Analisis-taxonomico-mediante-qumica-computacional-de-la-enzima-betalactamasa-y-su-importancia-en-cavidad-oral

•

Biológicas / Saúde

Estudiando Medicina

28.7.2022

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Medicina

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA

Carrera Cirujano Dentista

Título de Tesis: Análisis taxonómico mediante química computacional de
la enzima betalactamasa y su importancia en cavidad oral.
Modalidad: Experimental silico computacional.

Presenta:
Guillermo Refugio González Ochoa

Director de Tesis: Q.F.B. Tejeda Rosales Ma. Elena

Asesor: Cirujano Dentista. Miranda Llanas Iván Antonio

Revisor de Tesis: Q.F.B. María de las Mercedes Zamudio Durán

Fecha de entrega: 28 de noviembre del 2016.

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el
respectivo titular de los Derechos de Autor.

INDICE Página
I INTRODUCCIÓN
1.1 Introducción
1.2 Justificación
3
5
II OBJETIVOS
2.1 Objetivo General
2.2 Objetivos Particulares
7
8
III MATERIAL Y METODO
3.1 Tipo de Estudio
3.2 Método de Trabajo
3.3 Palabras Clave
9
9
10
IV DESARROLLO DEL TEMA
4.4 La Bioinformática
4.4.1 Cefalosporinasas
4.4.2 Enzimas de amplio espectro
4.4.3 Enzimas de espectro extendido (BLEE)
4.5 Enzimas de amplio espectro resistentes a inhibidores
4.5.1 Carbenicilinasas
4.5.2 Cloxacilinasas
4.5.3 Carbapenemasas
4.5.4 Metalo betalactamasas
4.5.5 Protein Data Bank

20
23
24
23
24
25
25
26
26
28

V BETALACTAMASAS SELECCIONADAS
5.1 La enzima 1M6K
5.2 La enzima 3LCE
5.3 La enzima 4X53
5.4 La enzima 3FV7
5.5 La enzima 1E25
5.6 La enzima 1ALQ
5.7 La enzima 1G68
5.8 La enzima 1G6A
5.9 La enzima 1SHV
5.10 La enzima 4R4R
5.11 La enzima 1LHY
5.12 La enzima 1ZG4
5.13 La enzima 1JTD
5.14 La enzima 1ZC2
5.15 La enzima 1K03
5.16 La enzima 4BP0
5.17 La enzima 1JJT
5.18 La enzima 2YNV

30
31
32
33
34
35
36
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49

VI CRUSTAL OMEGA
6.1 Crustal Omega
VII RESULTADOS
7.1 Interpretación de Matriz de identidad
7.2 Cladograma.
VIII CONCLUSIONES
50
51
53
57
58
67
5

INTRODUCCIÓN

La introducción de los antibióticos betalactámicos representa una de las
contribuciones científicas más importantes de la ciencia en la historia reciente1.
Hoy en día estos antibióticos siguen siendo los más utilizados debido a
su efectividad, bajo costo, accesibilidad y efectos secundarios mínimos1. Los
atributos que hacen especial a esta clase de antibióticos, parten de que su
objetivo de acción, inhibir la biosíntesis de la pared celular bacteriana, va dirigido
a un componente específico de las bacterias sin homólogo funcional o
estructural en el ser humano, por tanto es imperativo que se mantengan como
recurso clínico contra las enfermedades infecciosas1.
Los antibióticos betalactámicos inhiben la actividad de las transpeptidasas y
carboxipeptidasas por acilación de la serina en el sitio activo de las proteínas
enlazantes de penicilina o PBPs2.
A su vez, las betalactamasas son enzimas producidas por bacterias y son las
responsables de la resistencia que éstas exhiben ante la acción de antibióticos
betalactámicos como las penicilinas, las cefalosporinas, monobactámicos y
carbapenémicos.1,3
El Cirujano Dentista durante su práctica profesional usa los antibióticos
betalactámicos como antimicrobianos de primera elección.4,5
En la actualidad se ha reportado un alarmante aumento de la resistencia
bacteriana a éstos y a otros antibióticos, por lo que es importante hacer un
análisis filogenético, mediante el uso de las nuevas tecnologías de genética
molecular para identificar la evolución de las betalatamasas, y su posible impacto
en microorganismos de la cavidad oral.1,2,3
Con la ayuda del análisis filogenético que se realizará durante el proceso de esta
investigación de carácter documental, se analizarán las clasificaciones de las
familias y subfamilias de betalactamasas. Es importante su clasificación mediante
8

secuencias moleculares, ya que nos da una idea de su proceso evolutivo y
conocer así una perspectiva del futuro de la quimioterapia basada en antibióticos
betalactámicos.6
Los antibióticos betalactámicos son moléculas que poseen un anillo
betalactámico en el cual podemos encontrar un grupo de amino secundario.
Figura 1.1,7,8
Figura 1. Estructura General de los antibióticos betalacámicos: Penicilina y Cefalosporina

Las betalactamasas existen desde antes del descubrimiento de las penicilinas y
su presencia es el resultado de la resistencia de los microorganismos para su
supervivencia en el medio. 7,8
Las nuevas herramientas informáticas, los programas de modelado molecular,
los bancos de información y los servidores disponibles, nos permiten incorporar
nuevas tecnologías de la información a la generación de conocimiento, no sólo
en la FES Zaragoza en el área de odontología sino también en cualquier
rama.9,10,11

1.2 JUSTIFICACIÓN.
Hoy día, existe una amplia cantidad y diversidad de antibióticos para atender un
padecimiento infectocontagioso, sin embargo los antibióticos betalactámicos son los
más usados y consumidos. Su relativa inocuidad, alta eficacia y bajo costo, los hacen
el antibiótico de elección en un gran número de padecimientos. Infecciosos.
En la práctica diaria del Cirujano Dentista, los antibióticos betalactámicos siguen
siendo la antibioterapia de primera elección. Ello se debe a que la mayoría de
abscesos e infecciones bacterianas de la cavidad oral, son producidos por
microorganismos, que en general son sensibles a los antibióticos betalactámicos.
Se denominan antibióticos betalactámicos a un grupo de moléculas que poseen
como estructura química básica un anillo betalactámico que contiene un grupo amino
secundario con sustituyentes conjugados en la cadena lateral.
Las penicilinas y cefalosporinas, son las moléculas representativas de los
antibióticos betalactámicos.

Se sabe que la producción bacteriana de betalactamasas existe desde antes del uso
generalizado de la penicilina. Ello como resultado de la interacción natural de los
microorganismos, sin embargo el indiscriminado y generalizado uso de antibióticos
betalactámicos ha generalizado la diversificación y aumento de betalactamasas.

El descubrimiento de la multirresistencia bacteriana asociada a plásmidos, llamó
poderosamente la atención de la comunidad científica, evidenciando la posibilidad
de que la eficacia terapéutica de la antibioterapia pudiera ser puesta en riesgo.

Como resultado del alarmante aumento de betalactamasas, la clasificación de esta
fue ocurriendo por sus características clínicas y su semejanza estructural.
10

Posteriormente se propuso clasificarlas teniendo en cuenta distintos criterios como
las propiedades bioquímicas (peso molecular, secuenciación de nucleótidos), las
propiedades físicas (punto isoeléctrico), el espectro de hidrólisis, el espectro de
inhibición, la codificación (plasmídica o cromosómica).

