Analisis-funcional-de-las-senales-nucleo-citoplasmaticas-de-la-protena-ehncabp166-de-entamoeba-histolytica

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE MEDICINA 
DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS 
 
Análisis funcional de las señales núcleo – citoplasmáticas de la proteína 
EhNCABP166 de Entamoeba histolytica 
 
TESIS 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
DOCTOR EN CIENCIAS 
PRESENTA 
Q.F.B. RICARDO URIBE RODRÍGUEZ 
 
Tutor 
Dr. Miguel Ángel Vargas Mejía 
MÉXICO,D.F. 2012 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
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fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
El cambio llega de pronto, sin anunciar, y lo mismo la muerte. 
¿Qué crees que podamos hacer? 
- Vivir lo más felices que podamos- dije 
-¡Correcto! 
 Carlos Castaneda/ Don Juan Matus 
 
Contempla cada camino de cerca, entonces hazte esta pregunta crucial: 
¿Me lleva el corazón por esta ruta? 
Si lo hace, entonces el camino es bueno. 
Si no es así, es inútil. 
Don Juan Matus 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Jurado asignado: 
 
Presidente: Dra. Imelda López Villaseñor 
Secretario: Dr. Miguel Ángel Vargas Mejía 
Vocal: Dr. Julio César Carrero Sánchez 
Vocal: Dra. Isaura Meza Gómez Palacio 
Vocal: Dr. Armando Pérez Torres 
 
Comité tutoral 
Dra. Marcia Hiriart Urdanivia 
Dra. Martha Robles Flores 
Dr. Miguel Ángel Vargas Mejía 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Este proyecto de investigación fue realizado en: 
Departamento de Biomedicina Molecular 
CINVESTAV 
México D.F. 
Tutoría: Dr. Miguel Ángel Vargas Mejía 
 
Financiamiento: 
 Beca del Consejo nacional de ciencia y tecnología (CONACyT) para estudios de 
Doctorado (Número de becario 203209) 
 Consejo nacional de ciencia y tecnología (CONACyT): proyecto 130364 
 Programa de colaboración México – Francia ANR-CONACyT PARACTIN 
proyecto 140364 
 Agradecemos el apoyo económico proporcionado por el banco nacional de París, 
Francia (CIB – BNP PARIBAS) para el desarrollo del presente trabajo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 Al Dr. Miguel Ángel Vargas Mejía por permitirme ser parte de su grupo de 
investigación, por su gran apoyo en todo momento, por su confianza, por su exigencia 
académica y por todas sus enseñanzas, muchas gracias. 
 A la Dra. Marcia Hiriart Urdanivia y a la Dra. Martha Robles Flores por su 
enorme apoyo desde el inicio de mis estudios de doctorado, por todos sus consejos y su 
valiosa guía, por su apoyo incondicional aun en los momentos más difíciles, sin ustedes, 
este trabajo no hubiera sido posible. Soy muy afortunado en haberlas tenido como 
integrantes de mi comité tutoral. 
 A la Dra. Yolanda López Vidal por su invaluable apoyo en una etapa crítica de 
mis estudios de doctorado, sin sus consejos y ayuda la conclusión de mis estudios de 
doctorado no hubiera sido posible, muchas gracias. 
 A la Auxiliar de Investigación Ma. de Jesús Almaraz Barrera por su apoyo y 
asesoría en las diferentes técnicas empleadas en la realización experimental de este 
trabajo. 
 A la Dra. Imelda López, al Dr. Julio César Carrero a la Dra. Isaura Meza y al Dr. 
Armando Pérez por sus valiosos comentarios y críticas a este trabajo y por haberme 
otorgado un poco de su valioso tiempo. 
 Al CIB – BNP PARIBAS grant por el apoyo económico en el proyecto de 
colaboración ‘‘Impact of actin and actin-related proteins in parasitic human infections. 
Blanc International Mexico-France Program’’ 
 A mis compañeras de laboratorio Araceli y Eva, muchas gracias por sus 
consejos, apoyo y por todas las aventuras e historias realizadas estos 3 años. 
 A la diseñadora gráfica Valeria Gil Cruz por su gran ayuda en la generación de 
las figuras para la publicación del artículo, ¡muchas gracias! 
 Al Dr. Guillermo Mendoza Hernández (QEPD) por su apoyo en todo momento 
para los análisis de espectrometría de masas, por su crítica y consejos en el proyecto de 
doctorado. 
 A la Dra. Nancy Guillén por sus consejos académicos y por las facilidades 
otorgadas en el proyecto de colaboración ‘‘Impact of actin and actin-related proteins in 
parasitic human infections. Blanc International Mexico-France Program’’ 
 A la Auxiliar de Investigación Anel Edith Lagunes Guillén por su apoyo y 
asesoría en la técnica de microscopía electrónica de transmisión. 
 
 
DEDICATORIAS 
 
A mis padres que han dado todo por mí, por todo su amor, cariño, tiempo, 
dedicación, ayuda, apoyo en todo momento, sus desvelos y sus consejos. Gracias por 
todo, sin ustedes este logro no se podría consumir. Los quiero mucho. 
A mi hermana Laura, a mi hermano Guillermo y a mi hermana Cristina, gracias 
por todo su apoyo y cariño. Los quiero mucho. 
A Fernanda, esa pequeña traviesa que siempre me saca una sonrisa, te quiero 
mucho. 
A mi tía Catalina y a mi tío Carlos, que han sido un gran ejemplo de vida para 
mí, gracias por todo su apoyo y confianza. 
A mis abuelos, que siempre los he admirado por lo bueno que han hecho, este 
logro es también fruto de sus esfuerzos en el pasado. 
A mi familia, que siempre me ha apoyado en todo momento y aconsejado. 
A Sara B Díaz B, por hacer de cada día una experiencia única y feliz, por 
mostrarme que las pequeñas cosas esconden grandezas. Por una forma especial de ver 
las cosas, por tus consejos y tu sonrisa. Por toda la buena música que hemos escuchado 
y disfrutado. Por ser siempre tú. What is there to know? All this is what it is, you and 
me alone, sheer simplicity. 
 A mis amigos George, Carlos, Rocío, Raúl, Perla, Val, Alejandra, Elizabeth, 
Angélica, Rainier, Alma Ruth, Araceli, Eva, Mary, por ser buenos amigos y 
compañeros en todo momento. Gracias por su amistad y por todos esos buenos y malos 
momentos que hemos pasado. 
 A mis compañeros de laboratorio Araceli, Eva, Mary, Norma, Mercedes y 
Fernando por su apoyo y por los buenos momentos pasados en el laboratorio. 
 A mis primas Vero y Dany por tantas alegrías compartidas. 
 To Sabine Birkenfeld, thank you so much for all the time we spent, I learned 
many things, gracias compa! 
 A Ana Karen, por transmitir tanta buena vibra y felicidad! Llegarás tan lejos 
como quieras. 
 Al Dr. Guillermo Mendoza Hernández, por su buena disposición y espíritu de 
colaboración académica, por su gran ayuda. Un ejemplo en la ideología de la 
investigación. Descanse en paz. 
 To Dr. Jari Ylänne for his support and confidence. 
 Al personal del Instituto Nacional de Cardiología Ignacio Chávez que me apoyó. 
 A Los Guanábana, su buena música inspiró parte de este trabajo. 
 A toda la gente que he conocido y que de alguna u otra forma han influido en ser 
lo que soy. 
 Al pueblo de México. 
1 
 
ÍndiceLista de Figuras 
Lista de abreviaturas 
Resumen 
 Abstract 
I. Introducción 
 1.1. Amebiasis 
 1.2. Entamoeba histolytica 
 1.2.1 Factores de virulencia de E.histolytica 
 1.3. Actina en el parásito E. histolytica 
 1.4. Proteínas de unión a actina de E. histolytica 
 1.5. La proteína EhNCABP166 
 1.6. Proteínas de unión a actina nucleares 
 1.7. Transporte núcleo-citoplasmático 
 1.8. Señales de localización nuclear 
 1.9. Señales de localización nuclear no clásicas 
 1.10. Señales de exportación nuclear 
 1.11. La proteína Ran 
II. Justificación 
III. Hipótesis 
IV. Objetivos 
V. Materiales y Métodos 
2 
 
 5.1 Cultivo celular de cepas de bacterias y de E. histolytica. 
 5.1.1. Cultivo de Escherichia coli. 
 5.1.2. Cultivo de E. histolytica. 
 5.2. Técnicas de bioinformática 
 5.2.1. Multi alineamiento de las NLSs de EhNCABP166 
 5.2.2. Análisis bioinformático de la proteína EhRan. 
 5.3. Técnicas de biología molecular. 
 5.3.1 Amplificación de las versiones truncadas de la 
 proteína EhNCABP166 y de las quimeras que contienen 
 a las NLS por Reacción en Cadena de la Polimerasa 
 5.3.2. Elución de ADN amplificado de los geles de agarosa 
 5.3.3. Clonación de las versiones truncadas de la proteína 
 EhNCABP166 y de las quimeras que contienen a las NLS 
 en el vector amibiano pExEhNEO 
 5.3.4. Clonación de los dominios que contienen señales 
 de localización en el vector PCR 2.1 TOPO 
 5.3.5. Generación de mutantes dobles en los 
 dominios de EhNCABP166 que contienen NLS 
 5.3.6. Transformación de E. coli 
 5.3.7. Purificación de plásmidos 
 5.3.8. Electroporación de E. histolytica 
 5.4. Detección de la proteína EhNCABP166 y las construcciones 
 transfectadas usando microscopía de transmisión electrónica 
 5.5. Microscopía Confocal 
 5.6 Técnicas Bioquímicas 
 5.6.1. Electroforesis en geles de poliacrilamida SDS-PAGE 
3 
 
