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Aprendiendo Biologia

28/7/2022

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Biología

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN

Evaluación de la fotorrespiración en el crecimiento de
un consorcio alcalófilo fotosintético

TESIS
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
LICENCIADO EN BIOQUÍMICA DIAGNÓSTICA

PRESENTA:
MIGUEL ANGEL RAMÍREZ GARCÍA

ASESOR: DR. ARMANDO GONZÁLEZ SÁNCHEZ
COASESORA: DRA. MARIANA FRANCO MORGADO

CUAUTITLAN IZCALLI, ESTADO DE MEXICO, 2019

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN
SECRETARÍA GENERAL
DEPART AMENTO DE EXÁMENES PROFESIONALES
VliIVEp(.DAD ftlAqONA!..
AVlJOJ:¡OMA D[
)Y\.[lUC,O
M. en C. JORGE ALFREDO CUÉLLAR ORDAZ
DIRECTOR DE LA FES CUAUTITLAN
PRESENTE
..
"
ATN: I.A. LAURA MARGARITA CORT,..,...,,..,,,,,
Jefa del Departamento de Exánll~l'lWtp 'fils1bnales
IM' ~I.1'.<\t1¡¡OS'~ll ~ . de la!']!,/) cüau I lan.
Con base en el Reglamento General de Exámenes, y la Dirección de la Facultad, nos permitimos
comunicar a usted que revisamos el: Trabajo de Tesis
Evaluación de la fotorrespiración en el crecimiento de un consorcio alcalófilo fotosintético.
Que presenta el pasante: Miguel Angel Ramirez Garcia
Con número de cuenta: 312196125 para obtener el Titulo de la carrera: Licenciatura en Bioquímica Diagnóstica
Considerando que dicho trabajo reúne los requisitos necesarios para ser discutido en el EXAMEN PROFESIONAL
correspondiente, otorgamos nuestro VOTO APROBATORIO.
ATENTAMENTE
"POR MI RAZA HABLARÁ EL EspíRITU"
Cuautitlán Izcalli, Méx. a 15 de Agosto de 2019.
PROFESORES QUE INTEGRAN EL JURADO
NOMBRE
PRESIDENTE Q. Arcadia Hemández Beltrán
VOCAL Q.F.B. Verónica Ruiz Solorio
SECRETARIO Dr. Armando González Sánchez
)er. SUPLENTE Dr. Julio César Morales Mejía
2do. SUPLENTE Dra. Berenice Gómez Zaleta
NOTA: los sinodales suplentes están obligados a presentarse el día y hora del Examen Profes¡onal (art. 127).
LMCf/cga*
FIRMA
~ .

ESTE TRABAJO DE TESIS SE DESARROLLÓ EN EL LABORATORIO DE
INGENIERÍA AMBIENTAL DEL INSTITUTO DE INGENIERÍA DE LA UNAM, QUE
CUENTA CON CERTIFICADO DE CONFORMIDAD OTORGADO POR EL
ORGANISMO ACREDITADO CERTIFICACIÓN MEXICANA, S.C, POR HABER
IMPLEMENTADO Y MANTENER UN SISTEMA DE GESTIÓN DE LA CALIDAD DE
CONFORMIDAD CON LOS REQUISITOS DE LA NORMA INTERNACIONAL ISO
9001-2015 NO. DE CERTIFICACIÓN CMX C SGC 155 2017, VALIDO EN EL PERIODO
DEL 09 DE NOVIEMBRE DE 2017 AL 09 DE NOVIEMBRE DE 2020.

“Si realmente amas la naturaleza, encontrarás la
belleza en todas partes”
-Vincent van Gogh

“La grandeza nace en los pequeños inicios”
-Sir Fracis Drake

Dedicatoria
A mis padres, durante toda mi vida, ustedes han sido los que se han preocupado por mí y me
han colmado de sus atenciones. Son tantas las cosas que me han dado que mencionarlas me
llevaría el doble de espacio que necesite para este trabajo. Gracias por todo.

Agradecimientos
A mi alma mater la Universidad Nacional Autónoma de México por darme la oportunidad
de mi vida, como una madre, me entrego todo lo que pudo y yo como respuesta, me entregare
en todo lo que haga.
A la Facultad de Estudios superiores Cuautitlán, UNAM por el conocimiento, los amigos y
los buenos momentos que me dio.
Al instituto de ingeniería, UNAM por darme la oportunidad del desarrollo académico
Al proyecto CEMIEBIO 247006 del fondo SENER-CONACyT por su apoyo financiero.
Al proyecto PAPIIT IT-100317 por su financiamiento parcial.
Al Dr. Armando González Sánchez por su asesoría, apoyo y recomendaciones durante la
elaboración de la tesis de licenciatura.
A la Dra. Mariana Franco Morgado por sus consejos, apoyo, dirección y amistad desde el
primer día que nos conocimos.
A Daniel De los Cobos Vasconcelos por sus consejos en el laboratorio y su apoyo durante
mi experimentación.
A mi familia por su apoyo incondicional en el camino que elegí para mi vida.
A David, Orlando y Brigitte, mis amigos por casi 10 años.
A mis compañeros que integran la línea de investigación por sus consejos y amistad durante
todo el año que llevo trabajando junto con ellos.

Contenido
RESUMEN ...................................................................................................................... 4
MARCO TEORICO ........................................................................................................ 5
Microalgas ............................................................................................................... 5
Hábitat e impacto ecológico de las microalgas ................................................ 5
Fotosíntesis .............................................................................................................. 6
Reacciones dependientes de luz ....................................................................... 7
Reacciones independientes de luz .................................................................. 12
Rubisco .................................................................................................................. 15
Fotorrespiración ..................................................................................................... 16
Funciones y efectos de la fotorrespiración ..................................................... 18
Mecanismos concentradores de carbono ............................................................... 19
Uso de diferentes fuentes de carbono ............................................................. 19
Aclimatación en entornos limitados por CO2 ................................................. 20
Microcompartimento ...................................................................................... 21
Excreción extracelular .................................................................................... 21
Fotosíntesis y fotorrespiración en procariontes y eucariontes ............................... 21
Fotobiorreactores ................................................................................................... 23
Factores de estrés ambiental en el crecimiento microalgal .................................... 24
Luz y temperatura ........................................................................................... 25
pH ................................................................................................................... 25
Oxígeno disuelto ............................................................................................. 26
Usos y aplicaciones del cultivo de microalgas ...................................................... 26
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ..................................................................... 28
JUSTIFICACIÓN.......................................................................................................... 28

HIPÓTESIS ................................................................................................................... 29
OBJETIVO GENERAL ................................................................................................ 29
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................29
MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................... 30
Microrganismos ..................................................................................................... 30
Sistemas experimentales ........................................................................................ 30
Condiciones de cultivo ........................................................................................... 31
Cultivo en el fotobiorreactor HRAP ...................................................................... 32
Cultivo en fotobiorreactor cerrado y fotobiorreactor abierto ......................... 33
Determinaciones analíticas e instrumentales ......................................................... 34
Determinación de pH, oxígeno disuelto y temperatura .................................. 34
Cinética de crecimiento .................................................................................. 34
Determinación de tamaño celular de algas eucariontes por microscopía ....... 35
Cálculo de productividad de biomasa ............................................................. 37
Velocidad específica de crecimiento .............................................................. 37
Cálculo de tiempo de duplicación .................................................................. 38
Análisis estadístico ANOVA para tamaños celulares .................................... 38
Determinación de compuestos solubles en el medio de cultivo ..................... 38
Cálculo de CO2 disuelto (DCO2) .................................................................... 39
Producción y consumo oxígeno ...................................................................... 39
Fijación y producción de carbono .................................................................. 40
Consumo total de carbono inorgánico y nitrógeno ......................................... 41
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................... 42
Identificación de microalgas presentes en el consorcio de estudio........................ 42
Cinética de crecimiento en Fotobiorreactor Cerrado y Fotobiorreactor Abierto ... 42

Desempeño de los fotobiorreactores ...................................................................... 45
Parámetros cinéticos de los cultivos en el FBA y en el FBC ................................ 46
Velocidad especifica de crecimiento .............................................................. 46
Tiempo de duplicación ................................................................................... 47
Productividad de FBA y FBC ......................................................................... 48
Observaciones macroscópicas durante el cultivo en el FBA y FBC ..................... 49
Observaciones microscópicas del biofilm del FBA y FBC ................................... 52
Tamaño celular de células eucariotas y su proporción en los SST ........................ 52
Fotosíntesis y fotorrespiración en FBA y FBC ...................................................... 56
Desempeño del oxígeno disuelto, temperatura y pH ...................................... 56
Consumo de nutrientes ................................................................................... 59
rO2 y rIC en los sistemas FBA y FBC ............................................................. 61
Fotobiorreactor abierto HRAP ............................................................................... 64
RESUMEN DE RESULTADOS .................................................................................. 68
CONCLUSIONES ........................................................................................................ 69
REFERENCIAS ............................................................................................................ 70
APÉNDICES ................................................................................................................. 82
Apéndice I. Metodología de SST ........................................................................... 82
Apéndice II. Curva de calibración TSS vs conteo celular ..................................... 83
Apéndice III. Cuantificación de compuestos solubles en el medio de cultivo ...... 85
Apéndice IV. Resultados de prueba de normalidad para el tamaño celular .......... 87
Apéndice V. Resultados estadísticos. .................................................................... 88

