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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS INSTITUTO DE FISIOLOGÍA CELULAR “ANÁLISIS MORFOFUNCIONAL DE LA MADURACIÓN DE LA SECRECIÓN DE INSULINA” TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS P R E S E N T A: Médico Cirujano Carlos Alfonso Larqué Velázquez TUTOR PRINCIPAL: Dra. Marcia Hiriart Urdanivia Instituto de Fisiología Celular MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR Dr. Félix Recillas Targa Instituto de Fisiología Celular Dr. Mohamed El Hafidi Bentlaker Instituto Nacional de Cardiología “Ignacio Chávez” Ciudad Universitaria, Ciudad de México a, mayo de 2017 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. AGRADECIMIENTOS ACADÉMICOS Este trabajo fue apoyado por la Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-UNAM apoyos con clave IN-213114 a M Hiriart e IV-100116 a A Frank Hoeflich; y por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-México) apoyo con clave CB2009-131647 a M Hiriart; Beca de doctorado para Carlos Alfonso Larqué Velázquez. De igual manera agradezco mucho a los servicios de biología molecular, microscopía, cómputo, al bioterio y vivarium del Instituto de fisiología celular y al de citometría del Instituto de ciencias biomédicas. AGRADECIMIENTOS PERSONALES … De la forma más cariñosa y respetuosa agradezco a quienes con cariño me han apoyado y enriquecido en todos sentidos como persona y así enseñarme a honrar la Vida y a maravillarme con ella: Má, Pá, Peche, Cugüeli, Abuelitos, tío Mario, tía Glora, tío Oscar, tía Martha… y ahora Paquito Dra. Marcia y Myrian Hermanos Hugo, Pelono, Lalo, Gordo, Beto, Ramsés, Mike, Nena, Julia y Myrian Tíos, tías, prim@s y sobrin@s (ninguno se me pasa) Amig@s y “Kaligaris” (Todos)… “Amigos e hijos” del laboratorio Hijos Skiuty, Bruno y Ricochette 1 CONTENIDO 1. ABREVIATURAS .......................................................................................... 3 2. RESUMEN..................................................................................................... 8 3. ABSTRACT ................................................................................................... 9 4. MARCO TEÓRICO ...................................................................................... 10 4.1. Morfología general del páncreas .............................................................. 10 4.2. La célula beta y la secreción de insulina .................................................. 12 4.3. Secreción de insulina estimulada por glucosa ......................................... 14 4.4. Desarrollo del páncreas y diferenciación de las células beta ................... 18 4.5. Maduración de la célula beta ................................................................... 25 4.6. Diferenciación in vitro de células beta ...................................................... 28 5. ANTECEDENTES ....................................................................................... 29 5.1. Biología de sistemas y la célula beta ....................................................... 29 6. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ........................................................ 32 7. HIPÓTESIS ................................................................................................. 32 8. OBJETIVO GENERAL ................................................................................ 33 9. OBJETIVOS PARTICULARES ................................................................... 33 10. METODOLOGÍA ......................................................................................... 34 10.1. Diseño experimental ............................................................................. 34 10.2. Reactivos y materiales .......................................................................... 35 10.3. Animales ............................................................................................... 35 10.4. Cultivo primario de células insulares de páncreas ................................ 36 10.5. Purificación de células beta aisladas mediante citometría de flujo (FACS) …………………………………………………………………………………37 10.6. Inmunofluorescencia para determinación de purezas y evaluación de la proliferación celular ............................................................................................ 38 10.7. Extracción de RNA, hibridación y análisis de los microarreglos. ........... 41 10.8. Ensayo hemolítico inverso en placa para insulina (RHPA, reverse hemolythic plaque assay) ................................................................................... 42 10.9. Análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo ........................... 43 10.10. Electrofisiología ..................................................................................... 44 10.11. Análisis estadístico ............................................................................... 46 2 11. RESULTADOS ............................................................................................ 47 11.1. Caracterización morfológica y citométrica de las células insulares de ratas de 1, 20 y 28 días posnatales y adultas (250-280 g). ................................ 47 11.2. Análisis del transcriptoma de las células beta de ratas de 20 días posnatales y adultas (250-280 g) ....................................................................... 48 11.3. Los cambios en el transcriptoma de las células beta se correlacionan con la maduración de la secreción basal de insulina y la secreción estimulada por glucosa durante el desarrollo posnatal ........................................................ 58 11.4. Análisis funcional de genes con contribución significativa en el enriquecimiento de los grupos de genes relacionados con la maduración de las células beta de rata ............................................................................................ 63 11.4.1. Canales de calcio dependientes de voltaje tipo T .............................. 63 11.4.2. Genes que participan en la proliferación y el ciclo celular ................. 68 12. DISCUSIÓN................................................................................................. 74 13. CONCLUSIONES ........................................................................................ 80 14. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 84 3 1. ABREVIATURAS ADP – Difosfato de adenosina Arx – Factor de transcripción con homeodominio relacionado con la ausencia de aristas ATP –Trifosfato de adenosina bHLH – Dominio proteico básico hélice asa hélice BSA – Albumina de suero bovino cAMP - Monofosfato de adenosina cíclico CFTR – Regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística CHG A/B - Cromograninas A y B DAPI – 4’,6’-diamidino-2 fenilindole DMEM – Medio de Earl modificado por Dulbeco EGTA - Ácido etilenglicol-bis [β-aminoethylether] N, N, N’, N’-tetraacético EGTA – Ácido etilenglicol-bis [β-aminoetiléter] N, N, N’, N’-tetraacético FACS – Citometría de flujo basada en fluorescencia (del inglés Fluorescence- Activated Cell Sorting) FBS – Suero bovino fetal FITC – Isotiocianatode fluoresceína 4 Fmo5 – Monooxigenasa 5 que contiene flavina Foxa2 – Factor de transcripción A2 con cabeza de tenedor FSC – Desviación de luz directa GABA – Ácido gamma aminobutírico GEO – Ómnibus de expresión de genes GK – Glucocinasa Glp1r – Receptor de la proteína parecida al glucagon 1 GLUT1 / SLC2A1 – Transportador de glucosa tipo 1 / Acarreador de solutos de la familia 2 miembro 1 GLUT2 / SLC2A2 – Transportador de glucosa tipo 2 / Acarreador de solutos de la familia 2 miembro 2 Gpd 1/2 - Deshidrogenasa 1 de glicerol 3 fosfato GSEA – Análisis de enriquecimiento de grupos de genes GTP - trifosfato de guanosina Hadhsc – Deshidrogenasa de L-3 –hidroxiacil de cadena corta coenzima A HBSS – Solución salina balanceada de Hank HEPES - Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico Isl1 – Factor de transcripción islote 1 KATP – Canal de potasio sensible a ATP 5 Ki67 – Antígeno Ki67 Kir6.2 – Canal de potasio de rectificación entrante 6.2 Kv – Canales de potasio de rectificación tardía MafA/B/C – Factor de transcripción, proteína A/B/C (aviar) de la familia de oncogenes de fibrosarcoma musculoaponeurótico v- maf Mdh1/2 – Deshidrogenasa 1 y 2 de malato MEC – matriz extracelular MIAME – Información mínima acerca de experimentos con microarreglos miRNA – micro ácido ribonucléico MYRIP - proteína de interacción con miosina VIIA y rab NeuroD1 – Factor de transcripción de diferenciación neuronal 1 NFAT – Factor nuclear de activación de las células T Ngn3 – Neurogenina 3 Nkx6.1 – Factor de transcripción homeótico 1 NK 6) NSF – Proteína de fusión sensible a N-etilmaleimida o Proteína de fusión Pax4 – Factor de transcripción con caja pareada 4 Pax6 – Factor de transcripción con caja pareada 6 PBS – Solución amortiguadora de fosfatos 6 Pc – Carboxilasa de piruvato PCSK1 - Convertasa subtilisina/quexina tipo 1 de proproteína Pdx1 – Factor de transcripción 1 con homeodominio pancreático duodenal Pfk1 – Fosfofructocinasa 1 PTPRN - proteína fosfatasa de tirosina, tipo receptor RAB3a y 27 - miembros 3a y 7 de la familia de oncogenes ras RAP1a - miembro RAP1a de la familia de oncogenes RAS RAPGEF4 - factor 4 del intercambiador rap de nucleótidos de guanina Rfk – Cinasa de riboflavina RHPA – Ensayo hemolítico inverso en placa RMA – Promedio robusto de microarreglo RNAseq – Secuenciación de RNA RPH3AL – proteína parecida a rabfilina 3a RRP – Reserva de gránulos (que contienen insulina) listos para ser liberados