 5.6.2 Extracción de proteínas totales de E. histolytica 
 5.6.3. Extracción de proteínas citoplasmáticas y nucleares 
 de E. histolytica 
 5.6.4. Espectrometría de masas 
 5.7. Técnicas inmunológicas 
 5.7.1. Inmunoprecipitación de la proteína EhNCABP166 
 5.7.2. Ensayo de Western Blot 
VI. Resultados. 
 6.1. Localización nuclear de la proteína EhNCABP166 mediante MET 
 6.2. Localización celular del dominio Ac
-
d100
-
 y de las construcciones 
 NLS1, 2 y 3 fusionadas al dominio Ac
-
d100
-
. 
 6.3. Localización celular de diferentes construcciones de 
 EhNCABP166 en trofozoítos de E. histolytica. 
 6.4. Interacción del PI(3,4)P2 con EhNCBAR1-166 
 6.5. Localización celular del dominio EhNCGBD/FH3-166 mutado 
 y de la construcción EhNCR1C-166 mutada. 
 6.6. Localización nuclear de las construcciones NLS3 Ac
-
d100
-
, 
 EhNCRIC-166 y EhNCR1CK1005A/K1006/A mediante MET. 
 6.7. Inmunoprecipitación de la proteína EhNCABP166 
 6.8. Análisis in silico de la proteína Ran de E. histolytica 
 6.9. Detección de la proteína Ran en extractos totales de E. histolytica 
 
VII. Discusión de Resultados 
VIII. Conclusiones 
4 
 
IX. Perspectivas 
X. Referencias 
XI. Apéndices 
XII. Artículos publicados durante el doctorado 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
5 
 
Lista de figuras 
Figura 1. Ciclo de vida de E. histolytica 
Figura 2. Modelo de la fagocitosis en E. histolytica 
Figura 3. Esquema de la proteína EhNCABP166 
Figura 4. Multi alineamientos de NLSs y NES de EhNCABP166 
Figura 5. Funciones de las ABPs en el núcleoFigura 6. Sistema de transporte núcleo- citoplasmático 
Figura 7. Microscopía electrónica de transmisión de la proteína EhNCABP166 
Figura 8. Fusión de las NLSs al dominio Ac
-
d100
-
 
Figura 9. Construcciones realizadas para analizar los dominios 
de la proteína EhNCABP166 
Figura 10. Localización celular de la proteína EhNCABP166 y de los 
dominios que integran a la proteína 
Figura 11. Interacción del PI (3,4)P2 con el dominio EhNCBAR1-166 
Figura 12. Mutación de las lisinas 746/747 en el dominio EhNCGBD/FH3-166 y 
1005/1006 en la construcción EhNCR1C 
Figura 13. Microscopía electrónica de transmisión de las construcciones 
NLS3 Ac
-
d100
-
HSV, EhNCR1C-166 y EhNCR1CK1005A/K1006A-166 
Figura 14. SDS-PAGE de la inmunoprecipitación de la proteína 
EhNCABP166 en la fracción nuclear soluble 
Figura 15. Western blot de las fracciones nucleares e inmunoprecipitación 
de la fracción soluble nuclear 
6 
 
Figura 16. Multi alineamiento de la proteína Ran de E. histolytica 
Figura 17. Detección de la proteína Ran en trofozoitos 
 de E. histolytica cepa HM1:IMSS usando espectometría de masas 
Figura 18. Distribución de subfamilias de las carioferinas β en 
organismos eucariontes 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
7 
 
Lista de abreviaturas 
ABD Dominio de unión a actina (por sus siglas en inglés) 
ABP Proteína de unión a actina (por sus siglas en inglés) 
ADN Ácido desoxirribonucleico 
ATP Adenosín trifosfato 
BAR Bin–Amphiphysin–Rvs 
BSA Albúmina sérica bovina (por sus siglas en inglés) 
CH Dominio homólogo a calponina (por sus siglas en inglés) 
CRM1 Región de mantenimiento del cromosoma 1 (por sus siglas en inglés) 
DAPI 4,6 diamino 2 fenilindol 
D.O. Densidad óptica 
EDTA Ácido etilendiaminotetraacético (por sus siglas en inglés) 
EGTA Ácido etilenglicol-bis(β- aminoetil éter)- N, N, N´, tetraacético 
F-actin Actina filamentosa (por sus siglas en inglés) 
FITC Isotiocianato de Fluoresceína (por sus siglas en inglés) 
G418 Geneticina 
GBD/FH3 Dominio de unión a GTPasas (por sus siglas en inglés) 
GTP Guanosín trifosfato 
HSV Virus del herpes simple (por sus siglas en inglés) 
Kapα Carioferina alfa 
Kap β Carioferina beta 
8 
 
NES Señal de exportación nuclear (por sus siglas en inglés) 
NLS Señal de localización nuclear (por sus siglas en inglés) 
nm nanómetro 
NPC Complejo del poro nuclear (por sus siglas en inglés) 
PHMB Polihexametilenbiguanidina 
PBS Tampón de fosfatos salino (por sus siglas en inglés) 
PCR Reacción en cadena de la polimerasa (por sus siglas en inglés) 
PFA Paraformaldehído 
R1C Región localizada alrededor de los 1000 aminoácidos en la región C-terminal 
 (por sus siglas en inglés) 
RNAasa Ribonucleasa 
Rpm Revoluciones por minuto 
SDS Dodecil sulfato de sodio (por sus siglas en inglés) 
TEM Microscopía de transmisión electrónica 
TRITC Isotiocianato de tetrametilrodamina (por sus siglas en inglés) 
UV Ultra Violeta 
 
 
 
 
 
 
9 
 
Resumen 
 En células con una gran movilidad, la reorganización del citoesqueleto de actina es 
fundamental para generar los cambios estructurales que le permitirán responder de manera 
adecuada hacia las señales externas a las que se ven sometidas. El citoesqueleto de actina es 
una red dinámica de filamentos de actina que se asocian a múltiples proteínas de unión a 
actina (ABPs por sus siglas en inglés) y participan coordinadamente en diversos eventos 
celulares, tales como la arquitectura y motilidad celular. El re-arreglo del citoesqueleto de 
actina está mediado por la participación de múltiples ABPs, que permiten el 
entrecruzamiento de los filamentos de actina polimerizada para formar diferentes tipos de 
redes o bien pueden unirse a otras proteínas o lípidos. La mayor parte de los estudios 
realizados sobre ABPs han sido con el propósito de estudiar su estructura y función tanto en 
citoplasma así como en la membrana celular. Sin embargo, se ha demostrado que algunas 
ABPs no solo tienen funciones en el citoplasma, sino que además tienen diversas funciones 
en el núcleo, tales como su participación en la transcripción, replicación y reparación de 
ADN. A la fecha, varias ABPs han sido identificadas en E. histolytica; de entre ellas 
destaca la proteína EhNCABP166, la cual, hasta ahora, es la única ABP de E. histolytica 
que se localiza tanto en el citoplasma como en el núcleo de este parásito. La proteína 
EhNCABP166 tiene un dominio de unión a actina (ABD) similar al que contienen otras 
ABPs, dos dominios BAR, un dominio de unión a GTPasas y una región alfa hélice. 
 Análisis bioinformáticos de la secuencia de aminoácidos de EhNCABP166 
muestran la presencia de tres señales de localización nuclear bipartita (NLS) y una señal de 
exportación nuclear (NES). En el presente estudio nos enfocamos a determinar la 
funcionalidad de estas señales presentes en la proteína EhNCABP166. Para lograr este 
objetivo fusionamos cada una de las 3 NLSs a un dominio citoplasmático de la proteína 
ehFLN (Ac
-
d100
-
). Los resultados mostraron que la fusión de cada una de estas señales 
al dominio Ac
-
d100
-
, permitió a este dominio ser transportado hacia el núcleo. Además, se 
evaluó la localización celular de cada uno de los dominios transfectados de la proteína 
EhNCABP166. Estudios celulares de los dominios transfectados EhNCABD-166 y 
EhNCBAR1-166 (dominio que contiene la NLS1) permitieron determinar que éstos 
dominios transfectados fueron localizados fuera del núcleo, mientras que el dominio 
EhNCGBD/FH3-166 (dominio que contiene la NLS2), EhNCBAR2ΔNES y la 
10 
 
construcción EhNCR1C-166 (región que contiene la NLS3) fueron localizadas en el núcleo 
de trofozoítos transfectados con cada una de estas construcciones. Así mismo, añadimos la 
NES al dominio EhNCBAR2ΔNES-166 y la construcción EhNCR1C-166, con lo cual se 
observó un desplazamiento hacia el citoplasma en ambas construcciones, lo cual sugiere 
que esta señal es funcional. También mutamos las dos lisinas del primer bloque de las 
NLSs 2 y 3, teniendo como resultado una disminución en la localización nuclear del 
dominio EhNCGBD/FH3-166 y la construcción EhNCR1C-166. El uso de microscopía 
electrónica de transmisión nos permitió corroborar la localización nuclear de la proteína 
EhNCABP166 en trofozoítos silvestres y de las construcciones HSV-taggedNLS-Ac
-
d100
-
, 
EhNCR1C-166 y EhNCR1CK1005A/K1006A-166 en trofozoítos transfectados. El 
fosfoinosítido PI(3,4)P2 se une al EhNCBAR1-166 in vivo, posiblemente bloqueando el 
reconocimiento de la señal de transporte ubicada en este dominio. La proteína 
EhNCABP166 fue encontrada en la fracción nuclear insoluble, lo cual dificultó el estudio 
de la función de esta proteína en el núcleo del parásito. Un análisis in silico sugiere la 
presencia de la proteína Ran en Entamoeba histolytica. Con los resultados obtenidos 
sugerimos laexistencia de un sistema de transporte núcleo-citoplasmático en el parásito E. 
histolytica. 
 
