Logo Studenta

Analisis-morfofuncional-de-la-maduracion-de-la-secrecion-de-insulina

Vista previa del material en texto

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS 
INSTITUTO DE FISIOLOGÍA CELULAR 
 
“ANÁLISIS MORFOFUNCIONAL DE LA MADURACIÓN 
DE LA SECRECIÓN DE INSULINA” 
 
TESIS 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE 
DOCTOR EN CIENCIAS 
 
P R E S E N T A: 
Médico Cirujano Carlos Alfonso Larqué Velázquez 
 
 
TUTOR PRINCIPAL: 
Dra. Marcia Hiriart Urdanivia 
Instituto de Fisiología Celular 
 
MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR 
Dr. Félix Recillas Targa 
Instituto de Fisiología Celular 
Dr. Mohamed El Hafidi Bentlaker 
Instituto Nacional de Cardiología “Ignacio Chávez” 
 
 
Ciudad Universitaria, Ciudad de México a, mayo de 2017 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS ACADÉMICOS 
Este trabajo fue apoyado por la Dirección General de Asuntos del Personal 
Académico (DGAPA)-UNAM apoyos con clave IN-213114 a M Hiriart e IV-100116 
a A Frank Hoeflich; y por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología 
(CONACyT-México) apoyo con clave CB2009-131647 a M Hiriart; Beca de 
doctorado para Carlos Alfonso Larqué Velázquez. 
De igual manera agradezco mucho a los servicios de biología molecular, 
microscopía, cómputo, al bioterio y vivarium del Instituto de fisiología celular y al 
de citometría del Instituto de ciencias biomédicas. 
 
AGRADECIMIENTOS PERSONALES 
… De la forma más cariñosa y respetuosa agradezco a quienes con cariño me han 
apoyado y enriquecido en todos sentidos como persona y así enseñarme a honrar 
la Vida y a maravillarme con ella: 
Má, Pá, Peche, Cugüeli, Abuelitos, tío Mario, tía Glora, tío Oscar, tía Martha… y 
ahora Paquito 
Dra. Marcia y Myrian 
Hermanos Hugo, Pelono, Lalo, Gordo, Beto, Ramsés, Mike, Nena, Julia y Myrian 
Tíos, tías, prim@s y sobrin@s (ninguno se me pasa) 
Amig@s y “Kaligaris” (Todos)… 
“Amigos e hijos” del laboratorio 
Hijos Skiuty, Bruno y Ricochette 
 
 
1 
 
CONTENIDO 
1. ABREVIATURAS .......................................................................................... 3 
2. RESUMEN..................................................................................................... 8 
3. ABSTRACT ................................................................................................... 9 
4. MARCO TEÓRICO ...................................................................................... 10 
4.1. Morfología general del páncreas .............................................................. 10 
4.2. La célula beta y la secreción de insulina .................................................. 12 
4.3. Secreción de insulina estimulada por glucosa ......................................... 14 
4.4. Desarrollo del páncreas y diferenciación de las células beta ................... 18 
4.5. Maduración de la célula beta ................................................................... 25 
4.6. Diferenciación in vitro de células beta ...................................................... 28 
5. ANTECEDENTES ....................................................................................... 29 
5.1. Biología de sistemas y la célula beta ....................................................... 29 
6. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ........................................................ 32 
7. HIPÓTESIS ................................................................................................. 32 
8. OBJETIVO GENERAL ................................................................................ 33 
9. OBJETIVOS PARTICULARES ................................................................... 33 
10. METODOLOGÍA ......................................................................................... 34 
10.1. Diseño experimental ............................................................................. 34 
10.2. Reactivos y materiales .......................................................................... 35 
10.3. Animales ............................................................................................... 35 
10.4. Cultivo primario de células insulares de páncreas ................................ 36 
10.5. Purificación de células beta aisladas mediante citometría de flujo 
(FACS) …………………………………………………………………………………37 
10.6. Inmunofluorescencia para determinación de purezas y evaluación de la 
proliferación celular ............................................................................................ 38 
10.7. Extracción de RNA, hibridación y análisis de los microarreglos. ........... 41 
10.8. Ensayo hemolítico inverso en placa para insulina (RHPA, reverse 
hemolythic plaque assay) ................................................................................... 42 
10.9. Análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo ........................... 43 
10.10. Electrofisiología ..................................................................................... 44 
10.11. Análisis estadístico ............................................................................... 46 
2 
 
11. RESULTADOS ............................................................................................ 47 
11.1. Caracterización morfológica y citométrica de las células insulares de 
ratas de 1, 20 y 28 días posnatales y adultas (250-280 g). ................................ 47 
11.2. Análisis del transcriptoma de las células beta de ratas de 20 días 
posnatales y adultas (250-280 g) ....................................................................... 48 
11.3. Los cambios en el transcriptoma de las células beta se correlacionan 
con la maduración de la secreción basal de insulina y la secreción estimulada 
por glucosa durante el desarrollo posnatal ........................................................ 58 
11.4. Análisis funcional de genes con contribución significativa en el 
enriquecimiento de los grupos de genes relacionados con la maduración de las 
células beta de rata ............................................................................................ 63 
11.4.1. Canales de calcio dependientes de voltaje tipo T .............................. 63 
11.4.2. Genes que participan en la proliferación y el ciclo celular ................. 68 
12. DISCUSIÓN................................................................................................. 74 
13. CONCLUSIONES ........................................................................................ 80 
14. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 84 
 
 
3 
 
1. ABREVIATURAS 
ADP – Difosfato de adenosina 
Arx – Factor de transcripción con homeodominio relacionado con la ausencia de 
aristas 
ATP –Trifosfato de adenosina 
bHLH – Dominio proteico básico hélice asa hélice 
BSA – Albumina de suero bovino 
cAMP - Monofosfato de adenosina cíclico 
CFTR – Regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística 
CHG A/B - Cromograninas A y B 
DAPI – 4’,6’-diamidino-2 fenilindole 
DMEM – Medio de Earl modificado por Dulbeco 
EGTA - Ácido etilenglicol-bis [β-aminoethylether] N, N, N’, N’-tetraacético 
EGTA – Ácido etilenglicol-bis [β-aminoetiléter] N, N, N’, N’-tetraacético 
FACS – Citometría de flujo basada en fluorescencia (del inglés Fluorescence- 
Activated Cell Sorting) 
FBS – Suero bovino fetal 
FITC – Isotiocianatode fluoresceína 
4 
 
Fmo5 – Monooxigenasa 5 que contiene flavina 
Foxa2 – Factor de transcripción A2 con cabeza de tenedor 
FSC – Desviación de luz directa 
GABA – Ácido gamma aminobutírico 
GEO – Ómnibus de expresión de genes 
GK – Glucocinasa 
Glp1r – Receptor de la proteína parecida al glucagon 1 
GLUT1 / SLC2A1 – Transportador de glucosa tipo 1 / Acarreador de solutos de la 
familia 2 miembro 1 
GLUT2 / SLC2A2 – Transportador de glucosa tipo 2 / Acarreador de solutos de la 
familia 2 miembro 2 
Gpd 1/2 - Deshidrogenasa 1 de glicerol 3 fosfato 
GSEA – Análisis de enriquecimiento de grupos de genes 
GTP - trifosfato de guanosina 
Hadhsc – Deshidrogenasa de L-3 –hidroxiacil de cadena corta coenzima A 
HBSS – Solución salina balanceada de Hank 
HEPES - Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico 
Isl1 – Factor de transcripción islote 1 
KATP – Canal de potasio sensible a ATP 
5 
 
Ki67 – Antígeno Ki67 
Kir6.2 – Canal de potasio de rectificación entrante 6.2 
Kv – Canales de potasio de rectificación tardía 
MafA/B/C – Factor de transcripción, proteína A/B/C (aviar) de la familia de 
oncogenes de fibrosarcoma musculoaponeurótico v- maf 
Mdh1/2 – Deshidrogenasa 1 y 2 de malato 
MEC – matriz extracelular 
MIAME – Información mínima acerca de experimentos con microarreglos 
miRNA – micro ácido ribonucléico 
MYRIP - proteína de interacción con miosina VIIA y rab 
NeuroD1 – Factor de transcripción de diferenciación neuronal 1 
NFAT – Factor nuclear de activación de las células T 
Ngn3 – Neurogenina 3 
Nkx6.1 – Factor de transcripción homeótico 1 NK 6) 
NSF – Proteína de fusión sensible a N-etilmaleimida o Proteína de fusión 
Pax4 – Factor de transcripción con caja pareada 4 
Pax6 – Factor de transcripción con caja pareada 6 
PBS – Solución amortiguadora de fosfatos 
6 
 
Pc – Carboxilasa de piruvato 
PCSK1 - Convertasa subtilisina/quexina tipo 1 de proproteína 
Pdx1 – Factor de transcripción 1 con homeodominio pancreático duodenal 
Pfk1 – Fosfofructocinasa 1 
PTPRN - proteína fosfatasa de tirosina, tipo receptor 
RAB3a y 27 - miembros 3a y 7 de la familia de oncogenes ras 
RAP1a - miembro RAP1a de la familia de oncogenes RAS 
RAPGEF4 - factor 4 del intercambiador rap de nucleótidos de guanina 
Rfk – Cinasa de riboflavina 
RHPA – Ensayo hemolítico inverso en placa 
RMA – Promedio robusto de microarreglo 
RNAseq – Secuenciación de RNA 
RPH3AL – proteína parecida a rabfilina 3a 
RRP – Reserva de gránulos (que contienen insulina) listos para ser liberados 
SANP23/25 – Proteína 23/25 asociada al sinaptosoma 
SGP – Reserva de gránulos (que contienen insulina) de almacenamiento 
SLC30A8 - miembro 8 de la familia 30 de transportadores de solutos 
SNARE – Proteína receptor de unión a la proteína NSF soluble 
7 
 
SSC- Desviación de luz en ángulo recto 
Sur1 – Receptor a sulfonilureas 1 
SYT3, 5 y 7 - sinaptotagminas 3, 5 y 7 
TRP – Receptores de potencial transitorio 
VAMP – Proteínas asociadas a vesículas o Sinaptobrevinas 
VDCC – Canales de calcio dependientes de voltaje 
VGNS – Canales de sodio sensibles a voltaje 
 