Índice de figuras
Figura 2.1 Estructura química de la clorofila ........................................................................ 7
Figura 2.2 Estructura química de la clorofila y bacterioclorofila .......................................... 8
Figura 2.3 Estructuras químicas de ficourobilina, ficoeritrobilina y ficocyanobilina ........... 8
Figura 2.4 Carotenoides más importantes en algas y microalgas .......................................... 9
Figura 2.5 Flujo de electrones en las reacciones dependientes de luz................................. 12
Figura 2.6 Esquema del ciclo de Calvin-Benson ................................................................ 14
Figura 2.7 Activación y mecanismo de acción de 1,5 bifosfato carboxilaza-oxígenasa ..... 15
Figura 2.8 Rutas metabólicas de la fotorrespiración en microalgas .................................... 17
Figura 8.1 Sistemas experimentales. ................................................................................... 30
Figura 8.2 Estructura de soporte para fotobiorreactores de botellas de 1L. ........................ 34
Figura 8.3 Características de exclusión e inclusión para medición de tamaños celulares. . 35
Figura 9.1 A) Fotografía de cianobacterias B) fotografía de consorcio microalgal ............ 42
Figura 9.2 FBA (A) y FBC (B) al inicio de la experimentación. ........................................ 43
Figura 9.3 Cinéticas de crecimiento de FBA y FBC. .......................................................... 44
Figura 9.4 Cinética por TSS de FBC y FBA. ...................................................................... 45
Figura 9.5 SST iniciales y finales de cada repetición. ......................................................... 46
Figura 9.6 Productividad de las repeticiones experimentales. ............................................ 49
Figura 9.7 Fotobiorreactores en el último día de experimentación ..................................... 50
Figura 9.8 A) Bioincrustación y flóculos en FBC y B) flóculos en FBA. .......................... 51
Figura 9.9 Imagen a 40X de flóculos, A) cultivo de FBC B) cultivo FBA ......................... 52
Figura 9.10 Gráfica de promedios de tamaños celulares vs tiempo. ................................... 53
Figura 9.11 Aportaciones de biomasa de cianobacterias y Nannochloropsis sp. ................ 56
Figura 9.12 Perfiles de OD, pH y temperatura con respecto al tiempo ............................... 58
Figura 9.13 Gráficas de compuestos solubles y crecimiento vs tiempo .............................. 60
Figura 9.14 Consumo y producción de de rO2 y rIC ........................................................... 63
Figura 9.15 Perfiles de OD, pH y temperatura para el HRAP durante 21 días ................... 65
Figura 9.16 Cinética de crecimiento en el fotobiorreactor HRAP ...................................... 67
Figura 13.1 Pasos en la prueba de sólidos totales. .............................................................. 83
Figura 13.2 Gráfica SST vs Log (conteo) ........................................................................... 85
Figura 13.3 Equipo Shimadzu TOC-LSH Y TLM-L. ......................................................... 87

Figura 13.4 Gráfico de tallo y hoja para área celular. .........................................................87
Figura 13.5 Gráfico Q-Q normal de área celular. ................................................................ 88

Índice de tablas
Tabla 2.1 Pigmentos fotorreceptotes presentes en diferentes tipos de algas ....................... 10
Tabla 2.2 Diferencias fotosintéticas y fotorrespiratorias entre procariontes y eucariontes . 22
Tabla 2.3 Tipos de fotobiorreactores ................................................................................... 24
Tabla 2.4 Aplicaciones de las microalgas............................................................................ 27
Tabla 8.1 Composición de los medios mineral modificado Zarrouk y del medio mineral de
carbono empobrecido .................................................................................................... 31
Tabla 8.2 Composición de la solución elementos traza ....................................................... 32
Tabla 8.3 Características de construcción de fotobiorreactor HRAP .................................. 33
Tabla 9.1 Velocidades especificadas de crecimiento .......................................................... 47
Tabla 9.2 Promedios de tiempo de duplicación ................................................................... 48
Tabla 9.3 Análisis de varianza de área celular .................................................................... 53
Tabla 9.4 Prueba post hoc Games-Hollew para áreas celulares .......................................... 54
Tabla 9.5 Consumo total de carbono inorgánico antes de la hora 100 ................................ 61
Tabla 9.6 RO2/RCO2 en los sistemas FBA y FBC ............................................................. 62
Tabla 10.1 Resumen de resultados del FBC y FBA ............................................................ 68
Tabla 10.2 Resumen de resultados del HRAP ..................................................................... 68
Tabla 13.1 Resultados de curvas de calibración .................................................................. 84
Tabla 13.2 Pruebas de normalidad....................................................................................... 87
Tabla 13.3 Descriptivos de área celulares ........................................................................... 88
Tabla 13.4 Prueba de homogeneidad de varianzas .............................................................. 89
Tabla 13.5 Pruebas robustas de igualdad de medias............................................................ 89

Abreviaturas
OD Oxígeno disuelto
µ Velocidad especifica de crecimiento
2PG 2-fosfoglicerato
3PG 3-fosfoglicerato
ANOVA Análisis de varianza
ATP Adenosina trifosfato
CCM Mecanismos concentradores de carbono
DCO2 CO2 disuelto
FBA Fotobiorreactor abierto
FBC Fotobiorreactor cerrado
GAP Gliceraldehido-3-fosfato
HRAP High Rate Algal Pond
Ks Constante de Monod
LHC complejo de recolección de luz
NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato
rIC Tasa de consumo de carbono inorgánico
rO2 Tasa de producción de oxígeno
ROS Especies reactivas de oxígeno
Rubisco Ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa/oxígenasa
SST Solidos suspendidos totales
Td Tiempo de duplicación
Rpm Revoluciones por minuto

RESUMEN
La fotorrespiración es una ruta metabólica encargada del reciclaje del 2-fosfoglicerato
generado por la actividad oxígenasa de Rubisco. La actividad excesiva de la fotorrespiración
causa una reducción en crecimiento de cualquier fotoautótrofo, una reducción en el
crecimiento y en la calidad de los fotosintetizadores cobra importancia cuando afectan las
actividades humanas, el cultivo de microalgas no es la excepción. El cual ha tomado
importancia a partir del redescubrimiento de estos fotoautótrofos y de sus aplicaciones en la
industria alimentaria, energética y química.
Existen varias técnicas y sistemas para su cultivo, los cuales se llaman fotobiorreactores, para
elegir cual sistema o técnica de cultivo es la mejor, se debe de considerar el objetivo del
cultivo y la especie, pero generalmente, las variables que más afectan en el crecimiento de
un cultivo microalgal son: luz, temperatura, medio de cultivo, pH y oxígeno disuelto. Siendo
el oxígeno disuelto el que favorecen la fotorrespiración y la cual puede alcanzar
concentraciones superiores a la saturación del agua por la actividad fotosintética
El propósito de este trabajo fue la evaluación de los efectos provocados por la
fotorrespiración en el crecimiento de un consorcio alcalófilo microalgal. Mediante la
comparación de dos fotobiorreactores del mismo volumen, pero sin la misma capacidad de
transferencia de gases entre el cultivo y el entorno.
Los cultivos sin restricción de transferencia de gas resultaron ser los más productivos y con
mejores parámetros cinéticos, también se observa generación de biofilm y una reducción de
7.58 µm2 en el tamaño celular en los cultivos sometidos a altas concentraciones de oxígeno.
Con los cálculos de producción/consumo de O2 y CO2 se encontró que la actividad
fotorrespiratoria es favorecida antes de la hora 100 y que solo es necesario una concentración
de 0.7 mmol OD/L o 22 mg/L para que la fotorrespiración esté presente. Finalmente se
propuso el aumento en la agitación en un fotobiorreactor abierto para mejorar la desorción
de oxígeno, obteniendo una menor exposición del 4 mg de oxígeno y una mayor
productividad del 8%. La fotorrespiración reduce el crecimiento y calidad del cultivo pero
no es el único efecto por altas concentraciones de OD que puede reducir la actividad
fotosintética.

MARCO TEORICO
Microalgas
El término “microalga” se da a todo microorganismo con un rango de tamaño de 2 a 50 µm
y que tenga la capacidad de realizar la fotosíntesis oxigénica (Olaizola, 2003). Este término
hace referencia a grupos heterogéneos de eucariontes y procariontes. En el caso de los
procariontes, las cianobacterias son las únicas capaces de realizar la fotosíntesis de los 7
filums que existen de bacterias fijadoras de carbono (Overmann and Garcia-Pichel, 2006;
Yehuda and Gurevitz, 2006). Por otra parte, las microalgas eucariontes pertenecen a los filum
Chlorophyta y Charophyta son de 2 de los 3 grupos que constituyen el clado Viridiplantae,
grupo monofilético que comprende plantas terrestres, algas y microalgas eucariontes (De
Clerck, Bogaert and Leliaert, 2012).
Hábitat e impacto ecológico de las microalgas
Gracias la diversidad de estrategias adaptativas y su flexibilidad evolutiva, las cianobacterias
poseen una tolerancia a condiciones ecológicas extremas de temperatura, pH, salinidad,
concentración de oxígeno y dióxido de carbono, dominando un amplio espectro de hábitats
acuáticos y terrestres (Yehuda and Gurevitz, 2006). En comparación con las cianobacterias,
son pocas las microalgas eucariontes con la capacidad de sobrevivir en entornos extremos,
su principal ecosistema son aguas dulces y océanos, pero ciertas especies crecen en rocas,
suelos y nieve.
Las microalgas pueden formar interacciones de comensalismo, mutualismo, o simbióticas
entre sí, con hongos, animales y plantas (Andersen, 2003; Whitton and Potts, 2012). En el
caso de las interacciones de mutualismo o sinérgicas, la asociación de dos o más poblaciones
microbianas, de diferentes especies, que pueden sobrevivir independientemente, pero al
actuar conjuntamente como una comunidad en un sistema complejo, obtienen beneficios
mayores a su actividad individual, se les denomina consorcios microbianos (Pascual et al.,
2015).
Las microalgas tiene la capacidad de producir biofilm. El biofilm es una conglomeración de
microorganismos incrustados por una matriz extracelular polimérica generada por ellas

