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ESTUDIOS SOBRE LA BIOSÍNTESIS DE PÉPTIDOS ALDEHÍDICOS 
DE BAJO PESO MOLECULAR CON ACTIVIDAD INHIBITORIA DE 
PROTEASAS PRODUCIDOS POR STREPTOMYCES SPP 
 
TESIS 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
LICENCIADO EN BIOQUÍMICA DIAGNÓSTICA 
 
PRESENTA: 
MARCO ANTONIO MORALES ESCALANTE 
 
 ASESORES: DR. PABLO CRUZ MORALES 
 M. EN C. MARITERE DOMÍNGUEZ ROJAS 
 
CUAUTITLÁN IZCALLI, ESTADO DE MÉXICO 2015 
 
 
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
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reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
2 
 
 
 
 
 
 
 
 
El presente trabajo se realizó en el laboratorio de Evolución de la 
Diversidad Metabólica en el Laboratorio Nacional de Genómica para la 
Biodiversidad (LANGEBIO), en el CINVESTAV Irapuato, México. Se 
llevó a cabo bajo la dirección del Dr. Pablo Cruz Morales y la M. en C. 
Maritere Domínguez Rojas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 
 
Agradecimientos 
 
Quiero dedicar esta tesis a todos los que han creído en mí, como persona y como 
futuro profesionista, y han sido parte de todo este proceso de formación 
universitaria que culmina con esta tesis. 
 
A mi familia quiero agradecerles como siempre todo su apoyo incondicional. A mi 
mamá por ser la persona que más ha respaldado, impulsado y confiado en todas 
mis decisiones, desde siempre. A mi abuelita Francisca por ser la fuente de 
inspiración más grande en mi vida. A mis tías Magda y Lulú por siempre estar ahí 
cuando las he necesitado, llenas de cariño y consejos. A mis primos, que en 
realidad siempre he considerado hermanos, Adrian, Mario, Arturo, Alan y Rodrigo, 
por siempre ser un ejemplo de que el esfuerzo tiene recompensas y que siempre 
contamos el uno con el otro. 
 
Quiero también agradecer a los que han sido mis amigos incondicionales y han 
sido parte de mi vida desde ayeres preparatorianos, siempre felices de cualquiera 
de mis logros: Daniela, Gaby, Marco, Fabian, Bren, Pau y Oli, ya saben que los 
quiero y admiro, siempre. A mis amigos de la universidad Aislinn, Alexis, Rogelio, 
Fabiola, Heidi, Alberto, Irais, Daniel, Janete, Betty, Andy Campa, Diana y Quetza, 
por ser parte muy importante de esos cuatro años y por seguir siendo amigos 
entrañables de los cuales sigo aprendiendo mucho. A la M. en C. Maritere, gracias 
por todo lo enseñado, por creer en mí y en mis aptitudes, y por apoyarme cuando 
lo he necesitado, tiene mi admiración y cariño. 
 
 
 
 
 
 
4 
 
 
Quiero agradecer al Dr. Francisco Barona por darme la oportunidad de ser parte 
de su increíble equipo de trabajo, y por todos sus consejos y apoyo. A la M. en C. 
Hilda Erendira Ramos Aboites por todo su apoyo técnico como auxiliar de 
laboratorio en el empleo de HPLC y Espectrometría de masas, además de todo su 
cariño y paciencia. Al M. en C. Christian Eduardo Martínez Guerrero por su apoyo 
técnico como auxiliar del laboratorio en lo referente a cualquier eventualidad 
correspondiente al ambito Bioinformático, y por todas esas veces que demostró 
ser un amigo. A Marianita por todo su apoyo y amistad incondicionales. A Anita 
por siempre responder todas mis dudas y escuchar mis inquietudes en cuanto al 
proyecto, y por siempre ser una gran amiga dentro y fuera del laboratorio. A Neto 
por todos sus consejos de Biología Molecular, y por ser tan sarcástico, sincero y 
divertido. A Karina Verdel por su apoyo en el montaje de los ensayos de inhibición 
enzimática, y por todas las otras veces que me apoyó fuera y dentro del 
laboratorio. A Mitzi por darme asilo cuando lo necesité. A Lore, Nelly, Erasmo, Pau, 
Marcus, Kari Gutierrez, Ale, Yuli, Sarita, Gamboa, Miguel de HIlda, Romi y Jose 
Luis por ser excelentes compañeros, siempre dispuestos a ayudar, y que se 
quedan con toda mi admiración por estar tan comprometidos con la causa 
científica, se llevan todo mi cariño y amistad. A Miguel y Abraham por ser los 
mejores roomies, y a Rigel, Adri, y Anna O por ser tan ellas, tan divertidas y 
buenas amigas. Y a todos los amigos y compañeros de LANGEBIO que no puedo 
mencionar porque son muchos, pero que en definitiva ayudaron a que mi estancia 
en Irapuato sea un gran recuerdo. 
 
Y por último, pero no menos importante, quiero agradecer al Dr. Pablo Cruz, por 
ser tan buen guía en todo este proceso, por siempre hacer que la ciencia y este 
proyecto volvieran a cautivarme cuando mi interés parecía decaer, y por ser algo 
que se admira y se estima al mismo tiempo, fuera y dentro del laboratorio: un 
amigo. Gracias. 
 
5 
 
Índice General 
Abreviaturas ............................................................................................................ 8 
Índice de Figuras ..................................................................................................... 9 
Índice de Tablas .................................................................................................... 13 
Resumen ............................................................................................................... 14 
1. Introducción y Marco Teórico ............................................................................ 15 
1.1 Productos naturales ..................................................................................... 15 
1.1.1 Productos naturales ............................................................................... 15 
1.1.2 Streptomyces como fuente de productos naturales ............................... 17 
1.1.3 Métodos actuales para el descubrimiento de productos naturales y la 
elucidación de sus rutas biosintéticas ............................................................. 19 
1.2 Péptidos aldehídicos de bajo peso molecular inhibidores de proteasas ...... 24 
1.2.1 Características de los péptidos aldehídicos de bajo peso molecular 
inhibidores de proteasas ................................................................................. 24 
1.2.2 Importancia del estudio de los inhibidores de proteasas ....................... 26 
1.3 Antipaína y leupeptina .................................................................................. 28 
1.3.1 Química y actividad biológica de la antipaína ........................................ 28 
1.3.2 Química y actividad biológica de las leupeptinas ................................... 29 
1.3.3 Estudios biosintéticos de las leupeptinas ............................................... 31 
2. Hipótesis............................................................................................................ 33 
3. Objetivos ........................................................................................................... 33 
3.1 Objetivo General .......................................................................................... 33 
3.2 Objetivos Particulares .................................................................................. 33 
4. Materiales y Métodos ........................................................................................ 34 
4.1 Producción de leupeptina y antipaina .......................................................... 34 
6 
 
4.1.1 HPLC como técnica de detección de antipaina y leupeptina ................. 34 
4.1.2 Bioensayo para determinaractividad inhibitoria de proteasas por parte 
de leupeptina y antipaina ................................................................................ 37 
4.1.3 Espectrometría de masas para la detección de antipaina y leupeptina. 39 
4.2 Determinación de genes involucrados en la biosíntesis de leupeptina a 
través del desarrollo de una mutante de S. roseus no productora. ................... 40 
4.2.1 Fenotipificación de S. roseus MA839-A1 ............................................... 40 
4.2.2 Análisis genómico de S. roseus para la búsqueda de posibles clústeres 
involucrados en la biosíntesis de leupeptina ................................................... 40 
4.2.3 Diseño de una mutante de S. rosues no productora de leupeptina ...... 41 
4.2.3 Desarrollo de mutante de S. roseus no productora de leupeptina ......... 43 
4.2.3.1 Clonación de fragmentos LeupA1 y LeupH ........................................ 43 
4.2.3.2 Obtención de protoplastos de S. roseus. ............................................ 47 
4.2.3.3 Transformación de protoplastos de S. roseus con el vector pCR 2.1-
TOPO_LeupA1 ............................................................................................... 48 
4.2.3.4 HPLC como herramienta para la confirmación de la producción de una 
cepa de S. roseus no productora de leupeptina ............................................. 50 
4.2.3.5 Genotipificación como herramienta para la determinación de la 
producción de una cepa de S. roseus no productora de leupeptina ............... 51 
5. Resultados y discusión ...................................................................................... 54 
5.1 Obtención de Antipaina a partir de Streptomyces mauvecolor y de 
Leupeptina a partir de Streptomyces roseus. ..................................................... 54 
5.1.1 Obtención e identificación de cepas de S. mauvecolor y S. roseus ....... 54 
5.1.3 Bioensayos para la determinación de actividad inhibitoria de tripsina y 
papaina para confirmar la obtención de leupeptina y antipaina a partir de S. 
mauvecolor y S. roseus respectivamente. ...................................................... 59 
7 
 
5.1.4 Espectrometría de masas para la confirmación de la producción de 
Antipaína y Leupeptina ................................................................................... 62 
5.2 Determinación de genes involucrados en la biosíntesis de leupeptina ........ 66 
5.2.1 Análisis genómico de S. roseus ............................................................. 66 
5.2.2 Obtención de una mutante de S. roseus no productora de leupeptina .. 69 
5.2.2.1 Caracterización fenotípica de S. roseus ............................................. 69 
5.2.2.2 Clonación de fragmentos A1, A2 y H en pCR 2.1-TOPO .................... 72 
5.2.2.3 Transformación de S. roseus MA839-A1 con las secuencias 
homólogas A1 y H insertadas en pCR 2.1-TOPO ........................................... 78 
5.2.2.4 HPLC como herramienta para el análisis de posibles cepas mutantes 
de S. roseus incapaces de producir leupeptina. ............................................. 82 
5.2.2.5 Ensayo de inhibición de Tripsina como herramienta para el análisis de 
posibles cepas mutantes de S. roseus no productoras de leupeptina. ........... 85 
5.2.2.6 Espectrometría de masas como herramienta para el análisis de 
posibles cepas mutantes de S. roseus no productoras de leupeptina. ........... 86 
5.2.2.7 Genotipificación como herramienta para la confirmación de producción 
de una cepa mutante de S. roseus no productora de leupeptina .................... 92 
Conclusión............................................................................................................. 93 
Perspectivas .......................................................................................................... 95 
Referencias ........................................................................................................... 96 
Anexos ................................................................................................................ 108 
 
 
 
