Evaluacion-de-la-induccion-de-moleculas-de-adhesion-en-celulas-A549-infectadas-por-el-virus-de-influenza-AH1N1-y-su-efecto-en-la-adherencia-de-conidios-de-Aspergillus-fumigatus

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
 
EVALUACIÓN DE LA INDUCCIÓN DE MOLÉCULAS DE ADHESIÓN EN CÉLULAS 
A549 INFECTADAS POR EL VIRUS DE INFLUENZA A(H1N1) Y SU EFECTO 
EN LA ADHERENCIA DE CONIDIOS DE ASPERGILLUS FUMIGATUS. 
 
 
 
T E S I S 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
 
 
 
QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO 
 
 
 
PRESENTA 
 
CARLOS ALBERTO VANEGAS TORRES 
 
 
 
 
 
 
 
Ciudad Universitaria, CDMX. Año 2018 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
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JURADO ASIGNADO: 
 
 
PRESIDENTE: ABEL GUTIÉRREZ RAMOS. 
VOCAL: ROCÍO GABRIELA TIRADO MENDOZA. 
SECRETARIO: FERNANDO HERNÁNDEZ SÁNCHEZ. 
1er. SUPLENTE: VERÓNICA GARROCHO VILLEGAS. 
2° SUPLENTE: FRANCISCO JAVIER DÍAZ GARCÍA. 
 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
 
INSTITUTO NACIONAL DE ENFERMEDADES RESPIRATORIAS “ISMAEL COSÍO 
VILLEGAS”. 
DEPARTAMENTO DE INVESTIGACIÓN EN VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA. 
 
 
 
ASESOR DEL TEMA: 
M. en C. Fernando Hernández Sánchez. 
 
 
 
SUSTENTANTE 
Carlos Alberto Vanegas Torres. 
 
 
 
 
 
 
3	
	
Índice. 
 
I. Introducción. 
I.1 - Planteamiento del Problema. 5 
I.2 - Objetivo General. 8 
I.3 - Objetivos Particulares. 8 
I.4 – Hipótesis. 9 
 
II. Marco Teórico. 
II.1 - Influenzavirus A. 10 
II.2 - Variantes y Cepas de Influenzavirus A. 13 
II.3 - Influenzavirus A(H1N1)pdm09. 17 
II.4 – Infecciones secundarias a la Influenza. 19 
II.5 - Aspergillus fumigatus: Diseminación y 
Germinación. 22 
II.6 - Establecimiento de la Aspergilosis y 
Respuesta Inmune. 24 
II.7 - Interacciones conidio-epitelio. 27 
 
III. Procedimiento Experimental. 
III.1 - Material biológico y cultivo celular. 32 
III.2 - Propagación de la cepa viral. 34 
III.3 - Titulación viral por Hemaglutinación en placa. 34 
III.4 - Validación de infectividad viral. 36 
III.5 - Efecto del virus en la adhesión conidial el modelo 
 de epitelio. 37 
III.6 - Preparación de suspensión conidial y conteo en 
 cámara de Neubauer. 39 
III.7 - Evaluación de inducción en la expresión de 
 moléculas de adhesión. 41 
III.8 - Cuantificación de proteínas por Método de Bradford. 42 
III.9 - SDS-PAGE y Western Blot. 43 
III.10 - Análisis Estadístico. 47 
 
IV. Resultados y Discusión. 
IV.1 – Producción viral en células MDCK. 48 
IV.2 – Infectividad de las células A549. 53 
IV.3 – Ensayos de adhesión conidial. 57 
4	
	
IV.4 – Aumento en la adhesión conidial por Influenza. 59 
IV.5 – Cambio en los niveles de adhesinas epiteliales 
 por Influenza. 61 
IV.6 – Cambio a nivel transcripcional de adhesinas 
 epiteliales por Influenza. 67 
IV.7 – Cambio en la adherencia conidial por la inhibición 
 de la señalización por TGF-b. 68 
 
V. Conclusiones. 71 
 
VI. Referencias y Bibliografía. 72 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
5	
	
I. Introducción. 
 
I.1 - Planteamiento del Problema. 
La Influenza es una enfermedad viral del tracto respiratorio causada 
por miembros del género Influenzavirus, la mayoría de los casos en 
México se asocian a las variantes A(H1N1) y A(H3N2) de 
Influenzavirus A. El impacto en salud pública de esta enfermedad a 
nivel mundial es significativamente alto, dado que afecta 
periódicamente a todos los países del mundo, particularmente 
durante la época invernal. Asimismo, tras múltiples eventos 
pandémicos de esta virosis, los sistemas de salud globales han 
orientado sus esfuerzos a prevenir brotes de Influenzavirus, así como 
a combatir y mitigar sus efectos mediante el tratamiento y la 
contención de los pacientes afectados. Sin embargo, y a pesar de la 
gran cantidad de recursos destinados a la prevención de este 
padecimiento, la Influenza cobra cada vez más relevancia conforme la 
población mundial rápidamente aumenta y las condiciones que 
favorecen la transmisión viral se tornan más habituales en los 
grandes centros urbanos. 
 
Existen infecciones secundarias causadas comúnmente por agentes 
bacterianos como Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, 
Streptococcus pyogenes y Haemophilus influenzae, las cuales pueden 
agravar significativamente un cuadro subyacente de Influenza; una 
6	
	
infección secundaria puede aumentar la mortalidad de dicha virosis 
de forma significativa si no es atendida correctamente 1. Asimismo, 
algunos microorganismos eucariontes también han sido descritos en 
este contexto, siendo Aspergillus fumigatus el patógeno fúngico más 
frecuentemente detectado en pacientes previamente infectados con 
Influenzavirus 2. Debido a lo anterior, así como a la carga económica 
y logística que representan las hospitalizaciones por infecciones 
secundarias a la Influenza, es relevante el estudio del papel que A. 
fumigatus juega en el contexto de esta infección viral. 
 
Como otros hongos filamentosos, A. fumigatus produce conidios para 
facilitar su propagación, y éstos pueden dar origen a un proceso 
infeccioso en un huésped susceptible, resultado de múltiples factores 
de patogenicidad. La Aspergilosis puede presentarse de distintas 
formas como el Aspergiloma, la Aspergilosis Broncopulmonar 
Alérgica, y más relevantemente la Aspergilosis Pulmonar Invasiva. 
Todas estas manifestaciones requieren del establecimiento primario 
del hongo en el tracto respiratorio inferior, lo cual resalta la 
importancia de los conidios en la transmisibilidad y agravamiento de 
la enfermedad, dado que solamente a través de estas estructuras 
puede un tejido tan poco accesible como lo es el alveolo ser invadido 
por un hongo. Está demostrado que hospederos humanos que cursan 
por una infección aguda de Influenza pueden presentar una mayor 
susceptibilidad a la complicación de esta enfermedad por patógenos 
7	
	
oportunistas, particularmente si se encuentran inmunocomprometidos 
2. Asimismo, nuestros datos epidemiológicos indican un aumento en 
el número de solicitudes recibidas para el análisis serológico de 
posibles micosis invasivas durante el período correspondiente a la 
pandemia de Influenza de 2009. El agente etiológico más 
frecuentemente detectado fue A. fumigatus. Sin embargo, hasta la 
fecha no se ha explorado la posibilidad de que el virus de la Influenza 
facilite el fenómeno de coinfección con A. fumigatus. 
 
De acuerdo con lo reportado, la línea celular A549 de epitelio alveolar 
se eligió como modelo in vitro de infección viral dada su permisividad 
a la infección por Influenza debido a la presencia de glicoproteínas de 
superficie con arreglos de glicosilación Gal2-α2,3-SA1, los cuales son 
blanco, o receptor, de la Hemaglutinina viral 3,4. Asimismo, dichas 
células presentan en su superficie distintas proteínas como Integrina 
α5, Integrina β1, cuyos niveles pueden ser regulados mediante la 
acción de la citocina antiinflamatoria TGF-β 5 . La unión de dichas 
adhesinas con algunos componentes de la pared conidial como CalA y 
otras glicoproteínas ya ha sido probada 6,7, lo cual lleva a pensar en 
la posibilidad de que las interacciones a este nivel puedan verse 
afectadas por la presencia y acción del virus. Así, este estudio tienecomo finalidad el buscar un nexo mecanístico en la coinfección del 
tejido respiratorio por Influenzavirus A y A. fumigatus a partir del 
análisis de cambios en los niveles de proteínas de adhesión que 
8	
	
intervienen en la interacción física entre los conidios del hongo y las 
células del epitelio alveolar. 
 
I.2 - Objetivo General. 
Determinar en un modelo in vitro de infección de células A549 si el 
virus de Influenza A (H1N1) promueve el aumento en la unión de los 
conidios de A. fumigatus a través del incremento en las moléculas de 
adhesión Integrina α5β1 y E-cadherina. 
 
I.3 - Objetivos Particulares. 
- Evidenciar la permisividad de los modelos celulares a utilizar 
infectando microcultivos de éstos con diferentes valores de 
Multiplicidad de Infección y posteriormente realizar ensayos de 
Inmunocitoquímica para revelar la presencia de proteínas 
virales. 
 
- Establecer un procedimiento experimental para evaluar 
cuantitativamente la adherencia de los conidios de A. fumigatus 
en monocapas de células A549, con base en los modelos 
reportados en la literatura. 
 
- Determinar si la infección por el virus de Influenza modifica la 
adhesión relativa de conidios de A. fumigatus al modelo de 
epitelio alveolar mediante ensayos cuantitativos de adhesión. 
9	
	
- Evaluar si la infección por Influenzavirus A en células epiteliales 
A549 induce un cambio en los niveles de las moléculas de 
adhesión Integrina α5, Integrina β1 y E-Cadherina empleando 
la técnica de Western Blot. Adicionalmente, explorar si los 
posibles cambios se correlacionan con una modificación en los 
niveles de mRNA de los genes ITGA5 e ITGB1. 
 
- Probar el efecto que el bloqueo de la señalización por TGF- β 
ejerce en la adherencia conidial de Aspergillus fumigatus al 
epitelio alveolar mediante el uso de un inhibidor de SMADs. 
 
I.4 - Hipótesis. 
La infección de cultivos de células A549 con Influenzavirus A(H1N1) 
promoueve la adhesión relativa de los conidios de A. fumigatus a la 
superficie de este modelo celular, lo cual podrá explicarse mediante 
un aumento en los niveles de las moléculas de adhesión Integrina α5, 
Integrina β1 y E-Cadherina. Asimismo, el uso de un inhibidor de 
SMADs contrarrestará este efecto. 
 
