Analisis-molecular-del-patron-de-inactivacion-del-cromosoma-X-en-familias-con-distrofias-retinianas-hereditarias-recesivas-ligadas-al-cromosoma-X

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA 
DE MEXICO 
PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMEDICAS 
FACULTAD DE MEDICINA 
DIVISION DE ESTUDIOS DE POSGRADO 
ANÁLISIS MOLECULAR DEL PATRÓN DE INACTIVACIÓN DEL 
CROMOSOMA X EN FAMILIAS CON DISTROFIAS RETINIANAS 
HEREDITARIAS RECESIVAS LIGADAS AL CROMOSOMA X 
MEXICO, D.F. 
T E s I s 
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE: 
DOCTOR EN CIENCIAS 
PRESENTA 
Q.F.B. HECTOR JAVIER PEREZ CANO 
TUTOR: DR. JUAN CARLOS ZENTENO RUIZ 
COMITÉ TUTORIAL: 
DR. RAMON MAURICIO CORAL VAZQUEZ 
DR. HUGO QUIROZ MERCADO 
2011 
 
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Esta tesis se realizó en la Unidad de Investigación del Instituto de 
Oftalmología Conde de Valenciana Fundación I.A.P. bajo la 
dirección del Dr. Juan Carlos Zenteno Ruíz y el comité tutorial 
formado por el Dr. Ramón Mauricio Coral Vázquez y el Dr. Hugo 
Quiroz Mercado.
Jurado asignado:
Presidente: Dr. Juan Pablo Méndez Blanco
Secretario Dr. Juan Carlos Zenteno Ruíz
Vocal Dr. Rubén Burgos Vargas
Vocal Dr. Héctor Mayani Viveros
Vocal Dra. Teresa Tusie Luna
A LA MEMORIA DE MI QUERIDO HERMANO:
CARLOS ALEJANDRO PEREZ CANO†
(21 DE ABRIL DE 1973 - 06 DE NOVIEMBRE DE 2009)
“LIFE IS WHAT HAPPEND TO YOU
 WHILE YOUR BUSY MAKing OTHER PLANS”
JOHN LENNON
A
Agradecimientos
A MI ESPOSA QUE SIEMPRE ESTUVO A MI LADO DESDE QUE COMENCE ESTE PROYECTO HASTA EL FINAL Y 
QUE SIN LUGAR A DUDAS LO HIZO CON AMOR. MUCHAS GRACIAS CLAUDIA FIGUEROA GODINEZ POR LA 
PACIENCIA Y EL AMOR QUE ME BRINDAS. Te amo.
A MIS PADRES, FIDELIA CANO LASTRA Y CARLOS PEREZ HERNANDEZ, por darme la vida, por 
apoyarme y por todo lo que me han dado durante el transcurso de mi existencia. eSPERO 
QUE ESTEN ORGULLOSOS DE SUS HIJOS. Los quiero mucho.
A MIS HERMANOS:
Maria de Lourdes perez cano (Lulú), hermanita mi más grande y querida amiga, gracias 
por estar conmigo siempre, por ayudarme tanto y sobre todo por creer y confiar en mi. Te 
quiero mucho
Carlos Alejandro perez cano†, hermano, gracias por enseñarme a no tener miedo de nada 
y de nadie, pero sobre todo por enseñarme a luchar en las circunstancias mas adversas.
Nestor Daniel perez cano, mi gran ejemplo. Gracias por toda la ayuda que me has 
brindado, espero que estes orgulloso de mi tanto como yo de ti
Angel Rogelio perez cano, mi pequeño, quiero que sepas que eres mi gran amigo. Gracias 
por brindarme tu confianza, sigamos adelante hermano
Gracias por confiar y creer en mí, por su apoyo y ayuda, los quiero mucho.
A mi tio Rogelio cano lastra por creer siempre en mi
B
A mis sobrinos Jorge Alberto Eguiluz Pérez, Hania Yurline Eguiluz Pérez, Julio Adrián 
Eguiluz Pérez, Daniela Luna Figueroa, David Luna figueroa y Leo Rodriguez Figueroa. Los 
quiero mucho mis niños
Sra. Ines Godínez, Y A TODA LA FAMILIA FIGUEROA GODINEZ (Ines, Paty, Luz, Raul, PEPE, ESTELA, 
Y CARLOS) gracias por aceptarme en su familia.
Al QFB Rodrigo Suarez Ríos, por su apoyo y amistad que me ha brindado, gracias químico
A mis amigas y amigos que siempre tienen una palabra de aliento cuando más lo necesito, 
por sus palabras, consejos y regaños pues me han dado el apoyo necesario para seguir 
adelante. Gracias por aparecerse en mi vida y también por cruzarse en mi camino:
Argelia sujei HG, Argelia (MONSE), LIDIA, olga Tamayo, Adelita, Cintia, ana luisa, Susana 
muñoz, elizabet mendoza, Jesica n, AIDA, LINDA, nadia luz, mariana, verito, Edith, Claudia 
jimenez, Rosalinda velazquez, Cecilia reyna, lupita rivera, Maybelin L, Prisca, Kika, Liz, 
Jess, DOLORES.
Rodrigo Suarez, Roberto delgado, YONATHAN GARFIAS (master mix), francisco vences, OSCAR 
Chacón, JAIME CASTRO, Raymundo Ruiz, Jorge ramos, Gerardo garcia quinto, CHUY 
hernandez, Alex Pérez, Agustin, Gilberto Cardoso, Ricardo cervantes, David Rivera, 
vicente correa, Raul Ayala, Jonathan Quevedo, victor, Carlos Pantoja, carlos lopez.
“la amistad solo puede tener lugar a través del desarrollo del respeto mutuo y dentro 
de un espíritu de sinceridad”
Dalai lama
C
A eva Vargas por su valiosa ayuda en todos los trámites realizados durante el 
doctorado
A la unidad de investigación del instituto de oftalmología conde de valenciana por todo 
el apoyo brindado para la realización de esta tesis
Dr Juan Carlos Zenteno Ruiz, Dr. Yonathan garfias, dra. Maricarmen jimenez, dra Herlinda 
mejia y dr victor m. bautista
A los miembros del jurado
Dr. Juan pablo mendez blanco, dr. Juan carlos zenteno, dr. Ruben burgos, dr. Hector 
mayani y dra. Teresa tusie
D
INDICE
Dedicatoria y agradecimientos………………………………………………………… A
Índice……………………………………………………………………………………... I
Resumen…………………………………………………………………………………. III
Abstract…………………………………………………………………………………... IV
Antecedentes……………………………………………………………………………. 1
Inactivación del cromosoma X………………………………………………………… 1
Centro de inactivación del cromosoma X……………………………………….……. 9
Metilación de los sitios CpG del cromosoma X…………………………………....... 11
Inactivación sesgada o no al azar del cromosoma X …………………………........ 13
Patrón de inactivación del X relacionado con la edad………………………………. 16
Distrofias retinianas……………………………………………………………….......... 17
Distrofias retinianas de bastones o periféricas………………………………………. 18
Distrofias retinianas de conos o centrales……………………………………………. 18
Distrofias retinianas sindrómicas……………………………………………………… 18
Distrofias retinianas recesivas ligadas al X…………………………………………... 19
Coroideremia………………………………………………………………………......... 21
Retinosquisis ……………………………………………………………………………. 22
Planteamiento del problema…………………………………………………………… 24
Hipótesis…………………………………………………………………………………. 25
Objetivo ………………………………………………………………………………….. 26
Objetivos particulares…………………………………………………………………... 26
Material y métodos……………………………………………………………………… 27
Análisis genealógico……………………………………………………………………. 27
Análisis clínico…………………………………………………………………………… 27
Extracción de DNA ……………………………………………………………………... 27
Amplificación por PCR………………………………………………………………….. 28
Purificación del producto de PCR……………………………………………………... 30
I
Secuenciación nucleotídica……………………………………………………………. 31
Análisis del patrón de inactivación del X……………………………………………... 32
Patrón de inactivación del cromosoma X…………………………………………….. 36
Resultados……………………………………………………………………………….. 38
Análisis Molecular del gen CHM y Determinación del Patrón 
de Inactivación del Cromosoma X en Dos Familias con Coroideremia…………... 38
Artículo “CHM Gene Molecular Analysis and X-Chromosome Inactivation 
Pattern Determination in Two Families With Choroideremia”……………………… 46 
Análisis Molecular del gen RS1 en pacientes con retinosquisis y Determinación 
del Patrón de Inactivación del Cromosoma X en una Familia con 
Retinosquisis…………………………………………………………………………….. 53
Discusión………………………………………………………………………………… 60
Conclusiones…………………………………………………………………………….. 66
Bibliografía.………………………………………………………………………………. 67
Anexo 1. Mutaciones en el gen CHM…………………………………………………. 86
Anexo 2. Mutaciones en el gen RS1………………………………………………….. 92
Anexo 3. Carta de consentimiento informado ………………………………………. 101
II
Resumen
La inactivación del cromosoma X es un proceso que consiste en el silenciamiento de uno de los 
dos cromosomas X presentesen células somáticas femeninas con el objeto de compensar la 
dosis de expresión de los genes localizados en el X entre ambos sexos. Como resultado, la mujer 
es un mosaico de expresión de genes localizados en el cromosoma X. Una consecuencia directa 
es que una mujer heterocigota para una mutación recesiva en un gen ligado al X manifestará el 
alelo mutante en aquellas células en las que se haya inactivado el cromosoma X con el alelo 
normal. El proceso de inactivación del X es un proceso complejo en el que participan diversos 
mecanismos moleculares epigenéticos, tanto en su iniciación como en su mantenimiento, 
controlados por el centro de inactivación del X (XIC) localizado en Xq13. Cuando la inactivación es 
preferencial hacia uno de los dos cromosomas X, entonces ocurre un fenómeno conocido como 
patrón de inactivación del X sesgado. De este modo, algunas enfermedades recesivas ligadas al X 
pueden manifestarse en mujeres debido al sesgo desfavorable en el patrón de inactivación del 
cromosoma X. En las distrofias retinianas recesivas ligadas al X, clásicamente solo varones están 
afectados y las mujeres son portadoras que no manifiestan sintomatología ocular. Sin embargo, se 
han descrito casos en la literatura de familias con patrones recesivos ligados al X en las que 
existen una o más mujeres afectadas. No existen reportes que relacionen el patrón de inactivación 
del X con el fenotipo de mujeres portadoras de distrofias retinianas recesivas ligadas al 
cromosoma X. El objetivo del presente trabajo fue identificar si existe una relación entre el patrón 
de inactivación del cromosoma X y la presencia de manifestaciones clínicas en mujeres 
portadoras de distrofias retinianas hereditarias recesivas ligadas al cromosoma X. Se describen 
los hallazgos clínicos y moleculares de dos familias mexicanas con coroideremia. Se identificó en 
el gen CHM una mutación nueva (S468X) y otra previamente descrita (R270X). En la familia 1 se 
identificó una heterocigota de 70 años de edad que manifestó características de la enfermedad, 
comparables a las observadas en varones con coroideremia. El análisis de su patrón de 
inactivación no demostró inactivación desfavorable, es decir, se identificó un patrón de 
inactivación al azar de sus 2 cromosomas X. En contraste, una heterocigota de 24 años en la 
familia 2 que presentó datos retinianos de la enfermedad, demostró un patrón sesgado de 
inactivación. Sin embargo, análisis adicionales permitieron reconocer que el cromosoma X 
preferencialmente inactivado en sus leucocitos es el que porta el alelo mutante de coroideremia. 
