Descarga la aplicación para disfrutar aún más
Vista previa del material en texto
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE CIENCIAS ESTUDIOS DE LOS EFECTOS DE LA DEFICIENCIA DE BIOTINA SOBRE LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN DE LA INSULINA EN UN CULTIVO DE UNA LÍNEA CELULAR DE MÚSCULO T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: B I O L O G A P R E S E N T A : SONIA VARGAS CHÁVEZ DIRECTOR DE TESIS: DR. DANIEL D. ORTEGA CUELLAR 2014 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo ii HOJA DE DATOS DEL JURADO 1. Datos del alumno Vargas Chávez Sonia 01 59 39 14 20 17 Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Ciencias Biología 305161697 2. Datos del tutor Dr Daniel Dagoberto Ortega Cuellar 3. Datos del sinodal 1 Dra Rocio Salceda Sacanelles 4. Datos del sinodal 2 Dr Adolfo Andrade Cetto 5. Datos del sinodal 3 Dr Saúl Gómez Manzo 6. Datos del sinodal 4 Dra Liliana Carmona Aparicio 7. Datos del trabajo escrito Estudios de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la insulina en un cultivo de una línea celular de músculo. 53 p. 2014 Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo iii El presente trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) con el contrato 166857 correspondiente al proyecto “Estudio de los efectos genéticos y metabólicos del déficit energético en la privación de biotina y de sus mecanismos”, y por la Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica de la Universidad Nacional Autónoma de México (PAPIIT) con el contrato IN206011- 3 correspondiente al proyecto “Estudio de los mecanismos por los que la deficiencia de biotina afecta la sensibilidad a insulina”. Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo iv AGRADECIMIENTOS ““NNoo eess ssuuffiicciieennttee ssaabbeerr lloo qquuee hhaayy qquuee ddeecciirr,, ttaammbbiiéénn hhaayy qquuee ssaabbeerr ccóómmoo ddeecciirrlloo”” Aristóteles Por fin los agradecimientos. Las primeras páginas que leerán los lectores, pero las últimas que he escrito. El trabajo está hecho, y ya sólo queda dejar constancia de todo lo que debo a tanta gente. Por ello agradezco: A la Universidad Nacional Autónoma de México, por darme las herramientas para forjarme profesionalmente y crecer como persona; por ser mi alma mater. Al director de ésta tesis, Dr. Daniel Ortega Cuellar, por todas sus enseñanzas y consejos, pero sobre todo por su inigualable amistad. Al Dr. Antonio Velázquez Arellano, de la Unidad de Genética de la Nutrición del Instituto de Investigaciones Biomédicas - UNAM, por permitirme llevar a cabo éste trabajo en su laboratorio, además de todo el apoyo brindado durante mi estancia en la Unidad. A la Dra. Ma. Del Refugio García Villegas, del Dpto. de Fisiología, Biofísica y Neurociencias del CINVESTAV - IPN, por haberme facilitado la línea celular L6, modelo de estudio del presente trabajo. A la Dra. Laura Berrón Ruiz, de la Unidad de Investigación en Inmunodeficiencias del Instituto Nacional de Pediatría, por el apoyo y asesoría brindados para la realización de la citometría de flujo aquí empleada. Al M. en C. Alain de Jesús Hernández Vázquez, por todo el apoyo técnico proporcionado durante la realización de ésta tesis y durante mi estancia en el laboratorio. A Alicia Beltrán Langarica, del Dpto. de Biología Celular del CINVESTAV - IPN, por enseñarme a realizar cultivo celular. Al jurado de ésta tesis: Dra. Liliana Carmona, Dra. Rocío Salceda, Dr. Adolfo Andrade y Dr. Saúl Gómez, por sus revisiones, observaciones y comentarios para la mejora de éste trabajo. Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo v A título personal, quiero agradecer a las personas que me han acompañado en este camino, el mejor de mi época de “estudiante”. No es posible nombrarlas a todas, por lo que espero me perdonen aquellos a los que no pueda poner en estas líneas. Nuevamente agradezco a Daniel, por haberme aceptado como alumna, pero sobre todo como amiga; a Alain, Ana, Fany, Liz, Lucy y José, por su alegría, por apoyarme y enseñarme en los comienzos; a Atza, Gemma, Leo, Lupita, Magda y Moni, que aunque su estancia en el laboratorio fue corta, también formaron parte de mis días en el lab. A mis amigos y compañeros de la facultad, sobre todo a Andrea, Adri, Irazú, César Ramiro y ustedes mis queridos “rockancheros”, ya que han sido mi familia durante la mayor parte de éste trabajo, y siguen formando parte importante en mi vida. Celene, Christian, Dan y Luis, fui la última, pero ¡lo logré! Y como una Tesis no sólo se hace en el laboratorio y/o la facultad, debo dar las gracias también a mi familia por sus ánimos y por aguantar mi mal humor. Gracias a mis padres por su apoyo incondicional, por su amor y su paciencia; a mis hermanos y hermana porque, lo sepan o no, muchas veces me impulsaron a seguir adelante. También quiero agradecer a mis viejos amigos (especialmente a Karen y Raúl), por el aguante, por quererme tal cual soy y no juzgarme, y por seguir hasta ahora, junto a mí. A mis nuevos amigos (sobre todo a “Los toxi”), porque a pesar de ser nuevos en mi vida, me impulsaron para terminar por fin con éste trabajo y cerrar el círculo. A mi queridísima Facultad de Ciencias, por haber sido mí casa por más de 5 años, pero sobre todo, por regalarme amigos… ¡muchos! A la UNAM, por permitirme formar parte del orgullo azul y oro; desde ahora y para siempre, lo PUMA lo llevo en el corazón. A todos aquellos que me animaron a embarcarme en esta aventura, y a los que me apoyaron una vez estaba en ella. A todos los que me preguntaron una y mil veces cómo iban las cosas, a los que se interesaron por cuándo acababa (o cuándo empezaba), a los que hacían lo que podían por presionar mi perezosa voluntad para avanzar, y a todos los que han comprendido el significado de éstos últimos años. Todos ustedes, familia y amigos, han hecho posible que me sienta razonablemente orgullosa de este trabajo, y porque aunque no entiendan nada de ésta tesis, en cada espacio en blanco hay un ‘los quiero’ para ustedes. ¡¡GRACIAS!! Sonia Vargas Chávez (Sol para los cuates) Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo vi Con todo el amor que tengo, para mi ma’ y mi pa’, sin su apoyo nada de esto sería posible.Éste logro también es suyo, ¡los amo! Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo vii Información del Artículo: Recepción de revisión: 15 Agosto 2013. Aceptado: 30 Abril 2014 Publicado: 6 Mayo 2014 La sensibilidad a la insulina está inversamente relacionada con el estatus de energía celular, según lo revelado por la deficiencia de biotina. Ana Salvador-Adriano1,2*, Sonia Vargas-Chávez1*, Alain de J. Hernández-Vázquez1, Daniel Ortega-Cuellar2,3, Armando R. Tovar4 y Antonio Velázquez-Arellano1. *Contribución en partes iguales a éste trabajo. 1 Unidad de Genética de la Nutrición, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México e Instituto Nacional de Pediatría, México. 2 Instituto Nacional de Pediatría, México. 3 Laboratorio de Nutrición Experimental, México. 4 Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán, México. Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo viii ABREVIATURAS 2DG6P 2-desoxiglucosa-6-fosfato ACC I /II Isoforma 1 o 2 (respectivamente) de la Acetil-CoA carboxilasa Akt Oncogen homologo al timoma viral murino/Proteína Cinasa B AMP Monofosfato de adenosina AMPK Proteína cinasa dependiente de AMP ATP Trifosfato de adenosina BSA Albumina Sérica Bovina CoA Coenzima A Cs+ Ión cesio Def-Bt Deficiencia de biotina DMEM Medio de cultivo Eagle modificado de Dulbecco DTT Ditiotreitol DS Desviación estándar EDTA Ácido etilendiaminotetraacético EGTA Ácido etilenglicol tetraacético FACS Clasificador celular activado por fluorescencia FBS Suero fetal bovino FITC Isotiocinato de fluoresceína G6P Glucosa-6-fosfato G6PDH Glucosa-6fosfato deshidrogenasa GK Glucocinasa Glut-4 Transportador de glucosa 4 GMPc Guanosil monofosfato cíclico HCS Holocarboxilasa sintasa HepG2 Células de hepatoma humano IL Interleucina IRβ Receptor de insulina beta IRS Sustrato del receptor de insulina K+ Ión potasio KCl Cloruro de potasio M (Concentración) Molar MAPK Vía de las proteínas cinasas activadas por mitógenos MCC β-metilcrotonil-CoA carboxilasa mRNA Mensajero del Ácido Ribonucleico mTOR Diana de rapamicina en células de mamífero Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo ix NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido NaPPi Pirofosfato de sodio NF-kB Factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas NH4+ Amonio nM (Concentración) nanomolar PBS Buffer de Fosfatos salino PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida PC Piruvato cinasa PCC Propionil-CoA carboxilasa PDK1 Cinasa dependiente de fosfoinositidos-1 PDVF Difluoruro de polivilideno PEPCK Fosfoenolpiruvato carboxicinasa PFK-I Fosfofructocinasa I PI3K Fosfatidilinositol-3-cinasa PIP2 Fosfatidilinositol-3,4-bifosfato PIP3 Fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato pM (concentración) picomolar pmol Picomoles p-IR Receptor de insulina fosforilado rpm Revoluciones por minuto S6K Proteína S6 cinasa-1 SDS Dodecilsulfato sódico Ser Serina SFB Suero Fetal Bovino SMVT Transportador multivitamínico dependiente de sodio TCA Ciclo de los ácidos tricarboxílicos Thr Treonina Tyr Tirosina Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo x ÍNDICE HOJA DE DATOS DEL JURADO ............................................................................................................ II AGRADECIMIENTOS ......................................................................................................................... IV ABREVIATURAS .............................................................................................................................. VIII ÍNDICE .............................................................................................................................................. X RESUMEN ..........................................................................................................................................1 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................................3 1. BIOTINA .....................................................................................................................................3 1.1. BIOTINA Y CARBOXILASAS ................................................................................................................... 