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Evaluación de la expresión de los genes SEMA3C, 
Ednrb y RUNX3 durante la morfogénesis temprana 
del corazón (embrión de ratón). 
 
T E S I S 
 
 QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
 Química Farmacéutica Bióloga 
 
 
PRESENTA 
Nayelli Beatriz Ponce 
 
 
 ASESORA: Dra. Sandra Díaz Barriga Arceo 
 COASESORA: Dra. Guadalupe Díaz Rosas 
 
 
 CUAUTITLÁN IZCALLI, ESTADO DE MÉXICO 2015 
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
DE MÉXICO 
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN 
CAMPO 1 
 1 
http://www.google.com.mx/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&docid=7wlu8GjHxmguVM&tbnid=m3Kh6y4CVjZDrM:&ved=&url=http://gabysantte.blogspot.com/2012/09/escudo-unam.html&ei=7KIOU7z3JaP42QWB3ICACA&psig=AFQjCNEH_pKeVxK1Amq_zkuH51oupTbUvg&ust=1393554540932525
 
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FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN 
UNIDAD DE ADMINISTRACIÓN ESCOLAR 
DEPARTAMENTO DE EXÁMENES PROFESIONALES 
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ASUNTO: ~:O;APR()BATORIO 
VmVIEiR1DAD )'\Lé.\.CJOW 
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PRESENTE ATN: M. EN A. ISMAEL HE~~AURICIO 
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Con base en ei Reglamento General de Exámenes, y la Dirección de la Facultad, nos permitimos a 
comunicar a usted que revisamos el: Trabajo de Tesis 
Evaluación de la expresión de los genes SEMA3C, Ednrd y RUNX3 durante la morfogénesis temprana del 
corazón (embrión de ratón) 
Que presenta la pasante: Nayelli Beatriz Pon ce 
Con número de cuenta: 408046983 para obtener el Título de: Química Farmacéutica Bióloga 
Considerando que dicho trabajo reúne los requisitos necesarios para ser discutido en el EXAMEN PROFESIONAL 
correspondiente, otorgamos nuestro VOTO APROBATORIO. 
ATENTAMENTE 
"POR MI RAZA HABLARA EL EspíRITU" 
Cuautitlán Izcalli, Méx. a 30 de septiembre de 2014. 
PROFESORES QUE INTEGRAN EL JURADO 
NOMBRE 
PRESIDE~TE Dra. Sandra Díaz Barriga Arcea 
VOCAL QFB. Rosalba Bonilla Sánchez 
SECRETARIO M. en C. Tais Nopal Guerrero 
ler. SljPLENTE QFB. Sara Hernández Matilde 
2do. SUPLENTE M. en C. Maritere Domínguez Rojas 
NOTA: los sinodales suplentes están obligados a presentarse el día y hora del Examen Profesional (art. 127). 
HMI/iac 
 
 
 
DEDICATORIA 
 
 
A mi familia, quien siempre ha estado a mi lado para brindarme su 
apoyo a través de los años. 
A mi padre, quien siempre dio lo mejor de sí y trabajó arduamente 
para poder proveerme de todo lo necesario para poder crecer y 
obtener la formación que actualmente tengo. 
De una forma muy especial a mi madre, quien ha sido la base 
principal que me permitió culminar mi carrera, siendo para mí un 
gran ejemplo de superación y constancia. Demostrándome que 
todo aquéllo en lo que se dedique esfuerzo y dedicación se puede 
lograr. 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
A la Dra. Alejandra Contreras Ramos y la Dra. Guadalupe Díaz 
Rosas por todas sus enseñanzas y el apoyo incondicional que 
siempre me han brindado durante todo el tiempo que he estado 
trabajando en el laboratorio. 
Asimismo a la laboratorista Lucía Lima, de quien aprecio mucho su 
apoyo incondicional en el laboratorio durante la realización de mi 
tesis. 
A la Dra. Sandra Díaz Barriga Arceo por todo el apoyo que me ha 
brindado al ser una de mis asesoras de tesis. 
De igual forma a mis compañeros del laboratorio, con los cuales 
siempre tuvimos un ambiente ameno y agradable de trabajo. 
 
Arlett del Olmo Turrubiarte 
Alayde Calzada Torres 
Tania López Ruiz 
Karen Alejandra García Mejía 
María Cristina Sánchez 
 
 
 
 
 
 
 
 
La presente investigación se realizó en el laboratorio de 
Investigación en Biología del Desarrollo y Teratogénesis 
Experimental 
Del Hospital Infantil de México Federico Gómez 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El cual forma parte de un proyecto experimental de la 
autoría de la Dra. Alejandra Contreras Ramos 
HIM/2009/008 SSA 795 
 
 
Durante el tiempo de realización de éste proyecto conté 
con el apoyo de la beca PROBEI otorgada por la 
CCINSHAE. 
 
 Nayelli Beatriz Ponce 
I 
 
 
ÍNDICE 
ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................................ IV 
ÍNDICE DE TABLAS ............................................................................................................... V 
LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................................. VI 
RESUMEN ....................................................................................................................... 1 
1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 2 
1.1 Descripción anatómica del corazón................................................................................... 2 
1.1.1 Atrios o Aurículas ....................................................................................................... 3 
1.1.2 Ventrículos ................................................................................................................. 4 
1.2 Embriología Cardiaca ....................................................................................................... 5 
1.2.1 Etapa Premorfogenética ............................................................................................. 5 
1.2.2 Etapa Morfogenética .................................................................................................. 7 
1.2.3 Migración celular ........................................................................................................ 9 
1.3 SEMA3C ......................................................................................................................... 10 
1.4 Ednrb .............................................................................................................................. 11 
1.5. RUNX3 .......................................................................................................................... 13 
2. JUSTIFICACIÓN ...................................................................................................... 15 
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA....................................................................... 16 
4. HIPÓTESIS .............................................................................................................. 16 
5. OBJETIVOS ............................................................................................................. 16 
5.1 Objetivo General ............................................................................................................. 16 
5.2 Objetivos Particulares ..................................................................................................... 16 
6. MATERIAL ................................................................................................................ 17 
6.1 Material Biológico ............................................................................................................17 
6.2 Biología Molecular .......................................................................................................... 17 
6.3 Anticuerpos ..................................................................................................................... 17 
6.3.1 Primarios .................................................................................................................. 17 
6.3.2 Secundarios ............................................................................................................. 17 
6.4 Reactivos ........................................................................................................................ 18 
 Nayelli Beatriz Ponce 
II 
 
6.5 Equipos ........................................................................................................................... 19 
7. DIAGRAMA DE FLUJO ............................................................................................ 20 
8. METODOLOGÍA ....................................................................................................... 21 
8.1 Obtención de embriones cepa CD1 ................................................................................ 21 
8.2 Extracción de RNA total .................................................................................................. 21 
8.3 Síntesis de DNA complementario (cDNA) ....................................................................... 21 
8.4 Reacción en Cadena de la Polimerasa en tiempo real (qPCR Tiempo Real) .................. 22 
8.5 Diseño de Ribosondas. ................................................................................................... 23 
8.5.1 Amplificación del inserto ........................................................................................... 23 
8.5.2 Clonación ................................................................................................................. 24 
8.5.3 Restricción................................................................................................................ 25 
8.5.4 Secuenciación .......................................................................................................... 25 
8.5.5 Marcaje de sonda ..................................................................................................... 26 
8.6 Hibridación in situ ............................................................................................................ 26 
8.7 Inmunohistoquímica de Embriones Completos ............................................................... 27 
9. RESULTADOS ......................................................................................................... 28 
9.1 Diseño de ribosondas ..................................................................................................... 28 
9.1.1 Distribución espacio temporal de SEMA3C .................................................................. 34 
qPCR tiempo real de SEMA3C........................................................................................... 34 
Hibridación in situ de SEMA3C........................................................................................... 34 
Inmunofluorescencia de SEMA3C ...................................................................................... 34 
9.1.2 Distribución espacio temporal de Ednrb ....................................................................... 37 
qPCR tiempo real de Ednrb ................................................................................................ 37 
Hibridación in situ de Ednrb ................................................................................................ 37 
Inmunofluorescencia de Ednrb ........................................................................................... 37 
9.1.3 Distribución espacio temporal de RUNX3 .................................................................... 40 
qPCR tiempo Real de RUNX3 ............................................................................................ 40 
Inmunofluorescencia de RUNX3 ........................................................................................ 40 
10. ANÁLISIS DE RESULTADOS ................................................................................ 43 
10.1 SEMA3C ....................................................................................................................... 43 
10.2 Ednrb ............................................................................................................................ 44 
10.3 RUNX3 ......................................................................................................................... 44 
11. CONCLUSIONES .................................................................................................... 46 
 Nayelli Beatriz Ponce 
III 
 
I. PERSPECTIVAS ............................................................................................................... 47 
II. ANEXOS ........................................................................................................................... 48 
REFERENCIAS ..................................................................................................................... 51 
 Nayelli Beatriz Ponce 
IV 
 
ÍNDICE DE FIGURAS 
 
Figura 1. Corazón ___________________________________________________________2 
 
Figura 2. Ventrículo anatómicamente derecho ___________________________________4 
 
Figura 3. Ventrículo anatómicamente izquierdo __________________________________5 
 
Figura 4. Etapa Premorfogenética _____________________________________________6 
 
Figura 5. Etapas que comprenden el Periodo Premorfogenético _____________________7 
 
Figura 6. Semaforina 3C _____________________________________________________10 
 
Figura 7. Ednrb ____________________________________________________________12 
 
Figura 8. RUNX3 ___________________________________________________________13 
 
Figura 9. Síntesis de Ribosonda para SEMA3C ___________________________________29 
 
Figura 10. Síntesis de Ribosonda para SEMA3C __________________________________30 
 
Figura 11. Síntesis de Ribosonda para Ednrb ____________________________________31 
 
Figura 12. Síntesis de Ribosonda para Ednrb ____________________________________32 
 
Figura 13. Síntesis de Ribosonda para RUNX3 ___________________________________33 
 
 Figura 14. Micrografias de la distribución espacio-temporal de SEMA3C durante la 
 morfogénesis temprana del corazón de ratón _________________________35 
 
 Figura 15. Micrografias de la distribución espacio-temporal de Ednrb durante la 
 morfogénesis temprana del corazón de ratón _________________________36 
 
