluorescente 
GFP-D1 Proteína verde fluorescente dirigida por el promotor de dopamina D1 
GFP-D2 Proteína verde fluorescente dirigida por el promotor de dopamina D2 
GLAST Transportador de glutamato y aspartaro 
IF Inmunofluorescencia 
LCR Líquido cefaloraquideo 
 
MABT Amortiguador de ácido maléico 
NBT Cloruro de nitroazul de tetrazolio 
NG Neuro glial 
NIH Instituto Nacional de Salud 
NSC Células progenitoras neuronales 
NTMT Amortiguador que contiene cloruro de sodio, tris, cloruro de magnesio y tween 20 
PB Amortiguador de fosfatos 
PBS Amortiguador de fosfatos salino 
PBT Amortiguador de fosfatos adicionado con Tween 
PCR Reacción en cadena de la polimerasa 
PFA Paraformaldehido 
pH Potencial de hidrógeno 
RNA Ácido ribonucleico 
RT Retrotranscripción 
SNC Sistema nervioso central 
SSF Solución salina fisiológica 
TAE Solución de tris acetato y EDTA 
TE Amortiguador de tris-EDTA 
TM Transmembranal 
TPMPA Ácido 1,2,5,6-tetrahidropiridina-4-metilfosfinico 
TUB Tubulina 
UV Ultravioleta 
ZPVCb Zona periventricular del cerebelo 
10Cb Lóbulo X del cerebelo 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
INDICE 
 
1. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………………. 1 
2. ANTECEDENTES………………………………………………………………………….... 2 
2.1 Ácido γ-aminobutírico y sus receptores……………………………………..…... 2 
2.2 Receptores del ácido γ-aminobutírico en el cerebelo………………………..... 4 
2.3 El cerebelo y su estructura neuronal…………………………………………..... 5 
2.4 La glía en el cerebelo.………………………………………………...………....... 7 
2.5 Sistema ventricular y líquido cefaloraquídeo…………………………..............10 
3. JUSTIFICACIÓN…….…………………………………………………………..................15 
4. HIPÓTESIS…………………………………………………………………………..….......16 
5. OBJETIVOS…………………………………………………………………………….…...16 
6. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………………....17 
6.1 Sujetos experimentales…………………………………………………………..17 
6.2 RT-PCR…………………………………………………………………………….17 
6.2.1 Obtención de material biológico……….……………………………....17 
6.2.2 Extracción de RNA total………………………………………………...17 
6.2.3 RT-PCR…...……………………………………………………………...18 
6.3 Hibridación In-situ……………………………………………………………….....20 
6.3.1 Síntesis de sondas marcadas con digoxigenina…....…………….…20 
6.3.2 Cuantificación y titulación de las sondas………………………...…...20 
6.3.3 Obtención de material biológico………………………………….........22 
6.3.4 Pretratamiento……………………………………………………...…....22 
6.3.5 Prehibridación e hibridación………………………….…………......….23 
6.3.6 Detección inmunológica de la sonda hibridada…….………...………23 
6.4 Doble inmunofluorescencia……………………………………………...…........24 
6.4.1 Obtención de material biológico…………………………………….….24 
6.4.2 Desarrollo de la inmunofluorescencia…………………………………25 
6.4.3 Desarrollo de la inmunofluorescencia en ratones transgénicos……26 
 
 
 
 
7. RESULTADOS………………………………………………………………………….....27 
 7.1 Detección del RNAm de las subunidades del receptor GABAρ en la 
 ZPVCb…………….………………………………….………………………....27 
 7.2 Distribución del RNAm de la subunidad ρ1 en la ZPVCb ………...………28 
 7.3 Detección del receptor GABAρ en células dopaminérgicas D1-GFP y 
 D2-GFP………………………………………………………………………….30 
 7.4 Detección del receptor GABAρ en células GFAP de la ZPVCb …….……34 
8. DISCUSIÓN………...………………………………………………………………………36 
8.1 Distribución del RNAm de las subunidades ρ1 y ρ2 en la ZPVCb……….36 
8.2 Caracteristicas funcionales de la ZPVCb y la posible participación del 
 receptor GABAρ …..…………………………….……………………………..37 
 8.3 Implicación funcional de la presencia de neurotransmisores en el 
 sistema ventricular…………………………………………………………..…38 
 8.4 Distribución del receptor GABAρ1 en células inmunoreactivas para 
 GFAP de la ZPVCb y su distribución en ratones D1-GFP y D2…………..40 
9. CONCLUSIONES………………………………………..…………………………………42 
10. PERSPECTIVAS…….……………………………………….……………………………43 
11. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………..…………………...44 
12. LISTA DE TABLAS….…………………………………………………………………..…50 
13. LISTA DE FIGURAS………………………………………………………………………50 
14. ANEXOS……………………………………………………………………………………51 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1 
 
 
“ANÁLISIS DE LA DISTRIBUCIÓN DEL RECEPTOR GABAρ EN LA ZONA 
PERIVENTRICULAR DEL CEREBELO” 
 
1. INTRODUCCIÓN 
El Sistema Nervioso Central (SNC) de los vertebrados está formado por neuronas y 
células gliales que constituyen la materia gris y la materia blanca respectivamente. Por 
mucho tiempo se pensó que las células gliales tenían la única función de soporte para 
el establecimiento de redes neuronales, sin embargo actualmente se sabe que son de 
gran importancia en la fisiología neuronal y que participan en diferentes procesos 
fisiológicos como: el control de la osmolaridad, la regulación de la concentración 
extracelular de neurotransmisores, del gradiente iónico y nutrimentos celulares. 
La comunicación interneuronal se realiza principalmente medianteneurotransmisores excitadores e inhibidores, los cuales actúan en receptores 
específicos, generando un cambio de potencial en la membrana de las células 
postsinápticas. Se ha reportado que las células gliales liberan algunos 
neurotransmisores en respuesta a cambios en el ambiente extracelular y que al igual 
que las neuronas, presentan receptores específicos para neurotransmisores excitatorios 
e inhibitorios, sin embargo aún no se sabe cuál es el papel que estos receptores 
desempeñan y sus mecanismos de activación en este tipo celular. 
Uno de los neurotransmisores inhibitorios más importantes es el ácido γ-
aminobutírico (GABA), cuyos receptores están ampliamente distribuidos en el SNC. En 
el cerebelo específicamente, se ha reportado la presencia de receptores GABAρ en 
neuronas de Purkinje y células en canasta, sin embargo en la glía no se ha descrito su 
distribución ni función. Recientemente en nuestro laboratorio encontramos una 
población celular en la región periventricular del cerebelo que expresa el receptor 
GABAρ, por esta razón este proyecto se diseñó para identificar el tipo celular que lo 
presenta y determinar el tipo de subunidades que lo conforman. 
 
 
 
 
2 
 
2. ANTECEDENTES 
 
2.1 Ácido γ-aminobutírico y sus receptores 
En el SNC de mamíferos, el ácido γ-aminobutírico (GABA) es uno de los principales 
neurotransmisores inhibitorios (Gilman, 1996). Se han descrito dos tipos de receptores a 
GABA, que según sus propiedades farmacológicas y electrofisiológicas se clasifican en 
dos familias: GABAA y GABAB (Olsen y Sieghart, 2008). El receptor GABAA es 
ionotrópico y permite el paso de iones Cl-, es bloqueado selectivamente por bicuculina y 
modulado por esteroides, barbitúricos y benzodiacepinas (Chebib y Johnston, 1999). Por 
otra parte GABAB es un receptor metabotrópico acoplado a proteínas G que modula 
canales de Ca2+ y de K+, es activado selectivamente por baclofeno, ácido fosfínico y 
ácido 3-amino-propil-fosfínico (CGP27492)y bloqueado por faclofen (Bormann, 2000). 
Ambos tipos de receptores presentan cinéticas de activación diferentes, los GABAA 
presentan una activación rápida, mientras que los GABAB lenta (Nicoll, 2004). 
El receptor GABAρ pertenece a la familia GABAA y forma homo o 
heteropentámeros que pueden contener las subunidades GABAρ1-3. Estos receptores 
son altamente sensibles a GABA (EC50 ≈1-5µM) y no desensibilizan aun en presencia 
del agonista (Polenzani et al., 1991). Los principales agonistas del receptor GABAρ son 
el ácido cis-aminocrotónico (CACA) y el ácido cis-2-aminometil ciclopropano carboxílico 
(CAMP), es bloqueado por el ácido 1,2,5,6-tetrahidropiridina-4 metilfosfínico (TPMPA) y 
el ácido 3-aminociclopentil metilfosfínico [(±)-cis-3-ACPMPA]. Hasta la fecha no se 
conoce la estructura a alta resolución del receptor, sin embargo, como pertenece a la 
misma familia que el receptor nicotínico (familia de receptores “cys-loop”), (Adamian et 
al., 2009) se pude predecir que es un pentámero embebido en la membrana plasmática, 
y que cada subunidad tiene cuatro pases transmembranales (TM1-4) con abundantes 
residuos hidrofóbicos, con los grupos amino y carboxilo en la región extracelular, y que 
su segundo pase transmembranal forma la pared del canal iónico (Chebib, 2004). En la 
actualidad se cuenta con un modelo estructural básico del receptor (Adamian et al., 
2009) y en nuestro laboratorio ha sido generada in silico la estructura del receptor 
homomérico GABAρ1 (Figura 1) (Estrada-Mondragón et al., 2010). 
 