 
8 
 
2. RESUMEN 
La investigación para entender el desarrollo posnatal de las células beta 
pancreáticas se ha vuelto de mucho interés en los últimos años. La comprensión 
de los mecanismos que controlan la maduración posnatal de las células beta 
podría generar nuevas oportunidades de tratamiento para la diabetes. El período 
de ablactación es considerado como una ventana crítica del desarrollo posnatal 
del páncreas, en la que se han observado cambios estructurales y fisiológicos 
relacionados con la maduración de las células beta. Para determinar los cambios 
en el transcriptoma de las células beta que pudieran estar relacionados su 
maduración durante este período, se realizó un análisis mediante microarreglos, 
del transcriptoma de poblaciones enriquecidas de células beta obtenidas por 
citometría de flujo basada en fluorescencia (FACS) a partir de cultivos primarios de 
páncreas de ratas de distintas edades. Nuestros resultados mostraron una gran 
cantidad de grupos de genes que incluyen algunos relacionados con la integración 
del metabolismo, la modulación de la actividad eléctrica y la regulación del ciclo 
celular que juegan un papel importante en el proceso de maduración de las células 
beta. Estas observaciones fueron validadas usando el ensayo hemolítico inverso 
en placa para insulina, registros electrofisiológicos y análisis con citometría de 
flujo. Además, nos permitieron proponer algunas vías nuevas como la del 
metabolismo de esfingolípidos, la del procesamiento y tráfico de vesículas que 
contienen insulina, la de la regulación de la transcripción por el miRNA-30, la de 
las proteínas de tráfico intracelulares y las proteínas del ciclo celular; que podrían 
jugar un papel importante en el proceso de maduración mencionado. 
9 
 
3. ABSTRACT 
Research on the postnatal development of pancreatic beta cells has become an 
important subject in recent years. Understanding the mechanisms that govern beta 
cell-postnatal maturation could bring new opportunities to therapeutic approaches 
for diabetes. The weaning period consists of a critical postnatal window for 
structural and physiologic maturation of rat beta cells. To investigate transcriptome 
changes involved in the maturation of beta cells neighboring this period we 
performed microarray analysis in fluorescence-activated cell sorted (FACS) beta-
cell enriched populations. Our results showed a variety of gene sets including 
those involved in the integration of metabolism, modulation of electrical activity, 
and regulation of the cell cycle that play important roles in the maturation process. 
These observations were validated using reverse hemolytic plaque assay, 
electrophysiological recordings, and flow cytometry analysis. Moreover, we 
suggest some unexplored pathways such as sphingolipid metabolism, insulin-
vesicle trafficking, regulation of transcription/transduction by miRNA-30, trafficking 
proteins, and cell cycle proteins that could play important roles in the process 
mentioned above for further investigation. 
 
 
 
10 
 
4. MARCO TEÓRICO 
4.1. Morfología general del páncreas 
El páncreas es una glándula abdominal de secreción mixta que posee un 
componente exócrino y un componente endócrino. El páncreas exócrino 
constituye cerca del 98 % del volumen de la glándula y está conformado por 
acinos (arreglos saculares de células epiteliales cuboideas llamadas acinares) que 
producen y secretan enzimas digestivas; y conductos pancreáticos que secretan 
bicarbonato y vierten la secreción pancreática al duodeno durante la digestión de 
los alimentos (Hiriart M 2005) (Figura 1A y 1C) 
El páncreas endócrino forma entre el 1 y 3 % del volumen de la glándula y se 
conforma por agrupaciones (de 50 a 500 um de diámetro) de células llamados 
islotes (clásicamente llamados de Langerhans) que se encuentran inmersos entre 
las estructuras que componen el páncreas exócrino. Los islotes pancreáticos 
contienen 5 tipos diferentes de células productoras de hormonas: 1) células beta 
productoras de insulina (60-80 % del total de células en el islote de roedor); 2) 
células alfa productoras de glucagón (10-30 % del total de células en el islote de 
roedor); 3) células delta productoras de somatostatina (3-5 % del total de células 
insulares en roedores); 4) células PP productoras de polipéptido pancreático (1-3 
% de las células insulares en roedores) y; 5) células épsilon productoras de 
ghrelina (1-2 % de las células insulares en roedores) (Pan and Wright 2011) 
(Roscioni, et al. 2016). 
11 
 
La conformación de los islotes puede variar dependiendo de la especie animal. En 
los islotes de roedores, las células beta están distribuidas en el centro y los demás 
tipos celulares en la periferia (Figura 1B). Además, los islotes de la porción inferiorde la cabeza y del proceso uncinar del páncreas (derivados de la yema anterior; 
ver sección desarrollo del páncreas) contienen más células PP y menos células 
alfa y beta que los islotes de la parte superior de la cabeza, el cuerpo y la cola del 
páncreas. En los islotes humanos, los 5 tipos celulares se encuentran intercaladas 
sin patrón conocido hasta ahora (Kim, et al. 2009; Roscioni et al. 2016). 
Finalmente cabe señalar que, dado que cada islote pancreático constituye un 
microórgano, su nicho comprende otros tipos de células no endócrinas como 
neuronas, células endoteliales y células mesenquimatosas. Actualmente, se 
sugiere que la relación entre la matriz extracelular (MEC) y las células; y las 
uniones intercelulares podrían jugar un papel importante en la composición, la 
polaridad y la heterogeneidad funcional de las células beta (Roscioni et al. 2016). 
La irrigación sanguínea de los islotes ocurre del centro hacia la periferia de 
manera que en los roedores, las células beta se perfunden primero con sangre 
rica en oxígeno, seguidas de las células alfa y delta (Richards, et al. 2010; 
Roscioni et al. 2016). 
La inervación autónoma de los islotes pancreáticos se establece durante los 
primeros días de vida posnatal y juega un papel preponderante en la regulación de 
la secreción de insulina y glucagon (Cabrera-Vasquez, et al. 2009) (Roscioni et al. 
2016). Además, se ha sugerido que podría jugar un papel importante en la 
12 
 
maduración y el mantenimiento del número de células beta dentro del islote 
(Borden, et al. 2013; Di Cairano, et al. 2016) (Figura 1C). 
4.2. La célula beta y la secreción de insulina 
Las células beta pancreáticas están altamente especializadas y son las únicas 
capaces de sintetizar y secretar insulina en el humano y los roedores. Estas 
células pueden ser consideradas como sensores energéticos del cuerpo debido a 
su capacidad constante de monitorear los niveles de nutrimentos en el medio 
extracelular así como de responder a los cambios en sus concentraciones 
mediante variaciones en la secreción de insulina. La glucosa constituye el estímulo 
más importante para el proceso de secreción de insulina, aunque éste también 
puede ser estimulado por diversos secretagogos como otros nutrimentos, 
neurotransmisores, hormonas y fármacos (Hiriart, et al. 2014; Velasco, et al. 
2016). 
La insulina es una hormona anabólica que promueve la entrada de glucosa a las 
células del músculo esquelético y del tejido adiposo. Además, regula el 
almacenamiento de carbohidratos, lípidos y proteínas en el hígado, tejido adiposo 
y el músculo. Por esta razón, el proceso de secreción de insulina es fundamental 
en la homeostasis de nutrimentos corporales (Hiriart et al. 2014). 
13 
 
 
FIGURA 1. Morfología general del páncreas. A) Anatomía humana del páncreas B) Histología del 
páncreas de rata en donde se señalan los componentes exócrino y endócrino. C) Organización 
celular de los islotes de rata. 
14 
 
4.3. Secreción de insulina estimulada por glucosa 
La secreción de insulina estimulada por glucosa es un fenómeno complejo de 
transducción de señales que incluye el acoplamiento de procesos metabólicos a 
procesos eléctricos en las células beta. Éste proceso inicia cuando los niveles de 
glucosa en el medio extracelular se elevan (por encima de 7 mM) después de la 
ingestión de alimentos. Comprende una serie de eventos proximales tales como la 
internalización de la glucosa a través de proteínas transportadoras -GLUT2 en 
roedores (SLC2A2) o GLUT1 en humanos (SLC2A1)- localizadas en la membrana 
de las células beta; su fosforilación por la enzima glucocinasa (GK por sus siglas 
en inglés), el catabolismo de la misma en la glucólisis, el ciclo de Krebs y en la 
fosforilación oxidativa que resultan en un aumento en la relación intracelular de 
ATP/ADP. También comprende una serie de eventos distales que incluyen la 
activación de diferentes canales iónicos en la membrana celular, y que regulan la 
actividad eléctrica de la célula y de esta manera la secreción de insulina (Hiriart et 
al. 2014) (Hiriart M, et al. 2015). 
Cabe señalar que se ha propuesto que el flujo glucolítico en las células beta es 
regulado por el transporte de glucosa hacia el interior de las células y la actividad 
enzimática de la GK (Prentki and Matschinsky 1987; Prentki, et al. 2013). 
En las células beta de rata, el metabolismo de la glucosa produce un aumento en 
la relación ATP/ADP intracelular provoca el cierre de los canales de potasio 
sensibles a ATP (KATP, por su siglas en inglés) que aunado a la actividad de 
canales catiónicos no selectivos del tipo de receptores de potencial transitorio 
(TRP, transient receptor potential) inician una despolarización lenta del potencial 
15 
 
de membrana. Cuando el potencial alcanza valores de alrededor de -40 mV, 
aumenta la probabilidad de apretura de los canales de sodio (VGNS “voltage-
gated sodium channels” por sus siglas en inglés) y de calcio (VDCC “voltage-
dependent calcium channels” por sus siglas en inglés) tipo T dependientes de 
voltaje. Esto conlleva a un aumento en la entrada tanto de sodio (Na+) como de 
calcio (Ca2+) a la célula y así a una despolarización lenta. Posteriormente, 
alrededor de los -20 mV, los VDCC tipo P/Q, N y L (en roedores) se activan y 
aumentan su conductancia, lo que resulta en un incremento de la concentración 
intracelular de calcio, la despolarización de la membrana (con potencial en forma 
de meseta) y la aparición de ráfagas de potenciales de acción superpuestos; 
provocando la exocitosis de gránulos que contienen insulina (Hiriart and Aguilar-
Bryan 2008; Velasco et al. 2016). Finalmente, la actividad de los canales de 
potasio de rectificación tardía (Kv) y los canales de potasio dependientes de 
voltaje sensibles a calcio repolarizan el potencial de membrana y por lo tanto 
disminuyen la secreción de insulina estimulada por glucosa (Yang, et al. 2014) 
(Figura 2A). 
Actualmente, se conoce que la secreción de insulina en respuesta a una elevación 
sostenida en la concentración de glucosa es bifásica. La primera fase aparece 
como una elevación rápida y transitoria de la secreción de insulina (de entre 5 y 10 
min de duración) después de un período corto de tiempo tras la estimulación. En 
ésta se secreta la reserva de gránulos con insulina, previamente atracados a la 
membrana y que se encuentran disponibles para fusionarse con la membrana 
celular y liberar su contenido (RRP “readily releasable pool” por sus siglas en 
16 
 
