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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE CIENCIAS Evaluación de la inhalación de vanadio como generador de estrés oxidante y determinación del efecto antioxidante de la carnosina en células testiculares de ratones CD-1 T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: BIÓLOGA P R E S E N T A : MARIANA HERNÁNDEZ PÉREZ DIRECTOR DE TESIS: M. EN C. MARTHA PATRICIA BIZARRO NEVARES CIUDAD..UNIVERSITARIA,.CD..MX. 2017 Margarita Texto escrito a máquina UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 2 Hoja de datos del Jurado 1. Datos de la alumna Apellido paterno Apellido materno Nombre(s) Teléfono Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Ciencias Carrera Número de cuenta 2. Datos del tutor Grado Nombre(s) Apellido paterno Apellido materno 3. Datos del sinodal 1 Grado Nombre(s) Apellido paterno Apellido materno 4. Datos del sinodal 2 Grado Nombre(s) Apellido paterno Apellido materno 5. Datos del sinodal 3 Grado Nombre(s) Apellido paterno Apellido materno 6. Datos del sinodal 4 Grado Nombre(s) Apellido paterno Apellido materno 1. Datos de la alumna Hernández Pérez Mariana 044 (55) 45 84 18 41 Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Ciencias Biología 308280032 2. Datos del tutor M. en C. Martha Patricia Bizarro Nevares 3. Datos del sinodal 1 Dra. Marcela Rojas Lemus 4. Datos del sinodal 2 Dra. Patricia Rivas Manzano 5. Datos del sinodal 3 Dra. Teresa Imelda Fortoul Vander Goes 6. Datos del sinodal 4 Dr. Luis Felipe Jiménez García 3 7. Datos del trabajo escrito Título Subtítulo 7. Evaluación de la inhalación de vanadio como generador de estrés oxidante y determinación del efecto antioxidante de la carnosina en células testiculares de ratones CD-1. Número de páginas Año 65 2017 4 Dedicatorias A Dios, por darme todas las bendiciones que alguien pueda desear, por hacerme tener fe en Él y en la vida, por ponerme siempre en el mejor lugar, en aquel donde debo estar, pero sobre todo por hacerme tan fuerte ante las situaciones más difíciles. A mi familia: a mis padres por ser el motor y el carril para perseverar, para continuar siempre en el camino, por darme el mejor instructivo para vivir y brindarme las mejores herramientas para usar, por darme su apoyo hoy y siempre. A mi hermana por mostrarme que también los pequeños pueden darnos ejemplos de vida. A la vida, por hacerme anhelar siempre más, por mostrarme que sí es posible aunque el camino sea difícil, que aún al destino más complejo sé es posible llegar. Gracias por permitirme cerrar un ciclo tan importante y arrancar nuevas metas. A ti, mi bella Universidad, por abrirme tus puertas, por acogerme con calidez y permitirme sentirme tan orgullosa de ti, por hacerme sentir esta satisfacción y felicidad de formarme en esta carrera. Simplemente gracias por darme los mejores momentos, recuerdos y vivencias, por hacerme sonreír al pensar que tú también fuiste mi casa. A mi Facultad de Ciencias, eternamente en el corazón, por ofrecerme el mejor conocimiento y por para siempre ser, mi alma máter. A Ana Rosa, Lucy, Bonny, Denn y Danya por ser mis confidentes, por ser mis siempre mejores amigas, por hacerme reír aún en los peores momentos y animarme para lograr este tan importante paso. A mis mejores amigos de la Facultad, Ale y Gerardo, por hacerme reír tanto y ser mis cómplices en toda la carrera, por hacerme loca y divertida esta aventura. Finalmente, a mi persona favorita Carlos Sosa, por estar siempre en todos mis momentos, en todos mis modos. Por ser un pilar tan importante para motivarme y para alentarme en todo momento tanto profesional como personal, gracias de corazón. 5 Agradecimientos Gracias sinceras a mi tutora de tesis Patty Bizarro, por brindarme su apoyo, el mejor conocimiento y la guía perfecta para acertar en el proceso de titulación. Sin este último impulso, no habría sido posible. Gracias Patty. A la Dra. Laura Colín Barenque y a la Dra. Marcela Rojas, por guiarme y brindarme su apoyo durante mi preparación y desarrollo de la tesis. A la Dra. Teresa Fortoul por recibirme en el laboratorio y hacerme parte de un nuevo camino para concluir uno de los ciclos más importantes de mi vida. A mis compañeras Susy, Kat, Edith y Bren por hacer amena la estancia en el laboratorio y colaborarnos en las ideas para perfeccionar nuestros proyectos. Por apoyarnos en el cuidado de nuestros ratoncitos y en nuestras presentaciones. A los biólogos Francisco Pasos Nájera y Armando Zepeda Rodríguez por brindarme el mejor apoyo en la toma de fotomicrografías para este proyecto. A la técnica Académica Raquel Guerrero Alquicira por el apoyo para el procesamiento de muestras y el procedimiento histológico. Al MVZ Enrique Pinzón Estrada y al MVZ Ismael Torres Saldaña, personal del bioterio de la Facultad de Medicina por su apoyo en la obtención de los animales experimentales. A la Dirección General de Asuntos del Personal Académico DGAPA, por el financiamiento de la tesis a través de los proyectos PAPIIT IN 220414 Y PAPIIT IN 211315. 6 Evaluación de la inhalación de vanadio como generador de estrés oxidante y determinación del efecto antioxidante de la carnosina en células testiculares de ratones CD-1 7 1. Índice 1. Índice ............................................................................................................................................................. 7 2. Tabla de Abreviaturas ........................................................................................................................... 9 3. Resumen .................................................................................................................................................. 11 4. Introducción ............................................................................................................................................. 13 4.1 Contaminación atmosférica en la Zona Metropolitana del Valle de México ................. 13 4.1.1 Partículas Suspendidas ................................................................................................................... 14 4.1.2 Partículas menores a 10 μm (PM10) ........................................................................................ 17 4.1.3 Partículas menores a 2.5 μm (PM2.5) ..................................................................................... 17 4.1.4 Daños Tóxicos por Partículas Suspendidas ......................................................................... 18 4.1.5 Partículas Suspendidas y Metales ............................................................................................. 