SANP23/25 – Proteína 23/25 asociada al sinaptosoma SGP – Reserva de gránulos (que contienen insulina) de almacenamiento SLC30A8 - miembro 8 de la familia 30 de transportadores de solutos SNARE – Proteína receptor de unión a la proteína NSF soluble 7 SSC- Desviación de luz en ángulo recto Sur1 – Receptor a sulfonilureas 1 SYT3, 5 y 7 - sinaptotagminas 3, 5 y 7 TRP – Receptores de potencial transitorio VAMP – Proteínas asociadas a vesículas o Sinaptobrevinas VDCC – Canales de calcio dependientes de voltaje VGNS – Canales de sodio sensibles a voltaje 8 2. RESUMEN La investigación para entender el desarrollo posnatal de las células beta pancreáticas se ha vuelto de mucho interés en los últimos años. La comprensión de los mecanismos que controlan la maduración posnatal de las células beta podría generar nuevas oportunidades de tratamiento para la diabetes. El período de ablactación es considerado como una ventana crítica del desarrollo posnatal del páncreas, en la que se han observado cambios estructurales y fisiológicos relacionados con la maduración de las células beta. Para determinar los cambios en el transcriptoma de las células beta que pudieran estar relacionados su maduración durante este período, se realizó un análisis mediante microarreglos, del transcriptoma de poblaciones enriquecidas de células beta obtenidas por citometría de flujo basada en fluorescencia (FACS) a partir de cultivos primarios de páncreas de ratas de distintas edades. Nuestros resultados mostraron una gran cantidad de grupos de genes que incluyen algunos relacionados con la integración del metabolismo, la modulación de la actividad eléctrica y la regulación del ciclo celular que juegan un papel importante en el proceso de maduración de las células beta. Estas observaciones fueron validadas usando el ensayo hemolítico inverso en placa para insulina, registros electrofisiológicos y análisis con citometría de flujo. Además, nos permitieron proponer algunas vías nuevas como la del metabolismo de esfingolípidos, la del procesamiento y tráfico de vesículas que contienen insulina, la de la regulación de la transcripción por el miRNA-30, la de las proteínas de tráfico intracelulares y las proteínas del ciclo celular; que podrían jugar un papel importante en el proceso de maduración mencionado. 9 3. ABSTRACT Research on the postnatal development of pancreatic beta cells has become an important subject in recent years. Understanding the mechanisms that govern beta cell-postnatal maturation could bring new opportunities to therapeutic approaches for diabetes. The weaning period consists of a critical postnatal window for structural and physiologic maturation of rat beta cells. To investigate transcriptome changes involved in the maturation of beta cells neighboring this period we performed microarray analysis in fluorescence-activated cell sorted (FACS) beta- cell enriched populations. Our results showed a variety of gene sets including those involved in the integration of metabolism, modulation of electrical activity, and regulation of the cell cycle that play important roles in the maturation process. These observations were validated using reverse hemolytic plaque assay, electrophysiological recordings, and flow cytometry analysis. Moreover, we suggest some unexplored pathways such as sphingolipid metabolism, insulin- vesicle trafficking, regulation of transcription/transduction by miRNA-30, trafficking proteins, and cell cycle proteins that could play important roles in the process mentioned above for further investigation. 10 4. MARCO TEÓRICO 4.1. Morfología general del páncreas El páncreas es una glándula abdominal de secreción mixta que posee un componente exócrino y un componente endócrino. El páncreas exócrino constituye cerca del 98 % del volumen de la glándula y está conformado por acinos (arreglos saculares de células epiteliales cuboideas llamadas acinares) que producen y secretan enzimas digestivas; y conductos pancreáticos que secretan bicarbonato y vierten la secreción pancreática al duodeno durante la digestión de los alimentos (Hiriart M 2005) (Figura 1A y 1C) El páncreas endócrino forma entre el 1 y 3 % del volumen de la glándula y se conforma por agrupaciones (de 50 a 500 um de diámetro) de células llamados islotes (clásicamente llamados de Langerhans) que se encuentran inmersos entre las estructuras que componen el páncreas exócrino. Los islotes pancreáticos contienen 5 tipos diferentes de células productoras de hormonas: 1) células beta productoras de insulina (60-80 % del total de células en el islote de roedor); 2) células alfa productoras de glucagón (10-30 % del total de células en el islote de roedor); 3) células delta productoras de somatostatina (3-5 % del total de células insulares en roedores); 4) células PP productoras de polipéptido pancreático (1-3 % de las células insulares en roedores) y; 5) células épsilon productoras de ghrelina (1-2 % de las células insulares en roedores) (Pan and Wright 2011) (Roscioni, et al. 2016). 11 La conformación de los islotes puede variar dependiendo de la especie animal. En los islotes de roedores, las células beta están distribuidas en el centro y los demás tipos celulares en la periferia (Figura 1B). Además, los islotes de la porción inferiorde la cabeza y del proceso uncinar del páncreas (derivados de la yema anterior; ver sección desarrollo del páncreas) contienen más células PP y menos células alfa y beta que los islotes de la parte superior de la cabeza, el cuerpo y la cola del páncreas. En los islotes humanos, los 5 tipos celulares se encuentran intercaladas sin patrón conocido hasta ahora (Kim, et al. 2009; Roscioni et al. 2016). Finalmente cabe señalar que, dado que cada islote pancreático constituye un microórgano, su nicho comprende otros tipos de células no endócrinas como neuronas, células endoteliales y células mesenquimatosas. Actualmente, se sugiere que la relación entre la matriz extracelular (MEC) y las células; y las uniones intercelulares podrían jugar un papel importante en la composición, la polaridad y la heterogeneidad funcional de las células beta (Roscioni et al. 2016). La irrigación sanguínea de los islotes ocurre del centro hacia la periferia de manera que en los roedores, las células beta se perfunden primero con sangre rica en oxígeno, seguidas de las células alfa y delta (Richards, et al. 2010; Roscioni et al. 2016). La inervación autónoma de los islotes pancreáticos se establece durante los primeros días de vida posnatal y juega un papel preponderante en la regulación de la secreción de insulina y glucagon (Cabrera-Vasquez, et al. 2009) (Roscioni et al. 2016). Además, se ha sugerido que podría jugar un papel importante en la 12 maduración y el mantenimiento del número de células beta dentro del islote (Borden, et al. 2013; Di Cairano, et al. 2016) (Figura 1C). 4.2. La célula beta y la secreción de insulina Las células beta pancreáticas están altamente especializadas y son las únicas capaces de sintetizar y secretar insulina en el humano y los roedores. Estas células pueden ser consideradas como sensores energéticos del cuerpo debido a su capacidad constante de monitorear los niveles de nutrimentos en el medio extracelular así como de responder a los cambios en sus concentraciones mediante variaciones en la secreción de insulina. La glucosa constituye el estímulo más importante para el proceso de secreción de insulina, aunque éste también puede ser estimulado por diversos secretagogos como otros nutrimentos, neurotransmisores, hormonas y fármacos (Hiriart, et al. 2014; Velasco, et al. 2016). La insulina es una hormona anabólica que promueve la entrada de glucosa a las células del músculo esquelético y del tejido adiposo. Además, regula el almacenamiento de carbohidratos, lípidos y proteínas en el hígado, tejido adiposo y el músculo. Por esta razón, el proceso de secreción de insulina es fundamental en la homeostasis de nutrimentos corporales (Hiriart et al. 2014). 13 FIGURA 1. Morfología general del páncreas. A) Anatomía humana del páncreas B) Histología del páncreas de rata en donde se señalan los componentes exócrino y endócrino. C) Organización celular de los islotes de rata. 14 4.3. Secreción de insulina estimulada por glucosa La secreción de insulina estimulada por glucosa es un fenómeno complejo de transducción de señales que incluye el acoplamiento de procesos metabólicos a procesos eléctricos en las células beta. Éste proceso inicia cuando los niveles de glucosa en el medio extracelular se elevan (por encima de 7 mM) después de la ingestión de alimentos. Comprende una serie de eventos proximales tales como la internalización de la glucosa a través de proteínas transportadoras -GLUT2 en roedores (SLC2A2) o GLUT1 en humanos (SLC2A1)- localizadas en la membrana de las células beta; su fosforilación por la enzima glucocinasa (GK por sus siglas en inglés), el catabolismo de la misma en la glucólisis, el ciclo de Krebs y en la fosforilación oxidativa que resultan en un aumento en la relación intracelular de ATP/ADP. También comprende una serie de eventos distales que incluyen la activación de diferentes canales iónicos en la membrana celular, y que regulan la actividad eléctrica de la célula y de esta manera la secreción de insulina (Hiriart et al. 2014) (Hiriart M, et al. 2015). Cabe señalar que se ha propuesto que el flujo glucolítico en las células beta es regulado por el transporte de glucosa hacia el interior de las células y la actividad enzimática de la GK (Prentki and Matschinsky 1987; Prentki, et al. 2013). En las células beta de rata, el