8 
 
Abreviaturas 
 
ARN: Ácido ribonucleico 
ATP: Adenosín trifosfato 
BLAST: Basic Local Alignment Search Tool 
CoA: Coenzima A 
DMSO: Dimetil sulfóxido. 
DNA: Ácido Desoxirribonucleico 
DNAC: Agar Nutritivo Birmex suplementado con casaminoácidos. 
dNTP: Dinucleótido trifosfato. 
LPM: Medio de producción de leupeptina (Leupeptin Production Media) 
NADPH: Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (reducido). 
NRPS: Sintetasa de péptidos no ribosomales (Non ribosomal peptide synthetase). 
PAβN: Fenilalanina-Arginina Beta-Naftilamida. 
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa (Poli Chain Reaction). 
PEG: Polietilenglicol 
PKS: Policétido Sintasa (Polyketide synthase) 
PN’s: Productos Naturales. 
SDS: Dodecil Sulfato de Sodio 
SVPIPM: Medio de producción de inhibidores de proteasas para Streptomyces 
violascens (Streptomyces violascens protease inhibitors production media). 
T10CaCom: Células de E. coli Top10 Calcio Competentes 
VHC: Virus de Hepatitis C 
VIH: Virus de Inmunodeficiencia Humana 
 
 
 
9 
 
Índice de Figuras 
 
Figura 1. Descubrimiento de antibióticos importantes y otros 
productos naturales a través de los años. 
20 
Figura 2. Estructura química de algunos péptidos 
aldehídicos. 
24 
Figura 3. Estructura química y peso molecular de la 
antipaina. 
29 
Figura 4. Estructura química y pesos moleculares de las 
leupeptinas I y II. 
30 
Figura 5. Producción de antipaina por S. roseus. 
(Cromatograma). 
57 
Figura 6. Cromatograma comparativo de la producción de 
antipaína por S. mauvecolor en diferentes medios. 
58 
Figura 7. Producción de antipaina por S. mauvecolor. 59 
Figura 8. Ensayo de inhibición de tripsina empleando 
extractos de S. roseus. 
61 
Figura 9. Ensayo de inhibición de tripsina empleando 
extractos de S. mauvecolor. 
 62 
Figura 10. Espectro de masas de las fracciones recolectadas 
empleando HPLC a partir de los metabolitos del 
cultivo de S. mauvecolor en ISP1P. 
 
64 
10 
 
Figura 11. Espectro de masas correspondientes al análisis de 
las fracciones recolectadas empleando HPLC del 
cultivo de S. roseus en LPM. 
65 
Figura 12. Esquema de la biosíntesis de leupeptina propuesta 
de acuerdo a los trabajos de Suzukake y 
colaboradores. 
68 
Figura 13. Esquema del clúster identificado como el 
responsable de la biosíntesis de la leupeptina. 
69 
Figura 14. Crecimiento de S. roseus MA839-A1en diferentes 
medios sólidos. 
70 
Figura 15. Esquema que muestra de manera general el 
mecanismo por el cual ocurre una inactivación 
insercional vía entrecruzamiento sencillo. 
72 
Figura 16. Mapa del vector pCR2.1-TOPO. 73 
Figura 17. Optimización de PCR para la amplificación de 
fragmentos A1, A2 y H utilizando gradiente de 
temperatura. 
74 
Figura 18. PCR para determinar la presencia de los 
fragmentos A1 y H en posibles clonas positivas. 
75 
Figura 19. Digestión de fragmentos A1 y H para la 
determinación de clonas positivas. 
76 
Figura 20. Captura de pantalla del programa BioEdit. 77 
Figura 21. Captura de pantalla del programa BioEdit. 77 
11 
 
Figura 22. Obtención de stock de protoplastos a partir de la 
cepa S. roseus. 
79 
Figura 23. Fenotipificación de posibles mutantes de S. roseus 
no productoras de leupeptina. 
81 
Figura 24. Comparación de cromatogramas obtenidos a partir 
del estándar de leupeptina y los metabolitos 
obtenidos a partir de los cultivos en LPM de las 
posibles clonas mutantes. 
82 
Figura 25. Comparación de cromatogramas del estándar 
auténtico de leupeptina y de los metabolitos 
obtenidos a partir de S. roseus, la colonia 17 y la 
colonia 19. 
84 
Figura 26. Ensayo de inhibición de tripsina empleando los 
extractos obtenidos empleando HPLC a partir de 
los metabolitos de S. roseus MA839-A1 lineas 
rosas y de la colonia 17. 
86Figura 27. Espectros de masas obtenidos a partir del análisis 
de la fracción obtenida en HPLC con el pico 
observado al tiempo de retención 14.2 min a partir 
del estándar auténtico de leupeptina 1 mg/ml. 
 
 
 
88 
12 
 
Figura 28. Espectros de masas obtenidos a partir del análisis 
de la fracción obtenida en HPLC con el pico 
observado al tiempo de retención 14.2 min a partir 
de los metabolitos producidos por S. roseus 
MA839-A1. 
89 
Figura 29. Espectros de masas obtenidos a partir del análisis 
de la fracción obtenida en HPLC con el pico 
observado al tiempo de retención 14.3 min a partir 
de los metabolitos producidos por la colonia 19. 
90 
Figura 30. Espectros de masas obtenidos a partir del análisis 
de la fracción obtenida en HPLC con el pico 
observado al tiempo de retención 14.3 min a partir 
de los metabolitos producidos por la colonia 17. 
91 
Figura 31. Se muestra el resultado de la PCR realizada a la 
colonia 17 para identificar la inserción del vector 
pCR2.1-TOPO_LeupA en su genoma. 
92 
 
 
 
 
 
 
 
13 
 
Índice de Tablas 
 
Tabla 1. Algunos SPA’s y sus características. 25 
Tabla 2. Formulación de medios empleados para la 
producción de leupeptina y antipaina. 
34 
Tabla 3. Ensayo de inhibición de tripsina. 38 
Tabla 4. Ensayo de inhibición de papaina. 38 
Tabla 5. Secuencias de oligos diseñados para el desarrollo 
de mutante de S. roseus no productora de 
leupeptina. 
41 
Tabla 6. Componentes de PCR con gradiente de 
temperatura. 
42 
Tabla 7. Programa empleado para PCR con gradiente de 
temperatura. 
42 
Tabla 8. Condiciones de la digestión para confirmar la 
clonación de fragmentos LeupA y LeupH en el 
vector pCR2.1-TOPO 
46 
Tabla 9. Componentes de PCR para confirmación 
genotípica de mutantes de S. roseus no 
productoras de leupeptina. 
52 
Tabla 10. Programa empleado para PCR para la 
confirmación genotípica de mutantes de S. roseus 
no productoras de leupeptina. 
53 
Tabla 11. Resultados del antibiograma realizado a S. roseus. 71 
Tabla 12. Cantidad de posibles mutantes observadas por 
placa con medio ISP4 en presencia de 
Kanamicina. 
80 
 
 
 
 
 
14 
 
Resumen 
 
Los productos naturales (PN's) son un grupo de compuestos bioactivos producidos por 
microrganismos con diversas aplicaciones médicas e industriales. También son conocidos 
con metabolitos secundarios, ya que no están relacionados de manera directa con los 
procesos crecimiento y desarrollo del microorganismo productor, pero sí juegan un rol 
importante en procesos adaptativos. Los PN's presenta características químicas y 
funciones biológicas muy diversas. Dentro de este grupo de compuestos se encuentran 
los péptidos aldehídicos de bajo peso molecular con actividad inhibitoria de proteasas 
(SPA's), los cuales han sido estudiados desde la década de los setentas. Estas moléculas 
son de gran relevancia médica e industrial debido a que las protestas están involucradas 
en varios procesos patogénicos e infecciosos, además de que los inhibidores de 
proteasas son altamente usados en la industria y la investigación biotecnológica. 
 
Esta tesis se centra en el estudio de los genes involucrados en la biosíntesis de 
leupeptina, la cual es un SPA producido por Streptomyces roseus, cuya estructura y 
bioquímica básica de su biosíntesis fueron elucidadas en los sententas (Suzukake et. al., 
1972, 1979 y 1980); sin embargo la genética detrás de dicho compuesto se ha mantenido 
desconocida desde entonces. 
Empleando herramientas de genómica y el conocimiento generado por Umezawa, 
Suzukake y colaboradores, fue posible identificar y teorizar un cluster biosintético, 
conformado por un gen codificante para una NRPS y un gen codificante para una arginino 
succinato liasa, involucrado en la biosíntesis de leupeptina. A través de la obtención de 
este compuesto en las condiciones de nuestro laboratorio, y la utilización de herramientas 
de bioinformática, biología molecular y química analítica fue posible la obtención de una 
mutante de S. roseus no productora de leupeptina que permitió confirmar que la NRPS 
teorizada como la involucrada en la biosíntesis de este compuesto es la indicada. 
 
Los resultados aquí obtenidos permitirán ampliar el conocimiento respecto a la biosíntesis 
de los SPA's, y podrán ser empleados con fines biotecnológicos. 
 
15 
 
1. Introducción y Marco Teórico 
 
1.1 Productos naturales 
 
1.1.1 Productos naturales 
 
Los productos naturales (PN’s) son compuestos bioactivos producidos por 
microorganismos que tienen una gran relevancia médica, además de ser 
ampliamente utilizados en otras áreas como la industria agrícola o el área de la 
investigación como herramientas de uso cotidiano. Los productos naturales 
también han sido denominados metabolitos especializados o metabolitos 
secundarios. Un compuesto es clasificado como metabolito especializado si no 
parece tener una función directa en los procesos de desarrollo y crecimiento del 
microorganismo productor, pero se espera que dicho compuesto sea requerido 
para una mayor adaptación y su supervivencia en su nicho ecológico (Keulen y 
Dyson, 2014). 
 
Tras el descubrimiento de la penicilina por Fleming en 1928, Selman Waksman y 
sus colaboradores en Oxford, Estados Unidos, se dieron a la tarea de buscar 
nuevos antibióticos. Waksman estaba convencido que los diferentes microbios 
presentes en el suelo competían entre ellos para sobrevivir en el mismo nicho, y 
sostenía la idea de que estos microorganismos debieron haber evolucionado de tal 
forma que debían producir diversos agentes químicos que les confirieran ventajas 
y ganancias al momento de enfrentarse entre ellos. Esta idea fue reforzada por la 
observación de que bacterias causantes de enfermedades sobrevivían por 
periodos de tiempo muy cortos en el suelo, lo cual sugirió que los 
microorganismos presentes en éste se encargaban de destruirlas. A partir de 
estas ideas, en el laboratorio de Waksman se llevaron a cabo una serie de 
extensos experimentos donde se aislaron diferentes microorganismos del suelo y 
se probó su capacidad para matar determinados agentes infecciosos. De todos los 
16 
 
microorganismos probados, fueron en su gran mayoría los actinomicetos quienes 
presentaron propiedades antibióticas. (Hopwood, 2007) 
 
Sin embargo, los primeros antibióticos en ser obtenidos de estos experimentos 
presentaron una alta toxicidad por lo que su uso terapéutico no resultó viable. Fue 
en 1943 cuando Albert Schatz, un alumno de posgrado en el laboratorio de 
Waksman, encontró un nuevo antibiótico producido por una cepa de Streptomyces 
griseus, una bacteria del phyllum Actinobacteria. Dicho antibiótico recibió el 
nombre de estreptomicina y se comprobó su eficacia para matar patógenos Gram 
negativos y en el tratamiento de la tuberculosis, enfermedad para la cual en dicha 
época no existía tratamiento efectivo, sin causar toxicidad. (Hopwood, 2007) 
 
Fue a partir de ese momento que los científicos alrededor del mundo se dieron a la 
tarea de buscar nuevos antibióticos y otros productos naturales producidos por 
microorganismos. Desde los años cuarenta hasta finales de los sesenta hubo un 
periodo que se conoció como la “Época Dorada de los Antibióticos”, pues fue 
dentro de estos años que se descubrieron la gran mayoría de los antibióticos que 
hoy se utilizan. Sin embargo, después de este periodo, el descubrimiento de estas 
moléculas descendió estrepitosamente (Hopwood, 2007). 
 