19 4.2 Generalidades del Vanadio .....................................................................................................................20 4.2.1 Usos del vanadio ................................................................................................................................. 21 4.2.2 Daños por exposición a Vanadio ................................................................................................ 21 4.2.3 Metabolismo y Toxicidad del Vanadio ..................................................................................... 24 4.2.4 Mecanismos de Acción del Vanadio ......................................................................................... 25 4.3 Estrés oxidante .............................................................................................................................................. 27 4.3.1 Estrés oxidante inducido por vanadio ...................................................................................... 28 4.4 Peroxidación Lipídica ................................................................................................................................. 29 4.5 Antioxidantes .................................................................................................................................................. 30 4.5.1 Carnosina ................................................................................................................................................ 30 4.5.2 Metabolismo de la Carnosina ....................................................................................................... 32 4.6 Reprotoxicidad por Vanadio ................................................................................................................... 33 4.7 Aparato reproductor masculino ............................................................................................................. 35 4.7.1 El Testículo de ratón ......................................................................................................................... 35 4.7.2 Túbulos seminíferos y células de Leydig ............................................................................... 36 5. Justificación ............................................................................................................................................. 38 6. Hipótesis ................................................................................................................................................... 38 7. Objetivos ................................................................................................................................................... 38 7.1 Objetivo general ............................................................................................................................................ 38 7.2 Objetivos particulares ................................................................................................................................. 39 8. Método ....................................................................................................................................................... 40 8.1 Modelo de inhalación ................................................................................................................................. 40 8.2 Inmunohistoquímica para 4-hidroxinonenal ................................................................................... 41 8.3 Toma de fotomicrografías ........................................................................................................................ 42 8.4 Análisis Densitométrico ............................................................................................................................. 42 9. Resultados ............................................................................................................................................... 44 9.1 Peroxidación lipídica inducida por estrés oxidante .................................................................... 44 9.1.1 Túbulos seminíferos .......................................................................................................................... 44 9.1.2 Células de Leydig ............................................................................................................................... 46 8 10. Discusión ............................................................................................................................................... 49 10.1 Túbulos seminíferos ................................................................................................................................. 49 10.2 Células de Leydig ...................................................................................................................................... 50 10.3 Carnosina ...................................................................................................................................................... 52 11. Conclusiones ....................................................................................................................................... 54 12. Perspectivas ......................................................................................................................................... 55 13. Bibliografía ............................................................................................................................................ 56 13.1 Referencias de Internet .......................................................................................................................... 65 9 2. Tabla de Abreviaturas 4-HNE 4-Hidroxinonenal ADN Ácido desoxirribonucleico H2SO4 Ácido sulfúrico ATP Adenosín Trifosfato ANOVA Análisis de varianza CN1 Carnosinasa 1 ubicada en el suero CN2 Carnosinasa 2 ubicada en el citosol CAT Catalasa CMYK Cian Magenta Amarillo Negro CdCl2 Cloruro de cadmio COV Compuestos Orgánicos Volátiles DAB Diaminobencidina SO2 Dioxido de Azufre CO2 Dioxido de Carbono NO2 Dioxido de Nitrógeno ERO Especies Reactivas de Oxígeno gas LP Gas licuado de Petróleo GPX Glutatión peroxidasa GHS Glutatión g gramos ROOR Hidroxiperóxido FSH Hormona foliculo estimulante LH Hornona luteinizante HRP Horseradish peroxidase Kg kilogramo lb libras ROOH Lipoperóxido NaVO3 Metavanadato M metro msnm metros sobre el nivel del mar m micras µg microgramos µm micrómetros µM micromolar 10 Mg miligramo mM milimolar M Molar CO Monóxido de Carbono ng nanogramo NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido O2 Oxígeno O3 Ozono ppm partes por millón PM2.5 Partículas suspendidas