metabolismo de la glucosa produce un aumento en la relación ATP/ADP intracelular provoca el cierre de los canales de potasio sensibles a ATP (KATP, por su siglas en inglés) que aunado a la actividad de canales catiónicos no selectivos del tipo de receptores de potencial transitorio (TRP, transient receptor potential) inician una despolarización lenta del potencial 15 de membrana. Cuando el potencial alcanza valores de alrededor de -40 mV, aumenta la probabilidad de apretura de los canales de sodio (VGNS “voltage- gated sodium channels” por sus siglas en inglés) y de calcio (VDCC “voltage- dependent calcium channels” por sus siglas en inglés) tipo T dependientes de voltaje. Esto conlleva a un aumento en la entrada tanto de sodio (Na+) como de calcio (Ca2+) a la célula y así a una despolarización lenta. Posteriormente, alrededor de los -20 mV, los VDCC tipo P/Q, N y L (en roedores) se activan y aumentan su conductancia, lo que resulta en un incremento de la concentración intracelular de calcio, la despolarización de la membrana (con potencial en forma de meseta) y la aparición de ráfagas de potenciales de acción superpuestos; provocando la exocitosis de gránulos que contienen insulina (Hiriart and Aguilar- Bryan 2008; Velasco et al. 2016). Finalmente, la actividad de los canales de potasio de rectificación tardía (Kv) y los canales de potasio dependientes de voltaje sensibles a calcio repolarizan el potencial de membrana y por lo tanto disminuyen la secreción de insulina estimulada por glucosa (Yang, et al. 2014) (Figura 2A). Actualmente, se conoce que la secreción de insulina en respuesta a una elevación sostenida en la concentración de glucosa es bifásica. La primera fase aparece como una elevación rápida y transitoria de la secreción de insulina (de entre 5 y 10 min de duración) después de un período corto de tiempo tras la estimulación. En ésta se secreta la reserva de gránulos con insulina, previamente atracados a la membrana y que se encuentran disponibles para fusionarse con la membrana celular y liberar su contenido (RRP “readily releasable pool” por sus siglas en 16 inglés; y constituyen entre 1 y 2 % del total de gránulos con insulina en las células beta). La segunda fase aparece como una elevación lenta y prolongada de la secreción de insulina que persiste mientras haya estimulación con glucosa. En ésta se secretan gránulos de la reserva de almacenamiento (SGP “storage- granule pool” por sus siglas en inglés) que se procesan, movilizan, atracan y fusionan a la membrana una vez que la célula beta es estimulada (Hiriart M 2005, (Wang and Thurmond 2009) (Suckale and Solimena 2010). Se conoce que las señales de calcio intracelulares que disparan la exocitosis de gránulos de insulina son necesarias para la secreción de insulina estimulada por glucosa en ambas fases de la secreción. Sin embargo, se ha propuesto que el metabolismo, principalmente de glucosa, es importante en la segunda fase (sostenida) de la secreción de insulina debido a que esta vía de señalización - independiente de los canales KATP y del potencial de membrana- sensibiliza a la maquinaria exocítica de la célula a los cambios en la concentración intracelular de calcio y promueve el procesamiento, translocación, anclaje y fusión de los gránulos de la reserva de almacenamiento con la membrana plasmática (Hiriart M 2015) (Henquin 2000) (Straub, et al. 2004) (Ferdaoussi, et al. 2015; Ohara- Imaizumi, et al. 2007). Recientemente, algunos trabajosde análisis dinámicos de secreción de insulina en islotes pancreáticos de ratón, han sugerido que las señales de amplificación producidas por la glucosa pueden tener un papel regulador en la primera fase de secreción de insulina en respuesta a la glucosa (Henquin 2011). 17 El procesamiento, translocación, anclaje y fusión de los gránulos que contienen insulina, se lleva a cabo mediante proteínas de dos tipos: 1) proteínas ciclasas de nucleótidos de GTP/GDP y, 2) proteínas del complejo SNARE (“soluble NSF attachment protein receptor”) que incluyen a proteínas de membrana como la sintaxina y la SNAP23/25; y a proteínas asociadas a vesículas como VAMP (sinaptobrevinas). En conjunto, la interacción de las proteínas SNARE con los VDCC permiten coordinar la entrada de Ca2+ a la célula con el proceso de exocitosis de los gránulos que contienen insulina (Hiriart M, et al. 2015, (Jewell, et al. 2010) (MacDonald, et al. 2005) (Figura 2B). 18 FIGURA 2. Secreción de insulina estimulada por glucosa. A) Descripción general del proceso de secreción de insulina, desde la entrada de glucosa a la célula beta hasta la exocitosis de los gránulos que contienen insulina. B) Secreción bifásica de insulina después de un estímulo con glucosa. 4.4. Desarrollo del páncreas y diferenciación de las células beta La organogénesis del páncreas comprende una compleja y coordinada serie de procesos en la que intervienen diversas vías de señalización e interacciones epitelio mesénquima. En el desarrollo embrionario de la rata, este proceso inicia aproximadamente a partir del día E9.5 – E10.5 con la especificación del territorio pancreático en la parte final del intestino anterior del embrión, que se evidencia con la expresión del factor de transcripción 1 con homeodominio pancreático duodenal (Pdx1, por sus siglas en inglés). Al mismo tiempo, se observa un engrosamiento del mesénquima que rodea el territorio pancreático. Alrededor del día E10.5 se observan dos engrosamientos del endodermo hacia el mesénquima, el primero en la región posterior del tubo (yema pancreática posterior o dorsal) y el segundo, que sucede al primero en la parte anterior (yema hepatobiliar o anterior). Cabe señalar que los morfógenos que inducen la aparición de ambas yemas son diferentes y se ha propuesto que esto puede contribuir a la heterogeneidad funcional y morfológica de los islotes adultos (Slack, et al. 1995) (Pan and Wright 2011) (Gittes 2009) (Roscioni et al. 2016) (Figura 3A). Durante la organogénesis temprana, el epitelio de ambas yemas prolifera (“transición primaria”), se estratifica paulatinamente, se polariza y forma un microlumen en su interior. Subsecuentemente, ambas yemas se elongan hacia el 19 mesénquima que las rodea y al mismo tiempo se ramifican en sus porciones apicales formando una red tubular de forma arborescente (Pan and Wright 2011). Durante esta etapa inicial, aparecen algunas células con gránulos de secreción endócrina, principalmente glucagon, cuyo papel en el desarrollo se desconoce además de que se ha demostrado que dichas células no forman parte de la arquitectura posnatal de los islotes. La posterior rotación del tubo digestivo (entre el día E13 y E14 aproximadamente) permite la fusión de ambos primordios pancreáticos; cada uno con su conducto interno. Las células acinares se forman a partir de las células epiteliales de las puntas de las ramificaciones que proliferan de forma activa (Pan and Wright 2011; Slack et al. 1995) (Figura 3B). Entre el día E14 y E18 del desarrollo de la rata, aparecen en el epitelio de los troncos de las yemas ramificadas, células que expresan el factor de transcripción tipo bHLH (básico hélice asa hélice) Ngn3 (Neurogenina 3) y que constituyen una población progenitora de las células insulares (Schwitzgebel, et al. 2000) (Gu, et al. 2002). Éstas células se delaminan, se diferencian y se agrupan en forma de cordones que posteriormente dan origen a los islotes. Durante estos procesos estas células progenitoras se dividen y dan origen a células post mitóticas que expresan factores de transcripción como NeuroD1 (Diferenciación neuronal 1), Nkx6.1 (Homeótico 1 NK6) y Pax6 (Caja pareada 6) (Jensen, et al. 2000). El aumento considerable en el número de células endócrinas incluyendo a las células beta, es conocido como “transición secundaria” (Gittes 2009; Oliver-Krasinski and Stoffers 2008). Se ha sugerido que además de jugar un papel importante en la especificación del territorio pancreático, el factor de transcripción Pdx1 es esencial 20 para la aparición, supervivencia o proliferación de las células progenitoras endócrinas del páncreas (Burlison, et al. 2008) (Figura 3C). El factor de transcripción Ngn3 activa la programación endócrina mediante la inducción de otros factores de transcripción como son NeuroD1, Pax4, Arx (Homeodominio relacionado con la ausencia de aristas), Isl1 (Islote 1) y Nkx2.2 (Homeótico 2 NK2) (Oliver-Krasinski and Stoffers 2008). La evidencia experimental sugiere que los niveles y la ventana temporal de expresión de la Ngn3 está relacionada con la diferenciación de las células progenitoras hacia linajes específicos. Así, la expresión de Ngn3 entre los días E12.5 y E15.5 es importante para la diferenciación hacia la estirpe beta (Johansson, et al. 2007). La expresión de Ngn3 disminuye casi hasta desaparecer en la vida posnatal, sin embargo, recientemente se ha observado que las células beta mantienen una expresión muy baja que podría relacionarse con su funcionamiento durante la vida adulta (Wang, et al. 2009). La especificación del linaje y la diferenciación de las células beta requieren de la expresión de varios factores de transcripción específicos y a continuación de mencionarán los más conocidos (Figura 3D). El factor de transcripción Pax4 de la familia Pax (que contienen un par de dominios de caja de unión a DNA), es expresado en el territorio pancreático desde etapas tempranas del desarrollo. Estudios del linaje de dichas células han observado que las células que expresan Pax4 pueden dar origen a todos los tipos de células endócrinas. Además, se ha demostrado que la expresión de Pax4 es 