Estudio-qumico-y-biologico-de-propoleos-recolectados-en-la-zona-melfera-del-altiplano

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE 
MÉXICO 
 
 
PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS 
QUÍMICAS 
 
 
 
 
 
 
“ESTUDIO QUÍMICO Y BIOLÓGICO DE PROPÓLEOS 
RECOLECTADOS EN LA ZONA MELÍFERA DEL ALTIPLANO” 
 
 
 
 
TESIS 
PARA OPTAR POR EL GRADO DE 
 
MAESTRA EN CIENCIAS 
 
 
PRESENTA 
 
Q.F.B. GABRIELA LIZETH ZARCO ESPINOSA 
 
 
 
 
 
TUTOR: DR. JOSÉ FAUSTO RIVERO CRUZ AÑO: 2012 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
JURADO ASIGNADO 
 
Presidente Dr. Carlos Martín Cerda García Rojas 
Vocal Dr. Rogelio Gregorio Pereda Miranda 
Vocal Dr. Ricardo Reyes Chilpa 
Vocal Dr. Francisco Hernández Luis 
Secretario Dra. Martha Lydia Macías Rubalcaba 
 
 
 
Lugar donde se realizó la tesis: 
 
Laboratorio 111, Departamento de Farmacia, Facultad de Química, UNAM. 
 
 
 
Q.F.B. Gabriela Lizeth Zarco Espinosa 
Sustentante 
 
 
Dr. José Fausto Rivero Cruz 
Tutor 
 
El presente trabajo fue presentado en la 8va Reunión Internacional de 
Investigación en Productos Naturales que se llevó a cabo del 23 al 25 de 
mayo de 2012, en la UMAR-Huatulco, Oaxaca, México, en modalidad 
cartel. 
 
 
 
Agradecimientos 
 
A la Universidad Nacional Autónoma de México por darme la 
oportunidad de permanecer a ella y brindarme una mejor educación para 
forjarme como profesionista y que mediante el Posgrado en Ciencias 
Químicas me ha permitido continuar creciendo académica y 
profesionalmente. 
 
A CONACyT por la beca otorgada (245525) para realizar mis estudios 
en el Posgrado de Maestría y Doctorado en Ciencias Químicas. 
 
Al Dr. José Fausto Rivero Cruz por brindarme su apoyo para la 
realización de este trabajo. 
 
A los miembros del jurado asignado por el tiempo dedicado a la 
revisión del presente trabajo de tesis y por sus valiosas observaciones y 
comentarios para mejorarlo. 
 
A la Dra. Blanca Estela Rivero Cruz, por su valioso apoyo brindado en 
el manejo del equipo HPLC, que contribuyó en una parte importante para 
la realización de esta tesis. 
 
A la Q. Georgina Duarte Lisci, por su apoyo durante la realización de 
los análisis de CG-EM. 
 
Al personal técnico de la USAI por el registro de los distintos espectros 
utilizados en esta investigación. 
 
Al Instituto de Ciencia y Tecnología del Distrito Federal por el apoyo 
económico otorgado para realizar el presente trabajo mediante el proyecto 
PICSA10-27. 
Índice 
 Página I 
 
Índice 
 
I. Lista de abreviaturas. III 
II. Lista de figuras. V 
III. Lista de diagramas y gráficas. VIII 
IV. Lista de tablas. IX 
1 Resumen. 11 
2 Antecedentes. 13 
2.1 Propóleo. 13 
2.1.1 Definición y generalidades. 13 
2.1.2 Usos en la medicina tradicional: Propiedades biológicas y farmacológicas. 14 
2.1.3 Otras actividades del propóleo. 20 
2.1.4 Clasificación del propóleo de acuerdo a su origen. 21 
2.1.5 Composición química. 24 
2.1.6 Preparados que contienen propóleo en su composición. 32 
2.2 Estrés oxidante: definición y generalidades. 36 
2.2.1 Antioxidantes: definición y clasificación. 38 
2.2.2 Patologías asociadas al estrés oxidante. 40 
3 Justificación y objetivos. 42 
4 Desarrollo experimental. 44 
4.1 Material vegetal. 44 
4.2 Procedimientos generales de análisis. 45 
4.2.1 Análisis cromatográficos. 45 
4.2.2 Determinación de las constantes espectroscópicas y espectrométricas de los 
compuestos aislados. 45 
4.3 Cromatografía de líquidos de alta eficiencia. 46 
4.3.1 Identificación de la presencia de pinocembrina. 46 
4.3.2 Cuantificación de la pinocembrina. 47 
4.4 Cuantificación del contenido de fenoles totales. 47 
4.5 Cuantificación del contenido de flavonoides totales. 48 
4.6 Evaluación de la actividad antioxidante. 48 
4.6.1 Actividad inhibidora del radical libre 2,2-difenil-1-picril hidrazilo (DPPH˙). 48 
4.6.2 Actividad inhibidora del radical 2,2’-azino-bis-(3-etilbenzotiazolina)-6 
sulfonato de amonio (ABTS˙+). 49 
4.6.3 Medida de la capacidad reductora: Ensayo FRAP. 49 
Índice 
Página II 
 
4.7 Evaluación de la actividad antibacteriana. 50 
4.7.1 Microorganismo de prueba. 50 
4.7.2 Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI). 50 
4.7.3 Procedimiento general del ensayo. 51 
4.8 Microextracción en fase sólida de la fase gaseosa acoplada a cromatografía de 
gases con espectrometría de masas en tiempo de vuelo (HS-SPME-CG-EM-TOF). 52 
4.8.1 Microextracción. 52 
4.8.2 Cromatografía de gases-Espectrometría de masas (CG-EM). 52 
4.8.3 Obtención del índice de concentración (Fij). 53 
4.8.4 Identificación de los compuestos volátiles. 55 
4.9 Estudio fitoquímico biodirigido del propóleo obtenido en el apiario de 
“Acuexcomatl”. 55 
4.9.1 Preparación del extracto. 55 
4.9.2 Fraccionamiento primario del extracto etanólico. 55 
4.9.3 Fraccionamiento secundario. 56 
4.9.4 Aislamiento y purificación de los compuestos flavonoides. 57 
5 Resultados y discusión. 60 
5.1 Estudio fitoquímico biodirigido del propóleo Acuexcomatl. 62 
5.1.1 Caracterización estructural de los metabolitos aislados. 70 
5.2 Comparación de la actividad biológica, del contenido de fenoles y flavonoides 
totales del extracto etanólico de los propóleos. 81 
5.3 Cuantificación por HPLC del flavonoide pinocembrina (1). 83 
5.4 Análisis de la composición de volátiles. 87 
6 Conclusiones. 104 
7 Perspectivas. 105 
8. Anexo 1 106 
9. Referencias. 116 
 
 
 
Lista de abreviaturas 
 Página III 
 
I. Lista de abreviaturas. 
 
Abreviatura Significado 
ABTS 2,2´-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin)-6 sulfonato de amonio 
ACN Acetonitrilo 
AcOEt Acetato de etilo 
CCA Cromatografía en columna abierta 
CCD Cromatografía en capa delgada 
CG-EM Cromatografía de gases-espectrometría de masas 
CMI Concentración mínima inhibitoria 
COSY Correlation Spectroscopy 
 Desplazamiento químico 
d Doblete 
dd Doble de dobles 
ERO Especies reactivas de oxigeno 
DE Desviación estándar 
DPPH 2,2-difenil-1-picril hidrazilo 
FRAP Poder antioxidante reductor de fierro 
h Hora 
Hex Hexano 
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation 
HMQC Heteronuclear Multiple-Quantum Correlation 
HPLC High-performance liquid chromatography 
HS-SPME-GC-
MS-TOF 
Head space in solid phase microextraction to gas 
chromatography coupled with mass spectrometry time of 
flight 
HS Fase gaseosa 
IFN Interferon 
IL Interleucina 
Lista de abreviaturas 
Página IV 
 
I. Lista de abreviaturas (continuación). 
 
Abreviatura Significado 
J Constante de acoplamiento 
kg Kilogramo 
L Litro 
MeOH Metanol 
µg Microgramo 
µl Micro litro 
µmol Micromol 
mg Miligramo 
mmol Milimol 
mL Mililitro 
MHz Megahertz 
nm Nanómetro 
NO Óxido nítrico 
NOESY Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy 
PGE Prostaglandina 
ppm Partes por millón 
RMN1H Resonancia magnética nuclear de protón 
RMN13C Resonancia magnética nuclear de carbono 13 
SPME Microextracción en fase sólida 
UFC Unidades formadoras de colonias 
UV Ultravioleta 
TFA Ácido trifloro acético 
TIC Cromatograma iónico total 
ton Toneladas 
 
Lista de figuras 
 Página V 
 
II. Lista de figuras. 
 
Figura Descripción Página 
1 
Apariencia física de la muestra de propóleo 
recolectada en el apiario de Acuexcomatl. 
14 
2 
Patrones quimiogeográficos de los tipos de 
propóleos. 
22 
3 
Mapa de la República Mexicanaen donde se 
muestran las 5 regiones apícolas en que se divide el 
territorio nacional. 
24 
4 
Muestra de productos disponibles en el mercado 
con propóleo en su composición. 
32 
5 
Productos encontrados en el mercado a base de 
propóleo y de otras especies vegetales. 
33 
6 
Reacciones de formación y eliminación de especies 
reactivas oxígeno (ERO). 
37 
7 
Ubicación geográfica de los apiarios en dónde se 
recolectaron los propóleos analizados. 
44 
8 
Mecanismo de acción de los antioxidantes ABTS·+ y 
DPPH·. 
65 
9 
Estructuras químicas de los cinco compuestos 
aislados a partir del extracto etanólico del propóleo 
colectado en el apiario Acuexcomatl. 
67 
10 
Estructura química de la pinocembrina y sus datos 
de espectrometría de masas. 
70 
11 Espectro de RMN 1H de pinocembrina (1). 72 
12 Espectro de RMN 13C de pinocembrina (1). 72 
Lista de figuras 
Página VI 
 
II. Lista de figuras (Continuación). 
 
Figura Descripción Página 
13 
Estructura química de la alpinetina (3) y de la 5-
metileterpinobanksina (6). 
73 
14 
Espectro de RMN 1H de la mezcla de alpinetina (3) y 
5-metileterpinobanksina (6). 
75 
15 
Espectro de RMN 13C de la mezcla de alpinetina (3) 
y 5-metileter pinobanksina (6). 
75 
16 
Espectro NOE de la mezcla de alpinetina (3) y 5-
metileterpinobanksina (6). 
76 
17 
Identificación por HPLC de pinocembrina (1) en los 
extratos etanólicos de los propoleos colectados. 
84 
18 
Perfiles cromatográficos obtenidos para los 
extractos etanólicos de los propóleos recolectados. 
86 
19 
Cromatograma iónico total de los compuestos 
volátiles presentes en el propóleo colectado en el 
apiario Acuexcomatl obtenido por la técnica HS-
SPME-GC-MS-TOF utilizando tres fibras diferentes. 
88 
20 
Comparación de los espectros de masas del -
pineno y 3-careno. 
91 
21 
Comparación del cromatograma iónico total de los 
estándares empleados y el cromatograma iónico 
total obtenido de la muestra del propóleo 
proveniente del apiario Acuexcomatl para la 
obtención de los índices de Kovats. 
92 
22 
Comparación de los cromatogramas iónicos totales 
de los propóleos estudiados. 
94 
 