menores a dos punto cinco micrómetros PM1 Partículas suspendidas menores a un micrómetro PM Partículas Suspendidas o material particulado PST Partículas Suspendidas Totales V2O5 Pentóxido de Vanadio H2O2 Peróxido de hidrógeno PBS Phosphate Buffered Saline K Potasio O2− Radical anión superóxido OH· Radical hidroxilo ROO Radical peroxilo RL Radicales libres redox Reacciones de oxidación-reducción SNC Sistema Nervioso Central Na Sodio SOD Superóxido dismutasa V2O4 Tetraóxido de vanadio TH Tirosina hidroxilasa PEPT 1 Y 2 Transportador de oligopéptidos V5+ Vanadato V4+ Vanadilo V Vanadio ZMVM Zona Metrpolitana del Valle de México ZO zonula ocluddens 11 3. Resumen La disminución de la calidad del aire en la Zona Metropolitana del Valle de México (ZMVM), es actualmente uno de los grandes problemas que enfrentan sus pobladores, ya que es una consecuencia de las actividades tanto naturales (incendios forestales) como antropogénicas (actividad industrial). Alrededor de 175 000 toneladas es la cantidad de contaminantes gaseosos que predominan en la atmósfera, entre los que se encuentran: el ozono (O3), el monóxido de carbono (CO), dióxido de carbono (CO2), dióxido de nitrógeno (NO2), dióxido de azufre (SO2)y las partículas suspendidas totales (PST), a las cuales se adosan metales pesados como el vanadio (V). El daño a la salud generado por las PST radica en su radio aerodinámico, pues las partículas finas y ultrafinas: menores a 2.5 µm (PM2.5) y 1 µm (PM0.1) son las que inducen mayor toxicidad al penetrar más profundamente en el sistema respiratorio. Como resultado de la quema de combustibles fósiles se encuentra la emisión anual de alrededor de 65 000 toneladas de vanadio a la atmósfera, lo cual provoca que los seres humanos lo inhalen día a día en la forma más común, como pentóxido de vanadio (V2O5), al ser esta la vía de mayor absorción, altera el sistema antioxidante a través de la generación de radicales libres (RL) y especies reactivas de oxígeno (ERO), que es uno de sus principales mecanismos de acción y que a su vez producen estrés oxidante y peroxidación lipídica. Sin embargo, para contrarrestar el daño ocasionado por los agentes oxidantes, los mecanismos antioxidantes del organismo tienen la capacidad de prevenir o disminuir el daño causado por estrés oxidante. Dentro de los antioxidantes endógenos, los cuales son producidos por la propia célula se encuentra la carnosina, un dipéptido formado por β−alanina y L-histidina que se localiza en el cerebro y en el músculo esquelético y genera una función protectora contra el daño oxidante de los radicales libres si se administra de manera exógena, al reducir la actividad de la enzima tirosina hidroxilasa (TH), la cual es una de las que participa en inducir el estrés oxidante. Por lo que el objetivo principal de este estudio fue determinar el efecto antioxidante de la carnosina sobre la producción de estrés oxidante en túbulos seminíferos y células de Leydig con y sin exposición a inhalación subaguda de vanadio en ratones CD-1, mediante la técnica de inmunohistoquímica para 4-hidroxinonenal (4-HNE). Para lo cual se utilizaron 40 ratones adultos de la cepa CD-1, divididos en cuatro grupos: control, vanadio, vanadio + carnosina y carnosina, los grupos que inhalaron V2O5 lo hicieron a una concentración de 0.02 M (1436 µg/m3) una hora, dos veces por semana, durante cuatro semanas; y los grupos administrados con carnosina fueron a una concentración de 1mg x kg al día, por vía oral, durante cuatro semanas. Al término de los tratamientos, los animales fueron sacrificados y se obtuvieron los testículos de todos los ratones. Se realizó la técnica de inmunohistoquímica para 4-hidroxinonenal y se identificaron los túbulos seminíferos y las células de Leydig en un microscopio de campo claro y se tomaron fotomicrografías en un objetivo de 40X para los túbulos seminíferos y en un objetivo de 100X para las células de Leydig. Las imágenes fueron procesadas y analizadas en un programa digital para diferenciar la mínima y máxima intensidad de marca del cromógeno en las células. 12 Finalmente se realizó un análisis estadístico con la prueba de varianza ANOVA y post-hoc Tukey con el programa estadístico GraphPad Prism 5 para identificar diferencias estadísticas entre los grupos. Los resultados mostraron que en los túbulos seminíferos el porcentaje de intensidad de marca del grupo vanadio (7.28%) fue mayor que la intensidad de los grupos control (5.06%), vanadio + carnosina (4.01%) y carnosina (2.22%), para las células de Leydig se observó que el porcentaje de intensidad de marca para el grupo vanadio (22.43%) fue mayor que la intensidad de los grupos control (14.29%), vanadio + carnosina (17.11%) y carnosina (6.19%). En este trabajo se comprobó que el vanadio genera estrés oxidante en las células de los túbulos seminíferos y en las células de Leydig. Asimismo, se vio que la carnosina mostró su poder antioxidante en las células testiculares al disminuir el daño por la inhalación de vanadio al administrarlo en un periodo subagudo de inhalación. Además, se mostró que por sí sola no muestra efectos tóxicos y disminuye el estrés oxidante, ya que los grupos tratados con vanadio y carnosina presentaron menor peroxidación lipídica comparados con los grupos controles. Palabras clave: Contaminación atmosférica, partículas suspendidas, pentóxido de vanadio, estrés oxidante, 4-hidroxinonenal, carnosina, túbulos seminíferos, células de Leydig. 13 4. Introducción 4.1 Contaminación atmosférica en la Zona Metropolitana del Valle de México Desde hace algunas décadas, México se enfrenta a una serie de problemas ambientales que han tenido gran impacto en la población mexicana, uno de los principales es la contaminación atmosférica, pues la humanidad ha buscado el disfrute de una vida con mayor bienestar y comodidad, sin embargo, este desarrollo ha sido la causa de consumos masivos de recursos naturales, así como de la generación de emisiones contaminantes a la atmósfera ocasionando una degradación ambiental, en particular la disminución de la calidad del aire (SEMARNAT, 2013). La atmósfera es la capa gaseosa que rodea al planeta, está constituida por una mezcla de gases (aire) y otras sustancias y es el resultado de un largo proceso evolutivo. La contaminación del aire es el proceso de pérdida de pureza por la introducción de gases y partículas en niveles tales que pueden alterar su composición natural, representando un riesgo importante a la salud humana y ecosistemas biológicos (SEDEMA, 2015). La calidad del aire está relacionada directamente con el volumen y características de los contaminantes emitidos. La contaminación atmosférica ocurre como consecuencia de una gran cantidad de actividades que se desarrollan de manera cotidiana a escala individual como pueden ser la quema de basura, el uso de vehículos automotores, la quema de combustibles fósiles y a escala natural como las erupciones volcánicas e incendios forestales (Suk, et. al., 2007) así como a la presencia de asentamientos poblacionales, vialidades y áreas de vegetación, debido a que se estiman altas emisiones de compuestos orgánicos volátiles (COV) generadas por árboles, plantas y cultivos durante los incendios (SMA-GDF, 2010). Se ha reportado que los vehículos, la industria y los servicios de la Ciudad de México, emiten alrededor de 175 000 toneladas de contaminantes gaseosos en forma de partículas, generados principalmente por la quema de combustibles fósiles (SEDEMA, 2015). 