21 necesaria para la diferenciación de células beta así como su capacidad para inhibir la expresión del factor de transcripción Arx que favorece la diferenciación hacia la estirpe alfa (Sosa-Pineda, et al. 1997; Wang, et al. 2004). El factor de transcripción tipo Nkx2.2 comienza a expresarse alrededor del día E10.5 en el desarrollo de la rata, sin embargo su expresión queda restringida a las células alfa, beta, delta y PP a partir del día E16.5 (Sussel, et al. 1998). La forma con el exón A sólo se expresa en las células beta y es regulada por Foxa2 (Caja con cabeza de tenedor A2) unido a NeuroD1 (Gittes 2009). Se ha propuesto Nkx2.2 puede jugar tanto un papel represor de la transcripción de otros factores durante el desarrollo embrionario, como un papel activador durante la maduración y la función posnatal de las células beta ya que su expresión se correlaciona con los niveles de expresión del factor de transcripción MafA (Proteína A (aviar) de la familia de oncogenes de fibrosarcoma musculoaponeurótico v-maf), el transportador Glut-2 y la insulina (Doyle, et al. 2007; Doyle and Sussel 2007; Oliver-Krasinski and Stoffers 2008). El factor Nkx6.1 es expresado en el epitelio pancreático desde el día E11.5 en la rata y restringe su expresión a las células progenitoras endócrinas y posteriormente a las células beta, incluso durante la vida posnatal (Rudnick, et al. 1994; Sander, et al. 2000). Se ha propuesto que Nkx6.1 participa en la regulación de la secreción de insulina en las células beta maduras; y se ha sugerido que es capaz de reprimir la expresión del gen de glucagon en líneas celulares (Gauthier, et al. 2007; Schisler, et al.2005). 22 La familia de factores de transcripción Maf del tipo básico con dominio de cierre de leucina está constituida por tres miembros, MafA, MafB y c-Maf y se expresan en los islotes pancreáticos. El factor MafA es específico de las células beta y se ha identificado como el activador de la transcripción del gen de la insulina a través de su unión al elemento RIPE3b1 del promotor de dicho gen (Kataoka, et al. 2002; Matsuoka, et al. 2004; Olbrot, et al. 2002). Asimismo, se ha observado que MafA y Pdx1 regulan su transcripción de manera recíproca (Raum, et al. 2006; Samaras, et al. 2003). La expresión de MafA inicia a partir del día E14.5 de rata, en las células que expresan insulina y se mantiene en dicha población aún durante la vida adulta (Matsuoka et al. 2004). Datos experimentales sugieren que MafA juega un papel importante en la secreción de insulina estimulada por glucosa (Nishimura, et al. 2006; Zhang, et al. 2005). El factor MafB comienza a expresarse en las células alfa y beta de rata desde el día E13.5 y su expresión queda restringida a las células alfa en los islotes adultos (Artner, et al. 2006). Se ha propuesto a MafB como regulador de los genes MafA, Glut-2 y Nkx6.1 debido a que se puede unir a sus regiones promotoras. Finalmente, se ha propuesto que el cambio en la expresión de MafB por MafA durante el desarrollo embrionario se relaciona con un aumento en la expresión de Pdx1 en las células beta (Nishimura et al. 2006). El estudio del papel de los factores de transcripción de la familia del tipo “forkhead” (cabeza de tenedor) Foxa2 durante el desarrollo embrionario ha sido complicado debido a que en modelos de ratón “knockout” para dicho factor, se produce la muerte del embrión en el día E11. Sin embargo, Foxa2 ha sido propuesto como 23 participante en la diferenciación de las células beta a través de trabajos en donde ha sido deletado en las células beta de ratones adultos. Dicha ablación provoca una disminución en la expresión de genes blanco de dicho factor como Sur1 (Receptor a sulfonilureas 1), Kir6.2 (Canal de potasio de rectificación entrante 6.2) y Hadhsc (Deshidrogenasa de L-3-hidroxiacil de cadena corta coenzima A); así como alteraciones en la respuesta a calcio y en el atracamiento de gránulos que contienen insulina a la membrana plasmática (Ang and Rossant 1994; Gao, et al. 2007; Sund, et al. 2001). 24 FIGURA 3. Desarrollo embrionario del páncreas de rata y maduración de las células beta. A) Anatomía del páncreas embrionario de rata. B) Descripción del proceso de elongación y ramificación de las yemas pancreáticas (Transición primaria). C) Aparición y delaminación de células progenitoras endócrinas (Ngn3+) en los conductos y su posterior diferenciación hacia células insulares (Transición secundaria). Se muestran inmunofluorescencias para la detección de Ngn3 (verde) y núcleos (rojo) en los conductos del páncreas embrionario de rata E15.5. D) Páncreas embrionario de rata (día 15.5 de gestación) y factores de transcripción expresados por las células progenitoras endócrinas y células beta durante su diferenciación y maduración. 25 4.5. Maduración de la célula beta Como se mencionó, las células beta se derivan de una población de células progenitoras en el embrión. El número de células beta al momento del nacimiento depende tanto de la renovación como de la diferenciación de dichas células progenitoras durante el desarrollo embrionario (Stanger, et al. 2007). Se ha sugerido que después del nacimiento, la masa de células beta (número total de células beta pancreáticas en un momento dado) está dada por la diferenciación celular a partir de células progenitoras (neogénesis), el aumento del tamaño de las células (hipertrofia), la muerte celular programada (apoptosis) y la proliferación celular. Sin embargo se ha demostrado que en condiciones normales, la proliferación es el mecanismo principal que regula y determina la cantidad de células beta que se generan durante la ablactación, que constituye el período de mayor expansión de la masa de células beta en el páncreas (Aguayo-Mazzucato, et al. 2006; Dor, et al. 2004; Teta, et al. 2007) (Figura 4A). Por otro lado, se ha observado que la capacidad de proliferación de las células beta de roedores disminuye en función de la edad (Lee and Nielsen 2009). Se ha propuesto que aunado a la disminución en la capacidad proliferativa de las células beta en el período posnatal; la maduración funcional de estas, está determinada por su capacidad de secretar cantidades robustas de insulina en condiciones de glucosa basal en el medio extracelular (4.5 y 5.6 mM) así como de aumentar dicha secreción en correlación directa con concentraciones estimulantes de glucosa (> 7 mM) (Hiriart and Aguilar-Bryan 2008). Trabajos previos en nuestro laboratorio han demostrado la presencia de una ventana crítica posnatal en el desarrollo de los 26 islotes pancreáticos durante el período de ablactación de la rata (entre los días 20 y 28 del desarrollo posnatal en el laboratorio) (Aguayo-Mazzucato et al. 2006). La ablactación representa una situación de estrés metabólico debido al cambio de la dieta a base de leche rica en grasa hacia una dieta rica en carbohidratos. En nuestro laboratorio se ha observado que durante el período de ablactación (a partir del día 20 posnatal en condiciones de laboratorio), las ratas presentan un estado de resistencia fisiológica a la insulina con hiperinsulinemia relativa e hiperglucemia que se asocia al inicio de la maduración funcional de la secreción de insulina (Aguayo-Mazzucato et al. 2006). Diversos trabajos sugieren que el proceso de maduración de las células beta incluye cambios en: a) los niveles de expresión de canales iónicos relacionados con la secreción de insulina. b) los niveles de expresión de transportadores de glucosa (Navarro-Tableros, et al. 2007; Richardson, et al. 2007); c) la actividad enzimática de la glucocinasa (Taniguchi, et al. 2000), d) en la expresión de conexinas que forman las uniones comunicantes entre las células beta (Carvalho, et al. 2010); e) la expresión de proteínas que funcionan como marcadores de células beta maduras como la urocortina 3 (Blum, et al. 2012; van der Meulen, et al. 2012); f) la activación de la vía de señalización de la calcineurina/Factor nuclear de activación de las células T (NFAT por sus siglas en inglés) (Goodyer, et al. 2012) y g) la conformación estructural del islote per se, en su vasculatura y en su inervación (Cabrera-Vasquez et al. 2009) (Figura 2B). 27 FIGURA 4. Mecanismos de mantenimiento (in vivo) de la población de células beta y maduración de las células beta durante la ventana crítica del desarrollo posnatal (ablactación). A) Mecanismos fisiológicos que permiten mantener la población de células beta en el páncreas de rata durante la vida posnatal. B) Maduración de la secreción de insulina estimulada por glucosa durante el período de la lactancia y la ablactación (ventana crítica del desarrollo posnatal) de la rata. 28 4.6. Diferenciación in vitro de células beta La investigación relacionada con el desarrollo embrionario y posnatal de las células beta pancreáticas ha cobrado relevancia en años recientes. El conocimiento y la comprensión de las vías de señalización, los factores de transcripción y los mecanismos que regulan la diferenciación y la maduración posnatal de las células beta constituyen un pilar en la generación de nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento de la diabetes mellitus. Los avances en el área han permitido desarrollar algoritmos para generar células secretoras de insulina a partir de células troncales embrionarias o reprogramadas de humano y de ratón. Además se especula que dichos avances también permitirán controlar la proliferación y subsecuente maduración funcional delas células beta in vivo (Kumar, et al. 2014; Mayhew and Wells 2010; Schroeder 2012) (Figura 5). Trabajos recientes han sugerido la posibilidad de utilizar diferentes estrategias para generar células secretoras de insulina in vitro (Sena, et al. 2010; Vetere, et al. 2014). Estas células poseen algunas características parecidas a las de las células beta normales, que incluyen la presencia de gránulos que contienen insulina o la expresión de genes relacionados con las células beta. Sin embargo, dichas células poseen una secreción de insulina estimulada por glucosa poco desarrollada así como diferencias importantes en el transcriptoma cuando son comparadas con células beta maduras normales (D'Amour, et al. 2006; Hrvatin, et al. 2014; Narayanan, et al. 2014; Pagliuca, et al. 2014). 