 Figura 16. Micrografias de la distribución espacio-temporal de RUNX3 durante la 
 morfogénesis temprana del corazón de ratón _________________________38 
 
 Figura 17. Gráficas del análisis cuantitativo de la expresión espacio-temporal de SEMA3C 
 durante la morfogénesis del corazón de ratón _________________________39 
 
 Figura 18. Gráficas del análisis cuantitativo de la expresión espacio-temporal de Ednrb 
 durante la morfogénesis del corazón de ratón _________________________41 
 
 Figura 19. Gráficas del análisis cuantitativo de la expresión espacio-temporal de RUNX3 
 durante la morfogénesis del corazón de ratón _________________________42 
 
 
 Nayelli Beatriz Ponce 
V 
 
 
 
 
 
 
 
ÍNDICE DE TABLAS 
 
Tabla 1. Secuencia de oligonucleótidos ____________________________________________ 22 
 
Tabla 2. Condiciones de amplificaciónde la qPCR Tiempo real _________________________ 23 
 
Tabla 3. Lista de reactivos utilizados para PCR punto final ____________________________ 24 
 
Tabla 4. Condiciones de amplificación de PCR punto final _____________________________ 24 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Nayelli Beatriz Ponce 
VI 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS 
 
 ADAMTSI 
Agtrl1b 
BSA 
CBFβ 
Cts. 
DIG-UTP 
Ednra 
Ednrb 
ET 
Fgfr1 
GATA4 
HIMFG 
IPTG 
ISL1 
LB 
Mef2c 
MESP1 
MESP2 
NKX2-5 
PBT 
Pitx2 
RUNX3 
SEMA3C 
SNC 
SNP 
Tbx 
T-CD8 
TGF-β 
TIV 
TrkC 
VD 
VEGF120 
VI 
Wnt3a 
X-Gal 
 
 
 
ADAM Metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif 1 
Apelin receptor b 
Bovine Serum Albumin 
Core Binding Factor Transcription Complex 
Ciclos umbrales 
Digoxigenin Uridine Triphosfate 
Endothelin Receptor Type A 
Endothelin Receptor Type B 
Endotelina 
Fibroblast Growth Factor Receptor 1 
GATA binding factor 4 
Hospital Infantil de México Federico Gómez 
Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido 
ISL 1 transcription factor 
Luria Bertani 
Myocyte Enhancer Factor 2C 
Mesoderm Posterior Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factor 1 
Mesoderm Posterior Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factor 2 
Nkx2 Homeobox 5 
PBS-Tritón 
Paired-Like Homeodomain Transcription Factor 2 
Runt Related Transcription Factor 3 
Semaphorin 3C 
Sistema Nervioso Central 
Sistema Nervioso Periférico 
T- box 
Citolytic T Lymphocyt 
Transforming Growth Factor- β 
Tabique interventricular 
Tirocin Cinase C 
Ventrículo derecho 
Vascular Endothelial Growth Factor-120 
Ventrículo izquierdo 
Wingless-Type MMTV Integration Site Family,Member 3 
5-Bromo-4-cloro-3-indolil- β-D-galactopiranósido 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Nayelli Beatriz Ponce 
1 
 
 
RESUMEN 
 
El corazón es el primer órgano que llega a ser funcional dentro de los embriones vertebrados, la 
morfogénesis cardiaca ocurre entre la tercera y sexta semana de desarrollo intrauterino (van 
den Berg and Moorman, 2009). 
La Embriogénesis cardiaca es un proceso secuencial, progresivo, ininterrumpido e irreversible; 
el cual se ha dividido en 3 etapas: premorfogenética (desde las preáreas cardiacas hasta la 
creciente cardiaca), morfogenética (comprendida entre corazón en tubo recto hasta el cierre de 
la comunicación), y etapa de maduración y/o remodelación(De la Cruz and Markwald, 1998). 
La etapa morfogenética está dividida en dos periodos: morfogénesis temprana y morfogénesis 
tardía. En la morfogénesis se incluyen los siguientes procesos: Corazón en tubo recto, Asa en 
C, Asa en S y Asa en S avanzada; donde existe agregación poblacional primordial para la 
formación del corazón maduro. Mientras que en la morfogénesis tardía comprende desde la 
expresión de los esbozos trabeculares hasta la formación del tabique cardiaco(De la Cruz and 
Markwald, 1998). 
Con el advenimiento de nuevas técnicas moleculares aplicadas en biología del desarrollo, se 
han determinado diversas moléculas implicadas en la regulación de los procesos biológicos 
(Migración, Adhesión, Proliferación, Apoptosis y Diferenciación), sin embargo, aún no se han 
reportado la participación de moléculas reguladoras de la migración en el periodo 
morfogenético. Pese a que durante la etapa morfogenética la participación de la migración 
celular, es un proceso clave que permite la integración de nuevas poblacionales celulares. Este 
proceso comprende diversas fases (protrusión, adhesión y movimiento del cuerpo celular) 
(Ananthakrishnan, 2007, Lauffenburger and Horwitz, 1996). 
Con la finalidad de determinar el perfil de expresión de la morfogénesis temprana (corazón en 
tubo recto, asa en C, asa en S y Asa avanzada) y su correlación con el corazón de adulto 
recientemente nuestro grupo de investigación del Laboratorio de Biología del Desarrollo del 
HIMFG determinó en el corazón de embrión de ratón 196 genes sobreexpresados y 10 
subexpresados. Con el uso de programas bioinformáticos (Panter y Davis) se determinó y 
seleccionó un grupo de genes sobreexpresados, implicados en el proceso de migración celular: 
SEMA3C, Ednrb y RUNX3 , nunca antes reportado en la embriogénesis cardiaca. 
 
 
 Nayelli Beatriz Ponce 
2 
 
 
1. INTRODUCCIÓN 
1.1 Descripción anatómica del corazón 
El corazón está situado en el tórax, detrás de la pared esternocondrocostal en la parte inferior 
del mediastino. Está limitado por delante, por la cara posterior del esternón, de los cartílagos 
costales y de los espacios intercondrales; por detrás, por la cara anterior de la columna 
vertebral; a los lados por las pleuras, porciones mediastínicas derecha e izquierda; por abajo 
por la porción mediana del diafragma; por arriba por el orificio torácico superior a través del cual 
se comunica con los diferentes planos del cuello (Latarjet and Liard, 2004). 
El corazón tiene la forma de un cono o una pirámide; en donde se puede reconocer una base 
dirigida hacia atrás arriba y algo a la derecha así como un vértice o punta situada adelante y a 
la izquierda. Es un órgano hueco tetracameral, separado por el tabique cardiaco, de tal manera 
que se puede ubicar un atrio conectado a un ventrículo por el lado derecho y otro por el lado 
izquierdo (Moore, 2000). 
 
 
 
Figura 1. Corazón. Representación esquemática de la entrada y salida de sangre del corazón, así como sus 
principales estructuras. (Anatomía del corazón (n.d.) Tomado de la página de internet el 20 de septiembre del 
2013, Texas Heart Institute, página web de la Universidad 
http:www.texasheartinstitute.org/HIC/AnatomyEsp/anatosp.cfm). 
 
 
 Nayelli Beatriz Ponce 
3 
 
 
Debido a que el corazón actúa como una bomba que se conecta al sistema vascular, la sangre 
es transportada a través de la vena cava superior e inferior a la aurícula derecha, de ahí pasa al 
ventrículo derecho (VD), el cual impulsa la sangre venosa a través de la contracción (sístole), 
por el tronco pulmonar a los pulmones; en donde la sangre venosa se oxigena para retornar a la 
aurícula izquierda a través de las venas pulmonares; de la aurícula izquierda pasa al ventrículo 
izquierdo (VI), el cual bombea la sangre a la circulación sistémica a través de la aorta (Figura 1) 
(Moore and Agur, 2003). 
 
1.1.1 Atrios o Aurículas 
La sangre es continuamente recogida en las aurículas durante la sístole; por lo que las 
aurículas además de funcionar como reservorio, conducen la sangre a los ventrículos. Ambos 
atrios presentan dos regiones: la sinusal o venosa, donde desembocan los sistemas venosos; y 
la atrial primitiva u orejuela, de superficie irregular y situada a los lados (Urroz, 1991). 
El atrio morfológicamente derecho se sitúa por detrás, arriba y a la derecha del VD; y por 
delante y a la derecha del atrio morfológicamente izquierdo. Se caracteriza externamente, por la 
orejuela en forma triangular con base amplia y vértice romo; que se extiende hacia la izquierda 
y delante, abrazando la base de la aorta. En su interior, la orejuela se encuentra tapizada por un 
grupo de músculos que se extienden en forma de abanicos denominados músculos pectíneos, 
mientras que la porción sinusal se conecta con la vena cava superior e inferior (Latarjet and 
Liard, 2004, Moore, 2000). 
El atrio morfológicamente izquierdo se sitúa atrás, arriba y a la derecha del VI; y por detrás y a 
la izquierda del atrio derecho. Externamente se caracteriza por su orejuela alargada con una 
base estrecha, la cual presenta un vértice puntiagudo con su borde festonado; se extiende 
hacia adelante abrazando la cara antero-izquierda de la base de la arteria pulmonar principal. 
Internamente presenta escasos músculos pectíneos que le proporcionan un carácter esponjoso. 
La porción sinusal conecta con las cuatro venas pulmonares: las dos derechas en su parte 
medial y las dos izquierdas en la lateral (Mooreand Agur, 2003). 
 