 
3 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Estructura del receptor homomérico GABAρ1. Se muestran a la izquierda una 
subunidad del receptor en corte longitudinal, y a la derecha el homopentámero desde el lado 
extracelular de la membrana (Estrada-Mondragón et al., 2010). 
 
 
Diversos estudios han demostrado la expresión de receptores al GABA en 
diferentes regiones del SNC como: retina, colículo superior, hipocampo, tálamo 
(Wegelius et al., 1998), médula espinal, bulbo, puente, núcleo caudado, cuerpo calloso y 
cerebelo (Wegelius et al., 1998, López-Chávez et al., 2005, Rosas-Arellano et al., 2007). 
El receptor GABAρ se ha descrito principalmente en retina, en donde se sabe que 
modula la transmisión sináptica de las células bipolares hacia las ganglionares 
localizadas en la capa plexiforme interna (Sagdullaev et al., 2006; Yang, 2003), aunque 
también se ha reportado su expresión en la capa plexiforme externa (Enz et al., 1996, 
Wässle et al., 1998) (Figura 2). 
 
 
 
 
 
 
 
TM
2
TM
4
TM1
TM3
9.8 nm
TM2TM4
TM1
TM3
4 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Capas celulares de la retina. Se pueden apreciar las células GABAérgicas en azul 
(amácrinas y horizontales), el receptor GABAρ se localiza principalmente en las terminales 
sinápticas de las células bipolares (recuadro 2). (Modificado de Sagdullaev, 2004). 
 
2.2 Receptores del ácido γ-aminobutírico en el cerebelo 
El cerebelo es una estructura muy importante en el SNC, una de sus principales 
funciones es el control de la ejecución de movimientos finos, en esta región se ha 
reportado la presencia de receptores a GABA, estudios por inmunofluorescencia 
muestran que el receptor GABAB se encuentra distribuido en la capa molecular, 
específicamente en árboles dendríticos y espinas de las células de Purkinje, en 
membranas extrasinápticas de fibras paralelas y en regiones perisinápticas de la 
membrana plasmática de estas últimas (Lujan y Shigemoto; Yamasaki et al., 2006).En 
cuanto al receptor GABAρ, ensayos de RT-PCR, inmunohistoquímica y microscopía 
B
astón
C
ono
Segmento externo de los 
fotorreceptores
Epitelio pigmentado
Capa nuclear externa
Capa nuclear interna
Capa plexiforme externa
Capa plexiforme interna
Capa de células ganglionares
Capa de fibras nerviosas
Célula 
Horizontal Célula 
Bipolar Célula 
de
MülerCélula 
Amácrina
Célula 
Ganglionar
FR
CB CG
CBCH CA
Neurona glutamatérgica
Neurona GABAérgica
FR Fotoreceptor
CH Célula Horizontal
CB Célula Bipolar
AC Célula Amácrina
CG Célula Ganglionar
5 
 
electrónica muestran la presencia de GABAρ1 y ρ2 en somas y árboles dendríticos de 
las células de Purkinje (Mejía et al., 2007); por otro lado Rozzo et al., (2002) 
determinaron por hibridación in situ la presencia de GABAρ1 y ρ2 en células de Purkinje 
y en las células en cesto. Experimentos de electrofisiología comprobaron la presencia de 
receptores con propiedades farmacológicas de GABAA y GABAρ en células de Purkinje 
(Harvey et al., 2006). Además, a través de la inyección de RNAm de cerebelo de rata en 
ovocitos de Xenopus laevis se encontró un componente insensible a bicuculina, que es 
bloqueado por TPMPA, el antagonista específico de receptores GABAρ (Mejía et al., 
2007). 
Estudios realizados en nuestro laboratorio mostraron que GABAρ1 y ρ2 se 
encuentran en las células de Purkinje y algunas células de Golgi. Estos análisis 
revelaron también una población de células inmunoreactivas a GABAρ en la zona 
periventricular del cerebelo (ZPVCb), que rodea al cuarto ventrículo, la cual juega un 
papel muy importante en la producción de líquido cerebro raquídeo (LCR)(Skipor y 
Thiery, 2008). Actualmente se piensa que participa en otras funciones de gran 
importancia, como el metabolismo hormonal o como sensor de algunos neuropéptidos 
disueltos en el LCR provenientes del sistema circulatorio (Joly et al., 2007). Los 
receptores de GABA no habían sido descritos previamente en esta región, es por esto 
que el propósito de este trabajo es determinar la distribución de este grupo de células 
que expresan al receptor GABAρ. 
 
2.3 El cerebelo y su estructura neuronal 
El cerebelo es una estructura de gran importancia en el SNC que procesa información 
proveniente de diferentes áreas del cerebro como los núcleos vestibulares, bulbares, la 
oliva inferior, la médula espinal yreceptores sensoriales que coordinan la ejecución 
temporal precisa del sistema músculo esquelético (Sacchetti et al., 2005). Se encuentra 
conectado al tallo cerebral por fibras denominadas pedúnculos cerebelosos inferior, 
medio y superior, uniendo al cerebelo con la médula, puente y mesencéfalo 
respectivamente. Por abajo del cerebelo se encuentra el cuarto ventrículo que contiene 
LCR proveniente del tercer ventrículo, el cual viaja hacia el espacio subaracnoideo y 
hacia el canal central (Sotelo, 2004). 
6 
 
El cerebelo consiste de dos capas; una externa de materia gris y otra interna de 
materia blanca. La primera presenta proyecciones aferentes y eferentes desde la 
corteza cerebelosa hasta sus núcleos más profundos que tienen contacto con algunos 
núcleos del tallo cerebral y tálamo. Las células de la capa gris del cerebelo se ubican en 
tres capas: 1) la molecular, 2) la de neuronas de Purkinje y 3) la granular (Figura 3) 
(Carpenter et al., 1994). El cerebelo recibe fibras aferentes de la corteza cerebral, de la 
médula espinal, del núcleo olivar inferior, de núcleos vestibulares y del puente (Sotelo, 
2004), como regla general el cerebelo envía señales a las mismas regiones de las que 
recibe información y con base en sus conexiones se ha dividido en tres módulos: 1) el 
vestíbulocerebelo que recibe fibras primarias del aparato vestibular en el oído interno y 
fibras secundarias de núcleos vestibulares, 2) el espinocerebelo recibe fibras aferentes 
de la médula espinal a través de dos tractos, uno directo que contiene fibras 
provenientes de la médula espinal y uno indirecto, que también proviene de la médula 
espinal pero es sinápticamente interrumpido en la oliva inferior y 3) el cerebrocerebelo 
que recibe fibras provenientes la corteza cerebral, vía el núcleo pontino (Brodal, 2010). 
Los axones aferentes tienen terminaciones excitatorias en la corteza cerebelosa. 
Las fibras ingresan al cerebelo a través de los pedúnculos cerebelosos y se denominan 
fibras trepadoras y musgosas, las cuales tienen terminaciones en las neuronas 
granulares, las cuales envían sus axones hacia la capa molecular en donde forman 
fibras paralelas que se orientan a lo largo de las folias y establecen contacto con los 
axones de las neuronas de Purkinje, estrelladas, en cesto y axones de las neuronas de 
Golgi tipo I (Brodal, 2010). Las neuronas de Purkinje forman una capa unicelular, sus 
arborizaciones se extienden hasta la capa molecular en donde recibe señales 
excitatorias de las fibras paralelas e inhibitorias de las células de Golgi tipo I, en cesto y 
estrelladas (Sotelo, 2004), además las neuronas en cesto envían axones colaterales 
descendentes desde la capa molecular y que convergen con el segmento axonal inicial 
de las neuronas de Purkinje y en mayor proporción contacta células gliales de esta 
región.Este arreglo forma un denso plexo terminal denominado Pinceau, el cual se ha 
descrito como una estructura altamente compleja y única desde el punto de vista 
anatómico (Bobik et al., 2004). 
 
7 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Capas celulares del cerebelo. Se puede apreciar los distintos tipos celulares a través 
de las diferentes capas del cerebelo (Modificado de Carpenter et al., 1994). 
 