Aunque útiles, estas clasificaciones no consideran la posibilidad de analizarfilogenéticamente las betalactamasas, para identificar posibles orígenes comunes o
convergencias evolutivas.
Es en este punto donde las herramientas bioinformáticas y la química computacional
se consideran fundamentales para identificar filogenéticamente la clasificación de
las betalactamasas.
Dado el aumento de betalactamasas y la multirresistencia bacteriana asociada a
plásmidos, la flora microbiana de cavidad oral no está exenta de adquirir estas
características.
Por todo lo anteriormente expuesto, se justifica realizar estudios para identificar las
diversas betalactamasas de microorganismos de importancia clínica, tanto a nivel
sistémico como a nivel de cavidad oral, para proponer una nueva forma de
clasificación filogenética basada en alineamientos globales heurísticos de la
secuencia molecular de las distintas betalactamasas.
Para realizar esta clasificación, se requerirá acceder a herramientas informáticas
como bancos de datos, programas de software informático del servidor CLUSTAL
OMEGA del Instituto Europeo de Bioinformática de la Universidad de Cambridge,
campus Hinxton, en Inglaterra, lo que permitirá incorporar las nuevas tecnologías de
la información a la generación de conocimiento el área de Odontología de la FES
Zaragoza UNAM.

II OBJETIVOS
2.1 Objetivo General.

Hacer una clasificación, mediante análisis filogenético de su secuencia
molecular, de diversas betalactamasas, poniendo énfasis en bacterias de la
cavidad oral. El análisis filogenético se hará a partir de la secuencia de
aminoácidos de su estructura primaria, usando para ello las técnicas
bioinformáticas de análisis computacional y alineamiento de secuencias, para
construir un árbol filogenético que permita identificar familias y subfamilias de
betalactamasas.9,10,11

2.2 Objetivos Particulares.

•Identificar las diversas betalactamasas de microorganismos de importancia
clínica.9
•Identificar si se han reportado secuencias moleculares de betalactamasas
producidas por microorganismos de cavidad oral.9
•Identificar y conocer la secuencia de aminoácidos que conforman la estructura
molecular de las diferentes betalactamasas.9
•Construir el formato computacional FASTA de almacenamiento, la secuencia
molecular y su descripción de caracteres de seguridad, para las diversas
betalactamasas de microorganismos de importancia clínica reportadas en los
bancos de datos de estructuras moleculares9,11.
12

•Realizar el alineamiento secuencial múltiple de los aminoácidos que conforman
la estructura molecular de las diferentes betalactamasas, mediante los
programas de software informático del servidor CLUSTAL OMEGA del Instituto
Europeo de Bioinformática de la Universidad de Cambridge, campus Hinxton, en
Inglaterra.10
•Construir el árbol filogenético, mediante alineamientos globales de forma
heurística progresiva, para identificar familias y subfamilias de betalactamasas,
usando análisis multivariado de química computacional de secuencias de los
aminoácidos que conforman la estructura molecular de las diferentes
betalactamasas.10
•Analizar el árbol filogenético resultante de las betalactamasas.

III Material y Métodos.
3.1 Tipo de Estudio.
13

Se realizará un estudio Prolectivo, comparativo, transversal, experimental in
silico.
El término in silico se usa en la terminología científica para referirse a
experimentos biológicos llevados a cabo enteramente en un computador.
3.2 Método de trabajo
1.- En los diferentes bancos de datos seleccionar las betalactamasas existentes.9
2.-Descargar el código FASTA del alineamiento de la estructura primaria de la
proteína.9
3.-Realizar en formato *.TXT una base de datos del código FASTA de todas las
betalactamasas encontradas.
4.- Identificar para cada betalactamasa el microorganismo al cual pertenece.
5.-Acceder al servidor CLUSTAL OMEGA.10
6.- Iniciar el análisis heurístico, y alineamiento secuencial.10
7.- Mediante análisis multivariado de conglomerados (análisis clúster), determinar
los dendogramas de máxima verosimilitud.10
8.- El dendograma de máxima verosimilitud, será el mejor árbol filogenético
encontrado.10
Se pueden construir uno o varios árboles filogenéticos resultantes de esta
investigación a consideración del director y asesores de tesis, así como la misma
información documental de esta investigación lo requiera.
Se clasificarán en código FASTA, la secuencia de las betalactamasas reportadas
en los bancos de información, para iniciar con la clasificación filogenética.
3.3 Palabras Clave
Las palabras clave utilizadas en esta tesis son las siguientes:
14

*Datos
*Red
*Código
*Fasta
*Crustal
*Data
*Bank
*Alfa
*Proteína
*Alineamiento
*Secuencia
*Clustal
*Cadenas
*Conglomerado
*Bacterias.

IV DESARROLLO DEL TEMA.
4.1 La Bioinformática.

La bioinformática es una ciencia de reciente creación que une las nuevas
tecnologías de la información con otras ciencias como la biología, la genética,
bioquímica y la química.12,13

La secuenciación de genomas y proteínas lleva la necesidad de obtener
información y conclusiones de la lectura de esos millones de pares de bases o
de ciento o miles de aminoácidos; la rapidez, claridad y eficacia de esa
información ha impulsado el desarrollo de la Bioinformática.12,13

La Bioinformática se apoya en el uso de técnicas computacionales, matemáticas,
estadística y químicas para el análisis, interpretación y generación de datos
biológicos.14

La bioinformática estudia ácidos nucleicos, proteínas, mutaciones, polimorfismos,
y realiza cálculos matemáticos y estadísticos para interpretar la información
resultante del análisis de las estructuras moleculares.12,13,14

Es importante mencionar que el código FASTA es un formato de fichero
informático basado en texto, utilizado para representar secuencias bien de ácidos
nucleicos, bien de péptido, y en el que los pares de bases o los aminoácidos se
representan usando códigos de una única letra.12,13,14

4.2 ESTRUCTURAS BIOLOGICAS
4.2.1Las Proteínas.

En virtud de que en este trabajo usamos la secuencia molecular de
betalactamasas, se hará un breve recuento de las proteínas.

La palabra proteína proviene del griego proto (lo primero, lo principal, lo más
importante).15,16 Las proteínas son las responsables de la formación y reparación
de los tejidos, interviniendo en el desarrollo corporal e intelectual.17 Las proteínas
son biopolímeros (macromoléculas orgánicas), de elevado peso molecular,
constituidas básicamente por unidades estructurales (monómeros) llamados
aminoácidos (aa), los cuales se consideran como los "ladrillos de los edificios
moleculares proteicos".15,16,17

Estos edificios macromoleculares se construyen y desmoronan con gran facilidad
dentro de las células, y a ello debe precisamente la materia viva su capacidad de
crecimiento, reparación y regulación.17,18

La unión de un bajo número de aminoácidos da lugar a un péptido; si el número
de aa que forma la molécula no es mayor de 10, se denomina oligopéptido; si es
superior a 10, se llama poli péptido y si el número es superior a 50 aa, se habla
ya de proteína.15,16

Aunque existen diversas clasificaciones de las proteínas, si sólo están formadas
por aminoácidos se denominan Holoproteínas y si contienen además de
aminoácidos otras moléculas o elementos adicionales no aminoacídicos serán
Heteroproteínas. 15,16

La organización de una proteína viene definida por cuatro niveles estructurales
denominados: estructura primaria, estructura secundaria, estructura terciaria y
17

estructura cuaternaria. Cada una de estas estructuras informa de la disposición
de la anterior en el espacio. 15,16

4.2.2 Estructura Primaria.

Es una cadena polipeptídica lineal de aminoácidosunidos por enlaces peptídicos.
El primer puesto de la cadena corresponde al grupo amino terminal, y la
estructura primaria es la secuencia en la que están situados todos los
constituyentes hasta llegar al carboxilo terminal.15,16,17 Figura 2.