En conjunto, estos resultados indican que, al menos en las dos familias analizadas en este 
trabajo, no existe asociación entre un patrón no al azar de inactivación y un fenotipo retiniano 
específico en mujeres heterocigotas para mutaciones de coroideremia. Además de las dos 
familias con coroideremia, el estudio incluyó un caso familiar de otro tipo de distrofia retiniana 
ligada al X conocida como retinosquisis. El estudio molecular del gen RS1 permitió el 
reconocimiento de la mutación G626A en un paciente varón. Su madre y una hermana 
presentaron la mutación en estado heterocigoto, confirmando su estado de portadoras. Se realizó 
la determinación del patrón de inactivación del cromosoma X. Los resultados indicaron que ambas 
mujeres presentaban una inactivación sesgada, sin embargo, el cromosoma más frecuentemente 
afectado era el mutante. De este modo, los resultados obtenidos no permiten apoyar una 
participación del fenómeno de inactivación del X en el fenotipo de mujeres portadoras de 
retinosquisis. Un hallazgo interesante en el estudio de esta familia fue el de un evento de 
recombinación en la meiosis materna que dificultó el análisis de segregación familiar de la 
mutación.
III
Abstract
The X chromosome inactivation is a process which consists of the silencing of one of the two X 
chromosomes present in female somatic cells to compensate for the dose of expression of the 
genes located on the X between male and female. A direct consequence is that a female 
heterozygous for a recessive mutation in an X-linked gene will manifest the mutant allele in those 
cells in which the X chromosome with the normal allele has been inactivated. The process of X-
inactivation is a complex process involving several epigenetic molecular mechanisms, both in its 
inception and in their maintenance, controlled by the X inactivation center (XIC) located on Xq13. 
When the inactivation is preferential to one of the two X chromosomes, then occurs a phenomenon 
known as skewed X inactivation pattern. Thus, some X-linked recessive diseases can manifest in 
women due to the unfavourable bias in the X-chromosome inactivation pattern. In the X-linked 
recessive retinal dystrophies women are carriers who do not express eye symptoms. However, 
familial cases have been described in which one or more women are affected. There are no 
reports that relate the X inactivation pattern with the phenotype of women carriers of X-linked 
recessive retinal dystrophies. The objective of this study was to identify if there is a relationship 
between the X chromosome inactivation pattern and the presence of clinical manifestations in 
female carriers with X-chromosome linked recessive hereditary retinal dystrophies. The clinical and 
molecular findings of two Mexican families with choroideremia are described. A new mutation 
(S468X) and another previously described one (R270X) were identified in the CHM gene. A 
heterozygote of 70 years of age which expressed characteristics of the disease, comparable to 
those observed in males with choroideremia was identified in family 1 . The analysis of inactivation 
pattern showed no skewed inactivation, and identified a random pattern of inactivation. In contrast, 
a heterozygote of 24 years in the Family 2 who presented retinal disease data, showed a skewed 
pattern of X inactivation. However, additional analysis allowed to recognize that the X chromosome 
preferentially inactivated in their white blood cells is that carrying the mutant allele of 
choroideremia. Together, these results indicate, at least in two families analyzed in this paper, 
there is no association between X inactivation pattern and a specific retinal phenotype in women 
heterozigous for mutations of choroideremia. In addition to the two families with choroideremia, the 
study included a case family of another type of retinal dystrophy X-linked known as retinoschisis. 
Molecular study of the RS1 gene allowed the recognition of the G626A mutation in a male patient. 
His mother and sister presented the mutation in heterozygous condition, confirming his status of 
carriers. The X chromosome inactivation pattern was determinate. The results indicated that both 
women had a skewed inactivation, however, the most frequently affected chromosome was the 
mutant. In this way, the results do not allow supporting involvement of the phenomenon of X 
inactivation in the phenotype of women carriers of retinoschisis. An interesting finding in the study 
of this family was an event of recombination in maternal meiosis which difficulted family 
segregation analysis.
IV
INTRODUCCION
Antecedentes
Inactivación del cromosoma X.
La información genética de los humanos se localiza en el núcleo celular, organizada y 
compactada en estructuras conocidas como cromosomas. Cada célula somática contiene 23 
pares de cromosomas de los cuales 22 son autosomas y uno de ellos es conocido como par 
sexual, XX en la mujer y XY en el hombre1, 2. Existe una gran diferencia en el contenido 
genético entre el X y el Y ya que el cromosoma X contiene cerca de 1100 genes mientras 
que el cromosomaY contiene aproximadamente 200 genes. En las mujeres uno de los 
cromosomas X se condensa formando un cuerpo cromatínico conocido como corpúsculo de 
Barr. En las hembras el cromosoma X condensado es transcripcionalmente inactivo. Este 
proceso por el cuál uno de los cromosomas X se inactiva de forma aleatoria y permanente en 
las células somáticas se conoce como inactivación del cromosoma X o Lyonización. El 
resultado de la inactivación es que hombres y mujeres tendrán la misma dosis de productos 
(polipéptidos o RNAs) codificados por genes ligados al X3-6.
La inactivación del cromosoma X es un proceso que ocurre en todos los mamíferos y que 
consiste en el silenciamiento selectivo de los alelos de uno de los dos cromosomas X 
presentes en células somáticas femeninas con el objeto de compensar la dosis de expresión 
de los genes localizados en el X entre ambos sexos 7-9. 
1
La inactivación del cromosoma X presenta diversas particularidades entre ellas la de ser 
aleatoria, lo que significa que el cromosoma X inactivado en cada célula puede ser el de 
origen paterno o el de origen materno10-12. 
El cromosoma X inactivo se distingue del cromosoma X activo por las siguientes 
características:
1. Inactivación transcripcional extensa (Solo algunos genes ligados al X escapan a la 
inactivación.)
2. Condensación de la heterocromatina en la interfase del ciclo celular (cuerpo de Barr)
3. Replicación tardía durante la fase S
4. Metilación del DNA de los residuos de citosina en los sitios CpG
5. Hipoacetilación de la histona H4
6. Expresión del gen Xist localizado en el centro de inactivación del X, en Xq13
Otra característica importante es que la inactivación del cromosoma X es clonal ya que una 
vez establecida la inactivación en un X particular (el de origen materno o el de origen 
paterno), ésta será mantenida y todos los descendientes de tal célula inactivarán siempre 
ese mismo cromosoma X13-15 (Figura 1).
2
Figura 1. El patrón de inactivación del cromosoma X es un proceso aleatorio y clonal en el 
cuál la célula en su estadio de blastocisto temprano inactiva uno u otro cromosoma X y sus 
descendientes inactivarán siempre el mismo X. (En la figura, Xp= X paterno, Xm= X materno y 
el X inactivo se representa como un punto rojo y negro para el materno y el paterno 
respectivamente)
3
Embrión
Blastocisto 
temprano
Tejidos 
Aunque la inactivación del X es aleatoria, en estadios muy tempranos del desarrollo todas las 
células sufren una inactivación temprana del cromosoma X derivado del padre en el estadio 
de embrión de 2 a 4 células. Los tejidos extraembrionarios, que darán origen a la placenta, 
retienen esta inactivación temprana por lo que en estos tejidos solo el cromosoma X materno 
será activo.
En la etapa de blastocisto temprano, esta inactivación inicial exclusivamente del X paterno es 
revertida en las células de la masa celular interna (que darán origen al embrión) y en estas 
células ambos cromosomas X se vuelven activos otra vez. Después, cada una de estas 
células independientemente y de manera aleatoria inactiva un cromosoma X. Este evento es 
irreversible durante la vida de la célula (Figura 2).
4
Figura 2. Los rectángulos rojos representan el cromosoma X materno (M), los rectángulos 
azules representan el cromosoma X paterno y en blanco los cromosomas X perteneciente a 
la línea germinal de los cuáles toda marca epigenética ha sido borrada. Los cromosomas X 
activos e inactivos están indicados como Xa y Xi respectivamente. Los cromosomas X en el 
cigoto (a) son potencialmente activos. La inactivación del cromosoma X paterno improntado 
se establece en todas las células durante la preimplantación (representado con cruces en el 
estado de blastocisto) (b). esta inactivación se mantiene en la placenta y otros tejidos 
extraembrionarios (c) pero es revertida en el tejido embrionario (d). La inactivación del 
cromosoma X al azar se establece en las células embrionarias (e) y se mantiene hasta la 
etapa adulta excepto en el desarrollo de células germinales (f) en donde los cromosomas X 
son reprogramados y no se sabe aún cuando se establece la impronta como marca 
diferencial del cromosoma X paterno (g). Modificada de Nature Reviews Genetics 6, 403-410 
(May 2005)
5
La inactivación del X representa un silenciamiento transcripcional que no conlleva ningún 
cambio en la secuencia de bases del DNA, sino que tan solo afecta a la expresión de los 
genes localizados en tal cromosoma. Como resultado, la mujer es un mosaico de expresión 
de los genes localizados en el cromosoma X, pues tiene líneas celulares en las que solo el 
cromosoma X paterno está activo y líneas celulares en las que solo el X heredado de la 
madre está activo11,16, 17. Sin embargo, no todos los genes del cromosoma X son inactivados, 
pues existen algunos que escapan de la inactivación y estos se localizan principalmente en el 
brazo corto, en la región pseudoautosómica.18-25 En la Tabla 1 se muestran algunos genes 
que escapan a la inactivación. Mediante la aplicación de técnicas más sofisticadas de 
biología molecular tal como los microarreglos, se han identificado recientemente otros genes 
del cromosoma X que escapan a la inactivación y que también se localizan en la región 
pseudoautosómica22, 23.