mismas y adheridas a una superficie, en el caso que el biofilm se encuentre en suspensión es
comúnmente llamado flóculo (Donlan, 2002; Flemming and Wingender,2010).
El biofilm puede presentar características como; sistema de circulación de nutrientes y
desechos, diversos microambientes de pH, oxígeno y concentraciones de nutrientes,
diferentes modelos estructurales, adherencia y heterogeneidad (Carvalho, 2018). El biofilm
está compuesto por: 97% agua, 15-20% de microorganismos y del 75-95% de biopolímeros
extracelulares (Sutherland, 2001; Wimpenny and Colasanti, 2006). Aunque, también es
posible encontrar otras biomoléculas en el biofilm por lisis celular (Branda et al., 2005). El
biofilm protege contra un entorno agresivo, como puede ser la desecación, temperatura, pH,
competencia, depredación, fotoinhibición y escases de nutrientes (Donlan, 2002).
Las microalgas contribuyen aproximadamente a la mitad de la productividad fotosintética
del planeta, la mayor parte de la producción se ubica en los océanos, aportando al balance de
oxígeno, y gracias a ellas, se inician el flujo de energía en estos ecosistemas (Andersen, 2003;
Whitton and Potts, 2012).
Fotosíntesis
La fotosíntesis es la ruta metabólica encargada de la biosíntesis de moléculas orgánicas a
partir de luz solar, agua y carbono inorgánico (Ecuación 2.1). Es de las principales rutas
metabólicas del carbono en la tierra y quizás la ruta metabólica más importante, pues sin la
fotosíntesis como fuente energética y de carbono orgánico, la vida como la conócenos
simplemente no podría existir. Los organismos capaces de realizar la fotosíntesis son
llamados fotoautótrofos, los cuales pertenecen a diferentes reinos taxonómicos (Nelson and
Cox, 1994).
6CO2 + 12H2O + 18ATP + 12NADPH
Luz
→ C6H12O6 + 6O2 + 6H20 + 12NADPH
+ +
18ADP + 18Pi (Ec 2.1)
La fotosíntesis se divide en reacciones independientes de luz y reacciones dependientes de
luz.

Reacciones dependientes de luz
Los fotoautótrofos aprovechan los fotones de un rango conocido como PAR (radiación
fotosintética activa), este rango abarca de los 400 a 700 nm del espectro electromagnético.
La absorción del fotón comienza en una molécula fotorreceptora. Entre los fotorreceptores,
las clorofilas son los pigmentos fotosintéticos primordiales y los más comunes. La clorofila
es un tetrapirrol cíclico quelado con Mg, cuenta con una red de dobles y simples enlaces
alternantes, que le confieren gran eficiencia en la absorción de luz. La clorofila puede
absorber luz roja y azul, trasmitiendo luz verde. Como se muestra en la figura 2.1 las
diferencias en los grupos funcionales y en sus dobles enlaces crean diversos tipos de
clorofilas, que están presentes en diferentes autótrofos (Stryer, Berg and Tymoczko, 2007;
Beer, Bjork and Beardall, 2014c).

Figura 2.1 Estructura química de la clorofila, se muestra el tretapirrol ciclo y las
variaciones de radicales de las 5 clorofilas conocidas (Nelson and Cox, 1994;
Falkowski and Raven, 2007b; Stryer, Berg and Tymoczko, 2007).
La existencia de diferentes formas de clorofila que absorben luz en diferentes longitudes de
onda, permite a los autótrofos aprovechar mejor la energía electromagnética y disminuye la
competencia entre fotoautótrofos, permitiendo que coexistan en un mismo ambiente. Aparte
de las 5 clorofilas que existen, hay una variable presente de clorofilas en bacterias
anoxigénicas y cianobacterias, conocidas como bacterioclorofilas, como se observa en la

figura 2.2, la bacterioclorofila se difiere a la clorofila por la saturación del anillo 2 y una
cetona unida al carbono 7, dichas modificaciones reducen la eficiencia de captación de luz a
comparación de la clorofila. Las bacterioclorofilas esta presentes en las algas rojas
anoxigénicas y en algunas cianobacterias.

Figura 2.2 Estructura química de la clorofila y bacterioclorofila (Madigan et al.,
2016).
Aunque la clorofila es el pigmento fotosintético más importante, los fotoautótrofos necesitan
pigmentos accesorios. Los pigmentos accesorios se clasifican en carotenoides y ficobilinas.
En cianobacterias y algas rojas tienen como pigmentos accesorios a las ficobilinas. Las
ficobilinas son tetrapirroles no cíclicos, tampoco se encuentran asociados a un metal. Las
ficobilinas están unidades covalentemente a proteínas estructurales, formando estructuras
llamadas ficobilisomas, la energía de los fotones absorbidos por dichas estructuras se trasmite
a la clorofila mediante transferencia de excitones.

Figura 2.3 Estructuras químicas de ficourobilina, ficoeritrobilina y ficocyanobilina,
las cuales son las representativas del grupo de las ficobilinas adaptado de (Falkowski
and Raven, 2007b).

Los carotenoides representan a un gran grupo de pigmentos accesorios, su estructura básica
consta de un anillo de 6 carbonos con una cadena insaturada de 16 carbonos. Las variaciones
de grupos funcionales y la isomería originan la gran cantidad de carotenoides que conocemos,
en la figura 2.3 se muestran los carotenoides más importantes en algas y microalgas. Los
carotenoides igual que las clorofilas están unidas a la membrana.

Figura 2.4 Carotenoides más importantes en algas y microalgas adatado de
(Falkowski and Raven, 2007b).

Los pigmentos accesorios cumplen funciones como, receptores luminosos, amplían los
intervalos de energía luminosa que pueden ser utilizados, amortiguan el flujo de electrones,
protegen de la generación de especies reactivas de oxígeno, son disipadores de energía en
forma de calor. Dependerá de la especie de autótrofo la presencia y cantidad de cada
fotorreceptor, en la siguiente tabla se muestran los pigmentos presentes en algas y microalgas
presentes en cuerpos de agua dulce y marinos.
Tabla 2.1 Pigmentos fotorreceptotes presentes en diferentes tipos de algas

Pigmento
C
ia
n
o
b
ac
te
ri
a
P
ro
cl
o
ro
fi
ta
s
A
lg
a
v
er
d
e
A
lg
a
ro
ja

co
rm
o
fi
ta
s
d
in
o
fl
ag
el
ad
o
s
P
as
to
m
ar
in
o

Clorofila A x x x x x x x
Clorofila B x x x
Clorofila C1 y C2 x x
Clorofila D x x
Ficobilinas x x
Caroteniodes x x x x x x x
(Beer, Bjork and Beardall, 2014b)
Las clorofilas están asociadas a proteínas de unión específica creando complejos recolección
de luz, o por siglas en ingles LHC, en cambio los pigmentos accesorios a excepción de los
carotenoides, crean estructuras independientes. La unión de LHC´s con las proteínas
especializadas en transferencia de electrones forma un centro de reacción, el cual se conoce
como fotosistema. Dichos fotosistemas cumplen con la función de generar ATP y NADPH
para los posteriores pasos de la fotosíntesis (ecuación 2.2) (Falkowski and Raven, 2007b;
Stryer, Berg and Tymoczko, 2007; Horton et al., 2008; Rexroth, Nowaczyk and Rögner,
2017).
12H2O + 12NADP
+ + 18ADP + 18Pi
LUZ
→ 6O2 + 12NADPH + 18ATP + 12H
+ (Ec 2.2)

2.2.1.1 Flujo de electrones
El flujo de electrones inicia con la absorción de fotones por los pigmentos fotorreceptores,
aunque un sistema de captación de luz este formado entre 50 y 300 clorofilas y carotenoides
solo dos moléculas de clorofilas crea el centro de reacción, estas clorofilas reciben el nombre
de P680. P680 son los únicos pigmentos de todo el complejo que ceden electrones, la
tranferencia energía entre pigmentos fotorreceptores es por resonancia hasta llegar a P680.
P680 cede los electrones al fotosistema II, el cual es un sistema feofitina-quinona. Una
molécula de feofitina recibe los electrones del P680, dirige los electrones a un par de
plastoquinona, la segunda plastoquinona es reducida a plastoquinol. Esta reducción se lleva
a cabo por dos pasos, primero, una neutralización de P680+ y posteriormente en el centro de
manganeso captura dos moléculas de agua y por oxidación extrae 4 electrones, los cuales
sirven para reducir dos moléculas de plastoquinona, formandouna molécula de oxígeno y
dos moléculas de hidrogeno (Overmann and Garcia-Pichel, 2006; Horton et al., 2008; Beer,
Bjork and Beardall, 2014b).
Los fotosistemas II y I están conectados por el complejo citocromo bf. Este complejo es
homólogo al ubiquinol-citocromo C oxidorreductasa, cataliza el desprendimiento de los
protones de plastoquinol a través del ciclo Q. Obteniendo una transferencia de electrones
concomitante con el movimiento de protones a través de la membrana tilacoide (Jonathan H.
A. Nugent, 2004; Horton et al., 2008).
En fotosistema I se sustituye a P680 por P700. La absorción de luz es previa a la transferencia
del electrón. Una filoquinona acepta el electrón cedido por P700, luego a un conjunto de
agrupaciones de 4Fe-4S, hasta la proteína ferredoxina. La plastocianina neutraliza a P700+
transfiriendo su electrón. Con ayuda de la enzima ferredoxina-NADP+-reductasa cataliza la
formación de NADPH y la oxidación de dos moléculas de ferredoxina.
Las actividades combinadas de los dos fotosistema transportan electrones desde el agua al
NADP, conservando parte de la energía de la luz absorbida, sin embargo existe el flujo cíclico
de electrones, en el cual participa el fotosistema I, la ferrodoxina, citrocromo bf y P700.