 
2.4 La glía en el cerebelo 
Las células gliales tienen su origen en las zonas ventriculares (Verkhratsky y Butt, 
2008). Para formar la capa del manto cerebeloso la migración celular inicia en la zona 
ventricular germinal, antes del día embrionario (E) 17, con un máximo en el día E15 en 
la rata y entre E60 y E80 en humanos. En la rata durante el día E17, la placa 
cerebelosa está compuesta de las capas germinal ventricular, la intermedia y la 
germinal externa (Jacobson, 1993). Durante el desarrollo temprano, las células 
progenitoras neuronales forman la glía radial, la cual está compuesta por células 
neuroepiteliales que tienen su soma en la zona ventricular y sus procesos se extienden 
hasta la pía madre (Rakic, 2003). La glía radial presenta algunas características en 
común con los astrocitos maduros, incluyendo la expresión de transportadores de 
glutamato y aspartato (GLAST), proteína de unión a lípidos cerebrales (BLBP) y la 
 
8 
 
proteína glial ácida fibrilar (GFAP) (Abbott, 1991). A diferencia de los astrocitos las 
células que conforman la glía radial funcionan como células progenitoras de neuronas y 
glía durante el desarrollo (Rakic, 2003). 
El cerebelo contiene glía radial especializada llamada glía de Bergmann que 
posee cuerpos bipolares ovoides y procesos elongados que se extienden hacia las 
paredes ventriculares y hacia la pía en el periodo embrionario y durante el desarrollo 
comparten el mismo linaje de las células de Purkinje. La glía de Bergmann es el primer 
tipo celular que se desarrolla a partir de las células progenitoras y durante la etapa 
embrionaria temprana forma andamios para la migración neuronal, además prevalece 
aun después del desarrollo, a diferencia de otras regiones cerebrales en las cuales la 
glía radial desaparece para formar diferentes tipos de astrocitos (Yamada y Watanabe, 
2002). 
Por otra parte se encuentran los astrocitos en vela que rodean a las neuronas 
granulares (Verkhratsky y Butt, 2008). También existen los tanicitos, que son un tipo de 
glia ependimal o ependimocitos que se localizan en la ZPVCb, en donde junto con 
diferentes células ependimales forman la barrera hematoencefálica y forman uniones 
entre el parénquima neural y el LCR. En términos funcionales, los tanicitos son parte de 
los órganos circunventriculares (CVO) también llamados órganos neurohemales y que 
representan una interfase entre el parénquima neural, el compartimento vascular y el 
LCR (Joly et al., 2007) 
Los oligodendrocitos son células producidas por las células progenitoras de 
oligodendrocitos (CPOs) y están encargadas de producir mielina, la cual envuelve a los 
axones en el SNC (Bradl y Lassmann, 2010). Fueron descritos por primera vez por Del 
Río Hortega en 1928 y los clasificó en cuatro fenotipos (I-IV). En el cerebelo se ha 
reportado únicamente la presencia del fenotipo I (Verkhratsky y Butt, 2008). Se ha 
descrito también un nuevo tipo celular que expresa el proteoglicano sulfato de 
condroitina y por sus contactos con diversos tipos de neuronas se han considerado un 
tipo de célula neuro-glial (NG) a la que se le ha denominado glía NG2 ó sinantocitos 
(del griego synantos= contacto). Estas células expresan marcadores de CPOs, generan 
oligodendrocitos y se ha propuesto su posible participación en la regulación y plasticidad 
sináptica (Trotter et al., 2010; Kettenman y Verkhratsky, 2008 y Verkhratsky y Butt, 
9 
 
2008). En la Figura 4 se muestra la distribución de los tipos de astrocitos en las capas 
cerebelosas. 
 
 
Figura 4. Morfología de astrocitos en el cerebelo. Se muestra la distribución de los diferentes 
tipos de astrocitos a través de las capas cerebelosas, obsérvese en la región periventricular la 
epéndima que comprende la glía de Bergmann, tanicitos y células ependimales (modificado de 
Kettenmann y Ransom, 1995). 
 
Las células gliales tienen concentraciones de cationes intracelulares similares a 
otros tipos celulares, por ejemplo el K+ se encuentra a una concentración de 100-140 
mM, el Na+ de 10 mM y el Ca2+ de menos de 0.0001 mM. En contraste, en astrocitos y 
oligodendrocitos el Cl- se encuentra en mayores concentraciones, alcanzando 
aproximadamente 30-40 mM, a diferencia de otras células en donde la concentración es 
alrededor de 2.5 mM (Verkhratsky y Butt, 2008). 
Son escasos los estudios acerca de la distribución de receptores inhibitorios en 
células gliales. En 1984 se reportó una respuesta a GABA en astrocitos en cultivo 
obtenidos de los hemisferios cerebrales de ratas en desarrollo postnatal, este estudio 
demostró por métodos electrofisiológicos que GABA induce una despolarización en 
dichascélulas (Kettenmann et al., 1984). Estos experimentos descartaron la hipótesis 
de que dicha despolarización se debía a la salida de K+ intracelular de las neuronas 
adyacentes como se había sugerido previamente (Hosli et al., 1981a y 1981b). En otros 
estudios se realizaron caracterizaciones farmacológicas y electrofisiológicas más 
detalladas que demostraron la presencia de receptores GABAA en oligodendrocitos 
Pia 
Capa Granular Externa
Capa Molecular
Capa Granular
Capa de Células de Purkinje
Sustancia Blanca
Zona ventricular
a) Tanicitos
b) Astrocito fibroso
c) Astrocitos protoplásmicos
d) Astrocito en vela
e) Glia de Bergmann
f y g) Microglia
h) Células ependimales
Zona Periventricular
10 
 
(Gilbert et al., 1984 y Olsen, 1982). Sin embargo, aún no se sabe con precisión cuales 
son las subunidades que conforman a estos receptores ni cuál es su papel funcional en 
estas células. 
 
2.5 Sistema ventricular y líquido cefaloraquídeo 
La capa ependimaria que reviste al sistema ventricular proviene del ectodermo, el tejido 
nervioso y vasos sanguíneos que entran y salen a través de esta capa se encuentran 
rodeados por las meninges aracnoides y la pía, además de estar en contacto con las 
terminaciones perivasculares de astrocitos. Se ha sugerido que estos espacios permiten 
el flujo de LCR hacia el cerebelo. 
El LCR es muy importante en el soporte y amortiguación del SNC contra los 
traumatismos craneoencefálicos, pero además es fundamental en el mantenimiento de 
la homeostasis del encéfalo debido a que constituye una vía de eliminación de productos 
de desecho del metabolismo cerebral y se mantiene en constante recambio, además 
permite el paso de ciertas sustancias que difunden hacia el encéfalo desde la sangre. 
No existe barrera de difusión entre el LCR y el encéfalo en el revestimiento ependimario 
de los ventrículos en donde se encuentra el plexo coroideo que es una estructura que se 
extiende desde la superficie ventricular hacia el LCR y está formada de una monocapa 
de epitelio cúbico con pliegues asentada sobre una lámina basal, que cubre una extensa 
red capilar incluida en un estroma de tejido conectivo (Figura 5A). Las microvellosidades 
apicales de las células epiteliales están en contacto con el LCR, el epitelio cúbico posee 
uniones estrechas que forman una barrera para el intercambio pasivo de proteínas y 
solutos hidrofóbicos. Los capilares del estroma de tejido conectivo poseen 
fenestraciones endoteliales que permiten el intercambio entre la sangre y el líquido 
intersticial en el espacio perivascular (Figura 5B) (Joly et al., 2007). 
Las células de los plexos coroideos regulan la producción y composición del LCR, 
empleando mecanismos de transporte activo y pasivo; la presión hidrostática en el 
interior de los capilares favorece el flujo de agua acompañada de proteínas hacia el 
espacio intersticial, de donde por transporte activo pasa hacia el espacio ventricular 
empleando ATPasas Na+-K+ que bombean Na+ hacia la superficie ventricular del plexo y 
11 
 
LCR
externo
Hueso del cráneo Duramadre
Aracnoides
Vesículas 
sanguíneas
Plexo coroideo
Producción de LCR
LCR
interno
(ventrículos)
Epéndima
Tejido neuronalÓrgano
circunventricular
Piamadre
A
Espacio 
perivascular
Neurona del órgano
circunventricular
Axones 
terminales
Capilar 
fenestrado
Glia
B
K+ en la dirección contraria, además el transporte de Cl- y HCO3- ocurre de forma 
pasiva(Brodal, 2010). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Citoarquitectura en el sistema ventricular. A) Principales interacciones entre el tejido 
cerebral y el LCR, se observa la epéndima, el plexo coroideo y un órgano circunventricular, 
nótese la distribución de las vesículas sanguíneas por debajo de una capa de epitelio cúbico en 
las diferentes estructuras. B) Organización celular alrededor de los capilares que rodean la 
epéndima, nótese la presencia de axones terminales rodeando los capilares y los procesos de 
los tancitos (t) desde la región ventricular hasta los capilares y por otra parte la formación de 
uniones estrechas (por sus siglas en ingles, tj) entre las células de la epéndima, las cuales 
forman una barrera impermeable (Modificado de Joly et al., 2007). 
 