 
 
 
 
 
Abstract 
In cells with high mobility, the reorganization of the actin cytoskeleton is essential for 
generating the structural changes that allow responding appropriately to external cues to 
which they are subjected. The actin cytoskeleton is a dynamic network of actin filaments 
that are associated with multiple actin binding proteins (ABP) and participate in 
11 
 
coordination in various cellular events, such as architecture and cell motility. The 
rearrangement of the actin cytoskeleton is mediated by the participation of multiple ABPs, 
which allow crosslinking of the polymerized actin to form different types of networks or 
may bind to other proteins or lipids. Most studies on ABPs have been for the purpose of 
studying the structure and function both in the cytoplasm and cell membrane. However, it 
has been shown that some ABPs have functions not only in the cytoplasm, but also have 
various functions in the nucleus, such as its involvement in transcription, DNA replication 
and repair. To date, several ABPs have been identified in E. histolytica, with highlights 
including EhNCABP166 protein, which, so far, is the only ABP E. histolytica which is 
located in both the cytoplasm and nucleus of this parasite. EhNCABP166 protein has a 
domain of actin-binding (ABD) similar to which contain other ABPs, two domains BAR, a 
GTPases-binding domain and a alpha helix region. 
 EhNCABP166 is an Entamoeba histolytica actin-binding protein that localizes to 
the nucleus and cytoplasm. Bioinformatic analysis of the EhNCABP166 amino acid 
sequence shows the presence of three bipartite nuclear localization signals (NLS) and a 
nuclear export signal (NES). The present study aimed to investigate the functionality of 
these signals in three ways. To achieve this goal, we fused each potential NLS to a 
cytoplasmic domain of ehFLN (Ac
-
d100
-
). Results showed that fusion of each NLS resulted 
in shuttling of the Ac
-
d100
-
 domain to the nucleus.to determine whether the localization of 
this domain could be altered by the presence of the NLSs. Furthermore, the localization of 
each domain of EhNCABP166 was determined. EhNCABD-166 and EhNCBAR1-166 
(domain containing NLS1) domains were located outside the nucleus, while as 
EhNCGBD/FH3-166 domain (domain that contains NLS2), EhNCBAR2ΔNES-166 domain 
and construction EhNCR1C-166 (region containing NLS3) were located in the nucleus of 
transfected trophozoites. 
Additionally, we added the NES to EhNCBAR2ΔNES-166 domain and EhNCR1C-166 
construction which showed a shift to the cytoplasm in both constructions, suggesting that 
this signal is functional. A mutation of lysines in the first block of bipartite signals 2 and 3 
affected the localization of the EhNCGBD/FH3-166 domain and EhNCR1C-166 
construction. 
12 
 
 The use of transmission electron microscopy allowed us to confirm the nuclear 
location of EhNCABP166 protein in wild type trophozoites and HSV-taggedNLS-Ac
-
d100
-
, EhNCR1C-166 and EhNCR1CK1005A/K1006A-166 constructions in transfected 
trophozoites. The phosphoinositide PI (3, 4) P2 binds to EhNCBAR1-166 in vivo, possibly 
blocking the recognition of the transport signal located in this domain. EhNCABP166 
protein was found in the insoluble nuclear fraction, making it difficult to study the function 
of this protein in the nucleus of the parasite. An in silico analysis suggests the presence of 
Ran protein in E. histolytica. The obtained results suggest the existence of a nuclear-
cytoplasmic transport in the parasite E. histolytica. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
I. INTRODUCCIÓN 
1.1 Amebiasis 
 La amebiasis es definida por la Organización Mundial de la Salud como una 
infección causada por el parásito Entamoeba histolytica. Este parásito protozoario tiene una 
13 
 
distribución mundial y en especial un alto predominio en países pobres con condiciones 
sanitarias inapropiadas. En naciones desarrolladas, las infecciones registradas por E. 
histolytica han sido reportadas en viajeros que han visitado regiones endémicas y también 
en inmigrantes que vienen de estas regiones (Pritt & Clark. 2008). 
E. histolytica es un parásito protozoario, agente causal de la amebiasis en humanos y 
responsable de aproximadamente 35 a 50 millones de casos de síntomas de enfermedad y 
de aproximadamente 100 000 muertes anualmente (WHO/PAHO/UNESCO. 1997). 
 Se ha calculado que la prevalencia promedio de la amebiasis en el mundo es del 
10%, alcanzando de un 50-80% en países poco desarrollados y en zonas tropicales, siendo 
la tercera parasitosis más importante después de la malaria y la esquistosomiasis (Gil L y 
cols., 2011). La letalidad por complicaciones de esta patología está estimada entre el 0.1% 
y 0.25%. La amebiasis invasora está concentrada en pocos lugares del mundo: México, 
Sudamérica Occidental, sur de Asia, sudeste y oeste de África (Sánchez M & Mújica Y. 
2009). 
 En México, a pesar de que las enfermedades diarreicas provocadas por E.histolytica 
han ido a la baja y que esta patología ha presentado una disminución en el número de casos 
e incidencia en los últimos años, continúa manteniéndose entre las primeras veinte causas 
de morbilidad en el país. La mayoría de las infecciones son asintomáticas, pero la invasión 
de tejidos puede resultar en colitis amibiana, abscesos hepáticos e incluso diseminación a 
otros órganos. 
1.2. Entamoeba histolytica 
La infección por E. histolytica es adquirida a través de la ingestión de alimentos y agua 
contaminada con los quistes del parásito, haciendo que esta enfermedad sea de mayor 
incidencia en áreas con poca sanitización. 
 Cuando el humano ingiere alimentos o agua contaminada con quistes, éstos pueden 
llegar al intestino delgado, lugar donde se desenquistan, dando lugar a 8 trofozoítos por 
quiste. Los trofozoítos migran hacia el intestino grueso, lugar en donde se pueden enquistar 
y ser desechados con las heces, completando así su ciclo de vida (Figura 1). Bajo ciertas 
14 
 
condiciones que aun no se han esclarecido totalmente, E. histolytica tiene la capacidad de 
colonizar el intestino e invadir el epitelio intestinal causando desde una diarrea hasta una 
colitis ulcerativa crónica. En algunos casos el trofozoito se disemina al torrente sanguíneo, 
lo que resulta en abscesos amibianos extraintestinales, principalmente en el hígado 
(Stanley, S.L., Jr. 2003). 
 Las poblaciones de trofozoítos pueden alcanzar altas densidades y agregarse, un 
proceso en el cual se activa el cambio de crecimiento exponencial a enquistamiento y que 
también puede concebirse como un disparador de la virulencia (Faust & Guillén, 2012). A 
diferencia de otras especies de parásitos, E. histolytica no depende de un vector de 
transmisión, ya que los quistes son excretados en heces y de esta manera, perpetuán el ciclo 
fecal - oral de vida de este parásito (Faust & Guillén, 2012). 
 
 
15 
 
Figura 1.Ciclo de vida de E. histolytica y consecuencias clínicas de la infección en 
humanos. 
 
1.2.1. Factores de virulencia de E. histolytica 
 E. histolytica se caracteriza por su extraordinaria capacidad para invadir y destruir 
los tejidos del huésped. La capacidad patógena de los trofozoítos de E. histolytica se ha 
atribuido principalmente a la capacidad de este parásito para fagocitar, a su resistencia al 
sistema del complemento y a la expresión de adhesinas, proteasas de cisteínas, amebaporos 
colagenasas o fosfolipasas o su actividad citotóxica. El proceso invasivo es sumamente 
importante durante la patogénesis, debido a su gran movilidad manifestada por la rápida 
locomoción, pleiomorfismo y continuo movimiento de componentes intracelulares de este 
tipo de células. Las moléculas del hospedero como lo son: anafilotoxina C5a y fibronectina 
(FN), así como los lisados de los eritrocitosson capaces de atraer a los trofozoítos (Franco 
E y cols., 1997, Urban T y cols., 1983) , por lo tanto, estos datos sugieren fuertemente que 
la quimiotaxis de E. histolytica tiene una participación importante durante la invasión de los 
diferentes tejidos del huésped. Durante la quimiotaxis, la amiba sensa gradientes 
químicos en el ambiente extracelular vía quimioreceptores. La unión de este 
quimioatrayente con su receptor específico activa cascadas de señalización permitiendo la 
polarización de la célula y un movimiento orientado llevando a cabo la formación de un 
pseudópodo predominante que permite la elongación de la célula en una manera persistente 
y directa paralelo al gradiente quimiotáctico (Eisenbach M, 2004). Los pseudópodos son 
ricos en actina filamentosa y proteínas de unión a actina como la proteína ABP-120 , 
miosina IB, profilina (Binder M y cols, 1995) , EhPAK ( Labruyere E y cols., 2003) y 
miosina II ( Marion S y cols., 2005 ). Por otro lado, el uroide, un apéndice que se forma en 
la parte posterior de E. histolytica, que se puede formar estimulando las células con ConA o 
bien utilizando anticuerpos dirigidos contra este parásito. Generalmente E. histolytica 
puede generar un desprendimiento de membrana plasmática de la región que conforma el 
uroide, por lo que la membrana liberada al medio extracelular puede contener moléculas de 
superficie con ligandos multivalentes que fueron agrupadas y transportadas activamente en 
un proceso llamado capping (Trissl D y cols., 1977, Calderon J y cols., 1980). Por otro 
16 
 