5 1.2. CICLO DE LA BIOTINA .......................................................................................................................... 6 1.3. OTRAS FUNCIONES DE LA BIOTINA......................................................................................................... 8 1.4. PROTEÍNAS PARA EL METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS .......................................................................... 8 1.5. PROTEÍNAS DEPENDIENTES DE BIOTINA ................................................................................................ 10 1.6. OTROS GENES AFECTADOS POR BIOTINA .............................................................................................. 10 1.7. BIOTINA Y METABOLISMO ENERGÉTICO ................................................................................................ 11 2. REVISIÓN BREVE DE ALGUNAS VÍAS DE SEÑALIZACIÓN QUE MODULAN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA .................................................................................................................................... 12 2.1. INSULINA ........................................................................................................................................ 12 2.1.1. VÍA SE SEÑALIZACIÓN DE LA INSULINA .......................................................................................... 13 2.2. PROTEÍNA CINASA DEPENDIENTE DE AMP (AMPK) .............................................................................. 14 3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................................................. 16 4. HIPÓTESIS ................................................................................................................................ 17 5. OBJETIVOS ............................................................................................................................... 17 5.1. GENERAL ........................................................................................................................................ 17 5.2. PARTICULARES ................................................................................................................................ 17 6. MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................................................... 18 6.1. CULTIVO CELULAR ............................................................................................................................ 18 6.2. OBTENCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNA ....................................................................................... 18 6.3. ANÁLISIS DE LA DEFICIENCIA DE BIOTINA .............................................................................................. 19 6.4. ANÁLISIS POR WESTER BLOT DE LAS FORMAS FOSFORILADA Y TOTAL DE IRΒ, IRS, AKT, MTOR, S6K Y AMPK . 20 6.5. TRANSLOCACIÓN DE GLUT-4 POR CITOMETRÍA DE FLUJO ........................................................................ 20 6.6. CAPTACIÓN DE GLUCOSA ..................................................................................................................21 6.7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ...................................................................................................................... 22 7. RESULTADOS ............................................................................................................................ 23 7.1. INDUCCIÓN DE LA DEFICIENCIA DE BIOTINA EN CÉLULAS L6 ...................................................................... 23 7.2. AUMENTO DE LA ACTIVACIÓN DE LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN DE LA INSULINA POR DEPRIVACIÓN DE BIOTINA ...... 25 Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo xi 7.3. LA DEPRIVACIÓN DE BIOTINA AUMENTA LA SENSIBILIDAD DE LA VÍA DE LA INSULINA DEBIDA A LA DISMINUCIÓN DE LA SEÑALIZACIÓN MEDIADA POR LAS PROTEÍNAS MTOR/S6K .................................................................. 29 7.4. LA DEPRIVACIÓN DE BIOTINA AUMENTA LA FOSFORILACIÓN DE AMPK ...................................................... 32 7.5. TRANSLOCACIÓN DE GLUT4 POR CITOMETRÍA DE FLUJO ........................................................................ 33 7.6. EFECTO DE LA DEFICIENCIA DE BIOTINA SOBRE LA CAPTACIÓN DE GLUCOSA ................................................ 34 8. DISCUSIÓN ............................................................................................................................... 35 9. CONCLUSIONES ........................................................................................................................ 38 10. REFERENCIAS. ........................................................................................................................... 39 11. ANEXOS .................................................................................................................................... 42 Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 1 RESUMEN La vitamina biotina es un micronutriente esencial para la sobrevivencia de todos los seres vivos. Antecedentes recientes indican que la deficiencia de biotina afecta el metabolismo energético, en parte por su función de cofactor de las carboxilasas que modifican algunas de las vías del metabolismo intermediario. Algunos estudios proponen que la deficiencia de biotina modifica el nivel energético debido a la disminución del metabolismo oxidativo, el cual es reflejado por la disminución de los niveles de ATP/AMP y el aumento en la actividad de la AMPK, la cual al ser activada farmacológicamente aumenta la sensibilidad a la insulina, así como la captación de glucosa en células de músculo y tejido adiposo. En otros estudios se ha demostrado que la leucina aumenta la sensibilidad a la insulina, posiblemente a través del aumento de la AMPK y por la disminución de la vía de señalización mTOR/S6K. Debido a la similitud entre los efectos que causa la deficiencia de biotina y los de la deficiencia de leucina sobre el metabolismo energético, es plausible sugerir que la deficiencia de biotina también aumenta la sensibilidad a insulina por mecanismos similares. Para determinar si la deficiencia de biotina modifica la vía de señalización de insulina se realizaron cultivos de células de músculo (a partir de la línea celular de mioblastos L6), en un medio de cultivo deficiente de biotina (Def-Bt). Se evaluó la activación de algunas proteínas componentes de la vía de señalización de insulina (IRβ, IRS y Akt) así como proteínas de la vía de señalización mTOR/S6K, por medio de Western blot. Por otra parte, se evaluó, como punto final de la vía de insulina, la translocación del transportador de glucosa Glut-4, por medio de citometría de flujo, así como la captación de glucosa. Se encontró claramente que en las células L6 privadas de biotina (Def-Bt) hay un aumento de la fosforilación (activación) de la vía de señalización de la insulina, además del aumento en la translocación del Glut-4 a la membrana plasmática y el concomitante incremento de la captación de glucosa. Estos efectos concebibles se deben al aumento de la activación de la AMPK y por la disminución de la vía mTOR/S6K. Nosotros proponemos que el aumento en la activación de la AMPK en la Def-Bt, promueve la inhibición mTOR/S6K que a su vez contribuye al aumento de la activación Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 2 de la vía de señalización de insulina, además de aumentar la captación de glucosa. En suma el déficit energético por la biotina puede ser similar al de la leucina, cuya limitación conduce a un aumento de la sensibilidad a la insulina. Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 3 INTRODUCCIÓN Los micronutrientes son factores dietéticos esenciales requeridos por los seres humanos debido a su importante papel sobre el metabolismo central, modulando vías bioquímicas y procesos metabólicos que mantienen la función celular. Entre éstos se encuentran aquellos considerados elementos traza (cromo, cobre, manganeso, selenio y zinc), minerales esenciales (incluyendo calcio, yodo, hierro y magnesio), vitaminas solubles en agua, tales como la biotina (vitamina B7), tiamina (vitamina B1), riboflavina (vitamina B2), niacina (vitamina B3), ácido fólico (vitamina B9), piridoxina (vitamina B6), ácido pantoténico (vitamina B5), cobalamina (vitamina B12) y vitamina C, además de las vitaminas solubles en grasa: retinol, calciferol, tocoferol y fitomenadiona (vitaminas A, D, E y K, respectivamente). Debido al avance en el conocimiento del genoma humano, ahora se ha podido establecer que los micronutrientes también modulan la transcripción de genes que pueden estar implicados en enfermedades humanas. Se ha considerado que uno de los principales efectos que causan el déficit de micronutrientes es el daño oxidativo que importantemente contribuye al desarrollo de las enfermedades crónicas tales como cáncer o enfermedades del corazón (Weber, Stuetz et al. 2013). Por lo tanto, es indispensable desarrollar métodos eficaces para la detección de los niveles de micronutrientes que permitan prevenir sus deficiencias. El presente trabajo se enfocará al estudio de la biotina y su relación con vías que contralan su utilización. 1. BIOTINA La vitamina hidrosoluble biotina o también conocida como vitamina H o B7, es un micronutriente esencial que coadyuva al mantenimiento de la homeostasis metabólica y el crecimiento celular (Zempleni 2005). Su descubrimiento se debió a la observación de que el consumo de la clara de huevo cruda era tóxica para los humanos y ésta toxicidad se podía evitar por una sustancia, entonces no conocida, que está presente en la yema de huevo (Williams and Cline 1936). En 1936, Kogl y Tonnis (Kogl 1936) reportaron el descubrimiento y la identificación de un factor presente en la yema de Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 4 huevo, que resultó ser la biotina. Posteriormente se demostró que la toxicidad de la clara de huevo se debía al alto contenido de una proteína llamada avidina, que esencialmente se une de manera covalente a la biotina y evita su absorción provocando deficiencia de la vitamina (Eakin, McKinley et al. 1940). Subsecuentemente, en 1942 Du Vigneaud (du Vigneaud 1942) determinó la estructura química de la biotina (figura 1) que consiste de dos anillos fusionados, uno llamado imidazol (ureido) y otro de tetrahidrotiofeno, que contiene un átomo de azufre, ésteanillo tiene unida una cadena lateral compuesta por cinco carbonos denominada ácido valérico y que termina en un grupo carboxilo. Su peso molecular es de 244.31 g/mol; es soluble en agua, etanol y álcalis diluidos (du Vigneaud 1942). A finales de la década de los 40, Henry Lardy y colaboradores descubrieron su función en el metabolismo, es decir, que la biotina se requiere para llevar acabo reacciones de carboxilación (Lardy and Peanasky 1953). Una década más tarde, Salih Wakil y colaboradores descubrieron que la biotina está unida covalentemente a la acetil coA carboxilasa (Wakil, Titchener et al. 1958), demostrando que la biotina es un cofactor esencial para la catálisis enzimática, y ahora está bien establecido que la función biológica primaria de la biotina es servir como un cofactor enzimático para la transferencia de dióxido de carbono (C02) a enzimas que participan en reacciones de carboxilación importantes para el metabolismo intermediario (Moss and Lane 1971). Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 5 Figura 1. Estructura de la D-biotina. La vitamina biotina consiste de dos anillos fusionados, imidazol y tetrahidrotiofeno, éste último contiene un átomo de azufre y tiene unida una cadena lateral compuesta por cinco carbonos denominada ácido valérico y que termina en un grupo carboxilo. 1.1. BIOTINA Y CARBOXILASAS Las carboxilasas son enzimas que utilizan a la biotina como cofactor. Estas proteínas se descubrieron por primera vez hace más de 50 años y se han estudiado intensamente debido a sus funciones metabólicas importantes. La relación entre la biotina y las carboxilasas se estableció debido a la unión covalente que existe entre la vitamina y un residuo de lisina de las carboxilasas. En mamíferos existen cinco carboxilasas con diversas funciones biológicas. La acetil-CoA carboxilasa I y II (ACC I, II) participan en el metabolismo de ácidos grasos. Específicamente la ACC I, es citosólica y convierte la acetil-CoA a malonil-CoA que sirve como sustrato para la Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 6 síntesis de ácidos grasos en la mayor parte de los seres vivos. La ACC II es la isoforma mitocondrial y el malonil-CoA producido tiene la función de inhibir la actividad del trasportador de grupos acilo (carnitin palmitoil transferasa 1). La actividad de ambas isoformas es estimulada por citrato y son inhibidas por fosforilación, especialmente por la cinasa dependiente de AMP, AMPK (Fediuc, Gaidhu et al. 2006). La piruvato carboxilasa (PC) es una enzima que participa en la gluconeogénesis, y cataliza la reacción que convierte el piruvato a oxaloacetato, un intermediario del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Esta enzima es mitocondrial y se ha propuesto que participa de manera importante en la secreción de insulina (Xu, Han et al. 2008); la propionil-CoA carboxilasa (PCC) cataliza la conversión de propionil-CoA a metilmalonil-CoA. En la mayoría de los organismos es crucial para el catabolismo de aminoácidos de cadena ramificada (valina, isoleucina, metionina, treonina) y para la oxidación de ácidos grasos de cadena impar. Su ubicación es mitocondrial y se activa por cationes monovalentes como K+, NH4 + y Cs+ (Edwards and Keech 1968). Finalmente la β-metilcrotonil-CoA carboxilasa (MCC), que también es mitocondrial, convierte al 3-metilcrotonil-CoA a 3- metilglutaconil-CoA, que es esencial para el metabolismo de la leucina e isovalerato (Edwards and Keech 1968). 1.2. CICLO DE LA BIOTINA Los mamíferos obtienen biotina de fuentes exógenas como la dieta, sin embargo la mayor parte de ésta se encuentra unida a proteínas, por lo que, su biodisponibilidad es muy baja y ponen en riesgo la homeostasis metabólica de los organismos. Para cumplir con el requerimiento de biotina, los mamíferos tienen un ciclo de recuperación de la vitamina (figura 2), que les permite tener las concentraciones óptimas dentro de la célula (McMahon 2002; Pacheco-Alvarez, Solorzano-Vargas et al. 2002; Wolf 2008). Brevemente, el ciclo de reciclaje de la biotina inicia con la liberación de la vitamina de las proteínas mediante la biotinidasa, una enzima que hidroliza la unión entre el residuo de lisina y la carboxilasa, posteriormente la biotina libre se une a un grupo ε-amino de un residuo de lisina de la carboxilasa, ésta reacción es catalizada por la enzima holocarboxilasa sintasa (HCS). Al término de su vida media, las carboxilasas son degradadas Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 7 proteolíticamente en el sistema autofágico lisosomal (Wolf, 2012) produciendo péptidos de biocitina (Wallace, Jitrapakdee et al. 1998), y biotina libre para que reinicie el ciclo de biotina y activar a las carboxilasas (figura 2). Figura 1. Ciclo de reciclaje de la biotina. La biotina ingerida de la dieta se hace biodisponible mediante su reciclaje a través del ciclo de biotina. En el ciclo, la biotina libre se une a las carboxilasas (PC, ACC, PCC y MCC) mediante la HSC. Después de realizar su función metabólica, las carboxilasas son degradadas por proteasas que generan péptidos denominados biocitina. La biocitina es escindida por la enzima biotinidasa para producir biotina libre y lisina. PC: piruvato carboxilasa. ACC: Acetil-CoA carboxilasa. PCC: Propionil CoA carboxilasa y MCC: 3-metilcrotonil CoA carboxilasa. HCS: Holocarboxilasa sintasa Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 8 1.3. OTRAS FUNCIONES DE LA BIOTINA Además de su acción como grupo prostético de las carboxilasas, existe cada vez más evidencia que indica que la biotina interviene en otras funciones biológicas. Se ha encontrado que la biotina afecta la diferenciación tisular, el desarrollo embrionario y el crecimiento celular (Bonjour 1985; Watanabe and Endo 1990; Watanabe 1996; Zempleni, Helm et al. 2001), la maduración de linfocitos (Baez-Saldana, Diaz et al. 1998; Baez-Saldana and Ortega 2004) la diferenciación de los túbulos seminíferos y la espermiogénesis (Paulose, Thliveris et al. 1989), el metabolismo de los carbohidratos y lípidos (Vilches-Flores and Fernandez-Mejia 2005), y la expresión genética (Chauhan and Dakshinamurti 1991). Este efecto dual de la biotina es similar al de otras vitaminas, como la vitamina A y la D, las cuales son capaces de intervenir directamente en el metabolismo y afectar la expresión de los genes (Balmer and Blomhoff 2002; Christakos, Dhawan et al. 2003). Específicamente, la vitamina A, es capaz de intervenir como retinol en procesos de visión y a su vez como reguladora de la expresión génica. Por otra parte, varios estudios proponen que la biotina puede participar en la regulación de la expresión génica (Wiedmann, Rodriguez-Melendez et al. 2004). Si bien las bases bioquímicas de ésta regulación apenas comienzan a ser dilucidadas, las evidencias sobre la biotina como modulador de la expresión genética se conocen desde finales de la década de los 60 (Dakshinamurti and Cheah-Tan 1968). A continuación se realiza una descripción de las proteínas que son modificadas por la concentración de biotina intracelular. 