6
Tabla 1. Algunos genes localizados en PAR1 del cromosoma X que escapan a la inactivación
Símbolo del gen Símbolo alternativo Proteína Ref.
PLCXD1:Fosfatidilinositol 
fosfolipasa C específica.
FLJ11323 Función desconocida 26, 28
GTPBP6: Proteína 6 de 
unión a GTP
PGPL Función desconocida 29
PPP2R3B: Fosfatasa 
proteica 2 subunidad B 
regulatoria
PPP2R3L
Proteína PR48
Ejerce control regulatorio sobre la iniciación de la 
replicación del DNA. La sobreexpresión de PR48 
causa detención del ciclo celular en fase G1
30
SHOX: short stature 
homeobox
PHOG, GCFX, SS, 
SHOXY
Factor de transcripción relacionado a síndromes 
con talla baja
31, 32
CRLF2: receptor de 
citocinas 
CRL2, TSLPR Receptor de la proteína TSLP, una citocina que 
está involucrada en el proceso de maduración de 
las células dentríticas y promueve la proliferación 
de células T CD4+
33-36
CSF2RA: Receptor del 
factor 2 estimulante de 
colonias, alfa
CD116, GMCSFR La subunidad alfa del receptor para el factor 
estimulante de colonias de granulocitos-
macrófagos (GM-CSF). GM-CSF es importante 
para el crecimiento y diferenciación de 
eosinófilos y macrófagos en la médula ósea, 
también regula la viabilidad en embriones 
humanos
37–43
IL3RA: receptor de 
interleucina 3, alfa
CD123 Subunidad alfa de los receptores para 
interleucina 3
44, 45
SLC25A6:Familia 25 de 
acarreador soluble, miembro 
A6
ANT3, ANT3Y, 
MGC17525
Miembro de la familia traslocasa, el cual tiene un 
papel potencial en la sobrevivencia y la 
homeostasis inmunocelular
46-48
ASMTL: proteína parecida a 
la acetilserotonina O-metil 
transferasa
ASMTLX Función desconocida 49
P2RY8: Receptor 8 
purinérgico P2Y, acoplado a 
proteína G
P2Y8 Receptor de purina. Miembro de la familia de 
receptores transmembranales acoplados a 
proteína G
50
CXYorf3 XE7, XE7Y, 
DXYS155E, 
MGC39904, 
antígeno de 
superficie 721P de 
linfocito B, X-
escapee, CCDC133
Regulador de splicing alternativo 51, 
52, 53
ASMT: acetilserotonina O-
metiltransferasa
HIOMT, ASMTY, 
HIOMTY
Cataliza la reacción final en la síntesis de 
melatonina
47, 54
DHRSXY: deshidrogenasa / 
reductasa ligado al X
DHRS5X, 
DHRS5XY, DHRSY, 
DHRS5Y
Codifica una oxidoreductasa de cadena corta de 
la familia deshidrogenasa/reductasa
55
ZBEDI: dedo de zinc TRAMP, ALTE, 
KIAA0785
Se sugiere que está involucrada en la 
transposición de otros elementos transponibles
56
CD99: molécula CD99 MIC2, antígeno 
CD99
Es una molécula de superficie involucrada enlos 
procesos de adhesión de células T
57-58
XG: grupo sanguíneo XG PBDX, “grupo 
sanguíneo XG
El gene del grupo sanguíneo XG genera un 
antígeno de superficie 48% homólogo a CD99
59, 60
7
Los cromosomas X y Y provienen de un par de cromosomas ancestrales idénticos que a 
través de la evolución fueron perdiendo su homología resultando en la degradación 
progresiva del cromosoma Y por lo que ahora, este cromosoma es mucho más pequeño que 
el cromosoma X 21, 25. En los cromosomas X y Y existen dos regiones que aún conservan su 
homología y a las que se conoce como regiones pseudoautosómicas (PAR). Las regiones 
pseudoautosómicas (PAR1 y PAR2) son regiones cortas homologas que se comportan como 
autosomas y se recombinan durante la meiosis masculina. PAR1 se localiza en el extremo 
distal del brazo corto y comprende 2.6Mb mientras que PAR2 se localiza en el extremo distal 
del brazo largo y comprende tan solo 320Kb24 (Figura 3).
Figura 3. Cromosomas sexuales en los que se muestra la localización de las regiones 
homologas conocidas como PAR1 y PAR2
8
La secuenciación completa del cromosoma X ha permitido caracterizar los genes que se 
localizan en las regiones PAR1 y PAR2. La homología entre el cromosoma X y Y en la región 
PAR1 se mantiene por recombinación obligatoria en la meiosis masculina. Los loci en esta 
región están presentes en dos copias tanto en el hombre como en la mujer. Actualmente se 
conoce que los genes localizados en PAR1 no están sujetos a compensación de dosis 
génica ya que escapan a la inactivación del X24, 26. (Tabla 1)
Centro de inactivación del cromosoma X.
El proceso de inactivación del cromosoma X es un proceso complejo en el que participan 
diversos mecanismos moleculares epigenéticos tanto en su iniciación como en su 
mantenimiento. Existe una región en este cromosoma conocida como centro de inactivación 
del X (XIC) que se localiza en Xq13 y controla la iniciación y propagación de la inactivación18, 
19 (Figura 4).
Figura 4. Localización del centro de inactivación del X (CIX) en el brazo largo del cromosoma 
X (Xq13).
9
Dentro de la región XIC se localiza el gen XIST (X Inactive Specific Transcript) que codifica 
para un RNA denominado Xist el cual se transcribe únicamente a partir del alelo situado en el 
cromosoma X que será inactivado. Este RNA se propaga hacia arriba y abajo envolviendo al 
cromosoma X y actúa como una señal de inactivación silenciando a los genes que se 
encuentran en él (inactivación en cis). La acumulación de este RNA se regula al transcribirse 
el gen TSIX localizado en el mismo centro XIC el cual codifica un RNA antisentido llamado 
Tsix y que es complementario a Xist. El Tsix forma dímeros con el Xist en exceso evitando 
así su acumulación9, 19, 61-63 (Figura 5).
Figura 5. El centro de inactivación del cromosoma X (CIX) controla el silenciamiento a través 
del gen XIST, transcribiendo el RNA Xist (A) que envuelve al cromosoma X que será 
inactivado; el acúmulo de este RNA se regula mediante la transcripción del RNA 
complementario Tsix a partir del gen TSIX (B y C). Los dímeros Xist/Tsix serán eliminados 
por RNAsas (D).
10
Metilación de los sitios CpG del cromosoma X
A pesar de que XIST participa en el inicio de la inactivación del cromosoma X, este RNA 
tiene un papel menor en el mantenimiento del proceso. Una vez establecida la inactivación 
del cromosoma X por el XIC, se activa otro mecanismo epigenético para el mantenimiento 
del silenciamiento de los genes en el X. Este mecanismo consiste en la metilación de la 
citosina en la posición del carbono 5 en los sitios CpG ("islas CpG") de las regiones 
promotoras para regular negativamente la transcripción génica. La metilación de los sitios 
CpG está mediada por las enzimas DNA-metil-transferasas (DNMT) y el proceso de 
metilación se mantiene después de la replicación del DNA por un mecanismo en el cual las 
DNMT reconocen los sitios hemimetilados. Las DNMT no reconocen las cadenas de DNA no 
metiladas del cromosoma X activo por lo que los sitios CpG son mantenidos sin metilación64.
La metilación del DNA es un proceso epigenético regulador de la expresión génica que actúa 
de dos maneras: la primera es una acción directa que impide la unión de factores de 
transcripción a secuencias de DNA específicas; la segunda actúa indirectamente al cambiar 
el arreglo estérico propiciando la estructura "cerrada" de la cromatina. En general se 
considera que la metilación es un proceso unidireccional, de tal manera que, cuando una 
secuencia CpG adquiere metilación de novo, esta modificación se hace estable y es 
heredada como un patrón de metilación clonal 64-66 (Figura 6).
11
Figura 6. La inactivación del cromosoma X se mantiene por metilación de los sitios CpG (A) 
en el carbono 5 de citosinas presentes en las “islas” CpG. (B y C) Las DNMT reconocen 
también los sitios hemi metilados de las cadenas de DNA obtenidas después de la 
replicación. Los sitios CpG del cromosoma X activo permanecen sin metilación ya que no son 
reconocidas por las DNMT. 
12
Inactivación sesgada o no al azar del cromosoma X
La inactivación del cromosoma X es un evento epigenético modulador de la expresión de 
genes ligados al X en células femeninas en las que solo un cromosoma X permanece activo. 
Este fenómeno, como ya fue mencionado, ocurre de manera aleatoria por lo que 
teóricamente la mitad de las células de un tejido femenino particular inactivarán el X paterno 
y la otra mitad el X materno, es decir una proporción 50:50. Si la inactivación es preferencial 
hacia uno de los dos cromosomas X, entonces ocurre un fenómeno conocido como patrón de 
inactivación del X sesgado o Lyonización desfavorable del cromosoma X 67-70. 
Una consecuencia directa del fenómeno de inactivación del cromosoma X es que una mujer 
heterocigota para una mutación recesiva en un gen ligado al cromosoma X manifestará el 
alelo mutante en aquellas células en las que se haya inactivado el cromosoma X con el alelo 
normal. De este modo, algunas enfermedades recesivas ligadas al X pueden manifestarse en 
mujeres debido al sesgo desfavorable en el patrón de inactivación del cromosoma X. Debido 
al fenómeno de inactivación, la variación clínica en la expresión de trastornos recesivos 
ligados al X en heterocigotas puede ser extrema, desde individuos normales hasta individuos 
con manifestaciones completas de la enfermedad 71. 
En 1992 Allen et al72 describieron una técnica para la determinación del patrón de 
inactivación del cromosoma X la cual está basada en una PCR para el exón 1 del gen del 
receptor androgénico (AR) metilado. Este exón presenta un sitio polimórfico de un repetido 
CAG que incluye de 10 a 40 tripletes y en el que se encuentran islas CpG adyacentes 
además de sitios de corte de la enzima de restricción HpaII, sensible a metilación y que corta 
13
solamente secuencias de DNA no metiladas. Cuando un DNA de un sujeto femenino se ha 
sometido a una digestión con la enzima HpaII y se realiza una PCR para el repetido del gen 
del receptor de andrógenos, se amplificará solo el alelo localizado en el cromosoma X 
metilado o inactivado. Después, se realiza una electroforesis en gel de poliacrilamida para 
analizarlo por densitometría y calcular la relación de inactivación de cada uno de los X. Esta 
técnica ha sido modificada utilizando herramientas actuales de biología molecular tales como 
la electroforesis capilar y marcadores fluorescentes, lo que permite un mejor análisis para la 
determinación del patrón de inactivación del cromosoma X en padecimientos en los que el 
fenómeno de inactivación sesgada era solamente una especulación72. 