lado, la migración amibiana, además de polarizar a la célula, involucra cambios cíclicos en 
la fuerza adhesiva mediada por moléculas de superficie que forman estructuras altamente 
especializadas conocidas como placas de adhesión (Vázquez J y cols., 1995) en los sitios de 
contacto con proteínas de matriz extracelular. 
 Los trofozoítos realizan un proceso de invasión muy elaborado, en el cual secretan y 
expresan proteínas, lo que les permite adherirse al epitelio, degradar la matriz extracelular y 
producir citólisis de las células epiteliales para penetrar dentro de la mucosa; además 
fagocitan activamente bacterias y desechos de las células del huésped que les sirven de 
alimento. La fagocitosis consiste de varios pasos que en este parásito incluyen el 
reconocimiento y la unión a ligandos de la célula blanco, por ejemplo, la lectina específica 
de galactosa/N-acetilgalactosamina (Gal/GalNAc) o la adhesina de 112 kDa que une 
eritrocitos (Arroyo R & Orozco E, 1987, Banuelos C y cols., 2005). El reconocimiento 
ligando-receptor produce la activación de vías de señalización que llevan a la 
reorganización del citoesqueleto, permitiendo la formación de pseudópodos que se cierran 
sobre la célula que se va a fagocitar formando el fagosoma. Actualmente, con la ayuda de 
herramientas bioquímicas tales como la proteómica, se ha logrado tener un panorama más 
amplio acerca de las diferentes proteínas que participan durante la fagocitosis amibiana 
(Figura 2).Se han descrito tres pasos básicos en la patogénesis de la amebiasis: 
colonización, reducción/ disrupción de la mucosa y citólisis. Durante estos procesos, 
múltiples quimioatrayentes y citocinas proinflamatorias son liberadas por las células 
epiteliales, iniciando una respuesta aguda. En el inicio de la invasión, el trofozoito se 
enfrenta con la capa de mucina que recubre el epitelio del colon como el principal 
obstáculo para invadirlo (Gómez-Trejo JC y cols., 2007). En la invasión de la mucosa 
intestinal, los trofozoítos de E. histolytica tienen que destruir una extensa capa de mucina, 
la cual cubre el epitelio intestinal. Para que los trofozoítos de E. histolytica logren acceder 
al epitelio por proteólisis de la mucina MUC2 (principal componente glucoproteíco de la 
mucosa intestinal) (Garcia-Zepeda EA y cols., 2007., Moncada D y cols., 2003.) y ejerza su 
potencial patógeno sobre las células del huésped, es necesario que se establezca un contacto 
directo por medio de la interacción entre lectinas del parásito y las glucoproteínas presentes 
en la mucina del colon. 
17 
 
 La adherencia de los trofozoítos a las células blanco es un requisito para la 
colonización e invasión, y está mediada por varias moléculas. Esta adherencia se realiza 
gracias a la acción citolítica de las enzimas proteolíticas que el parásito posee, como 
proteasas y ameboporos. La extensión y profundidad de la acción citolítica determinan la 
aparición de úlceras de diversos tamaños, las cuales, generalmente, terminan en la 
perforación de la pared intestinal (McCoy JJ y cols., 1994, Almeida–Motta & Pontes da 
Silva 2002, Naquira C. 1997). 
 La muerte celular por invasión con E. histolytica depende del contacto, por lo tanto, 
la adherencia a las células del huésped es de importancia crítica en la patogénesis de la 
amebiasis intestinal y, también, en el desarrollo del absceso amebiano (McCoy JJ y cols., 
1994, Horga MA y cols., 2006). 
La adhesión es importante no solo por la persistencia y migración controlada del patógeno, 
sino también para la virulencia del parásito. Estos tres procesos involucran la participación 
del citoesqueleto de manera crucial. 
 
18 
 
Figura 2. Modelo de fagocitosis de E. histolytica. El esquema muestra las proteínas identificadas 
por proteómica (Marion S y cols., 2005a) en los fagosomas tempranos aislados de E. histolytica, las 
cuales fueron agrupadas dependiendo del posible evento en que participan. 1) La célula que va a ser 
fagocitada se adhiere a la superficie amibiana vía receptores específicos, desencadenando vías de 
señalización que permiten el rearreglo del citoesqueleto. 2) Proteínas del citoesqueleto son 
reclutadas al sitio de contacto amiba-célula. La deformación en la membrana, causada por 
polimerización local de actina y contracción de acto-miosina, permite la extensión de pseudópodos 
que forman la copa fagocítica. 3) La membrana se cierra sobre la célula que se va a fagocitar. 
Membranas del retículo endoplásmico (RE) o de endosomas (E) podrían fusionarse con el fagosoma 
naciente (Tomado y modificado de Marion S & Guillén N. 2006) 
 La mayoría de los procesos antes mencionados son regulados por el citoesqueleto de 
actina. La actina es una de las proteínas más abundantes y es regulada por diversas 
proteínas que se unen a ella. A continuación se hablará más de la actina y de las proteínas 
de unión a actina encontradas en E. histolytica. 
 
1.3. Actina en el parásito E. histolytica. 
En el parásito protozoario E. histolytica, los genes que codifican para la actina 
fueron clonados, analizados y secuenciados (Meza I y cols., 1983, Huber M y cols., 1987). 
Posteriormente, la expresión de la proteína fue confirmada al purificar de los trofozoítos 
una molécula con características moleculares, bioquímicas y funcionales similares a una 
actina típica (Meza I y cols., 1983). De acuerdo con las características bioquímicas de esta 
proteína, se sabe que es una molécula que presenta un peso molecular de 45 kDa con un pI 
de 5.4, lo que la hace ser una molécula ligeramente más pesada y ácida en comparación 
con la actina muscular. Funcionalmente esta proteína mostró “in vitro” la capacidad de 
formar filamentos que son capaces de activar a la ATPasa de la meromiosina de la actina 
muscular, pero que no se une a DNAasa I como lo hacen otras actinas (Meza I y cols., 
1983). Aunque esta actina no se une a DNAasa I, anticuerpos purificados que reconocen a 
actina de diferentes eucariontes superiores, incluyendo a otros protozoarios, sugirió un alto 
grado de homología entre este tipo de moléculas (Meza I y cols., 1984). 
19 
 
La disponibilidad de un marcador de actina polimerizada (faloidina-rodamina) ha 
permitido la localización de la actina F en la región cortical de los trofozoítos, en la copa 
fagocítica de los trofozoítos durante la eritrofagocitosis, en las invaginacionespinocíticas y 
durante la formación del uroide (Bailey GB y cols., 1985). Estas funciones están 
relacionadas con el movimiento celular así como también con la destrucción dependiente de 
contacto, las cuales son bloqueadas al hacer uso de la citocalasina D (una droga que inhibe 
la polimerización de actina), por lo que se ha propuesto una posible correlación entre la 
polimerización de actina y estos procesos celulares (Ravdin JI y cols., 1985). Por otra parte, 
el control de la transcripción del mRNA del gen de actina en los trofozoítos de E. 
histolytica está íntimamente relacionado con las condiciones de crecimiento del parásito, lo 
cual consecuentemente tiene un efecto directo sobre la organización de la red de 
microfilamentos, la movilidad, así como también en la capacidad invasiva del parásito 
(Manning-Cela R & Meza I. 1997). 
Experimentos posteriores mostraron que la actina puede inducir estructuras 
complejas tales como placas de adhesión, que son definidas como una interacción estrecha 
entre la amiba y el sustrato. Probablemente la formación de estas placas de adhesión en 
amiba sea el resultado de un proceso que requiere la interacción de un receptor (semejante a 
integrinas) con su ligando específico. En este parásito al menos dos receptores han sido 
reportados, una proteína de 37 kDa (Talamas-Rohana P & Meza I, 1998) y una de 140 kDa, 
esta última con similitud a la integrina β1 (β1EhFNR) (Talamas-Rohana P y cols., 1992), 
mientras que el ligando específico parece ser el extremo amino-terminal de la fibronectina 
(Franco E y cols., 1997). En estas estructuras de adhesión se reportó la participación de 
proteínas tales como la vinculina, α-actinina y tropomiosina, las cuales son importantes 
para ayudar a mantener la estabilidad de los filamentos de actina. Por otra parte, se ha 
reportado que la adhesión de los trofozoítos de E. histolytica a la fibronectina forma un 
complejo de señalización multimolecular que dispara eventos de fosforilación sobre el 
mismo receptor β1EhFNR, FAK, paxilina y vinculina (Flores-Robles D y cols., 2003). Por 
otra parte, se ha encontrado que los trofozoítos de E. histolytica en presencia de 
fibronectina, promueven la activación de diferentes vías de señalización acopladas a 
proteínas G heterotriméricas, las cuales promuevan la polimerización de actina que, en 
conjunto con otras proteínas, promueven diferentes procesos celulares tales como la 
20 
 
adhesión, la secreción de proteasas y la locomoción en los trofozoitos de este parásito 
(Soid-Raggi LG y cols., 1998). 
 