 
El cuarto ventrículo recibe LCR de los ventrículos laterales y tercero a través del 
acueducto cerebral o de Silvio y se envía hacia los espacios subaracnoideos que 
circundan al encéfalo y médula espinal (Figura 6) (Carpenter et al., 1994). En los 
ventrículos laterales se ha descrito la presencia de poblaciones celulares que poseen 
marcadores específicos de células progenitoras neuronales como nestina y CD133 y 
que han sido desplazadas por las células ependimarias hacia la región subventricular 
en el adulto y extienden sus procesos apicales hacia la región ventricular (Mirzadeh et 
al., 2008). Se han reportado diferentes descripciones de las células que comprenden la 
zona periventricular y subventricular, una de ellas realizada por Mirzadeh et al., 
(2008)que describen a esta región como una capa celular con proyecciones en forma 
de cilios hacia el lumen ventricular, de las cuales caracterizaron tres tipos de células: a) 
las B1 que se encuentran en la zona subventricular, que extienden un proceso apical 
hacia la zona ventricular, que son nestina, GFAP y CD133 positivas, además son CD24 
12 
 
y vimentina negativas lo cual sugiere que las células progenitoras neuronales no son 
parte de la población celular que forman la región periventricular; b) las células E1 que 
extienden un proceso apical hacia la luz ventricular y c) las células E2 que extienden 
dos o más procesos. Las células E1 y E2 son CD24 y vimentina positivas y no expresan 
GFAP, nestina ni CD133, lo cual indica otra población celular diferente que forma parte 
de la zona periventricular, con origen mesenquimal y que carece de funciones de 
células progenitoras neuronales. 
Por otro lado Hermann et al., (2009) reportaron nuevos tipos celulares de NSC 
en la zona ventricular, las células B, que proliferan lentamente y son de transición 
rápida, las células C que se renuevan rápidamente y que dan origen a las células A, 
que son neuroblastos, además describen la presencia de NSC conservadas a través del 
sistema ventricular y reportan una pérdida de diversidad celular en dirección rostro-
caudal. En sus experimentos emplearon diferentes marcadores para evaluar el estado 
mitótico de las células y concluyen que a pesar de encontrar células con marcadores 
para NSC a través del sistema ventricular, únicamente se les encuentra en división en 
los ventrículos laterales. Esta serie de reportes sugieren que el sistema ventricular y la 
zona periventricular juegan papeles muy importantes en la etapa adulta. No obstante a 
los diferentes reportes acerca de la citoarquitectura y funcionalidad del sistema 
ventricular, los estudios que se han reportado del cuarto ventrículo han sido realizados 
en el piso del mismo que corresponde al puente, en el tallo cerebral (Alvarez-Morujo et 
al., 1992; Hermann et al. 2009), y poco se sabe del techo del cuarto ventrículo, formado 
por la zona periventricular del cerebelo. 
 
 
 
 
 
13 
 
 
 
Figura 6. Sistema ventricular. Se muestran cuatro diferentes cortes a través del sistema 
ventricular de roedor, en A-A los ventrículos laterales, en B-B el tercer ventrículo, en C-C el 
acueducto cerebral o de Silvio y en D-D el cuarto ventrículo, el cual se comunica con el tercer 
ventrículo a través del acueducto cerebral, y con el canal central en la médula espinal 
(modificado de Hermann et al., 2009). 
 
 
Estudios recientes en nuestro laboratorio mostraron por métodos de 
inmunofluorescencia la expresión de la subunidad GABA ρ2 en la ZPVCb y además se 
encontró que esta población celular también expresa la proteína GFAP (Rosas-Arellano 
et al., en proceso), los resultados se muestran en la Figura 7, en donde se presenta un 
corte sagital del cerebelo,indicando en verde las células inmunoreactivas para GFAP, 
en rojo para ρ2 y finalmente el empalme en donde se puede observar la colocalización 
de ambas proteínas. La presencia del receptor GABAρ en esta zona no ha sido 
reportada, por lo que el presente proyecto se enfocó en determinar su distribución en la 
ZPVCb. 
 
 
 
 
 
 
 
Ventrículos 
laterales
Tercer
Ventrículo 
Acueducto
De Silvio 
Cuarto
Ventrículo 
Cerebelo
Puente
14 
 
 
Figura 7. Expresión de la subunidad ρ2 en la ZPVCb. Se observa un corte sagital de cerebelo de 
ratón, en verde se presenta la proteína GFAP, en rojo la subunidad ρ2 y finalmente la 
colocalización de ambas proteínas, principalmente en la epéndima del cerebelo. CPK: células de 
Purkinje, IV: cuarto ventrículo. (Rosas-Arellano et al., en proceso). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
20µm IV
Epéndima
50µm50µm
GFAP ρ2
15 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3. JUSTIFICACIÓN 
Estudios previos muestran que una población celular no neuronal en el cuarto ventrículo 
expresa los receptores GABAρ, particularmente en la zona periventricular del cerebelo. 
Hasta el momento no se sabe cuál es el papel que desempeña este receptor en esta 
región ni cuáles son los tipos celulares que lo expresan. La presencia de estos 
receptores en dicha zona podría indicar que las células allí presentes requieren de la 
participación de receptores a neurotransmisores de actividad inhibitoria rápida para 
controlar su función. Tal vez este receptor pudiera estar participando como factor trófico 
o regulando la activación de ciertos grupos celulares, por lo que el determinar en qué 
tipo celular se expresa GABAρ nos permitiría sugerir su papel en esta área y plantear 
en el futuro un abordaje experimental que nos permita conocer sus propiedades 
funcionales. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
16 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4. HIPÓTESIS 
 
La zona periventricular del cerebelo posee células que expresan el receptor GABAρ que 
colocaliza con marcadores característicos de células gliales. 
 
 
5. OBJETIVOS 
 
1) Determinar que subunidades del receptor GABAρ se expresan en la región 
periventricular del cerebelo, utilizando RT-PCR. 
 
2) Definir la distribución del RNAm del receptor GABAρ por hibridación in situ. 
 
3) Evaluar la co-expresión de las subunidades del receptor GABAρ en células que 
expresan receptores de Dopamina D1 y D2 y con células inmunoreactivas para GFAP, 
mediante inmunofluorescencia. 
 
 
 
 
 
 
 
17 
 
6. MATERIALES Y MÉTODOS 
 
6.1 Sujetos experimentales 
Ratones machos adultos de la cepa CD1 para RT-PCR, hibridación in situ y doble 
inmunofluorescencia, y ratones transgénicos que expresan la proteína GFP bajo el 
promotor del gen del receptor de Dopamina D1 o el D2 (Doig et al., 2010 y Gong et al., 
2003) para inmunofluorescencias con un anticuerpo. Los ratones transgénicos fueron 
donados por la Dra. Verónica Álvarez del Instituto Nacional de Salud (NIH), en 
Bethesda, Maryland. 
 
El manejo de los animales se realizó de acuerdo al protocolo establecido en el 
Bioterio del Instituto de Neurobiología de la UNAM, que está basado en normas 
internacionales y aprobado por el comité de Bioética. La clave de aprobación para el 
manejo de animales es: INEU/SA/CB/063. 
 
6.2 RT-PCR 
6.2.1 Obtención de Material Biológico 
Los ratones fueron anestesiados con pentobarbital (40mg/Kg) y sacrificados por 
decapitación. Posteriormente se obtuvieron los cerebros y utilizando un microscopio 
estereoscópico se disecó el tejido de la ZPVCb, se colocó en un tubo cónico con 
nitrógeno líquido y se mantuvo a -80 oC hasta su procesamiento (ubicación de la ZPVCb 
en Anexo 1). 
 
6.2.2 Extracción de RNA total 
Se utilizó la técnica de extracción fenol/cloroformo (Chomczynski y Sacchi, 1987), que se 
describe brevemente a continuación: 
Se preparó una solución denominada “solución D”, la cual contiene lo siguiente: 
 - 250 g de tiocianato de guanidina 
 - 17.6 mL de citrato de sodio 0.75M pH 7.0 
 - 26.4 g de lauril sarcosinato de sodio al 10% 
 - 293.0 mL deH2O tratada con dietil pirocarbonato (H2O-DEPC) 
 
18 
 
El H2O-DEPC se preparó con dietil pirocarbonato al 0.001% en H2O desionizada, 
se mantuvo en oscuridad A 37 oC por 16h para inactivar las RNAsas y se llevó al 
autoclave por 15 min a 121 oC para inactivar el DEPC. 
El tejido se homogenizó utilizando una pastilla de plástico y un volumen de 
solución D. Al homogenizado se le adicionó 500 μl de fenol y 500 μl de una mezcla de 
cloroformo: alcohol isoamílico (49:1), se mezcló un par de veces por inversión y se 
mantuvo en hielo 15 minutos. 
Posteriormente el homogenizado se centrifugó a 10,000 xg, por 20 min a 4oC en 
una microcetrífuga refrigerada Heraeus® (Biofuge fresco) se colectó la fase acuosa y se 
le adicionó un volumen de isopropanol frío, se mantuvo durante una hora -20oC. Se 
realizó una segunda centrifugación a 10,000 xg por 30 min 4oC, se desechó el 
sobrenadante y a la pastilla se le adicionó 150 μL de solución D con β-mercaptoetanol y 
150 μl de isopropanol, la mezcla se mantuvo en reposo a -20oC por una hora. Se 
centrifugó a máxima velocidad por 10 min a 4oC, se decantó el sobrenadante y la pastilla 
se resuspendió en 500 µl de etanol al 75%, se centrifugó nuevamente, se decantó el 
sobrenadante, se dejó secar la pastilla a temperatura ambiente y finalmente se 
resuspendió en 50 µL de H2O-DEPC y se mantuvo a -80oC. 
 
6.2.3 RT-PCR 
Para la retrotranscripción (RT) se emplearon 5 µL de RNA total (0.5µg), 1 µL de 
poliA*oligo(dT)12-18, 1 µL de una mezcla de nucleótidos trifosfato (dNTPs: dATP, dCTP, 
dGTP ydTTP, 10 mM cada uno), y 6 µL de H2O-DEPC, lo cual se mezcló en un tubo 
eppendorf y se incubó a 65oC por 5 minutos en el termociclador Techne® (FTGENE2D), 
se transfirió el tubo eppendorf a un baño de hielo 5 min y se adicionó 1 µL de la enzima 
Transcriptasa Reversa (Super Script II, Reverse Transcriptase, Invitrogen), 4 µL de 
buffer 5X (Tris-HCl, 250 mM, pH 8.3; KCl ,375 mM y MgCl2, 15 mM) y 2 µL de DTT, 0.1 
M. Posteriormente, el tubo se llevó al termociclador programado con las siguientes 
condiciones: 42oC por 50 min, 70oC por 15 min, 10oC por 5 min y un ciclo de 
terminación de 4oC. 
Para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se emplearon los 
oligonucleótidos que se muestran en la Tabla 1 los cuales amplifican las regiones que 
codifican para las subunidades ρ1-3 y tubulina, este último como control positivo. 
19 
 
Tabla 1 Secuencias de oligonucleótidos. Se muestran los oligonucleótidos específicos para 
amplificar las regiones que codifican para las subunidades ρ1-3 y tubulina. 
 