En la actualidad las bacterias del orden de los actinomicetos se reconocen como 
los productores de PN’s más prominentes. Estos incluyen compuestos como 
antibióticos (ej. Eritromicina, tetraciclinas, ácido calvulánico, vancomicina y 
compuestos con estructuras similares como telavancina y claritromicina, los 
lipopeptidosdaptomicina y dalbavicina que fueron recientemente aprobados por la 
FDA, y nuevas carbapenemas (comola thienamicina), antifúngicos (ej. Nistatina y 
candicidina), antivirales (ej. Complestatina y cloropeptinas que funcionan como 
inhibidores de VIH), fármacos inmunosupresores y anticancerosos (ej. 
Rapamicina, FK506, daunorubicina y doxorubicina), agentes antiparasitarios (ej. 
Avermectina y espiramicina), fármacos para controlar niveles de colesterol (ej. 
Pravastatin) y fármacos antidiabéticos (ej. Acarbosa) (Keulen y Dyson, 2014). 
17 
 
1.1.2 Streptomyces como fuente de productos naturales 
 
El género Streptomyces está conformado por bacterias filamentosas Gram 
positivas que pertenecen al phylum de las actinobacterias. Típicamente colonizan 
suelos terrestres y sedimentos marinos como bacterias saprofitas, inmóviles y de 
vida libre. Estas bacterias muestran complejas respuestas morfológicas y 
fisiológicas que les permiten adaptarse a la variabilidad de sus ambientes, de esta 
manera se pueden enfrentar a estreses tanto bióticos como abióticos (ej. Cambios 
en la humedad del suelo o la competencia con otros organismos presentes en el 
mismo nicho). Además, debido a que secretan una amplia variedad de enzimas 
hidrolíticas pueden romper complejos polímeros biológicos y por tanto jugar un rol 
importante en los ciclos de carbono y nitrógeno (Chater et. al., 2010). 
 
El estudio formal del género Streptomyces comenzó en la década de los cuarenta, 
y la caracterización de este género se dio a la par de la búsqueda de nuevos 
antibióticos (Hopwood, 2007). Dentro del orden de los actinomicetos, es la familia 
Streptomycetaceae la que produce la mayor cantidad de PN’s en todos los reinos. 
Esta familia ha producido el más alto número de fármacos cuyo uso ha sido 
aprobado en pruebas clínicas para su posterior uso terapéutico (Zhu et al, 2011). 
Además, debido a su naturaleza saprófita, los estreptomicetos crecen en casi 
cualquier polímero natural, y como tales son un recurso rico de enzimas 
industriales (Bhosale et. al. ,1996). 
 
La producción de los productos naturales por parte de las bacterias del género 
Streptomyces está ligada al proceso de esporulación en condiciones naturales o 
en medios de cultivo solido en el laboratorio. Durante su desarrollo morfológico, el 
crecimiento de las hifas es llevado a cabo gracias a la muerte programada de 
células en ciertas partes del micelio vegetativo y a la reutilización de las 
macromoléculas que son liberadas en este proceso. Mientras esto sucede, otras 
partes del micelio vegetativo pasan por una diferenciación fisiológica la cual lleva a 
la biosíntesis de metabolitos especializados. (Alam et al., 2010). 
 
18 
 
En cultivos liquidos estos acontecimientos no siempre están acoplados, ya que 
existen cepas de este género que no esporulan en este tipo de cultivos, sin 
embargo en estos casos la producción de PN’s se observa al final de la fase de 
crecimiento exponencial y se extiende en la fase estacionaria (Alam et al., 2010). 
 
Las enzimas involucradas en la síntesis de los PN’s se encuentran generalmente 
codificadas en clústeres de genes. Un clúster de genes es un conjunto de genes 
que codifican péptidos o proteínas similares que colectivamente comparten una 
función generalizada y tienen loci cercanos. En el caso de los clústeres 
biosintéticos, estos pueden estar conformados desde unos cuantos genes hasta 
más allá de una docena dependiendo de la complejidad del producto final 
sintetizado por las enzimas codificadas en ellos (Osbourn, 2010). Sin embargo, no 
todos los genes de una ruta biosintética deben estar localizados en un solo clúster, 
ya que pueden estar presente en más de uno, e incluso algunos genes pueden 
estar localizados independientemente a lo largo del genoma, aunque estos casos 
son poco comunes (Kimura et al., 2007). Cabe mencionar que los clústeres de 
genes biosintéticos parecen funcionar como unidades evolutivas, esto a partir de 
la observación de cepas cercanamente relacionadas que pueden tener clústeres 
de genes ortólogos y que además pueden contener pseudogenes que han sido 
inactivados debido a la acumulación de mutaciones (Hopwood, 2012). 
 
En cuanto a su arquitectura genómica, los Streptomyces contienen un único 
cromosoma lineal con un alto contenido de C + G. Este cromosoma tiene un 
“núcleo” que corresponde a aproximadamente la mitad del tamaño total del 
cromosoma y contiene prácticamente todos los genes que son considerados como 
indispensables para el crecimiento y desarrollo de la bacteria. La mayoría de los 
clústeres biosintéticos que codifican las proteínas involucradas en la biosíntesis de 
productos naturales tienden a localizarse en los brazos del cromosoma (Chandra y 
Chater, 2013). 
 
19 
 
Empleando herramientas de comparativa genómica se puede apreciar que existe 
una mayor divergencia entre los brazos del cromosoma que entre los núcleos 
cuando se alinean varios genomas de diferentes especies de Streptomyces (Kirby 
y Chen, 2011). Además del cromosoma, los clústeres biosintéticos también 
pueden encontrarse en plásmidos. Estos plásmidos divergen mucho en sus 
características: los hay de diferentes tamaños, número de copia, topología y 
autonomía. (Bentley et al., 2004) 
 
 
1.1.3 Métodos actuales para el descubrimiento de productos naturales 
y la elucidación de sus rutas biosintéticas 
 
Durante la “Época dorada de los antibióticos”, no solo fueron este tipo de 
moléculas las que se descubrieron, ya que además de antibióticos fueron diversos 
productos naturales los descubiertos con diferentes propiedades bioactivas. Estos 
compuestos fueron encontrados empleando técnicas clásicas de bioquímica y de 
química analítica que en aquel entonces fueron suficientes para identificar y 
caracterizar una gran cantidad de moléculas. El trabajo microbiológico realizado 
consistió en aislar la mayor cantidad posible de bacterias de diferentes grupos 
taxonómicos, principalmente de suelos de diversos ecosistemas. Estados Unidos y 
Japón fueron los países líderes en el área y todo este trabajo lo llevaban a cabo a 
la par grupos de investigación en diferentes universidades y compañías 
farmacéuticas. El conocimiento generado y las ganancias económicas fueron 
muchas y se dejaron establecidos los antecedentes para el estudio de PN’s. Sin 
embargo, llegó un punto donde el descubrimiento de los productos naturales inició 
un declive importante, y las moléculas descubiertas que presentaban una 
verdadera eficacia y poca toxicidad cada vez fueron menos (Hopwood, 2007). 
 
20 
 
 
 
Figura 1. Descubrimiento de antibióticos importantes y otros productos naturales a través de los años. 
(Hopwood, 2007) 
 
En los últimos 15 años, a partir del desarrollo de la genómica, la metabolómica, la 
transcriptómica y de novedosas herramientas bioinformáticas ha sido posible el 
análisis de los genomas de diversas especies bacterianas en búsqueda de 
clústeres y genes involucrados en la biosíntesis de PN’s. Estos avances han dado 
como resultado el descubrimiento de un gran número de moléculas candidatas a 
ser PN’s y de genes candidatos involucrados en su biosíntesis. Incluso se ha 
llegado a mencionar que hasta este momento solo conocemos “la punta del 
iceberg” en cuanto a productos naturales (Hopwood, 2007). 
 
Como ejemplo de lo anterior, antes de que se contara con todas estas 
herramientas, se sabía que S. coelicolor era productor de cinco PN’s (Medema et 
al., 2011), y cuando se secuenció el genoma de esta bacteria se encontraron 
7,825 genes codificados en este genoma, dentro de estos genes se determinó la 
presencia de 20 clústeres biosintéticos los cuáles codifican las enzimas 
involucradas en la biosíntesis de los 5 productos naturales ya conocidos y otras 8 
moléculas igualmente conocidas (antibióticos, lípidos, pigmentos, sideróforos y 
otras moléculas), sin embargo el resto de los clústeres codificaban enzimas 
21 
 
involucradas en la producción de compuestos no encontradoscon anterioridad y 
cuya estructura fue posible solo predecir (Bentley et. al., 2002). Sin embargo, en 
un estudio reciente al realizarse la minería de este genoma se determinó que S. 
coelicolor tiene el potencial para producir 34 compuestos candidatos a ser 
considerados como metabolitos especializados, y que estos pertenecen a 17 
clases de compuestos químicos diferentes. Además, en este trabajo se determinó 
la participación de nuevas enzimas en la biosíntesis de PN’s, lo cual amplió el 
conocimiento no solo en cuanto a la búsqueda de nuevos PN’s sino a los procesos 
catalíticos involucrados en sus síntesis lo cual tiene un gran potencial para ser 
aplicado en la industria biotecnológica (Challis, 2013). 
 
 
Cabe mencionar que a pesar de tener una gran cantidad de moléculas teorizadas, 
aún no se conocen las condiciones bajo las cuáles muchas de ellas son 
biosintetizadas ni las cascadas de regulación o señales externas bajo las cuáles 
puede estar sujeta su producción, es decir, no se conoce las condiciones bajo las 
cuales se expresan los genes que codifican las enzimas involucradas en su 
biosíntesis. Cuando esto sucede, se cree que se tiene identificado un clúster 
críptico. En la etapa experimental se deben probar diferentes medios y 
condiciones para que dichos genes se expresen y se produzcan en el laboratorio 
los nuevos PN’s (Hopwood, 2007). 
 