Lista de figuras 
 Página VII 
 
II. Lista de figuras (Continuación). 
 
 
Figura Descripción Página 
A 
Curvas de calibración utilizadas para la 
determinación de la capacidad antioxidante, 
fenoles y flavonoides totales. 
107 
B 
Espectros de RMN 1H, RMN 13C y NOE de la 4´,7-
dimetilnaringenina (5). 
110 
B-a Espectro NOE de la 4´,7-dimetilnaringenina (5). 111 
C 
 Espectros de RMN 1H y RMN 13C de la acacetina 
(2). 
112 
C-a Espectro NOE de la acacetina (2). 113 
D 
Espectros de RMN 1H y RMN 13C de la galangina 
(4). 
114 
E 
Perfiles cromatográficos obtenidos para los 
extractos etanólicos de los propóleos evaluados a 
una concentración de 2.0 mg/mL. 
115 
 
 
Lista de diagramas y gráficas 
Página VIII 
 
III. Lista de diagramas y gráficas. 
 
Diagrama Descripción Página 
1 
Procedimiento del fraccionamiento primario y 
secundario del extracto etanólico obtenido a partir del 
propóleo “Acuexcomatl”. 
59 
 
 
Gráfica Descripción Página 
1 
Actividad antioxidante y antibacteriana, contenido de 
fenoles y flavonoides totales en el extracto etanólico y 
las fracciones derivadas del fraccionamiento del 
propoleo seleccionado. 
66 
2 
Actividad antioxidante y antibacteriana de los 
compuestos aislados a partir del propóleo de 
Acuexcomatl. 
69 
Lista de tablas 
 Página IX 
 
IV. Lista de tablas. 
 
Tabla Descripción Página 
1 
Estructura química de algunos compuestos aislados a 
partir del propóleo. 
25 
2 
Preparados comerciales que contienen propóleo 
asociados con extractos de diferentes plantas 
medicinales. 
34 
3 Clasificación de los antioxidantes. 39 
4 Ubicación geográfica de los apiarios 44 
5 
Testigos utilizados en el ensayo biológico, para 
determinar la CMI. 
51 
6 
Resumen de las condiciones de preparación y análisis de 
las muestras de los diferentes propóleos analizados por 
la técnica HS-SPME-CG-EM-TOF. 
54 
7 
Fraccionamiento secundario por cromatográfica de la 
fracción primaria F-AcOEt. 
56 
8 Resumen del fraccionamiento ternario de la fracción F-F. 58 
9 
Ecuaciones de las curvas de calibración obtenidas para 
los ensayos de ABTS, DPPH, FRAP, fenoles y flavonoides 
totales. 
62 
10 
Desplazamientos químicos y constantes de acoplamiento 
de los compuestos aislados en RMN 1H y RMN 13C. 
78 
11 
Contenido de fenoles y flavonoides totales presentes en 
los extractos etanólicos de los propóleos colectados. 
81 
 
Lista de tablas 
Página X 
 
IV. Lista de tablas (Continuación). 
 
Tabla Descripción Página 
12 
Actividad inhibidora de los extractos etanolicos de los 
propoleos en estudio frente a los radicales DPPH˙ y 
ABTS˙+ y habilidad reductora por el ensayo FRAP 
82 
13 
Ecuaciones de las curvas de calibración de pinocembrina 
realizadas para los dos sistemas cromatográficos 
utilizados. 
85 
14 
Contenido de pinocembrina en los extractos etanólicos de 
los diferentes propóleos analizados. 
85 
15 
Valores del índice de capacidad de concentración Fij del 
propóleo colectado en el apiario Acuexcomatl para las 
tres fibras empleadas. 
87 
16 
Compuestos volátiles obtenidos para las 3 fibras 
empleadas en el propóleo “Acuexcomatl” 
88 
17 
Comparación de los compuestos volátiles presentes en 
las muestras de propóleos analizadas. 
95 
A 
Resumen de los valores obtenidos para la actividad 
antioxidante y antimicrobiana. 
108 
Resumen 
 Página 11 
 
1 Resumen. 
 
El propóleo es un material multifuncional utilizado por las abejas 
para la construcción, el mantenimiento y la protección de sus colmenas. 
Desde la época antigua, este recurso natural ha sido aprovechado por el 
hombre debido a sus propiedades antibacterianas, antibióticas, 
antifúngicas, antivirales, antitumorales y antioxidantes, entre otras. Desde 
el punto de vista químico, el propóleo se compone básicamente de 50% de 
resinas y bálsamos vegetales; 30% de ceras; 10% de aceites esenciales y 
aromáticos; 5% de polen y 5% de otras sustancias. En este sentido, en 
literatura describe el aislamiento de más de 300 compuestos entre los que 
destacan compuestos de carácter fenólico, terpenoide, esteroide, 
flavonoide, azúcares y aminoácidos. 
 
Estudios farmacológicos previos han permitido demostrar que tanto 
su actividad biológica como su potencia están relacionadas con su 
composición química. Esta composición es altamente variable y se 
encuentra íntimamente ligada con la zona geográfica, la vegetación y la 
época de recolección. 
 
En este marco de referencia, nuestro grupo de investigación se ha 
enfocado en determinar la composición química, la capacidad antioxidante 
y la actividad antibacteriana de extractos etanólicos preparados a partir de 
diferentes muestras de propóleos colectados en la zona rural del Distrito 
Federal. 
 
En el presente trabajo se describe el estudio fitoquímico del extracto 
etanólico de una muestra de propóleo proveniente del apiario 
“Acuexcomatl” ubicado en la Delegación Xochimilco del Distrito Federal. La 
aplicación de diferentes procedimientos cromatográficos permitió el 
Resumen 
Página 12 
 
aislamiento de pinocembrina (1), acacetina (2), alpinetina (3), 4´,7- 
galangina (4), dimetilnaringenina (5) y 5-metileterpinobanksina (6). Como 
ensayos biológicos se utilizaron: la capacidad antioxidante frente a los 
radicales DPPH˙ y ABTS˙+, así como capacidad de reducir a fierro (por sus 
siglas en inglés FRAP, Ferric Reducing Ability of Plasma); además de 
determinar su actividad sobre el crecimiento de la bacteria cariogénica 
Streptococcus mutans.. La galangina (4) presentó la mayor actividad 
antioxidante y la pinocembrina (1) el mejor efecto antibacteriano, con 
respecto a los otros compuestos aislados. 
 
El trabajo también incluye la cuantificación de pinocembrina (1), elcontenido de fenoles y flavonoides totales en el extracto etanólico de cinco 
propóleos recolectados, siendo el extracto etanólico del apiario Buhó quien 
posee el mayor contenido de dicho flavonoide y dichos compuestos. Sin 
embargo, los cinco propóleos cumplen con el contenido de fenoles y 
flavonoides totales establecidos en las normas de calidad emitidas por 
Argentina y Brasil. 
 
Por otra parte, se realizó la determinación de los compuestos volátiles 
presentes en cada propóleo utilizando la técnica de microextracción en 
fase sólida a partir de la fase gaseosa separada por cromatografía de gases 
y analizada por espectrometría de masas en tiempo de vuelo (HS-SPME-
GC-MS-TOF). Dicho análisis permitió establecer que los terpenoides son 
sus principales constituyentes. 
Antecedentes 
 Página 13 
 
2 Antecedentes. 
 
2.1 Propóleo. 
 
2.1.1 Definición y generalidades. 
 
La palabra propóleo deriva de los vocablos griegos “pro” (defensa de) y 
“polis” (ciudad o colmena) de tal forma que propóleo significa “protección 
de la colmena” (Ghisalberti, 1979). El propóleo es una sustancia resinosa 
resultante de la mezcla de enzimas salivales de las abejas con materiales 
de carácter lipofílico recolectados a partir de las yemas y las grietas de la 
corteza de diversas plantas como son el álamo, el castaño de Indias, los 
abedules y las coníferas (Bankova, 2005; Gardana, 2007). 
 
La recolección del propóleo a partir de las colmenas se realiza 
raspando o colocando trampas, siendo este último método el que produce 
propóleos de mejor calidad y con menor contaminación por plomo. En las 
zonas templadas la obtención del propóleo se realiza antes de la llegada del 
invierno, mientras que en los climas tropicales se hace al inicio de la 
estación lluviosa que es cuando la propolización parece ser más activa 
(Farré et al., 2004). En este sentido, la época y el método de recolección 
representan dos aspectos importantes para considerar, ya que la 
recolección puede realizarse en la temporada donde se determine que 
existen las concentraciones más elevadas de los compuestos que poseen 
las actividades biológicas de interés (Sforcin, 2007). 
 
Físicamente, el propóleo puede describirse como una sustancia dura y 
quebradiza a bajas temperaturas, sin embargo, si es calentado levemente 
se torna maleable y viscoso; su coloración varía del amarillo-verdoso al 
marrón oscuro, lo cual se debe básicamente a las fuentes vegetales y a su 
Antecedentes 
Página 14 
 
antigüedad (Burdock, 1998). Generalmente, posee un sabor acre aunque a 
veces es amargo y tiene un aroma semejante al de la miel debido a los 
compuestos volátiles presentes en el mismo (Niraldo, 2005). Su punto de 
fusión oscila entre 60-70 °C aunque en algunos casos puede llegar hasta 
100 °C (Marcucci, 1995). En la Figura 1 se ilustra la apariencia física de 
una muestra de propóleo recolectada en el apiario de Acuexcomatl de la 
zona rural del Distrito Federal. 
 
 
Figura 1. Apariencia física de la muestra de propóleo 
recolectada en el apiario de Acuexcomatl. 
 
2.1.2 Usos en la medicina tradicional: Propiedades biológicas y 
farmacológicas. 
 
El propóleo es utilizado por las abejas como antimicrobiano (Bankova, 
2005), para suavizar las paredes internas y sellar agujeros en la colmena, 
de esta forma se reduce la entrada de frío, viento y de posibles intrusos 
(Burdok, 1998). Por otra parte, esta resina es utilizada para embalsamar 
animales pequeños muertos que no pudieron ser retirados de la colmena, 
evitando así su putrefacción (Niraldo, 2005). 
 
Antecedentes 
 Página 15 
 
El propóleo ha sido aprovechado por el hombre desde la edad antigua, 
ya que su uso se remonta a la época de los Egipcios, quienes al igual que 
las abejas, lo utilizaban para embalsamar cadáveres (Ghisalberti, 1979); 
por otra parte, los Incas lo utilizaban como antipirético; los griegos y los 
romanos como antiinflamatorio en el tratamiento de heridas, úlceras y 
abscesos (Castaldo y Caspaso, 2002). En los siglos XII–XV, se utilizó como 
antiinflamatorio bucal y en el tratamiento de las caries dentales, resfriados 
y forúnculos (Castaldo y Capasso, 2002). En Europa, ente los siglos XVII–
XIX se destacó por sus propiedades antibacterianas y, finalmente, a partir 
de 1900 el propóleo fue utilizado como desinfectante y cicatrizante 
(Niraldo, 2005). Esta última propiedad es aprovechada en África, hace más 
de 90 años, combinando esta resina con la vaselina para confeccionar 
pomadas antibacterianas (Marcucci, 1996). 
 