Esta secuencia está codificada genéticamente.18
Existen cadenas polipeptídicas de cualquier número de aminoácidos, sin que
exista una solución de continuidad entre péptidos y proteínas. Por convención,
se suele considerar proteína aquellos polipéptidos con un peso molecular del
orden de 10,000 o más.15,16,17

Figura 2. Estructura primaria de una proteína

4.2.3 Estructura Secundaria

La estructura secundaria es la forma en la que la cadena polipeptídica se pliega
en el espacio.15,16 En una proteína, cada tramo de cadena polipeptídica tiene
distinta estructura secundaria. Existen varias formas definidas de estructura
secundaria, las más importantes son las llamadas hélice alfa y hoja plegada
beta.15,16,17

Las estructuras secundarias definidas están mantenidas por puentes de
hidrógeno formados exclusivamente entre los grupos amino y carboxilo que
constituyen el esqueleto de la cadena polipeptídica.15,16,19 Consecuentemente,
los parámetros estructurales, como distancias o ángulos, serán iguales
independientemente de la proteína y de los aminoácidos que formen la
estructura.19 Figura 3.

Figura 3. Estructura secundaria de una proteína
19

4.2.4 Estructura Terciaria

La estructura terciaria de la proteína es la forma en la que se organizan en el espacio
los diferentes tramos de la cadena polipeptídica. La estructura terciaria está
mantenida por diversas interacciones de las cadenas laterales de los aminoácidos
que conforman la proteína, como enlaces iónicos, puentes de hidrógeno entre las
cadenas laterales de los aminoácidos, enlaces hidrofóbicos y puentes
disulfuro.15,16,19 Figura 4.

Figura 4, Enlaces que estabilizan la estructura terciaria de una proteína

4.2.5 Estructura Cuaternaria

La estructura cuaternaria de una proteína es la forma en la que se asocian las
distintas subunidades constituyentes, si es que existen.19 Es decir, para poder
hablar de estructura cuaternaria es necesario que la proteína esté formada por
varias subunidades. Como ejemplos de proteínas con estructura cuaternaria se
puede considerar la hemoglobina, las inmunoglobulinas o la miosina.15,16,19

Figura 5. Resumen de las estructuras de una proteína.

4-3 FUNCIONES DE LAS PROTEINAS.
Las proteínas dirigen y realizan casi todos los procesos vitales, determinan la
forma y la estructura de las células.16,19 Las funciones de las proteínas son
específicas de cada una de ellas y permiten a las células mantener su integridad,
defenderse de agentes externos, reparar daños, controlar y regular funciones.
15,16,17,19

Todas las proteínas realizan su función de la misma manera: por unión selectiva
a moléculas.18,19 Las proteínas estructurales se agregan a otras moléculas de la
misma proteína para originar una estructura mayor.16,18,19 Existen , otras
proteínas se unen a moléculas distintas como los anticuerpos a los antígenos
específicos; la hemoglobina al oxígeno; las enzimas a sus sustratos; los
reguladores de la expresión genética al ADN; las hormonas a sus receptores
específicos.16,17,19

4.3.1 Tabla de aminoácidos.
Esta tabla de aminoácidos es importante puesto que el código FASTA emplea a las
abreviaturas como partes informáticas irrepetibles en su estructura.12,14,15,16

Aminoácido Código de tres letras Código de una letra
Alanina Ala A
Arginina Arg R
Asparagina Asn N
Ácido aspártico Asp D
Cisteína Cys C
Glutamina Gln Q
Ácido glutámico Glu E
Glicina Gly G
Histidina His H
Isoleucina Ile I
https://es.wikipedia.org/wiki/Alanina
https://es.wikipedia.org/wiki/Arginina
https://es.wikipedia.org/wiki/Asparagina
https://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_asp%C3%A1rtico
https://es.wikipedia.org/wiki/Ciste%C3%ADna
https://es.wikipedia.org/wiki/Glutamina
https://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_glut%C3%A1mico
https://es.wikipedia.org/wiki/Glicina
https://es.wikipedia.org/wiki/Histidina
https://es.wikipedia.org/wiki/Isoleucina
23

Aminoácido Código de tres letras Código de una letra
Leucina Leu L
Lisina Lys K
Metionina Met M
Fenilalanina Phe F
Prolina Pro P
Serina Ser S
Treonina Thr T
Triptófano Trp W
Tirosina Tyr Y
Valina Val V

https://es.wikipedia.org/wiki/Leucina
https://es.wikipedia.org/wiki/Lisina
https://es.wikipedia.org/wiki/Metionina
https://es.wikipedia.org/wiki/Fenilalanina
https://es.wikipedia.org/wiki/Prolina
https://es.wikipedia.org/wiki/Serina
https://es.wikipedia.org/wiki/Treonina
https://es.wikipedia.org/wiki/Tript%C3%B3fano
https://es.wikipedia.org/wiki/Tirosina
https://es.wikipedia.org/wiki/Valina
24

4.4 Betalactamasas.
Como se mencionó anteriormente, las betalactamasas son enzimas producidas
por la célula bacteriana, son las responsables de la resistencia que éstas exhiben
ante la acción de antibióticos betalactámicos como las penicilinas, las
cefalosporinas, monobactámicos y carbapenémicos.3,4,5
Son capaces de romper por hidrólisis el anillo betalactámico, impidiendo la acción
del antibiótico. Las betalactamasas hidrolizan el anillo betalactámico antes que el
antibiótico llegue al punto de unión con las PBP. (Proteínas enlazantes de
penicilina).20,21,22
Todas las betalatamasas catalizan la misma reacción, se han aislado y
caracterizado numerosos tipos de enzimas, que se clasifican en forma diversa,
de acuerdo con su secuencia de aminoácidos, peso molecular o especificidad del
substrato.20,21,22
La localización del gen que codifica la BETALACTAMASA es variable, pudiendo
localizarse en el cromosoma o estar codificada por plásmidos.20,21,22 Las
betalactamasas cromosómicas son universales en una bacteria específica,
mientras que la presencia de betalactamasas codificadas por plásmidos es
variable y transferible entre las diversas especies bacterianas.20,21,22
Se han realizado diversos intentos por clasificar a las betalactamasas, los
criterios usados han sido peso molecular, punto isoeléctrico y sitio activo entre
otros.2,4,5

Las sistematizaciones más difundidas de betalactamasas son la clasificación
molecular de Ambler23 y la clasificación funcional de Bush, Jacoby y Medeiros24.
Si bien Ambler en su clasificación considera la estructura molecular, su análisis
se basa en estudios cristalográficos, homología estructural, homología
secuencial y peso molecular 23 y no en alineamientos múltiples de la secuencia
molecular de la estructura primaria, para generar cladogramas ortonormales
mediante análisis multivariado, como es el objetivo de este trabajo.
Ambler divide las betalactamasas en cuatro clases (A-D). La clase A son
serinpenicilinasas, clase B metaloenzimas, clase C serin-cefalosporinasas y clase D
serin-oxacilinasas.23
La clasificación de Bush-Jacoby-Medeiros también consta de cuatro grupos y
diversos subgrupos.24 Se basa en las características funcionales, teniendo en
cuenta distintos criterios como las propiedades bioquímicas (peso molecular,
secuenciación de nucleótidos), las propiedades físicas (punto isoeléctrico), el
espectro de hidrólisis, el espectro de inhibición, la codificación (plasmídica o
cromosómica), etc. Esta clasificación es mucho más importante en el diagnóstico
microbiológico de laboratorio ya que considera los substratos y los inhibidores de las
betalactamasas clínicamente relevantes.

A continuación se presenta una tabla de una clasificación general de las
betalactamasas. Figura 6.