inglés; y constituyen entre 1 y 2 % del total de gránulos con insulina en las células 
beta). La segunda fase aparece como una elevación lenta y prolongada de la 
secreción de insulina que persiste mientras haya estimulación con glucosa. En 
ésta se secretan gránulos de la reserva de almacenamiento (SGP “storage-
granule pool” por sus siglas en inglés) que se procesan, movilizan, atracan y 
fusionan a la membrana una vez que la célula beta es estimulada (Hiriart M 2005, 
(Wang and Thurmond 2009) (Suckale and Solimena 2010). 
Se conoce que las señales de calcio intracelulares que disparan la exocitosis de 
gránulos de insulina son necesarias para la secreción de insulina estimulada por 
glucosa en ambas fases de la secreción. Sin embargo, se ha propuesto que el 
metabolismo, principalmente de glucosa, es importante en la segunda fase 
(sostenida) de la secreción de insulina debido a que esta vía de señalización -
independiente de los canales KATP y del potencial de membrana- sensibiliza a la 
maquinaria exocítica de la célula a los cambios en la concentración intracelular de 
calcio y promueve el procesamiento, translocación, anclaje y fusión de los 
gránulos de la reserva de almacenamiento con la membrana plasmática (Hiriart M 
2015) (Henquin 2000) (Straub, et al. 2004) (Ferdaoussi, et al. 2015; Ohara-
Imaizumi, et al. 2007). Recientemente, algunos trabajosde análisis dinámicos de 
secreción de insulina en islotes pancreáticos de ratón, han sugerido que las 
señales de amplificación producidas por la glucosa pueden tener un papel 
regulador en la primera fase de secreción de insulina en respuesta a la glucosa 
(Henquin 2011). 
17 
 
El procesamiento, translocación, anclaje y fusión de los gránulos que contienen 
insulina, se lleva a cabo mediante proteínas de dos tipos: 1) proteínas ciclasas de 
nucleótidos de GTP/GDP y, 2) proteínas del complejo SNARE (“soluble NSF 
attachment protein receptor”) que incluyen a proteínas de membrana como la 
sintaxina y la SNAP23/25; y a proteínas asociadas a vesículas como VAMP 
(sinaptobrevinas). En conjunto, la interacción de las proteínas SNARE con los 
VDCC permiten coordinar la entrada de Ca2+ a la célula con el proceso de 
exocitosis de los gránulos que contienen insulina (Hiriart M, et al. 2015, (Jewell, et 
al. 2010) (MacDonald, et al. 2005) (Figura 2B). 
 
18 
 
FIGURA 2. Secreción de insulina estimulada por glucosa. A) Descripción general del proceso 
de secreción de insulina, desde la entrada de glucosa a la célula beta hasta la exocitosis de los 
gránulos que contienen insulina. B) Secreción bifásica de insulina después de un estímulo con 
glucosa. 
4.4. Desarrollo del páncreas y diferenciación de las células beta 
La organogénesis del páncreas comprende una compleja y coordinada serie de 
procesos en la que intervienen diversas vías de señalización e interacciones 
epitelio mesénquima. En el desarrollo embrionario de la rata, este proceso inicia 
aproximadamente a partir del día E9.5 – E10.5 con la especificación del territorio 
pancreático en la parte final del intestino anterior del embrión, que se evidencia 
con la expresión del factor de transcripción 1 con homeodominio pancreático 
duodenal (Pdx1, por sus siglas en inglés). Al mismo tiempo, se observa un 
engrosamiento del mesénquima que rodea el territorio pancreático. Alrededor del 
día E10.5 se observan dos engrosamientos del endodermo hacia el mesénquima, 
el primero en la región posterior del tubo (yema pancreática posterior o dorsal) y el 
segundo, que sucede al primero en la parte anterior (yema hepatobiliar o anterior). 
Cabe señalar que los morfógenos que inducen la aparición de ambas yemas son 
diferentes y se ha propuesto que esto puede contribuir a la heterogeneidad 
funcional y morfológica de los islotes adultos (Slack, et al. 1995) (Pan and Wright 
2011) (Gittes 2009) (Roscioni et al. 2016) (Figura 3A). 
Durante la organogénesis temprana, el epitelio de ambas yemas prolifera 
(“transición primaria”), se estratifica paulatinamente, se polariza y forma un 
microlumen en su interior. Subsecuentemente, ambas yemas se elongan hacia el 
19 
 
mesénquima que las rodea y al mismo tiempo se ramifican en sus porciones 
apicales formando una red tubular de forma arborescente (Pan and Wright 2011). 
Durante esta etapa inicial, aparecen algunas células con gránulos de secreción 
endócrina, principalmente glucagon, cuyo papel en el desarrollo se desconoce 
además de que se ha demostrado que dichas células no forman parte de la 
arquitectura posnatal de los islotes. La posterior rotación del tubo digestivo (entre 
el día E13 y E14 aproximadamente) permite la fusión de ambos primordios 
pancreáticos; cada uno con su conducto interno. Las células acinares se forman a 
partir de las células epiteliales de las puntas de las ramificaciones que proliferan 
de forma activa (Pan and Wright 2011; Slack et al. 1995) (Figura 3B). 
Entre el día E14 y E18 del desarrollo de la rata, aparecen en el epitelio de los 
troncos de las yemas ramificadas, células que expresan el factor de transcripción 
tipo bHLH (básico hélice asa hélice) Ngn3 (Neurogenina 3) y que constituyen una 
población progenitora de las células insulares (Schwitzgebel, et al. 2000) (Gu, et 
al. 2002). Éstas células se delaminan, se diferencian y se agrupan en forma de 
cordones que posteriormente dan origen a los islotes. Durante estos procesos 
estas células progenitoras se dividen y dan origen a células post mitóticas que 
expresan factores de transcripción como NeuroD1 (Diferenciación neuronal 1), 
Nkx6.1 (Homeótico 1 NK6) y Pax6 (Caja pareada 6) (Jensen, et al. 2000). El 
aumento considerable en el número de células endócrinas incluyendo a las células 
beta, es conocido como “transición secundaria” (Gittes 2009; Oliver-Krasinski and 
Stoffers 2008). Se ha sugerido que además de jugar un papel importante en la 
especificación del territorio pancreático, el factor de transcripción Pdx1 es esencial 
20 
 
para la aparición, supervivencia o proliferación de las células progenitoras 
endócrinas del páncreas (Burlison, et al. 2008) (Figura 3C). 
El factor de transcripción Ngn3 activa la programación endócrina mediante la 
inducción de otros factores de transcripción como son NeuroD1, Pax4, Arx 
(Homeodominio relacionado con la ausencia de aristas), Isl1 (Islote 1) y Nkx2.2 
(Homeótico 2 NK2) (Oliver-Krasinski and Stoffers 2008). La evidencia experimental 
sugiere que los niveles y la ventana temporal de expresión de la Ngn3 está 
relacionada con la diferenciación de las células progenitoras hacia linajes 
específicos. Así, la expresión de Ngn3 entre los días E12.5 y E15.5 es importante 
para la diferenciación hacia la estirpe beta (Johansson, et al. 2007). La expresión 
de Ngn3 disminuye casi hasta desaparecer en la vida posnatal, sin embargo, 
recientemente se ha observado que las células beta mantienen una expresión muy 
baja que podría relacionarse con su funcionamiento durante la vida adulta (Wang, 
et al. 2009). 
La especificación del linaje y la diferenciación de las células beta requieren de la 
expresión de varios factores de transcripción específicos y a continuación de 
mencionarán los más conocidos (Figura 3D). 
El factor de transcripción Pax4 de la familia Pax (que contienen un par de 
dominios de caja de unión a DNA), es expresado en el territorio pancreático desde 
etapas tempranas del desarrollo. Estudios del linaje de dichas células han 
observado que las células que expresan Pax4 pueden dar origen a todos los tipos 
de células endócrinas. Además, se ha demostrado que la expresión de Pax4 es 
21 
 
necesaria para la diferenciación de células beta así como su capacidad para 
inhibir la expresión del factor de transcripción Arx que favorece la diferenciación 
hacia la estirpe alfa (Sosa-Pineda, et al. 1997; Wang, et al. 2004). 
El factor de transcripción tipo Nkx2.2 comienza a expresarse alrededor del día 
E10.5 en el desarrollo de la rata, sin embargo su expresión queda restringida a las 
células alfa, beta, delta y PP a partir del día E16.5 (Sussel, et al. 1998). La forma 
con el exón A sólo se expresa en las células beta y es regulada por Foxa2 (Caja 
con cabeza de tenedor A2) unido a NeuroD1 (Gittes 2009). Se ha propuesto 
Nkx2.2 puede jugar tanto un papel represor de la transcripción de otros factores 
durante el desarrollo embrionario, como un papel activador durante la maduración 
y la función posnatal de las células beta ya que su expresión se correlaciona con 
los niveles de expresión del factor de transcripción MafA (Proteína A (aviar) de la 
familia de oncogenes de fibrosarcoma musculoaponeurótico v-maf), el 
transportador Glut-2 y la insulina (Doyle, et al. 2007; Doyle and Sussel 2007; 
Oliver-Krasinski and Stoffers 2008). 
El factor Nkx6.1 es expresado en el epitelio pancreático desde el día E11.5 en la 
rata y restringe su expresión a las células progenitoras endócrinas y 
posteriormente a las células beta, incluso durante la vida posnatal (Rudnick, et al. 
1994; Sander, et al. 2000). Se ha propuesto que Nkx6.1 participa en la regulación 
de la secreción de insulina en las células beta maduras; y se ha sugerido que es 
capaz de reprimir la expresión del gen de glucagon en líneas celulares (Gauthier, 
et al. 2007; Schisler, et al.2005). 
22 
 