14 La cuenca del Valle de México está ubicada a una altura media de 2 240 metros sobre el nivel del mar (msnm), se encuentra rodeada de una cadena montañosa integrada por las formaciones de las sierras de Monte Bajo, de las Cruces, Chichinautzin, Nevada y del Río Frío. Debido a la altitud de la cadena montañosa, el contenido de oxígeno (O2) del aire es 23% menor en la Zona Metropolitana del Valle de México (ZMVM) que al nivel del mar, lo que contribuye a que los procesos de combustión sean menos eficientes y emitan una mayor cantidad de contaminantes (SMA-GDF, 2006). La capacidad de la ZMVM para soportar la carga de emisiones contaminantes, además de las actividades humanas, está relacionada con sus características fisiográficas y climáticas, las cuales determinan los flujos atmosféricos y la dinámica de los compuestos contaminantes (SMA-GDF, 2010). Durante la temporada seca se presentan los mayores niveles de contaminación, mientras que durante la temporada de lluvia los niveles se reducen significativamente, debido a que la lluvia remueve eficientemente las partículas (SEDEMA, 2015). En el caso particular de México, destaca la Zona Metropolitana del Valle de México como la más documentada y más conocida por sus efectos de contaminación atmosférica a nivel local, regional y global. A nivel local en la salud de las personas, a nivel regional en la afectación de los bosques y ecosistemas acuáticos y a nivel global en el cambio climático (SMA-GDF, 2010). La contaminación del aire se ha relacionado con dañosen el aparato respiratorio, ruptura de la cadena del ácido desoxirribonucleico (ADN), mutaciones inducidas, morfología anormal de los espermatozoides y reducción del rendimiento espermático en los hombres (Somers, 2011). Se ha descrito que los contaminantes que se encuentran en el ambiente se asocian con efectos adversos en la reproducción masculina, generando alteraciones en los espermatozoides e infertilidad por afectaciones en las funciones del testículo, epidídimo y órganos accesorios (Saradha y Mathur, 2006). 4.1.1 Partículas Suspendidas Las partículas suspendidas totales (PST) por sus siglas en español, están formadas por un núcleo de carbón y por compuestos orgánicos e inorgánicos, adheridos a su superficie (NOM-025-SSA1-2014), hacen referencia a una mezcla heterogénea compuesta de materiales sólidos y líquidos suspendidos en el aire, pueden variar significativamente en tamaño, forma y composición química en el tiempo y en el espacio (Suk, et. al., 2007). 15 Su tamaño varía desde 0.005 hasta 100 micras de diámetro aerodinámico; esto es, desde unos cuantos átomos hasta aproximadamente el grosor de un cabello humano. Las partículas primarias son emitidas directamente de la fuente natural (PM2.5) y las secundarias (precursores de PM2.5), aquellas que se forman con sustancias como óxidos de nitrógeno, óxidos de azufre, amoniaco, compuestos orgánicos, entre otros que reaccionan en la atmósfera (Suk, et. al., 2007). Las partículas suspendidas son componentes que forman parte de la gran cantidad de los contaminantes de la atmósfera, además de los diversos gases como el ozono, monóxido de carbono, dióxido de nitrógeno, dióxido de azufre (Suk, et. al., 2007). De acuerdo a la Comisión para la Cooperación Ambiental de América del Norte en 2013, las partículas suspendidas se clasifican por su radio aerodinámico. Las partículas suspendidas totales son menores a 100 µm: las partículas finas son menores a 10 µm (PM10) y 2.5 µm (PM2.5) de diámetro y las ultrafinas son menores a 1 µm (PM0.1) (SMA- GDF 2010). El tamaño es un parámetro importante para caracterizar su comportamiento en la atmósfera y la concentración a la que puede estar expuesta la población (NOM-025- SSA1-2014). Dependiendo del tamaño, es el tiempo que permanecen suspendidas en el aire, las partículas más grandes, con tamaños entre 50 y 100 µm, permanecen durante algunos minutos y tienden a depositarse cerca de su lugar de origen, mientras que las partículas más pequeñas, menores a 2.5 µm, pueden permanecer durante días o semanas suspendidas en el aire viajando cientos de kilómetros, antes de depositarse (SEDEMA, 2015 y SMA-GDF, SMAGEM, SEMARNAT, SS, 2011). De acuerdo a los patrones meteorológicos, se han identificado tres temporadas: la temporada de ozono, la temporada de lluvia y la temporada de partículas. Esta última se caracteriza por el aumento en las concentraciones de PST (PM10 y PM2.5) y otros contaminantes primarios, provocados por inestabilidad atmosférica, inversiones térmicas de superficie y el descenso de temperatura y humedad (SEDEMA, 2015). Las partículas suspendidas son resultado de actividades naturales y actividades antropogénicas. En cuanto a las actividades naturales se encuentran la polinización de las plantas, procesos geológicos e incendios forestales y en las actividades antropogénicas se encuentran la quema de combustibles fósiles y la fertilización de campos agrícolas que tienen implicaciones tanto locales como globales, de los cuales los más importantes son los efectos en la salud pública y en los ecosistemas naturales (Suk, et. al., 2007), así 16 como problemas en las vialidades pavimentadas, generadas por el intenso flujo vehicular que se desarrolla en ellas (SMA-GDF, 2010). Los valores límite para las concentraciones de partículas suspendidas en la ZMVM están regulados por la Norma Oficial Mexicana para PM10 y PM2.5 (NOM-025-SSA1-2014). Para efectos de protección de la salud se establecen dos valores límite, para ambas concentraciones en el aire: para PM10, el límite promedio de 24 horas es de 75 µg/m3 y el límite promedio anual es de 40 µg/m3. Para PM2.5, el límite promedio de 24 horas es de 45 µg/m3 y el límite promedio anual es de 12 µg/ m3. A partir del 2015 la NOM ya no requiere la medición de las PST. A pesar de la reducción que se ha conseguido en los últimos años, los niveles de PM10 y PM2.5 aún superan los límites permisibles, para PM10 se han superado con una concentración de 107 µg/m3 promedio de 24 horas y con una concentración de 52.6 µg/m3 promedio anual. Para PM2.5 se han superado con una concentración de 51 µg/m3 promedio de 24 horas y con una concentración de 26.6 µg/m3 promedio anual (SEDEMA, 2015) (Tabla 1). Tabla 1. Comparación de las concentraciones de PM10 y PM2.5 con los límites permisibles de la Norma Oficial Mexicana. NOM-025-SSA1-2014 PM10 Y PM2.5 Promedio 24 horas Anual Límite permisible PM10 75 µg/m3 40 µg/m3 Concentración superada en la ZMVM 107 µg/m3 52.6 µg/m3 Límite permisible PM2.5 45 µg/m3 12 µg/m3 Concentración superada en la ZMVM 51 µg/m3 26.6 µg/m3 (Concentraciones recuperadas de SEDEMA, 2015 y la NOM-025-SSA1-2014). 