1.4. Proteínas de unión a actina de E. histolytica. 
Al igual que en eucariontes superiores, en la amiba se han logrado identificar 
diversas proteínas de unión a actina entre las cuales se encuentran: profilina , miosina II 
(Coudrier E. y cols., 2005), vinculina, tropomiosina (Vázquez J y cols., 1995) y EhCaBP1 
(Sahoo N y cols., 2004). Así mismo se conocen proteínas con dominio ABD tales como: 
espectrina (Marion S y cols., 2004a), ABP120 (Vargas M.A. y cols., 1996b) α-actinina 
(Virel A and Backman L 2006), EhABPH y α-actinina 2 (Virel A y cols., 2007). Respecto 
a sus funciones, profilina es un componente central del citoesqueleto de actina (Carlsson L 
y cols., 1976), con 21 residuos de su secuencia capaces de interactuar con actina de 
mamíferos y de plantas, de los cuales 17 residuos están conservados con respecto a la 
secuencia de profilina de mamíferos (Binder M y cols., 1995b). 
Virel y Backman en los años 2006 y 2007 identificaron las proteínas α-actinina y α-
actinina 2 en E. histolytica. Estas proteínas conservan la función esencial para las α-
actininas reportadas en otros sistemas, que es la capacidad de entrecruzar filamentos de 
actina de una manera dependiente del calcio (Virel A. and Backman L. 2006). EhCaBP1es 
una proteína que se une a actina F y que participa en procesos de fagocitosis y endocitosis. 
(Sahoo N y cols., 2004). Otras de las proteínas de unión a actina identificadas en trofozoítos 
de E. histolytica son las moléculas EhABP-120 y EhABPH. La primera pertenece a la 
familia de las filaminas que son proteínas entrecruzadoras de filamentos de actina que 
promueven la formación de redes ortogonales. Esta molécula se localiza en el pseudópodo 
y en la región del uroide de E. histolytica, lo que sugiere que probablemente la importancia 
funcional de esta localización dual resida en el enriquecimiento de la actina F. Respecto a la 
estructura de EhABP120, se sabe que el extremo amino-terminal presenta un sitio de unión 
a actina que es homólogo al de las proteínas ABP-120 de D. discoideum, α-actinina y 
espectrina, mientras que en la región central exhibe cuatro repetidos tipo inmunoglobulina; 
21 
 
sin embargo, el extremo carboxilo-terminal es altamente divergente con respecto al de 
ABP-120 de D. discoideum (Vargas M y cols., 1996c). Esta región divergente fue 
denominada EhEND y es capaz de asociarse con sulfátido, siendo esta molécula blanco un 
nuevo ligando para miembros de la familia de las filaminas. Además, se demostró que esta 
región es capaz de dimerizar “in vitro” y que este dímero es estabilizado mediante la unión 
al sulfátido (Diaz-Valencia D y cols., 2005). EhABPH presenta una estructura bipartita, es 
decir, el extremo N-terminal muestra homología de secuencia con respecto a la proteína 
coronina de D. discoideum, mientras que el extremo C-terminal exhibe homología de 
secuencia a proteínas de la familia gelsolina/villina (Ebert F y cols., 2000). Con respecto a 
su función, se sugiere que puede ser un componente necesario para dirigir vesículas 
intracelulares hacia la membrana plasmática, además de su posible participación en la 
formación del uroide en el parásito E. histolytica (Ebert F y cols., 2000). 
Otro tipo de proteínas estudiadas en E. histolytica son las miosinas, proteínas 
motoras que entrecruzan filamentos de actina y que utilizan la energía de la hidrólisis del 
ATP para el movimiento. En la amiba únicamente se han identificado y estudiado dos, a la 
miosina II y la miosina 1B. La miosina II es una miosina convencional que presenta en su 
estructura los dominios reportados para la miosina II en eucariontes superiores que son: un 
dominio globular que contiene una región de aminoácidos involucrada en la interacción con 
ATP y con actina e interacción con la cadena ligera de la miosina (Raymond-D y cols., 
1993). Se ha observado que esta proteína se encuentra tres veces más concentrada en el 
uroide que en el resto de la célula durante el capping, lo que sugiere que la liberación del 
capping en la célula depende de la contracción dirigida por la miosina II (Arhets y cols., 
1995). La sobre-expresión de la cadena ligera meromiosina de la miosina II (la cual es 
esencial para la formación de filamentos de miosina II) en trofozoítos de E. histolytica 
provocó que los trofozoítos presentaran un movimiento anormal, además de mostrar 
irregularidades en la formación del uroide así como deficiencias en la formación del 
capping en células estimuladas con Con A. Esto permitió sugerir que esta proteína podría 
participar en estos procesos celulares (Arhets P y cols., 1998). La miosina IB es la primera 
miosina no convencional identificada en este parásito (Vargas M y cols., 1997). Esta 
proteína presenta los dominios característicos de las miosinas I subclase 1, ya que están 
formadas por una cabeza y una cola, un dominio de unión a GTP o ATP, un dominio de 
22 
 
unión a actina, una región IQ para interactuar con calmodulina y un dominio SH3 putativo 
que probablemente le permita interaccionar con la membrana plasmática de E. histolytica. 
Diferentes evidencias experimentales han permitido sugerir que la miosina IB tiene una 
participación importante durante el proceso de fagocitosis, por ejemplo, al usar anticuerpos 
contra esta proteína en ensayos de microscopía de fluorescencia esta molécula se ve 
enriquecidaen el pseudópodo y en vesículas. Sin embargo, cuando los trofozoítos son 
estimulados con eritrocitos humanos, la miosina IB se detecta en la copa fagocítica y 
alrededor de los fagosomas internalizados durante la eritrofagocitosis (Voigt H y cols., 
1999a). Por otro lado, la sobre-expresión de la miosina IB en los trofozoítos de E. 
histolytica, provocó un incremento en la rigidez de la actina cortical disminuyendo así la 
flexibilidad de la membrana plasmática, lo cual trae como consecuencia una deficiencia en 
la fagocitosis (Voigt H y cols., 1999a). También se ha observado que la sobre-expresión de 
la miosina IB tiene como resultado un incremento en la viscosidad del citoplasma, ya que 
se observaron cambios en la densidad de las redes de actina y por lo tanto se provocó un 
retraso en el inicio de la fagocitosis lo que sugiere que esta proteína puede regular el 
dinamismo de las redes de actina en el citoplasma, lo cual es trascendental para el proceso 
de fagocitosis en este parásito. Nuestro grupo de trabajo determinó la presencia de una 
nueva ABP en E. histolytica; esta proteína fue la proteína EhNCABP166, una proteína que 
es localizada tanto en el citoplasma y membrana celular como en el núcleo de trofozoítos 
(Campos-Parra A y cols., 2010). Es la primera vez que se ha reportado una ABP nuclear en 
este parásito. Sin embargo, en eucariontes superiores, se ha reportado la presencia de 
diversas ABPs en el núcleo; incluso, para muchas de ellas, se ha descrito que tienen 
funciones específicas. A continuación, se detalla un poco de la información sobre ABPs 
nucleares en eucariontes superiores. 
1.5 La proteína EhNCABP166 
La proteína EhNCABP166 consta de 1387 aminoácidos, tiene un peso molecular de 
166 kDa y un punto isoeléctrico teórico de 5.22 (Campos-Parra A y cols., 2010). Esta ABP 
contiene diversos dominios, entre los que se encuentran un dominio de unión a actina 
23 
 
(ABD por sus siglas en inglés) compuesto por dos dominios homólogos a Calponina, dos 
dominios Bin–Amphiphysin–Rvs (BAR), un dominio de unión a GTPasas (GBD por sus 
siglas en inglés) y una región alfa hélice (Figura 3). El multi-alineamiento del dominio 
ABD de la proteína EhNCABP166 con diferentes dominios ABDs de diferentes proteínas 
ABPs, mostró que el dominio ABD de EhNCABP166 contiene las tres regiones 
conservadas denominadas como ABS1, ABS2 y ABS3 las cuales, han sido reportadas 
como las regiones importantes para llevar a cabo la interacción con los filamentos de actina 
(Gimona M y cols.,. 2002a). Esta proteína se unió a la actina filamentosa tanto in vitro 
como in vivo, por lo que se sugiere que el ABD de la proteína EhNCABP166 es un 
dominio funcional. La proteína contiene dos dominios BAR, los cuales tienen un 
comportamiento similar a los dominios BAR observados en otras proteínas. In vitro, el 
dominio EhNCBAR1 de EhNCABP166 interacciona con gran afinidad con el lípido 
fosfatidilinositol (PI) 3 fosfato , PI4 fosfato y PI5 fosfato y con menor afinidad a los PI(4,5) 
bifosfato (P2) y PI (3,4)P2. El dominio EhNCBAR2-166 interacciona con gran afinidad con 
los lípidos PI 5 fosfato, PI 4 fosfato y PI 3fosfato y con menor afinidad al PI (4,5) P2 y al 
PI (3,4,5) trifosfato (P3). Así mismo, estos dominios fueron capaces de interaccionar in 
vitro con algunas GTPasas amibianas. El dominio EhBAR1-166 se unió a la GTPasa Rho1, 
mientras que el dominio EhBAR2-166 se unió con las GTPasas EhRacG, EhRacC y 
EhRas1 (Campos-Parra A y cols., 2010). 
 
Figura 3. Esquema que representa la organización de la proteína EhNCABP166. La proteína de 
1387 aminoácidos y de un peso de 166 kDa contiene un ABD conformado por dos dominios CH 
(aminoácidos 19-233). Así mismo, la proteína está conformada por dos dominios BAR (BAR1 
24 
 
aminoácidos 248-512, BAR2 aminoácidos 1057-1314) y un dominio GBD/FH3 (aminoácidos 438-
852). La proteína contiene una región alfa hélice entre el dominio GBD/FH3 y el dominio BAR2 
(aminoácidos 854-.1056). La proteína contiene 3 señales de localización nuclear clásicas bipartitas 
(NLS), localizadas en el dominio BAR1 (NLS1), en el dominio GBD/FH3 (NLS2) y en la región 
alfa hélice R1C (NLS3). Así mismo, la proteína EhNCABP166 contiene una señal de exportación 
nuclear (NES) localizada en el extremo C-terminal de la proteína. 
 