El flujo cíclico de electrones produce ATP sin producir NADPH, catalizado por ATP sintasa.
El sistema se encuentra localizado en la membrana impermeable de protones, la membrana
tilacoide, La producción de ATP controla el gradiente de protones dentro del lumen del
tilacoide (Stryer, Berg and Tymoczko, 2007).

Figura 2.5 Flujo de electrones en las reacciones dependientes de luz. PSII/PSI-
fotosistema I y II feo- feofitina QA/QB - plastoquinonas PQ/PQH2- plastoquinona/
plastoquinol CYT bf – citocromo bf PC/Cyt C6- plastocianina Fe-S-agrupación 4Fe-S
Fd-ferredoxina, fil-filoquinona, Fd-ferredoxina-NADP-reductasa, las flechas rojas
presenta el flujo principal de electrones, las flecha negra muestra el flujo de electrones
encargado de generar ATP (Adaptado de Kallas, 2012).

Reacciones independientes de luz
Las reacciones independientes de luz aprovecharan la energía almacenada en las moléculas
de ATP y NADPH, productos de las reacciones dependientes de luz. La vía metabólica para
la síntesis de biomoléculas a partir de CO2 como única fuente de carbono más representativa
es la ruta C3 o ciclo de Calvin-Benson (ecuación 2.3).
6CO2 + 12NADPH + 18ATP → C6H12O6 + 12NADP
+ + 18ADP + 18Pi (Ec 2.3)

2.2.2.1 Ciclo de Calvin-Benson
El ciclo de Calvin-Benson genera gliceraldehido-3-fosfato (GAP) utilizando el ATP y
NADPH producidos en las reacciones dependientes de luz. El ciclo de Calvin-Benson se
divide en 3 etapas; fijación, reducción y regeneración, como se muestra en la figura 2.2.
La etapa de fijación inicia con una carboxilación en una molécula de ribulosa-1,5-difosfato,
creando un compuesto inestable de 6 carbonos, el cual se hidroliza inmediatamente
obteniendo dos moléculas de 3-fosfoglicerato (3PG). Esta reacción es catalizada por la
enzima ribulosa-1,5 bifosfato carboxilaza-oxígenasa (Rubisco). En la etapa de reducción hay
una reacción de fosforilación en el carbono 1 y una reacción de reducción del 3-
fosfoglicerato, obteniendo como producto GAP o en el isómero dihidroxiacetona fosfato
(DHAP).
GAP se utiliza en el citosol para la formación de hexosas, pero es necesario que 5 moléculas
de GAP realicen la etapa de regeneración para poder utilizar solo una. A partir de moléculas
GAP, las enzimas tranferasas generan xilulosa-5-fosfato y ribosa-5-fosfato, las cuales por las
enzimas ribulosa-5-fosfato-3-epimerasa y ribosa-5-fofatoisomerasa forman ribulosa-5-
fosfato. Por último, la enzima fosforribulocinasa cataliza una reacción de fosforilación en el
carbono 1, así completando un ciclo (Falkowski and Raven, 2007b; Horton et al., 2008; Beer,
Bjork and Beardall, 2014b).
La ruta C3 o ciclo de Calvin-Benson es la más expandida entre los fotoautótrofos alcanzando
un porcentaje del 90% (Sheoran and Singh, 1999). Todas las microalgas utilizan la ruta C3,
sin embargo, existen otras rutas alternas para la fijación de carbono, las cuales no serán
abordadas en esta tesis (Fuchs, 2011).

Figura 2.6 Esquema del ciclo de Calvin-Benson, se divide en 3 etapas: fijación,
reducción y regeneración, se obtiene gliceraldehido-3-fosfato (GAP) a partir de la
azúcar ribulosa-5-fosfato, es necesario regenerar Ribulosa para repetir el ciclo, se
crean azucares de 4, 6,7 y 5 carbonos durante por 4 vías alternas. Las enzimas de ciclo
se identifican con los números encerrados en círculo. (1) Ribulosa bifosfato
carboxilasa oxígenasa;(2) 3-fosfoglicerato quinasa; (3) 3-fosfogliceraldehido
deshidrogrenasa (4) fosfotriosa isomerasa; (5) aldosa; (6) transcetolasa; (7) fructosa-
1,6-bifosfato-1-fosfatasa; (8) sedoheptulosa-1,7-bifosfato-1-fosfatasa; (9) fosfopentosa
epimerasa; (10) fosforibulosa isomerasa; (11) fosforibuloquinasa. Adaptado de
(Falkowski and Raven, 2007a).

Rubisco
Rubisco es la enzima encargada de la fijación de carbono y la hidroxilación de ribulosa-1,5-
difosfato para la obtención de dos moléculas de 3-fosfoglicerato. La súper familia de las
Rubisco se clasifica en 4 formas según el número de subunidades que las componen,
encontrándose en fotosintetizadores oxigénicos como anoxigénicos. Rubisco 1 se encuentra
en fotosintetizadores oxigénicos, es una enzima compuesta por 8 subunidades grandes
iguales y 8 subunidades pequeñas; estás últimas varían según sea la especie (Bracher et al.,
2017).
Para la actividad enzimática de Rubisco es necesario que exista un metal divalente que puede
ser Mn2+ o Mg2+ junto con una molécula de CO2. La activación es por la formación un
carbamato con un residuo de lisina, en el cual el metal divalente se unirá. Ribulosa formará
un enediolato con el sitio activo con una consecutiva hidroxilación en el carbono 3 generando
2 moléculas de 3PG (Stryer, Berg and Tymoczko, 2007; Horton et al., 2008; Bracher et al.,
2017).

Figura 2.7 Activación y mecanismo de acción de 1,5 bifosfato carboxilaza-oxígenasa.
Adaptado de (Nelson and Cox, 2009).

Rubisco tiene una actividad oxígenasa, la cual competirá con la actividad de carboxilasa
(Bloom and Lancaster, 2018). Esta competencia está regulada por concentraciones de CO2 y
O2, especificidad de Rubisco, el metal divalente (Mg
2+ o Mn2+) y la temperatura. La misma
estrategia química que utiliza la enzima Rubisco le dan características para la fijación del
oxígeno. La actividad oxígenasa promueve la fotorrespiración (Ślesak, Ślesak and Kruk,
2017; Bathellier et al., 2018; Bloom and Lancaster, 2018).
Fotorrespiración
La fijación de O2 que realiza Rubisco produce una molécula de 3PG y una molecula de 2-
fosfoglicolato (2PG). 2PG puede inhibir la regeneración de intermediarios del ciclo de
Calvin-Benson, por lo que la fotorrespiración es la ruta metabólica multicompartimental
encargada de metabolizar el 2PG reciclando el carbono para su reingreso en el ciclo de
Calvin-Benson. El intercambio de gases en la fotorrespiración es inverso a la fotosíntesis
como se puede ver en la ecuación 2.4 (Bauwe, Hagemann and Fernie, 2010; Peterhansel et
al., 2010; Abadie et al., 2016).
2 Glicina + H2O → Serina + NH4
+ + NADH + CO2 (Ec 2.4)
La ruta principal de la fotorrespiración desarrollada por las microalgas está representada en
la figura 2.4. La ruta metabólica consta de 8 reacciones, más una vía complementaria para el
reciclaje de nitrógeno. La fotorrespiración en las cianobacterias no es multicompartimental,
pero comparte las mismas reacciones. Además de la ruta principal que existe en todos los
fotosintetizadores las cianobacterias pueden ocupar otras dos rutas alternativas para
metabolizar 2PG, las cuales son: rutade descarboxilación y ruta de glicolato (Peterhansel et
al., 2010).
Las vías secundarias actúan en cianobacterias como disipadores de energía o sumideros de
metabolitos intermediarios como el glioxilato, por lo que algunos autores sugieren que la
existencia de vías secundarias en la fotorrespiración implica que la desintoxicación de 2PG
y compuestos derivados podría ser más importante que el reciclaje de 2PG en cianobacterias
(Eisenhut et al., 2008).

Ribulosa-1,5-biP
RiBisCO
3-Pglicerato
2-Pglicolato
CO2
O2
Gliceraldehido-3–P
gliceraldehido-3–P
Glicolato
Glioxilato
Gly
Serina
Hidroxipiruvato
Glicerato
CO2
NH3 NH3
NH3
Glicolato
Glicina
Serina
Glicerato
Gly
Gly
CH2-THC
Glutamato
Glutamina
Tartronato-
semialdehido
CO2
Oxoglutarato
Oxoglutarato
Glutamato
Glioxilato
Formiato
Oxalato
CO2
CO2cloroplasto
Peroxisoma
Mitocondria
Ciclo de
Calvin
O2 H2O
O2
H2O2 H2+½O2
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8
AB
1
AB
2
B1
C1
C2
D1
THC
CITOSOL
B2
B3
B4

Figura 2.8 Rutas metabólicas de la fotorrespiración en microalgas, las flechas
punteadas representan movimiento entre los organelos y simplificación de la ruta,
como sucede con el ciclo de Calvin-Benson. Ruta Principal (verde); (A1) fosfoglicolato
fosfatasa; (A2) glicolato deshidrogenasa o glicolato oxígenasa; (A3) glioxilato
aminotransferas; (A4) glicina descarboxilasa; (A5) serina hidroximetiltransferasa;
(A6) serina-glioxilato aminotransferasa; (A7) hidroxipiruvato reductasa; (A8)
glicerato-3-kinasa. Ciclo de nitrógeno fotorrespiratorio (morado); (AB1) glutamina
sintetasa; (AB2) glutamina:oxoglutarato aminotransferasa. Ruta de descarboxilacion
(rojo); (B1) glycolato deshidrogenasa; (B2) glioxilato oxidasa; (B3) oxalato
descarboxilasa; (B4) formiato deshidrogenasa. Ruta de glicolato (azul claro); (C1)
glioxilato de carboligasa; (C2) semialdehído reductasa tartrónica; Oxidación de H2O2
(amarilla); (D1) catalasa (Eisenhut et al., 2008; Peterhansel et al., 2010; Hohmann-
Marriott and Blankenship, 2011; Hagemann, Weber and Eisenhut, 2016).