Es así, que a través de los años esta resina ha sido y continúa siendo 
utilizada debido a sus múltiples y versátiles propiedades biológicas 
antibacterianas, antibióticas, antifúngicas (Hegazi, et al., 1996 y 2000), 
antivirales (Volpi, 2006), antiprotozoarias (Castaldo y Caspaso, 2002), 
antitumorales, inmunoestimulantes (Zhou, 2008), antiulcericas, 
hipotensoras, citostáticas (Bruschi, 2003), antioxidantes, antineoplásicas, 
antiinflamatorias (Peña, 2008), anestésicas, antisépticas, cicatrizantes 
(Hroboňová, 2009), bacteriostáticas, coléricas, espasmolíticas (Burdok, 
1998), antihipertensivas (Niraldo, 2005), antidiabéticas (Sforcin y Bankova, 
2011), regeneradoras de tejido cartilaginoso y tejido óseo (McLennan, 
2008), además el propóleo pose acción desintoxicante en el hígado 
(Marcucci, 1996). 
 
2.1.2.1 Actividad antimicrobiana. 
 
Estudios previos han demostrado la eficacia del propóleo contra el 
crecimiento de bacterias Gram positivo (Staphylococcus spp., Streptococcus 
Antecedentes 
Página 16 
 
spp., Bacillus spp.,) y bacterias Gram negativo (Helicobacter pylori, 
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Pseudomonas 
aeruginosa, Aerobacter aerogenes, Bordetella bronchiseptica, Serratia 
marcescens) (Dobrowalski, 1991; Marcucci, 1996; Ataҫ-Uzel, 2005; 
Castaldo y Caspaso, 2002). Además, estudios previos han demostrado que 
extractos derivados del propóleo presentan actividad contra el protozoario 
Trypanosoma cruzi (Castaldo y Caspaso, 2002). 
 
Por otra parte, extractos provenientes de propóleos demostraron 
actividad contra Candida albicans, Microsporum sp., Alternaria alternata y 
Penicillium digitatum (Marcucci, 1995; Farré, 2004; Castaldo y Caspaso, 
2002). También, presentan actividad contra el virus de inmunodeficiencia 
humana (VIH), del herpes, de las influenzas tipo A y B y de la viruela 
(Marcucci, 1995; Castaldo y Caspaso, 2002). 
 
Los principales componentes con actividad antimicrobiana presentes 
en los propóleos son del tipo flavonoide, ácido fenólico y los ésteres de los 
ácidos fenólicos (Hernández y Bernal, 1990; Kujumgiev et al., 1999; 
Sforcin, 2000). Sin embargo, se ha descrito que propóleos provenientes de 
zonas tropicales que no contienen compuestos de este tipo presentan una 
actividad antimicrobiana similar, lo que indica que la combinación de 
diferentes sustancias en el propóleo son esenciales para dicha actividad 
biológica (Chang-Li, 2005). 
 
2.1.2.2 Actividad antiinflamatoria. 
 
La actividad antiinflamatoria del propóleo se encuentra descrita 
principalmente para dolencias musculares y de las articulaciones, además 
de inflamaciones ocasionadas por infecciones, reumatismo y torceduras 
(Marcucci, 1996). Estudios previos realizados en ratones C57BL/6 a los 
cuales se les administraron diferentes extractos de propóleo durante un 
Antecedentes 
 Página 17 
 
periodo de 14 días mostraron una inhibición en la producción de las 
interleucinas IL-1, IL-6, IL-2, IL-10 y del interferón IFN- (Sforcin, 2011). 
 
Por otra parte, estudios realizados utilizando como modelo ratones a 
los cuales se les indujeron edemas con carragenina demostraron el efecto 
antiinflamatorio de extractos acuosos y etanólicos de propóleo. Estos 
estudios demostraron que el mecanismo responsable del efecto 
antiinflamatorio se debe a una disminución en los nivelesde 
prostaglandina E2 (PGE2) y de óxido nítrico (NO). Otros estudios utilizando 
ratas a las cuales se les indujo artritis permitieron determinar que la 
administración de extractos de propóleo inhibían de forma significativa las 
producción de interleucina-6 (IIL-6) (Fuliang-Hu, 2005). Esta respuesta 
antiinflamatoria en parte se encuentra relacionada con los flavonoides 
presentes en los propóleos, puesto que algunos flavonoides poseen la 
capacidad de modificar la síntesis de eicosanoides, lo cual está relacionado 
con dicho efecto (Florez, 2002). 
 
2.1.2.3 Actividad inmunoestimulante. 
 
Investigaciones previas realizadas utilizando extractos de propóleo 
describen que la capacidad de secreción de citocinas se incrementa 
significativamente tras la administración los mismos (Farré, 2004; Basim, 
2006). Asimismo, existen estudios que han demostrado que extractos 
etanólicos de propóleo son capaces de activar las etapas iniciales de la 
respuesta inmune mediante la expresión de los receptores TLR-2 y TLR-4, 
así como la producción de las citocinas proinflamatorias IL-1 e IL-6 
(Orsatti, 2010). Otras investigaciones en las cuales se administraron 
extractos derivados del propóleo al 10% en ratones de la cepa BALB/c a 
dosis de 5, 10 y 20 mg/kg describen un incremento en la producción de 
anticuerpos por los ratones (Sforcin, 2007). 
Antecedentes 
Página 18 
 
Recientemente, se demostró que la administración como coadyuvante 
de un extracto acuoso de propóleo al 13% a pacientes asmáticos por un 
período de dos meses redujo el grado de incidencia y la severidad de los 
ataques provocados por la misma (Sforcin, 2007). 
 
2.1.2.4 Actividad citotóxica y antitumoral. 
 
Estudios realizados in vivo con ratones a los cuales se les 
administraron extractos de propóleo, han demostrado un incremento en la 
actividad citotóxica de las células asesinas (NK), inhibiendo así el 
crecimiento celular y de la apoptosis en diferentes líneas tumorales 
(Marcucci, 1995), como es el caso del carcinoma cervical humano 
(Castaldo et al., 2002; Marcucci, 1996) y del linfoma murino (Sforcin y 
Bankova, 2011). 
 
2.1.2.5 Actividad anestésica, antiséptica y cicatrizante. 
 
Las propiedades anestésicas del propóleo han sido aprovechadas por 
cirujanos plásticos brasileños para el tratamiento estético de pieles con 
acné y arrugas superficiales. En la medicina dental se le utiliza para el 
tratamiento de gingivitis y caries dental (Serra, 1995). Por otra parte, 
preparados o extractos de propóleo se utilizan ampliamente para el 
tratamiento de infecciones en la garganta (Burdok, 1998; Niraldo, 2005; 
Walgrave et al., 2005). Por último, estudios recientes demuestran que el 
propóleo favorece la reepitelización de heridas en roedores diabetizados 
(McLennan, 2008). 
 
2.1.2.6 Actividad antiulcerosa. 
 
Estudios previos demuestran que algunos componentes del propóleo 
como el ácido cafeíco, el ácido p-cumárico y el ácido cinámico, compuestos 
Antecedentes 
 Página 19 
 
de carácter fenólico poseen propiedades antiulcéricas. Asimismo, se ha 
reportado que extractos de propóleos presentan un efecto gastroprotector 
(Sforcin, 2011). 
 
Por otra parte el grupo de trabajo de Primon (2007) ha demostrado 
que el extracto etanólico de propóleo verde brasileño reduce de forma 
significativa las lesiones gástricas inducidas por indometacina, etanol y 
estrés en una dosis de 500 mg/kg. 
 
2.1.2.7 Actividad antidiabética. 
 
Matsushige y colaboradores (1996) demostraron que el extracto 
acuoso de propóleo posee un efecto preventivo en la destrucción de las 
células -pancreáticas al inhibir la generación del IL-1 y la actividad de la 
óxido nítrico sintasa. Otras investigaciones describen que la 
administración del extracto acuoso o etanólico por un periodo de 7 días en 
ratas diabetizadas permitió controlar su glicemia y modular sus niveles de 
glucosa (Sforcin, 2011). 
 
2.1.2.8 Capacidad antioxidante. 
 
El propóleo es una fuente natural de antioxidantes que protegen a los 
ácidos grasos y lipoproteínas séricas de la oxidación, debido a su 
capacidad estabilizadora de radicales libres y a su efecto inhibidor sobre el 
ión cuproso, iniciador de la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad 
(Farré et al., 2004). En este sentido existen estudios que demuestran que 
el porcentaje de neutralización de radicales libres por esta resina es 
equiparable al descrito para la vitamina C (Velázquez et al., 2007). 
 
La excelente capacidad antioxidante descrita para el propóleo se 
atribuye básicamente a su elevado contenido de flavonoides. Estos 
Antecedentes 
Página 20 
 
compuestos poseen en su estructura un número variable de hidroxilos 
fenólicos que poseen propiedades quelantes del hierro y otros metales de 
transición confiriéndoles una gran capacidad antioxidante (Havsteen, 
1983). Por ello, los flavonoides desempeñan un papel esencial en la 
protección frente a daños provocados por el estrés oxidativo relacionado 
con un elevado número de patologías como cardiopatía isquémica, 
aterosclerosis, cáncer, entre otras más (Florez, 2002). Las propiedades 
antiradicales libres de los flavonoides se dirigen fundamentalmente hacia 
los radicales hidroxilo y superóxido, especies reactivas implicadas en el 
inicio de la cadena de peroxidación lipídica (Florez, 2002). 
 
2.1.3 Otras actividades del propóleo. 
 
Además de las actividades biológicas descritas previamente, en la 
literatura se ha reportado el efecto potenciador de extractos de propóleo 
sobre la actividad de antibióticos como la biomicina, la tetraciclina, la 
neomicina, la polimixina, la penicilina y la estreptomicina (Marcucci, 1996; 
Sforcin, 2000). Existen estudios que han demostrado la actividad sinérgica 
entre el ciproxacino y el propóleo en el tratamiento de la queratitis 
experimental inducida por Staphylococcus aureus (Sforcin, 2011). 
 
Además de las aplicaciones del propóleo en la medicina tradicional, 
esta resina se ha incorporado en productos domésticos, cosméticos y 
alimentarios, debido a sus propiedades biológicas (Chan-Li, 2005). Por su 
actividad cicatrizante ha sido aprovechado en la industria de cosméticos 
para la elaboración de cremas, faciales, pomadas, lociones (Niraldo, 2005), 
shampoos, ungüentos, acondicionadores, brillos labiales y barnices 
(Walgrave et al., 2005). Por otro lado, debido a sus propiedades 
antimicrobianas ha sido incorporado en hilos y cremas dentales, así como 
en enjuagues bucales (Burdok, 1998) para tratar diversas afecciones de la 
Antecedentes 
 Página 21 
 
cavidad oral como la gingivitis y la caries dental, principalmente (Walgrave 
et al., 2005). 
 