Un ejemplo de la elucidación de un producto natural y el clúster génico involucrado 
en su biosíntesis es el caso de la flavopeptina, la cual es un péptido aldehídico con 
actividad inhibitoria de proteasas como la papaina y la calpaina humana. Este 
compuesto fue purificado a partir de un cultivo de Streptomyces sp. NRRL-F6652, 
el cuál es una especie muy cercana a S. flavogriseus, y su estructura fue 
dilucidada empleando precursores marcados radioactivamente y espectrometría 
de masas. Empleando herramientas de proteómica se determinó que dos 
sintetasas de péptidos no ribosomales (NRPS, por sus siglas en inglés) están 
involucradas en la síntesis de este compuesto. Estas enzimas son capaces de 
22 
 
sintetizar cadenas peptídicas sin necesidad de ARN mensajero, además de ser 
capaces de hacerlo a partir de aminoácidos no proteinogénicos, es decir 
aminoácidos con modificaciones químicas, incluso estas enzimas son capaces de 
producir dichas modificaciones. Una vez que se determinaron los dominios 
presentes en estas NRPS y analizando el genoma de la cepa productora fue 
posible relacionar ambas enzimas con un clúster críptico (Chen y McClure, 2013). 
 
Los análisis genómicos no solo permiten el descubrimiento de nuevos PN’s, si no 
también ayudan a elucidar las rutas biosintéticas de compuestos ya conocidos. 
Conocer los genes involucrados en la ruta biosintética de un producto natural tiene 
diferentes perspectivas. En primer lugar la producción industrial de dichos 
compuestos se puede ver favorecida al tomar los genes involucrados en la 
biosíntesis de un PN e introducirlos en un sistema de sobre expresión que permita 
obtenerlo en mayores cantidades. 
 
Por otra parte, se puede llevar a cabo la ingeniería de rutas metabólicas. Un 
ejemplo de esto es el caso de los análogos de eritromicina llamados cetólidos. 
Estas moléculas se crearon originalmente empleando herramientas de química 
sintética a partir de eritromicina A al realizar la lisis ácida de la cladinosa (una 
hexosa que se encuentra en muchos antibióticos unida a un anillo macrólido), la 
oxidación del grupo 3-hidroxil a un grupo ceto y posteriores modificaciones 
químicas (Agouridas et. al., 1998). Un año después de esta innovación, científicos 
de la empresa farmacéutica Kosan idearon una ruta alternativa para la síntesis de 
estos compuestos. Primero un nuevo precursor de eritromicina fue sintetizado y 
se adhirió a una molécula capaz de mimetizarse como coenzima A (CoA) lo 
suficientemente pequeña para entrar a las células. Posteriormente éste iniciador 
artificial fue suministrado a una cepa de S. colicolor la cuál había sido diseñada 
para contener una policétido sintasa (PKS) de eritromicina diferente de la enzima 
natural al contener una cetosintasa inactiva en el primer módulo. Esto significa que 
la molécula iniciadora administrada a la bacteria (un dicétido análogo al producto 
que el primer módulo produciría normalmente) se saltó el primer paso de 
23 
 
condensación y fue aceptada por el segundo módulo. El producto siguió la línea 
de ensamblado en la PKS y el resultado fue un nuevo policétido con un grupo 
funcional interesante en la posición donde el iniciador normal se hubiera 
localizado. El compuesto resultante, un policétido, fue purificado y administrado a 
cultivos de una cepa de Sac. erythraea a la cual se le eliminaron los genes de la 
PKS involucrada en la biosíntesis de eritromicina, pero no los otros genes 
involucrados en los últimos pasos de la biosíntesis de este compuesto. El 
resultado fue que esta cepa convirtió el nuevo policétido en una nueva 
eritromicina. Finalmente, unos pasos más de química sintética dieron lugar a la 
producción de varios compuestos químicos con un gran potencial para ser 
cetólidos nuevos (McDaniel et. al., 1999). Estos nuevos compuestos son capaces 
de inhibir los ribosomas de patógenos que se han convertido resistentes a la 
eritromicina convencional (Hutchinson y McDaniel, 2001). 
 
Aunque los antibióticos han sido las moléculas más reportadas y estudiadas desde 
el comienzo de la explotación de los PN’s, como ya se mencionó, los PN’s pueden 
tener diversas funciones biológicas y pertenecer a distintas familias químicas. Esta 
tesis es un estudio biosintético de una familia de compuestos caracterizados 
químicamente por ser péptidos de bajo peso molecular que cuentan con un grupo 
aldehídico en su estructura y cuya actividad biológica consiste en ser inhibidores 
de proteasas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
24 
 
1.2 Péptidos aldehídicos de bajo peso molecular inhibidores de 
proteasas 
 
1.2.1 Características de los péptidos aldehídicos de bajo peso 
molecular inhibidores de proteasas 
 
Los péptidos aldehídicos son cadenas peptídicas cuya característica principal es la 
presencia de un grupo aldehídico en su extremo N-terminal (Figura 2). La cantidad 
de aminoácidos presentes en la cadena puede ser variable y estos pueden 
presentar diversas modificaciones y grupos funcionales e incluso incluir grupos 
ciclicos. Estos compuestos son producidos por diversos microorganismos, sin 
embargo en los últimos años también se han desarrollados diversas estrategias 
para su síntesis química y su modificación debido a la importante actividad 
biológica que presentan (Jakubke, 2008). 
 
Figura 2. Estructura química de algunos péptidos aldehídicos. En el círculo rojo se resalta el grupo aldehídico 
en el extremo N-terminal. (Kisselev et. al., 2012, modificado) 
 
Los péptidos aldehídicos fueron los primeros inhibidores de proteasas en ser 
desarrollados y debido a su relativo bajo costo, aún son los más ampliamente 
utilizados. Estos compuestos actúan formando enlaces covalentes reversibles con 
las treoninas, grupos tioles o hidroxilos de los sitios activos de las proteasas 
formando un hemiacetal. Existen diferentes tipos de péptidos aldehídicos 
producidos por diferentes microorganismos y no todos inhiben el mismo tipo de 
proteasas (Tabla 1) (Kisselev et. al., 2012). 
 
MG-132 PSI Felutamida B 
 
 
25 
 
Tabla 1. Algunos SPA’s y sus características. 
Compuesto Cepa productora Blanco 
Clase de 
proteasas que 
inhibe 
Referencia 
Antipaina 
Streptomyces 
yokosukanensis MC829-
AS1, Streptomyces 
mauvecolor 
Tripsina, 
Plasmina, 
Papaina 
Serin/Cistein 
proteasas 
(Suda et. al. 1972) 
(Umezawa et. al. 1972) 
Quimostatina 
Streptomyces 
hygroscopicus MC521-
C8, Streptomyces 
lavendulae MC524-C1 
Quimotripsina
, Papaina 
Serin/Cistein 
proteasas 
(Umezawa et. al. 1970) 
(Tatsutaet. al. 1973) 
Leupeptinas Streptomyces roseus MA839-A1 
Tripsina, 
Plasmina, 
Papaina, 20s 
proteosoma 
Serin/Cistein/Tre
onin proteasas (Aoyagi et. al. 1969) 
Elastatinal Streptomyces griseoruber MD 469-CG8 Elastasa Serin proteasas 
(Umezawa et. al. 1973) 
(Okura et. al. 1975) 
Pepstatina 
Streptomyces testaceus 
Hamada et Okami, 
Streptomyces argenteolus 
var. Toyonakensis 
Pepsina, 
Gastricsina 
Catepsina D y 
Renina 
Aspartato 
proteasas 
(Umezawa et. al. 1970) 
 
MAPI´s Streptomyces nigrescens WT-27 Subtilisina 
Alkaline 
proteasas 
(Murao y Watanabe, 
1978) 
 
Flavopeptina 
Streptomyces sp. NRRL-
F6652, Streptomyces f 
lavogriseus ATCC 33331 
Papaina, 
calpainaa Cistein proteasas (Chen et. al. 2013) 
Nerfilina Streptomyces halstedii 2723-SV2 
Cathepsin, 
Papaina Cistein proteasas (Hirao et. al. 1995) 
Staccopinas Staphylococcus 
tanabeensis 
Calpaina, 
Papaina Cistein proteasas (Saito et. al. 1987) 
Strepina Streptomyces 
tanabeensis (SAB-934) 
Tripsina, 
Papaina, 
calpaina 
Serin/Cistein 
proteasas (Ogura et. al. 1985) 
Tiropeptinas Kitasatospora sp. MK993-dF2 
20s 
Proteosoma 
Treonin 
proteasas (Momose et. al. 2001) 
Tirostatina Kitasatospora sp. Strain 55 
Papaina, 
Ficina y 
Carboxil 
proteinasas 
Carboxyl 
proteinases/ 
Cistein proteasas 
(Oda et. al. 1989) 
Bacitrocinas Bacillus laterosporus Laubach NR2988 
Trombina, 
Factor Xa, 
Tripsina y 
Papainaa 
Serin 
proteasas/Thiol 
proteasas 
(Kamiyama et. al. 1994) 
Tiolstatina Bacillus cereus EY-21 Papaina, Tripsina 
Serin/Cistein 
proteasas (Murao et. al. 1985) 
Acetyl-
Leu_arginal o 
Caricastatina 
Cepa bacteriana sin 
identificar BMG520-yF2 y 
Nigrosabulum novosp. 
Dipeptidil 
aminopeptida
sa III, 
Papaina, 
Fisin, 
Bromelain 
Cistein y Serin-
(Tiol proteasas) 
(Nishikiori et. al. 1984) 
(Murao et. al. 1987) 
Fellutamidas Penicillum fellutanum 20s Proteosoma 
Treonin 
proteasas (Shigemori et. al. 1991) 
GE20372 Streptomyces sp. ATCC 55925 
HIV-1 
aspartico 
proteasas 
Aspartico 
proteasas (Stefanelli et. Al. 1995) 
 
26 
 
1.2.2 Importancia del estudio de los inhibidores de proteasas 
 
Las proteasas son enzimas que producen proteólisis, es decir, a través de 
reacciones de hidrólisis rompen enlaces peptídicos que unen a los aminoácidos 
presentes en las proteínas. Las enzimas proteolíticas comprenden más del 2 % 
del proteoma conocido y su participación en muchos procesos biológicos ha sido 
bien establecida (Di Cera, 2011). 
 