El fenómeno de inactivación sesgada del X, se ha descrito en varios trastornos recesivosligados al cromosoma X. En 1992 Jorgensen y colaboradores estudiaron el caso de dos 
mujeres gemelas monocigóticas y heterocigotas obligadas para deuteroanomalía asociada 
con un gen de fusión verde-rojo derivado de su padre deuteroanómalo70. Identificaron que 
una de las gemelas era fenotípicamente deuteroanómala mientras que la otra tenía una 
visión normal al color. Después de realizar el estudio del patrón de inactivación del 
cromosoma X encontraron que la gemela con la alteración visual tenía un sesgo en el patrón 
de inactivación del X. Los autores postulan que la mayoría de los cromosomas X paternos 
deberían estar activos, lo que explicaría el defecto visual puesto que el cromosoma X 
materno que contiene el gen normal está inactivo. Además, la gemela con visión normal al 
color, el cromosoma X materno fue el más activo. Cabe señalar que en este estudio se utilizó 
la técnica de Allen et al pero los autores no muestran imágenes de los geles de la digestión 
14
con HpaII, solo mencionan que no se realizó la cuantificación de inactivación y la 
interpretación fue más bien subjetiva70. 
Otro caso similar es el reportado por Favier et al en al año 2000 acerca de un paciente 
femenino de 11 meses de edad, hija única de padres no consanguíneos y afectada con 
hemofilia severa A71. Se encontró una mutación de novo en el gen del factor 8 de la 
coagulación (F8) en el cromosoma X paterno. El análisis del patrón de inactivación del 
cromosoma X en la paciente demostró un sesgo de inactivación del cromosoma X materno, 
lo que explica la ocurrencia de la hemofilia A. En este caso la enfermedad se originó por un 
patrón no al azar de inactivación del X caracterizado por la inactivación preferencial del 
cromosoma que contiene el gen normal (materno) y expresando en mayor proporción el gen 
que tiene la mutación (paterno)71.
Existen otros reportes de enfermedades recesivas ligadas al X tales como la enfermedad de 
Fabry que se caracteriza por la deficiencia de la enzima alfa galactosidasa, y la distrofia 
muscular de Duchenne caracterizada por atrofia y debilidad muscular progresiva en los 
cuales, algunos autores han mostrado que existe una relación con el patrón sesgado de 
inactivación del X69. El sesgo de la inactivación del cromosoma X puede estar influenciado 
por factores genéticos y puede, también, ser secundario a un proceso de selección post-
inactivación en contra o a favor de células con un genotipo específico 73. Específicamente se 
ha demostrado que pueden existir mutaciones en la región promotora del gen XIST que 
favorecen el sesgo de inactivación del X. Se ha identificado en líneas celulares que una 
mutación en el promotor del gen XIST, de citosina a guanina en la posición –43, induce un 
patrón no aleatorio o sesgado de inactivación del cromosoma X inactivando 
15
preferencialmente el cromosoma que tiene el alelo -43G. Otra mutación identificada en la 
misma posición es de citosina a adenina la cual protege de la inactivación al cromosoma que 
la porta 73-75.
Patrón de inactivación del X relacionado con la edad
Aunque la inactivación del cromosoma X supuestamente es permanente en todos los 
descendientes de una célula, se ha observado que el patrón de inactivación del X puede 
cambiar con la edad. Existen reportes en donde se muestra que la frecuencia de inactivación 
sesgada del cromosoma X en leucocitos de sangre periférica es mucho más alta en mujeres 
mayores que en mujeres jóvenes con una correlación significativa estimada entre 0.23 y 
0.31. Los índices elevados de inactivación sesgada al parecer comienzan a los 55 años de 
edad67, 75.
En un estudio longitudinal del patrón de inactivación del cromosoma X se realizaron dos 
muestreos en un mismo grupo de mujeres. El primero entre 1982 y 1985 y el segundo en un 
intervalo de dos décadas encontrando diferencias significativas en el grado de sesgo con el 
tiempo en mujeres que tenían 60 años o más en el momento del primer muestreo 36. A pesar 
de que no es claro el significado biológico de la relación entre el patrón sesgado de 
inactivación del X con la edad, una de las consecuencias posibles es la manifestación de 
enfermedades ligadas al X en mujeres mayores75.
16
Distrofias retinianas 
Las distrofias retinianas hereditarias son un grupo de enfermedades genéticas que se 
caracterizan por la degeneración y atrofia de células de capas retinianas específicas y 
representan la causa más común de deficiencia visual hereditaria, con una prevalencia 
estimada de 1 en 3000 sujetos en la población general76. Las distrofias retinianas hereditarias 
presentan una gran variación en fenotipo y esto puede deberse a mutaciones en diferentes 
genes (heterogeneidad de locus), diferentes mutaciones en un mismo gen (heterogeneidad 
alélica), variabilidad en el genoma en el que un gen es expresado o a la modulación del 
fenotipo por factores ambientales. Además, el diagnóstico preciso puede dificultarse por los 
cambios fenotípicos que suceden durante la progresión de la enfermedad76-78. Actualmente, 
las técnicas de análisis genético molecular han revolucionado el conocimiento de las bases 
genéticas de las distrofias retinianas hereditarias.
Las distrofias retinianas se clasifican clínicamente de acuerdo a si son estacionarias o 
progresivas y al sistema de fotorreceptores (conos o bastones) que está principalmente 
afectado. Los conos operan durante condiciones de luz brillante (fotópicas) y proporcionan la 
visión tricrómica en color, mientras que los bastones funcionan en la oscuridad (escotópica). 
La región macular localizada en el centro de la retina es rica en conos y se encarga de 
maximizar la visión detallada, en tanto que la región periférica es dominada por los bastones 
que proporcionan un campo de visión adecuado y detección de movimiento 77, 78. 
17
Distrofias Retinianas de bastones o periféricas
Las alteraciones que afectan primariamente el sistema de bastones, como la retinosis 
pigmentaria y la coroideremia, se presentan inicialmente con ceguera nocturna (nictalopia) y 
pueden progresar hasta causar pérdida sustancial del campo visual periférico. Sin embargo, 
la visión central está preservada, al menos hasta etapas tardías de la enfermedad. Estas 
enfermedades pueden ser clasificadas como distrofias periféricas 79-83.
Distrofias retinianas de conos o centrales: 
Las alteraciones primarias del sistema de conos (distrofias de conos) se manifiestan 
inicialmente con pérdida de la agudeza visual central (discriminación) y de la visión de color y 
no afectan significativamente la visión periférica a menos que el sistema de bastones se 
encuentra también afectado (distrofias cono-bastón). Algunas enfermedades afectan a 
ambos sistemas de fotorreceptores en la zona especializada central de la retina dejando 
intactos los conos y bastones periféricos; estas enfermedades son llamadas distrofias 
maculares 78, 84, 85. Dentro de este grupo, la enfermedad de Stargardt o distrofia macular 
juvenil es la alteración más común. Otras enfermedades dentro de este grupo son la 
enfermedad de Best y la distrofia de conos.
Distrofias retinianas sindrómicas
Aunque la mayoría de pacientes con una distrofia retiniana tienen una degeneración retiniana 
aislada, existen algunas formas de distrofia retiniana sindrómicas en las que la degeneración 
retiniana progresiva se asocia a alteraciones sistémicas. En algunos casos, estas formas 
18
sindrómicas son causadas por defectos metabólicos conocidos y por lo tanto permiten 
conocer las bases fisiopatológicas de la alteración retiniana. Tal es el caso de la hipoacusia 
en el síndrome de Usher, la polidactilia y obesidad en el síndromede Bardet-Biedl y la ptosis 
y oftalmoplegia progresiva en el síndrome de Kearns-Sayre, entre otros82, 83, 86-89. 
A pesar de la diversidad de mutaciones genéticas identificadas en las formas hereditarias de 
distrofias retinianas, todas tienen un resultado final común representado por la pérdida de 
fotorreceptores y ceguera funcional. Las distrofias retinianas presentan gran heterogeneidad 
genética ya que pueden heredarse de manera autosómica, dominante y recesiva, o ligadas al 
cromosoma X dominantes y recesivas90.
Distrofias retinianas recesivas ligadas al X
En las formas recesivas ligadas al cromosoma X de distrofias retinianas, clásicamente solo 
varones están afectados y las mujeres son portadoras que no manifiestan sintomatología 
ocular. Sin embargo, se han descrito diversos casos en la literatura de familias con patrones 
recesivos ligados al X en las que existen una o más mujeres afectadas 91-125. 
En la literatura se pueden encontrar reportes que consideran importante la relación entre el 
patrón de inactivación del X y las enfermedades recesivas ligadas al X, atribuyendo un sesgo 
de inactivación en los casos en que las mujeres heterocigotas presentan los síntomas de la 
enfermedad permitiendo la expresión del alelo mutante118-125. Sin embargo, son pocos los 
estudios en los que se ha intentado determinar el patrón de inactivación del X 95, 121. La 
19
dificultad del estudio de la relación entre el patrón de inactivación del cromosoma X (PIX) con 
distrofias retinianas recesivas ligadas al X en mujeres que presentan manifestaciones 
clínicas de la enfermedad es el acceso al tejido afectado, muy diferente a estudios realizados 
con enfermedades en las que las muestras se pueden obtener del tejido afectado y ver la 
relación directa del PIX con la afectación12, 121, 125-127.
En 1975 Bird reportó casos familiares ligados al X de Retinosis pigmentaria en los cuales 
algunas mujeres portadoras obligadas presentaban características fundoscópicas de la 
enfermedad. Los autores discutieron la importancia del patrón de inactivación del X y 
argumentaron que éste explicaría porque algunas mujeres heterocigotas están afectadas con 
la enfermedad94. Friedrich et al en 1993 determinaron el patrón de inactivación del X en 13 
mujeres portadoras de Retinosis pigmentaria ligada al X, utilizando sondas marcadas que 
reconocen el locus DXS255 en el cromosoma X y además diferencia entre el X activo y el 
inactivo. Las características visuales de las mujeres en estudio iban desde visión normal 
hasta la pérdida de la visión. Sin embargo, no identificaron una correlación entre el fenotipo 
observado y el patrón de inactivación del X95. 