Figura 6. Una de las clasificaciones de las betalactamasas.27

4.4.1 Cefalosporinasas
Son serin-betalactamasas que hidrolizan las cefalosporinas de amplio espectro,
incluyenso a cefotaxima, ceftriaxona y ceftazidima, así como a monobactámicos
como el aztreonam.25,26 Están presentes de forma natural en diversas
enterobacterias y en bacilos gramnegativos no fermentadores
como Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumannii. 25,26 Estas enzimas
son capaces de resistir la inhibición por ácido clavulánico, sulbactam y
tazobactam.24,25,26

Los microorganismos que producen esta betalactamasa, tienen un gen
denominado AmpC, que favorece la expresión de la cefalosporinasa y están
asociados a elevada virulencias y mortalidad. 25,26
Penicilasas
Es una betalactamasa que hidroliza penicilinas como la penicilina V o penicilina
G, y aminopenicilinas, ampicilina y amoxicilina. Están presentes en
Staphylococcus aureus y son su principal mecanismo de resistencia.27
En la actualidad, la combinación de penicilinas o aminopenicilinas con
inhibidores de betalactamasas como ácido clavulánico o sulbactam, hacen a los
antibióticos estables a las penicilasas.27

https://es.wikipedia.org/wiki/Aztreonam
28

4.4.2 Enzimas de amplio espectro
Son betalactamasas que hidrolizan las bencilpenicilinas, las amino, carboxi y ureido-
penicilinas y cefalosporinas de espectro reducido como la cefazolina, cefalotina,
cefuroxima y cefamandol. Ninguna de estas betalactamasas hidroliza cefalosporinas
de tercera generación como la cefamicina, monobactams o carbapenems.24,28
Dentro de este grupo están incluidas betalactamasas TEM, SHV y las OXA.24,28 Las
betalactamasas TEM deben su nombre a la paciente llamada Temoniera donde se
aisló por primera vez esta enzima.24,28 La betalactamasa SHV su nombre hace
referencia a sulfhydryl variable o variante sulfhídrica; inicialmente descrita en el
género Klebsiella como betalactamasa cromosómica.24,28 y la variante OXA debe su
nombre a su capacidad de hidrolizar la oxacilina.24,27,28

4.4.3 Enzimas de espectro extendido (BLEE)
En los años 80 aparecen betalactamasas resistentes a cefalosporinas de tercera
generación, a las que se les denominaron betalactamasas de espectro extendido
(BLEE).29 Se ha propuesto que derivan de betalactamasas ya existentes que han
sufrido mutaciones aleatorias por presión selectiva al introducir las cefalosporinas
de tercera generación.30 Inicialmente estaban restringidas a Escherichia coli y
Klebsiella , organismos que contenían las tres betalactamasas progenitoras de las
BLEEs (TEM-1, TEM-2 y SHV-1).29,30
Las BLEEs se encuentran codificadas en plásmidos lo que permite su amplia y fácil
diseminación no sólo entre cepas de la misma especie sino también entre cepas de
distintas especies.29,30,31 Su aparición es especialmente importante por el amplio
patrón de resistencia que provocan y son las principales responsables de infecciones
nosocomiales graves y de infecciones de menor gravedad sumamente frecuentes
como las infecciones urinarias (ITU)29,30,31.
29

El perfil de multirresistencia asociado a otros antibióticos no betalactámicos ocasiona
un problema terapéutico de notables dimensiones.30,31

4. Enzimas de amplio espectro resistentes a inhibidores
Con el descubrimiento de los inhibidores de betalactamasas como el ácido
clavulánico sulbactam y tazobactam, se desarrollaron antibióticos estables a la
acción hidrolítica de estas enzimas. Con la sistemática introducción a la terapéutica
antimicrobiana, aparecieron cepas productoras de betalactamasa resistentes a los
inhibidores.24, 30,31

4.5.1 Carbenicilinasas
Son betalactamasas con actividad sobre las penicilinas y en especial carbenicilina,
son inhibidas por ácido clavulánico. Están codificadas generalmente por plasmídos,
ocasionalmente por vía cromosómica.32,33,34

4.5.2 Cloxacilinasas
Son enzimas con actividad sobre penicilinas y en especial oxacilina (Oxacilinasas).
Son inhibidas por el ácido clavulánico, aunque en menor grado que otras y codifican
en general por vía plasmídica.32,33,34

4.5.3 Carbapenemasas
Son betalactamasas con actividad sobre penicilinas, cefalosporinas y carbapenems.
Son débilmente inhibidas por clavulánico, y están codificadas en los cromosamas
bacterianos, su síntesis es fácilmente inducible.32,33,34

4.5.4 Metalo betalactamasas
Se trata de una familia de enzimas de gran diversidad genética que tienen iones
metálicos como cofactores enzimáticos.23,24,35,36 El mecanismo de acción de estas
enzimas difiere de todas las betalactamasas conocidas, ya que en este caso no se
producen uniones covalentes entre la enzima y el sustrato.23,24,35,36 Aquí cada átomo
del ión metálico actúa polarizando distintas estructuras del anillo betalactámico, lo
que lo hace sumamente vulnerable a la hidrólisis posterior por el sitio activo de la
betalactamasa.23,24,35,36 Estas betalactamasas no se ven afectadas por el ácido
clavulánico. Su espectro que abarca la mayor parte de betalactámicos, incluyendo
carbapenemes, pero no aztreonam.23,24,35,36

Penicilinasas
Son betalactamasas que actúan sobre penicilinas, no son inhibidas por el ácido
clavulánico; no se ha determinado con precisión se clase molecular y están poco
estudiadas y clasificadas.24,25,37

Existen otros tipos de resistencia a los antibióticos betalactámicos que involucran la
resistencia natural, especie o grupo bacteriano; y que de manera general pueden
clasificarse en4,5 :

 Inactivación enzimática: el principal mecanismo de inactivación es la hidrólisis,
como sucede con las betalactamasas y los betalactámicos,
 Modificaciones en el sitio blanco: modificaciones en el gen que codifica el propio
blanco del antibiótico,
 Alteraciones de la permeabilidad de la pared o de la membrana celular.
Un análisis completo y profundo de las diversas distintas formas de resistencia, sale
de las metas, objetivos y alcances de este trabajo, por lo que no será revisada.

4.5.5 Protein Data Bank

El Protein Data Bank (banco de datos de proteínas) es un repositorio de
descripciones experimentales de las estructuras moleculares de proteínas y ácidos
nucleicos resueltos hasta el momento.9,12,13,14 Cada descripción es un archivo de
texto que contiene las coordenadas atómicas de la molécula en cuestión en un
formato que se llama PDB.9,12,13,14

Cuando se fundó el PDB contenía sólo 7 estructuras de proteínas. Desde entonces
ha experimentado un crecimiento exponencial en el número de estructuras y nada
parece indicar que el ritmo vaya a decaer.9,12,13,14
La búsqueda de las estructuras en código FASTA de las betalactamasas se realizó
en la pantalla de trabajo al inicio de sesión del PDB mediante la solicitud de
betalactamasas Figura 7.

Figura 7. Pantalla de captura del PDB

A continuación se buscaron las betalactamasas reportadas en el PDB. Descargando
el código FASTA para cada una de ellas de la pantalla Sequence del PDB. Figura 8.

Figura 8. Descarga del código FASTA

4.5.6 BETALACTAMASAS SELECCIONADAS.

Para cada betalactamasa reportada en el PDB, se descargó el código FASTA y se
realizó un archivo en extensión TXT.
Es importante mencionar que durante la revisión NO se encontró reportada en los
bancos de datos alguna betalactamasa de microorganismos de cavidad oral.

Las betalactamasas encontradas en el PDB fueron:

Figura10. Cuadro betalactamasas seleccionadas.

Penicilasas. 1ALQ, 1ZG4, 1JTD, 1SHV, 1LHY,
Carbenicilinasas 1G6A, 1G68,
Cefalosporinasas 1ZC2, 4R4R, 1E25,
Cloxacilinasas 1M6K, 3LCE, 4X53, 3FV7.