1.4. PROTEÍNAS PARA EL METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS Estudios de Dakshinamurti (Dakshinamurti and Li 1994) sobre el efecto que causa la deficiencia de biotina en enzimas involucradas en el metabolismo de carbohidratos, como la glucocinasa (GK), indican que la deficiencia de la vitamina disminuye su actividad específica entre un 40-45 % respecto al control y que el efectose revirtió al administrar dosis farmacológicas de biotina al incrementar su actividad a niveles aún mayores que el control (Dakshinamurti and Cheah-Tan 1968). En un trabajo posterior también Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 9 se demostró que el efecto se observa a nivel de su trascripción, ya que la vitamina aumentó hasta 4 veces la expresión del ácido ribonucleico mensajero (mRNA) en ratas en ayuno, estos resultados indican que existe una correlación entre el aumento del mRNA con la actividad de la enzima (Chauhan and Dakshinamurti 1991). Resultados similares se obtuvieron en cultivos de hepatocitos e islotes pancreáticos (Spence and Koudelka 1984; Romero-Navarro, Cabrera-Valladares et al. 1999). Además se evidenció que a una concentración de 10-6 M la biotina fue capaz de incrementar los niveles del segundo mensajero guanosil monofosfato cíclico (GMPc), sugiriendo que los efectos de la biotina sobre la GK están mediados por los niveles intracelulares del GMPc (Spence, Merrill et al. 1981). Otra enzima importante en el metabolismo de la glucosa es la fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PEPCK) que participa en la gluconeogénesis y es considerada una de las enzimas limitantes para esta vía metabólica. En condiciones de ayuno o en animales diabéticos, ésta proteína se expresa abundantemente y por el contrario en condiciones posprandiales o con una dieta rica en carbohidratos, su expresión disminuye hasta ser casi imperceptible (Ballard and Hopgood 1973). Estudios realizados en ratas diabéticas indicaron que la expresión del mRNA de la PEPCK aumentó hasta 10 veces en comparación al control, y que la administración de biotina la disminuyó; estos resultados sugieren que la biotina tiene efectos negativos sobre la expresión de la PEPCK (Dakshinamurti and Li 1994). De manera similar a la GK y PEPCK, la PC y la fosfofructocinasa I (PFK-I) modifican su actividad enzimática en respuesta a la administración de biotina (Dakshinamurti and Ho Chong 1970). En ratas diabéticas la actividad enzimática de la PC se encontró disminuida en un 70 %, y la adición de biotina la incrementó hasta un 130 % sobre el nivel del estado diabético. De igual forma, la actividad de la fosfofructocinasa (PFK-I) en el hígado de ratas diabéticas está reducida en un 35 % y se restablece por la adición de biotina (Dakshinamurti and Ho Chong 1970). Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 10 1.5. PROTEÍNAS DEPENDIENTES DE BIOTINA Con respecto a los efectos que causa la deficiencia de biotina sobre la expresión genética de las carboxilasas, Velázquez y colaboradores (Rodriguez-Melendez, Cano et al. 2001) mostraron que la vitamina regula la expresión genética de la holocarboxilasa sintasa (HCS) y de las carboxilasas -PC y PCC- en varios tejidos como el hígado, el riñón y el músculo esquelético. El efecto observado fue la disminución de los niveles de sus mRNA, los cuales se restablecieron con la administración de la vitamina en un lapso de 24 horas (Rodriguez-Melendez, Cano et al. 2001). Resultados similares se obtuvieron en la línea celular HepG2 (células de hepatoma humano) crecidas en deficiencia de biotina durante 15 días, notándose una disminución de los mRNA para la HCS y las carboxilasas ACC1 y PCC (Solorzano-Vargas, Pacheco-Alvarez et al. 2002). Además, en leucocitos provenientes de humanos que presentaban deficiencia apenas marginal de biotina, se encontró que las carboxilasas (MCC, PCC, PC, ACC en sus isoformas 1 y 2), HCS, biotinidasa, y el transportador multivitamínico dependiente de sodio (SMVT) disminuyeron aproximadamente hasta un 80 % (Vlasova, Stratton et al. 2005). Estos datos indican que la biotina afecta la expresión de las proteínas que se relacionan directamente con dicha vitamina. 1.6. OTROS GENES AFECTADOS POR BIOTINA En mamíferos son numerosos los genes que se afectan por la deficiencia de biotina, por ejemplo; algunos oncogenes como N-myc, C-myb, N-ras y raf, disminuyen su expresión hasta en un 47 %, cuando las células se crecieron en concentración bajas de biotina (25 pM); (Scheerger and Zempleni 2003). De manera similar, disminuyó la expresión del factor transcripcional NF-kB, así como también para el receptor de la interleucina 2 (IL-2) y la interleucina 4 (IL-4) en células Jurkat (Rodriguez-Melendez, Schwab et al. 2004). En un estudio en el que se determinaron los cambios globales de la expresión genética por microarreglos, en células polimorfonucleares provenientes de humanos tratados con de 8.8 µmol de biotina, mostraron cambios algunos genes que codifican para proteínas que juegan un papel en los procesos tales como el metabolismo de citocinas, Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 11 la transducción de señales, la proliferación celular, la respuesta al estrés celular y la apoptosis, la abundancia de los mRNA que codifican para interferón-γ, interleucina-1β (IL-1β), y 3-metilcrotonil–CoA carboxilasa. De todos estos genes, su expresión fue mayor, mientras que la abundancia del mRNA que codifica para interleucina 4 fue menor (Wiedmann, Rodriguez-Melendez et al. 2004). Otro estudio similar en células HepG2, la deficiencia de biotina modifica la expresión de diversos genes relacionados a proteínas de unión a nucleótidos (Rodriguez-Melendez, Griffin et al. 2006). 1.7. BIOTINA Y METABOLISMO ENERGÉTICO Como se ha descrito anteriormente, la biotina es el grupo prostético de enzimas que modulan el metabolismo intermediario y energético. Por lo tanto, hipotetizar que la deficiencia de la vitamina modificaría dicho metabolismo era plausible. Con esta premisa, Velázquez-Arellano y colaboradores se preguntaron si la deficiencia de biotina podría afectar los niveles energéticos celulares, dada la importancia de al menos una de las enzimas anapleróticas del ciclo de los ácidos tricarboxilicos (TCA), la PC. En su estudio realizado en tres organismos eucariontes evolutivamente muy distantes (la levadura, Saccharomyces cerevisiae, el nematodo Caenorhabditis elegans y la rata Rattus novericus), encontraron que la deficiencia de biotina disminuye los niveles energéticos celulares, es decir, disminuye la relación de los nucleótidos de adenina ATP/AMP, y aumenta la activación de la proteína cinasa dependiente de AMP (AMPK); (Ortega-Cuellar, Hernandez-Mendoza et al. 2010; Velazquez-Arellano, Ortega-Cuellar et al. 2011). Estos mismos autores propusieron que la activación de la AMPK provocó un remodelaje metabólico en parte al modificar la expresión de genes importantes del metabolismo del carbono, presumiblemente a través de una red de transducción de señales iniciada por la AMPK (Velazquez-Arellano, Ortega-Cuellar et al. 2011). Inesperadamente, en otro de sus estudios más recientes, encontraron que la deficiencia de biotina in vivo, aumenta la sensibilidad a insulina y disminuye la concentración postprandial de glucosa en sangre (Hernandez-Vazquez, Ochoa-Ruiz et al. 2012). Estos resultados son similares a los encontrados en modelos deficientes de aminoácidos de cadena ramificada o de un sólo aminoácido como la leucina (Xiao, Huang Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 12 et al. 2011) y sugiere que ante la falta de nutrientes, los organismos sensibilizan vías que coadyuva en la captación de energía para mantener la homeostasis energética. 