 
 
 
 
10	
	
II. Marco Teórico. 
 
II.1 - Influenzavirus A. 
Los virus de la influenza son un grupo de patógenos respiratorios de 
gran importancia en salud pública a nivel mundial. Presentan una 
evolución antigénica rápida que se debe a la labilidad fisicoquímica de 
su genoma, así como al hecho de que éste se encuentra segmentado, 
lo cual permite la generación de nuevas cepas a partir de la co-
infección por viriones de cepas distintas, un fenómeno denominado 
“rearreglo”. Asimismo, la presión selectiva ejercida sobre los alelos de 
genes como HA, NA o NS1 de algunas cepas está muchas veces 
regulada por el tipo de huésped y tejido diana, así como por los 
mecanismos antivirales del hospedero y el uso adicional de agentes 
antivirales. Lo anterior causa que la evolución viral dependa de la 
compleja interacción entre el agente infeccioso, el medio y el 
huésped; un salto de especie o la acumulación crítica de mutaciones 
puntuales puede poner en ventaja selectiva a algunas cepas 
subrepresentadas en la población viral de origen, potencialmente 
originando eventos de infección a gran escala 3,8. 
 
Específicamente, el género Influenzavirus (Nomenclatura del Comité 
Internacional para la Taxonomía Viral - ICTV) pertenece a la familia 
Orthomyxoviridae y cuenta con un genoma de ssRNA(-) dividido en 8 
segmentos, cada uno codificando uno o más genes con funciones 
11	
	
diversas en el ciclo de replicación viral. Dicho genoma se encuentra 
asociado tanto a la RNA polimerasa viral como a múltiples copias de 
la nucleoproteína (NP); el conjunto de estos componentes se conoce 
como Ribonucleoproteína (RNP). Dichos aglomerados moleculares se 
encuentran organizados en una estructura cristaloide llamada 
nucleocápside, recubierta por una capa de proteína matricial (M1). 
Por encima de esta estructura se encuentra una envoltura lipídica 
provista de ionóforos (conformados por heterotetrámeros de la 
proteína M2) importantes en el proceso de desensamblaje viral. De la 
envoltura protruyen dos proteínas importantes: la Hemaglutinina 
(HA), que permite la unión del virión a los residuos de ácido siálico en 
la superficie de la célula, y la Neuraminidasa (NA), que medía la 
ruptura de esos carbohidratos durante la maduración y salida de las 
nuevas partículas virales 9. 
 
Referencia: Clancy, S. (2008) Genetics of the influenza 
virus. Nature Education 1(1):83 
Esquema 1. Estructura molecular 
de los viriones de Influenzavirus 
A. El significado correspondiente a 
cada acrónimo es el siguiente: 
 
M2 = Proteína Matricial 2; M1 = 
Proteína Matricial 1; NA = 
Neuraminidasa; HA = 
Hemaglutinina; NP = Nucleoproteína. 
PB2 = Segmento 1, gen PB2 
(subunidad de la polimerasa viral); 
PB1 = Segmento 2, gen PB1 
(subunidad de la polimerasa viral); 
PA = Segmento 3, gen PA 
(subunidad de la polimerasa viral) y 
proteína PA-X; HA = Segmento 4, 
gen HA; NP = Segmento 5, gen NP; 
NA = Segmento 6, gen NA; M = 
Segmento 7, genes M1 y M2; NS = 
Segmento 8, genes NS1 y NEP 
(proteínas no estructurales 
12	
	
El ciclo replicativo de Influenzavirus A comienza con la unión entre el 
virión y la célula del epitelio respiratorio, la cual le endocita mediante 
la interacción entre los trímeros de Hemaglutinina y glicolípidos 
membranales o glicoproteínas receptoras. Posteriormente, la célula 
acidifica el fagolisosoma, lo cual afecta la integridad fisicoquímica del 
virión. Primeramente, el pH ácido provoca el flujo de iones H3O+ a 
través de M2, causando el desensamblaje de la nucleocápside y la 
liberación de Ribonucleoproteínas (RNP) 10. Asimismo, la acidificación 
induce un cambio en la estructura terciaria de HA, lo cual causa la 
exposición de un dominio transmembranal que permite la fusión de la 
envoltura viral con la membrana del fagolisosoma, posibilitando la 
salida de RNPs al citosol. Dichas RNPs son transportadas al núcleo, 
donde se disocian y liberan sus componentes 11. 
 
Una vez en el núcleo, la RNA polimerasa viral degrada los mRNA de la 
célula huésped, y en un proceso llamado “cap snatching” reutiliza el 
7-metilguanilato como parte del RNA cebador en la transcripción del 
genoma viral a ssRNA(+), permitiendo así su traducción inmediata 12. 
Los primeros genes en ser traducidos corresponden a las proteínas 
HA, NA y M2. Éstas son sintetizadas y transportadas al retículo 
endoplásmico para ser plegadas y glicosiladas. Subsecuentemente, 
migran en vesículas al aparato de Golgi, donde son protegidas de una 
activación ácida temprana por la actividad ionófora de M2. Finalmente 
son llevadas a la membrana celular, donde permanecen hasta el 
13	
	
momento de la gemación de los nuevos viriones. Simultáneamente, 
el resto del genoma viral es transcrito, traducido, y replicado, lo cual 
culmina con la formación de nuevas RNP. 
 
Dichos complejos de RNA y proteína interactúan con los dominios 
intracelulares de HA y NA, formando parches membranales ricos en 
proteínas virales. Así, las RNP se agregan en un cristaloide, el cual es 
translocado al exterior celular como una nueva partícula viral 
envuelta, disociándose de la superficie celular gracias a la actividad 
de la NA 13. El paso final en la maduración del virus es la hidrólisis de 
un dominio expuesto en la HA, causada por enzimas proteolíticas 
presentes de forma variable en el tracto respiratorio. La distribución 
de estas proteasas no sólo varía entre tejidos, sino también a través 
de las especies en un ecosistema, y el paso de una cepa viral por un 
vector aviar o mamífero puede afectar su infectividad dadas las 
características funcionales del producto resultante del corte. Así, la 
presencia o ausencia de algunossitios de corte en la estructura 
primaria de la HA puede ser determinante en la maduración viral, e 
influir de tal manera en su patogenicidad 14. 
 
II.2 - Variantes y cepas de Influenzavirus A. 
Existen múltiples variantes dentro del género Influenzavirus A, las 
cuales son nombradas en función de las determinantes antigénicas 
HA y NA que presentan. Hasta este momento se conocen 18 subtipos 
14	
	
de HA y 11 subtipos de NA; algunas son más comunes que otras y 
pueden encontrarse en más de una variante. Además, existen 
múltiples cepas dentro de cada variante, cuya nomenclatura está 
determinada por el año y lugar de aislamiento así como por el 
huésped del cual se obtuvo dicho linaje viral 3,22. 
 
Un ejemplo que ilustra la relación que guarda la variabilidad de las 
cepas del virus de Influenza con su potencial infectivo lo tenemos en 
un estudio realizado por Goeijenbier M y colaboradores, en el que se 
infectaron hurones con distintas cepas de Influenzavirus A. La 
evidencia experimental indica que la localización anatómica de la 
cepa de influenza estacional A/Netherlands/177/2008/(H3N2) se 
circunscribió al tracto respiratorio superior y causó signos clínicos de 
baja intensidad, mientras que el linaje viral de influenza pandémica 
A/Netherlands/602/2009/(H1N1) causó signos clínicos de mediana 
severidad, encontrándose ubicuamente distribuido a lo largo del 
tracto respiratorio. Asimismo, la cepa A/Indonesia/5/2005/(H5N1) de 
influenza aviar altamente patogénica fue predominantemente 
encontrada en alveolos, y la infección causó signos clínicos altamente 
severos como disnea e hipoxia, además de la muerte de tres 
animales. Lo anterior sugiere que dichas propiedades antigénicas 
afectan no solamente la identidad del virus sino también el tropismo 
tisular que cada cepa presenta en el hospedero 15. 
15	
	
Este fenómeno se ha asociado al hecho de que las glicoproteínas 
receptoras del epitelio respiratorio presentan tanto N-glicanos como 
O-glicanos, los cuales requieren de un arreglo de glicosilación 
terminal específico SA1-Gal2-GlcNAc3 en su estructura para que la 
endocitosis de las partículas virales pueda acaecer. La presencia o 
ausencia de estos azúcares en la superficie celular determina la 
posibilidad de infección, es decir, la susceptibilidad o permisividad 
que las líneas celulares, tejidos, u organismos presentan para con el 
virus. Además, la galactosa intermedia de dicho arreglo puede estar 
anclada al ácido siálico terminal mediante ya sea un enlace glicosídico 
α2,3-SA1 o α2,6-SA1, presentándose más comúnmente este primero 
en el tracto respiratorio inferior, mientras que el segundo se 
encuentra preferentemente en el tracto respiratorio superior. 
Finalmente, la presencia de glicolípidos en la cara externa de la 
membrana celular puede promover un aumento en la unión virión-
epitelio, facilitando así la infección del tejido en cuestión por cepas 
virales afines a tales glicósidos 9. 
 
Así, Influenzavirus A puede encontrarse en una gran variedad de 
huéspedes, entre ellos el humano, suinos, equinos, mamíferos 
marinos, y aves de corral. No obstante, algunos estudios filogenéticos 
indican que todos los virus de Influenza, incluyendo aquellos que 
afectan a otras especies, tienen su origen en cepas originalmente 
aviares 16. Las aves playeras y acuáticas (órdenes Charadriiformes y 
16	
	
Anseriformes) son reconocidas como los principales reservorios de 
Influenzavirus A dada su permisividad a la infección, replicación y 
maduración viral sin que dichos hospederos presenten signos clínicos. 
 
Los virus logran dar un salto entre especies cuando los individuos 
infectados entran en contacto con otras especies presentando 
receptores estereoquímicamente compatibles con las determinantes 
antigénicas virales, dispersando los viriones a través de poblaciones 
previamente no afectadas. Este fenómeno se ha presentado ya en 
mercados de animales vivos en Asia y África, así como en complejos 
agropecuarios de todo el mundo 17. 
 