5.1 La enzima 1M6Kes una betalactamasa monomérica aislada de Escherichia
coli, es una hidrolasa serina activa ante oxilinasa y cloxacilina. Figura 11
Código FASTA:
>1ALQ:A|PDBID|CHAIN|SEQUENCE
MGQSEPIVLVIFTNKDNKSDKPNDKLISETAKSVMKEFAAGSKNAAKELNDLEK
KYNAHIGVYALDTKSGKEVKFNSDKRFAYASTSKAINSAILLEQVPYNKLNKKV
HINKDDIVAYSPILEKYVGKDITLKALIEASMTYSDNTANNKIIKEIGGIKK
VKQRLKELGDKVTNPVRYEIELNYYSPKSKKDTSTPAAFGKTLNKLIANGKLSK
ENKKFLLDLMLNNKSGDTLIKDGVPKDYKVADKSGQAITYASRNDVAFVYPK

Estructura tridimensional:

Figura11. Pantalla Betalactamasas seleccionadas.
36

5.2 La betalactamasa 3LCE es una enzima monomérica, pertenece a las
hidrolasas serin activas. Fue aislada de Escherichia coli. Figura 12.
Código FASTA:
>3LCE:A|PDBID|CHAIN|SEQUENCE
SITENTSWNKEFSAEAVNGVFVLCKSSSKSCATNDLARASKEYLPASTFKIPNA
IIGLETGVIKNEHQVFKWDGKPRAMKQWERDLTLRGAIQVSAVPVFQQIAREV
GEVRMQKYLKKFSYGNQNISGGIDKFWLEGQLRISAVNQVEFLESLYLNKLSA
SKENQLIVKEALVTEAAPEYLVHSKTGFSGVGTESNPGVAWWVGWVEKETEV
YFFAFNMDIDNESKLPLRKSIPTKIMES

Estructura tridimensional

Figura12. Pantalla Betalactamasas seleccionadas.

5.3 La betalactamasa 4X53 es una hidrolasa actúa contra las cefalosporinas, se
aisló de Acinetobacter baumannii. Figura 13.
El código FASTA es:
>4X53:A|PDBID|CHAIN|SEQUENCE
MHISSQQHEKAIKSYFDEAQTQGVIIIKEGKNLSTYGNALARANKEYVPASTFK
MLNALIGLENHKATTNEIFKWDGKKRTYPMWEKDMTLGEAMALSADPVYQEL
ARRTGLELMQKEVKRVNFGNTNIGTQVDNFWLVGPLKITPVQEVNFADDLAHN
LPFKLETQEEVKKMLLIKEVNGSKIYAKSGWGMGVTSQVGWLTGWVEQANGK
KIPFSLNLEMKEGMSGSIRNEITYKSLENLGII

La estructura tridimensional es:

Figura13. Pantalla Betalactamasas seleccionadas.
38

5.4 La enzima 3FV7, es una hidrolasa aislada de Staphuylococcus aureus. Figura
14 Su código FASTA:
>3FV7:A|PDBID|CHAIN|SEQUENCE
HISSQQHEKAIKSYFDEAQTQGVIIIKEGKNLSTYGNALARANKEYVPASTFKML
NALIGLENHKATTNEIFKWDGKKRTYPMWEKDMTLGEAMALSAVPVYQELAR
RTGLELMQKEVKRVNFGNTNIGTQVDNFWLVGPLKITPVQEVNFADDLAHNRL
PFKLETQEEVKKMLLIKEVNGSKIYAKSGWGMGVTPQVGWLTGWVEQANGKK
IPFSLNLEMKEGMSGSIRNEITYKSLENLGII

La estructura tridimensional es:

Figura14. Pantalla Betalactamasas seleccionadas.
39

5.5 La cefalosporinasa 1E25, aislada de Pseudomona aeuroginosa, pertenece a
las hidrolasas serín activas.Figura 15. El código FASTA es:
>1E25:A|PDBID|CHAIN|SEQUENCE
QSPLLKEQIESIVIGKKATVGVAVWGPDDLEPLLINPFEKFPMQSVFKLHLAMLV
LHQVDQGKLDLNQTVIVNRAKVLQNTWAPIMKAYQGDEFSVPVQQLLQYSVS
HSDNVACDLLFELVGGPAALHDYIQSMGIKETAVVANEAQMHADDQVQYQNW
T
SMKGAAEILKKFEQKTQLSETSQALLWKWMVETTTGPERLKGLLPAGTVVAHK
TGTSQIKAGKTAATNDLGIILLPDGRPLLVAVFVKDSAESSRTNEAIIAQVAQTAY
QFELKKLSALSPN

La estructura tridimensional es:

Figura15. Pantalla Betalactamasas seleccionadas.
40

5.6 La enzima 1ALQ es una hidrolasa, aislada de Staphilococcus aureus;
hidroliza la cefalosporina y cefalexina. Figura 16. Código FASTA:
>1AQL:A|PDBID|CHAIN|SEQUENCE
AKLGSVYTEGGFVEGVNKKLSLFGDSIDIFKGIPFAAAPKALEKPERHPGWQGT
LKAKSFKKRCLQATLTQDSTYGNEDCLYLNIWVPQGRKEVSHDLPVMIWIYGG
AFLMGASQGANFLSNYLYDGEEIATRGNVIVVTFNYRVGPLGFLSTGDSNLPG
NYGLWDQHMAIAWVKRNIEAFGGDPDNITLFGESAGGASVSLQTLSPYNKGLI
KRAISQSGVGLCPWAIQQDPLFWAKRIAEKVGCPVDDTSKMAGCLKITDPRAL
TLAYKLPLGSTEYPKLHYLSFVPVIDGDFIPDDPVNLYANAADVDYIAGTNDMD
GHLFVGMDVPAINSNKQDVTEEDFYKLVSGLTVTKGLRGANATYEVYTEPWA
QDSSQETRKKTMVDLETDILFLIPTKIAVAQHKSHAKSANTYTYLFSQPSRMPIY
PKWMGADHADDLQYVFGKPFATPLGYRAQDRTVSKAMIAYWTNFARTGDPN
TG
HSTVPANWDPYTLEDDNYLEINKQMDSNSMKLHLRTNYLQFWTQTYQALPTV

La estructura tridimensional es:

Figura16. Pantalla Betalactamasas seleccionadas.

5.7 La proteína 1G68, obtenida de Escherichia coli es activa frente a carbenicilina
se expresa como una carbenicilinasa. Figura 17 Código FASTA:
>1G68:A|PDBID|CHAIN|SEQUENCE
SSSKFQQVEQDVKAIEVSLSARIGVSVLDTQNGEYWDYNGNQRFPLTSTFKTI
ACAKLLYDAEQGKVNPNSTVEIKKADLVTYSPVIEKQVGQAITLDDACFATMTT
SDNTAANIILSAVGGPKGVTDFLRQIGDKETRLDRIEPDLNEGKLGDLRDTTT
PKAIASTLNKFLFGSALSEMNQKKLESWMVNNQVTGNLLRSVLPAGWNIADRS
GAGGFGARSITAVVWSEHQAPIIVSIYLAQTQASMEERNDAIVKIGHSIFDVYTS
QSR
La estructura tridimensional es:

Figura17. Pantalla Betalactamasas seleccionadas.

5.8 La Enzima 1G6A es una betalactamasa aislada de Pseudomona aeruginosa.
Es una hidrolasa de carbenicilina. Figura 18. El código FASTA es:
>1G6A:A|PDBID|CHAIN|SEQUENCE
SSSKFQQVEQDVKAIEVSLSARIGVSVLDTQNGEYWDYNGNQRFPLTSTFKTI
ACAKLLYDAEQGKVNPNSTVEIKKADLVTYSPVIEKQVGQAITLDDACFATMTT
SDNTAANIILSAVGGPKGVTDFLRQIGDKETRLDRIEPDLNEGKLGDLRDTTT
PKAIASTLNKFLFGSALSEMNQKKLESWMVNNQVTGNLLRSVLPAGWNIADKS
GAGGFGARSITAVVWSEHQAPIIVSIYLAQTQASMEERNDAIVKIGHSIFDVYTS
QSR
La estructura tridimensional es:

Figura18. Pantalla Betalactamasas seleccionadas.