Funciones y efectos de la fotorrespiración
La principal función de la fotorrespiración es la destoxificación de intermediarios
metabólicos y el reciclaje de 3 carbonos de los 4 carbonos orgánicos del compuesto 2PG,
generado por la actividad oxígenasa de Rubisco (Peterhansel et al., 2010). La fotorrespiración
tiene otras funciones benéficas para los organismos fotoautótrofos. Puede ser un sumidero de
electrones, al consumir equivalentes reductores como el NADP evitando la generación de
especies reactivas de oxígeno (ROS) o participar en reacciones de resistencia, al ser una
fuente de H2O2 (Latifi, Ruiz and Zhang, 2009).
Los intermediarios de la fotorrespiración por ejemplo la glutamina, glicina y serina, forman
parte de otras vías metabólicas, interaccionando con otros procesos metabólicos como:
asimilación de nitrógeno, respiración mitocondrial, metabolismo C1 y biosíntesis de purinas
(Fox and Stover, 2008; Hagemann et al., 2010; Peterhansel et al., 2010; Obata et al., 2016).
El conjunto de las funciones mencionadas dan efectos de protección durante el proceso de
fotosíntesis, adaptabilidad de condiciones ambientales adversas y la transferencia de energía
entre procesos metabólicos (Young et al., 2016; Bloom and Lancaster, 2018).
Antropocéntricamente hablando, el efecto más importante es la reducción en la eficiencia
fotosintética debido a la pérdida de CO2, NH3 y consumo de energía por parte de la
fotorrespiración. Cada oxigenación de Rubisco equivale a 3.5 ATP y 2 equivalentes de
NADH, al menos 2 de cada 7 reacciones catalizadas por Rubisco son oxígenasa en
condiciones atmosféricas normales (CO2 de 380 ppm y un O2 de 21%) (Peterhansel et al.,
2010; Walker et al., 2016). La máxima energía de conversión de la fotosíntesis por la vía C3
se puede reducir hasta en un 49% a 30°C sólo por la fotorrespiración (Zhu, Long and Ort,
2008), aunque esto puede variar según la temperatura, concentraciones O2/CO2 y la especie.
No obstante, un aumento a favor de la actividad carboxilasa también puede afectar de manera
negativa a los fotoautótrofos, se ha reportado una disminución de minerales, nitrógeno y
proteínas en fotoautótrofos cultivados en altas concentraciones de CO2 experimentales. Por
lo que los desequilibrios de la actividad carboxilaza y en la actividad oxígenasa de Rubisco
puede afectar el crecimiento de los fotoautótrofos y por ende las actividades humanas
relacionadas a ellos (Loladze, 2014).

Mecanismos concentradores de carbono
La fijación de CO2 presenta desafíos en todos los ambientes, pero en los ambientes acuáticos
tienen desafíos adicionales. A diferencia de la concentración de CO2 en la atmósfera (394
ppm), las concentraciones de CO2 en los cuerpos acuáticos rondan a los 10-13 μM variando
por la geografía, salinidad, presión, pureza del cuerpo, pH y temperatura. En cambio, las
concentraciones de oxígeno disuelto en los cuerpos acuosos ronda entre 7-8 mg/L (218-250
μM), variando su concentración por las mismos parámetros que el CO2 disuelto (Beer, Bjork
and Beardall, 2014a).
El CO2 disuelto interactúa con el agua formando HCO3
- y CO3
-2 en función del pH. Sumado
a la lenta difusión del CO2 (10
4 veces más lenta a comparación con la difusión en el aire)
(Beer, Bjork and Beardall, 2014a) resulta en un agotamiento del CO2 disuelto durante la
fotosíntesis activa. Por lo que las microalgas han desarrollado diversas adaptaciones para
concentrar el CO2 alrededor de Rubisco, estas adaptaciones se conoce como mecanismos
concentradores de carbono o por sus siglas en inglés CCM (Wang, Duanmu and Spalding,
2011; Beer, Bjork and Beardall, 2014a).
Uso de diferentes fuentes de carbono
Las microalgas pueden utilizar todas las formas de carbono disuelto como fuente de carbono,
siendo el HCO3
- la especie predominante en pH de ambientes acuáticos, el cual tiene un rango
de 7 a 10 (Markou, Vandamme and Muylaert, 2014). Para la captación de carbono inorgánico
y el transporte por las diferentes membranas celulares, son utilizados varios transportadores
activos y pasivos suministrados energéticamente por la misma fotosíntesis (Huertas, 2002).
Además de los transportadores, existe la enzima anhidrasa carbónica, la cual cataliza la
conversión de HCO3
- a CO2 y viceversa, para su fijación o para evitar la pérdida de carbono
intracelular por filtración de CO2 al medio extracelular. Por lo que existen diversas anhidrasas
carbónicas en las diferentes espacios intracelulares (Beer, Bjork and Beardall, 2014a;
Montgomery, Lechno-Yossef and Kerfeld, 2016).

Aclimatación en entornos limitados por CO2
Varias microalgas cambian en función a la concentración de CO2, teniendo tres estados
distintitos de aclimatación: alto, bajo y muy bajo CO2 (Vance and Spalding, 2005). Los cuales
difieren por el tamaño celular, la afinidad que se tenga por CO2 o HCO3
-, tasa de crecimiento,
velocidad fotosintética, cantidad de clorofila y actividad metabólica. Las limitaciones de
carbono regulan la expresión de diferentes genes siendo la anhidrasa carbónica y los genes
relacionados con la fotorrespiración los más inducidos (Brueggeman et al., 2012; Burnap,
Hagemann and Kaplan, 2015). En cambio, en entornos sin limitación de CO2 son los genes
relacionados con la fotosíntesis, proteínas transportadoras de CO2 y adquisición de nutrientes
lo que son inducidos (Klähn et al., 2015; Orf et al., 2015). La expresión genética de cada
estado está mediado por diversos metabolitos y factores ambientales, siendo los más
importantes la intensidad de luz, CO2, HCO3
- y O2 (Spalding, 2009; Wang, Duanmu and
Spalding, 2011).
La aclimatación microalgal da como resultado cambios en la fisiología celular, como la
reubicación de las mitocondrias en la periferia contribuyendo en la activación del transportede carbono inorgánico entre membranas o la reorganización en la matrices de orgánulos para
mejorar la fijación de CO2 (Huertas, 2002). También se afecta la expresión de diferentes
transportadores de carbono entre compartimentos y la expresión de isoenzimas anhidrasa
carbónica. (Freeman Rosenzweig et al., 2017).
Los estados de aclimatación bajo y muy bajo CO2, permiten una rápida adaptabilidad a las
fluctuaciones de CO2 del entorno y economización energética, es sólo el estadio de alto CO2
donde la expresión de los CCM es basal, enfocándose sólo en la captura de CO2 (Wang,
Stessman and Spalding, 2015). Los tiempos requeridos para la expresión de los diferentes
estados de aclimatación van de 2-24 h, dependerá de la especie y de las condiciones utilizadas
para inducir el estado de aclimatación (Matsuda and Colman, 1995).

Microcompartimento
Tanto lo procariontes como los eucariontes cuentan con microcompartimentos proteicos,
donde la enzima Rubisco se encuentra empacada. Son una característica central de los
mecanismos concentradores de carbono. Los carboxisomas son únicos en las cianobacterias,
son cuerpos poliédricos, proteínicos de 90 a 250 nanómetros de diámetro, dependiendo de
las especies de cianobacterias (Yehuda and Gurevitz, 2006; Price et al., 2008).
El homólogo del carboxisoma en células eucariontes es llamado pirenoide. El cual está
ubicado dentro del cloroplasto en la mayoría de algas eucariontes, rodeado de placas de
almidón y travesado por microtúbulos continuos con las membranas tilacoides. Tienen una
función homologa al carboxisoma de las cianobacterias, pero también cuenta con funciones
en la formación y almacenamiento de almidón. Existe variabilidad entre el número y la forma
del pirenoides entre especies (Rochaix, 2017; Zhan et al., 2018).
Excreción extracelular
Las microalgas pueden secretar glicolato en lugar de metabolizarlo. Cuando la microalga no
cuenta con el tiempo suficiente para expresar los CCM, carece de la capacidad de metabolizar
un flujo tan alto de glicolato, por lo que la excreción de glicolato es la única forma de lidiar
con el aumento del mismo en condiciones fotorrespiratorias altas o cambios drásticos en la
concentración de fuentes de carbono (Marek and Spalding, 1991). Este mecanismo se detiene
después de la expresión y desarrollo de los CCM, pues la excreción de glicolato se vuelve
innecesaria. Todos los CCM logran un aumento en la concentración de CO2 intracelular,
favoreciendo la carboxilación de Rubisco, pero no logran detener actividad oxígenasa de
Rubisco por completo (Nakamura et al., 2005; Price et al., 2008; Winck, Páez Melo and
González Barrios, 2013; Pronina, Kupriyanova and Igamberdiev, 2017).
Fotosíntesis y fotorrespiración en procariontes y eucariontes
Aparte de las diferencias morfológicas entre eucariontes y procariontes, también existen
diferencias entre la fotosíntesis y la fotorrespiración que cada grupo realiza. Las diferencias
entre procariontes y eucariontes fotoautótrofos se presentan en la tabla 2.1. (Larkum et al.,
2004; Overmann and Garcia-Pichel, 2006).