En la industria alimentaria el propóleo se ha incorporado en 
suplementos alimenticios y como aditivo en algunos alimentos y bebidas 
(Valencia, 2012). En algunos países, se adicionan unas gotas de una 
solución de propóleos en productos envasados o en alimentos frescos 
(como pescados congelados, grasas y aceites), con la finalidad de prolongar 
su vida útil entre dos y tres veces más. Además, la adición de propóleo en 
bebidas como el ron ayuda a mejorar la calidad del mismo. Por otro lado, 
en algunos países, se han efectuado estudios con resultados positivos para 
la conservación del mango con propóleos (Allende, 2012). 
 
Cabe mencionar que antiguamente está resina era utilizada por 
famosos fabricantes de violines como un ingrediente de la composición de 
los barnices y pulidores de los mismos, de tal forma que la coloración que 
se observa en algunos violines hechos por antiguos maestros de Cremona 
es debida en parte al propóleo (Marcucci, 1996). 
 
2.1.4 Clasificación del propóleo de acuerdo a su origen. 
 
Estudios farmacológicos previos han permitido demostrar que tanto la 
actividad biológica como la potencia de cada propóleo dependen 
básicamente de su composición química, misma que es altamente variabley se encuentra íntimamente ligada con la zona geográfica, la época de 
recolección, además de la raza de abeja (Soleo de Funari, 2007; Bankova 
2005; Chaillou, 2009; Ataç-Uzel et al., 2005). Por otra parte, es necesario 
considerar los disolventes y el método de extracción ya que los extractos 
etanólicos al 60-80% inhiben el crecimiento microbiano, mientras que al 
70-80% tienen una mayor actividad antioxidante (Farré et al., 2004). 
 
Antecedentes 
Página 22 
 
La zona geográfica es uno de los factores determinantes en la 
composición y por ende en la actividad biológica de los propóleos y aunque 
las abejas de la misma colonia pueden visitar plantas de diferentes 
especies, a menudo pareciera que hay una preferencia marcada con ciertas 
resinas, observándose así cinco patrones quimiogeográficos de los tipos de 
propóleos a nivel mundial (Figura 2), los cuales se clasifican en propóleos 
poplares o de climas templados, propóleos verdes o de climas tropicales, 
propóleos derivados de Clusia, propóleos derivados de Macaranga o de la 
región del pacifico y propóleos de las regiones orientales del Mediterráneo. 
Cada uno de ellos posee una composición característica (Salatino, 2011). 
 
 
Figura 2. Patrones quimiogeográficos de los tipos de propóleos. I. Propóleos 
poplares o de climas templados. II. Propóleos verdes o de climas tropicales. 
III. Propóleos derivados de Clusia. IV. Propóleos derivados de Macaranga o de 
la región del pacifico. V. Propóleos de las regiones orientales del Mediterráneo. 
 
Los componentes característicos de propóleos de climas templados o 
poplares (I), tanto de los hemisferios norte y sur, son flavonoides sin 
sustituyentes en el anillo B, ácidos fenilpropanoides y sus ésteres. Las 
fuentes de estos componentes son los exudados de las yemas apicales de 
las especies de Populus principalmente P. nigra (Salatino, 2011). 
 
Antecedentes 
 Página 23 
 
Propóleos de clima tropical o de tipo verde (II) como lo es el propóleo 
más importante de Brasil, tienen una composición bastante distinta, 
principalmente contienen fenilpropanoides prenilados, ácidos caféico y 
quínico, sustancias que derivan a partir de yemas vegetativas de Baccharis 
dracunculifolia (Salatino, 2011). 
 
Propóleos cuya fuente son los exudados de las flores de Clusia (III) 
poseen en su composición benzofenonas preniladas, como lo es el caso de 
los propóleos de Venezuela, Cuba y de algunos propóleos de Brasil 
(Salatino, 2011). 
 
Flavanonas de geranilo han sido reportadas para muestras de 
propóleos de la región del Pacífico (III), como es el caso de Taiwán y 
Okinawa. Recientemente, compuestos similares se han reportado para el 
propóleo de las regiones de África, como Egipto y Kenia. Los componentes 
del propóleo de Okinawa derivan de los exudados de la fruta de Macaranga 
tanarius, de la cual existen aproximadamente 280 variedades que 
producen diversos compuestos derivados de geranilo. Por lo tanto, no es de 
extrañar que el propóleo producido en África, Japón y Taiwán tenga 
composiciones similares (Salatino, 2011). 
 
Los propóleos de las regiones orientales del Mediterráneo (IV), como 
Grecia, Creta y Turquía, pueden contener predominantemente diterpenos 
o antraquinonas. La fuente de los diterpenos parece ser la especie 
Cupressaceae, sin embargo, nada se ha sugerido con respecto a los 
orígenes de las antraquinonas (Salatino, 2011). 
 
Con base a lo anterior, los propóleos mexicanos se ubican dentro de 
los propóleos de clima templados o poplares, sin embargo es importante 
destacar que el territorio mexicano comprende climas y regiones muy 
diferentes, con lo cual es necesaria la clasificación de los propóleos 
Antecedentes 
Página 24 
 
mexicanos. Sin embargo, en México sólo existe una clasificación de las 
zonas apícolas: la región del Altiplano, la Costa del Pacifico, la Región del 
Golfo, la región Norte y la región de la Península de Yucatán (Figura 3). 
Dentro de las cuales se ubica al Distrito Federal dentro de la zona 
correspondiente al altiplano. Esta región se distingue por tener mieles 
ámbar y ámbar claro de gran auge en el mercado europeo. Su origen floral 
es el acahual, la acacetillam la jarilla, el toronjil morado y la espinocilla, 
entre otros (Claridades, 2010). 
 
 
Figura 3. Mapa de la República Mexicana en donde se muestran 
las 5 regiones apícolas en que se divide el territorio nacional. 
 
2.1.5 Composición química. 
 
Desde el punto de vista químico el propóleo se compone de 50% de 
resinas y bálsamos vegetales; 30% de ceras; 10% de aceites esenciales y 
aromáticos; 5% de polen y 5% de otras sustancias (Burdok, 1998). La 
literatura química disponible a la fecha describe el aislamiento de más de 
300 compuestos entre los que destacan compuestos de carácter fenólico, 
terpenoides, esteroides, flavonoides, azúcares y aminoácidos 
(Kalogeropoulos et al., 2009). En la Tabla 1 ilustran algunos de los 
compuestos más representativos aislados del propóleo. 
 
 
Antecedentes 
 Página 25 
 
Tabla 1. Estructuras químicas de algunos compuestos representativos 
aislados a partir del propóleo. 
 
 
Compuesto 
químico 
Estructura química Referencia 
T
e
rp
e
n
o
id
e
s
 
Totarol 
 
 
Popova, 2009 
Geraniol 
 
 
Marcucci, 1996; 
Bankova, 2000 
Pineno 
 
Bankova, 2000 
Fucosterol 
 
Popova, 2009 
 
Cedrol 
 
Silici, 2005 
A
ld
e
h
íd
o
s
 
 
 
Vainillina 
 
 
 
 
Marcucci, 1996; 
Mohammadzadeh, 
2007 
Isovainillina 
 
Marcucci, 1996 
 
Antecedentes 
Página 26 
 
Tabla 1. Estructuras químicas de algunos compuestos representativos 
aislados a partir del propóleo (continuación). 
 
 
 
 
 
 
Compuesto 
químico 
Estructura química Referencia 
L
ig
n
a
n
o
s
 
 
Sesamina 
 
 
 
Bankova, 2000; 
Silici, 2005 
Sesartenina 
 
Bankova, 2000 
Yangambina 
 
Bankova, 2000 
Á
c
id
o
s
 g
ra
s
o
s
 
Ácido oleico 
 
Marcucci, 1996; 
Ataç-Uzel, 2005 
Ácido 
palmítico 
 
Ataç-Uzel, 2005; 
Marcucci, 1996 
Ácido 
linoleico 
Marcucci, 1996; 
Ataç-Uzel, 2005 
 
Antecedentes 
 Página 27 
 
Tabla 1. Estructuras químicas de algunos compuestos representativos 
aislados a partir del propóleo (continuación). 
 
Compuesto químico Estructura química Referencia 
F
la
v
o
n
o
id
e
s
 
 
 
Naringenina 
 
 
 
Ataç-Uzel, 2005; 
Silici, 2005 
Acacetina 
 
Marcucci, 1996; 
Silici, 2005 
Pinocembrina 
 
Marcucci, 1996; 
Ataç-Uzel, 2005; 
Gardana, 2007; Silici, 
2005 
 
Apigenina 
 
Marcucci, 1996; 
Gardana, 2007 
Galangina 
 
Marcucci, 1996; 
Ataç-Uzel, 2005 
Gardana, 2007; Silici, 
2005 
 
Quercetina 
 
Ataç-Uzel, 2005. 
Silici, 2005. 
 
 
Antecedentes 
Página 28 
 
Tabla 1. Estructuras químicas de algunos compuestos representativos 
aislados a partir del propóleo (continuación). 
 
Compuesto químico Estructura química Referencia 
F
la
v
o
n
o
id
e
s
 (
c
o
n
ti
n
u
a
c
ió
n
) 
4´,7-
Dimetilnaringenin
a 
 
Medina 2011 
4´,7-
Dimetilapigenina 
 
Medina 2011 
Canferol 
 
Bankova 
et al., 1983 
Isokuranetina 
 
Téllez y Murillo 
2011 
Pinobanksina 
 
Usia et al., 
2002 
6-Cinamilcrisina 
 
Usia et al., 
2002 
 
 
Antecedentes 
 Página 29 
 
Tabla 1. Estructuras químicas de algunos compuestos representativos 
aislados a partir del propóleo (continuación). 
 
Compuesto químico Estructura química Referencia 
F
la
v
o
n
o
id
e
s
 (
c
o
n
ti
n
u
a
c
ió
n
) 
3,7-Dihidroxi-5-
metoxiflavanona 
 
Bankova, 
1983 
2,5-Dihidroxi-7-
metoxiflavanona 
 
Bankova et 
al., 1983 
7-Metilgalangina 
 
Banskota, 
2002 
5-Metiléter 
pinobanksina 
 
Banskota, 
2002 
Pinostrobina 
 
Ataç-Uzel, 
2005 
3-Acetato de 
pinobanksina 
 
Ataç-Uzel, 
2005 
 
 
 
Antecedentes 
Página 30 
 
Tabla 1. Estructuras químicas de algunos compuestos representativos 
aislados a partir del propóleo (continuación). 
 