En el caso del dominio EhNCGBD/FH3-166 (GTPase binding domain) de la 
proteína EhNCABP166, éste fue capaz de interaccionar in vitro con las GTPasas EhRacG, 
EhRacC, EhRas1. El dominio EhGBD/FH3-166 también fue capaz de interaccionar con los 
lípidos PI 5 fosfato, PI 4 fosfato y el PI 3fosfato.Mediante un ensayo de pull down se 
mostró que el dominio EhNCGBD/FH3-166 fue capaz de interaccionar con la forma activa 
de la GTPasa EhRacG. Este primer estudio mostró que los dominios BAR y GBD de la 
proteína EhNCABP166 tienen propiedades similares a las ya reportadas para estos 
dominios, a pesar de que tienen muy poca homología con proteínas de eucariontes 
superiores. 
La proteína EhNCABP166 fue encontrada principalmente en el núcleo de E. 
histolytica. Sin embargo, hasta ahora no se ha determinado como es que la proteína 
EhNCABP166 puede ser transportada hacia el núcleo y hacia el citoplasma. El análisis in 
silico revela que esta proteína contiene 3 señales de localización nuclear bipartitas: 369-
KKIEELEKLVSVMKEKK-385 localizada en el dominio EhNCBAR1-166, 746-
KKQIEIIKNDNEKERKN-762 localizada en el dominio EhNCGBD/FH3-166 y la señal 
1005-KKQLENENEIIKKENKK-1021 localizada en la región alfa hélice EhNCR1C-166, 
además de una señal de exportación nuclear: 1336-LFNSLAL-1342, localizada en los 
últimos 73 aminoácidos de la proteína EhNCABP166 (Campos-Parra A y cols., 2010). 
 Un multialineamiento de estas señales de localización nuclear con la señal bipartita 
clásica de la proteína nucleoplasmina (cNLS) y las señales de localización nucleares 
encontradas en la proteína IL5 de humano y la proteína MAPKAP cinasa 2 muestra que las 
3 NLSs contienen aminoácidos básicos tanto en el bloque 1 como en el bloque 2, al igual 
que la NLSs de las proteínas previamente descritas (Figura 4A). El resultado nos muestra 
también que las 3 señales de localización nuclear de la proteína EhNCABP166 mantienen 
conservadas dos lisinas en el primer bloque de la señal bipartita. Así mismo, un multi 
25 
 
alineamiento de la señal de exportación nuclear de la proteína EhNCABP166 con señales 
de exportación nuclear encontradas en la proteína DcpS (Scavenger mRNA-decapping 
enzyme) humana, en la proteína Rad 24 y en la proteína Rex del virus de leucemia de las 
células T de humano (HTLV-1rex) muestra que la señal de exportación de la proteína 
EhNCABP166 contiene las 3 leucinas en la misma posición presentes en otras señales 
funcionales descritas para otras proteínas (Figura 4B). 
A B 
 
Figura 4. A. Multi alineamiento de las NLS 1,2 y 3 de EhNCABP166 con señales de localización 
nucleares de 3 diferentes proteínas. B. Multi alineamiento de la señal de exportación de la proteína 
EhNCABP166 con señales de exportación nuclear de 3 diferentes proteínas. 
 
La presencia de estas señales en la proteína EhNCABP166 y la localización de esta proteína 
en el núcleo y en el citoplasma nos hacen pensar en diversas funciones por parte de esta 
proteína en ambos compartimentos celulares. En otros sistemas eucariontes, se sabe que el 
transporte de proteínas que contienen señales de localización y exportación nucleares está 
regulado por un sistema de transporte núcleo- citoplasmático (Fried H & Kutay U 2003). 
Esta es la primera ABP nuclear reportada en E.histolytica, sin embargo, en eucariontes 
superiores se ha reportado la presencia de diversas ABPs en el núcleo. A continuación se 
describirán algunas ABPs encontradas en el núcleo y algunas de las funciones que hasta 
ahora se han encontradopara estas proteínas en el núcleo. 
 
1.6. Proteínas de unión a actina nucleares. 
La actina, así como también múltiples ABPs además de formar parte y de participar 
en la organización estructural del citoesqueleto de actina en el citoplasma de la célula, 
pueden desempeñar diferentes funciones en el núcleo (Uribe R & Jay D. 2009). Se ha 
reportado que en el núcleo, la actina puede participar en diferentes mecanismos 
26 
 
moleculares tales como la organización de los complejos remodeladores de la cromatina, el 
procesamiento del RNA, la regulación de la función de la DNAasa 1 (Olave I y cols., 2002) 
y regulación de la actividad transcripción llevada a cabo por las RNA polimerasas I, II y III 
(Fomproix N & Percipalle P 2004; Hofmann M y cols., 2004; Hu P y cols., 2004; 
Philimonenko V y cols., 2004). 
Por su parte, las ABPs como: la α-actinina 4 (Babakov VN 2004), espectrina (Bachs 
O y cols., 1990), α-espectrina II (McMahon L y cols., 2001; Sridharan D y cols., 2003), Β-
espectrina II (Tang Y y cols., 2003), filamina (Loy C y cols., 2003) y la distrofina 71 
(Fuentes-Mera L y cols., 2006) además de sus funciones citoplasmáticas, también llevan a 
cabo funciones adicionales en el núcleo (Fig. 4). Por ejemplo, la proteína α-actinina 4, 
además de entrecruzar filamentos de actina en el citoplasma y participar en el movimiento 
celular, se encuentra en el núcleo asociada con la subunidad p65/RelA de NF-Kappa β 
(Babakov VN 2004). La proteína espectrina ha sido encontrada en la envoltura nuclear así 
como también en gránulos intranucleares de células de hígado (Bachs O y cols., 1990) y se 
ha observado que la isoforma α -espectrina II, tiene una participación importante durante la 
reparación del DNA (McMahon L y cols., 2001; Sridharan D y cols., 2003), mientras que la 
isoforma β-espectrina II, se asocia con proteínas Smad en el citoplasma y son translocadas 
hacia el núcleo de las células del hígado (Tang Y y cols., 2003). La filamina A, organiza en 
el citoplasma a los filamentos de actina en redes tridimensionales ligándolos a la membrana 
plasmática pero también se ha observado que su región C-terminal es cortada por la 
proteasa calpaína, generando un fragmento de 100 KDa, fragmento que migra hacia el 
núcleo asociado con el receptor de andrógeno (AR) (Loy C y cols., 2003) o bien, se asocia 
en el núcleo con el factor de transcripción FOXC1 (Berry F y cols., 2005). Lo anterior 
sugiere que la filamina A puede influenciar la actividad de factores importantes de 
transcripción (Berry F y cols., 2005). La proteína Dp71, ha sido encontrada en fracciones 
de matriz nuclear de células HeLa, además coinmunoprecipita con lámina B1 y actina. La 
asociación de Dp71 con proteínas de la matriz nuclear indica que funcionan como proteínas 
de andamio con el fin de mantener la arquitectura nuclear (Fuentes-Mera L y cols., 2006). 
Recientemente se reportó que la forma activa de mDia entra y sale del núcleo a través del 
uso de la maquinaria de transporte nuclear compuesta por las proteínas importina alfa, beta 
y la proteína CRM1(Miki T y cols., 2009). Por lo tanto, además de organizar la estructura 
27 
 
del citoesqueleto, las ABPs también llevan a cabo funciones diferentes en el núcleo a las 
observadas en el citoplasma de las células, funciones tales como el remodelamiento de la 
cromatina, participación en el proceso de transcripción, reparación de ADN, replicación de 
ADN y tener un papel importante en la formación y mantenimiento de la estructura nuclear. 
 
 
 
 
 
 
 
28 
 
 
Figura 5. El modelo representa los procesos nucleares que involucran a la actina y a algunas 
ABPs en procesos de transcripción, replicación y reparación de ADN. El centro del modelo muestra 
algunos complejos remodeladores de cromatina, los cuales pueden intercambiar factores 
dependiendo del proceso celular (tomada de Castano E y cols., 2010). 
 
Algunas ABPs contienen señales de localización nucleares (monopartitas o 
bipartitas) que les permiten la entrada al núcleo (Tabla 1). En eucariontes superiores se ha 
reportado la presencia de un sistema núcleo- citoplasmático que permite el ingreso regulado 
hacia el núcleo y la exportación de proteínas desde el núcleo hacia el citoplasma. A 
continuación hablaremos del sistema de transporte núcleo- citoplasmático de eucariontes 
superiores. 
 
29 
 
Gene UniProt ABD Localización. Función 
ACTN2 P35609 CH Citoplasmática, 
nuclear 
Enlace del 
citoesqueleto 
CLMN Q96JQ2 CH Citoplasmática, 
nuclear 
Desconocida 
COBL 075128 WH2 Citoplasmática, 
nuclear 
Nucleador de 
actina 
DAAM1, 
2 
Q9Y4D1, 
Q86T65 
FH2 Citoplasmática, 
nuclear 
Formina 
nucleadora de 
actina 
DIAPH1 O60610 FH2 Citoplasmática, 
nuclear 
Formina 
nucleadora de 
actina 
DMD P11532 CH Citoplasmática, 
nuclear 
Enlace del 
citoesqueleto 
DST Q03001 CH Citoplasmática, 
nuclear 
Enlace del 
citoesqueleto 
EZR/RDX 
/MSN 
P15311, 
P35241 
ERM Citoplasmática, 
nuclear 
Enlace del 
citoesqueleto, 
adhesiones 
focales 
FHOD3 Q2V2M9 FH2 Citoplasmática Formina 
nucleadora de 
actina 
FMN1 Q68DA7 FH2 Citoplasmática Formina 
nucleadora de 
actina 
FMNL2 Q96PY5 FH2 Citoplasmática, 
nuclear 
Formina 
nucleadora de 
actina 
HIP1 O00291 ERM, 
I/LWEQ 
Citoplasmática, 
nuclear 
Endocitosis 
30 
 
INF2 Q27J81 FH2 Citoplasmática, 
nuclear 
Formina 
nucleadora de 
actina 
JMY Q8N9B5 WH2 Citoplasmática, 
nuclear 
Nucleador de 
actina, 
transcripción 
MACF1 Q9UPN3 CH Citoplasmática Enlace del 
citoesqueleto 
MAL 
(MKL1) 
Q969V6 RPEL Citoplasmática, 
nuclear 
Transcripción 
NAV2 Q8IVL1 CH, 
I/LWEQ* 
Citoplasmática, 
nuclear 
Migración 
celular 
PHACTR 
1-4 
Q9C0D0, 
Q8IZ21 
RPEL Citoplasmática, 
nuclear 
Desconocida 
PLEC1 Q15149 CH Citoplasmática Enlace del 
citoesqueleto 
SPIR1 Q08AE8 WH2 Citoplasmática Nucleador de 
actina 
SPTB1 P11277 CH Citoplasmática, 
nuclear 
Enlace de 
citoesqueleto 
SYNE1 Q8NF91 CH Citoplasmática, 
nuclear 
Enlace de 
citoesqueleto, 
componente 
de la 
membrana 
nuclear 
TLN1 Q9Y490 ERM, 
I/LWEQ 
Citoplasmática Enlace de 
citoesqueleto, 
adhesiones 
focales 
UTRO P46939 CH Citoplasmática Enlace de 
citoesqueleto 
31 
 