Tabla 2.2 Diferencias fotosintéticas y fotorrespiratorias entre procariontes y eucariontes
Eucariontes Procariontes
C
lo
ro
fi
la

Se encuentran 3 de las 5 clorofilas que existen, las
clorofilas sólo difieren en las cadenas laterales.
Sólo la clorofila b está en las plantas superiores,
algas y algunas microalgas.
Cuentan bacterioclorofila a y b. La
bacterioclorofila no sólo cambia en las cadenas
laterales si no que tiene la diferencia de un doble
enlace menos en el anillo 2.
P
ig
m
en
to
s
En eucariontes se pueden encontrar clorofila b,
xantofilas, carotenos α y β. Otorgando un rango de
absorción de 454-670 nm.
Las ficobilinas se presentan en cianobacterias
como ejemplo: ficocianina, ficoeritrina y
aloficocianina, otorgando un rango de absorción
de 415 a 670nm.
C
lo
ro
p
la
st
o
s Este organelo es donde se realizan las reacciones
dependientes e independientes de luz además de las
primeras reacciones como las ultimas de la
fotorrespiración.
Los cloroplastos son sustituidos por plegamientos
de la membrana celular, que originan una red
compleja interna de membranas. Las reacciones
dependientes de luz se realizarán en toda la
periferia de la membrana celular.
F
lu
jo
d
e
el
ec
tr
o
n
es
La mayoría de los eucariontes utilizan la
plastocianina como aceptador terminar de
electrones del complejo citocromo bf.
La mayor parte de las cianobacterias y algunos
eucariontes usan citocromo C como reductor de
P700.
F
o
to
si
st
em
a
II
En eucariontes se pueden encontrar los complejos
de captación II por sus siglas en inglés LHCII, es
una estructura que contiene clorofilas y
carotenoides, y rodea por completo al PSII. Dando
como resultado una captura de fotones más
eficiente.
En las cianobacterias las ficobilinas se encuentran
en complejos antena especiales llamados
ficobilisomas. El color azulado de las
cianobacterias azul verdosas.
F
o
to
rr
es
p
ir
ac
ió
n

Algunas microalgas eucariontes puede realizar la
fotorrespiración multicompatimental, pero la
mayoría de las utilizan una variación más simple,
donde sólo el cloroplasto y la mitocondria son
utilizados como compartimientos para la
fotorrespiración, además que ocupan una enzima
homologa llamada glicolato deshidrogenasa, que no
genera H2O4.
La fotorrespiración se da en el citosol y en el
carboxisoma. Tampoco no generan H2O2 gracias
a que igual ocupan la enzima glicolato
deshidrogenasa. Además, las cianobacterias
cuentan con otras dos vías alternas a la ruta
principal de la fotorrespiración, fig 1.3, llamadas
Ruta de descarboxilación y Ruta de glicolato.
(Stabenau and Winkler, 2005; Falkowski and Raven, 2007b; Stryer, Berg and Tymoczko,
2007b; Horton et al., 2008; Bauwe, Hagemann and Fernie, 2010; Peterhansel et al., 2010;
Beer, Bjork and Beardall, 2014c)

Fotobiorreactores
Los fotobiorreactores son sistemas que intensifican y mantienen un ambiente biológicamente
activo para el cultivo de microalgas. Existen dos diseños básicos de fotobiorreactor, sistemas
abiertos y cerrados. En tabla 2.2 se describen las generalidades, las ventajas y desventajas de
ambos sistemas. No existe el mejor fotobiorreactor que permita alcanzar la máxima
productividad con costos de operación mínimos ya que el fotobiorreactor más adecuado
dependerá de los requerimientos de la especie a cultivar, el entorno y el objetivo del cultivo.
Sin embargo, hay características generales para llegar a sistemas rentables; mezclado
adecuado, alta capacidad de transferencia de gases, alta relación superficie
iluminada/volumen y control de temperatura (Zittelli et al., 2003; Brennan and Owende,
2010).
Por otro lado, las técnicas de cultivo de microalgas, especialmente los fotobiorreactores
abiertos han existido por más de 30 años, los cuales son los más comunes, aunque en los
últimos años ha avanzado el desarrollo de los sistemas cerrados e híbridos, pues las ventajas
de control del entorno del cultivo, nuevos diseños que permiten la permeabilidad del carbono
y oxígeno, como la reducción de floculación convierten los sistemas cerrados y hibridos en
opciones más atractivas para el cultivo de microalgas a nivel industrial. A pesar de que hay
un interés en el cultivo de microalgas es necesario el aumento potencial de la producción de
biomasa para satisfacer las necesidades de su uso comercial (Zittelli et al., 2003; Posten,
2009).
En el caso del Instituto de Ingeniería en la UNAM, las microalgas son aplicadas en la
desulfuración y enriquecimiento de biogás y cultivadas en un fotobiorreactor abierto; lo que
ha llevado al estudio de su comportamiento bajo la influencia de la intemperie además de la
identificación de las especies que conforman el consorcio microrganismos fotosintéticosendógeno de la ciudad de México (Franco-Morgado et al., 2017; Granada-Moreno et al.,
2017; Franco-Morgado, 2018).

Tabla 2.3 Tipos de fotobiorreactores
Generalidades Ventajas Desventajas
F
o
to
b
io
rr
ea
ct
o
r
ab
ie
rt
o

Usualmente son estanques
naturales o artificiales,
estanques canalizados.
Interaccionan con el entorno
y pueden tener o no un
sistema de mezclado
Bajos costos de
construcción y operación.
Son útiles para
microorganismos
extremófilos
No recomendado para
monocultivos, fácil
contaminación con otros
microorganismos. La
evaporación y los cambios en el
clima pueden afectar la
productividad de la biomasa
F
o
to
b
io
rr
ea
ct
o
r
ce
rr
ad
o
Sistemas que protegen el
cultivo con un material
transparente e impermeable.
Pueden clasificarse por el
diseño o modo de operación,
las categorías principales
son: tubular vertical,
colector, hibrido, flotante y
reactores de biopelículas.
Limitación en el
intercambio de gases
entre el cultivo y el
entorno. Son útiles en el
cultivo de microalgas
destinada a producción de
compuestos finos. Pueden
producir biomasa de alta
calidad de forma regular.
Problemas con la
bioincrustación y acumulación
de oxígeno disuelto.
Dependiendo del objetivo del
cultivo los costos de operación
pueden aumentar
significativamente.
(Molina et al., 2001; Zittelli et al., 2003; Zeriouh et al., 2017)
El diseño de los fotobiorreactores ha progresado, obteniendo mayor producción de biomasa,
Acien et al. (2012) reporta una productividad de biomasa en tratamiento de aguas de 200
t/año con un costo de 274.82 MXN/kg. Por otro lado en la obtención de biocombustibles a
partir de microalgas se reportan productividades de 40 a 2000 mg/Ld (Pittman, Dean and
Osundeko, 2011), sin embargo, se debe de aumentar en varias órdenes de magnitud la
producción para lograr satisfacer las demandas comerciales (Posten, 2009).
Factores de estrés ambiental en el crecimiento microalgal
La respuesta a estímulos del entorno es una característica de cualquier organismo vivo, un
cambio en el entorno puede convertirse en un factor de estrés. El estrés se definirá como una
condición ambiental que produce un desequilibrio metabólico que requiere ajustes
bioquímicos y metabólicos antes de que se pueda establecer un nuevo estado de crecimiento
estable (Giuseppe and Vonshak, 2003). Lo cual afectará la productividad y calidad del cultivo
microalgal. A continuación, se habla de los factores más importantes para el cultivo de
microalgas.

Luz y temperatura
La luz determinará la intensidad con la que se realice la fotosíntesis, por lo tanto, modificará
la velocidad de crecimientos del cultivo, hasta alcanzar un punto de saturación de luz, donde
la tasa de crecimiento será máxima (Park, Craggs and Shilton, 2011). La intensidad y la
calidad de la luz que reciben las microalgas está determinada por la trayectoria de la luz, es
la distancia que un fotón debe de pasar a través de un fotobiorreactor (Richmond, 1996). La
profundidad del sistema, superficie del reactor, auto sombreado de las microalgas, la hora del
día, velocidad de mezclado, dilución del cultivo, localización geográfica y tipo de
fotobiorreactor influirán en la trayectoria de luz (Contreras et al., 2003; Posten, 2009).
El aumento de la intensidad de la luz visibles y UV encima del punto de saturación provocan
daños en los fotosistemas, inhibiendo la actividad de Rubisco y el proceso de reparación del
fotosistema II, en consecuencia, causado una fotoinhibición (Hu, 2003; Kumar et al., 2003;
Zittelli et al., 2003; Latifi, Ruiz and Zhang, 2009).
Igual que la intensidad de luz, la temperatura puede crear condiciones de fotoinhibición
inclusive cuando la intensidad de luz es óptima. Estos efectos son mejor observados en
sistemas abiertos donde la temperatura fluctúa de 15 a 35ºC durante día. La temperatura causa
inhibición en el crecimiento microalgal en magnitudes inferiores como superiores del rango
óptimo, este rango varía entre especies, pero se encuentran entre 25 a 40ºC (Giuseppe and
Vonshak, 2003).
pH
Los valores de pH están determinados por la actividad fotosintética, la respiración aerobia, y
composición del medio de cultivo. El pH determina la disponibilidad del carbono soluble en
el agua. También puede afectar la biodisponibilidad de otros nutrientes en el medio. Cada
especie necesita un rango determinado para el crecimiento óptimo. Usualmente para
microalgas dulces los valores rondan entre 8 a 12 (Contreras et al., 2003; Giuseppe and
Vonshak, 2003).