La separación biogeográfica entre los grupos poblacionales de dichas 
aves acuáticas a lo largo del planeta ha moldeado el acervo genético 
de Influenzavirus A en dos linajes evolutivamente independientes, los 
cuales corresponden a las poblaciones norteamericana y eurasiática. 
Dichas poblaciones virales presentan patrones evolutivos divergentes 
en función de las diferentes características bióticas y abióticas de sus 
respectivos entornos, y su evolución se ha visto afectada por el flujo 
genético entre sí, mediado por los movimientos migratorios de las 
aves acarreadoras. De tal suerte, el contacto entre individuos 
provenientes de regiones geográficas distintas puede promover el 
rearreglo entre cepas endémicas y foráneas, dando origen a nuevos 
virus con características de patogenicidad desconocidas, y 
17	
	
potencialmente también a eventos epidémicos con un impacto 
socioeconómicamente significativo, tales como las pandemias de 
Influenza de 1957 y 1968 18. 
 
II.3 - Influenzavirus A(H1N1)pdm09. 
En junio del 2009, la Organización Mundial de la Salud emitió una 
alerta pandémica concerniente a la diseminación de una nueva 
variante de Influenzavirus A en México y Estados Unidos. Nombrada 
A(H1N1)pdm09, ésta surgió a partir de un evento cuádruple de 
rearreglo genómico entre dos poblaciones norteamericanas de 
Influenza A(H3N2) de origen porcino, una población preexistente de 
Influenza A(H1N1) circulando en humanos, y otra población 
eurasiática de Influenza A(H1N1) aviar. Tal suceso marcó el inicio de 
la primera pandemia del siglo XXI, comenzando el 12 de abril de 
2009 con un brote de este virus en el estado de Veracruz, infectando 
primordialmente a niños, jóvenes, y algunos pacientes con 
padecimientos cardiorrespiratorios subyacentes. Dos días después, el 
virus fue aislado por el Centro de Control de Enfermedades (CDC) del 
gobierno norteamericano, sirviendo desde entonces como un modelo 
para el estudio de la Influenza A 19. 
 
Este virus se dispersó rápidamente al resto del mundo, culminando 
dicho evento pandémico el 31 de agosto de 2010 con 651,449 casos 
confirmados de Influenza en 153 países, 75.4% de los cuales fueron 
18	
	
atribuibles a esta nueva cepa. Las manifestaciones clínicas de esta 
enfermedad no fueron excepcionales, correspondiendo principalmente 
a fiebre, tos, cefalea, artralgia, mialgia y rinorrea, signos 
comúnmente encontrados en pacientes de Influenza estacional. Si 
bien la OMS reportó 18,631 muertes confirmadas por este 
padecimiento, estudios más recientes indican que la mortalidad pudo 
haber alcanzado los 203,000 decesos a nivel mundial, afectando 
principalmente a individuos con una edad menor a los 65 años e 
incluyendo áreas con un bajo nivel de retroalimentación 
epidemiológica. Asimismo, la media de edad en pacientes afectados 
por la Influenza pandémica fue de 18.1 años, lo cual resulta 
excepcional en comparación con las cepas estacionales de este virus, 
normalmente circunscritas a los grupos etarios en los extremos de la 
vida. Así, la pandemia de Influenza de 2009 representa un 
parteaguas en el estudio y entendimiento de esta virosis, tras lo cual 
se ha promovido el interés por la investigación de sus distintas 
manifestaciones en México y el mundo 20. 
 
No obstante, la circulación del virus de la Influenza no 
necesariamente conlleva eventos pandémicos, siendo también 
relevante en salud pública su participación periódica durante la época 
invernal en regiones con climas templados, tal y como es el caso de 
México. Las condiciones medioambientales durante esta temporada 
pueden propiciar la transmisión de las partículas virales mediante 
19	
	
aerosoles, dado que éstas presentan una mayor estabilidad a bajas 
temperaturas y niveles de humedad relativa, según los resultados de 
un estudio en cobayos por Palese P. y colaboradores 21. 
 
De tal suertepueden algunas variantes antigénicas de Influenzavirus 
A cobrar importancia en el período comprendido entre noviembre y 
abril. Conocida como Influenza estacional, ésta es una infección 
respiratoria aguda con signos poco concluyentes, tales como fiebre, 
tos, faringitis, cefalalgia y rinorrea, aunque algunos otros signos 
como mialgia, fatiga y artralgia pueden ser menos comunes, así como 
vómito y diarrea en pacientes pediátricos. Esta virosis es por sí 
misma una carga en salud pública, aunada a la frecuencia con la cual 
este padecimiento evoluciona a pneumonía, requiriendo atención 
especializada e incluso internamiento hospitalario 22. 
 
II.4 - Infecciones secundarias a la Influenza. 
Estudios previos señalan que una infección subyacente por 
Influenzavirus A puede agravarse debido a infecciones secundarias 
asociadas a otros microorganismos, más frecuentemente en 
individuos inmunocomprometidos, pero también en pacientes 
aparentemente sanos. En efecto, las pneumonías secundarias son la 
causa preponderante de mortalidad en el contexto de epidemias y 
pandemias causadas por Influenzavirus A. Existe una gran variedad 
de agentes patógenos capaces de aprovechar el marco de una 
20	
	
infección viral como ésta, habiéndose ya descrito a profundidad las 
infecciones secundarias causadas por Haemophilus influenzae, 
Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae y Streptococcus 
pyogenes 1,23. 
 
No obstante, se han reportado múltiples casos de infecciones 
secundarias tales causadas por agentes no bacterianos, siendo 
Aspergillus fumigatus el agente causal más prominente en este tipo 
de padecimientos 2. En concordancia con este hecho, datos 
epidemiológicos del departamento donde se realiza el presente 
trabajo indican un aumento en el número de solicitudes recibidas 
para el análisis serológico de posibles micosis invasivas durante el 
período correspondiente a la pandemia de Influenza de 2009, 
resultando efectivamente A. fumigatus como el agente causal más 
comúnmente detectado. 
 
La patogénesis de este hongo en el tracto respiratorio puede 
relacionarse con distintos factores de riesgo, algunos de ellos 
dependientes, y otros independientes de la respuesta inmune del 
hospedero. Como ejemplo de los primeros está el uso concurrente de 
antibióticos, que podría afectar la flora de las vías aéreas, 
disminuyendo la competencia que el hongo necesitaría para 
establecerse en los tejidos diana. Por otra parte, el uso de agentes 
quimioterapéuticos, así como la administración de antiinflamatorios 
21	
	
esteroideos, cuyo uso a largo plazo resulta inmunosupresivo, junto 
con la disrupción viral del epitelio alveolar, pueden conjuntamente 
impedir el funcionamiento linfocitario y alterar el eje de respuesta 
Th1/Th2. 
 
Así, es posible que el aumento en el registro de casos de Aspergilosis 
Pulmonar Invasiva esté relacionado con la prevalencia de 
Influenzavirus A en la población, fungiendo este último como un 
factor de riesgo para infecciones respiratorias agudas 2 24. 
 
Para que se pueda establecer una interacción patogénica entre un 
hongo y su huésped, es requisito el contacto físico entre las 
estructuras de diseminación fúngica y los tejidos hacia los cuales 
cada hongo presenta un tropismo particular. Por ejemplo, los hongos 
más comúnmente aislados en el contexto clínico corresponden al 
género Candida, particularmente la especie Candida albicans. Una 
alteración química, inmunitaria o bacteriana del tejido donde dichas 
levaduras se encuentren como parte de la microbiota residente puede 
inducir en éstas un cambio morfológico a pseudohifas, causando la 
expresión de las adhesinas de pared celular Als1-9, Eap1, y Hwp1, 
facilitando así la interacción física levadura-epitelio y promoviendo su 
invasión 25. No obstante, en el caso de A. fumigatus, el contacto 
célula-huésped no se establece de manera directa, dado que la fase 
micelial se encuentra en el medio ambiente, pero no es volátil. Tal 
22	
	
condición limita la posibilidad de que las hifas de este moho puedan 
dar pie a un proceso infectivo. 
 
II.5 - Aspergillus fumigatus: Diseminación y Germinación. 
Comúnmente encontrado en el suelo, en plantas y cerca de materia 
orgánica en descomposición, A. fumigatus es un hongo filamentoso 
saprótrofo perteneciente al filo Ascomycota que se encuentra 
ampliamente diseminado en todos los continentes, y ha ganado 
notoriedad por ser el agente causal más común de micosis en 
individuos inmunodeficientes 26,27. En la naturaleza, el micelio aéreo 
de este hongo presenta estructuras reproductivas llamadas 
conidióforos, cuya función es dar origen a mitosporas o 
clamidiosporas asexuales conocidas coloquialmente como “conidios”. 
Aún en el conidióforo, éstos presentan una disposición catenada en el 
ápice de las fiálides debido a la discretización de la conidiogénesis 
vesicular en dichas estructuras. 
 
Asimismo, poseen una coloración verde-grisácea causada por la 
presencia de metabolitos secundarios melánicos en su pared celular, 
lo cual les protege de la luz y agentes oxidantes. Dichas estructuras 
de diseminación son lo suficientemente pequeñas y volátiles para 
sortear las barreras físicas que normalmente impedirían la entrada de 
partículas al tracto respiratorio inferior. Aunado ésto al hecho de que 
son producidos en grandes cantidades y se encuentran ubicuamente 
23	
	
distribuidos en los ambientes donde el ser humano se desenvuelve, 
representan una potencial fuente de elementos infecciosos capaces 
de generar un impacto significativo en la salud 28. 
 
Los conidios pueden germinar en presencia de agua y nutrientes de 
bajo peso molecular como azúcares, aminoácidos y sales, así como 
una pO2 propia de condiciones aerobias. La disponibilidad y 
concentración de estos nutrientes regula la actividad de múltiples 
receptores vinculados con diferentes vías de señalización intracelular, 
siendo las principales cAMP/PKA y TOR, cuya actividad conjunta es 
estrictamente necesaria para dar inicio al proceso de germinación 29. 
Una vez sucedido, el conidio se rehidrata al degradar los cuerpos de 
reserva de trehalosa, tras lo cual se reanuda la respiración y el tráfico 
vesicular intracelular. 
 