 
 
 
 
 
 Nayelli Beatriz Ponce 
4 
 
 
1.1.2 Ventrículos 
Los ventrículos están conformados por: tracto de entrada, región trabeculada y tracto de salida. 
El ventrículo morfológicamente derecho se sitúa por delante y a la derecha del VI, al que rodea. 
Su vértice está dirigido hacia abajo, adelante y a la izquierda. La base mira hacia arriba, atrás y 
a la derecha. En la parte interna se localiza el tracto de entrada. En él, el aparato valvular que 
recibe el nombre de válvula tricúspide se conforma de 3 valvas; cada valva está unida al anillo 
de inserción y en su borde libre están ancladas a las paredes musculares por las cuerdas 
tendinosas, éstas se conectan a los músculos papilares. La región trabeculada del VD se 
extiende desde la inserción de los músculos papilares hasta el ápice ventricular, sus trabéculas 
son anchas y cortas. El tracto de salida en éste ventrículo se denomina infundíbulo debido a la 
forma de un cono truncado y consta de 3 paredes que corresponden a la pared libre ventricular 
anterior, el septum interventricular anterior o infundibular y la cresta supraventricular (Figura 2). 
Su aparato valvular está constituido por tres valvas sigmoideas de forma semilunar que se unen 
al anillo de inserción (Latarjet and Liard, 2004, Moore, 2000). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Ventrículo anatómicamente derecho. Principales estructuras que componen al VD (Anderson and 
Becker, 1981) 
 
 
El ventrículo morfológicamente izquierdo, ocupa una posición posterior e izquierda respecto al 
VD. Su cavidad es abrazada por la cavidad ventricular derecha. Tiene la forma de un cono, el 
cual se estrecha caudalmente para formar el ápice del corazón. Internamente en su tracto de 
 Nayelli Beatriz Ponce 
5 
 
 
entrada ubicamos la válvula mitral (2 valvas). La región trabeculada del VI se extiende desde la 
inserción de los músculos papilares hasta el ápice ventricular, consta de trabéculas largas y 
delgadas (Figura 3) (Moore and Agur, 2003). 
El tracto de salida es denominado vestíbulo, se conforma de dos paredes lisas: el tabique 
interventricular (TIV) y la porción libre de la válvula mitral. Al igual que el VD el aparato valvular 
presenta tres valvas sigmoideas que permiten el paso de la sangre del VI a la aorta (Latarjet 
and Liard, 2004, Moore, 2000). 
 
 
Figura 3. Ventrículo anatómicamente izquierdo. Principales estructuras que componen al VI (Anderson and 
Becker, 1981). 
 
 
1.2 Embriología Cardiaca 
El desarrollo del corazón es un proceso secuencial, progresivo e ininterrumpido, se divide en 3 
etapas: premorfogenética, morfogenética y etapa de maduración y/o remodelación. 
 
1.2.1 Etapa Premorfogenética 
Durante el periodo de blástula, el embrión se encuentra compuesto por dos capas celulares: el 
epiblasto y el hipoblasto. Durante este periodo las células del futuro corazón se ubican en la 
parte caudal a los laterales de la línea primitiva en grupos celulares y son llamados preáreas 
cardiogénicas (Figura 4) (Rosenquist, 1966). En el pollo las preáreas cardiacas se encuentran 
situadas en el epiblasto; son bilaterales y simétricas, ubicadas a cada lado de la mitad posterior 
y caudal de la línea primitiva. Posteriormente en el periodo de gástrula las áreas cardiacas se 
 Nayelli Beatriz Ponce 
6 
 
 
encuentran situadas en el mesodermo, son bilaterales y simétricas; localizadas a ambos lados 
de la línea primitiva a nivel del nódulo de Hensen (Figura 4) (Rawles, 1943). Mientras que en el 
ratón están localizadas en la región anterior de la línea primitiva (Garcia-Martinez and 
Schoenwolf, 1993, Tam et al., 1997). 
Como reguladores tempranos de los progenitores cardiacos, Kitajima y cols. (2000) proponen a 
los factores de transcripción MESP1 (Mesoderm Posterior Basic Helix-Loop-Helix Transcription 
Factor 1) y MESP2 (Mesoderm Posterior Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factor 2), como 
reguladores tempranos de los progenitores cardiacos. Una vez comprometidos los progenitores 
cardiacos, expresan los factores GATA4 (GATA binding Factor 4), NKX2-5 (NKX2 Homeobox 5) 
e ISL1 (ISL1 Transcription Factor). Tanto en aves como en mamíferos, las preáreas cardiacas 
migran antero-lateral a la línea primitiva y coalescente hasta formar la herradura cardiaca o 
también denominada creciente cardiaca. Estudios de linaje realizados por Rosenquist (1970) 
propone que la creciente cardiaca (Figura 4) está formada por el primer campo cardiaco que 
dará origen al VD, parte del VI y el tracto de entrada (Rosenquist, 1970). Asimismo trabajos 
publicados de Kelly et al., 2001; Mjaatvedt et al., 2001 y Waldo et al., 2001; señalan la 
existencia de un segundo campo cardiaco por debajo de la herradura cardiaca (Kelly et al., 
2001, Mjaatvedt et al., 2001, Waldo et al., 2001). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Etapa Premorfogenética. Representación esquemática de las estructuras que integran el periodo de 
Blástula (A), Gástrula (B) y Creciente cardiaca (C).Modificado de imágenes del Dr. Arteaga Martínez (Martínez, 
2014). 
 
 
A B C 
 Nayelli Beatriz Ponce 
7 
 
 
1.2.2 Etapa Morfogenética 
La Morfogénesis Cardiaca está dividida en dos periodos: morfogénesis temprana y 
morfogénesis tardía. 
La morfogénesis temprana comienza con la fusión de los túbulos de la herradura cardiaca para 
formar el corazón en tubo recto. Mediante marcaje in vivo en embriones de pollo, De la Cruz y 
cols. (1997) revelaron que el corazón se forma por la integración poblaciones celulares 
encargadas de desarrollar región apical trabeculada de VD y VI, tracto de entrada, tracto de 
salida, y atrios; por lo tanto dividieron a la morfogénesis temprana en: corazón en tubo recto, 
asa en C, asa en S y asa avanzada (de la Cruz et al., 1997). 
 
 
 
Figura 5. Etapas que comprenden el Periodo Morfogenético: Tubo recto A), Asa en C B), Asa en S C) y Asa 
avanzada D). Atrios primitivos (AP), Seno venoso (SV), Tracto de salida primitivo (TSP), Tracto de entrada 
primitivo (TEP), Primordio de la región apical trabeculada del ventrículo derecho (PAVD), Primordio de la región 
apical trabeculada del ventrículo izquierdo (PAVI), Segmento distal del tracto de salida (SDTS) (De la Cruz and 
Markwald, 1998). 
 Nayelli Beatriz Ponce 
8 
 
 
El corazón en tubo recto (Figura 5) tiene la forma de un canal abierto; mediante técnicas de 
marcaje in vivo en embriones de pollo se demostró que está constituido únicamente por el 
primordio de la región apical trabeculada del VD en su posición cefálica y el primordio de la 
región apical trabeculada del VI en posición caudal. Posteriormente conforme el desarrollo 
avanza, el tubo cardiaco rota a la derecha adquiriendo la forma de un asa en C con la superficie 
convexa a la derecha y el borde cóncavo a la izquierda (Figura 5). En esta etapa también se 
integran: los tractos de salida en su región proximal, los tractos de entrada y atrios primitivos 
derecho e izquierdo en su región distal. Poco después el embrión se flexiona a nivel craneal y 
cervical, afectando la torsión y rotación del corazón, por lo que el asa cardiaca se coloca en 
plano sagital y toma la forma de asa en S (Figura 5). La curvatura se vuelve ventral, la menor 
dorsal y se integra en el seno venoso. Durante este proceso los primordios de las regiones 
trabeculadas ventriculares permanecen uno cefálico y otro caudal, el tracto de entrada y los 
atrios primitivos se vuelven ligeramente dorso-cefálicos y el segmento proximal del tracto de 
salida casi se ha completado. Finalmente los segmentos cardiacos primitivos ocupan la posición 
espacial que tendrán en el corazón maduro, es decir los ventrículos establecen su relación de 
vecindad, los atrios y el tracto de entrada primitivo toman una posición dorso-cefálica, además 
se iniciala integración del segmento distal y la curvatura menor del asa desaparece, formando 
al corazón en asa avanzada (De la Cruz and Markwald, 1998, Salazar García et al., 2006). 
Estudios de linaje en ratón demostraron que en el primer campo cardiaco se ubican los 
progenitores que expresan Nkx2.5+/Isl-/Mef2c- (Myocyte Enhancer Factor 2C)/Tbx+ (T-box)/Pitx2+ 
(Paired-Like Homeodomain Transcription Factor); y darán origen a VD, parte del VI y tracto de 
entrada. Mientras que el segundo campo cardiaco contiene células progenitoras cardiacas 
multipotentes de miocardio, endocardio y de músculo liso, caracterizadas por una elevada 
proliferación y baja diferenciación (Laugwitz et al., 2005, Moretti et al., 2006). Sin embargo, 
Buckingham y Black señalaron que en el segundo campo cardiaco están presentes las células 
que contribuirán a la formación del tracto de salida caracterizadas por expresar Nkx2-
5+/Isl1+/Mef2c+/Pitx2+/Tbx-; además de las formadoras del tracto de entrada, las cuales 
expresan Nkx2-5+/Isl1-/Mef2c+/Pitx2+/Tbx+, y del VI Nkx2-5+/Isl1-/Mef2c-/Pitx2+/Tbx- (Buckingham 
et al., 2005, Black, 2007). 
 