Oxígeno disuelto
En los momentos de intensa actividad fotosintética, la concentración de oxígeno disuelto
(OD) se eleva por encima del valor de saturación con aire, afectando la afinidad de Rubisco,
otro problema de concentraciones altas de OD, es que puede fungir como un aceptor de
electrones en el flujo sintético de electrones de los fotosistemas, produciendo un anión
superoxido, que a su vez generará especies reactivas de oxígeno (ROS) (Imlay, 2003). Las
ROS pueden causar daños oxidativos al fotosistema II y a la estructura celular. En
consecuencia, la formación de las ROS lleva a la inactivación de los fotosistemas por la
desnaturalización de proteínas asociadas e inhibición de la síntesis de la misma.
El biofilm formado por las microalgas, crean microambientes hiperoxigénicos, debido a la
permeabilidad de polisacáridos de la matriz extracelular y las altas tasas de producción de
oxígeno (Whitton and Potts, 2012). Generando niveles del 600% de saturación de oxígeno
que favorecen los efectos anteriores. Es muy común utilizar la remoción de oxígeno por
desorción en el ambiente como solución a las altas concentraciones de oxígeno, aunque se
puede utilizar otras estrategias (Giuseppe and Vonshak, 2003; El Moustaid et al., 2017).
Usos y aplicaciones del cultivo de microalgas
La primera aplicación de las microalgas por el hombre data de 2000 años en china, las
colonias de microalgas Nostoc fueron utilizadas como alimento en épocas de hambruna. Sin
embargo, varias culturas también han utilizado las microalgas como alimento, es el caso de
las galletas llamadas “Tecuitlatl” en México o del “Dihé” en Kanembu, pero no fue hasta el
siglo XX que las microalgas fueron redescubiertas (B. Habib, 2008). En la actualidad las
aplicaciones de las microalgas se han diversificado, desde su uso tradicional como fuente de
alimentos hasta el potencial uso de las microalgas como fuentes de proteínas recombinantes
o como potencial solución a las altas concentraciones de CO2 atmosférico, producto de la
actividad humana. En la tabla 2.4 se muestra una general revisión de los usos de las
microalgas.

Tabla 2.4 Aplicaciones de las microalgas
Aplicación Descripción Ventajas Desventajas
A
li
m
en
ta
ci
ó
n

Es una comida rica en proteínas,
ácidos grasos, vitaminas y
carbohidratos. Al mejorar el
contenido nutricional de los
alimentos, afectan de manera
positiva la salud de animales y
humanos.
Incrementan la supervivencia,
desarrollo y crecimiento de
animales y humanos.
No es recomendable la
utilización de las
microalgas como dieta
única, sino como
complemento de la misma.
B
io
co
m
b
u
st
ib
le
s
El cultivo de microalgas
oleaginosas es utilizado como
alternativa al almacenar la energía
química como triacilgliceridos y
lípidos, produciendo varios
biocombustibles como: bioetanol,
biodiesel y biometano.
Soluciona la problemática que
rodea el uso de
biocombustibles al no ocupar
tierras de cultivo y espacio
destinados a satisfacer las
demandas alimenticias.
Sumando que se puede ocupar
agua no apta para el consumo
humano y requieren pocos
cuidados.
No existen productoras
comerciales masivas de
biodiesel de microalgas,
los cultivos con alto
contenidode lípidos
proporcionan una menor
energía que los
combustibles fósiles.
B
io
re
m
ed
ac
ió
n

Se ocupan principalmente como
indicadores de eutrofización,
modelos biológicos en pruebas de
ecotoxicidad. También son
utilizados en la eliminación de
nitrógeno, fósforo, metales
pesados, patógenos de aguas
residuales y limpieza de fases
gaseosas como CO2 y H2S, para el
enriquecimiento del biogás.
Son alternativas más
amigables con el ambiente y
económicas que las
alternativas convencionales.
Posible producción de
intermediarios
indeseables, poco control
en el tiempo y velocidad
del proceso. Compuestos
resistentes a
biorremediación
(pesticidas, compuestos
farmacéuticos).
C
o
m
p
u
es
to
s
fi
n
o
s
Se puede obtener productos de alto
valor como: proteínas, vitaminas,
ficobiliproteinas, pigmentos,
productos bioquímicos de isotopos
estables, entre otros.
La velocidad de duplicación es
muy alta (8 horas
aproximadamente,)
produciendo entre 15 y 300
veces más biomasa que plantas
superiores.
Altos costos asociados con
los sistemas y procesos de
producción actuales.
(Barclay and Apt, 2003; Becker, 2003; Olaizola, 2003; B. Habib, 2008; Ahmad et al., 2011;
Park, Craggs and Shilton, 2011; Hernández-Pérez and Labbé, 2014; Franco-Morgado, 2018)

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Debido a las aplicaciones que presentan las microalgas en diferentes sectores (agrícola,
tratamiento de residuos, tratamiento de biogás, producción de complementos alimenticios,
entre otros.), se ha incrementado la necesidad de promover su productividad. El incremento
en la producción de oxígeno disuelto debido a la naturaleza de la fotosíntesis, disminuye la
capacidad de producción de biomasa microalgal debido a la presencia de la fotorrespiración.
Altas concentraciones de oxígeno disuelto promueven un gasto de energía a nivel celular
considerable, afectando el metabolismo, la fisiología y la productividad del cultivo.
JUSTIFICACIÓN
Se han propuesto y desarrollado numerosas aplicaciones de las microalgas en diversos
campos, pues su simplicidad biológica, necesidades poco exigentes, su mayor eficiencia de
producir materia orgánica a partir del sol y material inorgánico a comparación de plantas
terrestres, su capacidad de cambiar fácilmente su composición bioquímica y la gran
acumulación de compuestos de interés comercial, tales como proteínas, lípidos, almidón,
glicerol, pigmentos, biopolímeros, productos recombinantes. Han convertido a estos
organismos en potenciales respuestas a problemas que nos aquejan actualmente.
Hoy en día el uso de cultivos microalgales en áreas de acuicultura, tratamiento de agua,
agricultura y farmacéutica se encuentra en plena explotación. Sin embargo otras aplicaciones
como fuente de biocombustible, biorremediación a gran escala o fijadores de CO2 producido
por las actividades humanas siguen en fases de investigación o con la necesidad de inversión
para su avance. Para hacer más accesible y atractiva dichas tecnologías se debe de reducir los
costes de las mismas. Es el caso de este trabajo, busca reducir costes del cultivo microalgal,
mejorando la productividad de generación de biomasa en fotobiorreactores abiertos de
pequeña escala, enfocándose en las reducciones de crecimiento por la fotorrespiración, vía
metabólica presente en todos los seres fotoautótrofos oxigénicos, y la cual ha sido de interés
para diversas organizaciones y científicos a lo largo de los años.

HIPÓTESIS
Las altas concentraciones de oxígeno disuelto producido por cultivos heterogéneos
microalgales aumentan la fotorrespiración, causando disminución en el crecimiento y
cambios en la interacción entre las especies que conforman el consorcio.
OBJETIVO GENERAL
Evaluar el crecimiento de un consorcio microalgal en fotobiorreactores abiertos y cerrados
en altas concentraciones de oxígeno disuelto para caracterizar los efectos de la
fotorrespiración.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Evaluar el efecto de la fotorrespiración sobre el crecimiento celular, productividad,
fijación de carbono y asimilación de nitrógeno de un consorcio alcalófilo microalgal.
 Proponer una estrategia de control del oxígeno disuelto en un fotobiorreactor abierto
para reducir el efecto de la fotorrespiración en el crecimiento del consorcio.

MATERIALES Y MÉTODOS
Microrganismos
Los inóculos fueron recolectados del Fotobiorreactor HRAP (High Rate Algal Pond) operado
a la intemperie durante diciembre 2018 a marzo 2019 en la Ciudad de México. El cual
contenía un consorcio fotoautótrofo compuesto por microalgas eucariontes y procariontes.
Su origen es el ex lago alcalino de Texcoco, Ciudad de México, a 19° 30 41.1″ N, latitud;
N98° 59′ 31.6″W. De acuerdo a Granada-Moreno et al.( 2017).
Sistemas experimentales
Se ocuparon 3 fotobiorreactores para el cultivo como se muestra en la figura 8.1
1) Fotobiorreactor cerrado (FBC) de 1 L, modificado con 3 entradas; dos entradas para
electrodos de medición, un puerto de muestreo.
2) Fotobiorreactor abierto (FBA) de 1 L, utilizado como control para el FBC.
3) Fotobiorreactor High Rate Algal Pond (HRAP) de 25 L. Expuesto a condiciones de
intemperie de la ciudad de México.

Figura 8.1 Sistemas experimentales. A) fotobiorreactor HRAP.B) fotobiorreactor de
1L modificado 1) entrada de sonda pH 2) entrada de sonda OD 3) puerto de muestreo.
C) fotobiorreactor de un 1L.