Compuesto químico Estructura química ReferenciaC
o
m
p
u
e
s
to
s
 f
e
n
ó
li
c
o
s
 
 
 
Ácido benzoico 
 
Marcucci, 1996 
Ataç-Uzel, 2005 
Silici, 2005 
Mohammadzadeh, 
2007 
Ácido p-
cumárico 
 
Marcucci, 1996 
Ácido gálico 
 
Marcucci, 1996 
Ácido ferúlico 
 
Ataç-Uzel, 2005 
Silici, 2005 
Ácido salicílico 
 
Marcucci, 1996 
 
Ácido cafeíco 
 
 
Ataç-Uzel, 2005 
Gardana, 2007 
Hidroquinona 
 
Popova, 2009 
Ácido cinámico 
 
Gardana, 2007 
 
Antecedentes 
 Página 31 
 
Tabla 1. Estructuras químicas de algunos compuestos representativos 
aislados a partir del propóleo (continuación). 
 
 Compuesto químico Estructura química Referencia 
C
o
m
p
u
e
s
to
s
 f
e
n
ó
li
c
o
s
 (
c
o
n
ti
n
u
a
c
ió
n
) 
p-coumarato de 
bencilo 
 
Popova, 
2005 
Ferulato de 
bencilo 
 
Popova, 
2005 
Cafeato de 
feniletilo 
 
Popova, 
2005 
Cinamato de 
cinamilo 
 
Popova, 
2005 
 
Como se ilustró en la Tabla 1, el grupo de los flavonoides (flavanoles, 
chalconas, flavonas y dihidroflavonas) son el tipo de compuestos aislados 
con mayor frecuencia a partir de muestras de propóleo, seguidos de 
compuestos fenólicos y todos ellos representan el grupo de productos 
activos más importantes presentes en el propóleo. Otros compuestos 
aislados son azúcares como la galactosa y la xilosa (Marcucci, 1996); 
vitaminas como la B1, B2, B6, C y E, minerales como la plata, el cesio, el 
mercurio, el lantano, el antimonio, el cobre, el manganeso, el hierro, el 
calcio, el aluminio, el vanadio y el silicio (Marcucci, 1995); y algunos 
aminoácidos como la lisina, la fenilalanina, la cisteína, la glicina, la 
leucina y la serina (Marcucci, 1996). 
Antecedentes 
Página 32 
 
2.1.6 Preparados que contienen propóleo en su composición. 
 
En México y el mundo, existen agroindustrias que manufacturan 
preparados a base de propóleo, un ejemplo es la agroindustria del Instituto 
Nacional de Tecnología Agropecuaria de la Estación Experimental 
Agropecuaria Famaillá (INTA EEA Famaillá), que ha montado una planta 
piloto de procesamiento de propóleos desarrollando múltiples productos. 
Para ello, en primer término se prepara el extracto etanólico de los 
propóleos y posteriormente se evapora el etanol con la finalidad de obtener 
los componentes biológicamente activos. Posteriormente, a partir del 
extracto obtenido se preparan tinturas, cremas, jabones, ungüentos, 
tabletas, etc. (Bedascarrasbure, 2001). En la Figura 4 se ilustran algunos 
de los preparados desarrollados que contienen própoleo en su 
composición. 
 
 
Figura 4. Muestra de productos disponibles en el mercado con propóleo 
en su composición. 
 
Es importante mencionar que los productos desarrollados a base de 
propóleo se combinan con otros derivados de la colmena como la miel y el 
polen, así como diversas plantas medicinales (ej. sauco, gordolobo, 
bugambilia, equinacea, ajo, canela, etc.). Estos productos se utilizan con 
frecuencia para tratar enfermedades respiratorias, bucales, 
gastrointestinales, inflamatorias, además de fortalecer el sistema inmune. 
La administración de estas asociaciones se realiza utilizando diferentes 
Antecedentes 
 Página 33 
 
presentaciones, entre las cuales se puede mencionar a los jarabes, gotas, 
infusiones, extractos, tizanas, pastillas (caramelos), cápsulas, jabones, 
ampolletas, entre otras (Figura 5). En la Tabla 2 se describen algunos de 
los preparados disponibles en el mercado en los cuales se incorporan 
extractos de propóleo en combinación con los de diversas especies 
vegetales, además de su posología y su uso recomendado. 
 
Figura 5. Productos encontrados en el mercado a base de propóleo y de otras especies 
vegetales. A. Gotas de ajo con propóleo, B. Tizana de abango con propóleo; C. Jabón de 
propóleo con manzanilla; D. Capsulas de propóleo con Echinacea y germen de trigo; E. 
Jarabe de propóleo con eucalipto, gordolobo y miel de abeja; F. Jarabe de miel con 
propóleo, eucalipto, gordolobo, sauco, polen y mentol; G. Propóleo en spray con esencia 
de eucalipto, mentol y miel; H. Ampolletas de equinacea con propóleo; I. Ampolletas a 
base de extractos de propóleo, Sauco, Llantén, semilla de pomelo, Regaliz, Equinacea y 
Astrágalus; J. Jarabe de miel con aloe vera y propóleo; K. Spray de propóleo con 
jengibre, miel de abeja y menta; L. Jarabe de miel con propóleo y melisa; M. Jarabe de 
miel con propóleo y extracto de palto; N. Spray de propóleo con canela y miel de abeja. 
 
 
Antecedentes 
Página 34 
 
Tabla 2. Preparados comerciales a base de propóleo asociados con diversas plantas medicinales. 
 
Preparado 
Asociación 
(extracto) 
Usos recomendados Posología 
Nombre 
comercial 
Jarabe 
eucalipto, 
gordolobo y miel 
de abeja 
afecciones del sistema 
respiratorio (tos) 
adultos: 
2 cucharadas/4 h 
Niños: 
1 cucharada /4 h 
Sin tos 
Jarabe melisa y miel 
tratamiento de problemas 
gastrointestinales, colon irritable 
de origen nervioso. 
1 a 2 cucharaditas 
dos a tres veces al 
día 
Miel propóleo-
Melisa 
Gotas ajo 
fortalecimiento del sistema 
inmune. 
Tratamiento de bronquitis y 
afecciones respiratorias, dolor de 
oído, presión alta, problemas 
gástricos y dérmicos. 
agregar 10 a 15 
gotas a media taza 
de agua tibia o 
leche. 
administrar 3 veces 
al día. 
Ajo propóleo 
gotas 
Nebulizador 
jengibre, miel de 
abeja y menta. 
tratamiento de tos y resfriados 
aplicar varias veces 
al día 
Nebulizador 
propóleo-
jengibre 
Ampolletas equinácea fortalecer el sistema inmune 
ingerir una 
ampolleta al día 
preferiblemente a la 
hora del desayuno, 
sola o disuelta en 
agua o zumo 
Master plant 
Ampolletas 
sauco, llantén, 
semilla de 
pomelo, regalíz, 
fortalecer el sistema inmune 
Tomar una 
ampolleta diaria 
por la mañana 
Inmunoguard 
Antecedentes 
 Página 35 
 
equinácea y 
Astrágalus 
Tizana abango 
tratamiento de los síntomas del 
resfriado común, 
no especificada 
Abango con 
propóleo 
(Therbal®) 
Tabla 2. Preparados comerciales de propóleo asociados con diversas plantas medicinales (continuación). 
 
Preparado 
Asociación 
(extracto) 
Uso recomendado Posología 
Nombre 
comercial 
Tabletas equinacea 
fortalecer el sistema inmune. 
tratamiento de problemas del 
tipo alérgico, fiebre, tos, 
anginas y dolor de garganta. 
Antibiótico. 
adultos: 
2 tabletas antes de 
cada comida. 
Niños 
2 tabletas al día. 
Antibiotil 
propóleo 
Cápsulas 
equinacea y 
germen de trigo 
fortalecer el sistema inmune 
tomar una cápsula al 
día antes del 
desayuno. 
Propóleo con 
equinácea 
1.000mg 
Pastillas fresa y acerola 
tratamiento de afecciones de 
la garganta, boca y afecciones 
respiratorias 
tomar de 4 a 6 
pastillas al día 
Propóleo BIO 
Jabón manzanilla Antibacteriano ------- Protex propolis 
Pasta dental mirra 
Prevención de placa 
dentobacterina. 
----- 
Tom's of Maine 
Toothpaste 
Propolis & Myrrh 
Crema 
aloe 
manzanilla 
consuelda 
Para problemas de la piel ------ 
Aloe propolis 
crem 
 
Antecedentes 
Página 36 
 
2.2 Estrés oxidante: definición y generalidades. 
 
En la mayor parte de las células, al menos un 90% del oxígeno 
molecular consumido es utilizado para la fosforilación oxidativa en la 
producción de ATP. El resto del O2 se emplea en una amplia gama de 
reacciones metabólicas especializadas. Existen al menos 200 enzimas 
conocidas que utilizan O2 como sustrato y prácticamente la totalidad de 
estas utiliza un ión metálico para potenciar la reactividad del oxígeno como 
es el caso de la citocromo oxidasa (Mathews, 2002). 
 
Sin embargo, la eficacia de estas enzimas oxidasas no suele ser del 
100%, de tal forma que a menudo se generan especies de oxígeno 
reducidas de forma incompleta: superóxido (O2˙-) que se forma a partir de 
una reducción del O2; peróxido de hidrógeno (HOOH) que se forma a partir 
de una reducción de dos electrones; y el radical hidroxilo (OH˙) que se 
forma por una reducción de tres electrones). Estasespecies radicales 
producidas son más reactivas que el O2 y son denominadas de forma 
colectiva especies reactivas de oxígeno (ERO) (Finley, 2011). En la Figura 6 
se muestran las reacciones de formación y eliminación de estas especies 
radicales. 
 
Específicamente, el radical hidroxilo es el más reactivo y es el 
responsable del daño de otras moléculas biológicas; daña a las proteínas 
de varias formas, así como a las membranas en un proceso denominado 
peroxidación lipídica, que es una reacción en cadena, en la cual se pueden 
generar radicales que inicien otra reacción de peroxidación. Asimismo, el 
radical hidroxilo también daña a los ácidos nucleicos, produciendo la 
ruptura de la cadena de polinucleótidos y cambiando la estructura de las 
bases del ADN (Saikat, 2011). 
 
Antecedentes 
 Página 37 
 
Por otra parte, el radical superóxido que es relativamente atóxico 
puede combinarse fácilmente con otro radical libre, el óxido nítrico (NO˙), 
produciendo peroxinitrito (OONO-), que es considerada una especie 
reactiva de oxígeno que también produce peroxidación lipídica (Mathews, 
2002). 
 
 
Figura 6. Reacciones de formación y de eliminación de las especies 
reactivas de oxígeno. Antioxidantes como la vitamina E y algunas 
enzimas antioxidantes como la superóxido dismutasa (SOD), catalasa o 
glutatión peroxidasa (GXP) pueden reducir a dichas especies; otros 
cofactores como el glutatión (GSH), el ascorbato y el NADPH y enzimas 
como la glutatión reductasa son importantes para la regeneración de la 
reducción de estas moléculas y/o enzimas. 
 
Cualquiera que sea su origen, la producción a gran escala de especies 
reactivas de oxigeno producen un daño considerable en los tejidos en los 
que se producen, generando así estrés oxidativo y para contrarrestarlo el 
organismo emplea defensas enzimáticas y no enzimáticas. 
 