17 4.1.2 Partículas menores a 10 µm (PM10) En la Ciudad de México las PM10 tienen distinguido comportamiento estacional durante el año, durante la temporada seca-fría del año se registraron las mayores concentraciones y durante la temporada de lluvias, las concentraciones son menores (SEDEMA, 2015). La distribución de las emisiones de PM10 depende en gran medida de la actividad vehicular sobre vialidades pavimentadas y sin pavimentar. La mayor parte de sus emisiones son generadas por el tránsito de automóviles (SMA-GDF, 2010), debido a la resuspensión de polvo durante el flujo vehicular sobre ellas, lo cual aporta casi el 46% de las emisiones totales de PM10 (SMA-GCDMX, 2014). En la ZMVM se generan más de 31 000 toneladas anuales de PM10, de las cuales el 41% (12 773 toneladas), son consideradas como las que afectan notablemente a la salud de los habitantes (SMA-GCDMX, 2014). 4.1.3 Partículas menores a 2.5 µm (PM2.5) Las partículas con un tamaño menor a 2.5 µm constituyen una fracción importante de las PM10, en la Ciudad de México representan alrededor del 50% de su masa total (SEDEMA, 2015). Las PM2.5 están formadas primordialmente por gases y por material proveniente de combustibles fósiles, está dominada por nitratos, sulfatos, compuestos orgánicos secundarios, carbón negro y metales pesados. Al igual que PM10, las PM2.5 tienen una marcada estacionalidad, con concentraciones máximas en los meses de invierno y mínimas en la temporada de lluvia (NOM-025-SSA1-2014). Entre las principales fuentes de emisión de PM2.5 se tiene a las emisiones fugitivas (pérdidas por evaporación de hidrocarburos y de gas natural), a los vehículos automotores (INE, 2012) provenientes de las vialidades pavimentadas, contribuyendo con el 12% (1 860 toneladas) de las emisiones totales del contaminante, así como a las actividades de la construcción, contribuyendo al 16% de las emisiones totales de este contaminante, a la combustión habitacional debido a la cantidad de gas LP que se utiliza en dicho sector, a los tractocamiones por el combustible que utilizan (diesel), al igual que los autobuses y camiones pesados de carga, contribuyendo con el 17% de las emisiones totales de PM2.5 (SMA-GCDMX, 2014). Las partículas ultrafinas (PM0.1) son generadas directamente por combustión de combustibles fósiles y actividad fotoquímica (NOM-025-SSA1-2014). 18 4.1.4 Daños Tóxicos por Partículas Suspendidas Actualmente la atención se centra en las partículas finas (PM10 y PM2.5) y ultrafinas (PM0.1) debido a sus efectos dañinos en la salud, pues se sabe que la principal vía de ingreso al organismo es en el mecanismo de respiración(SEDEMA, 2015). Existe una asociación directa entre el tamaño y la masa de las partículas suspendidas, con los efectos en la salud humana (SMA-GDF, SMAGEM, SEMARNAT, SS, 2011), entre más pequeñas pueden penetrar más profundamente en el tracto respiratorio (SEDEMA, 2015) y con mayor facilidad a los pulmones (Suk, et. al., 2007). Algunos estudios (Beelen, et. al., 2008) señalan un incremento en la mortalidad, relacionados con la exposición a los contaminantes atmosféricos, que han sido y continúan siendo los principales factores que contribuyen a las enfermedades crónicas y a la mortalidad, lo que repercute a la salud pública, en las enfermedades pulmonares obstructivas crónicas, enfermedades cardiovasculares, asma y cáncer de pulmón (Beelen, et. al., 2008). Se ha demostrado que la exposición a PM10 induce progresión, ruptura y desestabilización de placas ateroscleróticas en conejos hiperlipidémicos (Yatera, et. al., 2008). Se ha demostrado el aumento de la incidencia de enfermedades como tos, gripe, bronquitis, asma, infecciones por neumococo, influenza y alergias (Tapia, et. al., 2007). Las PM10 pueden entrar directamente al aparato respiratorio y depositarse en sus diferentes regiones, mientras que las PM2.5 pueden llegar a la región alveolar (Suk, et. al., 2007). Por su tamaño pueden ingresar a los pulmones y al torrente sanguíneo, produciendo efectos más severos sobre la salud en la disminución del funcionamiento pulmonar y aumento de enfermedades respiratorias, siendo los grupos más sensibles los niños, ancianos y personas con padecimientos respiratorios y cardiacos (Linares y Díaz, 2008). Estudios epidemiológicos, señalan un incremento en la mortalidad debido a complicaciones respiratorias y complicaciones cardiovasculares (Borja, et. al.,1998). 19 4.1.5 Partículas Suspendidas y Metales Los compuestos orgánicos como los hidrocarburos aromáticos policíclicos, sulfatos, nitratos y metales, forman parte de la composición general de las partículas suspendidas, ya que estos se adhieren a su superficie y son responsables de los efectos tóxicos de las partículas en los organismos vivos (NOM-025-SSA1-2014). Actualmente se asocia la exposición a la contaminación por partículas ricas en metales pesados con riesgos altos para la salud (Maher, et. al., 2008). En las PM10 se conoce que hasta el 50% de su masa es de carbón derivado de los procesos de la combustión, sin embargo, las partículas ultrafinas PM2.5 están asociadas con los metales de transición, así como con diversos componentes como el nitrógeno, azufre, cloro, materia orgánica y material geológico (Donaldson y Stone, 2003). Estudios demuestran que los metales inducen toxicidad y carcinogénesis al producir especies reactivas de oxígeno (ERO), como uno de sus principales mecanismos de acción. El exceso de radicales libres (RL) inducen la formación de peroxidación lipídica en las células (Valko, et. al., 2005). Se ha comprobado que el daño por estrés oxidante radica en las partículas que están suspendidas en el ambiente, pues estas contienen un gran número de metales solubles incluyendo metales de transición que son capaces de llevar a cabo reacciones de oxidación-reducción (redox) (Kelly, 2003). Se ha demostrado que la exposición de células pulmonares a partículas de níquel, fierro y vanadio provocan estrés oxidante, debido a que estos metales se adhieren a las partículas suspendidas y generan radicales libres, por lo que la cantidad de metal adosado a ellas puede ser un determinante principal en la respuesta inflamatoria aguda al ser estas fagocitadas por las células (Costa y Dreher, 1997). Dentro de los metales que se adosan a las partículas suspendidas que intervienen en las reacciones de oxidación y que inducen a la formación de especies reactivas de oxígeno se encuentran además del níquel, fierro y vanadio, el mercurio, cobre y cromo (Valko, et. al., 2005). 