29 FIGURA 5. Mecanismos propuestos para regeneración de células beta pancreáticas. 5. ANTECEDENTES 5.1. Biología de sistemas y la célula beta La utilización de metodologías como la citometría de flujo y de herramientas para analizar el transcriptoma de las células beta ha permitido un abordaje desde la perspectiva de la biología de sistemas. La biología de sistemas constituye una disciplina que analiza las propiedades sistémicas y las interacciones dinámicas en un objeto biológico de una manera cualitativa y cuantitativa mediante la combinación de estudios experimentales con modelos matemáticos (Klipp E, et al. 2016). Esta disciplina permite el estudio metodológico y comprensivo de sistemas biológicos complejos mediante la 30 recopilación y análisis de datos a gran escala para generar y probar modelos de procesos biológicos. La biología de sistemas utiliza tecnologías de nueva generación como microarreglos, RNAseq y espectrometría de masas entre otras; en combinación con herramientas estadísticas y computacionales para analizar las interacciones de los componentes de un sistema biológico e interrogarlo experimentalmente. Los abordajes experimentales de la biología de sistemas pretenden ir más allá de la determinación de correlaciones simples para determinar cómo interaccionan los componentes del sistema. El análisis de dichas interacciones puede basarse en conexiones bibliográficas, evidencia experimental de interacciones físicas o de procesos de regulación que pueden ser descritas en forma de redes y pueden ser modeladas matemáticamente de manera que permiten la predicción de respuestas del sistema ante ciertos estímulos (Lusis, et al. 2008). Trabajos recientes han utilizado la citometría de flujo o la microdisección con láser para obtener poblaciones enriquecidas de células beta de ratas neonatas y ratas adultas para analizar los cambios en la expresión de sus genes. Estos trabajos han sugerido que genes de factores de transcripción como MafA y NeuroD1, de receptores como Glp1r (Receptor de la proteína parecida al glucagon 1); genes relacionados con el metabolismo como Slc2a2/Glut2, Pfk1 (fosfofructocinasa 1), Pc (carboxilasa de piruvato), Fmo5 (Monooxigenasa 5 que contiene flavina), Rfk (cinasa de riboflavina); y de intercambiadores mitocondriales como Mdh1/2 (Deshidrogenasa 1 y 2 de malato) y Gpd1/2 (Deshidrogenasa 1 de glicerol 3 fosfato) podrían relacionarse con la maduración de la secreción de insulina 31 estimulada por glucosa (Aguayo-Mazzucato, et al. 2011; Jermendy, et al. 2011; Martens, et al. 2014). Sin embargo, el análisis por inmunotinción sugiere que el RNA extraído de células obtenidas a partir de la microdisección con láser incluyera transcritos de genes de otras estirpes celulares debido a las diferencias en la composición celular de los islotes en distintas etapas del desarrollo posnatal temprano (Jermendy et al. 2011). Por otro lado, se ha sugerido que los análisis del transcriptoma de células basado en los cambios en los valores de expresión de genes pueden pasar por alto los efectos de algunos procesos celulares o vías de señalización complejas (Subramanian, et al. 2005). Finalmente, es importante considerar que el proceso de maduración de la secreción de insulina estimulada por glucosa está correlacionada con la fase de ablactación de la rata y que la comparación utilizando animales recién nacidos podría no reflejar los cambios transcripcionales en esta etapa del desarrollo posnatal . 32 6. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA La determinación y el análisis de la expresión genética de las células beta pancreáticas, permitirá conocer y entender los mecanismos moleculares y las vías de señalización y metabólicas que participan en la maduración de la secreción de insulina estimulada por glucosa y otros procesos fisiológicos durante la ventana crítica del desarrollo posnatal del páncreas. 7. HIPÓTESIS Los genes que codifican proteínas que participan en el metabolismo de la glucosa (glucólisis, ciclo de ácidos tricarboxílicos, fosforilación oxidativa), en la generación del potencial de acción y en la diferenciación de las células beta cambiarán sus niveles de expresión durante la ventana crítica del desarrollo posnatal del páncreas, y se correlacionarán con el proceso de maduración de la secreción de insulina estimulada por glucosa de la célula beta. 33 8. OBJETIVO GENERAL El objetivo del presente trabajo consistió en analizar el contexto morfofuncional de poblaciones enriquecidas de células beta inmaduras (neonatales, 20d y 28d posnatal) y maduras (adultas) obtenidas mediante citometría de flujo para conocer los cambios en el transcriptoma que participan en su maduración. 9. OBJETIVOS PARTICULARES • Obtener poblaciones enriquecidas de células beta a partir de cultivos primarios de ratas neonatas (posnatal 0), lactantes (día 20), ablactadas (día 28) y adultas de 250-280 g (10-12 semanas de edad). • Obtener, analizar y comparar el transcriptoma de poblaciones enriquecidas de células beta obtenidas mediante citometría de flujo. • Determinar los principales grupos funcionales de genes y los genes individuales que pueden estar relacionados con la maduración de las células beta y la secreción de insulina. • Realizar validaciones funcionales de los grupos de genes y genes individuales que participan en el proceso de maduración de las células beta y la secreción de insulina. 34 10. METODOLOGÍA 10.1. Diseño experimental Aislamiento de células insulares Poblaciones enriquecidas de células beta (Fluorescence-activated cell sorting) Páncreas neonatal, 20d, 28d y Adultas Análisis funcional Neo, 20d, 28d y Adultas Análisis transcripcional 20d vs Adultas (Microarreglos) • RHPA • Electrofisiología • Citometría de flujo 35 10.2. Reactivos y materiales Los reactivos fueron obtenidos de las siguientes fuentes: Solución salina balanceada de Hank (HBSS por sus siglas en inglés), ácido etilenglicol-bis [β- aminoetiléter] N, N, N’, N’-tetraacético (EGTA), Ficoll 400, azul tripano, Poli-L- lisina, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico (HEPES), proteína A de Staphylococcus aureus, tripsina de Sigma-Aldrich (St. Louis MO, EUA); colagenasa P de Roche (Mannheim, Alemania), Sales para medio de Earl modificado por Dulbeco (DMEM), solución penicilina-estreptomicina, Medio Ham F10, solución de L-glutamina, suero bovino fetal (FBS), complemento de cobayo de Life Technologies (Grand Island, NY, EUA); polvo de albúmina de suero bovino liofilizada (BSA) de United States Biological (Swampscott, MA, EUA) 10.3. Animales Todos los procedimientos realizados en este trabajo fueron aprobados por el Comité de Cuidado Animal del Instituto de Fisiología Celular de la Universidad Nacional Autónoma de México. El cuidado de los animales se llevó a cabo de acuerdo con los “International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals”, del “Council for International Organization of Biomedical Sciences”,2010. Todos los experimentos, exceptuando el análisis con microarreglos, se realizaron en ratas macho Wistar recién nacidas (1 día posnatal), lactantes (20 días posnatales), ablactadas (28 días posnatales) y adultas jóvenes (250-280 g). Los animales fueron obtenidos del bioterio local del Instituto de Fisiología Celular 36 UNAM y fueron mantenidos en vivario con ciclos de luz/obscuridad de 12 h y temperatura constante de 22 °C. Las ratas fueron mantenidas con sus madres desde su nacimiento hasta el día 20 posnatal; y alimentadas con croquetas estándar Laboratory rodent diet 5001 (Lab Diet, St. Louis, MO. EUA) a partir del día 21 de edad. 10.4. Cultivo primario de células insulares de páncreas Previo a la disección del páncreas, las ratas utilizadas, fueron anestesiadas mediante una inyección de pentobarbital sódico (40 mg/kg). Posterior a la cirugía, se realizó dislocación cervical a cada uno de los animales. Las células insulares pancreáticas fueron obtenidas mediante un procedimiento descrito previamente en trabajos del laboratorio (Aguayo-Mazzucato et al. 2006). Los islotes pancreáticos fueron aislados y separados del tejido acinar mediante digestión por colagenasa (0.5 mg/ml) en solución salina balanceada de Hank y centrifugación en una solución con gradiente de concentración de Ficoll (para los islotes de ratas neonatales); y separados manualmente utilizando un microscopio esteroscópico (para los islotes de ratas lactantes, ablactadas y adultas). La disociación de las células insulares se realizó mediante incubación de los islotes en una solución libre de calcio con 5.6 mM de glucosa, 0.5% de BSA y 3 mM de EGTA (ácido etilenglicol-bis [β-aminoethylether] N, N, N’, N’-tetraacético) a 37 °C en baño con agitación durante 5 minutos; y posterior disgregación mecánica en la misma solución adicionada con tripsina (concentración final de 0.01%). La 37 disociación fue detenida cuando 50 ó 60 % de las células se observaron completamente aisladas. 