2. REVISIÓN BREVE DE ALGUNAS VÍAS DE SEÑALIZACIÓN QUE MODULAN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Debido a los hallazgos recientes sobrede los efectos que tiene la deficiencia de biotina sobre algunas vías de señalización que controlan el metabolismo energético, a continuación se hará una descripción breve de la vía de señalización de insulina así como la enzima llamada “regulador maestro” de la homeostasis energética, la cinasa dependiente de AMP, AMPK. 2.1. INSULINA La insulina es una hormona peptídica (5.8 kDa), con efectos pleiotrópicos sobre el metabolismo. Esta hormona es secretada por las células β en los islotes pancreáticos de Langerhans en respuesta a la cantidad de glucosa en sangre, es decir, después de que se lleva a cabo la ingestión de comida. Otros secretagogos como ácidos grasos libres y aminoácidos sirven como potenciadores. Además, diversas hormonas, como la melatonina, los estrógenos, la leptina, la hormona del crecimiento y péptido similar al glucagón-1, también regulan la secreción de insulina, así la célula β es el centro metabólico en el cuerpo que conecta el metabolismo de nutrientes con el sistema endócrino (Czech 1985). Brevemente, el mecanismo de secreción de insulina se lleva acabo de la siguiente manera: la glucosa metabolizada, a través de la glucolisis, conduce a un aumento en la relación ATP/ADP que provoca el cierre de los canales de potasio (K+) que son sensibles a ATP (KATP). Posteriormente la despolarización de la membrana plasmática, la activación de los canales de calcio (Ca2+) que son dependientes de voltaje, y el Ca2+ estimulan a los gránulos de exocitosis que liberan a la insulina (Czech 1985). En suma, la insulina es la principal responsable de mantener la concentración de glucosa en sangre en un rango fisiológico de entre 89-105 mg/dl Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 13 (Permutt, Chirgwin et al. 1984) al favorecer la captación y almacenamiento de este nutriente en músculo y tejido adiposo, mientras que en hígado inhibe su producción (Moller and Flier 1991). Otros efectos celulares promovidos par la insulina son; la división y el crecimiento celular (Moller and Flier 1991) mediadas por la activación de cascadas de señalización en la que participan las proteínas cinasas activadas por mitógenos (MAPK), que es la principal responsable de los efectos mitogénicos (Avruch 1998). 2.1.1. VÍA SE SEÑALIZACIÓN DE LA INSULINA La vía de señalización de la insulina se inicia cuando la insulina se une al receptor de insulina tipo β (IRβ) generándole cambios conformacionales para activarlo. La activación del IRβ promueve la fosforilación en un residuo de tirosina (Tyr) del sustrato de receptor de insulina (IRS). A pesar de que existen 4 isoformas de IRS, al parecer la que está involucrada en el transporte de glucosa a las células es la isoforma 1, por lo que, a continuación se hará referencia principalmente a esta isoforma. El IRS una vez fosforilado, es reconocido por las fosfatidilinositol-3 cinasas (PI3K), que son heterodímeros que constan de una subunidad reguladora (p85α, p55α, p50α, p85β ó p55PIK) y de una subunidad catalítica (p110α, p110β ó p110δ); (Avruch 1998). La interacción entre ambas proteínas provoca cambios alostéricos de la subunidad catalítica de PI3K. A consecuencia de ello, p110 se localiza cerca de la membrana plasmática en donde tiene acceso a sus sustratos fosfatidilinositol-4,5-bifosfato, los cuales son fosforilados en la posición 3 del inositol, generando los productos fosfatidilinositol-3,4-bifosfato (PIP2) y fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (PIP3), respectivamente. El PIP3 sirve como sitio de unión para cinasas de serina, tales como la cinasa dependiente de fosfoinositidos-1 (PDK1) y la proteína cinasa B (Akt); (Engelman, Luo et al. 2006). En el caso de la cinasa Akt, después de su reclutamiento a la membrana plasmática es fosforilada en dos residuos, la serina (Ser473) y la treonina (Thr308); (Engelman, Luo et al. 2006). La fosforilación en la Ser473 ocurre primero por acción del complejo proteíco mTOR/rictor (mTORC2). Esta fosforilación parece promover la interacción entre el motivo hidrofóbico del carboxilo terminal de Akt y la cinasa PDK1 que la fosforila en el Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 14 residuo Thr308, estas dos fosforilaciones son importantes para que Akt se active completamente (McCarthy and Elmendorf 2007). Una vez que Akt se activa, es capaz de fosforilar varias proteínas en la cascada de señalización que regulan el crecimiento y sobrevivencia celular así como el metabolismo energético (McCarthy and Elmendorf 2007). Existen tres isoformas de Akt (Akt1, 2 y 3) de las cuales, la isoforma 2 parece tener papel más importante en la captación de la glucosa que es inducida por la insulina. La Akt es importante ya que regula la señalización de múltiples procesos biológicos esenciales, como lo son la proliferación celular, síntesis de proteínas, la translocación del transportador de glucosa 4 (Glut-4) a la membrana plasmática para mejorar el transporte de glucosa (Kovacic, Soltys et al. 2003; McCarthy and Elmendorf 2007). Otro nodo en la regulación de la vía de insulina mediado por Akt es a nivel de la proteína mTOR (blanco de rapamicina), que es una cinasa de serina/treonina cuya función es acoplar el crecimiento y proliferación celular con los niveles de nutrientes disponibles, particularmente de amino ácidos y con señales hormonales como la de insulina (Jia, Chen et al. 2004). En los mamíferos, TOR, identificado como mTOR, existe en dos distintos complejos proteicos, mTORC1 y mTORC2 (Chotechuang, Azzout-Marniche et al. 2009). El complejo de mTORC1 fosforila a la proteína S6K, que tiene efectos negativos sobre la señalización de insulina, puesto que la inhibe a nivel del IRS-1 (Paulose, Thliveris et al. 1989; Pederson, Kramer et al. 2001). 2.2. PROTEÍNA CINASA DEPENDIENTE DE AMP (AMPK) La AMPK es una proteína cinasa dependiente de AMP que actúa como un sensor celular energético que está presente en los eucariontes. Regula los niveles de AMP/ATP, ya que se activa para inhibir el proceso de consumo de energía en reacciones anabólicas como síntesis de proteínas, síntesis de lípidos, síntesis de glucógeno y para activar el proceso de producción de energía en las reacciones catabólicas como la oxidación de ácidos grasos y la glucólisis; y así restablecer la homeostasis energética dentro de la célula (Hardie, Hawley et al. 2006). La AMPK es un heterodímero que está formado por una subunidad catalítica α y dos subunidades no catalíticas, la β y la γ. Existen dos isoformas de las subunidades α y β Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 15 (α1, α2, β1 y β2) y tres genes que codifican para las isoformas de la subunidad γ (γ1- γ3); (Nielsen, Mustard et al. 2003). La isoforma α2 es la subunidad de la AMPK que predomina en el músculo esquelético y el cardiaco, mientras que las isoformas α1 y α2 están igualmente distribuidas en el hígado (Hardie 2007). La fosforilación de la AMPK se da en la subunidad α en el residuo Thr172 que se encuentra en el asa de activación (Hardie and Sakamoto 2006). La AMPK se ha propuesto como regulador energético maestro, debido a la gran cantidad de vías que regula, ya sea por activación o por inhibición. La AMPK se activa con el aumento del AMP, que puede ser inducido por cambios farmacológicos o fisiológicos como el ejercicio, ayuno, hipoxia (Zhou, Myers et al. 2001; Viollet, Guigas et al. 2009). Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo16 3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Los antecedentes más recientes indican que la deficiencia de biotina afecta el metabolismo energético. Estos efectos se explican en parte por su función de cofactor de las enzimas (carboxilasas) que modifican algunas de las vías del metabolismo intermediario, tales como la anaplerosis del TCA y la síntesis de ácidos grasos. De manera interesante, dichos estudios proponen que la deficiencia de biotina modifica el nivel energético, debido a la disminución del metabolismo oxidativo, que se refleja por la disminución de los niveles de los nucleótidos de adenina (ATP/AMP) y con el concomitante aumento en la actividad de la AMPK. Es bien conocido que la activación farmacológica de la AMPK aumenta la sensibilidad a la insulina, así como el aumento de la captación de glucosa en células de músculo y tejido adiposo, de ahí su estudio intensivo en pacientes con enfermedades metabólicas como la diabetes y síndrome metabólico. Interesantemente, un estudio realizado en ratas alimentadas con una dieta sin un aminoácido esencial como la leucina, aumenta la sensibilidad a la insulina. El mecanismo propuesto de dicho efecto, es a través del aumentar la actividad de la proteína cinasa dependiente de AMP y la concomitante disminución de la vía de señalización mTOR/S6K. Dado el paralelismo de los efectos que causa la deficiencia de leucina con la deficiencia de biotina sobre el metabolismo energético, es plausible sugerir que la deficiencia de biotina también aumenta la sensibilidad a insulina por mecanismos similares. Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 17 4. HIPÓTESIS Dado que la deprivación de la vitamina biotina provoca un remodelaje metabólico y modifica el metabolismo energético, es probable que su deficiencia también active a la vía de señalización de insulina en células musculares (células L6). 5. OBJETIVOS 5.1. GENERAL Determinar si la deprivación de biotina modifica la vía de señalización de insulina y aumenta su sensibilidad en miotúbos derivados de la línea celular de músculo esquelético de rata (L6). 