20 4.2 Generalidades del Vanadio El vanadio es un metal de transición que se emite a la atmósfera durante la quema de combustibles fósiles, es de color gris plateado y sus estados de oxidación más comunes son 3+, 4+ y 5+, siendo la forma más predominante la del V5+ (Hope, 1994). En el ambiente, se produce en la forma oxidada (5+), pero en el organismo se encuentra exclusivamente en la forma oxidada (4+) (Aragón et. al., 2005). En la corteza terrestre ocupa el lugar 22 entre los elementos más abundantes con una presencia de 0.014 a 0.02% (Rodríguez-Mercado y Altamirano-Lozano, 2006). Para los humanos la principal fuente de exposición al V es la contaminación atmosférica pues se encuentra naturalmente en los combustibles derivados del petróleo y el carbón, sus niveles en el aire dependen de las estaciones del año y de la localización geográfica. Las emisiones de V a la atmósfera se producen en zonas urbanas y lugares próximos a industrias siderúrgicas y refinerías de petróleo (García, 2006). Los petróleos de América son los que contienen más vanadio, en crudos provenientes de Venezuela las concentraciones van de 282 a 1180 µg/g y el maya de México de 243 µg/g (IPCS, 1988). Generalmente, la concentración de vanadio en zonas rurales es mucho menor que en zonas urbanas. La concentración de vanadio en las zonas rurales alejadas oscila entre 1- 2 ng V/m3 y en otras zonas rurales entre 50-60 ng V/m3 (Barceloux, 1999). Se ha reportado que la concentración de V en la zona urbana es de 0.62 mg V/m3. Y en las zonas industriales en las que se queman combustibles con un alto contenido de fósiles el vanadio puede fluctuar hasta en 64 ng/m3 (PISSQ, 1995). Se estima que se liberan anualmente al ambiente cerca de 65 000 toneladas de vanadio de las cuales un 90% se originan por la combustión de petróleo y carbón y en la industria siderúrgica (García, 2006). Los combustibles crudos contienen tazas detectables de vanadio desde menos de 1 hasta 1600 µg V/kg y las cenizas de la combustión del petróleo contienen un 80% de V2O5. Se ha reportado que consumimos alrededor de 1µg de vanadio proveniente del aire, de 1 a 30 µg proveniente de alimentos y de 1 a 30 µg de vanadio proveniente del agua bebida, generando un total de 10 a 70 µg V/día (García, 2006). 21 El pentóxido de vanadio es la forma comercial más común, forma soluciones ácidas y se disuelve en ácidos, reacciona con las bases y forma vanadatos. La producción mundial anual de vanadio es del orden de 45 millones de kilogramos (equivalente V2O5) (PISSQ, 1995). 4.2.1 Usos del vanadio La producción de aceros (al mejorar la maleabilidad, dureza y resistencia), la producción de ácido sulfúrico (H2SO4) , formación de plásticos, fabricación de pigmentos amarillos y cerámicas, son algunos de los usos del vanadio a nivel industrial, ya que reacciona fácilmente como el carbono, el nitrógeno y el oxígeno a temperaturas mayores a 300º C. Se ha encontrado una concentración elevada de vanadio en el tabaco y en el humo de tabaco, el hongo Amanita muscaria, contiene cerca de 100 ppm V (Barceloux, 1999). El pentóxido de vanadio se utiliza principalmente en la fabricación de acero, plásticos, cerámica y otros productos químicos (García, 2006). Las aleaciones no ferrosas de vanadio se emplean en las industrias nuclear y aeroespacial. El V2O5 y los vanadatos se usan en la oxidación de compuestos orgánicos, en la refinación del petróleo y en convertidores catáliticos para los gases de escape de motores de combustión interna. Los compuestos de vanadio se emplean en la fabricación de vidrio, en barnices, esmaltes para porcelana, en lacas y pinturas, así como en sustancias químicas fotográficas y luminiscentes. Se utilizan también como aditivos para hule sintético y las escorias de vanadio se usan en la fundición para mejorar la calidad de las superficies de vaciado y facilitar la limpieza (PISSQ,1995). Se ha empleado también en tratamientos contra la diabetes y la obesidad (Rodríguez-Mercado y Altamirano-Lozano, 2006). En estudios se han demostrado aplicaciones farmacológicas como la terapia del cáncer, normalización de la hipertensión, así como anticoncepción espermicida (Pepato, et. al., 2008). 4.2.2 Daños por exposición a Vanadio El vanadio como otros contaminantes atmosféricos es un compuesto no biodegradable y se redistribuye por las actividades humanas y tiende a acumularse en los ecosistemas en concentraciones que pueden ser tóxicas para los seres vivos (Eckardt, 1971). 22 La toxicidad de los compuestos del vanadio incrementa con el aumento de su valencia, los pentavalentes son los más tóxicos. Según el Programa Internacional de Seguridad Química en 2001, encontró una correlación entre los niveles de vanadio y la mortalidad producida por diversos cánceres, neumonía y bronconeumonía, así como una correlación entre los niveles de vanadio y las partículas aéreas y la incidencia de enfermedades cardiovasculares (IPCS, 1988). Los óxidos de vanadio que están presentes en las partículas finas y ultrafinas de las cenizas y polvos, están asociados con efectos adversos a la salud. En humanos, la toxicidad aguda por inhalación (0.2 a 1 µg/m3), provoca irritación de los ojos, nariz y mucosa oral, mientras que una fuerte exposición aguda causa conjuntivitis, aumento del movimiento intestinal, dermatitis, vómito, diarrea, problemas respiratorios, temblor y daño renal (IPCS, 1988). Las personas encargadas de la limpieza de calderas son las que tienen mayor exposición a vanadio pues la concentración puede ir desde los 50 a 100 µg V/m3 y alcanzar hasta los 500 µg V/m3 (Barceloux, 1999). La exposición crónica en trabajadores a vapores de vanadio por inhalación, induce cambios en los órganos respiratorios, así como la aparición de bronquitis, rinitis, laringitis y faringitis, además cambios en el ritmo cardiaco y aparición de color verdoso en la lengua. Se han reportado alteraciones en sangre como la disminución de grupos sulfhidrilo y cambios en la concentración de albúmina y del colesterol (Rodríguez-Mercado y Altamirano-Lozano, 2006). En estudios previos del Programa Nacional de Toxicología de los Estados Unidos concluyó que la exposición a partículas de V2O5 produce neoplasias malignas en ratas, así como rinitis, hemorragia nasal, tos, dolor de garganta y asma (García, 2006). En la mayor parte de los órganos humanos, el vanadio puede ser detectado en cantidades inferiores a 1µg/kg de peso húmedo. Sin embargo, la mayor cantidad la poseen los pulmones con una concentración de 19-140 µg/kg de peso húmedo y alrededor de 30 µg/litro en el suero sanguíneo (PISSQ, 1995). La sobreexposición aguda o crónica al aire con partículas de V2O5 y otros compuestos inorgánicos de vanadio dan lugar a riesgos en la salud humana, principalmente irritación en las vías respiratorias y genotoxicidad (García, 2006), así como bronquitis, neumonía, rinitis y faringitis (Fortoul, et. al., 2011). 