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1.2.3 Migración celular 
El movimiento celular o motilidad es un fenómeno altamente dinámico que es esencial para una 
variedad de procesos biológicos durante el desarrollo, entre ellos la integración de poblaciones 
celulares en el corazón (Alberts, 2008). La detección de la señal, determina el movimiento por la 
polimerización de actina; si el señalamiento es quimioatrayente, se realiza la polimerización de 
actina en la región celular cercana a la señal; en cambio si el estímulo es quimiorepelente, la 
célula se aleja por polimerización de actina al lado opuesto al estímulo (Thurel et al., 1977). 
Se ha demostrado que el receptor Agtrl1b (Apelin receptor b) acoplado a proteína G y su 
ligando Apelin, son esenciales para la migración de los progenitores de miocardio durante la 
gastrulación (Zylberberg et al., 1997, Zeng, 2007). Por otra parte Ciruna y cols. (1997) 
comprobaron que el gen Fgfr1 (Fibroblast Growth Factor Receptor 1), regula la migración de 
células progenitoras a través de la línea primitiva; por tanto la deleción de Fgfr1 genera 
malformaciones en la creciente cardiaca y corazón en tubo recto (Ciruna et al., 1997). En 
cambio, en 2008 Yue y cols. señalaron que Wnt3a (Wingless-Type MMTV Integration Site 
Family,Member 3) es un potente activador de la migración del mesodermo precardiaco, se 
expresa en la línea primitiva y actúa como mediador de la repulsión de células progenitoras 
cardiacas; permitiendo que migren de manera lateral ((Michael et al., 1997). 
Por otro lado Saga y cols. demostraron que el factor de transcripción MESP1 es un marcador 
temprano de las células que contribuye a la formación del corazón en tubo recto; ya que la 
ausencia de MESP1 genera un corazón en tubo recto bífido o no fusionado (Saga et al., 1999). 
A pesar de ésta información, existen pocas evidencias de la regulación de la migración celular 
en el desarrollo del corazón. Con la finalidad de determinar el perfil de expresión de la 
morfogénesis temprana (corazón en tubo recto, asa en C, asa en S y asa avanzada) y su 
correlación con el corazón de ratón adulto, recientemente nuestro grupo de investigación del 
Laboratorio de Biología del Desarrollo del HIMFG determinó en el corazón de embrión de ratón 
196 genes sobreexpresados y 10 subexpresados. Con el uso de programas bioinformáticos 
Panter y David (http://www.pantherdb.org/ y http://david.abcc.ncifcrf.gov/) se determinó y 
seleccionó un grupo de genes sobre-expresados, implicados en el proceso de migración celular: 
SEMA3C (Semaphorin 3C), Ednrb (Endothelin Receptor Type B) y RUNX3 (Runt Related 
Transcription Factor 3), nunca antes reportado en la embriogénesis cardiaca. 
 
http://www.pantherdb.org/
http://david.abcc.ncifcrf.gov/
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1.3 SEMA3C 
SEMA3C, es un gen localizado en el cromosoma 5 de ratón, y en el 7q21-q31 de humano 
(Grier, 1997). Codifica para la proteína Semaforina 3C, forma parte de una familia de moléculas 
secretadas, altamente conservadas, transmembranales y su forma activa está ampliamente 
relacionada con la migración celular (Raper, 2000). 
Las semaforinas 3 son glicoproteínas que contienen aproximadamente 500 aminoácidos, su 
dominio sema se caracteriza por un conjunto de residuos de cisteína, la cual forma cuatro 
enlaces disulfuro permitiendo estabilizar la molécula. Este dominio es característico de todas las 
semaforinas y también se encuentra presente en la región extracelular de otras proteínas de 
superficie llamadas plexinas recientemente consideradas receptores funcionales para las 
semaforinas (Figura 6) (Tarantino et al., 2000). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Semaforina 3C. Representación esquemática de la interacción de la Semaforina 3C con plexinas y 
neurofilinas (Tamagnone and Comoglio, 2000). 
 
Estudios in vitro revelaron que la proteína de SEMA3C es quimiorepulsiva en neuronas 
simpáticas, pero quimioatrayente en neuronas gabaérgicas y células de la cresta neural. Por su 
parte Feiner y cols. en 2001, demostraron que embriones de ratón carentes de SEMA3C, 
mueren poco después del nacimiento por el desarrollo de cianosis, asociadas a malformaciones 
del arco aórtico y defectos de la septación del tracto de salida del corazón. Por lo tanto 
SEMA3C es selectiva del tracto de salida cardiaco proximal (cono) y necesario para la 
migración de las células de la cresta neural durante la tabicación (Feiner et al., 2001). En 
cambio Banu y cols. (2005) hallaron in vitro que la sobreexpresión de la proteína recombinante 
de SEMA3C estimula la proliferación y supervivencia de las células endoteliales glomerulares 
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de ratón; además mejora la adherencia y migración a través de la regulación de VEGF120 
(Vascular Endothelial Growth Factor-120), el cual es un factor de crecimiento endotelial vascular 
que estimula la permeabilidad y vasodilatación (Banu et al., 2006). Mientras tanto Esselens y 
cols. (2010) evidenciaron que la fragmentación de SEMA3C (p95 y p65) por ADAMTSI (ADAM 
Metallopeptidase with trombospondin type 1 motif 1), permite la migración de las células de 
cáncer de mama generando metástasis (Esselens et al., 2010). 
 
1.4 Ednrb 
El gen humano de Ednrb se encuentra localizado en el cromosoma 13, contiene 7 exones y 6 
intrones. Tiene 442 aminoácidos y una masa molecular de aproximadamente 50kDa; presenta 
una homología del 64% con Ednra (Endothelin Receptor Type A) (Hynynen and Khalil, 2006). 
Mientras que en ratón presenta una homología del 88% respecto al humano (Davenport, 2002). 
Ednrb pertenece al tipo de rodopsina de la superfamilia de los receptores acoplados a proteína 
G; que consisten de una larga secuencia extracelular con un amino terminal, con siete dominios 
transmembranales helicoidales (TMDs), 3 bucles extracelulares y 3 intracelulares, además de 
un C-terminal citoplasmático en la parte de la cola (Figura 7) (Sakamoto et al., 1993) 
Ednrb predomina en células endoteliales y está presente en bajas cantidades en células 
vasculares de músculo liso de algunos vasos como la aorta, arterias coronarias, arterias 
mesentéricas y venas de animales experimentales, también en arterias mamarias de humano 
(Hynynen and Khalil, 2006). 
Ednrb también es expresado en fibroblastos adventicios vasculares, el miocardio, túbulos 
renales, músculo liso de las vías respiratorias, hepatocitos, osteoblastos, neuronas del SNC y 
SNP, tejidos endócrinos y aparato reproductivo (Boyd et al., 2011). 
En diversos estudios se ha examinado la distribución celular de Ednrb en varios tipos de células 
cardiovasculares; como las células cardiacas y el endocardio en el humano, células del músculo 
liso vascular y células endoteliales.Aparece tanto en la membrana plasmática, citosol y núcleo; 
incluyendo la membrana nuclear y el nucleoplasma (Bkaily et al., 2011) 
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Figura 7. Ednrb. Representación esquemática de los componentes de la proteína Ednrb (Mazzuca and Khalil, 
2012). 
 
La ruta de señalamiento de Ednrb depende de las células efectoras; en el caso de las células 
endoteliales actúa como vasodilatador, mientras que en las células de músculo liso vascular 
actúa como un vasoconstrictor (D'Orleans-Juste et al., 2002). 
Ednrb tiene la capacidad de unirse a una familia de ligandos conocidos como endotelinas: ET1, 
ET2 y ET3 los cuales son tres potentes vasoactivos ante los cuales presenta la misma afinidad 
de unión; lo mismo sucede con las safarotoxinas S6b y S6c; éste último es altamente selectivo 
a Ednrb (Hynynen and Khalil, 2006). 
Hosoda y cols. (1994) observaron que ratones carentes del gen Ednrb (deleción en el exón 3), 
desarrollan amelanocitosis (pigmentaciones en cabeza y cola) y megacolon (ensanchamiento 
anormal del intestino grueso, producido en forma congénita o adquirida), debido a la ausencia 
de neuronas entéricas derivadas de la cresta neural en el intestino distal, lo cual provoca la 
muerte de ratones en la etapa juvenil. Dicho fenotipo fue similar al observado en ratones 
carentes de endotelina 3 (deleción del exón 2) (Baynash et al., 1994) y a lo reportado en el 
síndrome de Waardenburg tipo V en humanos (Shah et al., 1981). 
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1.5. RUNX3 
El gen RUNX3 de humano inicialmente fue clonado como AML2 (Levanon et al., 1994). En 
humanos se encuentra localizado en el cromosoma 1p36.1 (Levanon et al., 1994, Bae et al., 
1995) y en ratones en el cromosoma 4 (Avraham et al., 1995, Calabi et al., 1995). 
RUNX3 es un factor de transcripción que pertenece a una pequeña familia donde los miembros 
contienen una región altamente conservada conocida como dominio Runt; encontrada en el gen 
Runt de Drosophila. El dominio Runt muestra un nitrógeno terminal en parte de la molécula y a 
veces presenta una inmunoglobulina tipo S; este dominio permite una buena unión al DNA, 
como cuando ocurre la interacción de proteína / proteína con la subunidad CBFβ (Core Binding 
Factor Transcription Complex) (Downing, 1999). 
La expresión de los tres genes RUNX (RUNX1, RUNX2 y RUNX3) es iniciada por dos 
promotores; los cuales son llamados el promotor 1 o distal y el Promotor 2 o proximal (Figura 8). 
Estos promotores generan 2 isoformas de proteína que tienen distintos aminos terminales 
cortos llamados tipo l y tipo ll (Levanon and Groner, 2004) 
 
 
 
 
Figura 8. RUNX3. Organización genómica de RUNX3 (Bangsow et al., 2001). 
 
 
RUNX3 es requerido para el desarrollo de células T-CD8 (Citolytic T Lymphocyte) (Zeng, 2007, 
Bayliss et al., 1977) y de TrkC (Tirocin Cinase C) dependientes de las neuronas de la raíz dorsal 
(Urroz, 1991, Uchida et al., 2003). Funciona como un supresor tumoral, alrededor del 60% de 
los especímenes con cáncer gástrico primario expresan significativamente bajos niveles de la 
proteína de éste gen debido a la deleción hemicigota y la hipermetilación de la región promotora 
de RUNX3. Se ha observado que la ausencia de RUNX3, conduce a una alta proliferación y 
reprime la apoptosis de células del epitelio gastrointestinal, lo cual genera hiperplasia de la 
 
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mucosa gástrica; éstos procesos van acompañados de un decremento de la sensibilidad a TGF-
β (Transforming Growth Factor- β) ; el cual ha sido descrito como un potente supresor tumoral 
al promover la inhibición de crecimiento celular, apoptosis y diferenciación (Pernod et al., 1977). 
Por otro lado diversos científicos han demostrado que la inactivación del gen RUNX3 está 
asociada a diversos tipos de cáncer como: hígado, pulmón, colon, páncreas, próstata, conducto 
biliar, mama, laringe, esófago, endometrio, cérvix uterino (Bae and Lee, 2006, Goel et al., 2004, 
Mori et al., 2005, Nakase et al., 2005, Wada et al., 2004, Yanagawa et al., 2003, Kato et al., 
2003). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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2. JUSTIFICACIÓN 
 
Las malformaciones congénitas más frecuentes son las cardiopatías congénitas. La prevalencia 
reportada a nivel mundial va de 2.1 a 12.3 por 1,000 recién nacidos. En nuestro país, se 
desconoce su prevalencia real; como causa de muerte infantil, se ubica en el sexto lugar en 
menores de un año y como la tercera causa en los niños entre uno y cuatro años; con base en 
la tasa de natalidad, se calcula que alrededor de 10 mil a 12 mil niños nacen con algún tipo de 
malformación cardiaca. Debido a que el desarrollo del corazón es un proceso secuencial 
progresivo e interrumpido cuando más temprana sea la alteración mayor será la cardiopatía, al 
grado de ser incompatible con la vida, por ello las Cardiopatías congénitas también son causa 
de abortos espontáneos (Calderón 2010). 
Hoy en día se han determinado diversas redes de señales y factores de transcripción 
encargados de regular la proliferación, apoptosis y diferenciación celular, de las células 
progenitoras cardíacas en el embrión durante los procesos de elongación, torsión y crecimiento; 
sin embargo poco se ha establecido acerca de los mecanismos de migración celular, paso 
esencial en la morfogénesis del corazón definitivo. 
La comprensión de los mecanismos que regulan la adición de células progenitoras en el tubo 
cardíaco es tema aún desconocido. Por ello, este trabajo centra su interés en evidenciar por vez 
primera el patrón espacio-temporal de SEMA3C, Ednrb y RUNX3 en la morfogénesis temprana 
del corazón, ya que dichas moléculas han sido ampliamente estudiadas en diversos modelos 
celulares entre ellas el cáncer. 
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3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 
¿El patrón de expresión espacio-temporal de Sema3C, Ednrb y RUNX3 está implicado en la 
morfogénesis temprana del corazón? 
 