5.2. PARTICULARES Inducir la deficiencia de biotina en las L6, una línea celular de músculo de rata. Determinar si la deprivación de biotina afecta algunos componentes de la vía de señalización de insulina como el receptor de insulina (IRβ), el sustrato del receptor de insulina (IRS), la proteína cinasa B (AKT), la proteína blanco mecanístico de rapamicina (mTOR) y la proteína ribosomal S6 cinasa-1 (S6K). Evaluar si el cambio de la vía de insulina por la deficiencia de biotina, afecta la translocación del trasportador de glucosa 4 (Glut-4) y a la proteína cinasa de AMP (AMPK). Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 18 6. MATERIALES Y MÉTODOS 6.1. CULTIVO CELULAR Se utilizó como modelo de estudio a miotúbos diferenciados de la línea celular (L6) que proviene de músculo esquelético de rata, donada por la Dra. Ma. del Refugio García Villegas del Centro de Investigaciones y Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional (Dpto. Fisiología, Biofísica y Neurociencias, CINVESTAV-IPN). La línea celular se mantuvo en placas de 60 mm de diámetro en medio de cultivo Eagle modificado de Dulbecco (D-MEM) suplementado con 10 % (v/v) de suero fetal bovino (FBS) y antibióticos (penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 ug/mL) a 37 °C en una atmosfera húmeda y 5 % de CO2. Las células fueron subcultivadas, por tripsinización, aproximadamente cada cinco días, con cambio de medio fresco cada tercer día, para mantener la línea celular. Para inducir la diferenciación a miotúbos, las células L6 se cultivaron en D-MEM con 2 % de FBS cuando alcanzaron aproximadamente un 90 % de confluencia. Para la inducción de la deficiencia de biotina (Def-Bt), las células se mantuvieron en D- MEM libre de biotina, suplementado con 10 % de FBS dializado, por 7días. Todos los reactivos empleados para el cultivo celular fueron obtenidos de la compañía Invitrogen/GIBCO, BRL. 6.2. OBTENCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNA Una vez que las células fueron diferenciadas a miotúbos y fueron sometidas al tratamiento correspondiente, éstas se lavaron tres veces con buffer de fosfatos salino (PBS) frío. Las células se desprendieron con un buffer de lisis que contenía 50 mM de HEPES, 50 mM de cloruro de potasio (KCl), 1 mM de ácido etilendiaminotetra acético (EDTA), 5 mM de ácido etilenglicol tetra acético (EGTA), 1 mM glicerolfosfato, 0.1 % (v/v) Triton X-100, 50 mM de pirofosfato de sodio (NaPPi), 1 nM de ortovanadato, 1 nM de ditiotreitol (DTT), inhibidores de proteasas (Roche). Los lisados celulares se centrifugaron a 14,000 rpm (revoluciones por minuto) por 10 minutos; se tomó el sobrenadante del cual se determinó la concentración de proteína por el método de Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 19 Bradford. Este método usa al colorante azul brillante de coomasie J-250 (BioRad) que reacciona con las proteínas formando un complejo estable que tiene una absorbancia máxima de 595 nm. Se utilizó albúmina sérica bovina (BSA) como estándar. Como blanco se utilizó el buffer en el que se lisaron las muestras y se determinó la proteína con 3 uL de muestra, 797 uL de agua destilada y 200 uL de reactivo de Bradford (Bradford 1976). Las muestras de cada condición se realizaron por triplicado y se leyeron a 595 nm en un espectrofotómetro. 6.3. ANÁLISIS DE LA DEFICIENCIA DE BIOTINA La deficiencia de biotina se evaluó mediante Western blot. Brevemente, cantidades iguales de proteína total (100 g) de miotúbos L6 crecidos en deficiencia de biotina (-) o en condiciones control, con biotina (+), se hirvieron por 5 minutos en buffer de carga 2X, que contenía 4 % de dodecilsulfato sódico (SDS), 20 % de glicerol, 10 % 2- mercaptoethanol, 0.004 % de azul de bromofenol and 0.125 M de Tris HCl, con pH aproximado de 6.8. Posteriormente, las muestras se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) al 10 % en buffer de corrida (25 mM Tris base, 192 mM glicina, 0.1% SDS, pH 8.3). Después las proteínas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivilideno (PDVF) con una cámara de transferencia húmeda (Biorad) a 100 V durante 60 minutos con buffer de transferencia (25 mM Tris, 192 mM glicina, 10 % metanol, pH 8.3). Al final, la membrana se colocó en buffer de bloqueo (5% de leche descremada en PBS) y se incubó con, estreptavidina (proteína con elevada afinidad por la biotina) que estaba conjugada con peroxidasa de rábano (Sigma-Aldrich) durante 1 hora. El grado de biotinilación de las proteínas dependientes de biotina se determinaron por la intensidad de las bandas en la membrana, generada por la excitación de la peroxidasa de rábano con un reactivo de quimioluminiscencia (enhanced chemiluminescence reagent, Millipore), de acuerdo a las indicaciones del fabricante. La intensidad de las bandas generadas se cuantificaron por densitometría con el software Quantity One Versión 4.6.8 (BioRad), los resultados se expresaron como unidades densitométricas relativas a la actina, que corresponde a la relación entre los pixeles de cada muestra y los pixeles del control de carga. Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 20 6.4. ANÁLISIS POR WESTERN BLOT DE LAS FORMAS FOSFORILADA Y TOTAL DE IRΒ, IRS, AKT, MTOR, S6K Y AMPK Las células de miotúbulos (L6) deficientes de biotina(Def-Bt) y controles (Control-Bt) se dejaron libres de suero por 1 h, se lavaron dos veces con PBS frío y posteriormente se trataron con o sin insulina (10 nM) por 30 minutos, después de este tiempo las células se trataron y obtuvieron las muestras como se mencionó previamente (determinación de proteína, SDS-PAGE y trasferencia de proteínas). La inmunodetección de los sitios fosforilados y de las proteínas totales de: IRβ, IRS, Akt, mTOR, S6K y AMPK, se realizaron mediante el uso de anticuerpos anti-fosfo- AMPK Thr172 (Cell Signaling), anti- fosfo-Akt Ser473 (Cell Signaling), anti-fosfo-S6K Thr389 (Cell Signaling), anti-fosfo-IRS Ser302 (Cell Signaling), anti-fosfo-IRβ Tyr1150/1151 (Santa Cruz Biotechnology), anti-fosfo- mTOR Ser2448 (Cell Signaling), respectivamente. Para la detección de las proteínas totales se usaron los anticuerpos anti-AMPK (Cell Signaling), anti-Akt (Cell Signaling), anti-S6K (Cell Signaling), anti-IR (Santa Cruz Biotechnology) anti-mTOR (Cell Signaling), anti-IRS (Cell Signaling) y anti-actina (Cell Signaling), respectivamente. La incubación con los anticuerpos primarios (tanto para proteínas fosforiladas como para proteína total) se realizó toda la noche a 4 °C, y para detección del complejo antígeno- anticuerpo, se empleó una reacción de quimioluminiscencia. Las intensidades de las bandas se cuantificaron mediante escaneo y procesamiento con el software Quantity One versión 4.6.8 (BioRad), los resultados se expresaron como unidades densitométricas relativas de las proteínas fosforiladas con las proteínas totales y estas normalizadas con actina. 6.5. TRANSLOCACIÓN DE GLUT-4 POR CITOMETRÍA DE FLUJO La cantidad de Glut-4 en la superficie celular se midió utilizando citometría de flujo como fue descrito previamente (Koshy, Alizadeh et al. 2010). Brevemente, la monocapa de miotúbos deficientes de biotina (Def-Bt) y controles (Control-Bt) se trataron con o sin insulina (10 nM) por 30 minutos y se expusieron al anticuerpo anti-Glut-4 (1:50, Santa Cruz Biotecnology sc-53566) por 2 h. Las células se lavaron en buffer de lavado (PBS Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 21 con 1 % BSA y 0.1 % azida de sodio) y se incubaron con un anticuerpo secundario, conjugado con el fluorocromo Isotiocinato de fluoresceína (FITC; Cell Signaling Tecnology) a una dilución 1:100 por 30 minutos en oscuridad. Después de la incubación, se añadió 400 L de paraformaldehido 1 % y se incubaron por 20 minutos más en oscuridad. Las células se centrifugaron y el botón celular se lavó 2 veces con PBS frío, finalmente se resuspendió en 1 mL de buffer clasificador celular activado por fluorescencia (FACS; 1 % de BSA, 0.1 % de NaN3 Azida de sodio, en PBS). Las muestras se centrifugaron y el botón celular se resuspendió con 0.5 mL de buffer FACS. En cada experimento se analizó un mínimo de 15,000 células (por condición de tratamiento) en un citómetro de flujo FACS Calibur (BD Bioscience) equipado con capacidad de análisis multicolor. Se establecieron las condiciones para excluir células no viables, restos celulares y células de tamaño y forma anormal. Los resultados se expresaron como la intensidad de fluorescencia media/15,000 células. 