WASF2, 
4 
Q9Y6W5, 
Q8IV90 
WH2* Citoplasmática Activador de 
ARP 2/3 
WASL O00401 WH2 Citoplasmática, 
nuclear 
Activador de 
ARP 2/3 
 
Tabla 1. Proteínas de unión a actina de humano que contienen una señal de localización nuclear. * 
denota dominios de unión a actina putativos (aun sin caracterizar). Abreviaciones (por sus siglas en 
inglés): ACTN2, Alpha-actinin 2; CLMN, Calmin; COBL, Cordon-bleu; DAAM, Disheveled-
associated activator of morphogenesis1; DIAPH1, Diaphanous homolog 1; DMD, Dystrophin; 
DST, Dystonin; EZR, Ezrin; RDX, Radixin; MSN, Moesin; FHOD3, Formin Homology Domain 
containing 3; FMN1, Formin 1; FMNL2, Formin-like 2; HIP1, Huntingtin-interacting protein 1; 
INF2, Inverted Formin 2; JMY. Junction mediating and regulatory protein; MACF1, Microtubule-
Actin Cross-Linking Factor 1 (Actin Cross-Linking Factor 7); MAL (MKL1), Myocardin-like 
protein 1; NAV2, Neuron Navigator 2; PHACTR, Phosphatase and actin regulator; PLEC1, Plectin; 
SPIR1, Spire; SPTB1, Beta-Spectrin; SYNE1, Nesprin-1 (SYNE1); TLN1, Talin 1; UTRO, 
Utrophin; WASF2, WASp-family 2 (WAVE2); WASL, N-WASP. 
Los dominios de union a actina son: FH2, Formin Homology 2 domain; CH, Calponin Homolgy 
domain; ERM, Ezrin/Radixin/Moesin domain; WH2, Wiscott-Aldrich Homology 2 domain (tabla 
tomada de Zuchero JB y cols., 2012). 
 
 
1.7. Transporte núcleocitoplasmático 
 
 En células eucariontes, el citoplasma y el núcleo se intercomunican mediante los 
complejos del poro nuclear ubicados en la membrana nuclear. Este proceso consiste en un 
transporte selectivo bidireccional de macromoléculas que ocurre a través de los complejos 
del poro nuclear (NPCs por sus siglas en inglés). Los complejos delporo nuclear permiten 
la difusión pasiva de iones y de algunas pequeñas proteínas, pero restringe el paso de 
grandes proteínas que no contengan señales apropiadas de localización que las dirijan hacia 
el núcleo. El poro nuclear es un complejo de aproximadamente 125 MDa, el cual está 
construido por una clase de proteínas llamadas nucleoporinas, las cuales contienen una 
serie de repeticiones de fenilalanina - glicina que conforman la parte central del canal de 
32 
 
transporte del poro. (Stewart,M y cols., 2001, Suntharalingam, M., & Wente, S.R. 2003., 
Tran, E.J., & Wente, S.R. 2006). 
 El poro nuclear permite la difusión pasiva de moléculas pequeñas, incluyendo iones 
y metabolitos, pero la difusión se vuelve ineficiente cuando el peso molecular se acerca a 
los 20-40 kDa. El transporte de proteínas de mayor tamaño entre el compartimento 
citoplasmático y nuclear es un proceso activo y facilitado por un grupo de proteínas 
acarreadoras específicas que son colectivamente llamadas carioferinas, las cuales se dividen 
a su vez en importinas y exportinas. La familia de las carioferinas β abarca alrededor de 14 
miembros en levaduras y 19 en humanos (Yuh M. Chook & Katherine E. Süel. 2011). 
Muchos receptores de transporte son llamados colectivamente β-carioferinas, porque la 
mayoría de ellos son miembros de la súper familia de las importinas β. Aunque las 
proteínas cargo pueden unirse directamente a las β carioferinas (Ying M y cols., 2007., 
Diana Palmeri & Michael H. Malim. 1999), la interacción entre las β carioferinas y el cargo 
es mediada por la importina α durante la importación al núcleo clásico. En la vía clásica de 
transporte núcleo- citoplasmático la importina α reconoce la NLS en la proteína cargo y se 
une a ésta, uniéndose después a la importina β. La importina β media la interacción de este 
complejo trimérico con el NPC, permitiendo así el transporte de este complejo hacia el 
núcleo. Una vez que el complejo se encuentra en el núcleo, el complejo es desasociado por 
la proteína Ran unida a GTP. La unión de RanGTP a la importina β causa un cambio 
conformacional que resulta en la liberación del complejo entre la importina α y la proteína 
cargo. 
 En contraste, en el proceso de exportación, RanGTP, la proteína cargo que contiene 
a la señal de exportación y la exportina se unen de manera cooperativa, resultando en un 
complejo que es transportado hacia el citoplasma; este complejo se recluta en la cara 
nuclear del NPC y, posteriormente, el complejo es traslocado hacia el citoplasma. En este 
compartimento celular, la proteína cargo es liberada cuando la molécula de GTP unida a la 
proteína Ran es hidrolizada (Lee BJ, y cols., 2006). Aunque las carioferinas de importación 
y exportación son muy grandes ( 100 kDa) pueden pasar a través del NPC libremente 
(Peters R. 2006). El diámetro de un NPC puede incrementar hasta 30 nm con la finalidad de 
permitir el paso a grandes y largos complejos. Una vez que el transporte ha sido 
33 
 
completado, la proteína cargo es liberada y los transportadores son reciclados (Boulo S y 
cols., 2007) (Figura 6). A continuación se describirán las señales de localización y 
exportación nucleares que permiten a diversas proteínas ser reconocidas por las carioferinas 
para ser movilizadas hacia el núcleo o fuera de este. 
 
Figura 6. Esquema que representa el sistema de transporte núcleocitoplasmático. Ciclo de tansporte 
que llevan a cabo las proteínas con NLS y NES. La proteína Ran genera el gradiente para que exista 
el transporte. Las importinas α y β transportan a las proteínas que contienen señales de localización 
hacie el núcleo y son recicladas hacia el citoplasma para realizar un nuevo ciclo de transporte. La 
proteína CRM1 forma un complejo con la proteína cargo que contiene una señal de exportación 
nuclear junto con la proteína Ran para ser exportado hacia el citoplasma, (tomado y modificado de 
Clarke PR y Zhang C. 2008). 
34 
 
1.8. Señales de localización nuclear 
 El primer paso de la importación nuclear ocurre cuando una importina discrimina 
entre su proteína cargo y otras proteínas de citoplasma. Por lo general, las proteínas 
destinadas a migrar hacia el núcleo contienen NLS, las cuales, son secuencias de 
aminoácidos reconocidas por las importinas. El transporte de proteínas hacia el núcleo fue 
demostrado inicialmente con la proteína nucleoplasmina y en el antígeno T largo del virus 
SV40. La NLS de la proteína nucleoplasmina, está conformada por dos bloques de 
aminoácidos con carga, separados por un espaciador (10-12 aminoácidos indistintos) 
155
KRPAATKKAGQAKKKK
170
 (Robbins J.,Dilworth y cols., 1991). A este tipo de señal 
se le conoce como NLS bipartita. La NLS del antígeno largo T del virus SV40 está 
compuesta por un bloque de aminoácidos positivamente cargados 
126
PKKKRRV
132
 
(Kalderon D. y cols., 1984). A este tipo de señal se le conoce como señal monopartita. En 
resumen, las señales monopartitas están compuestas por unos cuantos aminoácidos básicos, 
esencialmente lisinas o argininas, con una secuencia consenso (K/R)4-6. Las señales 
bipartitas contienen dos bloques de aminoácidos básicos, separados por 10 ó 12 
aminoácidos. La secuencia consenso de estas señales es: (K/R)2 X10-12 (K/R)3, (donde X 
representa cualquier aminoácido) (Jans DA y cols., 2000). Cabe señalar que aunque existan 
secuencias como las mencionadas anteriormente en una proteína, no necesariamente tienen 
una participación en la migración hacia el núcleo (Boulikas T 1994). Las NLSs mono y 
bipartitas son encontradas frecuentemente en varias proteínas de diversos organismos y son 
conservadas. Es por ello que se les llama señales de localización nuclear clásicas. Sin 
embargo, existen señales que no siguen el patrón anterior y son llamadas señales de 
localización no clásicas. 
1.9. Señales de localización nuclear no clásicas 
 