Además de la Retinosis pigmentaria, existe otra distrofia retiniana ligada al X conocida como 
coroideremia en la cual se ha observado ocasionalmente que algunas mujeres portadoras 
presentan características de la enfermedad y esto ha sido explicado teóricamente también 
por un mecanismo de inactivación desfavorable o sesgada hacia el cromosoma X que porta 
el gen normal de coroideremia. Sin embargo, no existen reportes en la literatura que 
relacionen el patrón de inactivación del X con el fenotipo de mujeres portadoras de 
coroideremia.
20
Coroideremia
La coroideremia es una degeneración retiniana caracterizada por pérdida progresiva de la 
visión periférica y nictalopía como consecuencia principal de la atrofia de la capa coroidea y 
del epitelio pigmentado de la retina. Es una enfermedad hereditaria recesiva ligada al 
cromosoma X que tiene una frecuencia de 1:50 000 a 1:150 000. El gen CHM, responsable 
de esta enfermedad, se localiza en Xq21 y codifica para la proteína REP-1 necesaria para la 
eficiente prenilación de proteínas específicas Rab involucradas en el tráfico intracelular en el 
ojo y otros tejidos. Existe otra proteína conocida como CHML o REP-2 que tiene una función 
similar a REP-1. Hipotéticamente REP-2 sustituye la actividad de REP-1 cuando ésta pierde 
su función, sin embargo, se ha demostrado que REP-2 sustituye la función en todos los 
tejidos excepto en el ojo. Aparentemente esta compensación insuficiente se debe a la 
presencia de proteína Rab o proteínas Rabs que dependen preferencialmente de REP-1 103, 
104.
Las mutaciones reportadas a la fecha para el gen CHM han sido de tres tipos; mutaciones sin 
sentido, desplazamiento de marco de lectura y mutaciones en los sitios de splicing 96, 99. Es 
importante señalar que todas las mutaciones descritas a la fecha en CHM originan la 
introducción de un codón de paro prematuro, ya sea directamente o por el desplazamiento 
del marco de lectura103 (Anexo 1).
21
Retinosquisis
La Retinosquisis Juvenil (RS1) es una distrofia retiniana recesiva ligada al cromosoma X que 
se caracteriza por una alteración vitreoretiniana de la región macular 105. Es la forma más 
frecuente de degeneración macular en varones con una frecuencia promedio de 1:10.000. 
Las manifestaciones clínicas son evidentes en el fondo de ojo desde el nacimiento pero su 
sintomatología comienza en la segunda década de la vida con disminución progresiva de la 
agudeza visual105, 106. En la retina se observa una separación de la capa de fibras nerviosas 
con formación de cavidades quísticas, que pueden coalescer y romperse hacia el vítreo. La 
enfermedad se debe a mutaciones en el gen RS1 localizado en Xp22.1-22.3 y que codifica 
para una proteína conocida como retinosquisina105-110. Las mutaciones reportadas a la fecha 
para el gen RS1 han sido de tres tipos; mutaciones sin sentido, desplazamiento de marco de 
lectura y mutaciones en los sitios de splicing 111 (Anexo 2).
La retinosquisina, también conocida como RS1, fue inicialmente identificada como la proteína 
asociada a la retinosquisis 107-109. La estructura de ésta proteína de 24 kDa está formada por 
una cadena líder amino terminal de 23 aminoácidos, un dominio conocido como RS1 de 39 
aminoácidos, un dominio discoidina de 157 aminoácidos que al parecer es la principal 
característica de la retinosquisina por su función en el proceso de adhesión célula-célula, y 
un segmento carboxilo terminal formado por 5 aminoácidos112. 
La principal función de la retinosquisina parece ser el mantener la integridad estructural de la 
retina dando estabilidad a las capas retinianas, por lo que la deficiencia de retinosquisina 
causaria la separación de la capa de fibras nerviosas retinianas del resto de la retina 
22
sensorial. Esto se apoya en el fenotipo observado de ratones knockout para retinosquisina y 
en pacientes con retinosquisis juvenil ligada al X quienes presentan una retina altamente 
desorganizada; estos pacientes muestran una separación de las capas retinianas que se 
observan al examinar el fondo de ojo, estos hallazgos son posibles determinar en una 
tomografía coherente óptica y se han observado también cavidades quísticas dentro de la 
retina por métodos histológicos 100, 109, 115. 
23
Planteamiento del problema
Existen casos de familias con distrofias retinianas hereditarias recesivas ligadas al 
cromosoma X en las que mujeres portadoras (heterocigotas) de la mutación presentan 
manifestaciones clínicas de la enfermedad. De manera clásica, ésto, se ha atribuido a que 
probablemente la inactivación del cromosoma X se encuentra favorecida hacia el cromosoma 
X con el alelo normal permitiendo la expresión del alelo mutante (patrón de inactivación del X 
sesgado). Sin embargo no se han realizado estudios experimentales para evaluar esta 
posibilidad.
24
Hipótesis
Existe una relación entre el patrón de inactivación del cromosoma X y la presencia de 
manifestaciones clínicas en mujeres portadoras de distrofias retinianas hereditarias recesivas 
ligadas al cromosoma X 
25
Objetivo
Evaluarel patrón de inactivación del X y su relación con el fenotipo de distrofias retinianas 
recesivas ligadas a X en mujeres portadoras.
Objetivos particulares
1. Confirmar el diagnóstico de distrofia retiniana recesiva ligada al cromosoma X por 
análisis molecular de los genes involucrados (CHM para Coroideremia y RS1 para 
Retinosquisis)
2. Determinar el patrón de inactivación del cromosoma X en mujeres que presentan 
distrofia retiniana o algunas características de ésta, en familias con distrofias 
retinianas hereditarias recesivas ligadas al X. 
3. Establecer si existe relación entre el patrón de inactivación del cromosoma X y la 
presencia de sintomatología ocular de mujeres portadoras en familias con distrofias 
retinianas hereditarias recesivas ligadas al X. 
26
Material y métodos
Análisis genealógico
Se incluyó en el protocolo de investigación pacientes diagnosticados clínicamente con 
distrofia retiniana recesiva ligada al cromosoma X obteniendo su firma de consentimiento 
informado (anexo 3). El análisis genealógico permitirá identificar la transmisión recesiva 
ligada al cromosoma X de acuerdo a los siguientes criterios:
1. Varones afectados
2. Ausencia de transmisión varón-varón
3. Transmisión de la enfermedad a través de mujeres portadoras sanas
4. Al menos dos generaciones afectadas
Análisis clínico
Se determinó el estado clínico de las portadoras mediante determinación de agudeza visual, 
estudio fundoscópico ocular, electroretinograma y campos visuales. Se obtendrá una 
muestra de sangre completa de afectados y mujeres con manifestaciones clínicas de distrofia 
retiniana recesiva ligada al X y de portadoras sin manifestaciones para la extracción de DNA, 
utilizando EDTA como anticoagulante.
Extracción de DNA
El DNA genómico de cada individuo se obtuvo a partir de leucocitos utilizando reactivos 
comerciales siguiendo las indicaciones del fabricante (PureGene DNA purification system, 
Genomic DNA purification kit, Gentra systems. 13355 1oth Avenue North, Suite 120, 
Minneapolis, Minnesota USA). Se determinó la concentración y pureza del DNA por medio de 
27
un análisis de absorbancia a 260nm que corresponde a la fracción de DNA y 280nm para la 
fracción proteica utilizando un espectrofotómetro UV/Visible BIO-RAD. La relación 260/280 
permitió evaluar la pureza de la muestra. Se considero adecuada una relación entre 1.5 y 1.9
Amplificación por PCR
A partir del DNA genómico obtenido, se realizó la amplificación por reacción en cadena de la 
polimerasa (PCR) de los genes correspondientes a la distrofia retiniana recesiva ligada al X 
(CHM para coroideremia y RS1 para retinosquisis). Se utilizaron oligonucleótidos específicos 
derivados de la secuencia normal de cada gen a estudiar (Tablas 2 y 3). Para la amplificación 
de cada fragmento génico se utilizó un par de oligonucleótidos (sentido del inglés Forward y 
antisentido del inglés Reverse) cuyo producto de amplificación varía en tamaño en cada caso 
particular. La PCR se realizó en un volumen total de 20µL con los siguientes componentes: 
50 a 200ng de DNA genómico, 1mM de oligonucleótido correspondiente (sentido y 
antisentido), HotStarTaq Master Mix de Qiagen (este reactivo contiene amortiguador para 
PCR 1X, 0.3mM de cada uno de los 4 dNTPs, 8.5U de Taq Polimerasa, MgCl2 1.5mM), y 
agua bidestilada c.b.p. 20µL. Se utilizó un programa de temperaturas que incluye 1 ciclo de 
desnaturalización y activación de la DNA polimerasa de 15 minutos a 95ºC, 38 ciclos con 1 
minuto de desnaturalización, 1 minuto de alineamiento a temperaturas específicas para cada 
oligonucleótido y 1 minuto a 72ºC para la extensión y por ultimo un ciclo de 10 minutos a 
72ºC para la extensión final. Los productos obtenidos de la amplificación se sometieron a 
electroforesis en geles de agarosa al 1.5% con bromuro de etidio para identificar las bandas 
específicas con el producto amplificado, utilizando como referencia un marcador estándar de 
tamaños de 100 a 1500pb (Trackit 100bp DNA Ladder, Invitrogen. Carlsbad, CA., USA)
28
Tabla 2. Oligonucleótidos y Tm utilizadas para el gen CHM
Exón Oligonucleotido sentido Oligonucleotido anti-sentido Tm Amplificado
1 5’GCCTTCCACGGAGGGAATG3’ 5’CCAAAACTCGCCACTGACAGA3’ 57.9 204
2 5’TGTTCTATACAGCAATGGC3’ 5’TACGTACAGACATATATGTG3’ 50.1 245
3 GGTTTGTTGATGAAGATCAG TTCTTCAGTGCAGGGTTACT 53.0 221
4 TGAATTTAGACAAGAGGTAA TATTGTTGGCTTCTTCTA 47.0 288
5 ACGTACACTGAACTTGATA TCTGCATCTCAGAGAATTAC 50.1 549
6-7 ATGTATCTTTATTGTTTTCC GTAATAAGTGGCTCACTAA 47.4 1284
8 TGTGAAACACACTTCATCTCC CAAGTATCACTTTTAGAAGG 53.0 362
9 TTATGAAGTGTAAAATACTT TCACTTGTGTTTGGGATATG 50.1 333
10-11 AATTGGTAGCCGATTACAT GTGTAGTGATTAGTTCACC 50.1 707
12 CTCAGTTTAGAAGTTAACAGC CACAACTGTAATAACTGCC 51.5 259
13 CCATAATACCAGCTTAATGCC TCTAAGAAGATTATGATGG 53.0 242
14 GGCTTAATCGGTAATAGGCT GACTTCTCTCCTCCCAGAGGA 58.0 331
15 GTTAATGCCAGAAATGCACAC CAAGTAGACTCTGAGACCAG 54.4 326
Tabla 3. Oligonucleótidos y Tm utilizadas para el gen RS1
Exón Oligonucleotido sentido Oligonucleotido anti-sentido Tm Amplificado
(pb)
1 5’GGCTCAGCCAAAGACCTAAGA3’ 5’TCCTATTTATCAACGATATT3’ 57.1 256
2-3 5’CATGTAACGAGTGATGCTG3’ 5’GTTAATTCAGCTGAGTGGGAA3’ 53.2 1167
4 5’GTCACCTGGTGCTTGTTGAG3’ 5’TCACTGTGTTGGCCACGCTGG3’ 61 283
5 5’CCTCGAGAGCCAGCACCTGC3’ 5’AGAGGGCAGTGACAGGAGCT3’ 62.8 360
6 5’GGCTAGCTCCAGAAAGGAAC3’ 5’TATAGCCCTGTCCATCTCGG3’ 56.6 324
29
Purificación del producto de PCR
Se cortaron las bandas obtenidas en el gel de agarosa que corresponden al exón amplificado 
del gen de interés y se utilizó el método de purificación por columna (QIAquick Gel Extraction 
Kit, QIAGEN. Maryland, USA) basado en la solubilización de agarosa y la adsorción selectiva 
y cuantitativa de ácidos nucleicos por medio de partículas de sílica en presencia de una alta 
concentración de sales y eluida con una solución baja en sales. La concentración del 
producto amplificado y purificado se determinó por medio de electroforesis en gel de agarosa 
al 1.5% con bromuro de etidio comparando la intensidad de las bandas obtenidas con 
respecto a un marcador de tamaños estándar Low DNA Mass Ladder, Invitrogen (Figura 7).