 
4. HIPÓTESIS 
Sí determinamos la expresión espacio-temporal de Sema3C, Ednrb y RUNX3 entonces será 
posible establecer su asociación con los procesos de migración y morfogénesis del corazón. 
 
 
5. OBJETIVOS 
5.1 Objetivo General 
Validar la expresión espacio-temporal de los genes Sema3C, Ednrb y RUNX3 durante la 
morfogénesis temprana (desde corazón en tubo recto hasta el inicio de la septación cardiaca), 
con qPCR tiempo real, Hibridación in situ e Inmunofluorescencia. 
 
5.2 Objetivos Particulares 
 Analizar expresión temporal de los genes Sema3C, Ednrb y RUNX3 con qPCR Tiempo Real 
en tubo recto, asa en C, asa en S y asa avanzada. 
 Determinar in situ mediante la ribosonda específica, la distribución espacial de Sema3C, 
Ednrb y RUNX3 durante la morfogénesis temprana, 
 Establecer por Inmunofluorescencia la expresión espacial de la proteína de Sema3C, Ednrb 
y RUNX3 en tubo recto, asa en C, asa en S y asa avanzada. 
 
 
 
 
 
 
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6. MATERIAL 
6.1 Material Biológico 
 Ratones cepa CD1 (50 hembras y 15 machos de 6 a 8 meses de edad con un peso 
aproximado de 30 a 35 gramos) 
 Células competentes E. coli cepa D45α. 
 
6.2 Biología Molecular 
 dNTP´s (Promega, USA) 
 Hexámeros (Promega, USA) 
 Inhibidor de RNAsas (20U) (Fermentas, USA) 
 M-MuLV Reverse Transcriptase (100 U) (Bio Basic Inc., Canadá). 
 pGEM-T Vector System (Promega, USA) 
 SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystem, USA) 
 Taq DNA Polimerase (Fermentas, USA) 
 T4 DNA ligasa (Promega, USA) 
 
6.3 Anticuerpos 
6.3.1 Primarios 
 ETBR M-74 (rabbit, dilución 1:10,policlonal, Santa Cruz Biotechnology, USA) 
 RUNX3 K-12 (goat, dilución 1:10 policlonal, Santa Cruz Biotechnology ,USA) 
 SEMA3C N-20 (goat, dilución1:10 policlonal, Santa Cruz Biotechnology, USA) 
 DRAQ7 (Biostatus, UK) 
 
6.3.2 Secundarios 
 Alexa Flúor 594(anti-goat, dilución 1:50, Invitrogen, USA) 
 Alexa Flúor 488 (anti-rabbit, dilución 1:50, Invitrogen, USA) 
 Anti-Digoxigenin-Fluorescein (anti-mouse, dilución 1:10, Millipore, USA) 
 
 
 
 
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6.4 Reactivos 
 Ácido Cítrico (Sigma, USA) 
 Ácido Maleico (Sigma,USA) 
 Acetato de Potasio (J.T. Baker, México) 
 Acetato de Sodio (J.T. Baker, México) 
 Agarosa (Sigma,USA) 
 Ampicilina (Amresco, USA) 
 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido (Gibco BRL.,USA) 
 Cloroformo grado BM (Sigma-Aldrich,USA) 
 Cloruro de Calcio (Sigma-Aldrich, USA ) 
 Cloruro de Sodio (Sigma-Aldrich, USA) 
 Cloruro de Potasio (J.T. Baker, México) 
 Cloruro de Magnesio (J.T. Baker, México) 
 Ácido Etilendiamino tetrasódico (Sigma,USA) 
 Etanol absoluto grado BM (Sigma-Aldrich,USA) 
 Etanol absoluto grado RA (J.T.Baker,México) 
 Fenol: Cloroformo: Alcoholisoamílico (Sigma ,USA) 
 Formamida (Amresco, USA) 
 Fosfato de Potasio monobásico (J.T.Baker, México) 
 Fosfato de Sodio dibásico (J.T.Baker, México) 
 Glicerol (Sigma, USA) 
 Glicina (Sigma, USA ) 
 Glicógeno (J.T: BAKER, USA) 
 Heparina (Sigma Aldrich, USA) 
 Hidróxido de Sodio (Merck, Germany) 
 Isopropanol grado BM (Sigma -Aldrich, USA) 
 Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (Sigma-Aldrich, USA) 
 Medio Luria Bertani (Bio Inc., USA) 
 Metanol (Tecsiquim, México) 
 Paraformaldehído (Sigma-Aldrich, USA) 
 Power Block Universal Blocking Reagent (BioGenex, USA) 
 Proteinasa K (DakoCytomation, USA) 
 
 
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 Dodecil sulfato de sodio (Bio-Rad, USA) 
 Tris-HCI (Sigma, USA) 
 Tritón X-100 (Sigma, USA) 
 Trizol (Invitrogen, USA) 
 tRNA (BoehringerManheim, USA) 
 Tween 20 (Sigma, USA) 
 Vectashield (Vector Laboratories Inc., Burlingame) 
 
6.5 Equipos 
 Agitador orbital (Equipar, México) 
 Balanza Analítica (Ohaus, USA) 
 Cabinas Genetop600 (Thermolab, México) 
 Centrífuga ROTIXA (Hettich, Germany) 
 Centrífuga refrigeradaScilogex D3024R (J&B Lab., Perú) 
 Dry Bath Incubator (Daigger , USA) 
 Espectrofotómetro (GeneQuant, England) 
 Fuente de luz fría KL1500 LCD (Zeiss, Germany) 
 Incubadora LAB-LINE 494 (Thermo Scientific, USA) 
 Incubadora con agitación (Boekel Industries INC.,USA) 
 Medidor de pH (Accument Basic , USA) 
 Microscopio CONFOCAL Axiovision 100 (Zeiss, Germany) 
 Microscopio estereoscópico Stemi 2000C (Zeiss, Germany) 
 NanoDrop 2000c (Thermo Scientific, USA) 
 Sistema qPCR Stratagene Mx300Sp (Agilent Technologies, USA) 
 Transiluminador (Appligene, USA ) 
 Termociclador SureCycler 8800 (Agilent Technologies, USA). 
 Vortex -Genie 2 (Scientific Industries, USA) 
 
 
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7. DIAGRAMA DE FLUJO 
 
 
 
 
 
 
 
 
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8. METODOLOGÍA 
8.1 Obtención de embriones cepa CD1 
Los ratones de la cepa CD1 fueron apareados, la presencia del tapón vaginal (blanco) en las 
hembras fue indicativo de la cópula, considerado como día 0 de la gestación. Los ratones 
hembras gestantes fueron sacrificados por dislocación cervical, entre los días 7.5 y 9.5 dpc. 
Tras la disección de las trompas uterinas los embriones obtenidos fueron lavados con PBS 1x 
(Anexo 1) frío y clasificados en tubo recto, asa en C, asa en S y asa avanzada con ayuda de un 
microscopio estereoscópico Stemi 2000C (Zeiss, Germany). Posterior a la clasificación, algunos 
corazones fueron disectados, colocados en tubos de criopreservación y congelados a -70ºC 
hasta su uso. Por otro lado, algunos embriones fueron fijados con paraformaldehído al 4% 
(Anexo 2), y deshidratados en series de metanol para los estudios de hibridación in situ. En el 
caso de las inmunofluorescencias, después de la fijación los embriones fueron deshidratados 
en series de etanol y almacenados a -20°C hasta su uso. 
 
8.2 Extracción de RNA total 
Los corazones fueron triturados en frío, la extracción fenólica fue realizada siguiendo el método 
de Trizol (Invitrogen, USA). El cual es una solución monofásica de fenol e Isotiocianato de 
guanidina que mantiene la integridad del ARN mientras disgrega las células. Posteriormente se 
separan las fases con cloroformo y se obtiene el ARN total de la fase acuosa mediante 
precipitación con Isopropanol (Penna et al., 2009). La concentración y pureza fueron analizadas 
a una longitud de onda de 260/280nm en un espectrofotómetro (GeneQuant, USA) y la 
integridad mediante un gel de electroforesis. El RNA total se almacenó a -70°C hasta su uso. 
 
8.3 Síntesis de DNA complementario (cDNA) 
El cDNA fue sintetizado a partir de 1 µg de RNA total de cada etapa (tubo recto, asa en C, asa 
en S y asa avanzada) y de corazón de ratón adulto. Como iniciadores se utilizaron hexámeros 
al azar a una concentración final de 66 µM. La mezcla de reacción contenía amortiguador (1x), 
dNTP´s (1mM), inhibidor de RNAsas (20U) y 100U de la enzima M-MuLV Reverse 
Transcriptase (Bio Basic Inc., Canadá). Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: 
25°C/15 minutos, 37°C/1 hora y 70°C/10 minutos; utilizando el Termociclador SureCycler 8800 
 
 
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(Agilent Technologies, USA). El cDNA obtenido fue almacenado a -20 °C hasta su posterior 
uso. 
 