 Además de las señales de localización nuclear clásicas, muchas otras señales han 
sido reportadas como señales funcionales que permiten la importación de proteínas hacia el 
núcleo. Sin embargo, ninguna de ellas se ha encontrado de manera frecuente ni con un 
35 
 
patrón definido. En algunas de estas señales, existen una gran cantidad de aminoácidos que 
conforman una NLS. Tal es el caso de la señal M9, secuencia que se encuentra conformada 
por un fragmento de 38 aminoácidos, (rica en glicinas y contienen un bajo número de 
aminoácidos cargados positivamente) de las proteínas hNRNPA1 y A2 (Pollard VW y 
cols., 1996). Otros ejemplos de este tipo de señales son las secuencias KNS de la proteína 
hnRNP K (Michael WM y cols., 1997), la secuencia QXXXFXPM(X)5GXS de la proteína 
HUR (secuencia HNS de HUR) (Fan XC & Steitz JA.1998). En algunos casos, un 
segmento muy alargado de una proteína es identificado como su NLS, lo cual sugiere que el 
empaquetamiento tridimesional de la proteína completa es crítica para ser reconocidas por 
la importina β (Sorokin AV y cols., 2007). 
 Hasta ahora se ha descrito con que señales puede ingresar una proteína hacia el 
núcleo. Ahora se describirán las señales que permiten a una proteína ser exportada hacia el 
citoplasma desde el núcleo. 
1.10. Señales de exportación nuclear 
 Las señales de exportación nuclear (NES) son secuencias de aminoácidos básicos no 
polares que permiten a diversas proteínas ser exportadas hacia el citoplasma. La señal más 
común y mejor caracterizada es la NES hidrofóbica rica en leucina. Es un motivo no 
conservado con 3 ó 4 residuos hidrofóbicos, por ejemplo la secuencia LPPLERLTL. 
Diversos estudios de mutagénesis y computacionales han identificado una secuencia 
consenso φ-X(2-3)- φ-X(2-3)- φ-X- φ, en donde φ puede ser Lys, Val, Ile, Phe o Met y X 
representa cualquier aminoácido y los números en paréntesis representan el numero de 
aminoácidos que pueden haber (Fornerod M & Ohno M. 2002., La Cour T y cols., 2004). 
Aunque esta secuenciaes igual a varias NES reportadas, existen variaciones en esta señal. 
Las NES hidrofóbicas se han descubierto en muchos factores de transcripción y en 
reguladores de ciclo celular. Este tipo de señales fueron descubiertas en la proteína Rev del 
virus de inmunodeficiencia humana y el inhibidor de la proteína cinasa A (Fischer U y 
cols., 1995., Wen W y cols., 1995). Las exportinas reconocen a estas señales, permitiendo 
el transporte de las proteínas que contienen NES desde el núcleo hacia el citoplasma de las 
36 
 
proteínas que contienen estas señales. Estas NES son reconocidas por le exportina CRM1 
(también conocida como Xpo1). Como en el caso de la importina β1, la proteína CRM1 
puede mover diferentes substratos con o sin un adaptador. La proteína CRM1 unida a su 
proteína cargo no puede dejar el núcleo sin la asistencia de la proteína Ran. La proteína Ran 
unida a GTP se une de manera cooperativa a la proteína CRM1 para formar un complejo en 
el que se integra la proteína cargo, CRM1 y la proteína Ran. 
1.11. La proteína Ran 
 La proteína Ran es un factor crucial para el proceso de transporte 
nucleocitoplasmático (Moore M.S & Blobel G, 1993, Melchior F y cols., 1993). Esta 
proteína pertenece a la superfamilia de las GTPasas Ras. Los miembros de esta familia se 
encuentran unidos a GTP ó GDP, funcionando como un switch de apagado ó encendido. 
Los cambios estructurales que ocurren a la proteína Ran dependen del estado del nucleótido 
al cual se encuentran unido, los cuales, resultan en diferentes especificidades a sustratos 
(Scheffzek K y cols., 1995, Vetter I y cols., 1999a, 1999b). La energía para realizar el 
transporte núcleo - citoplasmático es provista por la proteína Ran, la cual tiene un ciclo 
entre su estado activo e inactivo (GTP/GDP). Una distribución asimétrica de Ran-GTP y 
Ran-GDP entre el núcleo y el citoplasma controla la importación y exportación de las 
proteínas cargo, y este gradiente es mantenido por varios elementos regulatorios asociados 
a Ran (Görlich D & Kutay U 1999). Ran-GTP se encuentra concentrada en el núcleo, 
mientras que Ran-GDP se encuentra concentrada en el citoplasma, así Ran puede 
comunicar direccionalmente el transporte nuclear actuando como un switch molecular que 
controla la unión y liberación de las proteínas cargo por compartimentalización. 
 En vías de importación, los substratos su unen a las β carioferinas de manera 
competitiva, permitiendo al substrato unirse en el citoplasma y ser liberado en el núcleo 
mediante Ran-GTP. En el citoplasma, una proteína cargo que contiene una señal de 
localización nuclear se une a una carioferina de importación en presencia de Ran GDP. El 
complejo de importación se une al NPC en la parte citoplásmica y entonces es translocado 
hacia el núcleo. Cuando se encuentra dentro del núcleo, la carioferina β se une a la 
37 
 
proteíma Ran-GTP y libera los substratos. Una vez liberados los componentes del complejo 
de transporte, la proteína cargo puede buscar su blanco nuclear específico (Clarke P & 
Zhang C 2008). En contraste, en las vías de exportación, Ran-GTP, substratos y las 
carioferinas β (exportinas) se unen cooperativamente, resultando en un complejo que se une 
en el núcleo y que es disociado en el citoplasma cuando el GTP de Ran-GTP es hidrolizado 
(Figura 6). Además de regular el transporte nucleocitoplasmático, hay dos funciones más en 
las que se ha visto involucrada la proteína Ran: el reensamble de la envoltura nuclear 
durante la mitosis y la formación del huso mitótico (Di Fiore y cols., 2004). La proteína 
Ran tiene una alta identidad en secuencia de aminoácidos entre organismos eucariontes, 
incluyendo los protozoarios, lo cual sugiere una función altamente conservada entre 
especies. 
 
 
 
 
 
 
 
38 
 
II. JUSTIFICACIÓN 
 En eucariontes superiores, la presencia de ABPs en el núcleo revela una 
multifuncionalidad de estas proteínas. Hasta ahora, la proteína EhNCABP166 es la única 
ABP reportada en el núcleo de E. histolytica. Esta proteína contiene 3 señales de 
localización nuclear y una señal de exportación nuclear. Las proteínas que contienen ambas 
señales, son capaces de ser transportadas continuamente hacia el citoplasma y hacia el 
núcleo teniendo funciones de regulación transcripcional o reguladoras de ciclo celular. El 
estudio de la funcionalidad de las NLS y de la NES de la proteína EhNCABP166 de E. 
histolytica y la determinación de las proteínas que interaccionan con la proteína 
EhNCABP166 nos ayudará a determinar la actividad de esta proteína en el núcleo. 
III. HIPÓTESIS 
 Si las señales de localización nuclear 1, 2 y 3 así como la señal de exportación 
nuclear presentes en la proteína EhNCBAP166 son funcionales, entonces la proteína 
EhNCABP166 puede tener actividades específicas tanto en el citoplasma como en el núcleo 
de E. histolytica. 
IV. Objetivos 
Objetivo general 
 Determinar la funcionalidad de las secuencias de localización y exportación 
nucleares presentes en la proteína EhNCABP166 y estudiar la función que a lleva a cabo la 
proteína en el núcleo de E. histolytica. 
 
39 
 
Objetivos particulares 
 Determinar la localización nuclear de la proteína EhNCABP166 en trofozoítos de E. 
histolytica cepa HM1:IMSS. 
 Evaluar si la secuencia NLS1 (369-KKIEELEKLVSVMKEKK-385), la NLS2 (746-
KKQIEIIKNDNEKERKN-762) y la NLS3 (1005-KKQLENENEIIKKENKK-
1021), así como la NES (1336-LFNSLAL-1342) están implicadas en el transporte 
nucleocitoplasmático de la proteína EhNCABP166. 
 Estudiar la localización subcelular individual de los dominios transfectados ABD, 
BAR1,GBD/FH3 y BAR2 así como la región C-terminal de la proteína 
EnNCABP166. 
 Determinar si la mutación de las lisinas K369A, K370A ubicadas en el dominio 
BAR1, las lisinas K746A, K747A ubicadas en el dominio GBD/FH3 y las lisinas 
K1005A y K1006A ubicadas en la región C-terminal afectan el transporte hacia el 
núcleo de la proteína EhNCABP166 
 Conocer las proteínas nucleares con las que la proteína EhNCABP166 pudiera estar 
interaccionando en el núcleo de trofozoítos de E. histolytica. 
 Determinar la presencia de la proteína Ran en extractos totales de E. histolytica. 
 
 
 
 
 
 
 
40 
 
V. MATERIALES Y MÉTODOS. 
5.1 Cultivo celular de cepas de bacterias y de E. histolytica. 
5.1.1. Cultivo de Escherichia coli. 
 Para las técnicas de clonación y expresión se utilizaron las cepas de E. coli DH5 o 
XL-BLUE dependiendo del vector. Las bacterias competentes fueron mantenidas a –80° C 
en glicerol al 50% y cuando se necesitaron fueron descongeladas. 
 
5.1.2. Cultivo de E. histolytica. 
 La cepa patógena de E. histolytica HM1: IMSS se cultivó axénicamente en medio 
de cultivo TYI-S-33 (Diamond y cols., 1978), suplementado con 20% de suero de bovino 
adulto previamente inactivado con calor durante 30 min a 60 °C y 3% de la mezcla de 
vitaminas de Diamond (Special Diamond Vitamin Mixture, North American Biologicals). 
Para todos los experimentos se utilizó un cultivo de amibas en fase logarítmica de 
crecimiento. 
5.2. Técnicas de bioinformática 
5.2.1. Multialineamiento de las NLSs de EhNCABP166 
 Se realizó un multi alineamiento de las NLS y NES de la proteína EhNCABP166 
para determinar la homología con señales previamente reportadas en otros sistemas 
celulares. Las secuencias utilizadas para el multi alineamiento de las NLS fueron: la señal 
de localización nuclear de la proteína nucleoplasmina, la señal de localización nuclear de la 
IL-5 humana y la proteína MAPKAP cinasa 2. Para el multi alineamiento de la señal de 
exportación su usaron las secuencias de las NES de las proteínas DcpS de humano, Rad24 y 
la proteína Rex del virus de leucemia del las células T de humano (HTLV-1rex). Los multi 
alineamientos se hicieron utilizando el programa computacional ClustalX con las opciones 
predefinidas. El multi alineamiento fue editado con el programa computacional