Figura 7. Gel de agarosa al 1.5% con bromuro de etidio cargado con 4mL de Low DNA Mass 
LAdder. Al lado se muestran las cantidades de cada fragmento de DNA en un determinado 
volumen para realizar la comparación de las bandas con el fragmento de DNA de interés y 
calcular su concentración.
30
Secuenciación nucleotídica
La determinación de las mutaciones se realizó por reacción de secuenciación nucleotídica 
directa utilizando terminadores fluorescentes (BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit, 
Applied Biosystems). Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 10µL con 
0.5 µL de BigDye la cual es una mezcla de los cuatro dideoxinucleotidos trifosfatados 
(ddNTPs) marcados con fluorescencia, deoxinucleotidos trifosfatados (dNTPs) no marcados, 
Tris-HCl (pH 9.0), MgCl2 y la enzima ampliTaq polimerasa; se agregó además 0.5 µL de 
oligonucleótido, ya sea sentido o antisentido, 10 a 20ng del DNA producto de PCR purificado 
como templado y agua bidestilada para un volumen final de 10 µL. Para esta reacción se 
utilizó un programa de 25 ciclos que incluyeron 30 segundos a 95ºC para la 
desnaturalización, 15 segundos a 50ºC para el alineamiento y 4 minutos a 60ºC para la 
extensión. Los productos obtenidos se purificaron por medio de columnas Centri-Sep 
(Applied Biosystems) para eliminar el exceso de ddNTPs fluorescentes y de dNTPs no 
marcados. Cada muestra se resuspendio en 20 µL de formamida desionizada y 
posteriormente se desnaturalizó a 95ºC por 5 min. Los productos se analizaron en un 
secuenciador automático ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) y las 
secuencias de DNA obtenidas se compararoncon las secuencias silvestres de cada gen 
estudiado, publicadas en la base de datos Ensembl (www.ensembl.org), para identificar las 
mutaciones correspondientes.
31
http://www.ensembl.org/
Análisis del patrón de inactivación del X 
El análisis del patrón de inactivación del cromosoma X se realizará utilizando la técnica de 
PCR para el gen del receptor androgénico (AR) metilado descrito por Allen et al72. 
La técnica se fundamenta en que el gen AR contiene en su primer exón un polimorfismo de 
20 a 40 repetidos CAG lo cual permite diferenciar los cromosomas X materno y paterno 
cuando son heterocigotos para este repetido después de una PCR y una electroforesis 
capilar utilizando marcadores de fluorescencia para la detección del producto de PCR. Este 
método permite identificar los cromosomas X con base en el conocimiento de que la 
metilación de los sitios CpG cercanos al repetido CAG correlaciona con la inactivación del 
cromosoma X. Al tratar el DNA genómico con la enzima HpaII, sensible a metilación, los 
sitios CpG no metilados serán cortados por esta enzima de tal forma que en la amplificación 
por PCR solo se tendrá el producto del gen metilado. En cada ensayo del patrón de IX 
deberá utilizarse un DNA control masculino tratado con HpaII el cual, al no presentar el 
fenómeno de inactivación, no producirá producto de amplificación del exón 1 del gen AR. La 
determinación del tamaño de los alelos se realiza en un equipo Genetic Analyzer 310 
(Applied Biosystems) mediante electroforesis capilar y utilizando el software Genescan de 
detección por fluorescencia. Las muestras homocigotas para el repetido CAG serán 
excluidas del estudio ya que no permiten la diferenciación entre ambos cromosomas X 72 
(figura 8).
32
Figura 8. Determinación del patrón de inactivación del cromosoma X con GeneScan. Cada 
uno de los picos representa la amplificación de un alelo (materno y paterno) del gen AR. En 
A se observan dos picos de amplificación del gen AR para el repetido CAG de una mujer 
heterocigota para este alelo (HpaII-). Abajo se muestra la amplificación del exón 1 del gen 
AR para el repetido utilizando un DNA tratado con la enzima de restricción HpaII (HpaII+), se 
observa que ambos picos presentan la misma área bajo la curva lo que indica que el patrón 
de inactivación del X es al azar. Un patrón de inactivación sesgado se muestra en B donde 
se puede observar dos picos que diferencian a los dos cromosomas X y después de ser 
tratados con HpaII muestran diferente área bajo la curva. En C se muestra una PCR del gen 
AR a partir de una muestra de DNA masculino con un solo cromosoma X, no metilado, que al 
ser tratado con la enzima HpaII cortará el DNA y no se obtendrá producto de amplificación. 
(Figura tomada de J Med Genet 2002;39:30–33)
33
Para la identificación de los cromosomas X se realizo una PCR para el exón 1 del gen del 
receptor de andrógenos (AR) utilizando un oligonucleótido (sentido) marcado con 
fluorescencia (FAM) y el antisentido sin marcar (Tabla 4).
Tabla 4. Oligonucleótidos y Tm utilizados para el repetido CAG del exón 1 del gen AR, el 
oligonucleótido sentido está marcado con fluorescencia (FAM) para la identificación de los 
productos utilizando el programa GeneScan
Exón Oligonucleotido sentido
Marcado fluorescente en 5’ (FAM)
Oligonucleotido anti-sentido Tm Amplificado
(pb)
1 5’FAM*TCCAGAATCTGTTCCAGAGCGTGC3’ 5’GCTGTGAAGGTTGCTGTTCCTCAT3’ 62 Aprox 280pb
Se verifica que se haya obtenido producto de amplificación mediante una electroforesis en 
gel de agarosa corriendo solamente 4-5 µl del amplificado con un marcador de tamaños para 
cuantificación (Figura 6), una vez obtenida la concentración del amplificado, se colocan 2-4ng 
en un tubo para secuenciación (600µl) con 20µl de formamida y 0.5µl del marcador de 
tamaños de para el programa genescan (GeneScan-500 TAMRA, Perkin Elmer p/n 401733). 
Se desnaturaliza a 95°C por 5 min y se coloca en hielo antes de ingresarlo al equipo de 
secuenciación (AbiPrism 310 Genetic Analyzer de Applied Biosystems) para su análisis por 
electroforesis capilar utilizando el programa GeneScan.
El producto de PCR migrará del polo negativo al positivo a través de un capilar lleno de un 
polímero (POP4 de Applied Biosystems) y pasa por una ventana en donde se encuentra un 
34
laser que, al emitir un rayo de luz ocasiona que el marcador FAM emita fluorescencia que 
será detectada por el equipo y traducida como un pico por cada fragmento de DNA marcado 
(Figura 9).
Figura 9. Fragmento de la secuencia del exón 1 del gen AR utilizado para la identificación de 
los cromosomas X y su estado de metilación.
En el caso del receptor de andrógenos es importante que las mujeres analizadas sean 
heterocigotas para este gen en el repetido CAG, ya que si fueran homocigotas solo se 
obtendría un pico pues los dos alelos amplificarían del mismo tamaño y se ubicarían en la 
misma posición (Figura 10).
35
A B
Figura 10. Electroferograma que muestra dos figuras de la identificación de los cromosomas 
X, en la imagen A se observan dos picos de amplificación que indican que la muestra 
pertenece a una mujer heterocigota para el repetido CAG localizado en el exón 1 del gen AR. 
En la imagen B se observa un electroferograma perteneciente a una mujer homocigota para 
el repetido en la cual no es posible diferenciar los cromosomas X.
La heterocigocidad del repetido CAG del gen receptor de andrógenos será de utilidad para la 
determinación del patrón de inactivación del cromosoma X puesto que el software GeneScan 
permite el análisis utilizando la altura del pico o el área bajo la curva y de esta forma 
comparar ambos cromosomas (X paterno y X materno).
Patrón de inactivación del cromosoma X.
Para la determinación del patrón de inactivación del X es necesario haber realizado la 
identificación de los cromosomas X con la PCR del exón 1 del gen AR para verificar que la 
muestra sea heterocigota para el repetido CAG como se explicó anteriormente. Incubar el 
DNA genómico con la enzima sensible a metilación HpaII que corta los sitios CC/GG 
respetando los sitios CpG metilados en la posición 5 de la citosina.
36
La mezcla de reacción para el ensayo de la enzima de restricción es 10-20ng de DNA, 1mL 
de Buffer NebI, 6µl de Enzima HpaII y agua c.b.p. 10µl. Se incuba a 37°C durante 16 hrs y se 
detiene la reacción al desnaturalizar la enzima a 95°C por 5 min. Después de esto se realiza 
una PCR para el exón 1 del gen AR y se analiza por GeneScan. Una vez obtenidos los 
electroferogramas, se determina la altura de cada pico (HARx) y se suman, el resultado de la 
suma de las alturas de los picos corresponden al 100%. Con este dato se calcula el 
porcentaje que corresponde para cada pico de amplificación y ese es el porcentaje de 
inactivación de cada cromosoma X particular (Figura 11).