Oligonucleótido SECUENCIAS DE LOS Tm (ºC) No. de identidad 
 INICIADORES del gen. 
ρ1S 5'-CGAGGAGCACACGACGATGC C-3' 76.69ºC 
ρ1A 5'-CTGCACATCCACGCCCACAG G-3' 76.69ºC NM_008075 
_____________________________________________________________________ 
ρ2S 5'-CCTGATGGCTCTCGTGGAGA G-3' 74.78ºC 
ρ2A 5'-CCAAAGGCTGGCCTCATGGT G-3' 74.78ºC NM_008076 
_____________________________________________________________________ 
ρ3S 5'-CCTCACCACAGTGGAGGAGTG-3' 73.96ºC 
ρ3A 5'-CTGCACAGGGGCTTCCTGTG-3' 74.40ºC NM_001081190 
 
TubulinaS 5'-GCCTCCCACTGTGGTACCCG-3' 76.45ºC 
TubulinaA 5'-CCCTCCTCCATGCCCTCACC-3' 76.45ºC NM_011653 
 
S: Sentido; A: Antisentido. 
 
Para la PCR se mezcló en un tubo el DNAc (1 µL) con 2.5 µL de buffer 10X (Tris-
HCl 200 mM pH 8.0 y KCl 500 mM), 0.75 µL de MgCl2 50mM, 0.5 µL de dNTPs 2.5 mM, 
2µL del oligonucleótido sentido (10 µM) y 2 µL del antisentido (10 µM), se agregó 1 µL 
de enzima Taq polimerasa (5 U/µL) y H2O ultrapura (c.b.p. 25 µL). La mezcla se llevó al 
termociclador programado con las siguientes condiciones:El producto de RT-PCR se reveló por electroforesis, para ello se preparó agarosa 
(2%) en una solución de tris acetato y EDTA, denominada TAE 1X (TAE 50X: 242g de 
tris, 57.1 mL de ácido acético glacial, 100mL EDTA 0.5 M, pH 8.0 y H2O desionizada 
cbp 1000mL, ajustada a pH 8.5) y se colocó en un molde de acrílico horizontal, se 
colocaron 3 µL del marcador de peso molecular de 1000 pb (Invitrogen®) y 3 µL de 
94ºC 1 min 1
94ºC 30 seg 30
65ºC 30 seg 30
72ºC 30 seg 30
72ºC 5 min 1
4ºC 5 min
20 
 
buffer de carga con 5 µL del producto de PCR, distribuidos en los diferentes carriles del 
gel.Por último el gel se observó bajo luz UV en el transiluminador Bio-Imaging System® 
(modelo MiniBisPro) para identificar las bandas. 
 
6.3 HibridaciónIn-situ 
6.3.1 Síntesis de sondas marcadas con digoxigenina 
La digoxigenina (DIG) es una molécula de estructura esteroidea extraída de 
flores y hojas de laplanta Digitalis purpureay es utilizada para marcar sondas de 
DNA y RNA para su posterior detección inmunológica, empleando como vehículo un 
nucleótido trifosfato (dUTP ó UTP). 
 Los fragmentos del cDNA de la subunidad ρ1 del recepor GABAρ se encontraban 
clonadas en el vector pGEM-T Easy® (Promega), el cual fue linearizado empleando la 
enzima de restricción SalI, y posteriormente se realizó la transcripción in vitro 
empleando la enzima RNA polimerasa de T7. 
 Se removió el plásmido con DNAsa (2µg/µL) por 15 min a 37 oC, se verificó la 
digestión por medio de electroforesis en gel de agarosa al 0.7%. Las sondas se 
purificaron empleando columnas cromatográficas de afinidad (Roche® 11814427001) y 
nuevamente se verificó el producto por medio de electroforesis (Anexo 3). 
 
6.3.2 Cuantificación y titulación de las sondas 
La cuantificación y titulación de las sondas es de gran importancia, puesto que el 
obtener grandes cantidades de transcrito no asegura que los nucleótidos acoplados con 
digoxigenina se hayan insertado en la sonda. 
La cuantificación de las sondas se realizó en el espectrofotómetro Nano-drop 
1000® (Thermo Scientific) y para su titulación se procedió de la siguiente forma: 
 
Soluciones para la titulación de las sondas 
 
Solución de ácido maléico pH 7.5 
Pesar 1.16 g de ácido maléico y 0.8766g NaCl en 100 mL de agua desionizada para 
obtener concentraciones de 0.1M y 0.15M respectivamente. Ajustar el pH a 7.5. 
21 
 
Solución de lavado 
Agregar 300 µL de Tween 20 a 100 mL de solución de ácido maléico. 
 
Solución de bloqueo 
Agregar 10 µL de suero de cabra a 100 µL de solución de ácido maléico. 
 
Solución con anticuerpo [1: 3000] 
Agregar 1µL de anticuerpo Anti digoxigenina AP (Roche®) en 3 mL de solución de 
bloqueo. 
 
Titulación de las sondas 
Se realizaron diluciones de las sondas en una solución que contiene: solución salina de 
citratos (SSC) 20X pH 7.2, Formaldehido 37 % y agua en proporciones 3:2:5, 
respectivamente. En la Figura 8 se esquematizan dichas diluciones. 
 
 
Figura 8. Esquema de diluciones empleadas para la titulación de las sondas. Se esquematizan 
las diluciones de las sondas que se prepararon con el fin de determinar la concentración 
necesaria para obtener señal. 
 
Se colocaron gotas de 1 µL de las diluciones en una membrana de nylon cargada 
positivamente (Hybond-NT, Amersham Pharmacia Biotech®) para la sonda sentido y 
otra para la antisentido, se colocaron en cajas Petri estériles y se humedecieron con 
solución de lavado para colocarlas bajo luz UV por 10 min para realizar el 
entrecruzamiento de la sonda con el nylon. 
 Se incubó en solución de bloqueo por 30 min a temperatura ambiente y 
posteriormente con la solución que contiene el anticuerpo que reconoce digoxigenina 
[1 ng/µL] [100 pg/µL] [10 pg/µL] [1 pg/µL] [0.1 pg/µL] [0.01 pg/µL]
5µL 5µL 5µL 5µL 5µL
45µL 45µL 45µL 45µL 45µL
22 
 
por 3 h a temperatura ambiente. Se realizaron 2 lavados de 2 min cada uno y se incubó 
con buffer de detección por 2 min. Finalmente se incubó con una mezcla comercial de 
cloruro de nitroazul de tetrazolio y 5-bromo-4-cloro-3‟-indolfosfato(NBT/BCIP, BM Purple 
Roche®) como sustrato cromogénico, hasta observar marca suficiente de la sonda y en 
ese momento se detuvo la reacción con una solución amortiguadota de tris-EDTA 
(buffer TE: tris 100mM, EDTA 50mM, pH 8.0). La concentración óptima a emplear se 
determinó evaluando la última dilución que produjo señal detectable (Anexo 4). 
 
6.3.3 Obtención de material biológico 
Los ratones fueron anestesiados con Pentobarbital (30mg/Kg), posteriormente se 
realizó perfusión intracardiaca, primero con una solución salina fisiológica (SSF: NaCl 
0.9%) durante 30 seg y posteriormente con 150 mL de una solución que se preparó 
disolviendo paraformaldehído al 4 % en solución de fosfatos PBS (PBS 10X: Na2HPO4 
77mM, NaH2PO4*H2O 23mM y NaCl 0.3M, pH 7.4) y ajustado a un a un pH de 7.0; lo 
cual se realizó por 30 min o hasta que el ratón presentara rigidez corporal. Todo el 
material empleado, es estéril y libre de RNAsas y todas las soluciones se prepararon 
con H2O-DEPC para prevenir contaminación con RNAsas (ver preparación en el punto 
6.2.2). Se extrajeron los cerebros y se sometieron a concentraciones crecientes de 
sacarosa (10, 20 y 30% en PBS 1X) para crioproteger el tejido, realizando el cambio de 
solución hasta que el cerebro se depositara en el fondo del vial y manteniendo a 4 oC. 
Se embebieron en medio para congelación (Tissue-Tek O.C.T. marca Sakura®) y se 
llevaron a -80 oC. Se realizaron cortes coronales de 40μm en el criostato Leica® 
(CM3050S) a -25 oC y se colocaron en porta objetos, manteniéndolos siempre dentro 
del criostato y se almacenaron a -80 oC hasta su procesamiento. En el Anexo 2 se 
muestran las coordenadas de los cortes obtenidos. Se empleó retina de ratón como 
control positivo para la subunidad ρ1. 
 