El conidio hinchado presenta un núcleo descondensado y utiliza las 
reservas de glucógeno para aumentar su metabolismo rápidamente, 
lo cual tiene como indicio morfológico el cambio en la estructura de la 
pared celular. Ésta consta de tres capas, siendo la más externa y 
melánica el sustrato de quitinasas y glucanasas exportadas al exterior 
de la pared con la finalidad de degradarla. La destrucción de esta 
capa externa deja expuestas a las glicoproteínas de la capa 
intermedia, lo cual invariablemente aumenta la adhesión del conidio 
al sustrato 30. 
24	
	
II.6 - Establecimiento de la Aspergilosis y Respuesta Inmune. 
Si los conidios de A. fumigatus acceden al tracto respiratorio inferior y 
no son eliminados completamente por el sistema inmunitario, pueden 
aprovechar las condiciones de temperatura, humedad y disponibilidad 
de nutrientes para germinar y proliferar dentro de éste, dando origen 
a diversas manifestaciones del proceso infeccioso tales como la 
Aspergilosis Pulmonar Invasiva (API), la Aspergilosis Broncopulmonar 
Alérgica (ABA), o el Aspergiloma. El tipo de manifestación depende 
directamente del estado inmunitario del paciente y de la respuesta 
particular que éste monte ante el hongo en función de factores 
diversos como el tamaño del inóculo y la eficiencia de la fagocitosis, 
entre otros. En consecuencia, un paciente con funciones inmunitarias 
suprimidas o deficientes tiene una mayor probabilidad de verse 
afectado por un proceso infeccioso tal 31. Asimismo, este hongo posee 
un variado repertorio de factores de virulencia, lo cual puede también 
influir en el desarrollo de la enfermedad si la oportunidad para ello es 
facilitadapor una infección subyacente o una deficiencia inmunitaria. 
 
Al momento de su liberación, estos conidios se encuentran 
recubiertos por una capa proteinácea cuya función es enmascarar los 
carbohidratos inmunógenos presentes en la pared celular. Dicha capa 
es un blanco de la Pentraxina-3, la cual puede iniciar el reclutamiento 
de proteínas del complemento (como C3 y C5) a la superficie conidial, 
culminando en su opsonización y posterior fagocitosis por parte de 
25	
	
células con Fc-γR. El hongo puede contrarrestar este efecto gracias a 
la presencia de pigmentos melánicos en su pared celular, los cuales 
limitan la deposición de C3 y otras glicoproteínas del complejo de 
ataque a membrana. 
 
Asimismo, se ha demostrado en A. fumigatus la habilidad de frenar 
este proceso mediante la liberación de lípidos inhibidores del 
complemento, cuya función coadyuva la capacidad del conidio para 
unir al Factor H y otras proteínas similares en su superficie, teniendo 
esto un efecto negativo en la formación exógena del poro membranal 
32. Durante el curso del hinchamiento conidial y la reactivación 
metabólica, este hongo puede también liberar la proteasa alcalina 
Alp1, la cual remueve a C3 y C5 de la superficie celular, ayudando a 
éste a evadir la fagocitosis y otorgándole más tiempo para germinar 
33. 
 
Más adelante, tras el proceso de hinchamiento pueden los neutrófilos 
intervenir en la eliminación de conidios mediante las Trampas 
Extracelulares de Neutrófilos (NETs), impidiendo el progreso de su 
germinación gracias a la limitación espacial que la red de ácidos 
nucleicos liberados ejerce sobre éstos, así como por la toxicidad 
causada por la presencia de peroxidasas, las cuales pueden mediar la 
generación de especies reactivas de oxígeno con roles hidrolítico-
oxidativos. No obstante, la expresión de catalasas y superóxido 
26	
	
dismutasas, así como la presencia de pigmentos, contribuyen a la 
resistencia que el hongo puede presentar ante tal mecanismo de 
respuesta, ayudándole a desintoxicar su entorno inmediato. Tomando 
en cuenta sus factores de virulencia, cualquier inmunocompromiso 
que afecte a los mecanismos de opsonización o NETosis puede 
facilitar al hongo la colonización de sus tejidos diana, según el estudio 
realizado por Cramer y colaboradores 34. 
 
Una vez hinchado, los polisacáridos antigénicos del conidio quedan 
expuestos a la interacción con PRRs de superficie leucocitaria, lo cual 
causa el reclutamiento citosólico de proteínas adaptadoras. Éstas 
inician cascadas de señalización que inducen la producción y 
exocitosis de múltiples citocinas, ayudando a comunicar la respuesta 
inmunitaria mediante el establecimiento de un microambiente 
inflamatorio. No obstante, tanto la presencia de Células Dendríticas 
derivadas de Monocitos (Mo-DC) en el sitio de infección como el tipo 
de receptor involucrado en el reconocimiento antigénico juegan un 
papel fundamental en el desarrollo de las subpoblaciones de 
Linfocitos T CD4+ generadas en torno a la presencia del hongo. Los 
receptores Toll-Like (TLR2, 4 y 9) transducen su interacción mediante 
la proteína adaptadora MyD88, la cual ha demostrado jugar un rol 
esencial en la producción del factor transcripcional T-bet y la 
subsecuente diferenciación linfocítica a Th1, estimulando así una 
respuesta inflamatoria a través de la secreción de IFN-γ. 
27	
	
En contraste, la activación de Receptores tipo Lectina-C (CLRs, 
Dectina-1) causa la amplificación de señales intracelulares por un 
mecanismo dependiente de las cinasas Src, cuya función está ligada a 
la producción de factores transcripcionales como GATA3 y ROR-γT. 
Éstos causan la diferenciación celular a fenotipos Th2 y Th17, 
ayudando a modular la respuesta inflamatoria mediante la producción 
de TGF-β y reclutando otras células con IL-17, respectivamente. 
Ambos tipos de receptores se encuentran en la superficie de los 
Linfocitos T que interactúan con los antígenos fúngicos en el nódulo 
linfático, por lo que un balance en los niveles de éstos es crucial en el 
desarrollo óptimo de la respuesta adaptativa al hongo33,34. La 
alteración de los niveles de PRRs o en la eficiencia de la transducción 
de su señal, así como una falla en reclutamiento de Mo-DCs 
dependiente de CCR2, son condiciones que pueden modificar las 
proporciones de linfocitos específicos a A. fumigatus, alterando la 
respuesta normal del sistema inmunitario y sesgándola en favor de la 
supervivencia del hongo. Finalmente, se ha demostrado que estos 
conidios pueden ser endocitados por distintas líneas celulares 
epiteliales provenientes de humanos 34 35. 
 
II.7 - Interacciones conidio-epitelio. 
El epitelio alveolar es un tejido que recubre la luz interna del alveolo 
y está compuesto por pneumocitos Tipo I, que son planos y 
extendidos, y pneumocitos Tipo II, que son cuboidales. Los 
28	
	
pneumocitos Tipo I representan el 37% de la población celular en 
este tejido, si bien cubren el 97% de su superficie. Su citosol está 
altamente ramificado y poseen placas citosólicas, las cuales son 
estructuras membranales delgadas que facilitan el intercambio 
gaseoso entre el alveolo y la microvasculatura. 
 
A su vez, los pneumocitos Tipo II se encargan de la manutención de 
esta barrera tisular, dividiéndose y transdiferenciándose para reponer 
células Tipo I muertas o dañadas. Al mismo tiempo, generan 
surfactante para mantener la integridad mecánica del saco alveolar al 
expandirse éste durante el proceso de ventilación, y también se ha 
demostrado que intervienen en el montaje de la respuesta 
inmunitaria ante agentes infecciosos del sistema respiratorio, 
promoviendo la diapédesis monocitaria a través de la exocitosis de 
citocinas proinflamatorias como IFN-γ36. Como ya se ha mencionado, 
el primer contacto entre los conidios y el hospedero ocurre al nivel 
del epitelio respiratorio. En este estado, dichas estructuras de 
diseminación pueden permanecer latentes durante períodos de 
tiempo más largos, y eventualmente germinar habiendo evadido la 
fagocitosis por macrófagos o neutrófilos. Dicha capacidad requiere de 
la adhesión conferida por la presencia de múltiples proteínas de 
superficie, las cuales pueden establecer interacciones directas con 
receptores de membrana epitelial. Un estudio por DeHart y 
colaboradores, en el cual se emplea la línea celular A549 como 
29	
	
modelo, indica que el epitelio alveolar puede ser un tejido diana para 
estos hongos, dado que éstos exhiben un nivel elevado de adhesión a 
este tejido tras 40 minutos de contacto en medio libre de suero 37. 
 
Similarmente, un estudio llevado a cabo por Liu y colaboradores 
demostró la presencia de la proteína de CalA en la superficie conidial 
de A. fumigatus y empleó la línea celular A549 para demostrar que 
ésta interactúa con los dímeros de Integrina α5β1, presentes en la 
membrana celular del epitelio alveolar para establecer puntos de 
anclaje con la matriz extracelular a través de la interacción con 
Fibronectina 6. Complementariamente, un estudio realizado en células 
A549 por Wasylnka y colaboradores señala que los carbohidratos 
cargados negativamente en la superficie del conidio pueden 
interactuar con las proteínas de matriz extracelular del tejido 
respiratorio 38, las cuales podrían quedar estéricamente disponibles 
como consecuencia del efecto de la patogénesis viral, y facilitar de 
esta forma el establecimiento de la infección fúngica. 
 
Asimismo, un estudio realizado por Yan y colaboradores 7 ha descrito 
la unión entre E-Cadherina y proteínas de membrana conidiales aún 
no descritas, lo cual lograron a través del bloqueo en la expresión de 
E-Cadherina mediante la transfección con siRNAs específicos y la 
posterior observación de una menor interacción del conidio con la 
línea celular A549. 
30	
	
En el contexto de una infección por Influenzavirus A, el TGF-β latente(LTGF-β) producido de manera normal por los epitelios puede ser 
activado por la neuraminidasa viral mediante un corte proteolitico, 
como lo muestran los resultados de un estudio llevado a cabo por 
Schultz-Cherry y colaboradores 39. Esta citocina de carácter 
antiinflamatorio interactúa con su receptor (TGFβ-R) en la superficie 
celular, lo cual causa la autofosforilación de sus subunidades 
catalíticas, promoviendo así la fosforilación de las proteínas SMAD. 
Dichas proteínas, una vez fosforiladas y translocadas al núcleo 
celular, pueden fungir como factores transcripcionales y así regular al 
alza múltiples genes, entre ellos los que codifican a cinasas activadas 
por mitógenos (MAPK/ERK) 40. 
 
En la línea celular A549, este efecto causa la apoptosis de las células 
infectadas por el virus, pero también da como resultado la 
sensibilización parácrina del tejido no infectado. Así, un estudio 
llevado a cabo por Ranganathan P. y colaboradores indica que la 
presencia de TGF-β puede promover la sobreexpresión de la Integrina 
α5 en esta línea celular, lo cual tiene consecuencias en múltiples 
aspectos como la adhesión y la integridad física del epitelio alveolar 5. 
 