5.9 La enzima 1SHV, pertenece a las hidrolasas y se encuentra en Escherichia
coli y Klebsiella pneumoniae. Figura 19 Su código FASTA es:
>1SHV:A|PDBID|CHAIN|SEQUENCE
SPQPLEQIKLSESQLSGRVGMIEMDLASGRTLTAWRADERFPMMSTFKVVLC
GAVLARVDAGDEQLERKIHYRQQDLVDYSPVSEKHLADGMTVGELCAAAITMS
DNSAANLLLATVGGPAGLTAFLRQIGDNVTRLDRWETELNEALPGDARDTTTP
AS
MAATLRKLLTSQRLSARSQRQLLQWMVDDRVAGPLIRSVLPAGWFIADKTGA
GERGARGIVALLGPNNKAERIVVIYLRDTPASMAERNQQIAGIGAALIEHWQR

La estructura tridimensional es:

Figura 20. Pantalla Betalactamasas seleccionadas.
44

5.10La enzima 4R4R es una betalactamasa aislada de Pseudomona aureginosa.
Figura 21. El código FASTA es:
>4R4R:A|PDBID|CHAIN|SEQUENCE
HPETLVKVKDAEDQLGARVGYIELDLNSGKILESFRPEERFPLTSTFKVLLCGA
VLSRVDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYSPVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDN
TAANLLLTTIGGPKELTDFLRQIGDKETRLDRIEPDLNEGKLGDLRDTTTPKA
IASTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSALPAGWFIADKSGAGE
RGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGASLIKHW

La estructura tridimensional es:

Figura 21. Pantalla Betalactamasas seleccionadas.

5.11 La enzima 1LHY, hidrolasa de Escherichia coli. Resistente a inhibidores
como el ácido clavulanico. Figura 22 Código FASTA:
>1LHY:A|PDBID|CHAIN|SEQUENCE
HPETLVKVKDAEDQLGARVGYIELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGA
VLSRVDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYSPVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDN
TAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRWEPELNEAIPNDERDTTMPAA
MATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSALPAGWFIADKSGAG
ERGSSGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGASLIKHW

La estructura tridimensional es:

Figura 22. Pantalla Betalactamasas seleccionadas.

5.12 La betalactamasa1ZG4, es una hidrolasa de Escherichia coli. Figura 23. El
código FASTA:
>1ZG4:A|PDBID|CHAIN|SEQUENCE
MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKDAEDQLGARVGYIELDLNSGKIL
ESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRIDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYSPVTE
KHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRL
DRWEPELNEAIPNDERDTTMPVAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADK
VAGPLLRSALPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQAT
MDERNRQIAEIGASLIKHW

La estructura tridimensional es:

Figura 23. Pantalla Betalactamasas seleccionadas.
47

5.13 La enzima 1JTD es una hidrolasa de Escherichia coli. Figura 24. Código Fasta:
>1JTD:A|PDBID|CHAIN|SEQUENCE
HPETLVKVKDAEDQLGARVGYIELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGA
VLSRVDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYSPVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDN
TAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRWEPELNEAIPNDERDTTMPVA
MATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSALPAGWFIADKSGAG
ERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGASLIKHW

La estructura tridimensional es:

Figura24. Pantalla Betalactamasas seleccionadas.

5.14 La enzima 1ZC2 es una hidrolasa codificada por plásmidos obtenida de
Klebsiella pneumonie. Figura 25 El Código FASTA:
>1ZC2:A|PDBID|CHAIN|SEQUENCE
AAKTEQQIADIVNRTITPLMQEQAIPGMAVAVIYQGKPYYFTWGKADIANNHPV
TQQTLFELGSVSKTFNGVLGGDAIARGEIKLSDPVTKYWPELTGKQWQGIRLL
HLATYTAGGLPLQIPDDVRDKAALLHFYQNWQPQWTPGAKRLYANSSIGLFGA
LAVKPSGMSYEEAMTRRVLQPLKLAHTWITVPQNEQKDYAWGYREGKPVHVS
PGQLDAEAYGVKSSVIDMARWVQANMDASHVQEKTLQQGIALAQSRYWRIGD
MYQGLGWEMLNWPLKADSIINGSDSKVALAALPAVEVNPPAPAVKASWVHKT
GSTG
GFGSYVAFVPEKNLGIVMLANKSYPNPVRVEAAWRILEKLQ

La estructura tridimensional es:

Figura25. Pantalla Betalactamasas seleccionadas.

5.15 La enzima 1K03, es una betalactamasa de Pseudomona aeuroginosa,
pertenece a las hidrolasas, actúa sobre cefepimeceftizidima, imipenem,
meropenem. Figura26 Su código FASTA es:
>1KO3:A|PDBID|CHAIN|SEQUENCE
EYPTVSEIPVGEVRLYQIADGVWSHIATQSFDGAVYPSNGLIVRDGDELLLIDTA
WGAKNTAALLAEIEKQIGLPVTRAVSTHFHDDRVGGVDVLRAAGVATYASPST
RRLAEVEGNEIPTHSLEGLSSSGDAVRFGPVELFYPGAAHSTDNLVVYVPSA
SVLYGGCAIYELSRTSAGNVADADLAEWPTSIERIQQHYPEAQFVIPGHGLPG
GLDLLKHTTNVVKAHTN
La estructura tridimensional es:

Figura 26. Pantalla Betalactamasas seleccionadas.
50

5.16 La betalactamasa 4BP0 obtenida de Pseudomona aureoguinosa, es una
metaloenzima o metalo-beta-lactamasa. Figura 27 El código FASTA es:
>4BP0:A|PDBID|CHAIN|SEQUENCE
GPKSSDHVDLPYNLTATKIDSDVFVVTDRDFYSSNVLVAKMLDGTVVIVSSPFE
NLGTQTLMDWVAKTMKPKKVVAINTHFHLDGTGGNEIYKKMGAETWSSDLTK
QLRLEENKKDRIKAAEFYKNEDLKRRILSSHPVPADNVFDLKQGKVFSFSNELV
EVSFPGPAHSPDNVVVYFPKKKLLFGGCMIKPKELGYLGDANVKAWPDSARR
LKKFDAKIVIPGHGEWGGPEMVNKTIKVAEKAVGEMRL

La estructura tridimensional es:

Figura 27. Pantalla Betalactamasas seleccionada
51

5.17 La enzima 1JJT obtenida de Pseudomona aureoguinosa es una
metaloenzima que hidroliza de manera eficiente los antibióticos betalactámicos
Figura 28 El código FASTA es:
>1JJT:A|PDBID|CHAIN|SEQUENCE
AESLPDLKIEKLDEGVYVHTSFEEVNGWGVVPKHGLVVLVNAEAYLIDTPFTAK
DTEKLVTWFVERGYKIKGSISSHFHSDSTGGIEWLNSRSIPTYASELTNELLKK
DGKVQATNSFSGVNYWLVKNKIEVFYPGPGHTPDNVVVWLPERKILFGGCFI
KPYGLGNLGDANIEAWPKSAKLLKSKYGKAKLVVPSHSEVGDASLLKLTLEQA
VKGLNESKKPSKPSN

La estructura tridimensional es:

Figura 28. Pantalla Betalactamasas seleccionadas.
52

5.18 La betalactamasa 2YNV es una hidrolasa aislada de pseudomona
auruginiosa. Figura 29 El código FASTA es:
>2YNV:A|PDBID|CHAIN|SEQUENCE
SQGHKPLEVIKIEDGVYLHTSFKNIEGYGLVDSNGLVVLDNNQAYIIDTPWSEE
DTKLLLSWATDRGYQVMASISTHSHEDRTAGIKLLNSKSIPTYTSELTKKLLARE
GKPVPTHYFKDDEFTLGNGLIELYYPGAGHTEDNIVAWLPKSKILFGGCLV
RSHEWEGLGYVGDASISSWADSIKNIVSKKYPIQMVVPGHGKVGSSDILDHTID
LAESASNKLMQPTAEASAD