A
50:50
B
17:83
Figura 11. En A Electroferograma que muestra la identificación de los cromosomas X, y en B 
el resultado de la restricción con la enzima HpaII. Para determinar el patrón de inactivación 
del cromosoma X se realiza el siguiente cálculo:
100% = H267pb + H280pb
El porcentaje de cada pico se calcula como
X%267pb = H267pb x 100 / (H267pb + H280pb)
X%280pb = 100% - X%267pb
Se consideró inactivación al azar 50:50 – 65:35 y como punto de corte para considerar sesgo 
en el patrón de inactivación a partir de 66:34 120
37
Resultados.
Análisis Molecular del gen CHM y Determinación del Patrón de Inactivación del 
Cromosoma X en Dos Familias con Coroideremia
Se estudiaron dos familias con diagnóstico clínico de coroideremia. En la Familia 1 se 
incluyeron 17 sujetos: 3 varones afectados, 6 varones sanos, 8 mujeres (entre ellas una 
afectada). En la Familia 2 se analizaron7 sujetos: 2 varones afectados y 5 mujeres. 
Se confirmó el diagnóstico de coroideremia en los varones afectados de ambas familias. En 
la familia 1 se identificó una mutación en el exón 6 que cambia el triplete 270 CGA (Arginina) 
a un codón de paro TGA; esta mutación predice una proteína truncada de REP-1 en el 
aminoácido 270 (R270X) (Figura 12). Esta mutación ya había sido descrita previamente en 
sujetos con coroideremia, 117, 118.
38
Figura 12. Árbol genealógico de la familia 1 afectada con CHM. Los electroferogramas 
muestran un fragmento de la secuencia del exón 6 del gen CHM de un varon y una mujer 
sanos asi como de un varón con la mutación R270X y una mujer portadora. El triplete 
afectado se encuentra subrayado. En el árbol genealógico el símbolo asterisco indica a los 
sujetos incluidos en el estudio molecular.
39
En la familia 2 se identificó una mutación sin sentido en el exón 11 que cambia el triplete TCA 
(Serina) a TGA (S468X). Esta mutación no ha sido reportada previamente (Figura 13)
Figura 13. Árbol genealógico de la familia 2 afectada con CHM. Los electroferogramas 
muestran un fragmento de la secuencia (anti-sentido) del exón 11 del gen CHM en DNA de 
un varon sano, de un varón afectado con la mutación S468X y de dos mujeres portadoras. 
Esta mutación no ha sido reportada previamente. El triplete afectado está encerrado en un 
cuadro y el asterisco en el árbol genealógico corresponde a los sujetos incluidos en el 
estudio molecular.
40
Identificación de los cromosomas X en mujeres.
Se identificaron un total de 13 mujeres portadoras de mutación en el gen CHM. Para la 
identificación de los cromosomas X se procedió con el ensayo de PCR del Exon 1 del gen 
AR obteniendo de este ensayo que de las 13 mujeres portadoras, 1 resultó homocigota para 
el repetido CAG del gen AR por lo que se excluyó del estudio. En la tabla 4 se reportan las 
características clínicas de las mujeres estudiadas.
 
Tabla 4. Características clínicas de mujeres portadoras heterocigotas de dos familias con 
CHM, Edad, condiciones visuales y hallazgos en el electroretinograma.
Familia No de 
registro
Edad
(años)
Síntomas 
Visuales
Agudeza 
Visual 
Electroretinograma 
(ERG)
1 258 70 Nictalopia,
Agudeza visual 
disminuida
OD 20/30, 
OI 20/20 
Condiciones escotópicas: apenas 
registrable; Condiciones fotópicas: 
moderadamente disminuida
1 259 36 Ninguno 20/20 Normal
1 275 19 Ninguno 20/20 Normal
1 276 48 Ninguno 20/20 Normal
1 294 42 Ninguno 20/20 Normal
1 304 44 Ninguno 20/20 Normal
1 325 38 Ninguno 20/20 Normal
2 386 53 Ninguno 20/20 Normal
2 387 26 Ninguno 20/20 Normal
2 389 24 Ninguno 20/20 Normal
2 555 10 Ninguno 20/20 Normal
2 556 11 Ninguno 20/20 Normal
41
Se obtuvo el patrón de inactivación del X (IX) y 11 presentaron un patrón de inactivación del 
X al azar (Promedio de familia 1, 54% & 46%; promedio de familia 2, 51% & 49%).Una mujer 
portadora en la familia 2 presentó un sesgo en el patrón de inactivación (68% & 32%) (Tabla 
5).
Tabla 5. Análisis de inactivación del cromosoma X en mujeres portadoras de CHM de dos 
familias
Patrón IX
No. de registro Cromosoma X1 Cromosoma X2 Patrón IX Familia
258 52 48 Azar 1
259 46 54 Azar 1
275 39 61 Azar 1
276 60 40 Azar 1
294 41 59 Azar 1
304 49 50 Azar 1
325 46 54 Azar 1
386 51 49 Azar 2
387 55 45 Azar 2
389 68 32 Sesgado 2
555 48 52 Azar 2
556 60 40 Azar 2
Control masculino 1 0 0 Sin inactivación -
Control masculino 2 0 0 Sin inactivación -
42
La mujer afectada en la familia 1 presentó un patrón de inactivación de 46% & 54% lo que 
indica un patrón de inactivación del X al azar (Figura 14). 
Figura 14. Mujer afectada por CHM y con un patrón de inactivación del X al azar (A). Se 
observan claros datos de afectación por CHM en la fundoscopia (B) y en la fluorangiografia 
(C). Comparese con un fondo de ojo normal (D)
43
La mujer que presentó el patrón de inactivación sesgado (68:32) presentó, al análisis de 
fondo de ojo, datos sugestivos de la enfermedad aunque sin afectar de manera importante la 
visión. El resultado sugirió que el fenotipo se debía al sesgo de inactivación del X. Sin 
embargo los resultados de inactivación del X indicaron que el cromosoma X que esta mujer 
inactiva preferencialmente es el que porta la mutación (materno), descartando el efecto por la 
inactivación sesgada (Figura 15).
Figura 15. Fundoscopía de mujer Portadora en donde se observan parches de 
hiperpigmentación retiniana. Sin embargo, el alelo mutado (276pb) es el que se inactiva 
preferencialmente (inactivación del X 68% vs 32%).
44
Se anexa artículo publicado
45
46
AMERICAN JOURNAL OF _ 
medical genetics lriJI 
CHM Gene Molecular Analysis and X-Chromosome 
Inactivation Pattern Determination in Two Families 
With Choroideremia 
Hector J. Perez-Cano, l Rosa E. Garnica-hayashi,2 and Juan C. Zenteno1 ,3 . 
'Research Unlt, Instltute o( Ophthalmolog\l "Conde De Valenciana, - Mexlco [ It\l, Mexlco 
20epartment of Retina, Institute of Ophthalmolog\l "Conde De Valenciana," Mexico [jI,::! , Mexico 
30epartment of Genetics, Institute of Ophth almolog\l "Conde De Valenciana," Mexico [jI,::! , Mexico 
Received 1 April 2008; Accepted 17 December 2008 
Choroideremia is an X-Iinkcd rcccssive retinal dystrophy 
chanlctcrizcd by progrcssive loss of the photorcccptor, the 
retinal pigmcnt cpithclium, ami the choriocapillaris laycrs which 
ultimatdy can rcsult in blindncss by the fifth decadc oflifc. Thc 
dis.ease is caused by mutations in the gene CHM, which encudes a 
protein involvcd in the regulation of intniCellular vesicular 
tmffic. Typically, hemizygous males are affectcd by the discase 
and female carriers are asymptomatic with only a diffuse mottlcd 
pallern of hyperpigmentation on funduscopy. Uncommon in_ 
stances of fully affectcd females have becn describcd previously 
and these cases are proposcd to arise from an skewcd Lyonization 
mechanism prderentially inactivating the X chromosome car-
rying the normal CHM allelc. In this work, the dinical and 
molecular fcatures of two Mexican families with choroideremia 
are describcd.A novel and a previouslydescribcd CHMmutation 
were identificd. X-chromosome inactivation assays were per-
formcd in a total of 12 heterozygous carriers from the two 
families. In an affectcd female from family A, a random 
X-inactivation pallern was demonstmtcd; on the other hand, in 
a female carrier from family B displaying a conspicuous pallern 
of pigment epithdium mottling at the peripherdl retina, a 
skewcd X-inactivation pallern was found. However, the X-chro-
mosome prderentially inactivated in this female was the one 
rnrrying the m1ltate<l allcle. 01lr rC~1Ilt~ a<l<l tn the genntypic 
spectrum in choroideremia and docs not support a currelation 
bctween X-inacth'lltion status and abnormal retinal phenotype 
in heterozygous female carriers from these two families. 
2009Wil<y-üss., loc. 
Key words: choroideremia; retina! dystrophy; REPl; X-inactivalion; 
CHM; femaie carrier 
INTRODUCTlON 
Choroidcrcmia (OM 1M #303100) is an X-linkrJ nxessivc dcgrnc-
rativcdiseasc of thr retinacharactrrizcJ by a progrrssiwccntripclal 
loss of thr pholorrceplor, thr rrtina! pigmrnt cpithrlium (RPE), 
and the ehorio.:apilLaris layas [Kri ll and Areher, 1971 ]. AffeCled 
How to Cite this Articie: 
Pcrcz-Cano Hj, Gami.:a-hayashi RE, Zcnlrno 
le. 2009. CHM grnc molccular analysis and 
X-chromosomc inaclivation patt t'fn 
d rt rrmination in two familirs wi th 
choroidrrrmia. 