8.4 Reacción en Cadena de la Polimerasa en tiempo real (qPCR Tiempo 
Real) 
La qPCR Tiempo Real fue realizada empleando SYBRGreen PCR Master Mix (Applied 
Biosystem, USA), como método de detección directa del producto de PCR a través del 
monitoreo del aumento de fluorescencia causado por la unión del fluoróforo SYBERGreen a la 
doble cadena de DNA, mediante el equipo de PCR tiempo real Stratagene Mx300Sp (Agilent 
Technologies, USA ); el cual consta de un termociclador que efectúa la amplificación y detecta 
la fluorescencia emitida por el agente intercalante, la cual es proporcional a la cantidad de DNA 
presente. Los iniciadores utilizados a una concentración de 0.4 µM (Tabla 1) fueron diseñados 
por medio del programa Primer 3 (http://primer3.ut.ee). 
Las condiciones de amplificación para cada uno de los genes se enlistan en la Tabla 2. 
 
Tabla 1. Secuencia de oligonucleótidos 
 
 
 
 
 
Nombre Secuencia (5’ – 3’) No. bases 
RUNX3 (Sentido) CTCCCTGCCTTCTCTCTGTG 20 
RUNX3 (Antisentido) TGAGCGTGAAACTCTTCCCT 20 
SEMA3C (Sentido) TCACAGAGCTGAGGAGCAGA 20 
SEMA3C (Antisentido) GATGAAATGCCAAGGGAGAA 20 
Ednrb (Sentido) TCTGCTTTCAAGGCCAGTTT 20 
Ednrb (Antisentido) GATCTATCCCCCACCACCTT 20 
18s (Sentido) TAGGGAGAGCGGCTTTTACA 20 
18s (Antisentido) GACTCATTCATTCCCCGAGA 20 
http://bioinfo.ut.ee/primer3/
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Tabla 2. Condiciones de amplificación de la qPCR Tiempo real 
 
 
 
Los Cts obtenidos fueron analizados por el método de 2Ct (Doble delta Ct) , el cual es utilizado 
para calcular los cambios relativos en la determinación de la expresión de un gen ; usando 
como normalizador el gen ribosomal 18s y como calibrador o control de la expresión el corazón 
de ratón adulto (Livak and Schmittgen, 2001). 
 
8.5 Diseño de Ribosondas. 
8.5.1 Amplificación del inserto 
Por medio de una PCR punto final utilizando el Termociclador SureCycler 8800 (Agilent 
Technologies, USA), se amplificaron las secuencias de SEMA3C, Ednrb y RUNX3 (insertos) 
empleando los iniciadores diseñados de cada gen (Tabla 1), cDNA de corazón de ratón adulto y 
Taq DNA Polimerase (Fermentas, USA) (Tabla 3). Las condiciones de amplificación se 
muestran en la Tabla 4. 
Todo el producto de PCR se corrió en un gel de Agarosa al 2%, se cortó la banda 
correspondiente al producto de amplificación para cada uno de los genes de estudio y se 
purificócon ayuda de las columnas Ultrafree-DA (Millipore, USA). 
 
 
Genes Desnaturalización inicial Alineamiento Disociación 
 
SEMA3C 
Ednrb 
 
95°C/10 min 
40 Ciclos 
95°C/15 seg, 
60°C/ 1 min 
1 Ciclo 
95°C/1 min 
60°C/1 min 
95°C/30 seg 
 
RUNX3 
 
95°C/10 min 
40 Ciclos 
95°C/15 seg 
58°C/1 min 
1 Ciclo 
95°C/1 min 
60°C/1 min 
95°C/30 seg 
 Nayelli Beatriz Ponce 
24 
 
 
 
Tabla 3. Lista de reactivos utilizados para PCR punto final 
 
Reactivos Concentración 
inicial 
Concentración 
final 
H20 libre de RNAsas ----- ------ 
Amortiguador 10 x 1 x 
MgCl2 25 mM 2.5 mM 
dNTP´s 10 mM 0.2 mM 
RUNX3, SEMA3C 
o Ednrb 
(Oligo Sentido) 
10 µM 0.4 µM 
RUNX3, SEMA3C 
o Ednrb 
(Oligo Antisentido) 
10 µM 0.4 µM 
Taq polimerasa 5U/ µL 0.5 U 
cDNA ----- ----- 
 
 
Tabla 4. Condiciones de amplificación de PCR punto final 
Genes 
Desnaturalización 
inicial 
 
 
 
SEMA3C 
y Ednrb 
 
95°C / 3 minutos 
 
35 Ciclos 
95°C /30 
segundos 
60°C /30 
segundos 
72°C / 1 
minuto 
72°C /15 
minutos 
RUNX3 
58°C /30 
segundos 
72°C / 1 
minuto 
72°C /15 
minutos 
 
 
8.5.2 Clonación 
La ligación de cada uno de los productos de PCR purificados se efectúo en reacciones de 10 
μL. Cada reacción de ligación contenía Amortiguador (1x), vector pGEM-T Vector System 
(Promega, USA): inserto en una relación 1:15 y T4 DNA ligasa (1U); la mezcla de reacción se 
incubó toda la noche a 4°C.La transformación se realizó en células competentes E.coli cepa 
 
 
 Nayelli Beatriz Ponce 
25 
 
 
D45α por el método de choque térmico; el cual consiste en realizar varios cambios de 
temperatura para permitir la inserción del plásmido con el inserto de interés dentro de las 
células competentes. Las células transformadas se sembraron de forma masiva con triángulos 
de vidrio en cajas petri preparadas con LB/Ampicilina/IPTG/X-Gal (Anexo 3.2) y se incubaron 
toda la noche a 37°C. 
Después de 16h de incubación se seleccionaron al menos 4 colonias blancas correspondientes 
a las clonas positivas (contienen el inserto de interés); éstas colonias fueron resembradas en 
cajas con LB/Ampicilina (Anexo 3.1) e incubadas toda la noche a 37°C. Se tomó la mitad de las 
colonias resembradas con una punta estéril para ser evaluadas por PCR punto final y escoger 
las colonias para extracción de DNA (Tabla 2). La colonia seleccionada (la que contiene el 
inserto) se resembró en medio LB líquido (Anexo 3) toda la noche a 37°C, posterior a las 16 
horas de incubación; se extrajo el DNA plasmídico utilizando el método de purificación por 
columnas EZ-10 Spin Column Plasmid DNA Kit (Bio Basic Inc.,Canadá) siguiendo las 
indicaciones del proveedor. El DNA plasmídico obtenido se cuantificó en un NanoDrop 2000c 
(Thermo Scientific, USA) y se almacenó a -20 °C. 
 
8.5.3 Restricción 
Para corroborar la presencia del inserto, se realizó la liberación del fragmento de interés 
(SEMA3C, RUNX3 y Ednrb) mediante una doble restricción partiendo de 1µg de DNA 
plasmídico; se adicionaron 2U de las enzimas Sacl y Sacll (New England Biolabs, USA), 
Amortiguador (1x), BSA (100 µg) a un volumen final de 50μL. La reacción se incubó a 37°C toda 
la noche; la mezcla de reacción se corrió en un gel de agarosa al 2% para visualizar la banda 
correspondiente al fragmento liberado. 
 
8.5.4 Secuenciación 
Para determinar el sentido y anti-sentido de los insertos, se realizó la secuenciación utilizando 
el método de marcaje con BigDye (Applied Biosystem, USA); para lo cual se utilizaron 400 ng 
de DNA plasmídico (SEMA3C y Ednrb), Oligonucleótidos (sentido o antisentido) 1μM, mezcla 
de reacción y H20 libre de nucleasas. 
Las condiciones del termociclador para la reacción fueron las siguientes: Calentamiento inicial a 
96°C durante 1 minuto; 25 Ciclos 96°C durante 10 segundos, 60°C durante 5 segundos y 62°C 
durante 4 minutos;4°C indefinido. El producto de PCR fue purificado con EDTA-Etanol (Anexo 
4) y se almacenó a -20 °C antes de su secuenciación. 
 Nayelli Beatriz Ponce 
26 
 
 
 
8.5.5 Marcaje de sonda 
Una vez determinada la dirección de los insertos, el plásmido correspondiente a cada gen 
clonado fue linealizado empleando enzimas de restricción para SP6 (Sacll) y para T7 (Sac l). 
Una parte del producto obtenido se visualizó en un gel de agarosa al 2%.El producto sobrante 
se purificó por medio de la técnica de fenol: cloroformo (Anexo 5).El marcaje con Digoxigenina 
de la secuencia obtenida se realizó de manera intercalada empleando el método DIG RNA 
Labeling Kit SP6/T7 (Roche, USA),para generar sondas de RNA de tamaño definido marcadas 
con Digoxigenina por transcripción in vitro de un molde de DNA en presencia de DIG-UTP y 
utilizando las RNA polimerasas SP6 y T7 siguiendo las indicaciones del proveedor. Las sondas 
obtenidas se cuantificaron y se almacenaron a -20 °C hasta el momento de su uso. 
 
8.6 Hibridación in situ 
Se colocaron 4 embriones deshidratados anteriormente en metanol, correspondientes a cada 
una de las etapas de estudio para cada sonda generada (SEMA3C y Ednrb) en cajas de 8 
pozos (Lab-tek, USA). Se les efectúo la hidratación progresiva con Metanol/PBS-Tritón (PBT) 
0.1 % frío (Anexo 6). Para aclarar los embriones, se efectuó un lavado de 1h en H202 al 6%/PBT 
(Anexo 7) sin agitación; posteriormente se lavaron 3 veces por 5 minutos en PBT con agitación. 
La permeabilización del tejido se efectúo con proteinasa K 10µg/mL de 20 a 30min, se lavó con 
Glicina 0.2%/PBT (Anexo 8). La postfijación se realizó con Formaldehído 4%/PBT (Anexo 9), 
seguida de una prehibridación con el Buffer de hibridación (Anexo 10) durante 1 hora a 60°C.La 
hibridación con la sonda marcada con Digoxigenina (Anexo 11) se realizó toda la noche a 60°C. 
Posteriormente se efectuaron lavados decrecientes con las soluciones 1, 2 y 3 (Anexo 12-14). 
La inespecificidad se evitó con Bloqueador universal 1X (Anexo 15). El anticuerpo secundario 
anti-DIG acoplado a FITC (1:10) fue incubado toda la noche a 4°C en agitación. Posterior a los 
lavados con MABT (Anexo 16) los embriones fueron almacenados en PBS: Glicerol en 
proporción 1:1 y fotografiados empleando un Microscopio CONFOCAL Axiover 100M (Zeiss, 
Germany). 
 