La estructura tridimensional es:

Figura 29. Pantalla Betalactamasas seleccionadas.
53

1M6K es una oxacillinasa serin-activa obtenida de Escherichia coli. Figura 30
Su Código FASTA es:

>1M6K:A|PDBID|CHAIN|SEQUENCE
STDISTVASPLFEGTEGCFLLYDASTNAEIAQFNKAKCATQMAPDSTFKIALSLM
AFDAEIIDQKTIFKWDKTPKGMEIWNSNHTPKTWMQFSVVWVSQEITQKIGLNK
IKNYLKDFDYGNQDFSGDKERNNGLTEAWLESSLKISPEEQIQFLRKIINH
NLPVKNSAIENTIENMYLQDLDNSTKLYGKTGAGFTANRTLQNGWFEGFIISKS
GHKYVFVSALTGNLGSNLTSSIKAKKNAITILNTLNL

La estructura tridimensional es:

Figura 30. Pantalla Betalactamasas seleccionadas.
54

VI CRUSTAL OMEGA.
6.1 Crustal Omega.
Con estos códigos FASTA almacenados en una base de datos con extensión TXT,
se realizó el análisis multivariado de secuencias moleculares en el servidor
CLUSTAL OMEGA. Figura 30. Del Instituto Europeo de Bioinformática del Campus
Hixton de la Universidad de Cambridge.10

Figura 30. Pantalla Betalactamasas seleccionadas.

A continuación se le da enviar (submit).

Clustal Omega envía los resultados por correo electrónico.

VII RESULTADOS

A continuación se presentan las alineaciones de secuenciación múltiple de las
betalactamasas:

CLUSTAL O(1.2.2) multiple sequence alignment

El alineamiento de estructuras múltiples anterior nos muestra básicamente una
comparación de los aminoácidos, donde se ubican las identidades entre
aminoácidos. El porcentaje de identidad se define como los aminoácidos idénticos
que poseen entre proteínas entre el número total de aminoácidos de la proteína a
comparar.

Los resultados de secuenciación anterior, son relativamente difíciles de leer, toda
vez que se superponen las cadenas de las 20 betalactamasas, pero nos verifica que
se realizó de manera correcta y sin errores el alineamiento estructural múltiple.

Una mejor forma de identificar el porcentaje de identidad se realiza en la matriz de
identidad. Figura 31 Que imprime CLUSTAL OMEGA y que se presenta a
continuación:
Figura 31. Pantalla Matriz de Identidad.

7.1 Interpretación de Matriz de identidad.

La forma de interpretar la matriz anterior es la siguiente:
La tabla representa una matriz comparativa de forma simétrica. Para encontrar el
porcentaje de identidad entre dos betalactamasas, se ubica la primera en la parte
izquierda y la otra en la parte superior, el cruce de ambas refiere el porcentaje de
identidad. Por ejemplo la betalactamasa 1ZG4 tiene un porcentaje de identidad
del 99.62 % con respecto a la 1JTD.
Estas dos betalactamasas tienen el porcentaje de identidad más alto encontrado
en el estudio. La betalactamasa 1ZG4, es una BLEE tipo TEM-1 de Escherichia
coli obtenida en 2005 por Stec y colaboradores. La enzima 1JTD obtenida en
2001, también es una BLEE tipo TEM-1 mutante obtenida de una cepa silvestre
de Escherichia coli.
La menor identidad ocurrió entre la 1M6K y la 2YNV con un 10.87%. La 1M6K es
una hidrolasa serina monomérica activa ante oxilinasa y cloxacilina aislada de
Escherichia coli, mientras que la 2YNV es una metalobetalactamasa aislada de
pseudomona auruginiosa.

A continuación se muestra el cladograma ortonormal. Figura 32 obtenido
mediante análisis multivariado de componentes principales generado por el
servidor CLUTAL OMEGA:
62

Figura 32. Pantalla Cladograma orto-normal Betalactamasas seleccionadas.
B~n(~ l en~: @ daoo~ram Real
lM6K.AI'DBIDICHAIN ISEQUENCE Ol 78J l
JlCE_ AI'D81DICHAlNISEQUENCE Ol0077
4XI3 J IPDBIDICHAJNISEQUENCE 0,OO4J4
JM J I'OBIOICHAINISEQUENCE 0,ooJ86
lE1IJ I'OBIOICHAIN ISEQUENCE 0.18671
lAlQJI'OBIOICHAINISEQUENCE Ol15J9
lG68JI'OBIDIC AIN ISEQUENCE O,OOJJ
lG6AJI'OBIOICHAINISEQUENCE 0,OO)J9
ISHV J i'OBIOICHAIN ISEQUENCE 0.1653
4R4RJI'DBIDICHAIN ISEQUENCE 0,OJ116
IlHU I'OBIDICHAlNISEQUENCE 0,00479
lZG4JIPOBIOICHAINISEQUENCE 0,00211
lJTD Ji'OBIO IC~AIN ISEQUENCE 0,00119
lZCt AI'OBIOICHAIN ISEQUENCE 0,40761
lKOt AI'D810ICHAlNISEQUENCE 0,l491J
4BPOJIPOBIDIC AIN ISEQUENCE 0,lJ161
lJJ1JI'OBIOICHAINISEQUENCE 0,26847
1YNUI'OBIOICHAIN ISEQUENCE 0,17978
63

7.2 Cladograma.
El análisis del cladograma Figura 33. Muestra la existencia de tres grandes
familias de betalactamasas, a las que denominaremos 1, 2 y 3.
Las secuencias moleculares de las betalactamasas, generaron la presencia de
varias subfamilias.
El primer clado o familia 1, tiene a su vez 2 subfamilias:

Figura 33.Cladograma Clado o Familia 1 Betalactamasas seleccionadas.

La primera subfamilia está conformada por las betalactamasas 1M6K, 3LCE,
4X53 y 3FV7. Todas ellas son hidrolasas serina activas, es decir tienen serina en
el sitio activo. La segunda subfamilia contiene las betalactamasas 1E25, 1ALQ,
1G68, 1G6A, 1SHV, 4R4R, 1LHY, 1ZG4 y 1JTD. Estas enzimas son hidrolasas
activas, sumamente resistentes a los inhibidores como el clavulanato, y en todas
ellas han ocurrido mutaciones puntuales y aparecen arginina y serina en sus
sitios activos.
La segunda familia está conformada por betalactamasas codificadas por
plásmidos. Figura 34

Figura. 34 Cladograma 2 familia codificada por plasmidos Betalactamasas seleccionadas.

El tercer grupo o familia la componen metaloenzimas hidrolíticas, es decir
betalactamasas que tienen cofactores metálicos en su sitio activo. Figura 35.

Figura 35 Familia 3 o metaloenzimas hidroliticas. Betalactamasas seleccionadas.

Los resultados obtenidos en este trabajo pueden resumirse en el siguiente
esquema: Figura 36.

Figuras 36 Esquema resultante de betalactamasas seleccionadas.

Por otro lado, la clasificación molecular de Ambler refiere 4 familias o clases.
Figura 37. La clase A que agrupa las serinpenicilinasas, clase B las
metaloenzimas, clase C a serin-cefalosporinasas y clase D las serin-
oxacilinasas.23
BETALACTAMASAS
Familia 1
Serina en el sitio
activo
Resistentes a
clavulonato,
arginina y serina en
el sitio activo
Familia 2
Codificadas por
plásmidos
Familia 3
Metaloproteínas
67

Figuras 37 Esquema la clasificación molecular de Amber.