Los datos anteriores sugieren que la infección fúngica del tracto 
respiratorio, como sucede en la Aspergilosis Pulmonar Invasiva, 
puede verse facilitada por un aumento en los niveles de Integrinas o 
31	
	
en las cargas negativas de la superficie celular, fortaleciendo el 
contacto entre conidios y el epitelio alveolar; Así, es también posible 
que la presencia del TGF-β pueda mediar el alza de los niveles 
superficiales de dichas proteínas. En función de los resultados 
provistos por dichos estudios es posible establecer que la línea celular 
A549 puede servir como un modelo in vitro para el estudio de este 
fenómeno. Hasta la fecha no se ha estudiado el efecto que la 
infección por Influenzavirus A ejerce sobre las propiedades adhesivas 
de la membrana epitelial, por lo que la participación de este 
fenómeno en la facilitación de la invasión fúngica del alveolo aún se 
desconoce. 
 
Por ello, el presente trabajo tiene como intención encontrar una 
relación mecanística en la coinfección del tejido respiratorio por 
Influenzavirus A y A. fumigatus a través del análisis de los cambios 
en los niveles de proteínas de adhesión que intervienen en la 
interacción física entre los conidios del hongo y las células del epitelio 
alveolar. 
 
 
 
 
 
 
32	
	
III. Procedimiento Experimental 
 
III.1 - Material biológico y cultivo celular. 
Virus: La cepa 2009-Cosío de Influenzavirus A(H1N1)pdm09, 
correspondiente a un aislado clínico, fue provista por el laboratorio en 
el que se realizó este trabajo. 
 
Líneas celulares: Para la propagación del virus se empleó la línea 
celular MDCK (ATCC, Estados Unidos), proveniente de epitelio renal 
canino, cultivada empleando medio de cultivo UltraMDCK (Lonza 
Group AG, Suiza) adicionado con Penicilina-Estreptomicina-
Anfotericina B (InVitro S.A., Mexico). En los ensayos experimentales 
se empleó la línea celular de epitelio alveolar humano A549 (ATCC, 
Estados Unidos) para cuyo mantenimiento se usó medio de cultivo F-
12 de Ham (Biowest, Estados Unidos) adicionado con Penicilina-
Estreptomicina-Anfotericina B (InVitro S.A., Mexico) y Suero Fetal 
Bovino al 10% (Lonza Group AG, Suiza). 
 
Hongos: Para la experimentación se eligió a la cepa de referencia 
Aspergillus fumigatus Fresenius MYA-3626™ (ATCC, Estados Unidos) 
provista por el Cepario del Laboratorio de Micología Molecular 
(Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de 
Medicina, UNAM, México) la cual fue cultivada en Agar Sabouraud 
(BD-Bioxon, Estados Unidos) empleando para su uso cajas Petri de 
33	
	
8cm de diámetro (IRSA, México) o criotubos de 5mL (NUNC A/S, 
Dinamarca) para su conservación bajo aceite mineral (Bio-Rad 
Laboratories Inc, Estados Unidos). 
 
En todos los casos, los cultivos celulares se incubaron a 37ºC y al 5% 
de CO2 empleando la incubadora SafeCell UV (Sanyo Electric Co. Ltd, 
Japón). Las células fueron mantenidas en botellas de 25cm2 (Corning 
Inc., Estados Unidos), crecidas a confluencia, lavadas con Solución 
Salina Isotónica (SSI) (Pisa Farmacéutica, México), y para la 
expansión de cultivos se utilizó solución de Tripsina (InVitro S.A., 
Mexico), para así ser subcultivados según las necesidades del 
laboratorio en placas de 6, 24 o 48 pozos. 
 
Los cultivos fúngicos se mantuvieron a la misma temperatura en la 
incubadora Cl-80 (ECOSHEL Technology Ltd, Estados Unidos) sin 
suplemento de CO2. La manipulación de este material se realizó bajo 
condiciones de Bioseguridad nivel 2 (BSL-2) en habitaciones 
especiales con campanas de flujo laminar “Gabinete de Seguridad 
Biológica” (Labconco, Estados Unidos), empleando el equipo de 
seguridad pertinente, y eliminando los residuos en cumplimiento de 
las recomendaciones del comité interno de Bioseguridad del INER. 
Para evaluar el estado de los cultivos celulares se empleó un 
microscopio óptico invertido Primo Vert (Carl Zeiss AG, Alemania). 
 
34	
	
III.2 - Propagación de la cepa viral. 
Cultivos confluentes de células MDCK fueron inoculados con la cepa 
2009-Cosío de Influenzavirus A(H1N1)pdm09 en una MOI=0.1 El 
sobrenadante conteniendo a las partículas virales fue utilizado para 
re-inocular cultivos frescos consecutivos hasta alcanzar un efecto 
citopático generalizado y sincrónico. A 72 horas post-infección las 
células fueron cosechadas por centrifugación y los sobrenadantes 
fueron almacenados a -80ºC en criotubos de 1.8mL (NUNC A/S, 
Dinamarca). Más adelante, alícuotas de virus fueron tituladas 
mediante la técnica de hemaglutinación en placa. 
 
III.3 - Titulación viral por Hemaglutinación en placa. 
Esta técnica se basa en la capacidad aglutinante de la HA de 
Influenzavirus sobre eritrocitos, lo cual permite cuantificar partículas 
aglutinantes en una muestra. Para ello, se emplea PBS 1X a pH=7.2, 
el cual se preparó como a continuación se describe: En un matraz 
volumétrico de 200ml se agregaron 5.48g de NaH2PO4 (JT Baker, 
Estados Unidos), 1.575g de K2HPO4 (JT Baker, Estados Unidos) y 
120ml de agua destilada. Se ajustó el pH a 7.2, tras lo cual se 
agregaron 8.5g de NaCl (JT Baker, Estados Unidos) y se llevó la 
solución a un volumen final de 1L. 
 
Asimismo, se empleó una suspensión al 0.5% de eritrocitos O Rh(D)+ 
obtenidos de donadores sanos, la cual se prepara como a 
35	
	
continuación se describe: En un tubo colector al vacío con EDTA (BD-
Vacutainer, Estados Unidos) se obtuvo una muestra sanguínea por 
punción venosa, la cual fue centrifugada a 2000RPM durante 10 
minutos, tras lo cual el suero fue descartado y los eritrocitos fueron 
lavados con PBS. Se centrifugaron y lavaron los eritrocitos de esta 
forma hasta que el sobrenadante fue transparente, tras lo cual se 
prepararon 12.5ml de una suspensión de eritrocitos al 0.5%. 
 
En cajas de 96 pocillos (NUNC A/S, Dinamarca) se agregaron 25µL de 
PBS 1X en cada uno de los pocillos a emplear, salvo en los 
correspondientes a la muestra de virus sin diluir. Por cada ensayo de 
titulación se agregó un volumen de 50µL de la muestra en el primer 
pozo, del cual fueron tomados 25µL para realizar la dilución 1:2. Tras 
mezclar ambos volúmenes, se tomaron 25µL de esta dilución y se 
continuó realizando diluciones seriadas a tal volumen hasta llegar a 
un factor de dilución 1:1024. 
 
Posteriormente, se agregó a cada pozo 25µL más de PBS 1X y 50µl 
de la suspensión de eritrocitos, tras lo cual la placa fue incubada a 
37ºC durante 1 hora. La hemaglutinación se presentó si hubo una 
malla celular formada, y se descartó su presencia si hubo 
sedimentación de eritrocitos. El máximo factor de dilución al cual se 
pudo observar hemaglutinación corresponde al título de la muestra. 
 
36	
	
III.4 - Validación de infectividad viral.Microcultivos de las líneas celulares A549 y MDCK en portaobjetos 
con cámaras Lab-Tek II Chamber Slide System (Thermo-Fisher 
Scientific, Estados Unidos) fueron lavados y suplementados con 
medio fresco como se indicó previamente, siendo después inoculados 
con la cepa 2009-Cosío de Influenzavirus A(H1N1)pdm09 en valores 
de MOI = 0, 0.1, 1 y 5. Tras 6, 12, 18, 24, 48 y 72 horas post-
infección, se realizaron ensayos de inmunocitoquímica usando los 
reactivos y la metodología correspondientes al kit “EXPOSE Mouse 
and Rabbit Specific HRP/DAB Detection IHC“ (Abcam PLC, Reino 
Unido). 
 
Para ello, las células fueron cubiertas con solución de H2O2 por 2 
minutos, bloqueadas con Protein Block 10 minutos e incubadas con 
los anticuerpos primarios α-M1 1:100 (Abcam PLC, Reino Unido), α-
M2 1:50, α-PCNA 1:50 y α-p65 1:250 (Santa Cruz Biotechnology, 
Estados Unidos) durante el período de una noche, tras lo cual se les 
aplicó “Mouse Specifying Reagent” (Complemento) durante 10 
minutos y Conjugado HRP durante otros 10 minutos. Después se les 
agregó DAB (Diaminobencidina) en tiempos de entre 1 y 2 minutos, y 
fueron teñidas con Hematoxilina (Golden Bell, Mexico) durante 30 
segundos, virando dicha tinción al sumergir los portaobjetos en una 
solución al 2% de NaHCO3 (JT Baker, Estados Unidos) por 10 
segundos. 
37	
	
Entre la mayoría de los tratamientos anteriormente descritos (salvo 
entre la tinción con Hematoxilina y el vire de ésta con NaHCO3) se 
realizaron de 2 a 4 lavados con PBS 1X en frascos Coplin (Tarsons 
Ltd, India). Posteriormente, se sumergieron las monocapas en un 
tren de lavado Agua-Alcohol-Xilol no más de 10 segundos por etapa, 
y las preparaciones fueron selladas con cubreojetos rectangulares de 
24x50mm (Corning Inc., Estados Unidos) y resina Entellan (Merck 
KGaA, Alemania) diluida al 50% con Xilol (Golden Bell, Mexico). Para 
la cuantificación de células infectadas, los resultados 
correspondientes a este ensayo experimental fueron obtenidos 
visualizando 4 campos aleatorios en la sección correspondiente a 
cada condición experimental, tras lo cual se contaron las células con 
un fenotipo ligeramente sepia como positivas (+) y aquellas con un 
fenotipo extendido y una coloración intensamente café como 
altamente positivas (++). Dicho conteo se realizó bajo el microscopio 
multimodal Axio Observer Z1, empleando las cámaras AxioCam MRm 
y AxioCam MRc5 (Carl Zeiss AG, Alemania). Las gráficas realizadas 
con este conteo contemplan solamente aquellas células altamente 
positivas (++) a la infección. 
 