 Nayelli Beatriz Ponce 
27 
 
 
 
8.7 Inmunohistoquímica de Embriones Completos 
Se utilizaron cuatro embriones correspondientes a cada una de las etapas para los estudios de 
Inmunohistoquímica en cajas de 8 pozos (Lab-tek, USA). Posterior a la fijación en 
paraformaldehído al 4%, fueron deshidratados en metanol en series graduales y almacenados a 
-20 ° C hasta el momento de su uso, para posteriormente ser hidratados nuevamente en series 
decrecientes de metanol; seguido de los lavados con PBS-Tween 20 (Anexo 17),la 
inespecificidad se evitó con Bloqueador Universal 1x (Anexo 15). El anticuerpo primario anti-
RUNX3, anti-SEMA3C o anti-Ednrb en una dilución 1:10, fue incubado toda la noche a 4°C. Los 
lavados se realizaron con PBS-Tritón 0.1% (Anexo 6). Se agregó el anticuerpo secundario en 
dilución 1:50 anti-conejo (Alexa flúor 488) o anti-cabra (Alexa flúor 594), según el caso y se 
incubó por 4 horas. Posteriormente los núcleos se marcaron con DRAQ7 (Biostatus, United 
Kingdom). Los embriones fueron almacenados en PBS: glicerol en proporción 1:1, hasta el 
momento de ser montados en portaobjetos con excavación utilizando VECTASHIELD (Vector 
Laboratories Inc.,Burlingame) y fotografiados con un Microscopio CONFOCAL Axiover 100M 
(Zeiss, Germany), empleando Zen2009 como programa de captura de imagen. Las micrografías 
fueron realizadas a 40X. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Nayelli Beatriz Ponce 
28 
 
 
9. RESULTADOS 
9.1 Diseño de ribosondas 
Para poder efectuar la hibridación in situ se llevó a cabo la formación de las sondas, las cuales 
se produjeron a partir de la amplificación de SEMA3C(152pb ), Ednrb (213pb) y RUNX3 (131 
pb); obteniendo el amplicón del tamaño esperado(Figura 1-A, 3-A y 5-A). 
Una parte crucial del proceso fué la transformación bacteriana, la cual se visualizó a través de la 
mayor cantidad de bacterias blancas y una menor cantidad de bacterias azules (Figura 1-B, 3-B 
y 5-B), lo que permitió que lográramos elegir la colonia bacteriana a utilizar de acuerdo a la 
mejor banda producida en el tamaño de amplicón esperado (Figura 1-C, 2-C y 3-C). A partir de 
las colonias seleccionadas, con la ayuda de la doble restricción se logró corroborar la presencia 
del inserto en las clonas bacterianas para cada gen de acuerdo al tamaño esperado para cada 
uno (Figura 1-D, 3-D). En el caso de RUNX3 no logró obtenerse la liberación del inserto (Figura 
5-D). 
Se llevó a cabo la secuenciación de cada clona elegida (Figura 1-E, 3-E); el resultado se 
introdujo en el programa BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi);donde se indica el 
porcentaje de complementariedad de la secuencia deseada con la problema así como la 
dirección de los insertos, en base a la numeración de los nucleótidos. El resultado indicó las 
secuencias en sentido 5’ – 3’ (Figura 2-A, 4-A). 
Finalmente se efectúo una restricción en sentido opuesto al promotor SP6 y T7 (Figura 2-B, 4-
B), observándose la linealización del plásmido, lo que permitió generar nuestra sonda, la región 
amplificada para ello se muestra en la Figura 2-C y 4-C. 
Sin embargo para RUNX3 no fue posible la obtención de ésta, lo cual pudo haberse debido a la 
ubicación de la región amplificada para generarla, y que el tamaño del inserto a obtener era 
pequeño. 
 
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
 Nayelli Beatriz Ponce 
29 
 
 
Figura 9. Síntesis de Ribosonda para SEMA3C 
A) Gel de agarosa del producto de SEMA3C por PCR punto final de un tamaño de 152 pb. B) Imagen del crecimiento 
de colonias blancas y azules de E. coli posterior a su transformación con la reacción de ligación. C) Visualización de 
la PCR punto final en un gel de agarosa de las colonias blancas (C1-C7) seleccionadas de la transformación de 
SEMA3C. D) Gel de doble restricción y visualización de la liberación del inserto de la colonia 6 y 7 (SEMA3C). 
E) Cromatograma de la Secuenciación del Forward de SEMA3C pb=pares de bases, C=colonia, PC=Plásmido Cerrado, 
E= Escalera. (HIMFG ,Lab. De Inv. En Biol. del Desarrollo y Teratogénesis Experimental). 
 
 Nayelli Beatriz Ponce 
30 
 
 
 
Figura 10. Síntesis de Ribosonda para SEMA3C 
A) BLAST del resultado obtenido de la secuenciación de SEMA3C (Forward) y la secuencia de SEMA3C. B) Gel de 
agarosa de la linealización del plásmido con enzimas de restricción para generar las ribosondas. C) Ubicación de la 
región amplificada en la secuencia del gen correspondiente a la sonda para Ednrb. PC=Plásmido Cerrado, b= bases. 
(HIMFG , Lab. De Inv. En Biol. Del Desarrollo y Teratogénesis Experimental). 
 
 Nayelli Beatriz Ponce 
31 
 
 
Figura 11. Síntesis de Ribosonda para Ednrb 
A) Gel de agarosa del producto de Ednrb por PCR punto final de un tamaño de 213pb. B) Imagen del crecimiento de 
colonias blancas y azules de E. coli posterior a su transformación con la reacción de ligación. C) Visualización de la 
PCR punto final en un gel de agarosa de las colonias blancas (C1-C5) seleccionadas de la transformación de Ednrb. 
D) Gel de doble restricción y visualización de la liberación del inserto de la colonia 3 (Ednrb). E) Cromatograma de 
la Secuenciación del Forward de Ednrb. pb=pares de bases, C=Colonia, PC=Plásmido Cerrado, E= Escalera. (HIMFG 
,Lab. de Inv. en Biol. del Desarrollo y Teratogénesis Experimental). 
 
 Nayelli Beatriz Ponce 
32 
 
 
 
Figura 12. Síntesis de Ribosonda para Ednrb 
A) BLAST del resultado obtenido de la secuenciación de Ednrb (Forward) y la secuencia de Ednrb. B) Gel de agarosa 
de la linealización del plásmido con enzimas de restricción para generar las ribosondas. C) Ubicación en la secuencia 
del gen de la región amplificada correspondiente a la sonda para Ednrb . PC=Plásmido Cerrado,b=bases. (HIMFG 
,Lab. de Inv. En Biol. del Desarrollo y Teratogénesis Experimental). 
 
B) 
C) 
Range 1: 1 lo 173 ~ 
$,,--
294 bits( 1 59) 
uery 1 
Sbjct: 173 
Ouery 61 
Sbjct: 11. 
Query 121 
Sbjct 56 
PC 
J ..... t¡~,. 
171/176(97%} 
S_n" 
Plus/Minus 
AGTGTCTCTTACTGAACCTCCCAGCTAAGCTAATGCCTACCAATCTCCAGAAATCCTATC 60 
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 11 I I I I I I I I I I 11 I I I I I 11 I I I I 
~GTGTCTCTTACTGAACCT-GGAGCTAAGCTAATGCCTACCAATCTCCAGAAATCCTATC 115 
ACTAGAATTATAGGCATGTGGGGTAGCCCATGCCTTATATCCCCCGCCCCTCCACTGCCC 120 
1 1 1 I I I 1 1 1111 1 1 1 1 1 1 11 11 1 I I I I 1 1 1 I I I 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 
ACTAGAATTATAGGCATGTGGG-TAGCC-ATGCCTTATATCCCCCGeCCCTCCACTGCCC 57 
TTCTTTCTTTGGTGTTTTAAGATAGGACCTTACTGTATAACTCAAACTGGCCTTGA 176 
1 1 1 1 1 1 1 1 1111 1 1 1 1 1 1 11 11 r 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 " 1 1 1I I I 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 
TTCTTTCTTTGGTGTTTTAAGATAGGACCTTACTGTATAACTCAAACTGGCCTTGA 1 
Sacl Sacll 
E~N E~N 
,-L" __ ~('=2~56~1~9~b'..:-~2::5~8:5=,3b':l)~~I __ 1 _....:...\ 1 
----~~- I ~ 
TCTGCTTTCAAGGCCAGTTTGAGTTATACAGTAAGGTCCTATCTTAAAACACCAAAGAAAGA 
AGGGCAGTGGAGGGGCGGGGGATATAAGGCATGGCTACCCACATGCCTATAATTCTAGTG 
ATAGGATTTCTGGAGATTGGTAGGCATTAGCTTAGCTCCAGGTTCAGTAAGAGACACTGTCT 
TAGGGAAATAAGGTGGTGGGGGATAGATC 
 Nayelli Beatriz Ponce 
33 
 
 
 
 
 
 
Figura 13. Síntesis de Ribosonda para RUNX3 
A) Gel de agarosa del producto de RUNX3 por PCR punto final de un tamaño de 131pb. B) Imagen del crecimiento de 
colonias blancas y azules de E. coli posterior a su transformación con la reacción de ligación. C) Visualización de la 
PCR punto final en un gel de agarosa de las colonias blancas (C1-C4) seleccionadas de la transformación de RUNX3. 
D) Gel de doble restricción y visualización de la liberación del inserto de la colonia 2 y 3 (RUNX3). pb= pares de 
bases, C=colonia, PC=Plásmido Cerrado, E= Escalera (HIMFG, Lab. De Inv. en Biol. del Desarrollo y Teratogénesis 
Experimental). 
 