El estrés oxidativo puede generarse mientras las células del 
organismo transforman los alimentos en energía especialmente en 
situaciones de hiperoxia, ejercicio intenso e isquemia y también por 
exposición a determinados agentes externos como las radiaciones 
Antecedentes 
Página 38 
 
ionizantes o luz ultravioleta, polución ambiental, humo del tabaco, etc. 
(Veiga, 1997). 
 
2.2.1 Antioxidantes: definición y clasificación. 
 
Para contrarrestar el daño provocado por el estrés oxidativo existen 
sistemas enzimáticos antioxidantes y sistemas antioxidantes no 
enzimáticos que son capaces de metabolizar a los radicales libres 
generados en los procesos redox en las células (Guerra, 2002). 
 
El término antioxidante tiene diferentes connotaciones según el área 
de especialidad, ya que por ejemplo en biología un antioxidante es un 
compuesto capaz de neutralizar especies reactivas generadas 
metabólicamente; mientras que en el área de alimentos, el término implica 
una sustancia utilizada por sus características funcionales como lo es el 
de retardar la oxidación (Finley, 2011). De esta forma los antioxidantes 
juegan un papel crucial en el mantenimiento de una salud óptima y en la 
defensa del daño provocado por los radicales libres formados durante el 
metabolismo. En la Tabla 3 se resume la clasificación de los antioxidantes.
Antecedentes 
 Página 39 
 
Tabla 3. Clasificación de los antioxidantes (Saikat, 2011). 
 
Tipo de antioxidante Ejemplos 
D
e
 a
c
u
e
rd
o
 a
 s
u
 
N
a
tu
ra
le
z
a
 
Antioxidantes enzimáticos 
Superóxido dismutasa (SOD), Catalasa 
(CAT), Glutatión peroxidasa (GPx), 
Glutatión reductasa (GR). 
Antioxidante
s no 
enzimáticos 
Metabólicos 
Glutatión reducido (GSH), L-arginina, 
coenzima Q10, bilirrubina, transferina, 
ácido úrico. 
Nutrimentales 
Vitamina E, vitamina C, carotonoides, 
flavonoides, omega-3, ácidos grasos, 
compuestos fenólicos. 
D
e
 a
c
u
e
rd
o
 a
 s
u
 f
u
e
n
te
 
Antioxidantes endógenos 
Bilirrubina, glutatión, ácido lipoico, 
N-acetilcisteína, NADPH y NADH, 
ubiquinona, ácido úrico, enzimas 
(SOD, CAT, GPx, GR) 
Antioxidantes de la dieta 
Viataminas E y C, -caroteno y otros 
carotenoides y oxicarotenoides, 
polifenoles (flavonoides, flavonas, 
proantocianidinas, flavanoles) 
Metales unidos a proteínas 
Albumina (cobre), ceruloplasmina 
(cobre), metalotioneina (cobre), 
ferritina (hierro), mioglobina (hierro), 
transferina (ferretina). 
D
e
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c
u
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 s
u
 m
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c
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d
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c
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ió
n
 
Sistemas catalícos de 
neutralización de diversas ERO 
Superóxido dismutasa (SOD), Catalasa 
(CAT), Glutatión peroxidasa (GPx). 
Unión o inactivación de los iones 
metálicos que evitan la 
producción de ROS por medio de 
la reacción de Haber-Weiss 
Ferritina y catequinas 
Autodestrucción y ruptura de la 
cadena de los antioxidantes de 
barrido, destrucción de ERO. 
Vitamina C, Vitamina E, ácido úrico, 
flavonoides, glutatión. 
Neutralización de ERO Carotenoides, antocianidinas. 
Antecedentes 
Página 40 
 
2.2.2 Patologías asociadas al estrés oxidante. 
 
Existen una serie de patologías atribuibles al ataque de radicales 
libres que están implicados en algunas de sus fases o secuencias 
bioquímicas (Guerra, 2001). A continuación se describen algunas de estas 
patologías: 
 
 Envejecimiento prematuro: resulta de la acumulación de 
lesiones orgánicas debidas a las ERO. Además, se ha detectado una menor 
actividad proteolítica que en las células jóvenes, una disminución de las 
concentraciones de antioxidantes e inactivación de las enzimas 
detoxificadoras de ERO y una acumulación de proteínas oxidadas no 
degradadas (Rivet, 2000). 
 
 Ateroesclerosis: la formación de una placa de grasa y de otras 
sustancias que cubren parcial o totalmente los vasos sanguíneos. Esta 
placa, se inicia con la captación de lipoproteínas de baja densidad (LDL) 
por los macrófagos que se transforman así en células espumosas. En 
determinadas condiciones oxidativas las lipoproteínas se fragmentan y 
determinados residuos de aminoácidos de la apoproteína de la LDL son 
alterados. Estas LDL oxidadas o productos liberados de ellas, son 
citotóxicas para el endotelio y estimulan la producción de diversos factores 
que inician o extienden la lesión ateroesclerótica. Se ha demostrado una 
estrecha relación entre ERO y LDL, se sabe que su aumento tiene una 
influencia directa en la aparición de ateroesclerosis (Guerra, 2001). 
 
 Cáncer: el desarrollo tumoral es un proceso altamente 
complejo caracterizado por la presencia de necrosis celular del tejido sano, 
crecimiento incontrolado de las células cancerosas, neovascularización del 
área afectada para asegurar el aporte de oxígeno y nutrientes al tumor, 
entre otros muchos fenómenos. Se ha sugerido la implicación de los 
Antecedentes 
 Página 41 
 
radicales libres en el desarrollo tumoral. Los radicales libres estimulan el 
crecimiento de las células musculares lisas, lo que sugiere un papel del 
estrés oxidativo en la neovascularización tumoral o angiogénesis. Por otra 
parte, debe considerarse que la transformación oncogénica está 
condicionada por la presencia de genes mutados u oncogenes que 
controlan funciones celulares clave, y esto puede influenciarse por el 
estado redox celular (Borek, 2004). 
 
 La catarata senil: los radicales generados en el cristalino 
producen entrecruzamiento, desnaturalización, degradación de sus 
proteínas y otros efectos, formándose gránulos microscópicos de 
composición compleja por la aglomeración desordenada de moléculas que 
crecen en tamaño y cantidad, produciendo inicialmente el efecto Tindall y 
finalmente, la total opacificación del cristalino (Fletcher, 2010). 
 
 Diabetes mellitus: a concentraciones altas de glucosa, típicas 
de estados diabéticos, la producción de ERO se incrementan. Sin embargo, 
el incremento de estrés oxidativo descrito en los diabéticos, no soólo está 
relacionado con la aceleración en la producción de ERO, sino también con 
la disminución de antioxidantes.(Oberley, 1997; Roja, 2005). 
 
 Hipertensión arterial (HTA): la HTA puede ser considerada 
como un conjunto de resultados sistémicos de las lesiones producidas por 
las ERO. En la HTA se ha encontrado aumento de la peroxidación de 
lípidos, tanto en plasma como en las membranas celulares, así como un 
aumento en la cantidad total de lípidos y una disminución de la capacidad 
antioxidante. La HTA predispone a acelerar la ateroesclerosis, al menos en 
parte a causa de la sinergia entre elevación de presión sanguínea y otros 
estímulos aterogénicos que inducen estrés oxidante en los vasos arteriales 
(Guerra, 2001). 
Justificación y objetivos 
Página 42 
 
3 Justificación y objetivos. 
 
Desde tiempos inmemoriales, el propóleo ha jugado un rol importante 
en la medicina tradicional para el tratamiento de diversos padecimientos 
debido a sus múltiples propiedades biológicas. Es por ello que países como 
Argentina y Brasil han emitido directivas que establecen los contenidos 
mínimos de resinas, fenoles y flavonoides totales (compuestos 
responsables de la actividad biológica), así como los máximos admisibles 
de diversas impurezas físicas y químicas que los propóleos y sus extractos 
deben poseer para que puedan ser utilizados como materia prima en la 
elaboración de diversos productos farmacéuticos y cosméticos. Sin 
embargo, en México no existe una norma que establezca los criterios de 
calidad que deban poseer los propóleos mexicanos para dichos fines, a 
pesar de ser un producto ampliamente utilizado en nuestro país. Lo cual 
se debe básicamente a que la información acerca de los propóleos 
mexicanos es escasa. 
 
Considerando el potencial productivo y el incremento en el consumo 
de este producto a nivel mundial, surge la necesidad de ampliar el 
conocimiento sobre la composición química, las propiedades biológicas y 
los límites de seguridad de los propóleos mexicanos que permitan a los 
productores nacionales comercializar productos de calidad a base de ellos. 
 
Con base en estas consideraciones, el objetivo general del presente 
proyecto de investigación es determinar la composición química, la 
capacidad antioxidante in vitro y el efecto sobre el crecimiento de la 
bacteria cariogénica Streptococcus mutans de propóleos recolectados en la 
zona melífera del altiplano mexicano. Para el cumplimiento del objetivo 
general se plantearon los siguientes objetivos particulares: 
Justificación y objetivos 
 Página 43 
 
 Colectar diversas muestras de propóleos de la zona melífera del 
altiplano mexicano (zona rural del Distrito Federal). 
 Realizar el estudio químico del extracto etanólico de uno de los 
propóleos recolectados. 
 Aislar mediante técnicas cromatográficas los compuestos 
mayoritarios presentes en el extracto del propóleo seleccionado. 
 Caracterizar los compuestos aislados empleando métodos 
espectroscópicos y espectrométricos, tales como espectrometría de 
masas y espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) de 
1H y 13C mono y bidimensional. 
 Determinar el contenido de fenoles totales y flavonoides totales en el 
extracto, y las fracciones derivadas mediante el método desarrollado 
por Folin y Kumasawa, respectivamente. 
 Evaluar la capacidad antioxidante in vitro del extracto, de las 
fracciones derivadas y de los compuestos aislados, mediante la 
actividad inhibitoria de los radicales 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo 
(DPPH˙), 2,2´-azino-bis-(3-etilbenzoatiazolina)-6-sulfonato de amonio 
(ABTS˙+), así como de su capacidad para reducir a hierro (FRAP, por 
sus siglas en inglés). 
 Determinar la actividad biológica, el contenido de fenoles y de 
flavonoides totales de al menos otras cuatro muestras más y 
comparar los resultados obtenidos con el propóleo seleccionado. 
 Cuantificar mediante cromatografía de líquidos de alta resolución 
(HPLC) el compuesto mayoritario presente en el extracto del propóleo 
seleccionado y de al menos otras cuatro muestras más. 
 Establecer la composición de volátiles presentes en las diferentes 
muestras de propóleos utilizando la técnica de microextracción en 
fase sólida de la fase gaseosa acoplada a cromatografía de gases con 
espectrometría de masas en tiempo de vuelo (HS-SPME-CG-EM-
TOF). 
Desarrollo experimental 
Página 44 
 
4 Desarrollo experimental. 
 
4.1 Material vegetal. 
 
Las muestras de los propóleos estudiados fueron obtenidas en los 
apiarios Acuexcomatl, Trojes, Don Nico, Búho y Valentín ubicados en la 
zona rural del Distrito Federal. La recolección de los mismos se realizó 
2010 por investigadores de la Facultad de Medicina Veterinaria y 
Zootecnia, UNAM. En la Figura 7 y en la Tabla 4 se describe la ubicación 
donde se recolectaron los propóleos analizados. 
 