23 Se ha demostrado en un estudio con ratas macho, que a través de la instilación intratraqueal de V2O5 durante 15 días, hay inflamación pulmonar, engrosamiento de las células del músculo liso de las vías respiratorias, metaplasia de las células mucosas y fibrosis de las vías respiratorias (Bonner, et. al., 2000). Se ha observado en modelos experimentales en ratas, que los compuestos de vanadio afectan los niveles de hormona tiroidea en sangre, afectan el metabolismo de la glucosa y los lípidos (Nakai, et. al., 1995), además de tener un efecto diurético e inhibitorio en la actividad de Na+/K+ATPasa en riñon, cerebro y corazón (Nriagu, 1998). Algunos estudios muestran que también son inhibidas las enzimas ATP-fosfohidrolasa, ribonucleasa, adenilatocinasa, fosfofructocinasa y la glucosa-6-fosfatasa. La toxicidad en animales por ingestión de compuestos de vanadio lleva a alteraciones nerviosas, déficit respiratorio, convulsiones, deposiciones sanguinolentas y muerte. Por inhalación los efectos principales son la irritación de los ojos y el tracto respiratorio, tos, rinitis y dolor de garganta (García, 2006). La inhalación de V2O5 en ratones a una concentración de 0.02 M (1436 µgV/m3), ha producido daños en diferentes órganos (Ávila-Costa, et. al., 2005). Se ha observado que la inhalación de vanadio causa alteraciones morfológicas en las estructuras del sistema nervioso como lo es en: el bulbo olfatorio, la corteza motora, el hipocampo y la sustancia negra. Y daños en el sistema inmune: cambios en la distribución del timo corteza-médula, así como cambios en la distribución y morfofisiología de las células dendríticas. Aumento en la peroxidación lipídica del hígado: membrana celular de los hepatocitos alterada por daño oxidante, destrucción de ácidos grasos poliinsaturados en sus membranas y aumento en el número de células binucleadas con meganúcleos. Alteraciones en la función pulmonar: aumento de citocinas localizadas en el epitelio bronquiolar, engrosamiento de la capa muscular bronquiolar (Fortoul, et. al., 2011). Se ha demostrado que el vanadio en el aparato reproductor, causa toxicidad en células testiculares: necrosis, disminución y desaparición de las crestas mitocondriales, daño al citoesqueleto, así como edema mitocondrial en espermatogonias, espermatocitos y células de Sertoli. Alteraciones en la espermatogénesis, disminución de espermatozoides, disminución de la motilidad espermática y aumento de anomalías morfológicas en los espermatozoides que podrían conducir a la infertilidad (Mussali-Galante, et. al., 2005). 24 Se ha observado que el V es capaz de alterar la actina, proteína del citoesqueleto de las células testiculares como en las células de Sertolli, Leydig y células germinales (Rodríguez-Lara, 2013). 4.2.3 Metabolismo y Toxicidad del Vanadio La toxicidad de los compuestos de vanadio depende de una variedad de factores que incluyen la vía de administración y la toxicidad inherente del compuesto particular. La concentración de vanadio en el cuerpo humano se mantiene alrededor de 0.3 µM (Contreras-Cadena, et. al., 2014). Las mayores concentraciones aparecen en los pulmones, riñones e hígado. Así como en los dientes y huesos por su similitud con el fosfato (Barceloux, 1999). Existen diferentes vías de entrada a través de las cuales alcanza diferente grado de daño. La vía dérmica presenta la menor absorción, ya que tiene una baja solubilidad el vanadio metálico. La ingestión muestra una toxicidad intermedia, la mayoría de los alimentos contienen bajas concentraciones (1 ng V/g). El vanadio en los alimentos se encuentra en la pimienta negra, las setas, el perejil, los mariscos y las espinacas; en menor cantidad en frutas, verduras y cereales (1-10 ng V/g) (Barceloux, 1999). La inhalación es la vía de mayor absorción, se lleva a cabo a través de la inhalación de polvos y humos en forma de vanadato V+5, el efecto tóxico del V aumenta con sus valencias más altas y los compuestos pentavalentes son los más tóxicos, en la forma aniónica el vanadato se absorbe aproximadamente cinco veces más que en la forma vanadilo (Barceloux, 1999). Durante la absorción de vanadio, alrededor del 25% de V2O5 que se inhala, pasa al torrente sanguíneo (Rodríguez-Mercado y Altamirano-Lozano, 2006). La distribución del vanadio es a través de la sangre, el vanadato es reducido a vanadil por agentes reductores como, el glutatión de los eritrocitos, las catecolaminas y ácido ascórbico y es transportado alrededor del 90% de vanadio por el plasma sanguíneo, a través de la albúmina y transferrina (Chasteen, et. al., 1986; Evangelou, 2002). El vanadio entra a la célula por mecanismos de transporte aniónico, principalmente por los canales de fosfato en forma de vanadato y en el interior de la célula el vanadatoes convertido nuevamente a vanadilo por el glutatión (Rodríguez-Mercado y Altamirano-Lozano, 2006). En la célula, el vanadilo tiene preferencia por los grupos fosfato (61%), después por las proteínas (29%) y después por los radicales sulfhidrilo (9%). 25 Posteriormente se distribuye a los órganos como, bazo, riñón, huesos, dientes e hígado, así como a los testículos y a los pulmones en menos cantidad (Rodríguez-Mercado y Altamirano-Lozano, 2006). En estudios previos se ha observado que la concentración de vanadio en el cerebro es del 5% de la concentración total encontrada en la sangre y que su eliminación por orina se lleva a cabo de forma bifásica, con una tasa inicial rápida de eliminación de 10 a 20 horas y una fase más extensa terminal de 40-50 días (Rodríguez-Mercado y Altamirano-Lozano, 2006), siendo su vida media del vanadio en la orina de 20-40 horas (Barceloux, 1999). 