La familia de factores de transcripción Maf del tipo básico con dominio de cierre de 
leucina está constituida por tres miembros, MafA, MafB y c-Maf y se expresan en 
los islotes pancreáticos. El factor MafA es específico de las células beta y se ha 
identificado como el activador de la transcripción del gen de la insulina a través de 
su unión al elemento RIPE3b1 del promotor de dicho gen (Kataoka, et al. 2002; 
Matsuoka, et al. 2004; Olbrot, et al. 2002). Asimismo, se ha observado que MafA y 
Pdx1 regulan su transcripción de manera recíproca (Raum, et al. 2006; Samaras, 
et al. 2003). La expresión de MafA inicia a partir del día E14.5 de rata, en las 
células que expresan insulina y se mantiene en dicha población aún durante la 
vida adulta (Matsuoka et al. 2004). Datos experimentales sugieren que MafA juega 
un papel importante en la secreción de insulina estimulada por glucosa 
(Nishimura, et al. 2006; Zhang, et al. 2005). 
El factor MafB comienza a expresarse en las células alfa y beta de rata desde el 
día E13.5 y su expresión queda restringida a las células alfa en los islotes adultos 
(Artner, et al. 2006). Se ha propuesto a MafB como regulador de los genes MafA, 
Glut-2 y Nkx6.1 debido a que se puede unir a sus regiones promotoras. 
Finalmente, se ha propuesto que el cambio en la expresión de MafB por MafA 
durante el desarrollo embrionario se relaciona con un aumento en la expresión de 
Pdx1 en las células beta (Nishimura et al. 2006). 
El estudio del papel de los factores de transcripción de la familia del tipo “forkhead” 
(cabeza de tenedor) Foxa2 durante el desarrollo embrionario ha sido complicado 
debido a que en modelos de ratón “knockout” para dicho factor, se produce la 
muerte del embrión en el día E11. Sin embargo, Foxa2 ha sido propuesto como 
23 
 
participante en la diferenciación de las células beta a través de trabajos en donde 
ha sido deletado en las células beta de ratones adultos. Dicha ablación provoca 
una disminución en la expresión de genes blanco de dicho factor como Sur1 
(Receptor a sulfonilureas 1), Kir6.2 (Canal de potasio de rectificación entrante 6.2) 
y Hadhsc (Deshidrogenasa de L-3-hidroxiacil de cadena corta coenzima A); así 
como alteraciones en la respuesta a calcio y en el atracamiento de gránulos que 
contienen insulina a la membrana plasmática (Ang and Rossant 1994; Gao, et al. 
2007; Sund, et al. 2001). 
24 
 
 
FIGURA 3. Desarrollo embrionario del páncreas de rata y maduración de las células beta. A) 
Anatomía del páncreas embrionario de rata. B) Descripción del proceso de elongación y 
ramificación de las yemas pancreáticas (Transición primaria). C) Aparición y delaminación de 
células progenitoras endócrinas (Ngn3+) en los conductos y su posterior diferenciación hacia 
células insulares (Transición secundaria). Se muestran inmunofluorescencias para la detección de 
Ngn3 (verde) y núcleos (rojo) en los conductos del páncreas embrionario de rata E15.5. D) 
Páncreas embrionario de rata (día 15.5 de gestación) y factores de transcripción expresados por 
las células progenitoras endócrinas y células beta durante su diferenciación y maduración. 
25 
 
4.5. Maduración de la célula beta 
Como se mencionó, las células beta se derivan de una población de células 
progenitoras en el embrión. El número de células beta al momento del nacimiento 
depende tanto de la renovación como de la diferenciación de dichas células 
progenitoras durante el desarrollo embrionario (Stanger, et al. 2007). 
Se ha sugerido que después del nacimiento, la masa de células beta (número total 
de células beta pancreáticas en un momento dado) está dada por la diferenciación 
celular a partir de células progenitoras (neogénesis), el aumento del tamaño de las 
células (hipertrofia), la muerte celular programada (apoptosis) y la proliferación 
celular. Sin embargo se ha demostrado que en condiciones normales, la 
proliferación es el mecanismo principal que regula y determina la cantidad de 
células beta que se generan durante la ablactación, que constituye el período de 
mayor expansión de la masa de células beta en el páncreas (Aguayo-Mazzucato, 
et al. 2006; Dor, et al. 2004; Teta, et al. 2007) (Figura 4A). 
Por otro lado, se ha observado que la capacidad de proliferación de las células 
beta de roedores disminuye en función de la edad (Lee and Nielsen 2009). Se ha 
propuesto que aunado a la disminución en la capacidad proliferativa de las células 
beta en el período posnatal; la maduración funcional de estas, está determinada 
por su capacidad de secretar cantidades robustas de insulina en condiciones de 
glucosa basal en el medio extracelular (4.5 y 5.6 mM) así como de aumentar dicha 
secreción en correlación directa con concentraciones estimulantes de glucosa (> 7 
mM) (Hiriart and Aguilar-Bryan 2008). Trabajos previos en nuestro laboratorio han 
demostrado la presencia de una ventana crítica posnatal en el desarrollo de los 
26 
 
islotes pancreáticos durante el período de ablactación de la rata (entre los días 20 
y 28 del desarrollo posnatal en el laboratorio) (Aguayo-Mazzucato et al. 2006). 
La ablactación representa una situación de estrés metabólico debido al cambio de 
la dieta a base de leche rica en grasa hacia una dieta rica en carbohidratos. En 
nuestro laboratorio se ha observado que durante el período de ablactación (a partir 
del día 20 posnatal en condiciones de laboratorio), las ratas presentan un estado 
de resistencia fisiológica a la insulina con hiperinsulinemia relativa e hiperglucemia 
que se asocia al inicio de la maduración funcional de la secreción de insulina 
(Aguayo-Mazzucato et al. 2006). 
Diversos trabajos sugieren que el proceso de maduración de las células 
beta incluye cambios en: a) los niveles de expresión de canales iónicos 
relacionados con la secreción de insulina. b) los niveles de expresión de 
transportadores de glucosa (Navarro-Tableros, et al. 2007; Richardson, et al. 
2007); c) la actividad enzimática de la glucocinasa (Taniguchi, et al. 2000), d) en la 
expresión de conexinas que forman las uniones comunicantes entre las células 
beta (Carvalho, et al. 2010); e) la expresión de proteínas que funcionan como 
marcadores de células beta maduras como la urocortina 3 (Blum, et al. 2012; van 
der Meulen, et al. 2012); f) la activación de la vía de señalización de la 
calcineurina/Factor nuclear de activación de las células T (NFAT por sus siglas en 
inglés) (Goodyer, et al. 2012) y g) la conformación estructural del islote per se, en 
su vasculatura y en su inervación (Cabrera-Vasquez et al. 2009) (Figura 2B). 
27 
 
 
FIGURA 4. Mecanismos de mantenimiento (in vivo) de la población de células beta y 
maduración de las células beta durante la ventana crítica del desarrollo posnatal 
(ablactación). A) Mecanismos fisiológicos que permiten mantener la población de células beta en 
el páncreas de rata durante la vida posnatal. B) Maduración de la secreción de insulina estimulada 
por glucosa durante el período de la lactancia y la ablactación (ventana crítica del desarrollo 
posnatal) de la rata. 
28 
 
4.6. Diferenciación in vitro de células beta 
La investigación relacionada con el desarrollo embrionario y posnatal de las 
células beta pancreáticas ha cobrado relevancia en años recientes. El 
conocimiento y la comprensión de las vías de señalización, los factores de 
transcripción y los mecanismos que regulan la diferenciación y la maduración 
posnatal de las células beta constituyen un pilar en la generación de nuevas 
estrategias terapéuticas para el tratamiento de la diabetes mellitus. Los avances 
en el área han permitido desarrollar algoritmos para generar células secretoras de 
insulina a partir de células troncales embrionarias o reprogramadas de humano y 
de ratón. Además se especula que dichos avances también permitirán controlar la 
proliferación y subsecuente maduración funcional delas células beta in vivo 
(Kumar, et al. 2014; Mayhew and Wells 2010; Schroeder 2012) (Figura 5). 
Trabajos recientes han sugerido la posibilidad de utilizar diferentes estrategias 
para generar células secretoras de insulina in vitro (Sena, et al. 2010; Vetere, et al. 
2014). Estas células poseen algunas características parecidas a las de las células 
beta normales, que incluyen la presencia de gránulos que contienen insulina o la 
expresión de genes relacionados con las células beta. Sin embargo, dichas células 
poseen una secreción de insulina estimulada por glucosa poco desarrollada así 
como diferencias importantes en el transcriptoma cuando son comparadas con 
células beta maduras normales (D'Amour, et al. 2006; Hrvatin, et al. 2014; 
Narayanan, et al. 2014; Pagliuca, et al. 2014). 
 
29 
 
 
FIGURA 5. Mecanismos propuestos para regeneración de células beta pancreáticas. 
 
5. ANTECEDENTES 
5.1. Biología de sistemas y la célula beta 
La utilización de metodologías como la citometría de flujo y de herramientas para 
analizar el transcriptoma de las células beta ha permitido un abordaje desde la 
perspectiva de la biología de sistemas. 
La biología de sistemas constituye una disciplina que analiza las propiedades 
sistémicas y las interacciones dinámicas en un objeto biológico de una manera 
cualitativa y cuantitativa mediante la combinación de estudios experimentales con 
modelos matemáticos (Klipp E, et al. 2016). Esta disciplina permite el estudio 
metodológico y comprensivo de sistemas biológicos complejos mediante la 
30 
 
recopilación y análisis de datos a gran escala para generar y probar modelos de 
procesos biológicos. 
La biología de sistemas utiliza tecnologías de nueva generación como 
microarreglos, RNAseq y espectrometría de masas entre otras; en combinación 
con herramientas estadísticas y computacionales para analizar las interacciones 
de los componentes de un sistema biológico e interrogarlo experimentalmente. Los 
abordajes experimentales de la biología de sistemas pretenden ir más allá de la 
determinación de correlaciones simples para determinar cómo interaccionan los 
componentes del sistema. El análisis de dichas interacciones puede basarse en 
conexiones bibliográficas, evidencia experimental de interacciones físicas o de 
procesos de regulación que pueden ser descritas en forma de redes y pueden ser 
modeladas matemáticamente de manera que permiten la predicción de respuestas 
del sistema ante ciertos estímulos (Lusis, et al. 2008). 
Trabajos recientes han utilizado la citometría de flujo o la microdisección con láser 
para obtener poblaciones enriquecidas de células beta de ratas neonatas y ratas 
adultas para analizar los cambios en la expresión de sus genes. Estos trabajos 
han sugerido que genes de factores de transcripción como MafA y NeuroD1, de 
receptores como Glp1r (Receptor de la proteína parecida al glucagon 1); genes 
relacionados con el metabolismo como Slc2a2/Glut2, Pfk1 (fosfofructocinasa 1), 
Pc (carboxilasa de piruvato), Fmo5 (Monooxigenasa 5 que contiene flavina), Rfk 
(cinasa de riboflavina); y de intercambiadores mitocondriales como Mdh1/2 
(Deshidrogenasa 1 y 2 de malato) y Gpd1/2 (Deshidrogenasa 1 de glicerol 3 
fosfato) podrían relacionarse con la maduración de la secreción de insulina 
31 
 
estimulada por glucosa (Aguayo-Mazzucato, et al. 2011; Jermendy, et al. 2011; 
Martens, et al. 2014). 
Sin embargo, el análisis por inmunotinción sugiere que el RNA extraído de células 
obtenidas a partir de la microdisección con láser incluyera transcritos de genes de 
otras estirpes celulares debido a las diferencias en la composición celular de los 
islotes en distintas etapas del desarrollo posnatal temprano (Jermendy et al. 
2011). Por otro lado, se ha sugerido que los análisis del transcriptoma de células 
basado en los cambios en los valores de expresión de genes pueden pasar por 
alto los efectos de algunos procesos celulares o vías de señalización complejas 
(Subramanian, et al. 2005). Finalmente, es importante considerar que el proceso 
de maduración de la secreción de insulina estimulada por glucosa está 
correlacionada con la fase de ablactación de la rata y que la comparación 
utilizando animales recién nacidos podría no reflejar los cambios transcripcionales 
en esta etapa del desarrollo posnatal . 
32 
 
6. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 
La determinación y el análisis de la expresión genética de las células beta 
pancreáticas, permitirá conocer y entender los mecanismos moleculares y las vías 
de señalización y metabólicas que participan en la maduración de la secreción de 
insulina estimulada por glucosa y otros procesos fisiológicos durante la ventana 
crítica del desarrollo posnatal del páncreas. 
7. HIPÓTESIS 
Los genes que codifican proteínas que participan en el metabolismo de la glucosa 
(glucólisis, ciclo de ácidos tricarboxílicos, fosforilación oxidativa), en la 
generación del potencial de acción y en la diferenciación de las células beta 
cambiarán sus niveles de expresión durante la ventana crítica del desarrollo 
posnatal del páncreas, y se correlacionarán con el proceso de maduración de la 
secreción de insulina estimulada por glucosa de la célula beta. 
 
33 
 
8. OBJETIVO GENERAL 
El objetivo del presente trabajo consistió en analizar el contexto morfofuncional de 
poblaciones enriquecidas de células beta inmaduras (neonatales, 20d y 28d 
posnatal) y maduras (adultas) obtenidas mediante citometría de flujo para conocer 
los cambios en el transcriptoma que participan en su maduración. 
9. OBJETIVOS PARTICULARES 
• Obtener poblaciones enriquecidas de células beta a partir de cultivos 
primarios de ratas neonatas (posnatal 0), lactantes (día 20), ablactadas (día 
28) y adultas de 250-280 g (10-12 semanas de edad). 
• Obtener, analizar y comparar el transcriptoma de poblaciones enriquecidas 
de células beta obtenidas mediante citometría de flujo. 
• Determinar los principales grupos funcionales de genes y los genes 
individuales que pueden estar relacionados con la maduración de las 
células beta y la secreción de insulina. 
• Realizar validaciones funcionales de los grupos de genes y genes 
individuales que participan en el proceso de maduración de las células beta 
y la secreción de insulina. 
 
 
 
34 
 
 
10. METODOLOGÍA 
10.1. Diseño experimental 
 
 
 
Aislamiento de células insulares 
Poblaciones enriquecidas 
de células beta 
(Fluorescence-activated 
cell sorting) 
Páncreas 
neonatal, 20d, 
28d y Adultas 
Análisis funcional 
Neo, 20d, 28d y Adultas 
Análisis transcripcional 
20d vs Adultas 
(Microarreglos) 
• RHPA 
• Electrofisiología 
• Citometría de flujo 
35 
 
10.2. Reactivos y materiales 
Los reactivos fueron obtenidos de las siguientes fuentes: Solución salina 
balanceada de Hank (HBSS por sus siglas en inglés), ácido etilenglicol-bis [β-
aminoetiléter] N, N, N’, N’-tetraacético (EGTA), Ficoll 400, azul tripano, Poli-L-
lisina, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico (HEPES), proteína A de 
Staphylococcus aureus, tripsina de Sigma-Aldrich (St. Louis MO, EUA); 
colagenasa P de Roche (Mannheim, Alemania), Sales para medio de Earl 
modificado por Dulbeco (DMEM), solución penicilina-estreptomicina, Medio Ham 
F10, solución de L-glutamina, suero bovino fetal (FBS), complemento de cobayo 
de Life Technologies (Grand Island, NY, EUA); polvo de albúmina de suero bovino 
liofilizada (BSA) de United States Biological (Swampscott, MA, EUA) 
10.3. Animales 
Todos los procedimientos realizados en este trabajo fueron aprobados por el 
Comité de Cuidado Animal del Instituto de Fisiología Celular de la Universidad 
Nacional Autónoma de México. El cuidado de los animales se llevó a cabo de 
acuerdo con los “International Guiding Principles for Biomedical Research 
Involving Animals”, del “Council for International Organization of Biomedical 
Sciences”,2010. 
Todos los experimentos, exceptuando el análisis con microarreglos, se realizaron 
en ratas macho Wistar recién nacidas (1 día posnatal), lactantes (20 días 
posnatales), ablactadas (28 días posnatales) y adultas jóvenes (250-280 g). Los 
animales fueron obtenidos del bioterio local del Instituto de Fisiología Celular 
36 
 
UNAM y fueron mantenidos en vivario con ciclos de luz/obscuridad de 12 h y 
temperatura constante de 22 °C. Las ratas fueron mantenidas con sus madres 
desde su nacimiento hasta el día 20 posnatal; y alimentadas con croquetas 
estándar Laboratory rodent diet 5001 (Lab Diet, St. Louis, MO. EUA) a partir del 
día 21 de edad. 
10.4. Cultivo primario de células insulares de páncreas 
Previo a la disección del páncreas, las ratas utilizadas, fueron anestesiadas 
mediante una inyección de pentobarbital sódico (40 mg/kg). Posterior a la cirugía, 
se realizó dislocación cervical a cada uno de los animales. 
Las células insulares pancreáticas fueron obtenidas mediante un procedimiento 
descrito previamente en trabajos del laboratorio (Aguayo-Mazzucato et al. 2006). 
Los islotes pancreáticos fueron aislados y separados del tejido acinar mediante 
digestión por colagenasa (0.5 mg/ml) en solución salina balanceada de Hank y 
centrifugación en una solución con gradiente de concentración de Ficoll (para los 
islotes de ratas neonatales); y separados manualmente utilizando un microscopio 
esteroscópico (para los islotes de ratas lactantes, ablactadas y adultas). 
La disociación de las células insulares se realizó mediante incubación de los 
islotes en una solución libre de calcio con 5.6 mM de glucosa, 0.5% de BSA y 3 
mM de EGTA (ácido etilenglicol-bis [β-aminoethylether] N, N, N’, N’-tetraacético) a 
37 °C en baño con agitación durante 5 minutos; y posterior disgregación mecánica 
en la misma solución adicionada con tripsina (concentración final de 0.01%). La 
37 
 
disociación fue detenida cuando 50 ó 60 % de las células se observaron 
completamente aisladas. 
10.5. Purificación de células beta aisladas mediante citometría de flujo 
(FACS) 
Previo al proceso de aislamiento mediante FACS, las células insulares obtenidas 
por medio de cultivo primario, fueron incubadas en medio DMEM suplementado 
con 0.05 % de BSA, 200 U/ml de penicilina G y 200 µg/ml de estreptomicina 
durante 45-60 minutos a temperatura ambiente; y filtradas utilizando mallas de 
nylon con poros de 70 µm de diámetro para remover agregados celulares. 
Para el proceso de aislamiento, las células insulares fueron enjuagadas, 
transportadas en solución de aislamiento (123 mM de NaCl, 1.8 mM de CaCl2, 0.8 
mM de MgSO4, 5.4 mM de KCl, 1 mM de NaH2PO4, 2.8 mM de glucosa, 4.2 mM 
NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.5 % de BSA, 200 U/ml de penicilina G y 200 µg/ml de 
estreptomicina) (Stangé G 2003). Las células beta fueron aisladas utilizando un 
citómetro FACSAria I (Becton, Dickinson and Company, San Diego, CA. EUA) 
(con láseres azul y rojo). Las células beta purificadas fueron recibidas y cultivadas 
en medio Ham F10 suplementado con 10% de suero bovino fetal, 200 µM de L-
glutamina, 200 U/ml de penicilina G, 200 µg/ml de estreptomicina, y 0.5 µg/ml de 
anfotericina. 
 La estrategia de purificación consistió en: 1) la selección de eventos aislados en 
una gráfica con los parámetros FSC-H/FSC-A; 2) la selección de eventos con la 
fluorescencia (emitida entre 515 y 545 nm de longitud de onda; FITC-A) mayor en 
38 
 
una gráfica con los parámetros FITC-A/FSC-A; 3) la selección de eventos con 
valores altos de complejidad interna (SSC-A) en una gráfica con los parámetros 
SSC-A/FITC-A (Figura 6). 
10.6. Inmunofluorescencia para determinación de purezas y evaluación de 
la proliferación celular 
Las células beta aisladas mediante FACS fueron adheridas a cubreobjetos 
impregnados con poli-L-lisina y cultivadas en incubadora a 37 °C y 5 % de CO2 
durante 12 horas. Posteriormente, las células fueron fijadas con una solución de 
paraformaldehído al 2 % en solución amortiguadora de fosfatos (PBS, phosphate 
buffer solution, por sus siglas en inglés) a temperatura ambiente, durante 45 min, 
enjuagadas con PBS y permeabilizadas con una solución permeabilizante y 
bloqueante con 2 % de suero de cabra y 0.1 % de Triton-X (vol-vol) a temperatura 
ambiente durante 30 minutos. Inmediatamente después, las células se incubaron 
en una solución con anticuerpos de cobayo anti insulina (primarios) en PBS a una 
dilución de 1:5000, a 4 °C durante una noche. Al día siguiente, las células fueron 
enjuagadas con PBS e incubadas en solución con anticuerpos anti anticuerpos de 
cobayo (secundarios), conjugados con Dye-Light 483 (Jackson ImmunoResearch 
Laboratories Inc. EUA) o Alexa 649 (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. 
EUA) a temperatura ambiente durante 2 horas. Finalmente, las células fueron 
incubadas en una solución de Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich St. Louis, MO, EUA) 
1:30000 en PBS a temperatura ambiente durante 10 minutos; y se utilizó medio de 
montaje para preservar fluorescencia con 15 mM NaN3 (DAKO North America, Inc. 
39 
 