 
 Nayelli Beatriz Ponce 
34 
 
 
9.1.1 Distribución espacio temporal de SEMA3C 
qPCR tiempo real de SEMA3C 
El mensajero de SEMA3C en cada etapa del corazón fue analizado por qPCR tiempo real. Con 
la finalidad de determinar los cambios de expresión entre las etapas de estudio y el corazón 
adulto; los Cts obtenidos de cada etapa fueron analizados por el método de 2Ct, encontrando 
que en todas las etapas de la morfogénesis temprana, la expresión del mensajero de SEMA3C 
siempre fue mayor a la observada en el corazón adulto, para tubo recto 5 veces más, para asa 
en C 8.67 veces más, para asa en S 6.16 veces más y para asa avanzada 19.35 veces más 
(Figura 14). 
 
Hibridación in situ de SEMA3C 
Con la finalidad de determinar los cambios de expresión in situ del mensajero correspondiente 
a SEMA3C durante las etapas de la morfogénesis temprana, realizamos hibridación in situ; 
mediante microscopia confocal observamos que el mensajero de SEMA3C no tiene una 
expresión regionalizada con respecto a las estructuras que se integran; cabe destacar que fue 
posible notar algunas células tanto en el extremo inferior como en el superior con mayor 
expresión, que también fueron positivas a la ribosonda empleada (Figura 15). 
 
Inmunofluorescencia de SEMA3C 
Con el propósito de determinar los cambios de expresión in situ de la proteína de SEMA3C 
durante las etapas de la morfogénesis temprana, realizamos inmunofluorescencia en embrión 
completo; mediante microscopia confocal observamos que ésta proteína está expresada en 
mayor cantidad en el corazón de etapa de asa S y asa avanzada, en ninguna de las 
micrografías fue posible determinar la proteína en poblaciones celulares extracardiacas (Figura 
15). A través de la obtenciónde la gráfica de intensidad por pixel se observó un mayor valor en 
la etapa de tubo recto, y un posterior descenso en las etapas posteriores (Figura 14). 
En cuanto a la ubicación celular de la proteína, se observó su presencia en el núcleo celular y 
en el citoplasma. 
 
 
 
 
 
 Nayelli Beatriz Ponce 
35 
 
 
 
 
Figura 14. Gráficas del análisis cuantitativo de la expresión espacio-temporal de SEMA3C durante la 
morfogénesis temprana del corazón de ratón. 
A) Expresión relativa de SEMA3C, empleando como gen constitutivo 18S y como calibrador el corazón de 
ratón en etapa adulta, B) Media de intensidad por pixel de la proteína de SEMA3C en cada una de las 
etapas del corazón. TR=tubo recto, AC=Asa en C, AS=Asa en S, AA=Asa Avanzada, AD= Adulto. 
 Nayelli Beatriz Ponce 
36 
 
 
 
Figura 15. Micrografias de la distribución espacio-temporal de SEMA3C durante la morfogénesis durante la 
morfogénesis temprana del corazón de ratón. 
A) Micrografías en campo claro, B) Expresión de la ribosonda para SEMA3C por inmunofluorescencia, C) Expresión 
de la proteína de SEMA3C. TR=tubo recto, AC=Asa en C, AS=Asa en S, AA=Asa Avanzada, VD=ventrículo derecho, VI= 
ventrículo izquierdo, TS= tracto de salida, TE= tracto de entrada, AI= atrio izquierdo, AD= atrio derecho (HIMFG, Lab. 
De Inv. en Biol. del Desarrollo y Teratogénesis Experimental). 
 Nayelli Beatriz Ponce 
37 
 
 
9.1.2 Distribución espacio temporal de Ednrb 
qPCR tiempo real de Ednrb 
El mensajero de Ednrb en cada etapa del corazón fue analizado por qPCR tiempo real. Los 
cambios de expresión únicamente fueron observados en las etapas de asa en C (10.39 veces 
más que el adulto) y asa Avanzada (1.4 veces más que el adulto), el resto de las etapas los 
valores de expresión obtenidos no mayores al corazón de etapa adulta (Figura 16). 
 
Hibridación in situ de Ednrb 
Con la finalidad de determinar los cambio expresión in situ de la proteína de Ednrb durante las 
etapas de la morfogénesis temprana, realizamos hibridación in situ; mediante microscopia 
confocal hallamos que el mensajero de Ednrb tiene una baja expresión, pero al igual que 
SEMA3C no es regionalizada, cabe destacar que dicha expresión fue claramente visible en la 
región ventricular (Figura 17). 
 
Inmunofluorescencia de Ednrb 
Con la finalidad de determinar los cambios de expresión in situ de la proteína de Ednrb durante 
las etapas de la morfogénesis temprana, analizamos micrografías con Inmunofluorescencia en 
embrión completo. A diferencia del mensajero, la proteína fue claramente visible desde el 
corazón en tubo recto hasta el asa avanzada, pero expresión de la proteína no fue exclusiva a 
la región apical trabeculada. Su localización subcelular fue muy notable (Figura 17). 
De acuerdo a los valores obtenidos de la gráfica de intensidad por pixel se obtuvo un mayor 
valor en la etapa de asa en C, con un valor muy próximo al obtenido en tubo recto y asa 
avanzada (Figura 16). 
En cuanto a la ubicación celular, la proteína se localizó en la membrana celular (Figura 17). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Nayelli Beatriz Ponce 
38 
 
 
 
Figura 16. Gráficas del análisis cuantitativo de la expresión espacio-temporal de Ednrb durante la morfogénesis 
temprana del corazón de ratón. 
A) Expresión relativa de Ednrb, empleando como gen constitutivo 18S y como calibrador el corazón de ratón en 
etapa adulta, B) Media de intensidad por pixel de la proteína de Ednrb en cada una de las etapas del corazón. 
TR=tubo recto, AC=Asa en C, AS=Asa en S, AA o SA=Asa Avanzada, AD= Adulto. 
 Nayelli Beatriz Ponce 
39 
 
 
 
Figura 17. Micrografías de la distribución espacio temporal de Ednrb durante la morfogénesis temprana del 
corazón de ratón. 
A) Micrografías en campo claro, B) Expresión de la ribosonda para Ednrb por inmunofluorescencia, C) Expresión de 
la proteína para Ednrb. TR=tubo recto, AC=Asa en C, AS=Asa en S, AA=Asa Avanzada, VD=ventrículo derecho, VI= 
ventrículo izquierdo, TS= tracto de salida, TE= tracto de entrada. (Lab. De Inv. En Biol. Del Desarrollo y teratogénesis 
experimental). 
 Nayelli Beatriz Ponce 
40 
 
 
 
9.1.3 Distribución espacio temporal de RUNX3 
qPCR tiempo Real de RUNX3 
Los cambios de expresión del mensajero de RUNX3 fueron evidentes en las etapas de corazón 
en tubo recto (1.2) asa en S (16.21) y asa avanzada (4.21), en el corazón de etapa en asa en C 
los valores obtenidos no fueron muy similares a la expresión del corazón en etapa adulta. 
(Figura 18). Por su baja expresión no fue posible realizar la hibridación in situ. 
 
Inmunofluorescencia de RUNX3 
Las micrografías con inmunofluorescencia para RUNX3 en embrión completo, mostraron al 
igual que la qPCR tiempo real, que la expresión de RUNX3 es muy escasa en el corazón en 
tubo recto, prácticamente negativo en el corazón en el corazón en etapa en C, mientras que 
dicha expresión se recupera en las siguientes dos etapas (Figura 19). 
De acuerdo a los valores observados por la gráfica de intensidad por pixel se obtuvo un mayor 
valor en la etapa de TR, con un descenso drástico y un aumento en las etapas posteriores 
(Figura 18). La proteína correspondiente a un factor de transcripción se localizó en el núcleo 
celular (Figura 19). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Nayelli Beatriz Ponce 
41 
 
 
 
 
 
Figura 18. Gráficas del análisis cuantitativo de la expresión espacio-temporal de RUNX3 durante la morfogénesis 
temprana del corazón de ratón. 
A) Expresión relativa de RUNX3, empleando como gen constitutivo 18S y como calibrador el corazón de ratón en 
etapa adulta, C) Media de intensidad por pixel de la proteína de RUNX3 en cada una de las etapas del corazón. 
TR=tubo recto, AC=Asa en C, AS=Asa en S, AA o SA=Asa Avanzada, AD= Adulto (HIMFG, Laboratorio de investigación 
en Biología del desarrollo y teratogénesis experimental). 
A) 
~ 
> 
:;:¡ 
~ 
-.; 
'" " -O -.; .. a. 
x 
~ 
B) 
20 
18 
16 
1 4 
12 
10 
8 
6 
4 
2 
O 
TR 
900 
800 
700 
600 
SOO 
400 
300 
200 
100 
O 
RNAm de RUNX3 
AC AS SA 
Inmunofluorescencia RUNX3 
TR AC AS 
A D 
AA 
• TR 
• AC 
• AS 
• SA 
. AD 
. AA 
 Nayelli Beatriz Ponce 
42 
 
 
 
Figura 19. Micrografías de la distribución espacio-temporal de RUNX3 durante la morfogénesis temprana del 
corazón de ratón. 
A) Micrografías en campo claro, B) Expresión de la proteína para RUNX3. TR=tubo recto, AC=Asa en C, AS=Asa en S, 
AA=Asa Avanzada, VD=ventrículo derecho, VI= ventrículo izquierdo, TS= tracto de salida, TE= tracto de entrada. 
(HIMFG, Laboratorio de Investigación en Biología Del Desarrollo y Teratogénesis Experimental). 
 Nayelli Beatriz Ponce 
43 
 
 
10. ANÁLISIS DE RESULTADOS 
 
La morfogénesis temprana del corazón es un proceso que implica la integración de poblaciones 
celulares destinadas a formar regiones específicas del corazón (tracto de entrada, región apical 
trabeculada, tracto de salida, atrios y seno venoso); regida por diversos mecanismos aún 
desconocidos. En este estudio analizamos la distribución espacio temporal de tres genes 
SEMA3C, Ednrb y RUNX3 involucrados en procesos de migración que previamente fueron 
determinados por estudios de microarreglos de expresión. 
De forma interesante, ninguno de los tres genes de estudio presentó una expresión selectiva o 
mejor dicho regionalizada dentro de las diferentes regiones en formación del corazón. Sin 
embargo, es necesario destacar que fue evidente una distribución temporal, lo cual 
posiblemente este asociado con los procesos de torsión y looping durante la morfogénesis 
temprana. 
 
10.1 SEMA3C 
Mediante estudios in vitro se ha demostrado que SEMA3C puede ser quimiorepulsiva o 
quimioatrayente dependiendo del tejido, además