6.6. CAPTACIÓN DE GLUCOSA La captación de glucosa en las células L6 se llevó a cabo como fue descrito previamente (Saito et al., 2011), utilizando un ensayo comercial no radiactivo que determina la captación de 2-deoxiglucosa (Cosmo Bio Co., Ltd., Tokio). Las células L6 (2x105) deficientes de biotina (Def-Bt) y controles (Control-Bt) fueron crecidas a confluencia en placas de 35 mm de diámetro conteniendo DMEM con 2 % de FBS y después fueron precondicionadas por una hora en DMEM sin suero, se lavaron 2 veces con buffer Ringer Krebs (KRPH) a 37 °C para eliminar el medio de cultivo. Los grupos de tratamiento fueron incubados con 1 mM de 2-deoxiglucosa en KRPH, 20 minutos después se añadió 10 nM de insulina y se incubaron por 30 minutos más. Finalmente, las células se lavaron 3 veces con PBS y se lisaron por sonicación en un buffer que contenía 10 mM de buffer Tris-HCl (pH 8.0) y se centrifugaron a 15,000 g por 20 minutos a 4 °C. La captación de glucosa se medió con el kit Cosmobio (#CSR-OKP-PMG-K01TE) siguiendo las instrucciones del fabricante. La determinación se basa en que una pequeña cantidad de 2-desoxiglucosa (2DG) es administrada a las células en cultivo, y Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 22 tanto la glucosa endógena como la glucosa-6-fosfato (G6P) en las células se oxida en presencia de una baja concentración de glucosa-6fosfato deshidrogenasa (G6PDH). La 2-desoxiglucosa-6-fosfato (2DG6P) acumulada en las células se oxida a continuación, en presencia de una alta concentración de G6PDH. El nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido (NADPH), que es producido a partir de 2DG6P y G6PDH, se cuantificó a 420 nm espectrofotométricamente. Éste método enzimático puede cuantificar 2DG o 2DG6P en un intervalo entre 5-80 pmol. 6.7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Todas las determinaciones se realizaron en tres experimentos diferentes y por triplicado. Los datos se analizaron en el programa PRISM 5 (Graph Pad, Ca, USA). Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar (DS). La significancia estadística se calculó utilizando ANOVA de una vía y el test post hoc de Bonferroni para comparaciones simples y múltiples, respectivamente. Se consideró como diferente la significancia de p<0.05. Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 23 7. RESULTADOS 7.1. INDUCCIÓN DE LA DEFICIENCIA DE BIOTINA EN CÉLULAS L6 Aunque en la literatura se ha reportado la deficiencia de biotina para diversas líneas celulares (Solorzano-Vargas, Pacheco-Alvarez et al. 2002; Mall, Chew et al. 2010) no existe información referente a las células de miotúbos L6. Por lo tanto, nosotros primero establecimos las condiciones que evidenciarían la deprivación de la biotina en dichas células. Para este fin, crecimos a las células (diferenciadas a miotúbos) en medio de cultivo (D-MEM) sin biotina durante siete días y posteriormente evaluamos el grado de biotinilación de tres proteínas dependientes de biotina: la PC, PCC y MCC. Como se muestra en la figura 3A, el grado de biotinilación de las tres carboxilasas disminuyó hasta en un 70% en los miotúbos L6 deficientes de biotina (biotina -), en comparación con los miotúbos L6 control (biotina +). Estos datos confirman que la deprivación de biotina por siete días, a los cultivos de células L6, es suficiente para disminuir el nivel intracelular de la vitamina biotina. Durante el periodo de deprivación de biotina, no se observaron cambios en la morfología ni en la velocidad de crecimiento de éstas células (Anexo I). Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 24 Figura 3. Identificación del grado de biotinilación de las proteínas dependientes de biotina. A) Western Blot que muestra el grado de biotinilación de las tres carboxilasas (PC, PCC/MCC). Para la PCC/MCC sólo se identifica una banda debido a su ambas proteínas tienen un peso molecular similar, 75/84 KDa respectivamente. B y C) Gráficas que representa el análisis densitométrico de la expresión de la PC, PCC/MCC respectivamente. Los resultados se expresaron como unidades densitométricas relativas a actina. Los resultados son X ± DS, n= tres experimentos por grupo experimental. El asterisco (*) indica diferencia significativacomparado con el control (p<0.05). PC: Piruvato Carboxilasa, PCC: Propionil CoA carboxilasa y MCC: 3-metilcrotonil CoA carboxilasa. Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 25 7.2. AUMENTO DE LA ACTIVACIÓN DE LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN DE LA INSULINA POR DEPRIVACIÓN DE BIOTINA Está ampliamente conocido que la captación de nutrientes conduce a la estimulación de la vía de señalización de insulina. Sin embargo, evidencias recientes indican que la falta de un micronutriente esencial como la leucina, también aumenta la sensibilidad a la insulina (Xiao, Huang et al. 2011). Con el fin de explorar si la deprivación de biotina podría tener efectos similares, nosotros evaluamos la activación la vía de señalización de insulina, analizando las formas activas (fosforilación) de algunas proteínas clave en la regulación de dicha vía, en los miotúbulos L6. Como se muestra en la figura 4A, en las células L6 control (biotina +) estimuladas con 10 nM de insulina (insulina +) durante 30 minutos, las bandas que corresponden a el nivel de fosforilación del receptor de insulina (p-IR Tyr1150/51) aumentaron significativamente. Éste dato fue corroborado por el análisis densitométrico de la intensidad de las bandas, e indica que como se esperaba, la insulina incrementa a mas el doble el nivel de fosforilación del p-IRTyr1150/51 en células control, en comparación con las células sin insulina (figura 4B). En contra parte, al evaluar el efecto de la deficiencia de biotina sobre el p-IRTyr1150/51, inesperadamente encontramos que la deficiencia de la vitamina sin insulina aumenta el nivel de fosforilación del p-IRTyr1150/51 similar a las controles con insulina (figura 4A), mientras que las células sin biotina más insulina no tuvieron un efecto aditivo (Figura 4A y B). Resultados similares se obtuvieron en los niveles de fosforilación para las proteínas que forman parte de la vía de señalización de insulina, como es el sustrato del receptor de insulina (p-IRSSer302) y la proteína cinasa B (AktSer473). Es decir, la insulina en los controles (10 nM por 30 min) aumenta las bandas de p-IRSSer302 y p-AktSer473 en comparación al control sin insulina (Figuras 5A, B y 6A, B) y ésta fosforilación es similar en la deficiencia de biotina, aun sin insulina. Consistente con lo observado para p- IRTyr1150/51 y -AktSer473, la deficiencia de biotina más insulina no mostró mayor cambio (Figuras 5A, B y 6A, B). Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 26 Estos resultados son similares a los producidos en la deficiencia de leucina, indicando que la deficiencia de biotina también activa a la vía de la insulina (Xiao, Huang et al. 2011) y sugieren que el aumento de la fosforilación de p-IR/p-IRS/p-Akt en la deficiencia de biotina sin insulina se deben a un mecanismos independiente de la insulina. Figura 4. Fosforilación (activación) del receptor de insulina. A) Western blot que representa la activación de IRβ en miotúbulos L6 crecidos con biotina (+) o sin biotina (-) y estimulados (+) o no (-) con 10nM de insulina por 30 minutos. Como control de carga, se empleó a la actina. B) Gráfica que representa el análisis densitométrico de la activación de p-IRβ. Los resultados se expresaron como unidades densitométricas relativas al IRβ total (t-IRβ) y a la actina. Los resultados son X ± DS, n= tres experimentos por grupo experimental. El asterisco (*) indica diferencia significativa comparado con el control (p<0.05). Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 27 Figura 5. Fosforilación (activación) del sustrato del receptor de insulina A) Western blot que representa la activación de IRS en miotúbulos L6 crecidos con biotina (+) o sin biotina (-) y estimulados (+) o no (-) con 10nM de insulina por 30 minutos. Como control de carga, se empleó a la actina. B) Gráfica que representa el análisis densitométrico de la activación de p-IRS. Los resultados se expresaron como unidades densitométricas relativas al IRSβ total (t-IRS) y a la actina. Los resultados son X ± DS, n= tres experimentos por grupo experimental. El asterisco (*) indica diferencia significativa comparado con el control (p<0.05). Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 28 Figura 6. Fosforilación (activación) de la proteína cinasa B (AKT). A) Western blot que representa la activación de AKT en miotúbulos L6 crecidos con biotina (+) o sin biotina (-) y estimulados (+) o no (-) con 10nM de insulina por 30 minutos. Como control de carga, se empleó a la actina. B) Gráfica que representa el análisis densitométrico de la activación de p-AKT. Los resultados se expresaron como unidades densitométricas relativas al AKT total (t-AKT) y a la actina. Los resultados son X ± DS, n= tres experimentos por grupo experimental. El asterisco (*) indica diferencia significativa comparado con el control (p<0.05). Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 29 7.3. LA DEPRIVACIÓN DE BIOTINA AUMENTA LA SENSIBILIDAD DE LA VÍA DE LA INSULINA DEBIDA A LA DISMINUCIÓN DE LA SEÑALIZACIÓN MEDIADA POR LAS PROTEÍNAS MTOR/S6K Se sabe que la hiperactivación de mTORC1 contribuye a la generación de la resistencia a insulina a través de un mecanismo que implica la inhibición, por fosforilación, del IRS (Carlson, White et al. 2004; Um, D'Alessio et al. 2006), además la disminución de la señalización mTOR/S6K por mutación del gen S6K o por déficit de leucina, incrementa la sensibilidad a insulina (Um, D'Alessio et al. 2006). Para determinar si la deficiencia de biotina afecta la señalización de mTOR/S6K, evaluamos el nivel de fosforilación de ambas proteínas, en miotúbulos L6 crecidos en medio deficiente de biotina con y sin inulina. Como se muestra en la figura 7A y B, las bandas que representan el nivel de fosforilación de la proteína mTOR aumentan significativamente en las células control, indicando que las células responden al estímulo de insulina. Sin embargo en la deficiencia de biotina, con o sin insulina, la fosforilación de mTOR disminuye (figura 7A y B). Un sustrato de la cinasa mTOR, la proteína S6K, también presentó el mismo efecto, es decir; en la deficiencia de biotina con o sin insulina también disminuyó la fosforilación (activación; figura 8A y B). Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 30 Figura 7. Fosforilación de mTOR. A) Western blot que representa la activación de mTOR en miotúbulos L6 crecidos con biotina (+) o sin biotina (-) y estimulados (+) o no (-) con 10nM de insulina por 30 minutos. Como control de carga, se empleó a la actina. B) Gráfica que representa el análisis densitométrico de la activación de p-mTOR. Los resultados se expresaron como unidades densitométricas relativas al mTOR total (t- mTOR) y a la actina. Los resultados son X ± DS, n= tres experimentos por grupo experimental. El asterisco (*) indica diferencia significativa comparado con el control (p<0.05). Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 31 Figura 8. Fosforilación de S6K. A) Western blot que representa la activación de S6K en miotúbulos L6 crecidos con biotina (+) o sin biotina (-) y estimulados (+) o no (-) con10nM de insulina por 30 minutos. Como control de carga, se empleó a la actina. B) Gráfica que representa el análisis densitométrico de la activación de p- S6K. Los resultados se expresaron como unidades densitométricas relativas al S6K total (t- S6K) y a la actina. Los resultados son X ± DS, n= tres experimentos por grupo experimental. El asterisco (*) indica diferencia significativa comparado con el control (p<0.05). Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 32 7.4. LA DEPRIVACIÓN DE BIOTINA AUMENTA LA FOSFORILACIÓN DE AMPK Como mostramos anteriormente, la deficiencia de biotina (sin insulina) incrementó la activación de la vía de señalización de insulina. Estos datos nos sugieren que un mecanismo diferente al mediado por insulina es el responsable de los resultados obtenidos. Diferentes estudios han evidenciado que la activación de AMPK mejora la sensibilidad a insulina (Lessard, Chen et al. 2006), por lo tanto, para identificar si ésta proteína se modifica en la deficiencia de biotina, evaluamos su fosforilación (la activación). En la figura 9, se muestra que la deficiencia de biotina (Def-Bt) aumenta significativamente el nivel de fosforilación de la cinasa AMPK comparada con el control, sin alterar los niveles de proteína total. Estos hallazgos sugieren que el aumento de la vía de señalización de la insulina, por la deficiencia de biotina, podría deberse al aumento de la actividad de AMPK. Figura 9. Fosforilación de AMPK. A) Western blot que representa la activación AMPK en miotúbulos L6 crecidos por siete días con biotina (+) o sin biotina (-).Como control de carga, se empleó a la actina. B) Gráfica que representa el análisis densitométrico de la activación de p-AMPK. Los resultados se expresaron como unidades densitométricas relativas al AMPK total (t-AMPK) y a la actina. Los resultados son X ± DS, n= tres experimentos por grupo experimental. El asterisco (*) indica diferencia significativa comparado con el control (p<0.05). Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 33 7.5. TRANSLOCACIÓN DE GLUT4 POR CITOMETRÍA DE FLUJO Uno de los efectos metabólicos que induce la vía de señalización de insulina en las células de músculo y tejido adiposo, es la captación de glucosa principalmente a través del trasportador de glucosa, Glut-4. Dicho transportador se encuentra en el citoplasma de la célula y debe ser reclutado a la membrana plasmática para que pueda llevar a cabo su función. Para determinar si la deficiencia de biotina (Def-Bt) tiene efecto sobre el trasportador Glut-4, nosotros evaluamos su translocación a la membrana plasmática mediante citometría de flujo. Como se muestra en la figura 10, la deficiencia de biotina (barras grises), aún sin estímulo de insulina, aumentó significativamente la cantidad de Glut-4 en la membrana plasmática, similar al aumento observado en las células control que fueron estimuladas con insulina (barra negra). Figura 10. Translocación de Glut-4 a la membrana plasmática. Células L6 crecidas por siete días con (+) o sin biotina (-), se estimularon (+) o no (-) con 10 nM de insulina, se evaluó la translocacion de Glut-4 a la menbrana plasmática por citometria de flujo. Se muestra la gráfica que representa la cuantificación de la intensidad de fluorescencia en las condiciones experimentales mencionadas. Los resultados son X ± DS, n= tres experimentos por grupo experimental. El asterisco (*) indica diferencia significativa comparado con el control (p<0.05). Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 34 7.6. EFECTO DE LA DEFICIENCIA DE BIOTINA SOBRE LA CAPTACIÓN DE GLUCOSA Como se mencionó antes, la captación de glucosa es uno de los efectos metábolicos que induce la vía de señalización de insulina y es mediada principalmente por el transportado Glut-4. Para establecer si el aumento del transportador Glut-4 a la membrana plasmática, en la deficiencia de biotina, también se refleja en la captación de glucosa, nosotros medimos la captación de un análogo no metabolizable, la 2- deoxiglucosa (2-DG). Nuestros resultados muestran que, comparadas con las células controles, las células deficientes de biotina sin insulina incrementaron significativamente la captación de 2-DG, de manera similar a las controles tratadas con insulina. Estos datos son consistentes con el aumento observado del transportador Glut-4 en la membrana plasmática, además las células deficientes de biotina tratadas con insulina no mostraron un efecto aditivo al compararlas con las controles con insulina (Figura 11). Figura 11. Captación de 2-deoxiglucosa (2-DG), análogo de glucosa. Captación de 2-DG por células L6 crecidas por siete días con (+) o sin biotina (-), se estimularon (+) o no (-) con 10nM de insulina. Los resultados son X ± DS, n= tres experimentos por grupo experimental. El asterisco (*) indica diferencia significativa comparado con el control (p<0.05). Estudio de los efectos de la deficiencia de biotina sobre la vía de señalización de la Insulina en un cultivo de una línea celular de músculo 35 8. DISCUSIÓN El objetivo principal del presente trabajo fue determinar si la deprivación de la vitamina biotina modifica la vía de señalización de la insulina en miotúbos diferenciados de la línea celular L6, por lo que, nosotros primeramente evidenciamos la deficiencia de biotina (Def-Bt) en la línea celular L6. Ya se han reportado modelos de deficiencia de biotina en la línea celular HepG2 crecida sin biotina durante 15 días y en células Jurkat crecidas en deficiencia media de biotina (0.025 nmol/L); (Solorzano-Vargas, Pacheco-Alvarez et al. 2002; Mall, Chew et al. 2010). Sin embargo, no existe en la literatura información referente a dicha condición en miotúbos, por lo cual nosotros implementamos un modelo de deficiencia de biotina en ésta línea celular (figura 3). El método más utilizado para evaluar la deficiencia de biotina tanto en modelos animales como en modelos celulares, es un blot de estreptavidina, en el cual se evalúa la cantidad de carboxilasas (PC, PCC y MCC) que tienen unida a la biotina. En este sentido, es bien sabido que la unión biotina - estreptavidina es tan específica como la unión antígeno – anticuerpo. Si existe deficiencia de biotina, la intensidad de las bandas correspondientes a dichas carboxilasas será considerablemente menor, debido a que no habrá la suficiente cantidad de vitamina a la cual unir la estreptavidina. Nuestros resultados mostraron que a los siete días de tratamiento en medio sin biotina, la concentración de carboxilasas unidas a biotina es menor en comparación con los controles (figura 3), por tanto, se puede deducir que los niveles intracelulares de ésta vitamina están disminuidos y que la línea celular L6 es un bueno modelo para estudiar el efecto de la deficiencia de esta vitamina. La insulina es una hormona secretada por las células β pancreáticas en respuesta a la alimentación y otros estímulos, y es bien conocido que su vía de señalización juega un papel importante en la regulación del metabolismo energético (Czech 1985; Permutt, Chirgwin et al. 1984; Moller and Flier 1991). Una de las principales funciones biológicas de la insulina es la regulación de los niveles de glucosa en sangre (Permutt, Chirgwin et al. 1984). En humanos, defectos en la producción de insulina causados por enfermedades, como la diabetes tipo 2, síndrome metabólico, la enfermedad del hígado graso no alcohólico, etc., son incapaces de regular apropiadamente el metabolismo de la glucosa. La unión Estudio de los efectos de la
Compartir