Carpinteria, CA, EUA). Los controles negativos de la inmunotinción se realizaron 
omitiendo la incubación con anticuerpos primarios. 
Para realizar el análisis de la proliferación de células beta de cultivos primarios, se 
utilizaron ratas lactantes y adultas. Las células insulares fueron cultivadas en 
cubreobjetos cubiertos con poli-L-lisina a 37 °C en 5 % de CO2 durante 12 horas. 
Posteriormente, las células fueron fijadas con una solución de paraformaldehído al 
2 % en PBS a temperatura ambiente durante 30 minutos, enjuagadas con PBS y 
permeabilizadas con una solución perforante y bloqueante con suero de cabra al 
10 %, 0.3 M de glicina, albúmina de suero bovino al 1 % y 0.1 % de Tween 
(vol/vol) a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, se incubaron con 
anticuerpo primario de conejo anti Ki67 (ab15580 Abcam) y anticuerpo primario de 
cobayo anti insulina a diluciones de 1:100 y 1:5000 respectivamente a 4 °C 
durante 12 h. 
Al día siguiente, las células fueron enjuagadas con PBS e incubadas con 
anticuerpo IgG de cabra anti conejo conjugado con FITC (Jackson 
ImmunoResearch Laboratories Inc. EUA) a una dilución 1:100 y posteriormente, 
previo lavado con PBS, con anticuerpo IgG de cabra anti cobayo conjugado con 
Alexa 649 a una dilución 1:200 a temperatura ambiente durante 1 hora. 
Finalmente, para la tinción nuclear, las células fueron incubadas en una solución 
con Hoechst 33342 1:30000 en PBS a temperatura ambiente durante 10 minutos; 
y se utilizó medio de montaje para preservar fluorescencia con 15 mM NaN3 
(DAKO North America, Inc. Carpinteria, CA, EUA). Los controles negativos de la 
inmunotinción se realizaron omitiendo la incubación con anticuerpos primarios. 
40 
 
Para el control positivo de la inmunotinción de Ki67 se utilizaron células de cáncer 
cervicouterino de la línea SiHa. 
Para el análisis de las inmunofluorescencias se utilizó un microscopio de 
epifluorescencia Olympus lX7l equipado con una lámpara de mercurio de 100 W y 
filtros ópticos apropiados para los siguientes fluoróforos: Hoechst 
(excitación/emisión 365/440 nm de longitud de onda), FITC (excitación/emisión 
488/510 nm de longitud de onda), y Alexa 649 (excitación/emisión 586/647 nm de 
longitud de onda). Las células fueron observadas a través de un objetivo 20 X y 
una amplificación de 1.63. Las imágenes digitales fueron adquiridas con una 
cámara CCD digital (Evolution Media Cybernetics, Silver Spring, MD). La 
exposición para cada fotografía fue seleccionada de acuerdo con el rango de 
intensidad de fluorescencia de cada muestra y su control negativo de 
inmunotinción. 
Las imágenes fueron adquiridas mediante el programa Image-Pro Express 2.0 
(Media Cybernetics, Silver Spring, MD, EUA) y guardados en formato TIFF. El 
análisis de las imágenes se realizó con el programa ImageJ del NIHde EUA 
(http://rsb.info.nih.gov/ij). La pureza de las células beta fue obtenida mediante la 
cuantificación de las células positivas para la tinción de insulina en relación al total 
de células en la muestra; y el nivel de proliferación mediante la cuantificación de 
las células positivas para la tinción de Ki67 en relación al total de células de la 
muestra. 
41 
 
10.7. Extracción de RNA, hibridación y análisis de los microarreglos. 
El RNA total fue obtenido a partir de tres replicas biológicas de cada condición 
mediante el RNeasy Micro Kit (Qiagen, EUA.). Cada muestra consistió en una 
población de células beta purificadas mediante citometría de flujo a partir de un 
cultivo de células insulares. Para cada cultivo de células adultas, se utilizaron 4 
ratas de 250-280 g y para cada cultivo de ratas de 20 días se utilizaron 6 
animales. 
Se utilizó un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, EUA) para realizar 
el control de calidad del RNA obtenido. Se tomó en cuenta un valor mínimo de 6.4 
para el número de integridad del RNA (RNA integrity number, RIN). Se marcaron 
200 ng de RNA total con el fluoróforo Cy5 y posteriormente se hibridaron en chips 
Affymetrix Rat GeneChip Gene 1.0 ST (Affymetrix, EUA) de acuerdo con las 
instrucciones del fabricante. 
Los datos obtenidos (16,000 genes según la hoja técnica de los microarreglos) 
fueron procesados con el programa R/Bioconductor (Gentleman, et al. 2004). 
Previo al análisis, se realizaron la corrección de fondo, la normalización y el 
cálculo de los niveles de expresión mediante el método de promedio robusto de 
microarreglo (robust microarray average, RMA por sus siglas en inglés). Los datos 
obtenidos, fueron puestos a disposición pública en el repositorio GEO (Gene 
expression omnibus) en conformidad con una base de datos de información 
mínima acerca de experimentos con microarreglos (mínimum information about a 
microarray experiment, MIAME) con el registro GSE76969. 
42 
 
La comparación de los niveles de expresión se realizó mediante análisis de 
enriquecimiento de grupos de genes (gene-set enrichment analysis, GSEA) para 
identificar grupos de genes (sets de genes) relacionados funcionalmente, con 
enriquecimiento significativo para cada edad. De manera breve, los datos de los 
perfiles de expresión de las muestras, se ordenaron en una lista de acuerdo con la 
correlación entre su nivel de expresión y la condición a comparar (edad). 
Finalmente, se determinó si los miembros de cada uno de los sets de genes 
(definidos a priori) se distribuyeron de manera aleatoria o se encontraron al inicio o 
al final de la lista ordenada de genes (Subramanian et al. 2005). Los grupos de 
genes que mostraron un “índice de descubrimiento falso” (false discovery rate) < 
25 % y p < 0.05 fueron considerados como enriquecidos. 
Finalmente, la comparación de la expresión diferencial de genes entre las células 
beta de cada edad, se realizó mediante el paquete lima del programa 
R/Bioconductor (Gentleman et al. 2004) en el que se utilizó un ajuste de modelo 
lineal. Los genes que tuvieron valores del estadístico B > 0 y cambio > 1.5 en la 
expresión (log2 absoluto) fueron considerados como diferencialmente expresados. 
10.8. Ensayo hemolítico inverso en placa para insulina (RHPA, reverse 
hemolythic plaque assay) 
Previo a la cuantificación de la secreción de insulina, entre 1000 y 2000 células 
beta purificadas por citometría de flujo fueron sembradas en cámaras de 
Cunningham tratadas con poli-L-lisina. Las células fueron cultivadas en medio 
Ham F10 suplementado durante 12 horas a 37 °C en 5 % de CO2. Antes de cada 
43 
 
experimento, las células se incubaron en solución salina balanceada de Hank con 
5.6 mM de glucosa y 0.5 % de albúmina de suero bovino. 
Para el experimento, se agregó un volumen de 300 µl de eritrocitos de borrego 
cubiertos previamente con proteína A de Staphylococcus aureus (a dilución 1:15), 
anticuerpo de cobayo anti insulina (a dilución 1:50) y complemento de cobayo en 
solución salina balanceada de Hank con 5.6 mM o 15.6 mM de glucosa; y las 
células fueron incubadas 2 horas a 37 °C en 5 % de CO2. La insulina secretada 
fue revelada mediante placas de hemólisis alrededor de las células beta, que 
resulta de la lisis de eritrocitos por la activación de complemento mediada por 
inmunocomplejos de insulina y anticuerpo anti insulina. 
Después de la incubación, cada cámara fue fotografiada con un microscopio Leica 
Micro Dissection System 6000 (versión 6.4.1.2887, Leica Microsystems, Alemania) 
acoplado a una cámara Hitachi HV-D20, para posteriormente medir las áreas de 
inmunoplaca con el programa ImageJ del NIH de EUA (http://rsb.info.nih.gov/ij). 
Para la cuantificación, se contabilizaron en promedio 100 células por experimento, 
y se utilizaron al menos tres experimentos independientes realizados por 
duplicado. 
10.9. Análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo 
Se obtuvieron células insulares de cultivo primario de ratas macho de 1, 20 y 28 
días posnatales y adultas de 250-280 g (correspondientes a 10-12 semanas de 
edad). Las células cultivadas fueron fijadas con una solución de paraformaldehído 
al 2 % en PBS a temperatura ambiente durante 45 minutos. Posteriormente, se 
http://rsb.info.nih.gov/ij
44 
 
añadió PBS y se centrifugaron a 80 rcf en dos ocasiones para eliminar el 
paraformaldehído. A continuación, las células se incubaron en una solución 
permeabilizante y bloqueante con suero normal de cabra al 2 %, triton X al 0.1 % 
(vol/vol) en PBS a temperatura ambiente durante 10 minutos; e incubadas con 
suero de cobayo antiinsulina a una dilución de 0.8 µL/106 células a 4 °C durante 
una noche. Al día siguiente, las células fueron centrifugadas nuevamente; y 
posteriormente se incubaron con una solución de anticuerpos de cabra contra 
cobayo conjugados con DyLight 483 (Jackson ImmunoResearch, Inc. EUA) a una 
dilución de 1:200 a temperatura ambiente durante 2 horas. Finalmente, las células 
fueron enjuagadas con PBS, centrifugadas e incubadas con una solución con 
DAPI (4’,6’-diamidino-2fenilindole) 1mg/mL a temperatura ambiente durante 1 hora 
para marcar el DNA de doble cadena. 
Para determinar y analizar el estadio del ciclo celular de las células beta, se 
cuantificó el contenido de DNA de doble cadena en células (entre 10, 000 y 20, 
000) con marca positiva para insulina mediante un citometro Attune Acoustic 
Focusing Cytometer (Life Technologies, EUA) con láseres azul/violeta y el 
programa MODFIT (Verity Software House, Inc EUA). 
10.10. Electrofisiología 
Los experimentos de electrofisiología complementarios fueron realizados por la 
candidata a doctor Neivys García Delgado. Las células insulares cultivadas de 
ratas de 20 días y adultas (250-280 g), fueron utilizadas para registrar corrientes 
de calcio en micro áreas de membrana en la configuración de célula completa, en 
45 
 
la modalidad de fijación de voltaje. Los registros fueron realizados a temperatura 
ambiente mediante un amplificador Axopatch 200A (Axon Instruments, EUA). Las 
micro pipetas con 2-4 MOhms de resistencia, fueron obtenidos mediante el 
estiramiento de tubos capilares Kimax-51 (Kimble Glass, EUA). La punta de las 
pipetas fue cubierta con cera odontológica para reducir su capacitancia. 
Posterior a la obtención de sellos estables, se compensaron los transientes 
capacitivos de la pipeta y se obtuvo la capacitancia celular mediante una 
integración digital con pulsos de + 10 mV. La capacitancia en serie se compensó 
utilizando los circuitos del amplificador. El resto de los transientes capacitivos 
lineales y las corrientes de fuga, se sustrajeron con un procedimiento en línea P/2. 
La generación de pulsos y la adquisición de registros se realizaron con el 
programa PClamp versión 8 (Axon Instruments, EUA). 
La composición de la solución externa de registro fue la siguiente (enmM): 130 de 
NaCl, 5 de KCl, 10 de HEPES, 2 de MgCl2, 5 de CaCl2, 10 de glucosa y 100 nM 
de TTX y pH de 7.3. La solución interna contenía (en mM): 120 de CsAsp, 10 de 
CsCl, 5 de CsF, 10 de HEPES, 2.5 de BAPTA, 2 de ATP y 7.3 de pH. 
Los protocolos de rampa que se utilizaron para el análisis consistieron en pulsos 
despolarizantes desde -120 mV hasta 120 mV con una duración de 480 ms a partir 
de un potencial de reposo de -80 mV. Las gráficas que se mostrarán en éste 
trabajo contienen la relación corriente-voltaje entre -80 y 60 mV. 
Finalmente, las corrientes macroscópicas de calcio analizadas fueron obtenidas de 
células beta obtenidas mediante cultivo primario con capacitancias de entre 4.5 y 
46 
 