III.5 - Efecto del virus en la adhesión conidial del modelo de 
epitelio. 
Un protocolo acorde a las condiciones experimentales de interés fue 
diseñado con base en los ensayos de adhesión y endocitosis conidial 
38	
	
propuestos por DeHart et al 37. Brevemente, la línea celular A549 fue 
subcultivada y crecida a confluencia en cajas de 6 pozos (NUNC A/S, 
Dinamarca). En este punto les fueron agregados a los cultivos 
celulares 0µL, 1.25µL, 2.5µL, 3.75µL o 5µL del reactivo (Sigma-Merck 
KGaA, Alemania) tras lo cual las células fueron incubadas con esta 
sustancia durante 1 hora, según el experimento realizado. 
A 
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
Figura 1. Esquema de la metodología empleada en los ensayos de adherencia 
conidial. A) A las monocapas de células epiteliales cultivadas en cajas de 6 pozos les 
fueron agregados 150 conidios en medio líquido (MEM), y se les permitió interactuar 
durante 40 minutos; se eliminaron los conidios no adheridos y se añadió medio 
Sabouraud en presencia de MTT (puntos morados). El número de conidios adheridos se 
estimó por la presencia de colonias tras 24 -30 horas de cultivo a 37°C. Los valores de 
adherencia relativa se obtuvieron a partir de la normalización de los resultados 
experimentales con el número de colonias presentes en los controles sin estímulo. 
 
Posteriormente fueron infectadas con el virus en una MOI = 1, y 
después de diferentes tiempos de infección (12, 18, 24, 48 y 72 
horas), los sobrenadantes fueron removidos y/o almacenados para su 
posterior análisis. Las monocapas fueron lavadas 2 veces con SSI 
(Pisa Farmacéutica, México), tras lo cual se les proporcionó a las 
células medio de cultivo DMEM (InVitro S.A., Mexico) no 
39	
	
suplementado, y en función de las condiciones experimentales, se 
agregaron 40µL de SSI o un volumen equivalente a 150 conidios de 
A. fumigatus, provenientes de una suspensión de conidios maduros 
en PBS-Tween 20 al 0.05% (Figura 1) (Sigma-Merck KGaA, 
Alemania). La suspensión conidial fue cuantificada con una cámara de 
Neubauer empleando la técnica correspondiente. 
 
Después de 40 ó 120 minutos de contacto célula-conidio para los 
ensayos de adhesión y endocitosis, respectivamente, los 
sobrenadantes fueron de nueva cuenta recolectados o removidos, 
para después lavar las células 4 veces con SSI. A los pozos lavados 
se les agregaron 3mL de Agar Sabouraud (BD-Bioxon, Estados 
Unidos) diluido al 50% con Agarosa a 15g/L (GeneChoice Inc, 
Estados Unidos) y Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-
difeniltetrazolio 0.5X (Sigma-Merck KGaA, Alemania), y dichos 
cultivos fúngicos fueron incubados durante 24h. Las colonias 
resultantes fueron contadas con ayuda de un transiluminador. 
 
III.6 - Preparación de suspensión conidial y conteo en cámara 
de Neubauer. 
A un cultivo maduro de A. fumigatus en placa de Agar Sabouraud 
fueron agregados 5mL de PBS-Tween 20 0.05% con la finalidad de 
recuperar la mayor cantidad de conidios posible. Dicho volumen de 
suspensión conidial fue filtrado con la finalidad de eliminar hifas y 
40	
	
otros componentes miceliares, empleando para ello filtros de jeringa 
SWINNEX (Millipore-Merck KGaA, Alemania) y círculos de papel 
Whatman® Nº 3 (Sigma-Merck KGaA, Alemania) con un tamaño de 
poro de 6 µm y un diámetro aproximado de 2.5cm, así como jeringas 
de 5mL (BD-Plastipak, Estados Unidos). Una vez sin residuos de 
micelio, se realizaron 4 diluciones seriadas de esta suspensión, las 
cuales fueron cuantificadas en una cámara de Neubauer (Hausser 
Scientific, Estados Unidos), empleando el microscopio de campo claro 
Primo Star (Carl Zeiss AG, Alemania). 
 
Para ello, se colocó un cubreobjetos rectangular limpio de 24x50mm 
sobre los soportes de la cámara, tras lo cual se tomaron 20µL de la 
suspensión conidial y en cada uno de los dos campos de conteo de la 
cámara previamente mencionada se colocaron 10µL. Posteriormente, 
la cámara de Neubauer fue colocada en la platina del microscopio, y 
empleando el objetivo 40X se contaron los conidios en cada uno de 
los 16 cuadrados de 0.0625mm2, correspondientes en su totalidad a 
un cuadrante de 1mm2. Por cada dilución se llevó a cabo este conteo 
8 veces, es decir, 4 veces por campo de conteo, y empleando la 
siguiente ecuación se obtuvo el valor promedio expresado en 
conidios/µL. Dicho resultado fue empleado como referencia para 
realizar posteriores diluciones de trabajo, cuyos valores finales de 
concentración permitieron manejar volúmenes accesibles. 
 
41	
	
Ecuación: 
X =
Np partículas
Nc mm! ∗ D mm ∗ Fd 
 
X = Concentración expresada en partículas/mL 
Np = Número de partículas contadas. 
Nc = Número de cuadrantes contados. (1 cuadrante = 1mm2) 
Fd = Factor de dilución (si se busca la concentración original) 
D = Profundidad de la cámara de Neubauer. (1 mm). 
 
III.7 - Evaluación de inducción en la expresión de moléculas 
de adhesión. 
Se subcultivó y creció a confluencia la línea celular A549 en cajas de 
6 pozos (NUNC A/S, Dinamarca), tras lo cual fue infectada con la 
cepa 2009-Cosío de Influenzavirus A(H1N1)pdm09 en una MOI = 1. 
Finalizando diferentes tiempos de infección (12h, 18h, 24h, 48h y 
72h) las células fueron lavadas 2 veces con SSI. Para la extracción de 
proteína, las células fueron lisadas con 150µL de Buffer RipA 
(Thermo-Fisher Scientific, Estados Unidos) adicionadocon inhibidores 
de proteasas. Los extractos protéicos fueron homogeneizados y 
centrifugados a 4ºC a una velocidad de 14,000 RPM durante 20 
minutos empleando la microcentrífuga 5417R (Eppendorf AG, 
Alemania) tras lo cual se recuperaron, rotularon, y almacenaron los 
sobrenadantes. Dichos extractos fueron analizados mediante la 
42	
	
técnica de Western Blot. Para la extracción de RNA, las células fueron 
lisadas con 350µL de Buffer RLT (Qiagen N.V., Alemania), tras lo cual 
el extracto fue homogeneizado y recuperado para adicionarle con 
350µL de Etanol al 70% (Macron Fine Chemicals, Estados Unidos), 
para conseguir una proporción 1:1. Esta mezcla se colocó en 
columnas de intercambio RNeasy™ (Qiagen N.V., Alemania) con las 
que se purificó el RNA total para su posterior análisis siguiendo las 
instrucciones del proveedor. 
 
III.8 - Cuantificación de proteínas por Método de Bradford. 
Con la finalidad de emplear una cantidad de proteína adecuada en el 
análisis por Western Blot, los extractos proteicos obtenidos durante la 
experimentación fueron cuantificadas usando el reactivo de Bradford, 
Coomassie Brilliant Blue G250. Para ello, las muestras a analizar 
fueron descongeladas junto con los estándares de Albúmina Sérica 
Bovina (Bio-Rad Laboratories Inc, Estados Unidos) correspondientes a 
las concentraciones de 2, 1, 0.5, 0.25 y 0.125 µg/µL. En una placa de 
96 pocillos con fondo plano (NUNC A/S, Dinamarca) se colocaron 
200µL de agua desionizada en todos los pocillos a utilizar. Las 
muestras y los estándares fueron añadidos en volúmenes de 2µL por 
pocillo y cargados por triplicado, tras lo cual fueron agregados 50µL 
de Reactivo de Bradford (Bio-Rad Laboratories Inc, Estados Unidos) a 
todos los pocillos. Tras mezclar 40 veces, 50µL de cada pocillo fueron 
removidos para contar con un volumen final de 200µL, tras lo cual la 
43	
	
placa fue colocada y leída en el espectrofotómetro Epoch™ (Biotek 
Instruments, Inc., Estados Unidos) a λ=545nm. Los resultados de la 
lectura de los estándares fueron usados para generar una curva de 
concentraciones, la cual permitió interpolar las concentraciones de 
cada extracto para así calcular el volumen de muestra a cargar en la 
técnica de SDS-PAGE. 
 
III.9 - SDS-PAGE y Western Blot. 
Los extractos proteicos fueron analizados mediante la técnica de 
Western Blot, siendo primero separados por peso molecular 
empleando la técnica de SDS-PAGE. Para ello, se hicieron geles de 
acrilamida/bisacrilamida al 10% usando la siguiente metodología: 
 
Gel separador: Para preparar 15ml de mezcla, se utilizaron 5.9ml de 
agua destilada provista por el laboratorio, 5.0ml de mezcla de 
acrilamida al 30% (Bio-Rad Laboratories Inc, Estados Unidos), 3.8ml 
de Buffer Tris-HCl (Sigma-Merck KGaA, Alemania) 1.5M a pH=8.8, 
150µL de SDS (Bio-Rad Laboratories Inc, Estados Unidos) al 10%, 
150µL de Persulfato de Amonio al 10% (Bio-Rad Laboratories Inc, 
Estados Unidos) y 6µL de Tetrametiletilendiamina (Sigma-Merck 
KGaA, Alemania) como catalizador de la polimerización. 
 
Gel concentrador: Para preparar 3ml de mezcla, se utilizaron 2.1ml 
de agua destilada provista por el laboratorio, 500µL de mezcla de 
44	
	
acrilamida al 30% (Bio-Rad Laboratories Inc, Estados Unidos), 380µL 
de Buffer Tris-HCl (Sigma-Merck KGaA, Alemania) 1M a pH=6.8, 30µL 
de SDS (Bio-Rad Laboratories Inc, Estados Unidos) al 10%, 30µL de 
Persulfato de Amonio al 10% (Bio-Rad Laboratories Inc, Estados 
Unidos) y 3µL de Tetrametiletilendiamina (Sigma-Merck KGaA, 
Alemania) como catalizador de la polimerización. 
 