Am j MrJ Gcnrt Pan A 149A:2134-2140. 
hrmizygous males havc symploms in thr first or s('"(ond dr<:adr of 
lifr which bcgin ,vi th progressivc nigh t blindnrss foUowcd by 
conslriction of thr pcriphrral visual ficlds, and progrcssivc loss of 
visual acui!y which oftrn 1(".J.ds 10 tunnrl vision and blindness by Ih r 
fifth decadr of li fr [McCuUoch and McCuUoch, 1950; Prrising and 
Ayuso, 2004 ]. El(,"(lrorrtinographicfratures indudr cxtrnsivc 
rod and conr syslrm dysfunclion which eharaclrris lically are 
prrscnt sincc thr ini tial sla!,,'es of thr diseasc [Sirving ct al. , 
1986]. Hrlrrozy!:.'Ü us frmales havr no or mildrr symploms associ-
aloo wi th fund uscopically cvidcnt patehy arcas of choriorrtinal 
drgcnrra tion [Karna, 1986; Heckrnlivcly and Bird , 1988; 
Hannr')' ct al. , 1990; Rudolph r t al. , 2003 ], presumably rcla trJ to 
thr pat!crn of X_ehromosomc inaclivation [Hanncry ct al. , 1990; 
MacDona!d CI al. , 1997]. Howrvcr, cxccptiona! carrirr frma!rs fully 
a!frclrd by choroidrrrmia havc lX'"Cn also describcd [Shapira and 
Si tncy, 1943; frascr and frirJmann, 1968; Karna, 1986; Majid CI al. , 
1998; Endo CI al. , 2000; Rrnnrr ct al. , 2006], thrsc cases apparrn tly 
arising dur 10 non-random or skrwcd X-chromosoJ1K'" Iyonization 
prrfrrcntially inaclivating thr chromosomc carrying thr normal 
all rlr IJay, 1985; Pot! rr ct al. , 2004 ]. 
' Correspondence to: 
luan C. Zenteno. Departamento de Genética. Instituto de Oítalmología 
··Conde de Valenciana:· Chimalpopoca 14. Col. Obrera. Mexico City. Cp 
06800. México. E-mail: jC"lenteno@institutodeoílahnologia.org 
l'ublished online 16 September 2009 in \Viley InterScience 
( w,vw. interscience. ,viley .com) 
DOI to.lOO1!ajmg.a.31 727 
47
PEREZ-CANO I:.vr AL. 
Tnr molrwlar basis of enoroidrrrmia invo lvr mulations in 
CHM, a grnr locatrd at Xq21 and romposrd of 15 rxons tnat 
rneodrs an ubiqui tously rxprrssrd prolrin known as Rab rseort 
protrin-I or REPI ICr('m('rs('t al. , 1990; van Boknov('n('t al. , 1994 [. 
REPI is cri tieal for tne posnranslational lipid modifieation and 
subsequrnt mrmbrane tar!:,'eting of Rab prolrins, smaU GT P-
binding prolrins tnal .1.(\ as key rrgulalors of in lraeeUular vesicular 
traffie lSeabra et al. , 1992; Alexandrov et al. , 1994[. 
Tnr majori ty of CHM grne mulations idrntified to datr in 
enoroidrrrmia patirnls from diffcrrn l rtnniei tirs arr point muta-
tions tnat dir("( lly introduce a premature SIOP rodon I van den Hurk 
et al. , 1997,2003; Beaufrcrr et al. , 1999; MeTaggart et al. , 2002 [; 
Otnrr CHM drfecls as drletions (partial or total ), transloeations, 
insrrtions, and intronic mulalions eausing spliee drf('( IS, navr .lIso 
b("("n r('(ognizro in some patirnts ISankilaet al. , 1992; van den Hurk 
et al. , 2003; Yip r t al. , 2007[. CHM missense mutations navr not 
b("("n yet idrn lified, sUgh'Csling tnal tnrse enangrs arr ei tnrr embry-
onie [ctnal or nave no or very mild pnrnolypie rff('( l~ . 
In tnis artidr wr drsuilX' tnr dinieal and mol('(ular analyses of 
two Mrxiean fami li rs wj tn enoroidrrrmia. A novrl and a prrviously 
drscribed nonsrnsr mulations in CHM wcrr idrntified. Tnr 
X-enromosome inactiV'.J. tion patl rrn was investigatrd in 12 carrirr 
frma les from tnrse two fami li es, indudinga srverrly aff('(trd frmale 
individual. Our results add 10 the genotypic spt.·nrum in {horoi-
drrrmia and do nOI support a role for X-cnromosome inaetivation 
paHrrn in drtrrmining thr fundus phrnolype in hrtrrozYh'Üus 
CHM frmalrs. 
PATlENTS AND METHODS 
Two Mrxican Mrslizo fami li rs, A and B, werr indudrd in thr sludy. 
No hislOI)' of immigrati on aneeslry orconsanguinity was f('(ordrd 
in any proigf('{'. 
Ophthalmologic Studies 
Ophthalmologie examinations indudrd best-corr('(lrd visual 
amity (BCVA ) drtrrmination, sli t-lamp and dilatrd fundus 
examination, app lanal ion tonomrtry, fundus pbolhograpby, 
f'arnsworth-MunsrU ehromatie trs l, el(,,( lrorr tinogram (ERG ), 
fluorrscein rrtinal angiography (fA), Goldmann kinetie perimrtry 
(G KP), and contrast sensi tivity Irsts. All a!f('( lrd subj(,( ls undrr-
went syslrmie eV'a luation by a grnetieisl to exdude associalrd 
soma tic anomalirs. Tne patirnls wrrr rrcrui trd from thr Depart-
mrnt ofRrtina of our insli tution. ERGs werr performrd aecording 
to standards from thr Inlrrnational Socirty for Clinieal EI('(lro-
physiology of Visiono 
Molecular Analyses 
CHM gell e (///(/1)'5;s. Aftcr obtainin g local Elhies Commi ure 
approval and Infonnrd Consent from patirnls or thrir parrnls, 
blood samples wrrr drawn by venipuncture, and h'Cnomie DNA 
was extrae trd using the Purrgrne DNA Purification Ki t (Gentra 
Syslrms, Minnrapolis, MN). PC:R amplification of thr complet r 
coding rrgion of thr CHM b'Cne ( 15 exons) was aenirvro using pairs 
of primrrs and trmpcra turrs aV'ailablr on rrqurst. Eaen 25 l-\1 PCR 
amplification rrae tion con lainro IX bu!frr, 200ng of grnomie 
2135 
DNA, 0.2 mM of raen dNTP, 2U Taqpolymerase, I mM offorward 
and rrvrrse primrrs, and 1.5 mM MgCI2. PCR produel~ wrrr ana-
Iyzed in 1.5% agarosr gels from whien thr bands wi th thr amplified 
trmplalrs wrre exeised, and thr DNA subsequrnlly purified wi th 
thr hrlp of thr Qiaex [] ki t (Qiagm, Hildrn, Germany) . Dirw 
automalrd sequrneing of CHM was performrd wi th thr BigDye 
Trrminalor Cydr $equrneing ki l (Applird Biosystrms, f'os lcr City, 
CA), adding aboul 15 ng of Irmpla tr DNA in eaen rraction and 
using a Irmperalurr program thal indudrd 25 eydrs of drnatura-
tion al 97Q C for 30 s("(, annealingal 500C for 15 scc, and rxl rnsion al 
6ij
Q C for 4 mino Samples wrrr analYled in anA BI Prism 3 10 Genetie 
Analyler (Applird Biosyslrms). Wild-Iype and mulalrd CHM 
sequrnees werr eomparrd manuaUy. 
X·c/rromosome ;mrct;wrl;oll ptrltenr. Thr patlcrn of X-enro-
mosome inactivalion was detrrmined using Ihr androgrn r("(eplor 
(A R) polymorpbie triplrl assay drscribed by All rn el al. I 1992[. Tnr 
AR b'Cneron tain s a high ly polymorpbie CAG rrpeal in Ihr firs l rxon 
and melhylalion of CpG si trs dose to Ihis rrpeal corrrlalrs wi th X-
enromosomr inaelivalion Slalus as those si trs arr mrthylalrd only 
in thr inactive X enromosomr and resis l draV'ab'C by methylation-
sensitive rrs lrielion enzymes. Tnus, a PCR produel is obtainrd only 
from thr inaetive X enromosomr. In frmales hrlrrozygous for thr 
polymorphie AR rrpeal, this assay allows thr dis linetion 1X'lw('("n 
the maternal and paternal alleles and idemifics their mcthylation 
Slalus. Brirfly, Iwo parallcl rraelions wrrr set for eaen DNA samplr: 
in Ihr firsl, 2 l-\g DNA was digrs lrd wi th 20U of Hpall rrs lrie tion 
rnzyrTK"; in Ihr s("(()nd, 2l-\g DNA was ineubatrd only wi lh Ihr 
enzymedigrslion bu!frrcontaining no rnzymr. peR produels wrrr 
run in an ABI PRl SM 310 Genrlie analyzer and analYled by mrans 
of thr Genr$can soflwarr. Thr ralios of X-inaeliV'alion wrrr caku-
lalrd using pmk hrigbt ratios d rt rrminrd by Ihe built-in soflware. 
Tnr X-inaeliV'a tion patl rrn was dassified as random (aUrlr ra tios 
5O:50-{)5:35), modrralrly skrwro (ralios 65:35-80:20), hignly 
skrwrd (ratios 80:20-90:10) and extremely skewrd (ra tios 
90: 10-1 00:0), as prrviously eSlablisnrd IOrslavik el al. , 1996; Salon 
1'1 aL , 2008[. 
RESULTS 
Clinical Examination 
family A was composed of 18 Subjec l~ : 3 a!f('( lrd males, I affeclrd 
frmale, 6carrirrfrmalrs,6 hra lthy males, and 2 non-carrirr frmalrs . 
famil y B was composed of 9 subj(,,( ls: 2 a!f('( lrd malrs, 6 carrirr 
frmales, and I non-carrirrfrma!r. No associalrd physical anomalirs 
or hypoawsia werr f('(ognized in any affeclrd subjecl or obligalr 
carrirr from bOlh fami li rs . Nyetalopia was thr ini tial symplom in 
a!f('(lrd ma!rs from bOlh fami!irs wi lh agrs of onsel belw("("n 7 and 
10 years in family A, and belw('("n 15 and 20 years in family B. Visual 
acuity (VA) in a!f('( lrd subjecls from family A ranb'Cd from 20120 10 
light pereeption wilh no color discrimination wni!r bOlh affeclrd 
individuals from fami ly B had a 20120 VA . AlI afhlrd malrs from 
bOlh fami li rs in whom color IrSIS could IX' performrd drmon-
stratrd a Iritanopie patl rrn. funduscopie and fluorangiogra phie 
fralurrs werr consislrnl wi th enoroidrrrmia diagnosis. Diffuse 
enoriorrtinal alrophy wi th sparing of thr macula was obsrrved al 
thr poslrriorpolrofth reye in afhtrd males (fig.~ . lA and 2A). fAG 
drmonslralrs extrnsive alrophy of Ihr enoriocapi Uaris and RPE as 
48