6.3.4 Pretratamiento 
Previo a la hibridación los tejidos se lavaron con solución de PFA 4% pH 7.0 con DEPC 
0.1 % activo (no inactivado por autoclaveado) por 10 min y dos veces (10 min cada uno) 
con solución de PBT (PBS1X, Tween 20, 0.1%). 
23 
 
 
6.3.5 Prehibridación e hibridación 
Los tejidos se incubaron a 60oC por 60 min con la solución de prehibridación, la cual se 
describe en la Tabla 2. 
 
Tabla 2. Preparación de la solución de prehibridación. Se presentan los reactivos necesarios, la 
concentración de cada uno de ellos, la concentración final requerida y el volumen necesario 
para preparar 50 mL. 
 
Reactivos Concentración de reactivos Concentración final Vol. para 50 mL 
Formamida 100 % 50 % 25 mL 
SSC pH 4.5 20 % 5X 12.5 mL 
Heparina 50mg/mL 5 µg/mL 50 µL 
Tween 20 10 % 0.1 % 500 µl 
RNA de levadura 20 mg/mL 50 µg/mL 125 µL 
DNA de esperma de salmón 10 mg/mL 50 µg/mL 250 µL 
H2O-DEPC c.b.p. 100 % --- 11.58 mL 
 
Para la hibridación las muestras se incubaron con la solución descrita para la 
prehibridación pero con 1 ng/µL de la sonda y posteriormente se incubaron durante 48 h 
a 60oC en cámara húmeda (preparada con formamida 50% y SSC 5x en H2O-DEPC) y 
en agitación ligera. 
 
6.3.6 Detección inmunológica de la sonda hibridada 
Los tejidos se lavaron dos veces de 20 min con solución amortiguadora de ácido 
maléico, denominadaMABT (ácido maléico 0.1 M, pH 7.5, NaCl 150 mM y Tween 20, 
0.1%), se reemplazó la solución por otra de MABT con suero de cabra al 15% y el 
anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (1:3000) y se incubó por 12 horas a 4oC. 
Después de la incubación, se realizaron 5 lavados de 15 min cada uno con MABT y 
después con el buffer de detección denominado NTMT (NaCl 0.1 M, Tris 0.2 M, MgCl2 
0.05 M y Tween 20 0.1 %, pH 9.5) por 5 min y finalmente con el sustrato NBT/BCIP 
(BM-Purple, Roche®) por 2h o hasta que se apreció señal al observar al microscopio de 
campo claro. La reacción se detuvo con el buffer de paro descrito en la técnica de 
titulación de lasonda (apartado 6.3.2); las preparaciones se cubrieron con resina a 
24 
 
base de agua (Fluoromount G, Southern Biotech®) y un cubreobjetos para analizar al 
microscopio de campo claro. 
 
6.4 Doble inmunofluorescencia 
6.4.1 Obtención de material biológico 
Los ratones fueron perfundidos como se describe en el punto 6.3.4, pero empleando 
agua destilada y desionizada. 
Una vez perfundidos, los ratones fueron decapitados, se extrajo el cerebelo y se 
colocó en solución de formaldehido al 4% (preparación en el punto 6.3.4) a 4oC por 5 h 
aproximadamente, posteriormente el tejido se expuso a concentraciones crecientes de 
sacarosa (10, 20 y 30% en PBS 1X) con el fin de crioproteger, realizando el cambio de 
concentración hasta que el cerebro se depositara en el fondo del vial. Para exponer la 
ZPVCb se seccionó como se muestra en la Figura 9 y posteriormente se realizaron 
cortes de 200 µm en vibratomo (OTS-5000) para obtener cortes en el plano horizontal. 
Solo se colectaron los cortes de la zona periventricular del cerebelo. Estos tejidos se 
mantuvieron en PBS 1X. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
25 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9. Cortes realizados en el cerebro de ratón para exponer la ZPVCb. En los paneles a-l se 
muestran los diferentes cortes realizados para obtener rebanadas de la ZPVCb, de cada 
cerebro se obtuvieron dos rebanadas. 
 
La citoarquitectura del tejido se verificó mediante una tinción con azul de toluidina 
(azul de toluidina, 1%; borato de sodio, 2%). Para esto los cortes se colocaron en un 
portaobjetos y se lavaron con PBS 1X, se cubrieron con la solución de azul de toluidina 
y se lavaron inmediatamente con agua desionizada, posteriormente se deshidrató la 
preparación con etanol 96% por 2 min, y etanol absoluto por 3 min. Finalmente se lavó 
con xilol y se montó con resina (Entellan, Merck®) y un cubreobjetos. Las 
preparaciones se observaron en un microscopio de campo claro (Anexo 6). 
 
6.4.2 Desarrollo de la inmunofluorescencia 
Se realizó doble inmunofluorescencia por la técnica descrita por Rosas-Arellano et al., 
(2007) pero en este caso se realizó por flotación de tejido utilizando viales de vidrio. La 
lista de anticuerpos se muestra en la Tabla 3. 
Para la detección inmunológica con los anticuerpos primarios, los cortes se 
lavaron dos veces con solución de PBS-Tween 20 (PBS 1X, Tween 20, 0.5%) y se 
a b c d
e f g h
i j k l
26 
 
incubaron con solución de bloqueo (suero de burro 2.0%, albúmina bovina, 0.1%, 
Tween 20, 0.05% y Tritón X-100, 0.1% en PBS 1X) por 30 min. Posteriormente los 
cortes se incubaron con el anticuerpo primario 1:200 disuelto en PBS con Tween, 0.1%. 
Los controles se incubaron con la solución sin anticuerpo. 
Una vez incubado con el anticuerpo primario, los tejidos incluyendo el control, se 
lavaron tres veces y se expusieron al anticuerpo secundario correspondiente (Ver Tabla 
3) a una dilución de 1:200 en PBS con Tween 20, 0.1% por 24 h en oscuridad y ligera 
agitación a 4oC. Para la doble inmunofluorescencia se repitió la metodología pero se 
empleó un anticuerpo secundario diferente. Para realizar contratinción nuclear los 
tejidos se lavaron dos veces con solución de PBS1X, Tween 20 0.1 % y se incubaron 
con una solución de 4,6-diamino-2-fenilidona (DAPI) 1:100 en PBS 1X por 20 minutos. 
Se deshidrató el tejido con etanol 96% y posteriormente con etanol absoluto, se 
montaron en un portaobjetos y se observó en el microscopio confocal ZEISS® (LSM 
510 META). 
 
Tabla 3. Descripción de los anticuerpos empleados para la inmunofluorescencia. Se presentan 
los anticuerpos primarios y secundarios empleados, así como la especie en la que fueron 
generados y los datos comerciales. 
Anticuerpo Descripción Casa Comercial No de Catálogo 
GABAARρ1 (N-19) IgG, generado en cabra Santa Cruz sc-21336 
GFAP (N-18) IgG, generado en cabra Santa Cruz sc-6171 
Alexa Fluor 488 IgG generado en burro, anti cabra Invitrogen A11055 
Alexa Fluor 594 IgG generado en burro, anti cabra Invitrogen A11058 
 
6.4.3 Desarrollo de la inmunofluorescencia en ratones transgénicos. 
Se emplearon ratones tanto GFP-D1 como GFP-D2, se procedió como se describe en 
el punto 6.4.1, se obtuvieron cortes coronales de 40µm aproximadamente a -2.44mm de 
la línea interaural y se colectaron en portaobjetos, la técnica de inmunofluorescencia se 
desarrolló como se describe en el punto 6.4.2, empleando el anticuerpo primario 
GABAARρ1 (N-19) y el secundario Alexa Fluor 594, ambos indicados en la Tabla 3 y 
finalmente los núcleosse contratiñeron con DAPIy se montaron las muestras con Vecta 
shield® para observar finalmente en el microscopio confocal ZEISS (LSM 510 META). 
27 
 
7. RESULTADOS 
 
7.1 Detección del RNAm de las subunidades del receptor GABAρ en la ZPVCb 
Para el desarrollo de la RT-PCR se emplearon series de diez ratones para cada 
extracción de RNA total de la ZPVCb y de retina, se realizaron cinco extracciones y 
cinco PCRs para cada subunidad. Los resultados se muestran en la Figura 10. En 10A 
se presenta el gel de agarosa en el que se observa el RNA de la ZPVCb y de la retina 
de ratón como control positivo. En 10B se presenta la amplificación del RNAm de las 
subunidades ρ1 y ρ2 para la región de interés, en el caso de ρ2 se observa una banda 
muy tenue, mientras que la subunidad ρ3 no se observa. Se presenta como control 
positivo retina, la cual expresa las tres subunidades ρ. Se empleó tubulina (TUB) como 
control positivo interno. Estos resultados sugieren que la subunidad GABAρ1 se 
expresa con mayor abundancia en la ZPVCb, por los que los siguientes experimentos 
se enfocaron en esta subunidad. 
 
 
 
Figura 10. RT-PCR de las subunidades ρ1-3. En A se muestra el RNA de retina y de la ZPVCb, 
en B los resultados de la PCR para las tres subunidades GABAρ y tubulina, esta última como 
control interno positivo. Se observa la presencia del RNAm de las subunidades ρ1 y ρ2 del 
receptor GABAρ. El RNA se obtuvo de 5 extracciones independientes utilizando 10 ratones en 
cada una. Se realizaron 5 reacciones de PCR y se encontraron resultados consistentes en cada 
una. 
 