Para llevar a cabo el siguiente procedimiento se emplearon todos los 
contenidos del equipo de electroforesis Mini-PROTEAN® Tetra (Bio-
Rad Laboratories Inc, Estados Unidos). Respecto a la formación de 
estos geles, se colocaron las placas de vidrio sobre los soportes de 
plástico, tras lo cual éstas se marcaron a una altura de 5.5cm, lo cual 
sirvió como referencia para cargar un volumen adecuado de la mezcla 
correspondiente al gel separador, aproximadamente 5ml, evitando la 
formación de burbujas y eliminando las que pudiesen formarse con 
volúmenes pequeños de isopropanol (Sigma-Merck KGaA, Alemania). 
 
Una vez polimerizada la mezcla, se removió el alcohol y se colocó un 
volumen cercano a 1ml de mezcla de gel concentrador, tras lo cual se 
posicionó un aditamento para formar pocillos de carga en el extremo 
superior del gel, asegurándose de que ninguna burbuja quedase 
atrapada en esta interfase. Después de la segunda ronda de 
polimerización, las placas de vidrio conteniendo a los geles fueron 
removidas de los soportes y colocadas en la cámara de electroforesis, 
45	
	
tras lo cual ésta se llenó a capacidad con Buffer de Corrida (Tris-HCl 
25mM, Glicina 190mM, SDS 0.1%). Se calculó el volumen 
correspondiente a 10µg de proteína total y se mezcló con buffer de 
carga 2x (Bio-Rad Laboratories Inc, Estados Unidos), tras lo cual se 
desnaturalizaron las muestras a 100ºC durante 5 minutos. Dichos 
volúmenes fueron cargados en los carriles asignados a cada uno, 
empleando como referencia el marcador de peso molecular “Precision 
Plus Protein™ Standards - All Blue” (Bio-Rad Laboratories Inc, 
Estados Unidos). 
 
Terminado lo anterior, se colocó la tapa en la cámara de 
electroforesis y se le conectó al regulador de corriente Power/Pac 
3000 (Bio-Rad Laboratories Inc, Estados Unidos), programando a 
este aparato para entregar una diferencia de potencial de 85v 
durante los primeros 15 minutos del experimento, y de 100v durante 
las 2 horas 15 minutos subsecuentes. Después de haber realizado la 
técnica de SDS-PAGE, las proteínas fueron transferidas a membranas 
de PVDF de 8.5x5.5cm (Bio-Rad Laboratories Inc, Estados Unidos) 
empleando el equipo de transferencia Criterion® Blotter (Bio-Rad 
Laboratories Inc, Estados Unidos), filtros de celulosa FilterPaper (Bio-
Rad Laboratories Inc, Estados Unidos), un volumen adecuado de 
Buffer de Transferencia (Tris-HCl 25mM, Glicina 190mM), y el 
regulador de corriente Power/Pac 3000 (Bio-Rad Laboratories Inc, 
Estados Unidos), programado a una intensidad de corriente fija de 
46	
	
300mA durante 1 hora. La transferencia se llevó a cabo en una 
hielera, cubriendo la cámara de transferencia con hielo para evitar el 
sobrecalentamiento del sistema. 
 
Tras la finalización de la transferencia, las membranas con las 
proteínas ya adsorbidas fueron bloqueadas con caseína usando una 
solución de leche en polvo libre de grasas disuelta en TBS-Tween 20 
al 0.01% (Sigma-Merck KGaA, Alemania) durante 1 hora. 
Posteriormente fueron incubadas con los anticuerpos primarios α-M1 
1:100 (Abcam PLC, Reino Unido), α-Integrina α5 1:200 (leporino), α-
Integrina β1 1:100 (murino), α-E-cadherina 1:400 (murino) y α-
GAPDH 1:400 (murino) (Santa Cruz Biotechnology, Estados Unidos) 
tras lo cual fueron lavadas 3 veces por 10 minutos y 2 veces por 5 
minutos en TBS-Tween 20 al 0.01% (Sigma-Merck KGaA, Alemania) 
a temperatura ambiente. Los anticuerpos secundarios usados fueron 
“Goat Anti-Mouse IgG (H+L)-HRP Conjugate” 1:4,000 (Bio-Rad 
Laboratories Inc, Estados Unidos) y “Goat pAb to Rb IgG (HRP)” 
1:10,000 (Abcam PLC, Reino Unido). 
 
El experimento fue revelado empleando el reactivo Clarity Max™ 
Western ECL Substrate (Bio-Rad Laboratories Inc, Estados Unidos) y 
los resultados fueron capturados con el fotodocumentador ChemiDoc 
XRS+ (Bio-Rad Laboratories Inc, Estados Unidos). 
 
47	
	
III.10 - Análisis Estadístico. 
El análisis fue realizado empleando GraphPad Prism (GraphPad 
Software, Estados Unidos). Los datos se presentan como promedios, 
acompañados con su desviación estándar en caso de los 
experimentos con n > 1. A estos se les realizó una prueba de análisis 
de varianza (ANOVA) acoplada a una prueba de Dunnett para 
comprobar diferencias respecto a sus controles correspondientes. Se 
consideró como significativo unvalor de α ≤ 0.05, alcanzando un valor 
mínimo de α = 0.001. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
48	
	
IV. Resultados y Discusión. 
 
IV.1 – Producción viral en células MDCK. La producción viral 
óptima de la cepa 2009-Cosío de Influenzavirus A 
(H1N1)pdm09 en la línea celular MDCK se presenta a las 72h 
post-infección y con una MOI = 0.1. 
Para poder realizar los experimentos descritos en los objetivos 
planteados por este estudio, primero fue necesario el montaje de 
distintas metodologías. La primera de ellas fue la producción del virus 
en cultivo celular, lo cual habría de permitirnos a futuro la 
disponibilidad de partículas virales con las cuales simular el proceso 
infectivo en el modelo propuesto, para lo cual primero se evaluó la 
producción viral en la línea celular MDCK a distintas multiplicidades 
de infección (MOI). 
 
El virus corresponde a la cepa 2009-Cosío de Influenzavirus A 
(H1N1)pdm09, la cual fue aislada por el grupo de trabajo que 
supervisa este estudio a partir de un paciente mexicano infectado 
durante la pandemia de Influenza de 2009. La razón por la cual se 
eligió esta cepa recae principalmente en el hecho de que este virus, 
al ser el agente causal de dicho evento pandémico, permite simular 
las condiciones bajo las cuales se suscitó el fenómeno biológico que 
sustenta este trabajo. Para tal fin, se estudió el efecto citopático 
adquirido por las células MDCK tras la infección con el virus a 
49	
	
diferentes tiempos, el cual pudo apreciarse a partir de los cambios en 
las características morfológicas de las células. Asimismo, la 
acumulación de diaminobencidina oxidada confirió a las células 
infectadas una coloración desde sepia hasta café oscuro, la cual 
aumentaba gradualmente en función de los niveles de proteína M2 
acumulada, dada a partir del reconocimiento de ésta por el 
anticuerpo primario específico y la detección correspondiente por el 
anticuerpo secundario conjugado con una peroxidasa. 
A 
 
B 
 
C 
 
D 
 
Figura 2. Evaluación de la infectividad de Influenzavirus A(H1N1)pdm09 en la línea 
celular MDCK a 24h post-infección. Las imágenes muestran la detección por inmunocitoquímica 
de la proteína viral M2 en microcultivos de células MDCK infectadas a una MOI = 1, utilizando como 
anticuerpo primario un IgG monoclonal de ratón y como secundario un IgG anti-murino conjugado 
con peroxidasa de rábano. Los tratamientos fueron los siguientes: A) Sin anticuerpo primario, Sin 
virus. B) Sin anticuerpo primario, Con virus. C) Con anticuerpo primario, Sin virus. D) Con anticuerpo 
primario, Con virus. Se observan células positivas sólo en presencia de virus y de anticuerpo primario 
(D). Las fotografías fueron adquiridas con un objetivo 40x, las células pueden observarse de forma 
individual por la tinción nuclear con hematoxilina. 
50	
	
Este experimento de Inmunocitoquímica permitió notar el efecto 
citopático en cultivo a las 24h post-infección mediante la observación 
de un morfología celular alargada, la cual es normalmente atípica 
para esta línea celular. Dicha morfología cambia de nueva cuenta 
conforme progresa la infección, lo que causa la acumulación de 
proteínas virales y el redondeamiento de la célula, tras lo cual ésta se 
retrae y se desprende (Figura 2D). En consecuencia queda la matriz 
extracelular expuesta, observándose placas de lisis después del 
desprendimiento; esto compromete la integridad de la monocapa y 
deja vulnerables a las células remanentes para posteriores 
interacciones conidiales. Así, tanto la coloración sepia observada en 
algunas células aisladas, como la presencia de dicho fenotipo 
alargado en éstas, son evidencias de la acumulación de la proteína 
viral M2, así como del daño ejercido por el virus en éstas durante la 
infección, respectivamente (Figura 2D). 
 
Réplicas de este experimento fueron realizadas a diferentes tiempos 
post-infección. Si bien los ensayos correspondientes a tiempos 
previos a 24hpi (6h y 12h post infección) no manifestaron efecto 
citopático ni una acumulación significativa de proteína viral M2 (datos 
no mostrados). A tiempos iguales o mayores a 24h post-infección, se 
detectó una correlación positiva entre el tiempo transcurrido desde el 
inicio del experimento y el número de células con evidencias de 
acumulación de proteína viral. Por ello, éstas fueron contadas y los 
51	
	
números resultantes fueron considerados para realizar una cinética 
de infección. Como es de esperarse, el número de células infectadas 
es proporcional a la magnitud del valor de MOI utilizado. El 
incremento en el número de células infectadas se aprecia 
notablemente a partir de 48hpi, independientemente del valor de 
MOI. Esto indica que las células MDCK permiten la replicación 
eficiente del virus de Influenza (Figura 3). 
 