En el caso de los seres humanos, sus papeles fisiológicos incluyen procesos tan 
diversos como el desarrollo, la digestión, la coagulación, la inflamación y la 
inmunidad (Di Cera, 2011). Entre las diversas patogenias en las cuáles se 
encuentran involucradas las proteasas, una de las más estudiadas es la 
enfermedad de Alzheimer, en la cual una aspartil proteasa está involucrada en la 
acumulación de péptidos beta amiloides, formadores de las placas características 
de esta enfermedad. Partiendo de dicha información, durante los últimos años se 
ha considerado a los inhibidores de proteasas como respuesta terapéutica a esta 
enfermedad. (Beher y Graham, 2005). Otro proceso patológico importante en el 
cuál están involucradas las proteasas es el cáncer: Se ha demostrado que la 
función anormal del proteosoma está altamente relacionado con procesos 
cancerígenos ya que durante el desarrollo del cáncer las cinasas dependientes de 
cilclinas, proteínas encargadas de la regulación del ciclo celular, son degradadas 
de manera exacerbada (Kisselev et. al., 2012). 
 
En el caso de los microorganismos además de tener diferentes papeles 
fisiológicos, las proteasas son potentes factores patogénicos. La gran mayoría de 
las proteasas son secretadas hacia los hospederos infectados y producen una 
amplia gama de daños que va desde dolor y edema, hasta un shock sistémico 
cuando estas ayudan a que el agente patógeno pase del sitio de infección hacia el 
sistema circulatorio (Maeda, 1996). 
 
 
27 
 
En los últimos años, tambien se ha demostrado que las proteasas juegan un papel 
sumamente importante en la virulencia de Pseudomonas aeruginosa, bacteria 
oportunista altamente relacionada a infecciones nosocomiales, y que el 
tratamiento de infecciones producidas por esta bacteria con inhibidores de 
proteasas resulta efectivo (Hoge et. al., 2010). 
 
En los virus, las proteasas juegan un papel muy importante, ya que muchos 
producen todas sus proteínas como una solo poliproteína, y son las proteasas 
codificadas en el genoma de estos virus las encargadas de romper esta 
poliproteína y dar paso a las proteínas maduras encargadas del ensamblaje del 
virus (Lendeckel y Hooper, 2009). En las últimas dos décadas el uso de 
inhibidores de proteasas ha sido uno de los avances más significativos en el 
tratamiento de infecciones producidas por virus, como es el caso del tratamiento 
contra el virus de la inminodeficiencia humana (VIH) (Wu et. al., 2014) y el 
tratamiento contra el virus de la hepatitis C (VHC) (Pol y Corouge, 2014). 
 
Además de los usos terapéuticos, los inhibidores de proteasas son herramientas 
útiles en áreas como la biotecnología y la investigación biológica. Ejemplo de esto 
es su uso para evitar la degradación de proteínas expresadas heterologamente 
(Archer et. al., 1992) y su uso como inhibidores del proteosoma cuando se 
investigan proteínas que son rápidamente degradadas después o durante una 
respuesta celular (Lee y Goldberg, 2008). 
 
Entre los péptidos aldehídicos de bajo peso molecular inhibidores de proteasas, la 
antipaína y la leupeptina son de los más empleados y comercializados. Ambos 
compuestos se emplean por lo regular en forma de cocteles acompañados de 
otros inhibidores de proteasas como quimostatina y aprotonina. (Sigma-Aldrich, 
2014) 
 
Entre los usos terapéuticos en desarrollo más recientes de estos compuestos se 
encuentra su uso como agentes contra la malaria, ya que se ha demostrado que 
28 
 
su uso ayuda a inhibir el desarrollo de Plasmodium flaciparum, el agente causante 
de ésta enfermedad (Lisk et. al., 2008). De igual manera han demostrado ser 
eficientes en el tratamiento de gingivitis al inhibir los procesos inflamatorios 
causados por la bacteria Porphyromonas gingivalis (Kitano et. al., 2001). 
 
En cuanto a su valor comercial, la leupeptina puede ser adquirida en forma de una 
sal hemisulfatada con un valor comercial de 818 MXP por mg (Sigma-Aldrich, 
2014) y la antipaína se puede adquirir como antipaina hidroclorada con un valor 
comercial de 750 MXP por mg (Sigma-ALdrich, 2014). 
 
Debido a todas las aplicaciones mencionadas, no sorprende la gran importancia 
que recae en la investigación de los inhibidores de proteasas y por ende, su 
extenso uso en diferentes áreas y en consecuencia el alto valor comercial que 
estos han adquirido. 
 
 
1.3 Antipaína y leupeptina 
1.3.1 Química y actividad biológica de la antipaína 
 
La antipaina es un péptido aldehídico de bajo peso molecular que fue descubierto 
a principios de la década de 1970 por Suda y colaboradores en el Instituto de 
Química Microbiana en Tokio, Japón. Este compuesto fue encontrado en los 
filtrados de cultivos de varias especies de actinomicetos entre los que se 
encuentran Streptomyces yokosukanensis, Streptomyces michiganensis, 
Streptomyces mauvecolor y Actinomyces violascens. Se demostró que la 
antipaína presenta una potente actividad inhibitoria de serin y cistein proteasas 
como la tripsina, la papaina y la plasmina (Suda et. al., 1972). 
 
La estructura de la antipaina se obtuvo empleando técnicas químicas para la 
fragmentación del compuesto y los iones obtenidos fueron analizados empleando 
espectrometría de masas. Se determinó que la estructura química de la antipaina 
29 
 
es [(s)-1-carboxi-2-feniletil] carbamoil-L-arginil-L-vanil-argininal (Figura 3). 
(Umezawa et. al., 1972). 
 
 
 
Figura 3. Estructura química y pesomolecular de la antipaina. 
 
1.3.2 Química y actividad biológica de las leupeptinas 
 
 
Las leupeptinas son una clase de péptidos aldehídicos de bajo peso molecular que 
fueron obtenidos a finales de la década de 1960 a partir de filtrados de cultivos de 
diferentes especies de actinomicetos, entre los que destacan S. roseus, S. 
roseochromogenes, S. alberticuli y S. lavendulae, entre muchos otros. Se 
determinó que las leupeptinas presentan una potente actividad inhibitoria de 
cistein, serin y treonin proteasas (Umezawa et. al., 1969). 
 
 
Hasta el momento se han descrito dos leupeptinas diferentes, cuya variación en su 
estructura química está localizada en el sustituyente que tienen en el extremo 
amino terminal. La fórmula química de la leupeptina I es acetil-L-leucil-L-leucil-DL-
argininal y la de la leupeptina II es propionil-L-leucil-L-leucil-DL-argininal (Figura 4). 
La leupeptina I es producida en mayores cantidades por los microorganismso 
productores, y por tanto es la que se comercializa más frecuentemente (Umezawa, 
1969). 
 
Antipaina 
PM: 604.7 
30 
 
 
Figura 4. Estructura química y pesos moleculares de las leupeptinas I y II 
 
Empleando como modelo de estudio a Streptomyces exfoliatus SMF13 se ha 
ligado a la leupeptina a los procesos de desarrollo del micelio. En cultivos 
sumergidos, todo parece indicar que esta cepa produce proteasas extracelulares 
cuando requiere degradar fuentes de nitrógeno como el caseinato de sodio 
presentes en el medio y la leupeptina es producida a la par para regular que el 
proceso de proteólisis no afecte a las proteínas de la misma bacteria, pero cuando 
la glucosa del medio se agota entonces la bacteria produce una enzima capaz de 
degradar la leupeptina para permitir el uso de las proteasas extracelulares. Esto 
sugiere que las proteasas participan en la incorporación del caseinato no solo 
como fuente de nitrógeno sino también como fuente de carbono en caso de 
requerirse. También se observó que cuando la bacteria crece en medios donde la 
producción de proteasas esta reprimida debido a que el medio contiene fuentes de 
nitrógeno pequeñas y accesibles (como los casaminoácidos), aun así las 
leupeptinas se producen, e incluso su producción se mantiene constante durante 
todo el desarrollo de la bacteria. (Kim, 1996) 
 
Cuando esta misma cepa se pone a crecer en un medio sólido, se ha observado 
que cuando el micelio aéreo se empieza a formar y los nutrientes del medio 
comienzan a agotarse, el micelio vegetativo, el cuál es el que se encuentra 
sumergido en el medio sólido, y el micelio aéreo, el cuál es el que está en contacto 
con el exterior del medio, comienzan a producir proteasas, sin embargo solo el 
Leupeptina 
R1: CH3 Leupeptina I PM: 426.5 
R2: CH3CH2 Leupeptina II PM: 440.5 
31 
 
micelio aéreo produce leupeptina, y el micelio vegetativo incluso produce una 
molécula inhibidora de leupeptina. Esto parece indicar que para que el micelio 
aéreo se pueda mantener vivo, el micelio vegetativo se degrada por acción de las 
proteasas para liberar así nutrientes al medio y de esta manera el micelio aéreo se 
pueda abastecer mientras está protegido de la acción de las proteasas a través de 
la secreción de leupeptinas. El micelio aéreo más adelante forma esporas y estas 
son liberadas al ambiente para así llegar a un nicho rico en nutrimentos y 
comenzar su desarrollo y formar una nueva colonia (Kim y Lee, 1996). 
 
1.3.3 Estudios biosintéticos de las leupeptinas 
 
El estudio de la biosíntesis de leupeptina comenzó de manera prácticamente 
simultánea al descubrimiento de esta molécula. Los trabajos de Kawamura (1969), 
Hori (1977), Suzukake (1979,1980, 1981) y colaboradores, dejaron plasmadas las 
primeras evidencias para la identificación de las enzimas involucradas en la 
biosíntesis de leupeptina. Estos trabajos describieron algunas de las 
características funcionales y fisicoquímicas más importantes estas enzimas, 
además de determinar precursores involucrados en esta ruta biosintética y 
condiciones bajo las cuáles se lleva a cabo la biosíntesis de la leupeptina. Sin 
embargo, debido a que la gran mayoría de los métodos de biología molecular 
todavía no eran de uso frecuente en esa época (por ejemplo secuenciación y 
clonación de genes) no se llegó a describir las bases genéticas de la producción 
de este compuesto. 
 
De acuerdo al trabajo pionero de Umezawa y su equipo hay tres principales 
precursores para la biosíntesis de leupeptina, los cuáles se determinaron 
empleando precursores marcados radioactivamente, y estos son: L-leucina, L-
arginina y L-guanido-arginina (Hori et. al., 1977). 
 
Dado que se logró la producción de leupeptina en extractos libres de células, se 
propuso que en su biosíntesis está involucrado un sistema multi-enzimático no 
32 
 
ribosomal que sintetiza péptidos y que requiere de ATP para su funcionamiento 
(Suzukake et. al., 1979). 
 