 
Figura 7. Ubicación gráfica de los apiarios donde 
se colectaron los diversos propóleos analizados. 
 
Tabla 4. Ubicación geográfica de los apiarios. 
 
Apiario Ubicación m.s.n.m*. 
Acuexcomatl 
Poblado de San Luis Tlaxialtemalco 
Xochimilco, D.F. 
2240 
Don Nico Topilejo, Tlalpan, D.F 2410 
Búho 
Poblado de San Pablo Ozotepec, Milpa Alta, 
D.F. 
2420 
Trojes 
Poblado de san Antonio Tecomitl, Delegación 
Milpa Alta, D.F 
2420 
Valentín 
Poblado de San Pedro Atocpan, Milpa Alta, 
D.F. 
2420 
*m.s.n.m: metros sobre el nivel del mar 
Desarrollo experimental 
 Página 45 
 
4.2 Procedimientos generales de análisis. 
 
4.2.1 Análisis cromatográficos. 
 
La cromatografía por adsorción en columna abierta se realizó sobre 
gel de sílice 60 Merck con tamaño de partícula 0.063-0.200mm, 70-230 
mesh ASTM y Sephadex LH-20 (Fluka). Los análisis cromatográficos en 
capa fina (CCF) de tipo analítica o preparativa se realizaron según las 
técnicas convencionales, utilizando diversos sistemas de elución y placas 
de aluminio y/o de vidrio de diversas dimensiones, las cuales están 
recubiertas con gel de sílice (60F254 Merck ®, tamaño de partícula 0.063-
0.200mm, 70-230 mesh ASTM) de 0.25 mm de espesor. Las placas fueron 
reveladas con vainillina sulfúrica, seguido de calentamiento 
(aproximadamente 110 ° C) hasta la visualización completa. Cabe destacar 
que antes de ser reveladas, dichas placas fueron visualizadas a dos 
longitudes de onda (254 y 365 nm). 
 
4.2.2 Determinación de las constantes espectroscópicas y 
espectrométricas de los compuestos aislados. 
 
La determinación de las constantes espectroscópicas y 
espectrométricas se realizó en la Unidad de Servicio de Apoyo a la 
Investigación (USAI) de la Facultad de Química, UNAM. Los espectros de 
masas generados por la técnica de impacto electrónico (EM/IE) se 
determinaron en un espectrómetro Thermo Electron DFS (Double Focus 
Sector) introducción directa a 70 eV. Los espectros de Resonancia 
Magnética Nuclear Protónica (RMN-1H) y de Carbono 13 (RMN-13C) se 
generaron en un equipo marca Varian, modelo VNMRS el cual se operó a 
una radiofrecuencia de 400 y 100 MHz, respectivamente. Los espectros se 
registraron utilizando CDCl3, MeOH-d4, DMSO-d6 y acetona-d6 y los 
Desarrollo experimental 
Página 46 
 
desplazamientos químicos se reportan en ppm referidas al tetrametilsilano 
(TMS). 
 
4.3 Cromatografía de líquidos de alta eficiencia. 
 
La cromatografía de líquidos de alta eficiencia se realizó en un 
cromatógrafo Shimadzu modelo 10 AVP equipado con un detector UV dual. 
El control del equipo, la adquisición de los datos, el procesamiento y la 
manipulación de la información se realizaron utilizando el programa de 
software LC-solution versión 1.22 SP1. Los perfiles cromatográficos se 
registraron empleando una columna Purospher® STAR RP-18, con un 
tamaño de partícula de 5 µm, 4.6 mm de diámetro interno y 15 cm de 
longitud para los propóleos de los apiarios de Valentín y Don Nico, 
mientras que para los propóleos de Acuexcomatl, Búho y Trojes se utilizó 
una columna Waters, X-bridge C18, con un tamaño de partícula de 5 µm, 
4.6 mm de diámetro internoy 5 cm de longitud. La detección se ajustó a 
290 y 254 nm. 
 
4.3.1 Identificación de la presencia de pinocembrina. 
 
La identificación de pinocembrina en los extractos de los propóleos se 
realizó mediante la comparación de los tiempos de retención y la 
absorbancia del estándar con las señales presentes en el cromatograma 
obtenido con el extracto. Para ello, se prepararon las disoluciones de los 
extractos y del estándar a una concentración de 1 mg/mL en etanol. La 
fase móvil utilizada consistió en una mezcla binaria de MeOH/(H2O:TFA 
0.1%) en proporción 55:45. El flujo de la fase móvil fue de 1.0 mL/min, el 
volumen de inyección de 10 µL y una temperatura de 25 °C. 
 
 
Desarrollo experimental 
 Página 47 
 
4.3.2 Cuantificación de la pinocembrina. 
 
Para la cuantificación de pinocembrina presente en los extractos 
etanólicos de los propóleos se prepararon las disoluciones de cada extracto 
a una concentración de 2 mg/mL para los propóleos “Acuexcomatl”, “Don 
Nico”, “Trojes” y “Valentín”, mientras que para el propóleo “Búho” la 
concentración del extracto fue de 1 mg/mL. Las condiciones 
cromatográficas fueron las mismas que se describen en el punto 4.3.1 
excepto para los propóleos de Valentín y Don Nico. En este caso, la fase 
móvil consistió en una mezcla ternaria compuesta por 
MeOH/ACN/(H2O/TFA 0.1%) en proporción 30:20:50. Para cada sistema 
se realizó una curva de calibración de pinocembrina con seis niveles de 
concentración (5, 10, 25, 50, 100 y 150 µg/mL). 
 
4.4 Cuantificación del contenido de fenoles totales. 
 
La cuantificación del contenido de fenoles totales se realizó utilizando 
el método descrito por Singleton y Rossi (1965) con ligeras modificaciones. 
En el tubo de reacción se adicionaron 100 µL de solución metanólica de las 
muestras a analizar (1 mg/mL), 800 µL de agua y 100 µL de reactivo Folin-
Ciocalteu (1:1). Se agitó y se dejó en reposo por 8 minutos. Posteriormente, 
se adicionaron 50 µL de Na2CO3 al 20%. Por último, se incubó por una 
hora en ausencia de luz y se midió la absorbancia a 760 nm en un 
espectrofotómetro Beckman Coulter D4® 530 Life science UV/VIS. 
 
Con la finalidad de expresar los resultados como equivalentes de 
ácido gálico (mg de ácido gálico/g de muestra), se construyó una curva de 
calibración en un intervalo de concentración entre 10-200 µg/mL. En 
todos los casos, se realizaron tres réplicas independientes y los resultados 
se muestran como el promedio de las determinaciones ± desviación 
estándar. 
Desarrollo experimental 
Página 48 
 
4.5 Cuantificación del contenido de flavonoides totales. 
 
El contenido de flavonoides totales se calculó utilizando la 
metodología descrita por Kumazawa y colaboradores (2004). El ensayo se 
realizó en una placa de 96 pozos. Para ello, se colocaron 100 µL de la 
solución muestra (1 mg/mL) y se adicionaron 100 µL de la solución 
etanólica de AlCl3 al 2%. Después de una hora de incubación a 
temperatura ambiente se midió, la absorbencia a 420 nm en un lector de 
Elisa Labsystem Multiskan® MCC/340. 
 
 El contenido de flavonoides totales fue calculado como equivalentes 
de quercetina (mg de quercetina/g de muestra) a partir de una curva de 
calibración realizada con este compuesto, en un intervalo de concentración 
de 10-60 µg/mL. Las evaluaciones de cada muestra se realizó por 
triplicado y los resultados se expresaron como el promedio de las 
determinaciones ± desviación estándar. 
 
4.6 Evaluación de la actividad antioxidante. 
 
4.6.1 Actividad inhibidora del radical libre 2,2-difenil-1-picril 
hidrazilo (DPPH˙). 
 
La actividad antioxidante de las muestras se evaluaron mediante la 
capacidad atrapadora del radical DPPH˙ utilizando la metodología descrita 
por Rojano y colaboradores (2008) con algunas modificaciones. El ensayo 
se realizó en una placa de 96 pozos. Se colocaron 100 µL de solución de 
cada muestra (1 mg/mL) y, posteriormente, se adicionaron 100 µL de 
solución etanólica de DPPH. 0.208 mM. La absorbancia fue medida 
después de incubar a temperatura ambiente por un periodo de 20 min a 
515 nm en un lector de Elisa Labsystem Multiskan® MCC/340. Los 
resultados fueron convertidos a porcentaje de inhibición y expresados 
Desarrollo experimental 
 Página 49 
 
como equivalentes de Trolox por miligramo de muestra (mMTrolox/g muestra), 
de acuerdo con una curva de calibración realizada con el antioxidante 
comercial Trolox en un intervalo de 3.2 a 200 mMtrolox. 
 
4.6.2 Actividad inhibidora del radical 2,2’-azino-bis-(3-
etilbenzotiazolina)-6 sulfonato de amonio (ABTS˙+). 
 
La capacidad atrapadora del radical ABTS•+ de las muestras se midió 
empleando el método de Kriengsak y colaboradores (2006) con ligeras 
modificaciones. El radical ABTS˙+ se generó por reacción de oxidación de 
una solución 7mM de ABTS con una solución 2.45 mM de persulfato de 
potasio. La solución resultante se conservó en ausencia de luz por 12 
horas antes de su uso. Posteriormente, esta solución se diluyó con MeOH 
hasta obtener una absorbencia inicial de al menos 0.70 a 734 nm. Para 
realizar el bioensayo se colocaron 20 µL de solución de cada muestra (1 
mg/mL) en cada pozo. Posteriormente, se adicionaron 180 µL de la 
solución con el radical ABTS•+ ajustada a una absorbancia de 0.70. La 
absorbancia final se midió a 700 nm después de 6 minutos de incubación 
a temperatura ambiente. Se construyó una curva de calibración de Trolox 
como estándar en un intervalo de 12.8 a 500 mMtrolox y los resultados se 
expresaron en equivalentes de Trolox por miligramo de muestra (mMTrolox/g 
muestra). 
 
4.6.3 Medida de la capacidad reductora: Ensayo FRAP. 
 
La evaluación de la actividad reductora se realizó siguiendo el método 
de Strain (1996) con modificaciones. Para realizar la determinación se 
adicionaron a cada pozo 20 µL de la solución de propóleo (1 mg/mL), 180 
µL del reactivo FRAP (2.5 mL de solución 2,4,6-tripiridil-S-triazina 10 mM 
en HCl 40 mM, 2.5 mL de FeCl3 20 mM y 25 mL de buffer acetato 300 mM 
a un pH de 3.6). La mezcla resultante se incubo durante 30 minutos a 
Desarrollo experimental 
Página 50 
 
temperatura ambiente; al término de este proceso se registró la 
absorbancia a 593 nm. La capacidad reductora se expresó como capacidad 
antioxidante en equivalentes de ácido ascórbico (mMácido ascórbico/gmuestra) de 
acuerdo a una curva de calibración de ácido ascórbico realizada en un 
intervalo 10 a 1500 mM. 
 