A)
ρ1 ρ2 ρ3 TUBρ1
(-)
ρ2
(-)
ρ3
(-)
TUB
(-)
M
200 PB
200 PB
Retina
ZPVCb
B)
R
et
in
a
ZP
V
C
b
25s
18s
5s
RNA total
28 
 
 7.2 Distribución del RNAm de la subunidad ρ1 en la ZPVCb 
Para la hibridación in situ se emplearon cortes de cerebros de tres ratones para cada 
experimento y se repitió tres veces empleando dos tipos de controles negativos, unos 
sin sonda y otros empleando la sonda sentido (Anexo 5). 
En la Figura 11 se muestran los resultados para la sonda antisentido, en el panel 
11Ase presenta un corte coronal en el que se indica con una flecha azul laZPVCb, que 
involucra todo el techo del cuarto ventrículo (IV), en 11B se muestra un esquema que 
permite ubicar la zona del cerebro empleada. En 11A se indica en cuadrados punteados 
las zonas cuya ampliación se muestra en los paneles 11C y 11D. En 11Cse revela 
claramente el RNAm de ρ1en la ZPVCb (flecha roja) y es evidente la presencia de señal 
en las neuronas de Purkinje (CP, flecha negra) como control positivo. Es interesante 
hacer notar que los plexos coroideos muestran señal intensa (flecha blanca). Asimismo 
en 11D, panel que corresponde a la región más lateral cercana a los núcleos medial y 
vestíbulocerebelosos, también se observa señal intensa. 
Para determinar la especificidad de las sondas se utilizaron cortes de retina 
como controles (debido a que en ésta se expresa constitutivamente la subunidad ρ1); 
con la sonda antisentido como control positivo y como controles negativos una serie sin 
sonda y otra con sonda sentido. Además de ello como controles negativos adicionales 
se emplearon series de cortes coronales (obtenidos de las mismas coordenadas a 
evaluar) y se procesaron a la par empleando en una serie la sonda sentido en otra serie 
omitiendo lasonda. Los resultados se muestran en el Anexo 5. 
 
 
29 
 
 
 
Figura 11. Detección del RNAm de la subunidad ρ1. Se presentan los resultados de hibridación 
in situ, en B se muestran las coordenadas empleadas para realizar los cortes, en donde se 
aprecia el lóbulo X del cerebelo (X) y el puente que forman el cuarto ventrículo, en A se observa 
un corte coronal y los recuadros punteados en rojo se amplían en los paneles C y D. En C se 
presenta la región más medial, se indicacon una flecha roja la señal del RNAm de la subunidad 
ρ1 en la ZPVCb y con una flecha negra la capa de neuronas de Purkinje, como control positivo; 
un hallazgo interesante es la presencia de señal en los plexos coroideos (flecha blanca). En D 
se presenta la zona más lateral, la cual se encuentra cercana a los núcleos mediales y vestíbulo 
cerebeloso y en la cual también se aprecia señal hacia la ZPVCb (flecha roja). IV: cuarto 
ventrículo, ZPVCb: zona periventricular del cerebelo, CG: capa granular, CP: capa de neuronas 
de Purkinje, CM: capa molecular. n=3. 
 
 
 
 
 
 
 
A B
250 µm
Cerebelo
Puente
IV 
ZPVCb
Plexos 
coroideos
50 µm
CP
CG
CM
50 µm
C D
ZPVCb
ZPVCb
X
Puente 
30 
 
7.3 Detección del receptor GABAρ en células dopaminérgicas D1-GFP y D2-GFP 
Para esta sección experimental se realizaron tres series de cortes y para cada serie se 
emplearon los cerebros de dos ratones de cada línea (D1-GFP y D2-GFP) la 
inmunofluorescencia se realizó para cada serie. 
Inicialmente se evaluó que la citoarquitectura del cerebelo y de la ZPVCb se 
preservara durante los tratamientos de perfusión, fijación etc. Estos resultados se 
muestran en el Anexo 6. Las coordenadas de los cortes coronales se muestran en el 
Anexo 2, en donde se indica la zona de interés, específicamente en el lóbulo X de la 
ZPVCb. 
En la Figura 12 se presentan los resultados para detectar por 
inmunofluorescencia la subunidad ρ1 en ratones D1-GFP. Con el canal verde se 
presentan las células que expresan el receptor D1 de dopamina, el cual se sabe que se 
encuentra en la glía de Bergmann, en rojo la subunidad GABAρ1, en azul los núcleos 
contrateñidos con DAPI y finalmente el empalme de los tres canales. Se pueden 
apreciar las diferentes capas del cerebelo, la granular (CG), la de neuronas de Purkinje 
(CP), la molecular (CM) y la zona periventricular del cerebelo (ZPVCb) que está en 
contacto con el cuarto ventrículo (IV) en donde se puede observar el plexo coroideo 
(PC).Se pueden apreciar células dopaminérgicas D1 en la ZPVCb,(flechas) y asimismo 
la expresión de la subunidad ρ1 (cabezas de flechas blancas), es importante hacer 
notar que la distribución de esta subunidad no es uniforme a través de la ZPVCb y que 
además se aprecia una polarización en su distribución, observándose más señal hacia 
la luz ventricular. Dos hallazgos muy interesantes en los plexos coroideos son la 
presencia del receptor GABAρ (cabezas de flecha amarillas) y el segundo, la expresión 
del receptor D1. 
 
 
 
 
 
 
 
31 
 
 
 
Figura 12. Detección del receptor GABAρ1 en ratones transgénicos D1-GFP. En verde células 
que expresan el receptor D1 de dopamina, en rojo la subunidad GABAρ1, en azul los núcleos 
contrateñidos con DAPI y el empalme de los tres canales. Se puede apreciar claramente la 
expresión de la subunidad ρ1 indicada con cabezas de flechas blancas hacia la luz ventricular, 
el receptor D1 de Dopamina también está presente en ésta zona (flechas) y se puede apreciar 
la presencia de GABAρ1 en los plexos coroideos, indicado con cabezas de flecha amarillas. 
CG: capa granular; CP: capa de células de Purkinje; CM: capa molecular, ZPVCb: zona 
periventricular del cerebelo; IV: cuarto ventrículo; PC: plexo coroideo. n=3). 
 
 
 
 
 
32 
 
En la Figura 13 se presentan los resultados obtenidos para detectar por 
inmunofluorescencia la subunidad GABAρ1 en ratones D2-GFP. Con el canal verde se 
presentan las células que expresan el receptor D2 de dopamina, el cual también es 
expresado en células de Purkinje, en rojo la subunidad GABAρ1, en azul los núcleos 
contrateñidos con DAPI y finalmente el empalme de los tres canales. Se pueden 
apreciar las diferentes capas del cerebelo al igual que en la Figura 12 y la presencia de 
células GFP positivas que expresan el receptor D2 en la ZPVCb lo cual se señala con 
flechas. A diferencia del receptor D1 se distingue su presencia en la estructura de la 
lámina basal de las células ependimales, y asimismo la expresión de la subunidad ρ1 
(cabezas de flechas), al igual que en la Figura 12 se puede notar la distribución de esta 
subunidad hacia la luz ventricular. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
33 
 
 
 
 
 
Figura 13. Detección del receptor GABAρ1 en ratones transgénicos D2-GFP. En verde las 
células que expresan el receptor D2 de dopamina, en rojo la subunidad GABAρ1, en azul los 
núcleos contrateñidos con DAPI y el empalme de los tres canales. Se puede apreciar la 
expresión de GABAρ1 indicado con cabezas de flechas hacia la luz ventricular, el receptor D2 
también está presente en ésta zona (flechas). CG: capa granular; CP: capa de células de 
Purkinje; CM: capa molecular, ZPVCb: zona periventricular del cerebelo; IV: cuarto ventrículo. 
n=3. 
 
 
 
20µm20µm
20µm20µm
ρ1D2-GFP
DAPI
EMPALME
EMPALME
CP
CM
CG
ZPVCb
IV
34 
 
7.4 Detección del receptor GABAρ en células GFAP de la ZPVCb 
Para la doble inmunofluorescencia se utilizaron cortes con disposición de libro abierto, 
se realizaron 5 series, para cada una se emplearon de 5-7 ratones, la n fué mayor que 
para los cortes sagitales debido a la poca cantidad de tejido que se obtiene con este 
tipo de cortes. La inmunofluorescencia se realizó por cada serie. 
En la Figura 14 se muestran los resultados para detectar al receptorGABAρ1 y 
GFAP, que es un marcador de glía y que también es expresado por las células 
ependimales. Se muestra en el canal rojo el receptor GABAρ1, en verde GFAP, en azul 
los núcleos contrateñidos con DAPI y finalmente el empalme de señales. Se puede 
apreciar la distribución del receptor GABAρ1 en diferentes estructuras (algunas de ellas 
se señalan con cabezas de flecha), principalmente en estructuras parecidas a cilios. En 
el canal verde se puede apreciar que todas las estructuras son inmunoreactivas para 
GFAP y en el empalme se aprecia que en algunas zonas hay colocalización del 
receptor con estructuras GFAP positivas (flechas). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
35 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 14. Detección del receptor GABAρ1 en células GFAP de la ZPVCb. Se muestra en el 
canal rojo GABAρ1, en verde GFAP, en azul los núcleos y finalmente el empalme de señales. 
Se presenta un corte en disposición de libro abierto en donde se aprecia la presencia de 
abundantes cilios GFAP positivos, con cabezas de flecha se indican algunas de las estructuras 
que expresan el receptorGABAρ1 y con flechas se señalan regiones en las que se observa 
colocalización del receptor con GFAP. n=5. 
 