 
Umezawa y su equipo también determinaron que la enzima encargada de 
sintetizar ácido leupeptídico (Acetil-L-leucil-L-leucil-L-arginina) es poco estable, lo 
cual abre la posibilidad de que se trate de un complejo multienzimatico y no de un 
solo polipéptido, también quedo establecido que esta enzima (o complejo) tiene 
una masa molecular de 260 KDa. A esta enzima se le denominó sintetasa de 
ácido leupeptídico debido al producto y a su requerimiento de ATP. Los 
experimentos realizados empleando diferentes sustratos marcados 
radioactivamente mostraron que el ácido leupeptídico es sintetizado por la 
sintetasa de ácido leupeptídico a partir de Acetil-L-leucil-L-leucina o Actil-L-leucina, 
L-leucina y L-arginina. Sin embargo, también observaron que el intermediario 
Acetil-L-leucil-L-leucil es liberado espontáneamente de la enzima antes de 
terminar la extensión de la cadena para la formación de ácido leupeptídico. A esta 
enzima se le denominó sintetasa de ácido leupeptídico. (Suzukake et. al., 1981) 
 
A partir de extractos de S. roseus se logró purificar una aciltransferasa capaz de 
sintetizar Acetil-L-leucina a partir de L-leucina y acetil-CoA. Dicha enzima se 
purificó empleando la misma técnica empleada para purificar la sintetasa de ácido 
leupeptídico, y durante el proceso de purificación quedó claro que se trataba de 
dos enzimas diferentes. Se determinó que el peso molecular de la leucina 
aciltransferasa es de 21 KDa (Suzukake et. al., 1979). 
 
Una última enzima encargada de la reducción del ácido leupeptídico, que es el 
último paso en la biosíntesis de leupeptina, fue parcialmente purificada y 
caracterizada. Se denominó como reductasa de ácido leupeptídico, se estimó su 
peso molecular en 320 KDa y se determinó que para su actividad requiere de ATP 
y NADPH (Suzukake et. al., 1981). 
 
33 
 
2. Hipótesis 
 
El empleo de herramientas modernas de química analítica, biología molecular y 
genómica, junto con el conocimiento clásico de rutas biosintéticas de productos 
naturales, permiten la identificación de los genes que dirigen la biosíntesis de 
dichos compuestos. 
 
3. Objetivos 
3.1 Objetivo General 
 
Determinar la producción de péptidos aldehídicos de bajo peso molecular con 
actividad de inhibidores de proteasas en cepas del género Streptomyces 
históricamente relevantes (Antipaina y Leupeptina), y contribuir en el 
establecimiento de la relación gen-metabolito de sus rutas biosintéticas, 
empleando herramientas de minería genómica, biología molecular y análisis 
químico. 
3.2 Objetivos Particulares 
 
1. Obtener bajo las condiciones del laboratorio leupeptina a partir de S. roseus 
MA839-A1 
 
2. Obtener bajo condiciones de laboratorio antipaina a partir de Streptomyces 
mauvecolor ATCC29835. 
 
3. Analizar el genoma de S. roseus para determinar genes candidatos 
involucrados en la biosíntesis de leupeptina. 
 
4. Diseñar una mutante de S. roseus no productora de leupeptinamediante el 
uso de herramientas bioinformáticas. 
 
5. Producir una mutante S. roseus no productora de leupeptina empleando 
herramientas de Biología molecular para demostrar que los genes 
teorizados como los involucrados en la biosíntesis de este compuesto son 
los correctos. 
34 
 
4. Materiales y Métodos 
 
4.1 Producción de leupeptina y antipaina 
 
4.1.1 HPLC como técnica de detección de antipaina y leupeptina 
 
Para la producción de leupeptina por S. roseus, se formuló el medio LPM (Medio 
de producción de leupeptina) (Takagi, 1978). Para la producción de antipaina por 
S. mauvecolor, se formularon cinco medios diferentes: ISP1P (International 
Streptomyces Program suplementado con peptona) (Shirling y Gottlieb, 1966), 
ISP1C (International Streptomyces Program suplementado con casaminoácidos) 
(Shirling y Gottlieb, 1966), R5LFKR (Medio R5 suplementado con leucina, 
fenilalanina, lisina, arginina y casaminoácidos) (Kieser et al, 2000), DNAC (Agar 
Nutritivo Birmex suplementado con casaminoácidos) y SVPIPM (Medio de 
producción de inhibidores de proteasas para Streptomyces violascens modificado) 
(Jönsson y Torstensson, 1972). Los componentes de todos los medios empleados 
se encuentran en la Tabla 2. 
 
Tabla 2. Formulación de medios empleados para la producción de leupeptina y antipaina. 
Medio Ingrediente Concentración final en 
el medio (%) 
LPM Glucosa 3 
 NH4NO3 0.5 
 MgSO4 (7H2O) 0.5 
 KCl 0.05 
 L-leucina 0.75 
 L-arginina 0.75 
 Glicina 0.75 
 Casaminoácidos 0.1 
 Extracto de levadura 0.4 
35 
 
ISP1P Peptona 0.5 
 Extracto de levadura 0.3 
ISP1C Casaminoácidos 0.5 
 Extracto de levadura 0.3 
R5FKLR Sacarosa 10.3 
 K2SO4 0.025 
 Glucosa 1 
 MgCl2*6H2O 1.012 
 Casaminoácidos 0.05 
 Solución de elementos 
traza * 
0.2 
 Extracto de levadura 0.05 
 Buffer TES 0.572 
 L-lisina 0.02 
 L-leucina 0.02 
 L-arginina 0.02 
 L-fenilalanina 0.02 
DNAC Extracto de carne 0.3 
 Peptona 0.1 
 Casaminoácidos 0.1 
SVPIPM Peptona** 1.8 
 Glucosa 1 
 K2HPO4 0.1 
 KCl 0.005 
 NaNO3 0.3 
 MgSO4 (7H2O) 0.005 
 FeSO4 (7H2O) 0.001 
 
* La solución de elementos traza contiene: ZnCl2 (40 mg/mL), FeCl3*6H2O (200 mg/mL), CuCl2*2H2O (10 
mg/mL), MnCl2*4H2O (10 mg/mL), Na2B4O7*10H2O (10 mg/mL) y (NH4)6Mo7O24*4H2O (10 mg/mL). ** El medio 
originalmente contiene polvo de proteína seca, al no encontrarse dicho reactivo en el laboratorio se sustituyó 
36 
 
por peptona. Todos los medios se llevaron a los volúmenes deseados empleando agua MiliQ y se esterilizaron 
en autoclave después de la integración de sus componentes. 
 
Se dispensaron 50 mL de cada medio en matraces de 250 mL previamente 
esterilizados. Se inocularon 50 µL del stock de esporas de S. roseus (250000 
esporas/µL) en LPM y de S. mauvecolor (200000 esporas/ µL) en los medios 
ISP1P, ISP1C, R5LFKR, DNAC y SVPIPM. Se incubaron los cultivos a 30° C por 
48 horas. Ambos stocks fueron proporcionados por el Dr. Pablo Cruz Morales 
quien obtuvo las cepas de las American Type Culture Collection (ATCC). 
 
Pasado dicho tiempo de incubación, se recuperaron los metabolitos producidos y 
secretados al medio de cultivo. Para esto se centrifugaron las muestras a 5000 
rpm por 10 minutos y se obtuvieron los sobrenadantes. Los sobrenadantes se 
dispensaron en volúmenes de 5 mL en tubos Falcon de 50 mL. Estos se 
congelaron a – 80 °C y posteriormente fueron liofilizados a -40°C empleando la 
liofilizadora FreeZone 4.5 de la marca Labconco. Una vez liofilizadas las muestras 
se re suspendieron en 500 µL de agua MiliQ y se filtraron empleando un filtro 
millipore de nylon con un poro de 0.2 µm de la marca Millex-GN. 
 
Se prepararon soluciones estándar de antipaina 0.01 mg/mL (SIGMA-ALDRICH 
A6191) y leupeptina 0.01 mg/mL (SIGMA-ALDRICH L9783). 
 
Las muestras provenientes de los 6 cultivos diferentes se analizaron usando 
cromatografía liquida de alto desempeño (HPLC), junto con las soluciones 
estándar de antipaina y leupeptina. Se empleó el equipo Agilent 1200 con una 
columna Vydac C18 (218TP) de 15 cm con un tamaño de partícula de 5 µm. La 
fase móvil estuvo constituida por Acetonitrilo, TFA (Ácido trifluoroacético) y H2O. El 
flujo fue de 1 mL/minuto. El programa empleado determino que la concentración 
de Acetonitrilo en la fase móvil aumentara gradualmente de 0% a 100% en un 
lapso de 30 minutos. Se inyectaron 10 µL de cada una de las muestras. 
 
37 
 
Los cromatogramas obtenidos a partir de los metabolitos de S. mauvecolor y S. 
roseus se compararon entre sí y con los de los estándares de antipaina y 
leupeptina. 
 
De los cultivos de S mauvecolor en IP1C e ISP1P se recolectaron los picos 
correspondientes a los tiempos de retención 11.5, 11.9 y 14.4. 
Del cultivo de S. roseus se en LPM se recolectaron los picos correspondientes a 
los tiempos de retención 11.3 min, 12.1 min, 12.8 min y 14.3 min. Todas las 
fracciones se recolectaron manualmente y en tubos Eppendorf de 1.5 mL. 
Inmediatamente después de su recolección se mantuvieron en refrigeración. 
 
4.1.2 Bioensayo para determinar actividad inhibitoria de proteasas por 
parte de leupeptina y antipaina 
 
La actividad inhibitoria de proteasas se determinó a través de una cinética 
enzimática empleando fluorometría. En estos ensayos se detectó la inhibición de 
papaina usando los extractos obtenidos a partir de los metabolitos de S. 
mauvecolor, y de tripsina usando los extractos obtenidos a partir de los 
metabolitos de S. roseus en HPLC. 
 
Como substrato para ambas enzimas se empleó PAβN (Fenilalanina-Arginina 
Beta-Naftilamida) (SIGMA-ALDRICH P4157). Se empleó una placa de 96 pozos 
planos LumiNunc FluoroNunc. Las cinéticas se montaron como lo indican las 
tablas 3 y 4. 
 
 
 
 
 
38 
 
Tabla 3. Ensayo de inhibición de tripsina. Se indican las concentraciones y volúmenes en cada 
pozo de las soluciones empleadas en el ensayo enzimático. 
 
 
Tabla 4. Ensayo de inhibición de papaina. Se indican las concentraciones y volúmenes en cada 
pozo de las soluciones empleadas en el ensayo enzimático. 
 