11 pF (n= 64 células de animales de 20 días de edad y n= 40 células de ratas 
adultas de 250-280 g). 
10.11. Análisis estadístico 
Todos los datos se reportan como medias + error estándar de la media; la n 
denota el número de animales analizados. La significancia estadística p < 0.01 se 
obtuvo mediante análisis de varianza de una vía (ANOVA) y para p < 0.05 se 
utilizó la prueba de T-student, ambas realizadas con el programa Prism 6 para 
Windows versión 6.01 (GraphPad Software 1992-2012, La Jolla, California, EUA). 
47 
 
11. RESULTADOS 
11.1. Caracterización morfológica y citométrica de las células insulares de 
ratas de 1, 20 y 28 días posnatales y adultas (250-280 g). 
Para lograr la obtención de poblaciones enriquecidas de células beta a partir de 
cultivos primarios de células insulares de ratas de las edades estudiadas, fue 
necesario realizar una caracterización morfológica completa de las últimas 
utilizando un citómetro de flujo FACSAriaI (Figura 6A). 
Posteriormente, se diseñó una estrategia que consistió en la selección sucesiva 
de: 1) la subpoblación de eventos aislados con base en los parámetros FSC-A y 
FSC-H; 2) la subpoblación con mayor tamaño (FSC-A) y mayor autofluorescencia 
(FITC-A) y por último, 3) la subpoblación de eventos con mayor complejidad 
interna (SSC-A) (Figura 6B). 
La validación de la pureza de poblaciones de células beta obtenidas con citometría 
de flujo, se realizó mediante la detección de insulina con inmunofluorescencia. Los 
porcentajes de pureza obtenidos fueron los siguientes: a) 78 + 1.4 % para células 
beta de ratas recién nacidas; b) 74 + 1.4 % para células beta de ratas de 20 días 
posnatales; c) 81 + 2.3 % de células beta de ratas de 28 días posnatales y; d) 91 + 
2.1 % de células beta de ratas adultas (250-280 g) (Figura 6C). 
El análisis de la autofluorescencia (emitida entre 515 y 545 nm de longitud de 
onda, FITC-A; correlacionada con el contenido intracelular de FAD/FADH) de las 
células beta mediante citometría de flujo mostró que dicha fluorescencia aumenta 
48 
 
de forma gradual en relación directa con la edad a partir del día 20 posnatal hasta 
alcanzar los niveles máximos en la edad adulta (Figura 6D). 
 
11.2. Análisis del transcriptoma de las células beta de ratas de 20 días 
posnatales y adultas (250-280 g) 
Para conocer los niveles de expresión genética de las células beta durante su 
período de maduración posnatal se realizaron microarreglos utilizando el RNA de 
células beta de ratas de 20 días y adultas (250-280 g) purificadas mediante 
citometría de flujo. 
El análisis inicial de los datos obtenidos mediante los microarreglos permitió 
mostrar la correlación entre la expresión global de las células beta y las edades de 
las células para determinar el parecido ente las mismas (Figura 6E). 
49 
 
 
 
 
 
 
50 
 
 D 
 
 E 
 
 
FIGURA 6. Estrategia para la obtención de las poblaciones enriquecidas de células beta de 
ratas en diferentes etapas posnatales, niveles de enriquecimiento, dendrograma de 
correlación entre muestras y autofluorescencia de las células beta. A) Criterios de selección 
para obtener poblaciones enriquecidas de células beta a partir de cultivos primarios de ratas 
neonatas, lactantes, ablactadas y adultas. B) Inmunofluorescencia para la detección de insulina 
(verde) y contratinción nuclear (azul) en poblaciones celulares obtenidas mediante citometría de 
flujo. C) Cuantificación de purezas de las poblaciones obtenidas mediante citometría de flujo. D) 
Incremento (representado en porcentaje) de los niveles intracelulares de FAD/FADH en las células 
51 
 
beta (autofluorescencia en longitud de onda de 510 nm) en comparación con el resto de células 
insulares de ratas de diferentes edades. * p < 0.05 comparado con las células beta de ratas 
neonatas; ** p < 0.05 comparado con las células beta de ratas de 20 d. E) Dendrograma y mapa de 
calor que representan los niveles de expresión globales de cada muestra y la correlación entre los 
microarreglos, respectivamente. 
 
Posteriormente, se realizó un análisis de enriquecimiento de grupos de genes 
(gene-set enrichment analysis, GSEA por sus siglas en inglés) para conocer los 
grupos funcionales de genes que son mayormente utilizados por las células beta 
de 20 días posnatales y adultas, así como un análisis de los genes en el “extremo 
representativo” (leading-edge) de dichos grupos de genes. 
El análisis GSEA mostró una lista de 155 grupos de genes de la base de datos 
MSigDB (Molecular Signature Database) con enriquecimiento positivo con 
significancia estadística. En ellos se incluyen 40 grupos de la base de datos 
Reactome y 64 grupos de la colección Gene Ontology (GO) (Tabla1). Además 
mostró una lista de 1055 grupos de genes de la base de datos MSigDB con 
enriquecimiento negativo con significancia estadística que incluyen 165 grupos de 
la base de datos Reactome, y 163 grupos de la colección GO (Tabla 2). 
52 
 
 
 NOMBRE TAMAÑO NES NOM 
p-val 
FDR 
q-val 
FWER 
p-val 
POSICIÓN 
EN NIVEL 
MÁXIMO 
LEADING 
EDGE 
R
EA
C
TO
M
E
 
REGULACIÓN 
DE LA 
EXPRESIÓN DE 
GENES EN LAS 
CÉLULAS BETA 
19 2.07 0.0 0.0036 0.004 1492 tags=58%, 
list=11%, 
signal=65% 
SISTEMA 
NEURONAL 
257 1.97 0.0 0.011 0.025 2382 tags=30%, 
list=17%, 
signal=35% 
REGULACIÓN 
DE LA 
SECRECIÓN DE 
INSULINA 
83 1.94 0.0 0.013 0.044 1128 tags=28%, 
list=8%, 
signal=30% 
TRANSMISIÓN A 
TRAVÉS DE 
SINÁPSIS 
QUÍMICAS 
175 1.88 0.0 0.026 0.111 2335 tags=30%, 
list=17%, 
signal=36% 
INTEGRACIÓN 
DEL 
METABOLISMO 
ENERGÉTICO 
106 1.87 0.0 0.024 0.126 1128 tags=25%, 
list=8%, 
signal=26% 
SÍNTESIS, 
LIBERACIÓN, 
RECAPTURA Y 
DEGRADACIÓN 
DE GABA 
17 1.85 0.005 0.028 0.1367 271 tags=29%, 
list=2%, 
signal=30% 
CANALES DE 
POTASIO 
89 1.83 0.001 0.030 0.205 1947 tags=29%, 
list=14%, 
signal=34% 
INTERACCIÓN 
ENTRE L1 Y 
ANQUIRINAS 
19 1.82 0.001 0.030 0.231 1961 tags=37%, 
list=14%, 
signal=43% 
ACTIVACIÓN DE 
LA EXPRESIÓN 
CIRCADIANA 
POR RORA 
20 1.82 0.001 0.027 0.231 3093 tags=75%, 
list=22%, 
signal=96% 
 
 
REPRESIÓN DE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
tags=75%, 
53 
 
LA EXPRESIÓN 
POR REV ERBA 
20 1.82 0.003 0.025 0.243 3093 list=22%, 
signal=96% 
ACTIVACIÓN 
DEL RECEPTOR 
DE GABA 
48 1.81 0.001 0.024 0.254 2335 tags=38%, 
list=17%, 
signal=45% 
REGULACIÓN 
DEL 
DESARROLLO 
DE LA CÉLULA 
BETA 
27 1.80 0.003 0.024 0.272 1875 tags=44%, 
list=13%, 
signal=51% 
G
EN
E 
O
N
TO
LO
G
Y
 
ACTIVIDAD DE 
CANALES DE 
CALCIO 
30 2.23 0.0 0.0 0.0 1183 tags=40%, 
list=8%, 
signal=44% 
ACTIVIDAD DE 
CANALES DE 
CALCIO 
DEPENDIENTES 
DE VOLTAJE 
17 2.14 0.0 0.004 0.001 1089 tags=53%, 
list=8%, 
signal=57% 
ACTIVIDAD DE 
CANALES 
CATIÓNICOS 
DEPENDIENTES 
DE VOLTAJE 
57 2.10 0.0 0.032 0.001 1914 tags=35%, 
list=14%, 
signal=40% 
ACTIVIDAD DE 
CANALES 
DEPENDIENTES 
DE VOLTAJE 
64 2.07 0.0 0.097 0.004 1121 tags=28%, 
list=8%, 
signal=30% 
PROCESA 
MIENTO 
METABÓLICO 
DE ESFINGOLÍ 
PIDOS 
27 2.04 0.0 0.001 0.009 1998 tags=56%, 
list=14%, 
signal=65% 
ACTIVIDAD 
TRANSPORTAD
ORA 
TRANSMEMBRA
NAL DE IONES 
METÁLICOS 
127 2.03 0.0 0.001 0.011 1947 tags=29%, 
list=14%, 
signal=33% 
ACTIVIDADDE 
CANALES 
CATIÓNICOS 
104 1.99 0.0 0.004 0.03 1947 tags=29%, 
list=14%, 
signal=33% 
54 
 