En la infección a MOI = 1, el total (100%) de las células mostró algún 
nivel de expresión de proteína viral a 72hpi, lo que corresponde a una 
 
 
Figura 3. Cinética de Infección de células MDCK con la cepa 2009-Cosío de Influenzavirus 
A(H1N1)pdm09 a 24, 48 y 72hpi. La gráfica describe la relación entre el tiempo de infección y el 
número de células altamente positivas a la proteína viral M2 reveladas por inmunocitoquímica y 
descritas en el texto como (++). La acumulación de proteínas y el cambio morfológico de estas 
células es indicativo de la producción de partículas virales infectivas. Se emplearon las siguientes 
condiciones de infección: Sin estímulo = rombos azules (línea punteada); MOI 0.1= cuadrados 
anaranjados (línea de puntos y guiones); MOI 1 = triángulos grises (línea de guiones); MOI 5 = 
cruces amarillas (línea sólida). Se muestra el promedio del número de células (++) por cada 100 
totales contadas en ocho campos elegidos al azar. El incremento observado en todas las condiciones 
de infección es indicativo de la capacidad de las MDCK para producir partículas virales infectivas. 
-2 
3 
8 
13 
18 
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A
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+
+
) 
Tiempo post-infección (Horas) 
Cinética de Infección - Células MDCK 
52	
	
infección 1:1. Bajo el microscopio fue posible apreciar un incremento 
paralelo en el número de células con un fenotipo positivo a la 
infección por IVA con respecto al tiempo, tanto en aquellas con 
coloración café (++) como en el caso de aquellas con un fenotipo 
sepia (+). No obstante, el efecto citopático es sugestivo de la 
producción viral más evidentemente en las células con un fenotipo 
café (++), debido a lo cual éstas fueron contadas para así obtener un 
gráfico que describiera la cinética de infección (Figura 3). 
 
El incremento en el número de células con gran cantidad de proteína 
M2 acumulada (++) puede significar que las células infectadas 
detienen la diseminación viral hasta el momento en el que mueren 
por la exocitosis masiva, conteniendo a las partículas virales antes de 
tal evento. La presencia simultánea de células con alta y baja 
expresión de la proteína viral M2 podría deberse a la heterogeneidad 
poblacional de las células MDCK, generando diferencias intrínsecas en 
la producción viral 41. Ya que el tamaño del inóculo inicial limita el 
número de eventos de infección posibles durante el primer contacto 
entre el virus y las células, emplear un valor de MOI pequeño permite 
mantener un mayor número de células disponibles para posteriores 
ciclos de replicación. Esto significa que para una menor proporción de 
infección inicial existe potencialmente un mayor rendimiento de 
producción viral, lo cual se traduce como la posibilidad de cosechar 
títulos virales más altos a tiempos posteriores a 72hpi. Debido a ello, 
53	
	
se infectaron los cultivos con una MOI = 0.1 para la obtención del 
lote viral a ser evaluado durante la fase de experimentación 
posterior, el cual reflejó consistentemente un título de 1:256 tras la 
titulacióncorrespondiente, indicando que dichas condiciones de 
infección y tiempo de cosecha son óptimas para la producción de 
partículas virales (datos no mostrados). 
 
En conjunto, los anteriores resultados indican que la línea celular 
MDCK es permisiva a la infección por Influenzavirus A, evidenciando 
que el proceso infectivo de este último es más evidente a partir de 
24hpi y genera la máxima cantidad posible de viriones a tiempos 
posteriores a 72hpi. Estos resultados asimismo validan la utilidad de 
las células MDCK como huéspedes adecuados para la producción in 
vitro de partículas virales y la accesibilidad que la titulación por 
hemaglutinación brinda al cálculo posterior de MOI dada la exactitud 
con la cual estima el número de partículas virales infectivas por 
volumen de sobrenadante. 
 
IV.2 – Infectividad de las células A549. El linaje celular A549 
es permisivo a la infección por la cepa 2009-Cosío de 
Influenzavirus A(H1N1)pdm09 y alcanza un porcentaje de 
infección del 100% a 24hpi con MOI = 1. 
Una vez sentada la base de producción vírica, se procedió a validar la 
infectividad de la línea celular A549. Si bien las referencias 
54	
	
consideradas han indicado repetidamente que dicho linaje celular es 
susceptible a la infección por Influenzavirus A, se realizó este 
experimento para cerciorarse de que las condiciones experimentales 
a ser empleadas posteriormente permitirían observar cambios 
celulares atribuibles a la infección viral. 
 
Para tal fin se realizaron ensayos de Inmunocitoquímica a 
microcultivos de células A549 infectadas con la cepa 2009-Cosío de 
Influenzavirus A(H1N1)pdm09 utilizando valores de MOI diferentes y 
A 
 
B 
 
C 
 
D 
 
Figura 4. Evaluación de la infectividad de Influenzavirus A(H1N1)pdm09 en la línea celular 
A549. Las imágenes muestran la detección por inmunocitoquímica de la proteína viral M2 en microcultivos 
de células MDCK infectadas a una MOI = 1, utilizando como anticuerpo primario un IgG monoclonal de 
ratón y como secundario un IgG anti-murino conjugado con peroxidasa de rábano. Los tratamientos fueron 
los siguientes: A) Sin anticuerpo primario, Sin virus. B) Sin anticuerpo primario, Con virus. C) Con 
anticuerpo primario, Sin virus. D) Con anticuerpo primario, Con virus. Se observan células positivas sólo en 
presencia de virus y de anticuerpo primario (D). Las fotografías fueron adquiridas con un objetivo 40x, las 
células pueden observarse de forma individual por la tinción nuclear con hematoxilina. 
55	
	
distintos tiempos de infección. Dichos ensayos ponen de manifiesto el 
efecto citopático que el virus ejerce sobre las células, las cuales 
sufren un cambio morfológico al retraerse del resto de la monocapa, 
para posteriormente redondearse (Figura 4D) y finalmente 
desprenderse, dejando huecos y provocando el alargamiento de las 
células circundantes (Figura 4B). Asimismo, la acumulación de la 
proteína viral M2 es puesta en evidencia mediante la coloración sepia 
producida por la diaminobencidina oxidada, la cual fue observada 
tanto en el citosol como en las membranas de las células en cuestión 
(Figura 4D). La literatura indica que esta proteína se localiza en la 
membrana celular durante el ciclo de replicación viral de 
Influenzavirus A, dado que su actividad puede solamente llevarse a 
cabo cuando se encuentra embebida en envoltura lipídica del virión, 
una vez que el ensamblaje de nuevas partículas virales sucede 3. 
 
Tabla 1. Comparación del número de células altamente positivas (++) obtenidas 
por infección con MOI=1 en las líneas celulares MDCK y A549. 
Los datos mostrados en las celdas 
sombreadas se grafican en la Figura 2. Las 
células A549 muestran una menor 
proporción de células productoras de 
viriones a los tiempos estudiados. 
 
Las réplicas de este experimento a mayores tiempos post-infección 
mostraron una relación positiva entre el tiempo transcurrido después 
de la infección inicial y el incremento progresivo en el número de 
células exhibiendo un fenotipo propio de las etapas finales de la 
infección viral, es decir, con morfología y niveles de M2 semejantes a 
 24hpi 48hpi 72hpi 
MDCK (++) 1.5 1.75 10 
A549 (++) 0.5 2 2.75 
56	
	
los observados en las células MDCK con fenotipo (++) (Tabla 1). Los 
resultados recabados por este ensayo indican que en este modelo 
celular también existe una correlación positiva entre la magnitud del 
inóculo inicial y el número de células positivas a la infección por el 
virus. Como puede observarse, los microcultivos inoculados con una 
MOI = 1 revelan un aumento significativo en el número de células 
positivas a la infección (Figura 5A), pudiéndose apreciar el efecto 
incluso a 72hpi. Asimismo, el incremento en el número de células 
ligeramente positivas a la infección (+) alcanzó valores del 100% a 
24hpi (Figura 4D; Tabla 1). 
 
 
Figura 5. Cinética de Infección de células A549 con la cepa 2009-Cosío de 
Influenzavirus A(H1N1)pdm09 a 24, 48 y 72hpi. La gráfica describe la relación entre el 
tiempo de infección y el número de células altamente positivas a la proteína viral M2 reveladas 
por ICQ y descritas en el texto como (++). La acumulación de proteínas y el cambio morfológico 
de las células es indicativo de la producción de partículas virales infectivas. Se emplearon las 
siguientes condiciones de infección: Sin estímulo = rombos azules (línea punteada); MOI 0.1= 
cuadrados anaranjados (línea de puntos y guiones); MOI 1 = triángulos grises (línea de guiones); 
MOI 5 = cruces amarillas (línea sólida). Se muestra el promedio del número de células (++) por 
cada 100 contadas en ocho campos al azar. Se observa que, a diferencia de las células MDCK, las 
A549 sólo son productoras de virus a multiplicidades de infección elevadas. 
0 
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) 
Tiempo post-infección (Horas) 
Cinética de Infección - Células A549 
57	
	
Lo anterior es sugestivo de que las células no solamente son 
permisivas a la infección por el virus, sino que además una 
subpoblación de ellas permite la gemación de nuevos viriones 
conforme el curso de la infección progresa, manifestándose en el 
virus como una mayor eficiencia de diseminación. Sin embargo, y a 
diferencia de la línea celular MDCK, las células A549 infectadas a MOI 
= 5 aumentan con el progreso de la infección y posteriormente bajan 
en número a 72hpi (Figura 5A). La razón de esto puede ser el fuerte 
efecto citopático que el virus ejerce sobre la monocapa, causando que 
múltiples células se desprendan y mueran, no pudiendo ser 
visualizadas durante el proceso de conteo. Conjuntamente, los datos 
que este experimento brinda indican que la línea celular A549, 
proveniente de epitelio alveolar, es un modelo permisivo a la 
infección. Además, la cinética de infección nos permitió establecer 
que el efecto de esta interacción es evidente a partir de las 24hpi, 
debido a lo cual dicho tiempo fue elegido como referencia para 
estudiar los fenómenos biológicos bajo escrutinio en experimentos 
posteriores. 
 
IV.3 – Ensayos de adhesión conidial. Los experimentos de 
adhesión conidial permiten observar la adherencia de 
Aspergillus fumigatus a monocapas de células A549. 
Para poder adaptar los experimentos propuestos por DeHart y 
colaboradores 37 a las preguntas científicas que este estudio pretende 
58	
	
abordar, se realizaron ensayos de adhesión conidial preliminares con 
la intención de implementarlos de acuerdo con las condiciones locales 
y usando el material biológico disponible en el laboratorio (células 
epiteliales y hongo). Una vez que la cepa fúngica fue crecida durante 
3 días (Figura 6A), los propágulos de ésta fueron obtenidos, 
cuantificados, suspendidos y almacenados como se describe en la 
sección de Procedimiento Experimental. Posteriormente, una placa de 
6 pozos con