 
 
ρ1 GFAP
DAPI EMPALME
36 
 
8. DISCUSIÓN 
Los resultados presentados en esta tesis se discutirán a través de los siguientes 
puntos: a) la presencia del RNAm de las subunidades GABAρ1 y ρ2 en la zona 
periventricular del cerebelo y la distribución heterogénea del RNAm de la subunidad 
GABAρ1; b) las características funcionales de la ZPVCb y la posible participación del 
receptor GABAρ, c) la implicación funcional de la presencia de neurotransmisores en el 
sistema ventricular y d) la expresión heterogénea de la subunidad GABAρ1 en células 
GFAP positivas. 
Los resultados obtenidos en el presente trabajo amplían el conocimiento de la 
distribución de los receptores a GABA, uno de los neurotransmisores inhibitorios más 
importantes en el SNC. Se reporta la presencia del receptor GABAρ en la ZPVCb, una 
región de granimportancia durante el desarrollo por su participación en la 
neurogénesis. 
 
8.1 Distribución del RNAm de las subunidades ρ1 y ρ2 en la ZPVCb 
Los resultados del presente trabajo indican la presencia de los RNAm de GABAρ1 y ρ2 
en la ZPVCb. Nuestro estudio se centró en la determinación de la expresión de GABAρ 
únicamente en la ZPVCb debido a que antecedentes en nuestro laboratorio indicaban la 
posibilidad de la expresión de este receptor en esta región, por tanto se seccionó 
cuidadosamente la ZPVCb, que incluye únicamente unas cuantas capas de células 
ependimales, por lo que la cantidad de material biológico aislado fue muy limitado, pero 
esta estrategia nos permitió localizar con precisión la presencia de este receptor en 
dicha estructura. 
Los resultados de RT-PCR muestran que la subunidad GABAρ1 es más 
abundante. Serán requeridos ensayos cuantitativos, tal como RT-PCR cuantitativo; sin 
embargo debido a que en repetidas ocasiones el transcrito para GABAρ2 fue detectado 
con muy baja eficiencia, el resto del proyecto se enfocó en la subunidad GABAρ1. 
En un estudio previo (Mejia et al., 2008) se determinó por RT-PCR con material 
aislado del cerebelo en varios estados del desarrollo postnatal, que la abundancia 
relativa de las subunidades GABAρ es GABAρ3>GABAρ1>GABAρ2; sin embargo en 
relación con la tubulina, la expresión de cada subunidad del receptor es muy baja. 
37 
 
Estas observaciones coinciden con nuestros resultados en dos puntos: 1) la expresión 
de GABAρ1 es mayor que GABAρ2y 2) la abundancia del receptor es baja en 
comparación con un gen que se expresa constitutivamente, tal y como la tubulina. En 
contraste, nuestros ensayos no coinciden con la expresión de GABAρ3, muy 
posiblemente a que esta subunidad se ubica únicamente en el componente neuronal 
del cerebelo (Mejía et al., 2008). 
La distribución de GABAρ1 es heterogénea a través de la ZPVCb, mostrando 
mayor expresión en la región más central del lóbulo X del cerebelo y en la zona más 
lateral, en donde se encuentran los núcleos cerebelosos medial y vestíbulo cerebeloso 
(Voogd et al., 1996 y Paxinos, 2004); dicha distribución nos podría sugerir que participa 
en funciones específicas de estas estructuras, pero para apoyar esta hipótesis será 
necesario el diseño de experimentos que primero nos permitan conocer con precisión 
en que subtipo celular se encuentra el receptor y con ello evaluar el aspecto funcional 
en esta zona. 
 
8.2 Características funcionales de la ZPVCb y la posible participación del 
receptor GABAρ. 
En la zona periventricular encontramos por RT-PCR e hibridación in situ la presencia 
del RNAm de subunidades del receptor GABAρ, la segunda técnica nos permitió 
distinguir la distribución del mismo y encontramos la expresión en dos tipos de 
estructuras diferentes en la ZPVCb, la primera y más central correspondiente al lóbulo 
X del cerebelo (10Cb) y las zonas más laterales, que corresponden a los núcleos 
cerebelosos medial (o fastigial) y vestíbulo cerebeloso (ambos referidos como NCb). 
 Para discutir este punto es importante mencionar que gran parte de la literatura 
describe a la corteza cerebelosa como una estructura homogénea a través de las folias 
y aunque parece serlo, se ha descrito también que presenta arreglos parasagitales y 
transversales muy peculiares, una de las descripciones neuroanatómicas la realizaron 
Ozol et al., (1999) quienes empleando marcadores como Zebrina II y calbindina 
clasificaron los lóbulos I-V en una zona anterior, VI-VII en una zona central, VIII-IX en 
una zona posterior y al lóbulo X en zona nodular. En cuanto a los núcleos cerebelosos, 
ha sido difícil establecer los bordes entre ellos, puesto que además presentan una gran 
38 
 
variedad de morfologías celulares, sin embargo se sabe que el núcleo medial se 
encuentra separado de otros núcleos por fibras mielinizadas (Paxinos, 2004). 
Las zonas periventriculares estudiadas en el presente trabajo tienen 
implicaciones funcionales muy importantes, 10Cb recibe aferencias de fibras trepadoras 
desde nervios vestibulares, vestíbulocerebelosos y subnúcleos olivares opticinéticos, en 
cuanto a sus eferencias aún no hay evidencias claras; el núcleo vestíbulocerebeloso 
recibe aferencias de núcleos vestibulares y proyecta hacia los lóbulos I, II, IX y X; 
además envía proyecciones hacia núcleos vestibulares; finalmente el núcleo medial 
recibe aferencias de células de Purkinje del vermis y envía proyecciones hacia los 
núcleos vestibular y parasolitario, formación reticular bulbar, médula espinal y 
finalmente hacia el tálamo, a los núcleos parafascicular, ventromedial y ventrolateral 
(Voogd et al., 1996). Las proyecciones de estas estructuras hacia la zona periventricular 
aún se desconocen, sin embargo por su ubicación anatómica se podría plantear una 
hipótesis acerca de las funciones en las que se encuentran involucradas las células que 
allí se encuentran, aunque aún es necesario conocer la presencia de proyecciones 
neuronales y/o gliales desde las folias cerebelosas hacia la luz ventricular, y 
específicamente hacia la zona periventricular del lóbulo X. 
Con la información que se cuenta (Carpenter et al., 1994; Ozol et al., 1999 y 
Voogd et al., 1996) se puede hacer notar que el lóbulo X del cerebelo(cuya zona 
periventricular se estudió en la presente tesis) y los nucleos cerebelosos medial y 
vestibulocerebeloso, están relacionados principalmente con funciones vestibulares y 
además hay comunicación recíproca entre ambas estructuras. 
 
8.3 Implicación funcional de la presencia de neurotransmisores en el sistema 
ventricular 
La presencia de receptores a neurotransmisores en la zonas periventriculares ha sido 
estudiada principalmente en los ventrículos laterales y relacionada primordialmente con 
la regulación de la proliferación y migración neuronal, puesto que las neuronas migran 
desde la zona subventricular hacia el bulbo olfatorio y zona subgranular hipocampal en 
el giro dentado (Mu et al., 2010) y por otra parte se ha reportado que en el canal central 
hay poblaciones de células progenitoras neuronales que pudieran participar en 
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procesos de regeneración celular, aunque no se conocen los mecanismos implicados 
en ello (Hamilton et al., 2009). 
Estudios recientes en nuestro laboratorio evidenciaron la presencia del receptor 
GABAρ en la epéndima de los ventrículos laterales (Rosas-Arellano et al., en proceso). 
El GABA es un neurotransmisor muy abundante tanto en el estriado, que es una 
estructura muy cercana a los ventrículos laterales, como en el cerebelo, cuya porción 
nodular forma el cuarto ventrículo (Young et al., 2011). En los ventrículos laterales se 
ha demostrado que realizando cultivos de rebanadas de cerebro de ratón, la aplicación 
de GABA (10µM) induce disminución en la velocidad de migración neuronal en un 21% 
y la aplicación de bicuculina, un antagonista del receptor GABAA, potencia la velocidad 
de migración en un 30%, sugiriendo que el GABA endógeno reduce la velocidad de 
migración, empleando como vía la activación de receptores GABAA (Bolteus y Bordey, 
2004). Por otra parte se ha descrito en la misma zona que las células denominadas tipo 
A (neuroblastos jóvenes en la zona subventricular) son GABAérgicas y que las células 
tipo B (células progenitoras primarias) expresan receptores GABAA y transportadores 
de GABA y con ello se sugiere la participación de este neurotransmisor en a) inhibición 
de la proliferación de las células B y en b) disminuir la velocidad de la migración de los 
neuroblastos tipo A (Ihrie y Álvarez-Buylla, 2011). 
La expresión del receptor GABAB en zonas periventriculares aún no se ha 
explorado, pero la presencia del receptor GABAρ en estas zonas debe tener 
implicaciones funcionales de gran importancia que también quedan por explorar. 
 La participación de neuromoduladores como dopamina y serotonina en los 
ventrículos