 
La placa se incubó durante 15 minutos a 37° C, con una agitación de 180 rpm. 
Posteriormente se agregaron 20 µL de PAβN 0.1 mg/mL a cada pozo de la 
cinética de inhibición de tripsina y 20 µL de PAβN 0.01 mg/mL a cada pozo de la 
cinética de inhibición de papaina. 
 
Inmediatamente, la placa se leyó en un equipo Tecan Infinite M1000. Se programó 
el equipo para usar una longitud de onda de excitación de 340 nm y de detección 
de 402 nm (Bury y Pennington, 1975), y para realizar las lecturas de la placa a 
partir del tiempo cero y posteriormente cada minuto por 20 minutos. 
 Control (-) Control (+) Muestra Problema 
Buffer Tris HCl 0.1 M pH 8 110 µL 90 µL 60 µL 
Tripsina 0.05 mg/mL 20 µL 20 µL 20 µL 
Leupeptina 0.001 mg/mL 0 20 µL 0 
Fracción recolectada en HPLC 0 0 50 µL 
Volumen Total 130 µL 130 µL 130 µL 
 Control (-) Control (+) Muestra Problema 
Buffer 500mM NaH2PO4 pH 6 8 µL 8 µL 8 µL 
EDTA 60 mM 5 µL 5 µL 5 µL 
DTT 100 mM 5 µL 5 µL 5 µL 
Papaína 0.01 mg/mL 20 µL 20 µL 20 µL 
Antipaína 0.01 mg/mL 0 20 µL 0 
Fracción recolectada en HPLC 0 0 50 µL 
H2O 102 µL 82 µL 52 µL 
Volumen Total 140 µL 140 µL 140 µL 
39 
 
Este mismo ensayo se empleó para confirmar la ausencia de producción de 
leupeptina en la cepa mutante que se describe más adelante. 
4.1.3 Espectrometría de masas para la detección de antipaina y 
leupeptina. 
 
Las fracciones obtenidas por HPLC con actividad inhibitoria de antipaina o de 
papaina fueron analizadas empleando espectrometría de masas. Estos fueron los 
picos correspondientes a los tiempos de retención 11.5 min y 11.9 min obtenidos 
del cultivo de S. mauvecolor tanto en ISP1C como ISP1P y los picos 
correspondientes al tiempo de retención 11.3 min, 12.1 min y 12.8 min obtenidos 
del cultivo de S. roseus en LPM. 
 
Se empleó el equipo IonTrap LTQ-Velus de Thermo Scientific.Las muestras se 
inyectaron directamente al equipo y se analizaron con un flujo de 5 µL/min. El 
rango de masas analizado fue de 150–1100. El tiempo de adquisición de datos fue 
de 1.5 minutos y la fragmentación de 20 e-V empleando moléculas de helio. El 
equipo se empleó en modo positivo. Primero se inyectaron 150 µL de los mismos 
estándares auténticos empleados en HPLC y posteriormente se inyectaron 150 µL 
de cada una de las muestras. 
 
Los resultados obtenidos fueron analizados empelando el software mMass 
(Niedermeyer y Strohalm, 2012). 
 
Este mismo procedimiento se empleó para confirmar la ausencia de producción de 
leupeptina en la cepa mutante que se describe más adelante. 
 
 
40 
 
4.2 Determinación de genes involucrados en la biosíntesis de 
leupeptina a través del desarrollo de una mutante de S. roseus no 
productora. 
 
4.2.1 Fenotipificación de S. roseus MA839-A1 
 
Se realizaron cultivos masivos a partir de 40 µL del stock de esporas de S. roseus 
MA839-A1 en placas con 20 mL de los medios solidos ISP1, SFM, ISP2 e ISP4. 
Las placas se incubaron a 30° C hasta que se observó esporulación en las placas. 
 
Se realizó un antibiograma a la cepa S. roseus MA839-A1. Para esto se 
prepararon placas con 10 ml de medio ISP4 con los antibióticos apramicina, 
cloranfenicol, kanamicina, tiostrepton, estreptomicina e higromicina, a las 
concentraciones 12.5, 25, 50 y 100 µg/mL y ampicilina a las concentraciones 50, 
100, 200 y 400 µg/mL. En cada una de las 28 placas se sembraron de manera 
masiva 20 µL del stock de esporas de S. roseus MA839-A1. A la par se inocularon 
20 µL del stock de esporas de S. roseus MA839-A1 en una placa con 10 mL de 
medio ISP4 sin antibiótico. Todas las placas se incubaron a 30°C por 6 días, que 
fue el tiempo en el que se observó esporulación en la placa sin antibiótico. 
 
 
4.2.2 Análisis genómico de S. roseus para la búsqueda de posibles 
clústeres involucrados en la biosíntesis de leupeptina 
 
El genoma de S. roseus MA839-A1 fue proporcionado por el Dr. Pablo Cruz 
Morales (Datos no publicados). Empleando las herramientas bioinformáticas 
antiSMASH, BLAST y EvoMining (Cruz-Morales, manuscrito en preparación) se 
buscaron clústeres biosintéticos en éste genoma. 
 
41 
 
Los hits obtenidos fueron después analizados empleando el software Artemis 
(Rutherford et. al., 2000), y las características de las enzimas codificadas en estos 
se compararon con las reportadas por Suzukake para determinar los genes que 
fueran los mejores candidatos para estar involucrados en la biosíntesis de 
leupeptina (Suzukake et. al., 1980). 
 
4.2.3 Diseño de una mutante de S. rosues no productora de leupeptina 
 
Empleando el software Artemis (Rutherford et. al. 2000) se diseñaron oligos para 
obtener tres amplicones diferentes a partir de la secuencia del gen codificante a la 
NRPS que se determinó como la involucrada en la biosíntesis de leupeptina 
(LeupA). Estos oligos se sintetizaron en la unidad de síntesis y secuenciación del 
Instituto de Biotecnología de la UNAM y sus secuencias se muestran en la tabla 5. 
 
 
Tabla 5. Secuencias de oligos diseñados para el desarrollo de mutante de S. roseus no productora 
de leupeptina. 
 
 
Nombre Secuencia 
LeupA_F 5´ CGGCACCACCGGCACCCGGGC 3´ 
LeupA_R1 5´ACGCAGGTCCGGGATGGGCAC 3´ 
LeupA_R2 5´GTCGGAGATGGCTGCGGGCGC 3´ 
LeupH_F 5´GCTGCGCTTCACCCTCGTCCG 3´ 
LeupH_R 5´GCTCCCGCGAGCCGCTGGATC 3´ 
 
 
 
Se realizó una PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) con gradiente de 
temperatura para determinar la temperatura de alineación adecuada para la 
amplificación de los fragmentos deseados. La PCR se realizó empleando los 
42 
 
oligos de la siguiente forma: LeupA_F y LeupA_R1 (fragmento LeupA1), LeupA_F 
y LeupA_R2 (fragmento LeupA2) y LeupH_F y LeupH_R (fragmento LeupH). El 
templado de DNA de S. roseus MA839-A1 fue proporcionado por el Dr. Pablo 
Cruz. Las condiciones de esta PCR se muestran en las tablas 6 y 7. 
 
Tabla 6. Componentes de PCR con gradiente de temperatura. 
 
Reactivo Volumen por reacción 
DMSO 2.5 µL 
dNTP’s (10 mM) 0.5 µL 
Buffer B (KAPA Biosystems) 2.5 µL 
Oligo Forward (20 pm/ µL) 1.5 µL 
Olio Reverse (20 pm/ µL) 1.5 µL 
DNA genómico de S. rosues 
(2500 ng/ µL) 
1 µL 
Taq Polimerasa (KAPA Biosystems) 0.25 µL 
H2O 15.25 µL 
Volumen Total 25 µL 
 
Tabla 7. Programa empleado para PCR con gradiente de temperatura. 
 
Etapa Tiegmpo Temperatura (s) No. de 
ciclos 
Desnaturalización inicial 1 min 95° C 1 
Desnaturalización 
 
Alineación 
 
Extensión 
30 s 
 
30 s 
 
1:00 min 
95° C 
 
50°C 52° C 54° C 56° C 58°C 
60° C 
 
72° C 
 
 
30 
Extensión final 10 min 72° C 1 
Mantenimiento ∞ 4° C 1 
 
43 
 
Una vez terminada la reacción se procedió a realizar una electroforesis en gel de 
agarosa al 1%, empleando una cámara de la marca Bio-Rad modelo 192 Cell. 
Para ésta electroforesis se mezclaron 10 µL de cada reacción y 2 µL de buffer de 
carga (Thermo Scientific) y se cargaron 10 µL de esta mezcla en cada pozo del gel 
de agarosa. Se empleó un marcador de peso molecular de 1 kb (Thermo 
Scientific) como referencia. 
 
4.2.3 Desarrollo de mutante de S. roseus no productora de leupeptina 
 
4.2.3.1 Clonación de fragmentos LeupA1 y LeupH 
 
Se obtuvieron células de E. coli Top 10 calcio competentes (T10CaCom). Para 
esto se inocularon de 10 µL de E. coli T10, a partir de un stock proporcionado por 
el M. en C. Ernesto Verduzco, en 10 mL de medio LB (Triptona 1%, Extracto de 
levadura 1% y NaCL 0.5%) en un tubo Falcon de 15 mL. El cultivo se mantuvo en 
incubación por 15 horas a 37°C y en agitación. De este cultivo se tomaron 10 mL y 
se inocularon en 1 litro de medio LB fresco en un matraz Erlenmeyer de 5 litros. 
Este cultivo se incubó a 37° C y en agitación. Pasadas cinco horas, se midió la 
densidad óptica del cultivo cada media hora empleando el espectrofotómetro 
(Amersham Biosciences). Se empleó una longitud de onda de 600 nm y como 
blanco se empleó medio LB sin inocular. Una vez que el cultivo presentó una 
densidad óptica de 0.6, se centrifugó a 4000 rpm, durante 10 minutos a una 
temperatura de 4° C. Una vez centrifugado, se decantó el sobrenadante, y el pellet 
se re suspendió en medio litro de una solución de CaCl2 0.1 M (previamente 
enfriada en hielo) y se incubó en hielo durante 25 minutos. Pasado este tiempo, 
dicha suspensión de células se centrifugó a 4000 rpm, durante 10 minutos a 4° C. 
Se decantó el sobrenadante. El pellet se re-suspendió en 20 mL de CaCl2 0.1 M y 
2 mL de glicerol estéril. La suspensión obtenida se distribuyó en tubos Eppendorf 
de 1.5 mL previamente etiquetados, e inmediatamente se almacenaron a – 80 °C 
en un ultra-congelador marca REVCO. 
44 
 
 
Los fragmentos LeupA1 y LeupH se amplificaron empleando como temperaturas 
de alineamiento 60° C y 58° C respectivamente, y se observaron en una 
electroforesis en gel de agarosa al 1 % las bandas correspondientes a los 
fragmentos del tamaño esperado (LeupA1 de 640 pb y LeupH de 620 pb). 
 