Condiciones de cultivo
En los experimentos realizados en los FBC Y FBA, se utilizó medio mineral de carbono
“empobrecido”, el cual tenía una concentración de carbono inorgánico de 1.3 g/L, aportada
por 0.3 g de Na2CO3 y 1 g de NaHCO3 (Tabla 8.1). Con el objetivo de promover la
fotorrespiración, sin llegar a valores inferiores de Ks (constante de Monod) de 17.52 mg C/L
de acuerdo a Watson and Drapcho, (2016) para microalgas alcalófilas de agua. Los
compuestos Na2CO3 y NaHCO3 generan un buffer de carbonatos que amortigua el pH en 9.6
(Grobbelaar, 2003). En la tabla 8.1, se muestra la composición del medio mineral de carbono
empobrecido.
FBC Y FBA se cultivaron con luz continua a 150 µmol/m2s, un pH inicial de 9.4 y con
agitación mecánica de 120 rpm. No se controló temperatura durante la experimentación sólo
en el sistema el FBA se permitió una libre transferencia de gases con la atmósfera, evitando
así la acumulación de oxígeno disuelto.
Tabla 8.1 Composición de los medios mineral modificado Zarrouk y del medio mineral de
carbono empobrecido
Reactivo Medio mineral modificado
Zarrouk (g/L)
Medio mineral “empobrecido”
en carbono (g/L)
Na2CO3 4.03 0.3
NaHCO3 13.61 1
NaCl 1 1
K2HPO4 1 1
K2SO4 1 1
CaCl*H2O 0.04 0.04
Soluciones
KNO3 101g/L 25 mL 25 mL
MgCl2*6 H2O 200g/L 1 mL 1 mL
Elementos traza 2 mL 2 mL
(de los Cobos-Vasconcelos et al., 2016)

Tabla 8.2 Composición de la solución elementos traza
Reactivo Concentración (mg/L)
EDTA 5
FeSO4*7H2O 2
ZnSo4*7H2O 100
MnCl2*4H2O 30
CoCl2*6H2O 200
NiCl2*6H2O 20
Na2MoO4*2H2O 30
CuCl2*2H2O 10
H3BO3 300

Cultivo en el fotobiorreactor HRAP
El fotobiorreactor HRAP ha permanecido en operación continua desde el 2015. Diseñado y
construido con un tiempo residencia hidráulico de 9.5 d, las especificaciones son mostradas
en la tabla 8.3 (Franco-Morgado, 2018). Este HRAP se ha utilizado para determinar los
efectos físicos, químicos y biológicos, que se llevan a cabo en el tratamiento de biogás en
condiciones ambientales (Franco-Morgado, 2018; Toro-Huertas et al., 2019). Además, sirvió
para inocular los sistemas experimentales, al estar las microalgas en condiciones de
crecimiento constante y en estado fisiológico constante.
Desde el mes de junio del 2018 se aplicó como estrategia de eliminación de oxígeno disuelto
(OD) el aumento de la velocidad del aspa de agitación, de 15 a 20 cm/s. Justificadopor la
operación unitaria de transporte de materia, llamado desorción. La desorción es el cambio de
un gas disuelto a un gas inerte, siendo eliminado de la fase líquida. En el HRAP se capturaron
las siguientes variables experimentales: temperatura, pH, irradiancia y oxígeno disuelto (OD)
desde junio 2018 hasta marzo 2019.

Tabla 8.3 Características de construcción de fotobiorreactor HRAP
Largo 1.20 m
Ancho 0.12 m
Altura nominal 0.24 m
Superficie 0.28 m2
Volumen total 28.8 L
volumen de operación 25 L
Velocidad de agitación 15 cm s-1
(Franco-Morgado, 2018)
Cultivo en fotobiorreactor cerrado y fotobiorreactor abierto
Se tomó un inoculo de 800 mL del HRAP con una concentración de biomasa de 0.95 g/L la
cual se centrifugó dos veces a 2500g/25C/10min, se resuspendió en medio mineral
empobrecido. El segundo pellet formado se resuspendió inmediatamente en un volumen total
de 1.5L, con una concentración teórica de 176 mg C/L. El cultivo se mezcló por agitación
magnética a una velocidad de 120 rpm, hasta no ver flóculos suspendidos en el cultivo, con
una concentración de biomasa inicial de 0.5 g/L.
Del anterior cultivo preparado, se adicionaron 600 mL al FBC y al FBA. Sólo en el FBC, se
cerró a hermeticidad y se adquirieron los datos de pH y OD cada 90 segundos de manera
automática. Ambos son agitados en todo momento por agitación magnética a 120 rpm.
Fueron iluminados continuamente por tiras LED flexibles para interiores SMD 2835 FSL-
2835X600-N/W. Para evitar alguna incidencia de alguna otra fuerte luminosa, fueron
colocadas cámaras negras alrededor de los fotobiorreactores que rodea toda la estructura
como se muestra en le figura 8.2. Fueron tomados 4 mL de muestra a las 12:00 pm durante
9 días evitando disminuir hasta 10 % el volumen total del cultivo.

Figura 8.2 A) cámara negra. B) estructura de soporte para fotobiorreactores de
botellas de 1L.
Determinaciones analíticas e instrumentales
Determinación de pH, oxígeno disuelto y temperatura
Las determinaciones para el sistema HRAP se realizaron mediante la sonda de OD Applisens
Z10023525, Holanda, Thermo Scientific Orion 9107BNMD, USA, una sonda de temperatura
y los valores de irradiancia fueron determinados por un Sensor Quantum LI-190R, USA.
Posteriormente los datos fueron capturados cada 5 minutos con una tarjeta de adquisición de
datos (DAC) Labjack U3-LV®.
Por otra parte, en los sistemas FBC y FBA, las concentraciones de OD y el pH se midieron
utilizando una sonda OD Applisens Z010023525, Holanda, sonda de pH Van London
Phoenix Co. 715-772-0041, USA, una sonda de pH Oakton WD-35801-00, USA, Thermo
Scientific Orion 081010MD, USA. A diferencia del sistema HRAP los datos fueron
capturados cada 90 segundos con los programas Lucullus durante 216 horas.
Cinética de crecimiento
La determinación de la concentración de la biomasa se realizó por dos técnicas;
1) Sólidos suspendidos totales (SST), con alícuotas de 5 mL durante la experimentación en
los 3 sistemas experimentales ocupados. La metodología para la determinación de solidos
suspendidos totales (SST) esta descrita en el ver apéndice I (APHA/AWWA/WEF, 2012).

2) Conteo celular de microalgas eucariontes, con el objetivo de poder dar seguimiento al
crecimiento en los FBC y FBA correlacionando los SST con el conteo celular por curva de
calibración con alícuotas del HRAP, las diluciones usadas como los resultados de la curva de
calibración se muestran en el apéndice II. La técnica se llevó a cabo en un microscopio
invertido Primovert ZEISS con una cámara de Neubauer de un 0.1 mm de profundidad. Se
excluyeron a procariontes filamentosos (cianobacterias) siguiendo el protocolo de métodos
y herramientas analíticas en la evaluación de la biomasa microalgal (Arregondo and
Voltolina, 2017).
Determinación de tamaño celular de algas eucariontes por microscopía
Se realizaron observaciones y se tomaron fotografías con los objetivos 40X y 100x en el
microscopio invertido Primovert ZEISS y con una cámara microscópica AxioCam ICm 1
Rev.1 FireWire. Con ayuda de software ZEN lite de Zeiss se obtuvieron las áreas celulares,
excluyendo células con daño en la pared celular y en división celular como se muestra en la
figura 8.3.

Figura 8.3 Características de exclusión e inclusión para medición de tamaños
celulares A) célula aceptable para medición B) célula en división C) célula con daño en
la pared.

Con el fin de considerar una muestra estadísticamente significativa de las mediciones de área
celular medidas en el microscopio se utilizó la ecuación 8.1 la cual es utilizada para
poblaciones infinitas de variables cuantitativas (Malhotra, 2004b).
𝑛 =
𝑍2∗𝜎2
𝐸2
(Ec 8.1)
Donde:
n= Tamaño de la muestra
Z= Valor obtenido mediante niveles de confianza
E= Límite aceptable de error muestral
σ= Desviación estándar
Por otro lado se realizó una estimación de la biomasa aportada por las algas eucariontes a
partir del conteo celular y el volumen, mediante la siguiente ecuación (Lavoie, Mouget and
de la Noile, 1986).
𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎
𝑔
𝐿
= (
𝐶𝐶∗𝑉𝐶∗ρC

1000 𝐿
1 𝑚3
) ∗ 𝐹𝐵𝐶 (Ec 8.2)
Donde:
CC= Conteo celular/m3
VC= Volumen celular m3
ρC= Densidad celular 1075000-1080000 g/m3
FBC= Fracción de biomasa seca (0.3)

Cálculo de productividad de biomasa
Con los resultados obtenidos en la cinética de crecimiento por los 2 métodos utilizados (SST
y conteo celular) se calculó la productividad de la biomasa con la ecuación 8.2 (Godia
Casablancas and Lopez, 2005).
P =
X2−X1
t2−t1
(Ec 8.3)
Donde:
X2= Biomasa final (mg/L)
X1= Biomasa inicial (mg/L)
t2= Tiempo final (h)
t1= Tiempo inicial (h)
Velocidad específica de crecimiento
Con los resultados de en la cinética de crecimiento por los 2 métodos utilizados (SST y conteo
celular) se calculó la velocidad específica de crecimiento con la pendiente de la siguiente
función (Godia Casablancas and Lopez, 2005).
µ =
ln 𝑋
𝑋𝑜
(Ec 8.4)
Donde:
µ= Velocidad especifica de crecimiento (h-1)
X= Concentración de biomasa (mg/L)
Xo= Concentración biomasa inicial (mg/L)

Cálculo de tiempo de duplicación
Con los valores de la velocidad especifica de crecimiento para cada punto se calculó el
tiempo de duplicación (Td) con la ecuación 8.4 (Godia Casablancas and Lopez, 2005).
Td =
ln 2
µ
(Ec 8.5)
Donde:
µ= Velocidad especifica de crecimiento (h)
Análisis estadístico ANOVA para tamaños celulares
Antes del análisis ANOVA se realizaron dos pruebas. La prueba de Shapiro-Wilk para
conocer si los datos cumplían con una distribución normal, característica necesaria para dicha
prueba y el estadístico de Levene para conocer si los datos cumplen con la homogeneidad de
varianzas. Se realizan la prueba análisis de variancia (ANOVA) para los datos de los 9 días
de experimentación. Después de realizar el análisis ANOVA se realizaron las pruebas post
hoc Bonferroni y Games-Howell para determinar la homogeneidad de varianzas. Todas la
pruebas excepto por la ecuación de tamaño poblacional se hicieron en el programa IBM SPSS
Statistics (Malhotra, 2004a).
Determinación de compuestos solubles en el medio de cultivo
Se determinó la concentración del carbono inorgánico (IC) y nitrógeno total (NT) en
analizador de carbono y nitrógeno de muestras liquidas TOC-L