10.5. Purificación de células beta aisladas mediante citometría de flujo (FACS) Previo al proceso de aislamiento mediante FACS, las células insulares obtenidas por medio de cultivo primario, fueron incubadas en medio DMEM suplementado con 0.05 % de BSA, 200 U/ml de penicilina G y 200 µg/ml de estreptomicina durante 45-60 minutos a temperatura ambiente; y filtradas utilizando mallas de nylon con poros de 70 µm de diámetro para remover agregados celulares. Para el proceso de aislamiento, las células insulares fueron enjuagadas, transportadas en solución de aislamiento (123 mM de NaCl, 1.8 mM de CaCl2, 0.8 mM de MgSO4, 5.4 mM de KCl, 1 mM de NaH2PO4, 2.8 mM de glucosa, 4.2 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.5 % de BSA, 200 U/ml de penicilina G y 200 µg/ml de estreptomicina) (Stangé G 2003). Las células beta fueron aisladas utilizando un citómetro FACSAria I (Becton, Dickinson and Company, San Diego, CA. EUA) (con láseres azul y rojo). Las células beta purificadas fueron recibidas y cultivadas en medio Ham F10 suplementado con 10% de suero bovino fetal, 200 µM de L- glutamina, 200 U/ml de penicilina G, 200 µg/ml de estreptomicina, y 0.5 µg/ml de anfotericina. La estrategia de purificación consistió en: 1) la selección de eventos aislados en una gráfica con los parámetros FSC-H/FSC-A; 2) la selección de eventos con la fluorescencia (emitida entre 515 y 545 nm de longitud de onda; FITC-A) mayor en 38 una gráfica con los parámetros FITC-A/FSC-A; 3) la selección de eventos con valores altos de complejidad interna (SSC-A) en una gráfica con los parámetros SSC-A/FITC-A (Figura 6). 10.6. Inmunofluorescencia para determinación de purezas y evaluación de la proliferación celular Las células beta aisladas mediante FACS fueron adheridas a cubreobjetos impregnados con poli-L-lisina y cultivadas en incubadora a 37 °C y 5 % de CO2 durante 12 horas. Posteriormente, las células fueron fijadas con una solución de paraformaldehído al 2 % en solución amortiguadora de fosfatos (PBS, phosphate buffer solution, por sus siglas en inglés) a temperatura ambiente, durante 45 min, enjuagadas con PBS y permeabilizadas con una solución permeabilizante y bloqueante con 2 % de suero de cabra y 0.1 % de Triton-X (vol-vol) a temperatura ambiente durante 30 minutos. Inmediatamente después, las células se incubaron en una solución con anticuerpos de cobayo anti insulina (primarios) en PBS a una dilución de 1:5000, a 4 °C durante una noche. Al día siguiente, las células fueron enjuagadas con PBS e incubadas en solución con anticuerpos anti anticuerpos de cobayo (secundarios), conjugados con Dye-Light 483 (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. EUA) o Alexa 649 (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. EUA) a temperatura ambiente durante 2 horas. Finalmente, las células fueron incubadas en una solución de Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich St. Louis, MO, EUA) 1:30000 en PBS a temperatura ambiente durante 10 minutos; y se utilizó medio de montaje para preservar fluorescencia con 15 mM NaN3 (DAKO North America, Inc. 39 Carpinteria, CA, EUA). Los controles negativos de la inmunotinción se realizaron omitiendo la incubación con anticuerpos primarios. Para realizar el análisis de la proliferación de células beta de cultivos primarios, se utilizaron ratas lactantes y adultas. Las células insulares fueron cultivadas en cubreobjetos cubiertos con poli-L-lisina a 37 °C en 5 % de CO2 durante 12 horas. Posteriormente, las células fueron fijadas con una solución de paraformaldehído al 2 % en PBS a temperatura ambiente durante 30 minutos, enjuagadas con PBS y permeabilizadas con una solución perforante y bloqueante con suero de cabra al 10 %, 0.3 M de glicina, albúmina de suero bovino al 1 % y 0.1 % de Tween (vol/vol) a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, se incubaron con anticuerpo primario de conejo anti Ki67 (ab15580 Abcam) y anticuerpo primario de cobayo anti insulina a diluciones de 1:100 y 1:5000 respectivamente a 4 °C durante 12 h. Al día siguiente, las células fueron enjuagadas con PBS e incubadas con anticuerpo IgG de cabra anti conejo conjugado con FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. EUA) a una dilución 1:100 y posteriormente, previo lavado con PBS, con anticuerpo IgG de cabra anti cobayo conjugado con Alexa 649 a una dilución 1:200 a temperatura ambiente durante 1 hora. Finalmente, para la tinción nuclear, las células fueron incubadas en una solución con Hoechst 33342 1:30000 en PBS a temperatura ambiente durante 10 minutos; y se utilizó medio de montaje para preservar fluorescencia con 15 mM NaN3 (DAKO North America, Inc. Carpinteria, CA, EUA). Los controles negativos de la inmunotinción se realizaron omitiendo la incubación con anticuerpos primarios. 40 Para el control positivo de la inmunotinción de Ki67 se utilizaron células de cáncer cervicouterino de la línea SiHa. Para el análisis de las inmunofluorescencias se utilizó un microscopio de epifluorescencia Olympus lX7l equipado con una lámpara de mercurio de 100 W y filtros ópticos apropiados para los siguientes fluoróforos: Hoechst (excitación/emisión 365/440 nm de longitud de onda), FITC (excitación/emisión 488/510 nm de longitud de onda), y Alexa 649 (excitación/emisión 586/647 nm de longitud de onda). Las células fueron observadas a través de un objetivo 20 X y una amplificación de 1.63. Las imágenes digitales fueron adquiridas con una cámara CCD digital (Evolution Media Cybernetics, Silver Spring, MD). La exposición para cada fotografía fue seleccionada de acuerdo con el rango de intensidad de fluorescencia de cada muestra y su control negativo de inmunotinción. Las imágenes fueron adquiridas mediante el programa Image-Pro Express 2.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, EUA) y guardados en formato TIFF. El análisis de las imágenes se realizó con el programa ImageJ del NIHde EUA (http://rsb.info.nih.gov/ij). La pureza de las células beta fue obtenida mediante la cuantificación de las células positivas para la tinción de insulina en relación al total de células en la muestra; y el nivel de proliferación mediante la cuantificación de las células positivas para la tinción de Ki67 en relación al total de células de la muestra. 41 10.7. Extracción de RNA, hibridación y análisis de los microarreglos. El RNA total fue obtenido a partir de tres replicas biológicas de cada condición mediante el RNeasy Micro Kit (Qiagen, EUA.). Cada muestra consistió en una población de células beta purificadas mediante citometría de flujo a partir de un cultivo de células insulares. Para cada cultivo de células adultas, se utilizaron 4 ratas de 250-280 g y para cada cultivo de ratas de 20 días se utilizaron 6 animales. Se utilizó un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, EUA) para realizar el control de calidad del RNA obtenido. Se tomó en cuenta un valor mínimo de 6.4 para el número de integridad del RNA (RNA integrity number, RIN). Se marcaron 200 ng de RNA total con el fluoróforo Cy5 y posteriormente se hibridaron en chips Affymetrix Rat GeneChip Gene 1.0 ST (Affymetrix, EUA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos obtenidos (16,000 genes según la hoja técnica de los microarreglos) fueron procesados con el programa R/Bioconductor (Gentleman, et al. 2004). Previo al análisis, se realizaron la corrección de fondo, la normalización y el cálculo de los niveles de expresión mediante el método de promedio robusto de microarreglo (robust microarray average, RMA por sus siglas en inglés). Los datos obtenidos, fueron puestos a disposición pública en el repositorio GEO (Gene expression omnibus) en conformidad con una base de datos de información mínima acerca de experimentos con microarreglos (mínimum information about a microarray experiment, MIAME) con el registro GSE76969. 42 La comparación de los niveles de expresión se realizó mediante análisis de enriquecimiento de grupos de genes (gene-set enrichment analysis, GSEA) para identificar grupos de genes (sets de genes) relacionados funcionalmente, con enriquecimiento significativo para cada edad. De manera breve, los datos de los perfiles de expresión de las muestras, se ordenaron en una lista de acuerdo con la correlación entre su nivel de expresión y la condición a comparar (edad). Finalmente, se determinó si los miembros de cada uno de los sets de genes (definidos a priori) se distribuyeron de manera aleatoria o se encontraron al inicio o al final de la lista ordenada de genes (Subramanian et al. 2005). Los grupos de genes que mostraron un “índice de descubrimiento falso” (false discovery rate) < 25 % y p < 0.05 fueron considerados como enriquecidos. Finalmente, la comparación de la expresión diferencial de genes entre las células beta de cada edad, se realizó mediante el paquete lima del programa R/Bioconductor (Gentleman et al. 2004) en el que se utilizó un ajuste de modelo lineal. Los genes que tuvieron valores del estadístico B > 0 y cambio > 1.5 en la expresión (log2 absoluto) fueron considerados como diferencialmente expresados. 