4.7 Evaluación de la actividad antibacteriana. 
 
4.7.1 Microorganismo de prueba. 
 
Para realizar la determinación del efecto de los extractos y 
compuestos aislados sobre el crecimiento bacteriano se utilizó como 
microorganismo de prueba a la bacteria cariogénica Streptococcus mutans 
(ATCC 10499). 
 
4.7.2 Determinación de la concentración mínima inhibitoria 
(CMI). 
 
El efecto de los compuestos y los extractos etanólicos sobre el 
crecimiento de la bacteria Streptococcus mutans se determinó utilizando el 
método de microdilución en placa de 96 pozos. La cepa de S. mutans 
utilizada se conservó en glicerol a -64°C a partir del cultivo original ATCC. 
Para reactivar la cepa, se incubó un inóculo de la bacteria original 
criopreservada por 24 h en caldo infusión cerebro-corazón (BHI, por sus 
siglas en inglés). En seguida, se resembraron las bacterias que crecieron 
utilizando de nueva cuenta caldo BHI y se incubó por 4 horas. 
Posteriormente, la suspensión celular se ajustó a 2 en la escala de Mc. 
Farland correspondiente a una concentración de 1×106 UFC/mL utilizando 
un espectrofotómetro Agilent, modelo 8453E. El valor de CMI se definió 
como la concentración mínima del compuesto o extracto de prueba que 
limitaba la turbidez a menos de 0.05 A660 nm. 
Desarrollo experimental 
 Página 51 
 
4.7.3 Procedimiento general del ensayo. 
 
En los 96 pozos de la placa se colocaron 100 µL del medio de cultivo. 
Posteriormente, se adicionaronen la línea A 100 µL de la muestra (2.0 
mg/mL) y se realizaron diluciones seriadas transfiriendo 100 µl de línea en 
línea (A-H) desechando los últimos 100 µL. Como paso siguiente se 
agregaron 80 µL de medio de cultivo enriquecido con 1% de sacarosa e 
inmediatamente se adicionaron 20 µL de la bacteria S. mutans (1×106 
UFC/mL). Como controles se utilizaron: el medio de cultivo inoculado con 
la bacteria de prueba (control negativo), el medio sin inocular (control de 
esterilidad) y el medio de cultivo con inóculo y disolvente (control de 
disolvente) y el medio con inóculo y gluconato de clorhexidina al 0.12% 
como muestra (control positivo) (Tabla 5). Las placas fueron incubadas 
durante 24 horas a 37°C en una incubadora Labnet 211DS. Por último se 
leyeron en una lectora de placas de Elisa a 660 nm para determinar su 
CMI. Las determinaciones se realizaron por triplicado. 
 
Tabla 5. Testigos utilizados en el ensayo biológico, para determinar la CMI. 
 
Control 
Medio de 
cultivo 
Compuesto de prueba 
Control de 
disolvente 
Con inóculo Agua-DMSO (1mL:100µL) 
Control negativo Con inóculo Medio BHI 
Control de 
esterilidad 
Sin inóculo Medio BHI 
Control positivo Con inóculo 
Gluconato de clorhexidina (CHX) al 
0.12% 
Desarrollo experimental 
Página 52 
 
4.8 Microextracción en fase sólida de la fase gaseosa acoplada a 
cromatografía de gases con espectrometría de masas en tiempo 
de vuelo (HS-SPME-CG-EM-TOF). 
 
4.8.1 Microextracción. 
 
La microextracción se realizó empleando fibras de 50/30 µm de 
divinilbencen-carboxen-polidimetilsiloxano (DVB/CAR/PDMS), 100 µm de 
polidimetilsiloxano (PDMS) y 75 µm de divinilbencen-polidimetilsiloxano 
(DVB/PDMS). Las fibras se activaron siguiendo las instrucciones del 
fabricante (Supelco). 
 
Para cada extracción se emplearon aproximadamente 200 mg de cada 
propóleos, 5 mL de agua y 20 mg de NaCl. Cada muestra se colocó por 
separado en un vial de 40 mL con séptum de politetrafluoroetileno (PTFE). 
Posteriormente, cada vial fue sometido a agitación a una temperatura de 
45-50°C y la fibra para la microextracción se expuso en la fase gaseosa del 
vial para la sorción de los analitos durante 45 minutos. Una vez 
transcurrido este tiempo, se retiró la fibra del vial y se introdujo en el 
inyector del cromatógrafo por 3 minutos para su desorción y su análisis. 
Para evitar cualquier sesgo experimental en el análisis, el proceso se 
realizó por triplicado para cada muestra y para cada una de las fibras. 
 
4.8.2 Cromatografía de gases-Espectrometría de masas (CG-EM). 
 
Para la realización del análisis se empleó el espectrómetro de masas 
marca LECO, modelo Pegasus 4D, acoplado a un cromatógrafo de gases 
Agilent, modelo Agilent 6890N equipado con una columna capilar DB-5 
(5%fenil-polimetilsiloxano de 10 m × 0.18 mm x 0.18µm). La temperatura 
del inyector se mantuvo a 300°C; utilizando como gas acarreador Helio 
(Praxair, 5.0) a una velocidad lineal de 1 mL/min (medido a 250°C). La 
Desarrollo experimental 
 Página 53 
 
temperatura del horno se programó a 40°C (durante 1 minuto) y se 
incrementó la temperatura a 20°C/min hasta los 300°C durante 5 
minutos. Las inyecciones fueron realizadas mediante el modo de inyección 
“split” (1:20). 
 
La ionización se llevó a cabo mediante impacto electrónico a 70eV; la 
temperatura de la cámara de ionización fue de 200°C y la de la línea de 
transferencia de 250°C. Se programó una velocidad espectral de 20 
espectros/seg. El barrido de masas fue de 33-400 uma (unidad de masa 
atómica). En la Tabla 6 se resumen las condiciones bajo las cuales las 
muestras fueron preparadas y analizadas. 
 
4.8.3 Obtención del índice de concentración (Fij). 
 
El coeficiente Fij se obtuvo realizando el procedimiento del inciso 
4.8.1 para cada una de las fibras. Este índice fue introducido inicialmente 
por Zuba et al., (2002) y fue modificado posteriormente por Hamm et al. 
(2003) de la siguiente manera: 
 
 
 
Dónde: Fij es el índice de la capacidad de concentración de la fibra j 
para los analitos i, k es el número de fibras empleadas y, Hij el área o pico 
del analito i para la fibra j. 
 
 
 
 
Desarrollo experimental 
Página 54 
 
Tabla 6. Resumen de las condiciones de preparación y análisis de las 
muestras mediante HS-SPME-CG-EM-TOF. 
 
Parámetro Condición 
P
re
p
a
ra
ci
ó
n
 d
e
 l
a
 m
u
e
s
tr
a
 Técnica de preparación de la 
muestra 
Microextracción en fase sólida en la fase gaseosa 
(HS-SPME) 
Microfibra utilizada 
2cm 50/30µm DVB/CAR/PDMS 
Marca Supelco Lote P340030 No. Cat. 573-48-U. 
Tiempo de exposición de la fibra 45 minutos 
Temperatura de la muestra 45-50°C (baño de agua) 
Posición de la fibra en la extracción En fase gaseosa (Headspace) 
Tiempo de sorción en el inyector 3 minutos 
A
n
á
li
s
is
 d
e
 l
a
 m
u
e
s
tr
a
 
Marca y modelo del equipo LECO Pegasus 4D 
Técnica analítica CG-EM-TOF 
Temperatura del inyector 300°C 
Cromatógrafo de gases Agilent 6890N 
Columna capilar (fase) DB5 10m x 0,18mm dii x 0,18µm 
Programación de la temperatura del 
horno 
40°C (1 minuto), 20°C/minuto hasta 300°C (5 
minutos) 
Tipo de inyección Split (con división de flujo) 1:20 
Gas acarreador Helio, Praxair, grado 5.0 (Ultra Alta Pureza) 
Flujo del gas acarreador 1 mL/minuto 
Temperatura de la línea de 
transferencia 
250°C 
Tipo de ionización Ionización electrónica (IE) 
Analizador másico Tiempo de vuelo (TOF) 
Velocidad de adquisición espectral 20 espectros/segundo 
Retraso/encendido del filamento 0 minutos 
Intervalo masas 45-400u 
Temperatura de la cámara de 
ionización 
200°C 
Compuestos de calibración Perfluoroterbutilamina (PFTBA) 
 
Desarrollo experimental 
 Página 55 
 
4.8.4 Identificación de los compuestos volátiles. 
 
La identificación de los compuestos volátiles se realizó por medio de la 
comparación de sus espectros de masas y de sus índices de retención con 
los reportados en la biblioteca electrónica NIST (Instituto Nacional de 
Estándares y Tecnología) y en la biblioteca Wiley Versión 2.0. 
 
4.9 Estudio fitoquímico biodirigido del propóleo obtenido en el 
apiario de “Acuexcomatl”. 
 
4.9.1 Preparación del extracto. 
 
El material vegetal (200 g) se sometió a una extracción por 
maceración a temperatura ambiente utilizando 1000 mL de etanol por un 
período de 48 horas. Posteriormente, el extracto obtenido se filtró al vacío y 
se recuperó el disolvente a presión reducida para finalmente obtener 85.4 
g del extracto total. 
 
4.9.2 Fraccionamiento primario del extracto etanólico. 
 
El extracto etanólico se sometió a un proceso de fraccionamiento 
utilizando un método de partición líquido-líquido. Para ello, el extracto 
etanólico se suspendió en 700 mL de metanol-agua (95:5) y 
posteriormente, se sometió a un proceso de reparto utilizando 
secuencialmente hexano (300 mL  3) y acetato de etilo (AcOEt, 300 mL  
3). Las particiones resultantes fueron concentradas a presión reducida. 
Este proceso condujo a la obtención de las fracciones primarias F-Hex, F-
AcOEt y F-MeOH. 
 
 
Desarrollo experimental 
Página 56 
 
4.9.3 Fraccionamiento secundario. 
 
Los 58.0 g de la fracción F-AcOEt se sometieron a un segundo 
fraccionamiento vía cromatografía en columna abierta sobre 500 g de gel 
de sílice. El proceso de elución se llevó a cabo con CH2Cl2 y se incrementó 
gradualmente con acetona. Se colectaron 95 fracciones de 500 mL cada 
uno y se reunieron aquellas que resultaron ser cromatograficamente 
similares. De esta forma se generaron 14 fracciones combinadas (F-A a F-
N). En el Tabla 7 se resume este proceso. 
 
Tabla 7. Resumen del fraccionamiento secundario mediante 
cromatográfica en columna abierta de la fracción F-AcOEt. 
 
Fase móvil 
Proporción 
(%) 
Fracciones 
Fracciones 
combinadas 
Clave 
CH2Cl2 100 1-10 1 F-A 
CH2Cl2-
Acetona 
99:1 11-25 2 F-B 
98:2 26-33 3-10 F-C 
97:3 34-41 11-12 F-D 
95:5