En su clasificación, no hay diferencia molecular entre las betalactamasas de
origen cromosómico o plasmídico,23 situación que sí ocurrió en nuestro estudio.
Con respecto a las metaloenzimas o clase B, Ambler considera 3 subfamilias: B1,
B2 y B3. Las subfamilias B1 y B3 engloban enzimas con amplio espectro de
acción que actuan frente a la mayoría de los betalactámicos excepto
monobactámicos, mientras que B2 son Carbapenemasas las cuales presentan
poca acción frente a penicilinas y cefalosporinas.23

En nuestro caso encontramos 4 subfamilias de metaloenzimas: Figura 38

Figuras 38 Subfamilias de metaloenzimas.

7.3 Subfamilia 1. Metaloenzimas con zinc que hidrolizan carbapenems.
7.4 Subfamilia 2. Metalo-betalactamasas, que catalizan la hidrólisis de casi todos
los antibióticos etalactámicos, al igual que todas las metalobetalactamas usa Zn++
como cofactor enzimático; tiene características estructurales que confieren
resistencia a inhibidores como clavulanato.
7.5 Subfamilia 3. Metaloenzimas de zinc codificadas por plásmidos que hidrolizan
de manera eficiente los antibióticos betalactámicos, incluyendo los carbapenems.
Subfamilia 4. Metalobetalactamasas codificadas por el gen bla(GIM-1), que
regula la expresión de tales enzimas, descubiertas en Pseudomonas aeruginosa,
más recientemente se ha informado su presencia en la familia
Enterobacteriaceae.

VIII CONCLUSIONES
Del Protein Data Bank se obtuvo el código FASTA para 20 betalactamasas de
importanciaclínica. NO se encuentra reportada en los bancos de datos revisados
alguna betalactamasa de microorganismos de cavidad oral.9
Se realizó el alineamiento secuencial múltiple de las betalactamasas estudiadas
mediante el servidor CLUSTAL OMEGA del Instituto Europeo de Bioinformática
de la Universidad de Cambridge, campus Hinxton, en Inglaterra.10
El alineamiento de estructuras múltiples nos muestra la ubicación de identidades
entre aminoácidos.

Se generó la matriz de identidad mediante el servidor CLUSTAL OMEGA, la cual
es una matriz comparativa de forma simétrica donde se presentan los porcentajes
de identidad entre dos betalactamasas.

La mayor identidad se encontró entre la betalactamasa 1ZG4 y 1JTD, con un
porcentaje del 99.62 %. La betalactamasa 1ZG4, es una BLEE tipo TEM-1 de
Escherichia coli obtenida en 2005 por Stec y colaboradores. La enzima 1JTD
obtenida en 2001, también es una BLEE tipo TEM-1 mutante obtenida de una
cepa silvestre de Escherichia coli.

La menor identidad ocurrió entre la 1M6K y la 2YNV con un 10.87%. La 1M6K es
una hidrolasa serina monomérica activa ante oxilinasa y cloxacilina aislada de
Escherichia coli, mientras que la 2YNV es una metalobetalactamasa aislada de
pseudomona auruginiosa.

Se construyó un árbol filogenético o dendograma de máxima verosimilitud donde
se ubica la clasificación de las betalactamasas estudiadas.

Los resultados muestran la existencia de tres grandes familias diferentes de
betalactamasas las cuales a su vez presentan diferentes subfamilias

A continuación se presenta el Cladograma: Figura 40.

Figuras 40 Cladograma y la representación de este en sus tres Familias obtenidas.

B~lKh lell9lh: @ Cla~ogram Real
IM6K J IPDBIDICHAINISEQUENCE 0.l7831
3LCUIPDBIDICHAINISEQUENCE 030077
4X5tAIPDBIDICHAINISEQ UENCE 0,00434
¡Pl7 J IPDBIDICHAlNISEQUENCE 0,00386
IE25 J IPDBIDICHAINISEQUENCE 0.38671
IALQJIPDBIDICHAINISEQUENCE 032539
IG68J IPDBIDICHAINISEQUENCE 0,0033
IG6UIPDBIDICHAlNISEQ UENCE 0,00039
ISHUIPDBIDICHAlNISEQUENCE 0.1653
4R4R J IPDBIDICHAINISEQUENCE 0,03226
IlJIUIPDBIDICHAINISEQUENCE 0,00479
IZGUIPDBIDICHAINISEQUENCE 0,00251
lITO J IPDBIDICHAlNISEQUENCE 0,00129
IZCtAIPDBIDICHAlNlSEQUENCE 0,40761
IKOlJlPDBIDICHAINISEQUENCE 0.l4923
4BPOJIPDBIDICHAINISEQUENCE 0.33161
UJT J IPD BIDICHllNISEQUENCE 0,26847
2YNUIPDBIDICHAlNISEQUENCE 0,27978
71

El análisis del cladográfico muestra la existencia de tres grandes familias de
betalactamasas, a las que denominamos familias 1, 2 y 3.
Las secuencias moleculares de las betalactamasas, generaron varias
subfamilias.
El primer clado o familia 1, tiene a su vez 2 subfamilias. La primera subfamilia
está conformada por las betalactamasas 1M6K, 3LCE, 4X53 y 3FV7. Todas ellas
son hidrolasas serina activas. La segunda subfamilia contiene las
betalactamasas 1E25, 1ALQ, 1G68, 1G6A, 1SHV, 4R4R, 1LHY, 1ZG4 y 1JTD.
Estas enzimas son hidrolasas activas, sumamente resistentes a los inhibidores
como el clavulanato, y en todas ellas han ocurrido mutaciones puntuales y
aparecen arginina y serina en sus sitios activos.
La segunda familia está conformada por betalactamasas codificadas por
plásmidos.
El tercer grupo o familia la componen metaloenzimas hidrolíticas, es decir
betalactamasas que tienen cofactores metálicos en su sitio activo, las 4
subfamilias de las metalobetalactamasas son:
Subfamilia 1. Metaloenzimas con zinc que hidrolizan carbapenems.
Subfamilia 2. Metalo-betalactamasas, que catalizan la hidrólisis de casi todos los
antibióticos etalactámicos, al igual que todas las metalobetalactamas usa Zn
como cofactor enzimático; tiene características estructurales que confieren
resistencia a inhibidores como clavulanato.
Subfamilia 3. Metaloenzimas de zinc codificadas por plásmidos que hidrolizan de
manera eficiente los antibióticos betalactámicos, incluyendo los carbapenems.
Subfamilia 4. Metalobetalactamasas codificadas por el gen bla(GIM-1), que
regula la expresión de tales enzimas, descubiertas en Pseudomonas aeruginosa,
más recientemente se ha informado su presencia en la familia
Enterobacteriaceae
72

Los resultados obtenidos en este trabajo pueden resumirse en el siguiente
esquema:

Figuras 41 Esquema resultante de esta investigación.
Existen algunas diferencias entre la clasificación molecular de Ambler y la
encontrada en este trabajo. Amber no realizó cladogramas ortonomales mediante
análisis multivariado, su clasificación obedece a estudios cristalográficos,
homología estructural, homología secuencial y peso molecular. 23
No se encontraron reportado betalactamasas producidas por microorganismos
de cavidad oral.
Se recomienda proseguir este estudio con más betalactamasas y verificar la
posible semejanza de cladogramas ortonomales mediante análisis multivariado
con la clasificación de Amber.

BETALACTAMASAS
Familia 1
Serina en el sitio
activo
Resistentes a
clavulonato,
arginina y serina en
el sitio activo
Familia 2
Codificadas por
plásmidos
Familia 3
Metaloproteínas
73

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Portada
Índice
I. Introducción
II. Objetivos
III. Material y Método
IV. Desarrollo del Tema
V. Betalactamasas Seleccionadas
VI. Crustal Omega
VII. Resultados
VIII. Conclusiones
Bibliografía