10.8. Ensayo hemolítico inverso en placa para insulina (RHPA, reverse hemolythic plaque assay) Previo a la cuantificación de la secreción de insulina, entre 1000 y 2000 células beta purificadas por citometría de flujo fueron sembradas en cámaras de Cunningham tratadas con poli-L-lisina. Las células fueron cultivadas en medio Ham F10 suplementado durante 12 horas a 37 °C en 5 % de CO2. Antes de cada 43 experimento, las células se incubaron en solución salina balanceada de Hank con 5.6 mM de glucosa y 0.5 % de albúmina de suero bovino. Para el experimento, se agregó un volumen de 300 µl de eritrocitos de borrego cubiertos previamente con proteína A de Staphylococcus aureus (a dilución 1:15), anticuerpo de cobayo anti insulina (a dilución 1:50) y complemento de cobayo en solución salina balanceada de Hank con 5.6 mM o 15.6 mM de glucosa; y las células fueron incubadas 2 horas a 37 °C en 5 % de CO2. La insulina secretada fue revelada mediante placas de hemólisis alrededor de las células beta, que resulta de la lisis de eritrocitos por la activación de complemento mediada por inmunocomplejos de insulina y anticuerpo anti insulina. Después de la incubación, cada cámara fue fotografiada con un microscopio Leica Micro Dissection System 6000 (versión 6.4.1.2887, Leica Microsystems, Alemania) acoplado a una cámara Hitachi HV-D20, para posteriormente medir las áreas de inmunoplaca con el programa ImageJ del NIH de EUA (http://rsb.info.nih.gov/ij). Para la cuantificación, se contabilizaron en promedio 100 células por experimento, y se utilizaron al menos tres experimentos independientes realizados por duplicado. 10.9. Análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo Se obtuvieron células insulares de cultivo primario de ratas macho de 1, 20 y 28 días posnatales y adultas de 250-280 g (correspondientes a 10-12 semanas de edad). Las células cultivadas fueron fijadas con una solución de paraformaldehído al 2 % en PBS a temperatura ambiente durante 45 minutos. Posteriormente, se http://rsb.info.nih.gov/ij 44 añadió PBS y se centrifugaron a 80 rcf en dos ocasiones para eliminar el paraformaldehído. A continuación, las células se incubaron en una solución permeabilizante y bloqueante con suero normal de cabra al 2 %, triton X al 0.1 % (vol/vol) en PBS a temperatura ambiente durante 10 minutos; e incubadas con suero de cobayo antiinsulina a una dilución de 0.8 µL/106 células a 4 °C durante una noche. Al día siguiente, las células fueron centrifugadas nuevamente; y posteriormente se incubaron con una solución de anticuerpos de cabra contra cobayo conjugados con DyLight 483 (Jackson ImmunoResearch, Inc. EUA) a una dilución de 1:200 a temperatura ambiente durante 2 horas. Finalmente, las células fueron enjuagadas con PBS, centrifugadas e incubadas con una solución con DAPI (4’,6’-diamidino-2fenilindole) 1mg/mL a temperatura ambiente durante 1 hora para marcar el DNA de doble cadena. Para determinar y analizar el estadio del ciclo celular de las células beta, se cuantificó el contenido de DNA de doble cadena en células (entre 10, 000 y 20, 000) con marca positiva para insulina mediante un citometro Attune Acoustic Focusing Cytometer (Life Technologies, EUA) con láseres azul/violeta y el programa MODFIT (Verity Software House, Inc EUA). 10.10. Electrofisiología Los experimentos de electrofisiología complementarios fueron realizados por la candidata a doctor Neivys García Delgado. Las células insulares cultivadas de ratas de 20 días y adultas (250-280 g), fueron utilizadas para registrar corrientes de calcio en micro áreas de membrana en la configuración de célula completa, en 45 la modalidad de fijación de voltaje. Los registros fueron realizados a temperatura ambiente mediante un amplificador Axopatch 200A (Axon Instruments, EUA). Las micro pipetas con 2-4 MOhms de resistencia, fueron obtenidos mediante el estiramiento de tubos capilares Kimax-51 (Kimble Glass, EUA). La punta de las pipetas fue cubierta con cera odontológica para reducir su capacitancia. Posterior a la obtención de sellos estables, se compensaron los transientes capacitivos de la pipeta y se obtuvo la capacitancia celular mediante una integración digital con pulsos de + 10 mV. La capacitancia en serie se compensó utilizando los circuitos del amplificador. El resto de los transientes capacitivos lineales y las corrientes de fuga, se sustrajeron con un procedimiento en línea P/2. La generación de pulsos y la adquisición de registros se realizaron con el programa PClamp versión 8 (Axon Instruments, EUA). La composición de la solución externa de registro fue la siguiente (enmM): 130 de NaCl, 5 de KCl, 10 de HEPES, 2 de MgCl2, 5 de CaCl2, 10 de glucosa y 100 nM de TTX y pH de 7.3. La solución interna contenía (en mM): 120 de CsAsp, 10 de CsCl, 5 de CsF, 10 de HEPES, 2.5 de BAPTA, 2 de ATP y 7.3 de pH. Los protocolos de rampa que se utilizaron para el análisis consistieron en pulsos despolarizantes desde -120 mV hasta 120 mV con una duración de 480 ms a partir de un potencial de reposo de -80 mV. Las gráficas que se mostrarán en éste trabajo contienen la relación corriente-voltaje entre -80 y 60 mV. Finalmente, las corrientes macroscópicas de calcio analizadas fueron obtenidas de células beta obtenidas mediante cultivo primario con capacitancias de entre 4.5 y 46 11 pF (n= 64 células de animales de 20 días de edad y n= 40 células de ratas adultas de 250-280 g). 10.11. Análisis estadístico Todos los datos se reportan como medias + error estándar de la media; la n denota el número de animales analizados. La significancia estadística p < 0.01 se obtuvo mediante análisis de varianza de una vía (ANOVA) y para p < 0.05 se utilizó la prueba de T-student, ambas realizadas con el programa Prism 6 para Windows versión 6.01 (GraphPad Software 1992-2012, La Jolla, California, EUA). 47 11. RESULTADOS 11.1. Caracterización morfológica y citométrica de las células insulares de ratas de 1, 20 y 28 días posnatales y adultas (250-280 g). Para lograr la obtención de poblaciones enriquecidas de células beta a partir de cultivos primarios de células insulares de ratas de las edades estudiadas, fue necesario realizar una caracterización morfológica completa de las últimas utilizando un citómetro de flujo FACSAriaI (Figura 6A). Posteriormente, se diseñó una estrategia que consistió en la selección sucesiva de: 1) la subpoblación de eventos aislados con base en los parámetros FSC-A y FSC-H; 2) la subpoblación con mayor tamaño (FSC-A) y mayor autofluorescencia (FITC-A) y por último, 3) la subpoblación de eventos con mayor complejidad interna (SSC-A) (Figura 6B). La validación de la pureza de poblaciones de células beta obtenidas con citometría de flujo, se realizó mediante la detección de insulina con inmunofluorescencia. Los porcentajes de pureza obtenidos fueron los siguientes: a) 78 + 1.4 % para células beta de ratas recién nacidas; b) 74 + 1.4 % para células beta de ratas de 20 días posnatales; c) 81 + 2.3 % de células beta de ratas de 28 días posnatales y; d) 91 + 2.1 % de células beta de ratas adultas (250-280 g) (Figura 6C). El análisis de la autofluorescencia (emitida entre 515 y 545 nm de longitud de onda, FITC-A; correlacionada con el contenido intracelular de FAD/FADH) de las células beta mediante citometría de flujo mostró que dicha fluorescencia aumenta 48 de forma gradual en relación directa con la edad a partir del día 20 posnatal hasta alcanzar los niveles máximos en la edad adulta (Figura 6D). 11.2. Análisis del transcriptoma de las células beta de ratas de 20 días posnatales y adultas (250-280 g) Para conocer los niveles de expresión genética de las células beta durante su período de maduración posnatal se realizaron microarreglos utilizando el RNA de células beta de ratas de 20 días y adultas (250-280 g) purificadas mediante citometría de flujo. El análisis inicial de los datos obtenidos mediante los microarreglos permitió mostrar la correlación entre la expresión global de las células beta y las edades de las células para determinar el parecido ente las mismas (Figura 6E). 49 50 D E FIGURA 6. Estrategia para la obtención de las poblaciones enriquecidas de células beta de ratas en diferentes etapas posnatales, niveles de enriquecimiento, dendrograma de correlación entre muestras y autofluorescencia de las células beta. A) Criterios de selección para obtener poblaciones enriquecidas de células beta a partir de cultivos primarios de ratas neonatas, lactantes, ablactadas y adultas. B) Inmunofluorescencia para la detección de insulina (verde) y contratinción nuclear (azul) en poblaciones celulares obtenidas mediante citometría de flujo. C) Cuantificación de purezas de las poblaciones obtenidas mediante citometría de flujo. D) Incremento (representado en porcentaje) de los niveles intracelulares de FAD/FADH en las células 51 beta (autofluorescencia en longitud de onda de 510 nm) en comparación con el resto de células insulares de ratas de diferentes edades. * p < 0.05 comparado con las células beta de ratas neonatas; ** p < 0.05 comparado con las células beta de ratas de 20 d. E) Dendrograma y mapa de calor que representan los niveles de expresión globales de cada muestra y la correlación entre los microarreglos, respectivamente. Posteriormente, se realizó un análisis de enriquecimiento de grupos de genes (gene-set enrichment analysis, GSEA por sus siglas en inglés) para conocer los grupos funcionales de genes que son mayormente utilizados por las células beta de 20 días posnatales y adultas, así como un análisis de los genes en el “extremo representativo” (leading-edge) de dichos grupos de genes. El análisis GSEA mostró una lista de 155 grupos de genes de la base de datos MSigDB (Molecular Signature Database) con enriquecimiento positivo con significancia estadística. En ellos se incluyen 40 grupos de la base de datos Reactome y 64 grupos de la colección Gene Ontology (GO) (Tabla1). Además mostró una lista de 1055 grupos de genes de la base de datos MSigDB con enriquecimiento negativo con significancia estadística que incluyen 165 grupos de la base de datos Reactome, y 163 grupos de la colección GO (Tabla 2). 