Dichos fragmentos se purificaron del gel de agarosa con el kit QIAprep Spin 
Miniprep 250 (QiaGen) empleando el protocolo indicado para purificación de 
banda de gel de agarosa. Después de la extracción, se cuantificó la concentración 
de DNA obtenido empleando el espectrómetro NanoDrop 8000 (Thermo 
Scientific). Se obtuvo una concentración de 110 ng/µL del fragmento LeupA1 y 220 
ng/µL del fragmento LeupH. 
 
Los fragmentos LeupA1 y LeupH se clonaron empelando el kit de clonación TOPO 
pCR®2.1-TOPO (LIfe Technologies). Estas reacciones de clonación se emplearon 
para transformar bacterias E. coli T10CaCom. Para esto se mezclaron 250 µL de 
suspensión de células E. coli T10CaCom con 5 µL de cada una de las reacciones 
de clonación, tanto de LeupA1 como de LeupH en el vector pCR2.1-TOPO 
(TOPO_LeupA y TOPO_LeupH), y se incubaron en hielo por 20 minutos. Pasado 
este tiempo seles dio un choque térmico de 45 segundos a 42° C empleando el 
ThermoMIxer compact (Eppendorf). Inmediatamente se incubaron en hielo por 5 
minutos, y posteriormente se le agrego a cada reacción de transformación 500 µL 
de medio LB. Se incubaron una vez más a 37° C por una hora en agitación. 
Posteriormente, de dicha suspensión de células, se inocularon 50, 150 y 300 µL 
en cajas Petri con medio LB sólido con kanamicina 50 mg/mL y X-Gal (5-bromo-4-
chloro-3-indolyl-β-D-galactopiranosa) 20 mg/mL, y se incubaron a 37° C. 
 
El sitio de inserción en el vector pCR2.1-TOPO se encuentra dentro del gen LacZ. 
Este gen codifica para la enzima β-galactosidasa, la cual rompe al X-Gal liberando 
galactosa y 5-bromo-4-chloro-3-hydroxindol, este último se dimeriza y oxida dando 
lugar a un compuesto de un color azul intenso e insoluble. Por tanto las colonias 
45 
 
que se observan azules corresponden a colonias transformadas con el vector sin 
inserto, mientras que las colonias blancas corresponden a colonias transformadas 
con el vector con un inserto irrumpiendo el gen LacZ. 
 
Pasadas 14 horas se observaron colonias de buen tamaño, tanto blancas como 
azules. Se seleccionaron 6 colonias blancas de las placas donde se sembraron las 
células transformadas con TOPO_LeupA (A1-1 a A1-6) y 2 colonias de las placas 
donde se sembraron las transformadas con TOPO_LeupH (H1 y H2). Estas 
colonias se inocularon en 10 mL de medio LB con Kanamicina 50 mg/mL y se 
incubaron por 14 horas a 37° C y en agitación. 
 
A partir de estos cultivos se obtuvo DNA plasmídico empleando el kit QIAprep Spin 
Miniprep 250 (QiaGen) empleando el protocolo indicado para extracción de DNA 
plasmídico. De estos mismos cultivos se tomó 1 mL de cada uno y se mezclaron 
con 100 µL de glicerol estéril en tubos Eppendorf de 1.5 mL, posteriormente se 
almacenaron a -80°C. Tras la extracción, se cuantificó la concentración de DNA 
obtenido empleando el espectrómetro NanoDrop 8000 (Thermo Scientific). El DNA 
obtenido se empleó como templado para una reacción de PCR para amplificar los 
fragmentos LeupA y LeupH y una posterior electroforesis en gel de agarosa al 1 % 
para confirmar la presencia de los fragmentos en el vector. 
 
 
A la par se realizó una digestión empleando la enzima de restricción EcoRI, ya que 
el vector empleado tiene dos sitios de restricción para esta enzima a los extremos 
del sitio de inserción. Las condiciones para esta digestión se muestran en la tabla 
8. 
 
 
 
 
 
46 
 
Tabla 8. Condiciones de la digestión para confirmar la clonación de fragmentos LeupA y LeupH en 
el vector pCR2.1-TOPO 
 
Reactivo Volumen por reacción 
Buffer CutSmart (NEB) 3 µL 
Enzima EcoRI (NEB) 1 µL 
DNA 5 µL 
H20 21 µL 
Volumen Total 30 µL 
 
 
La reacción de digestión se incubó a 37° C por 6 horas. Posteriormente se realizó 
una electroforesis en gel de agarosa al 1 % para determinar si el tamaño de los 
fragmentos liberados del vector correspondía con el tamaño de los fragmentos 
LeupA1 y LeupH. 
 
Dados los resultados, se decidió enviar a secuenciar el DNA plasmídico obtenido 
de dos de las clonas (A1-3 y H-2). Esto se realizó en el departamento de Servicios 
Genómicos en el LANGEBIO del Cinvestav, unidad Irapuato. El método de 
secuenciación que se empleó fue el de Sanger (Sanger y Coulson, 1975) y se 
utilizaron los oligos M13_F (5´ GTAAAACGACGGCCAG 3´) y M13_R (5´ 
AACAGCTATGACCATG 3´), que son los indicados para amplificar insertos en el 
vector pCR2.1-TOPO. 
 
Los resultados de la secuenciación fueron analizados empleando el software 
BioEdit y se confirmó la clonación de ambos fragmentos, LeupA1 y LeupH, en el 
vector pCR 2.1-TOPO. 
 
 
47 
 
 
4.2.3.2 Obtención de protoplastos de S. roseus. 
 
Se inocularon 200 µL de un stock de esporas, proporcionado por el Dr. Pablo Cruz 
Morales, de S. roseus MA839-A1 (250,000 esporas/µL) en un matraz Erlenmeyer 
de 250 mL con un resorte de acero de grado alimenticio en fondo, que contenía 25 
mL de medio YEME (34% sacarosa, 5 mM MgCl2 y 0.5% glicina) y 25 mL de 
medio TSBS (Caldo Soya Tripticasa (Becton&Dickinson)) suplementado con 
almidón al 1% y con ampicilina 100 mg/mL. Este cultivo se incubó a 30° C por 48 h 
en agitación. 
 
Pasado el tiempo de incubación se confirmó que el cultivo estuviera libre de 
contaminaciones, para lo cual se observó una muestra de 10 µL del cultivo en el 
microscopio óptico de la marca Olympus modelo CX41. 
 
Posteriormente, el cultivo se distribuyó en tubos tipo Falcon de 50 mL y se 
centrifugó a 4000 rpm por 10 minutos a temperatura ambiente. Se deshecho el 
sobrenadante y el micelio se re suspendió en 15 mL de sacarosa al 10.3 % y de 
nuevo se centrifugó a 4000 rpm por 10 minutos. Se deshecho el sobrenadante y 
se re suspendió el micelio en 15 mL de sacarosa al 10.3%. Se centrifugó el cultivo 
una vez más a 4000 rpm por 10 minutos y se desechó el sobrenadante. 
 
Se re suspendió el micelio en 4 mL de una solución que contenía 1.5 mg/mL de 
lisozima disuelta en Buffer P (sacarosa 10.3 %, K2SO4 0.025%, MgCl2 (6H2O) 0.2 
%, solución de elementos trazas 0.2 %, KH2PO4 %, CaCl2 %, Buffer TES 5.73 % 
pH 7.2) y esterilizada empleando un filtro con un poro de 0.45 µm (Millex). La 
suspensión se incubó a 30° C por 1.5 horas. 
Se mezcló tres veces por pipeteo empleando una pipeta estéril de 5 mL y se dejó 
incubar por otros 15 minutos. 
 
48 
 
Pasado el tiempo de incubación se agregaron 5 mL de buffer P y se mezcló una 
vez más 3 veces por pipeteo empleando una pipeta estéril de 5 mL. Los 
protoplastos se filtraron empleando una jeringa con una pequeña torunda de 
algodón en el fondo previamente esterilizada, y se recibieron en un tubo tipo 
Falcon de 15 mL estéril. 
 
Una vez filtrados se centrifugaron a 4000 rpm por 7 minutos. Se deshecho el 
sobrenadante, y los protoplastos se resuspendieron usando una micropipeta en 1 
mL de buffer P. Se dispensaron en un tubo eppendorf de 1.5 mL y se almacenaron 
a – 80° C. 
 
Para confirmar la obtención de protoplastos, se tomaron 50 µL del stock obtenido y 
se realizaron dos diluciones, 1:10 y 1:100. Las diluciones se hicieron tanto en 
buffer P como en una solución estéril de SDS al 0.01 %. Se tomaron 150 µL de 
cada una de las diluciones y se sembraron en placas con medio ISP2 sólido 
(extracto de levadura 0.4 %, extracto de malta 1 %, dextrosa 0.4 %, agar 
bacteriológico 2 %). 
 
Las placas se incubaron a 30° C por 5 días y posteriormente se realizó un conteo 
de las colonias que crecieron en cada una de las 4 placas. 
 
4.2.3.3 Transformación de protoplastos de S. roseus con el vector pCR 
2.1-TOPO_LeupA1 
 
Se produjo un cultivo de 10 mL de medio LB con 50 µL del stock de esporas de 
la clona A1-3 almacenado a -80°, este cultivo se incubó 12 horas a 37°C y en 
agitación. Posteriormente se extrajo ADN utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep 
250 (QiaGen) empleando el protocolo indicado para extracción de DNA 
plasmídico. Se obtuvieron 100 µL de solución de ADN con una concentración de 
1580 ng/µL del vector pCR 2.1-TOPO_LeupA. 
 
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Se tomaron 30 µL de la solución de ADN y se secaron empleando el equipo 
SpeedVac. Posteriormente el DNA se re suspendió en 50 µL de buffer TE (Tris-
HCl 10 mM, Sodio EDTA 1 mM). 
 
Se dispensaron 200 µL del stock de protoplastos de S. roseus en dos tubos 
Eppendorf de 1.5 mL y se centrifugaron a 3000 rpm por 7 minutos a temperatura 
ambiente. Se desechó el sobrenadante y los protoplastos se re suspendieron 
golpeado suavement el fondo del tubo en el poco volumen restante 
(aproximadamente 50 µL). Se agregó a uno de los tubos 15 µL del ADN disuelto 
en buffer TE y al otro 15 µL de agua MiliQ estéril. Inmediatamente se agregaron a 
cada tubo 500 µL de buffer P adicionado con PEG (polietilenglicol) 6000 al 25 %. 
Se mezcló por pipeteo una vez. Inmediatamente se agregó 1 mL de buffer P y se 
mezcló por pipeteo una