TRANSMISIÓN 
SINÁPCTICA 
155 1.95 0.0 0.007 0.058 1999 tags=26%, 
list=14%, 
signal=30% 
DESARROLLO 
NEURONAL 
55 1.94 0.0 0.007 0.066 1173 tags=29%, 
list=8%, 
signal=32% 
ACTIVIDAD DE 
CANALES 
DEPENDIENTES 
108 1.91 0.0 0.011 0.109 1121 tags=22%, 
list=8%, 
signal=24% 
TRANSMISIÓN 
DE IMPULSO 
NERVIOSO 
168 1.89 0.0 0.014 0.147 1999 tags=26%, 
list=15%, 
signal=29% 
TRANSPORTE 
IÓNES 
METÁLICOS 
100 1.89 0.0 0.014 0.163 2144 tags=32%, 
list=15%, 
signal=37% 
TABLA 1. Grupos de genes de las bases de datos Reactoma y Gene Ontology 
correlacionadas con el fenotipo adulto de las células beta (con enriquecimiento positivo). 
 NOMBRE TAMAÑO NES NOM 
p-val 
FDR 
q-val 
FWER 
p-val 
POSICIÓN 
EN NIVEL 
MÁXIMO 
LEADING 
EDGE 
R
EA
C
TO
M
E
 
REPLICACIÓN 
DEL DNA 
160 -3.01 0.0 0.0 0.0 1450 tags=52%, 
list=10%, 
signal=57% 
FASES M-M-G1 
DE LA MITOSIS 
140 -2.96 0.0 0.0 0.0 1450 tags=53%, 
list=10%, 
signal 58% 
CICLO CELULAR 315 -2.95 0.0 0.0 0.0 1386 tags=42%, 
list=10%, 
signal=45% 
CICLO CELULAR 
MITÓTICO 
262 -2.91 0.0 0.0 0.0 1450 tags=42%, 
list=10%, 
signal=46% 
PROMETAFASE 
MITÓTICA 
67 -2.76 0.0 0.0 0.0 599 tags=48%, 
list=4%, 
signal=50% 
55 
 
PUNTOS DE 
CONTROL DEL 
CICLO CELULAR 
100 -2.67 0.0 0.0 0.0 2363 tags=58%, 
list=17%, 
signal=69% 
PUNTOS DE 
CONTROL DE 
G2-M 
39 -2.57 0.0 0.0 0.0 1201 tags=62%, 
list=9%, 
signal=67% 
MANTENIMIENT
O DE 
CROMOSOMAS 
74 -2.55 0.0 0.0 0.0 1252 tags=49%, 
list=9%, 
signal=53% 
TRANSICIÓN G1-
S 
96 -2.55 0.0 0.0 0.0 1809 tags=52%, 
list=13%, 
signal=59% 
DEPOSICIÓN DE 
NUEVOS 
NUCLEOSOMAS 
CON CENPA EN 
EL 
CENTRÓMERO 
27 -2.54 0.0 0.0 0.0 626 tags=70%, 
list=4%, 
signal=73% 
FASES G1-G1-S 
DE LA MITOSIS 
114 -2.53 0.0 0.0 0.0 1914 tags=48%, 
list=14%, 
signal=55% 
FASE S 99 -2.50 0.0 0.0 0.0 1809 tags=48%, 
list=13%, 
signal=55% 
G
EN
E 
O
N
TO
LO
G
Y
 
 
 
CROMOSOMA 101 -2.64 0.0 0.0 0.0 704 tags=31%, 
list=5%, 
signal=32% 
CICLO CELULAR 
MITÓTICO 
132 -2.56 0.0 0.0 0.0 1269 tags=33%, 
list=9%, 
signal=36& 
FASE M DEL 
CICLO CELULAR 
MITÓTICO 
71 -2.55 0.0 0.0 0.0 1269 tags=39%, 
list=9%, 
signal=43% 
REGIÓN 
PERICÉNTRICA 
DEL 
CROMOSOMA 
26 -2.55 0.0 0.0 0.0 368 tags=50%, 
list=3%, 
signal=51% 
HUSO 34 -2.51 0.0 0.0 0.0 368 tags=41%, 
list=3%, 
signal=42% 
56 
 
MITOSIS 68 -2.51 0.0 0.0 0.0 1269 tags=40%, 
list=9%, 
signal=43% 
FASE M 95 -2.49 0.0 0.0 0.0 1269 tags=36%, 
list=9%, 
signal=38% 
PARTE DEL 
CROMOSOMA 
77 -2.48 0.0 0.0 0.0 704 tags=31%, 
list=5%, 
signal=39% 
PROCESO DEL 
CICLO CELULAR 
167 -2.47 0.0 0.0 0.0 1269 tags=32%, 
list=9%, 
signal=34% 
FASE DEL 
CICLO CELULAR 
145 -2.45 0.0 0.0 0.0 1269 tags=32%, 
list=9%, 
signal=35% 
SEGREGACIÓN 
DE 
CROMOSOMAS 
26 -2.32 0.0 0.0 0.0 770 tags=46%, 
list=5%, 
signal=49% 
CINETOCORO 21 -2.27 0.0 0.0 0.0 271 tags=43%, 
list=2%, 
signal=44% 
TABLA 2. Grupos de genes de las bases de datos Reactome y Gene Ontology 
correlacionados con el fenotipo inmaduro de células beta (con el enriquecimiento negativo 
mayor) 
 
Cabe señalar que 5 de los grupos de genes con mayor enriquecimiento positivo 
(correlacionados con la edad adulta 250-280 g) de la base de datos Reactome se 
relacionaron directamente con las células beta pancreáticas e incluyeron: 1) 
regulación de la expresión de genes de las células beta (NES = 2.07); 2) 
regulación de la secreción de insulina (NES = 1.94); 3) Integración del 
metabolismo energético (NES= 1.87); 4) Síntesis, liberación, recaptura y 
degradación del ácido gamma aminobutírico (GABA) (NES = 1.85) y, 5) 
Regulación del desarrollo de las células beta (NES = 1.80). 
57 
 
Además, los grupos de genes de la colección GO con mayor enriquecimiento 
positivo incluyen: 1) actividad de canales de calcio (NES = 2.23), 2) actividad de 
canales de calcio dependientes de voltaje (NES = 2.14), 3) Actividad de canales 
catiónicos dependientes de voltaje (NES = 2.10) y, 4) actividad de canales 
dependientes de voltaje (NES = 2.07). 
Por otro lado, los grupos de genes con enriquecimiento negativo (correlacionados 
con la edad de 20 días posnatales) de la base de datos Reactome y la colección 
GO consistieron en genes relacionados con la proliferación celular (Tabla 2). 
De manera paralela al análisis GSEA, se compararon los niveles de expresión de 
los genes y se obtuvieron los genes con expresión diferencial. Se encontraron 438 
genes con una expresión mayor en células beta adultas y 778 con genes con una 
expresión mayor en células beta de 20 días. Éste tipo de análisis permitió validar 
los resultados obtenidos con el análisis GSEA. Los genes con mayor expresión en 
células beta adultas se relacionan con el control de la expresión de genes 
específicos de la célula beta y el acoplamiento del metabolismo con la secreción 
de insulina como: MafA, Glp1r, Aplp2, y Gabbr2. Además, se encontró que 
algunos genes relacionados con la maduración de las células beta como Slc2a2, 
Ucn3, Gcgr, Pcsk1, Igf1, Egfr y Kcnb2 mostraron una expresión mayor en células 
beta de ratas adultas. Los genes con mayor expresión en las células beta de 20 
días se relacionan con roles críticos en la regulación del ciclo celular, entre ellos 
se incluyen: Ccna2, Ccnb1 y Ccnb2. 
58 
 
11.3. Los cambios en el transcriptoma de las células beta se correlacionan 
con la maduración de la secreción basal de insulina y la secreción 
estimulada por glucosa durante el desarrollo posnatal 
El análisis de los genes en el “extremo representativo” (leading-edge) de los 
grupos de genes enriquecidos en las células beta de ratas adultas 
(particularmente los grupos “regulación de la secreción de insulina” e “integración 
del metabolismo energético” de la base de datos Reactome) mostró que los genes 
con contribución significativa en el enriquecimiento también se relacionan con la 
identidad y el funcionamiento de las células beta (Figura 7 y Tabla 3). 
Para confirmar los cambios en el transcriptoma asociados con la maduración de la 
secreción de insulina y la integración del metabolismo energético se realizó 
ensayo hemolítico inverso en placa para analizar la secreción basal de insulina 
(5.6 mM) y la secreción estimulada por glucosa (15.6 mM) de células beta 
purificadas de ratas de todos los grupos estudiados (RN, 20, 28 días posnatales y 
adultas). 
59 
 
 
 
60 
 
 
FIGURA 7. Cambios en la expresión de genes y cambios funcionales relacionados con la 
secreción de insulina basal y estimulada por glucosa. A) Gráficas de enriquecimiento de los 
grupos de genes “secreción de insulina” y “integración del metabolismo energético” de la base de 
datos Reactome, en las que se muestran el incremento de enriquecimiento a lo largo de los genes 
expresados en las células beta (línea verde) y los genes blanco que contribuyeron a dicho 
enriquecimiento (líneas verticales negras). Mapa de calor con los niveles de expresión de los 
genes que contribuyeron al enriquecimiento de los grupos de genes; dendrograma que muestra las 
similitudes entre muestras. B) Imágenes representativas del ensayo hemolítico inverso en placa en 
condiciones basales (5.6 mM) y estimulantes de glucosa (15.6 mM) de células beta de ratas 
neonatas, lactantes, ablactadas y adultas. C) Cuantificación de las áreas de inmunoplaca 
observadas en condiciones basales (gráfica de la izquierda) y condiciones estimulantes (gráfica de 
la derecha) de glucosa. Las barras rojas representan la media + error estándar de la media. La 
barra de escala equivale a 50 µm. + p < 0.01 en comparación con el estadio de desarrollo posnatal 
previo, * p < 0.01 en comparación con la misma edad en condiciones basales de glucosa (5.6 mM) 
 
 
 
61 
 
SÍMBOLO 
DEL GEN 
NOMBRE DEL GEN POSICIÓN 
EN LA 
LISTA DE 
GENES 
(RANK AT 
GENE 
LIST) 
PUNTAJE 
SEGÚN EL 
RANGO 
(RANK 
METRIC 
SCORE) 
PUNTAJE

Otros materiales