52 NOMBRE TAMAÑO NES NOM p-val FDR q-val FWER p-val POSICIÓN EN NIVEL MÁXIMO LEADING EDGE R EA C TO M E REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE GENES EN LAS CÉLULAS BETA 19 2.07 0.0 0.0036 0.004 1492 tags=58%, list=11%, signal=65% SISTEMA NEURONAL 257 1.97 0.0 0.011 0.025 2382 tags=30%, list=17%, signal=35% REGULACIÓN DE LA SECRECIÓN DE INSULINA 83 1.94 0.0 0.013 0.044 1128 tags=28%, list=8%, signal=30% TRANSMISIÓN A TRAVÉS DE SINÁPSIS QUÍMICAS 175 1.88 0.0 0.026 0.111 2335 tags=30%, list=17%, signal=36% INTEGRACIÓN DEL METABOLISMO ENERGÉTICO 106 1.87 0.0 0.024 0.126 1128 tags=25%, list=8%, signal=26% SÍNTESIS, LIBERACIÓN, RECAPTURA Y DEGRADACIÓN DE GABA 17 1.85 0.005 0.028 0.1367 271 tags=29%, list=2%, signal=30% CANALES DE POTASIO 89 1.83 0.001 0.030 0.205 1947 tags=29%, list=14%, signal=34% INTERACCIÓN ENTRE L1 Y ANQUIRINAS 19 1.82 0.001 0.030 0.231 1961 tags=37%, list=14%, signal=43% ACTIVACIÓN DE LA EXPRESIÓN CIRCADIANA POR RORA 20 1.82 0.001 0.027 0.231 3093 tags=75%, list=22%, signal=96% REPRESIÓN DE tags=75%, 53 LA EXPRESIÓN POR REV ERBA 20 1.82 0.003 0.025 0.243 3093 list=22%, signal=96% ACTIVACIÓN DEL RECEPTOR DE GABA 48 1.81 0.001 0.024 0.254 2335 tags=38%, list=17%, signal=45% REGULACIÓN DEL DESARROLLO DE LA CÉLULA BETA 27 1.80 0.003 0.024 0.272 1875 tags=44%, list=13%, signal=51% G EN E O N TO LO G Y ACTIVIDAD DE CANALES DE CALCIO 30 2.23 0.0 0.0 0.0 1183 tags=40%, list=8%, signal=44% ACTIVIDAD DE CANALES DE CALCIO DEPENDIENTES DE VOLTAJE 17 2.14 0.0 0.004 0.001 1089 tags=53%, list=8%, signal=57% ACTIVIDAD DE CANALES CATIÓNICOS DEPENDIENTES DE VOLTAJE 57 2.10 0.0 0.032 0.001 1914 tags=35%, list=14%, signal=40% ACTIVIDAD DE CANALES DEPENDIENTES DE VOLTAJE 64 2.07 0.0 0.097 0.004 1121 tags=28%, list=8%, signal=30% PROCESA MIENTO METABÓLICO DE ESFINGOLÍ PIDOS 27 2.04 0.0 0.001 0.009 1998 tags=56%, list=14%, signal=65% ACTIVIDAD TRANSPORTAD ORA TRANSMEMBRA NAL DE IONES METÁLICOS 127 2.03 0.0 0.001 0.011 1947 tags=29%, list=14%, signal=33% ACTIVIDADDE CANALES CATIÓNICOS 104 1.99 0.0 0.004 0.03 1947 tags=29%, list=14%, signal=33% 54 TRANSMISIÓN SINÁPCTICA 155 1.95 0.0 0.007 0.058 1999 tags=26%, list=14%, signal=30% DESARROLLO NEURONAL 55 1.94 0.0 0.007 0.066 1173 tags=29%, list=8%, signal=32% ACTIVIDAD DE CANALES DEPENDIENTES 108 1.91 0.0 0.011 0.109 1121 tags=22%, list=8%, signal=24% TRANSMISIÓN DE IMPULSO NERVIOSO 168 1.89 0.0 0.014 0.147 1999 tags=26%, list=15%, signal=29% TRANSPORTE IÓNES METÁLICOS 100 1.89 0.0 0.014 0.163 2144 tags=32%, list=15%, signal=37% TABLA 1. Grupos de genes de las bases de datos Reactoma y Gene Ontology correlacionadas con el fenotipo adulto de las células beta (con enriquecimiento positivo). NOMBRE TAMAÑO NES NOM p-val FDR q-val FWER p-val POSICIÓN EN NIVEL MÁXIMO LEADING EDGE R EA C TO M E REPLICACIÓN DEL DNA 160 -3.01 0.0 0.0 0.0 1450 tags=52%, list=10%, signal=57% FASES M-M-G1 DE LA MITOSIS 140 -2.96 0.0 0.0 0.0 1450 tags=53%, list=10%, signal 58% CICLO CELULAR 315 -2.95 0.0 0.0 0.0 1386 tags=42%, list=10%, signal=45% CICLO CELULAR MITÓTICO 262 -2.91 0.0 0.0 0.0 1450 tags=42%, list=10%, signal=46% PROMETAFASE MITÓTICA 67 -2.76 0.0 0.0 0.0 599 tags=48%, list=4%, signal=50% 55 PUNTOS DE CONTROL DEL CICLO CELULAR 100 -2.67 0.0 0.0 0.0 2363 tags=58%, list=17%, signal=69% PUNTOS DE CONTROL DE G2-M 39 -2.57 0.0 0.0 0.0 1201 tags=62%, list=9%, signal=67% MANTENIMIENT O DE CROMOSOMAS 74 -2.55 0.0 0.0 0.0 1252 tags=49%, list=9%, signal=53% TRANSICIÓN G1- S 96 -2.55 0.0 0.0 0.0 1809 tags=52%, list=13%, signal=59% DEPOSICIÓN DE NUEVOS NUCLEOSOMAS CON CENPA EN EL CENTRÓMERO 27 -2.54 0.0 0.0 0.0 626 tags=70%, list=4%, signal=73% FASES G1-G1-S DE LA MITOSIS 114 -2.53 0.0 0.0 0.0 1914 tags=48%, list=14%, signal=55% FASE S 99 -2.50 0.0 0.0 0.0 1809 tags=48%, list=13%, signal=55% G EN E O N TO LO G Y CROMOSOMA 101 -2.64 0.0 0.0 0.0 704 tags=31%, list=5%, signal=32% CICLO CELULAR MITÓTICO 132 -2.56 0.0 0.0 0.0 1269 tags=33%, list=9%, signal=36& FASE M DEL CICLO CELULAR MITÓTICO 71 -2.55 0.0 0.0 0.0 1269 tags=39%, list=9%, signal=43% REGIÓN PERICÉNTRICA DEL CROMOSOMA 26 -2.55 0.0 0.0 0.0 368 tags=50%, list=3%, signal=51% HUSO 34 -2.51 0.0 0.0 0.0 368 tags=41%, list=3%, signal=42% 56 MITOSIS 68 -2.51 0.0 0.0 0.0 1269 tags=40%, list=9%, signal=43% FASE M 95 -2.49 0.0 0.0 0.0 1269 tags=36%, list=9%, signal=38% PARTE DEL CROMOSOMA 77 -2.48 0.0 0.0 0.0 704 tags=31%, list=5%, signal=39% PROCESO DEL CICLO CELULAR 167 -2.47 0.0 0.0 0.0 1269 tags=32%, list=9%, signal=34% FASE DEL CICLO CELULAR 145 -2.45 0.0 0.0 0.0 1269 tags=32%, list=9%, signal=35% SEGREGACIÓN DE CROMOSOMAS 26 -2.32 0.0 0.0 0.0 770 tags=46%, list=5%, signal=49% CINETOCORO 21 -2.27 0.0 0.0 0.0 271 tags=43%, list=2%, signal=44% TABLA 2. Grupos de genes de las bases de datos Reactome y Gene Ontology correlacionados con el fenotipo inmaduro de células beta (con el enriquecimiento negativo mayor) Cabe señalar que 5 de los grupos de genes con mayor enriquecimiento positivo (correlacionados con la edad adulta 250-280 g) de la base de datos Reactome se relacionaron directamente con las células beta pancreáticas e incluyeron: 1) regulación de la expresión de genes de las células beta (NES = 2.07); 2) regulación de la secreción de insulina (NES = 1.94); 3) Integración del metabolismo energético (NES= 1.87); 4) Síntesis, liberación, recaptura y degradación del ácido gamma aminobutírico (GABA) (NES = 1.85) y, 5) Regulación del desarrollo de las células beta (NES = 1.80). 57 Además, los grupos de genes de la colección GO con mayor enriquecimiento positivo incluyen: 1) actividad de canales de calcio (NES = 2.23), 2) actividad de canales de calcio dependientes de voltaje (NES = 2.14), 3) Actividad de canales catiónicos dependientes de voltaje (NES = 2.10) y, 4) actividad de canales dependientes de voltaje (NES = 2.07). Por otro lado, los grupos de genes con enriquecimiento negativo (correlacionados con la edad de 20 días posnatales) de la base de datos Reactome y la colección GO consistieron en genes relacionados con la proliferación celular (Tabla 2). De manera paralela al análisis GSEA, se compararon los niveles de expresión de los genes y se obtuvieron los genes con expresión diferencial. Se encontraron 438 genes con una expresión mayor en células beta adultas y 778 con genes con una expresión mayor en células beta de 20 días. Éste tipo de análisis permitió validar los resultados obtenidos con el análisis GSEA. Los genes con mayor expresión en células beta adultas se relacionan con el control de la expresión de genes específicos de la célula beta y el acoplamiento del metabolismo con la secreción de insulina como: MafA, Glp1r, Aplp2, y Gabbr2. Además, se encontró que algunos genes relacionados con la maduración de las células beta como Slc2a2, Ucn3, Gcgr, Pcsk1, Igf1, Egfr y Kcnb2 mostraron una expresión mayor en células beta de ratas adultas. Los genes con mayor expresión en las células beta de 20 días se relacionan con roles críticos en la regulación del ciclo celular, entre ellos se incluyen: Ccna2, Ccnb1 y Ccnb2. 58 11.3. Los cambios en el transcriptoma de las células beta se correlacionan con la maduración de la secreción basal de insulina y la secreción estimulada por glucosa durante el desarrollo posnatal El análisis de los genes en el “extremo representativo” (leading-edge) de los grupos de genes enriquecidos en las células beta de ratas adultas (particularmente los grupos “regulación de la secreción de insulina” e “integración del metabolismo energético” de la base de datos Reactome) mostró que los genes con contribución significativa en el enriquecimiento también se relacionan con la identidad y el funcionamiento de las células beta (Figura 7 y Tabla 3). Para confirmar los cambios en el transcriptoma asociados con la maduración de la secreción de insulina y la integración del metabolismo energético se realizó ensayo hemolítico inverso en placa para analizar la secreción basal de insulina (5.6 mM) y la secreción estimulada por glucosa (15.6 mM) de células beta purificadas de ratas de todos los grupos estudiados (RN, 20, 28 días posnatales y adultas). 59 60 FIGURA 7. Cambios en la expresión de genes y cambios funcionales relacionados con la secreción de insulina basal y estimulada por glucosa. A) Gráficas de enriquecimiento de los grupos de genes “secreción de insulina” y “integración del metabolismo energético” de la base de datos Reactome, en las que se muestran el incremento de enriquecimiento a lo largo de los genes expresados en las células beta (línea verde) y los genes blanco que contribuyeron a dicho enriquecimiento (líneas verticales negras). Mapa de calor con los niveles de expresión de los genes que contribuyeron al enriquecimiento de los grupos de genes; dendrograma que muestra las similitudes entre muestras. B) Imágenes representativas del ensayo hemolítico inverso en placa en condiciones basales (5.6 mM) y estimulantes de glucosa (15.6 mM) de células beta de ratas neonatas, lactantes, ablactadas y adultas. C) Cuantificación de las áreas de inmunoplaca observadas en condiciones basales (gráfica de la izquierda) y condiciones estimulantes (gráfica de la derecha) de glucosa. Las barras rojas representan la media + error estándar de la media. La barra de escala equivale a 50 µm. + p < 0.01 en comparación con el estadio de desarrollo posnatal previo, * p < 0.01 en comparación con la misma edad en condiciones basales de glucosa (5.6 mM) 61 SÍMBOLO DEL GEN NOMBRE DEL GEN POSICIÓN EN LA LISTA DE GENES (RANK AT GENE LIST) PUNTAJE SEGÚN EL RANGO (RANK METRIC SCORE) PUNTAJE
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