4.2.4 Mecanismos de Acción del Vanadio La generación de radicales libres es uno de los principales mecanismos de acción del vanadio, se ha demostrado que induce estrés oxidante y peroxidación lipídica in vivo (Stohs y Bagchi, 1995). Los radicales libres son aquellas especies químicas, que tienen en su último orbital un electrón desapareado, que generan una gran inestabilidad en su estructura atómica, ya que son muy susceptibles a crear un enlace con otro átomo o molécula y suelen ser muy reactivos, tienen una vida media corta y se forman al interactuar con biomoléculas importantes del organismo (Venereo, 2002). El daño que los RL causan a las células es reparado constantemente, sin embargo, bajo los graves niveles de estrés oxidante, el daño produce que la célula muera. Probablemente, la fuente más importante de oxígeno reactivo en condiciones normales en organismos aeróbicos es la pérdida de oxígeno activado de las mitocondrias durante el funcionamiento normal de la respiración oxidativa (Fina, 2009). El vanadio es un agente inductor de estrés oxidante puesto que se ha estudiado su efecto sobre la disminución del potencial de membrana de la mitocondria, la disminución del GSH mitocondrial, la generación de ERO (Hosseini, et. al., 2013) y de radicales libres (Mayer, 2011). En estudios previos se ha visto que el vanadio inhibe la (Na+, K+) ATPasa presente en el músculo, así como en el sitio activo de ciertas enzimas como la haloperoxidasa (en algas marinas y líquenes) y las nitrogenasas (en bacterias fijadoras de nitrógeno Azotobacter). En ratas, se ha visto que el vanadio produce un aumento en el nivel de peroxidación lipídica y la pérdida de glutatión celular (García, et. al., 2006). 26 Se ha demostrado en estudios experimentales, que las partículas que contienen vanadio son capaces de inducir inflamación en células epiteliales bronquiolares de las vías respiratorias de humano a través de la expresión de las citocinas proinflamatorias IL-8, IL- 6 y TNF-alfa, producto de las reacciones de los radicales libres inducidos por vanadio (Carter, et. al., 1997). Se ha visto que la inhalación de vanadio produce alteraciones morfológicas en el epitelio ependimario (Ávila-Costa, et. al., 2005). Se ha comprobado que la inhalación a vanadio causa genotoxicidad en el ADN en células de la médula ósea, lo que provoca rompimientos de cadena sencilla, así como la aparición de procesos aneugénicos y clastogénicos y formación de micronúcleos que provocan inestabilidad cromosomal (Fortoul, et. al., 2011). La inhalación de V2O5 causa la disminución de gamma-tubulina en el citoesqueleto de células testiculares: Sertoli, Leydig y germinales (Mussali-Galante, et. al., 2007). Así como el desarrollo de apoptosis en células neuronales por la activación de caspasas, producto del marcador de daño oxidante 4-HNE (Jenner, et. al., 2003). Se ha propuesto que las especies reactivas resultantes del efecto pro-oxidante del vanadio en su forma V4+ pueden ocasionar lesiones celulares, por la generación de H2O2 a través de la reacción tipo Fenton, provocando rompimiento en la cadena de ADN, así como la activación de vías de señalización que regulan la fosforilación y desfosforilación de proteínas críticas para la transducción de señales a través de las proteínas tirosina-cinasas, fosfatasas y fosfocinasas (Shi, et. al., 1996). La exposición excesiva de vanadio es potencialmente perjudicial causando toxicidad, debido a su composición química y a la producción de radicales durante las reacciones redox. El vanadio afecta varias funciones químicas y es capaz de generar estrés oxidante interfiriendo en la transducción de señales (Byczkowski y Kulkarni, 1996). Además, produce oxidación de los radicales libres, cuando en su forma vanadato es reducido en presencia de O2 y éste, recibe un electrón formándose así el radical superóxido (O2·) y cuando el vanadilo es oxidado a vanadato a través de la reacción de Fenton, se produce el radical hidroxilo (OH·) (Capella, et. al., 2002). Las especies reactivas de oxígeno, activan vías de señalización al activar las proteínas cinasas MAPKs, las cuales fosforilan proteínas de señalización ERK, adenilato ciclasas, gliceraldehído 3-fosfato desidrogenasa y ribonucleasa (Barceloux, 1999). 27 4.3 Estrés oxidante El estrés oxidante es un proceso fisiopatológico en el que hay un desequilibrio entre los prooxidantes y antioxidantes de la célula, dejando desprotegidos a los prooxidantes y expuestos a los radicales libres (Byczkowski y Kulkarni, 1996). Es causado por un desequilibrio entre la producción de especies reactivas de oxígeno y la capacidad de un sistema biológico para desintoxicar rápidamente o reparar el daño resultante (Fina, 2009). Desde el punto de vista químico, el estrés oxidante conduce a la reducción del potencial antioxidante, ya que sobrepasa la capacidad reductora de diferentes enzimas. El estrés oxidante severo puede causar la muerte celular, una oxidación moderada puede desencadenar la apoptosis, mientras que si es muy intensa puede provocar la necrosis. Los desbalances del estado normal redox causan efectos tóxicos al producir peróxidos y radicales libres que son capaces de dañar a todos los componentes de la célula, incluyendo las proteínas, los lípidos y el ADN (Fina, 2009). Las ERO pueden resultar beneficiosas, debido a que son utilizadas por el sistema inmunitario como un medio para atacar y matar a los patógenos a través de la fagocitosis (Fina, 2009). El desequilibrio y predominio de los radicales libres se debe a diversas causas, clasificadas en endógenas y exógenas. Las endógenas son aquellas producidas por el propio organismo en su funcionamiento, como pueden ser: la respiración mitocondrial, el metabolismo del ácido araquidónico y las acciones enzimáticas. Las exógenas, se deben a factores externos como: la contaminación ambiental, obesidad, sedentarismo, estrés prolongado, exposición indebida al sol, asma y enfermedades cardiovasculares, se ha demostrado que la presencia de estrés oxidante está involucrado en más de 250 enfermedades (Fina, 2009). Se ha visto que una manera indirecta de detectar la presencia de estrés oxidante es mediante la formación de grupos carbonilo en las proteínas, pues se consideran marcadores de este mecanismo de acción y han sido muy estudiados debido a su estabilidad y fácil detección (Irazusta, et. al., 2008). También se ha considerado como marcador de estrés oxidante, la presencia del aldehído 4-HNE por ser derivado de la peroxidación lipídica (Leonarduzzi, et. al., 2000). 28 4.3.1 Estrés oxidante inducido por vanadio El vanadio entra a las células en su forma vanadato V5+ a través de canales aniónicos y por transportadores de fosfato y una vez dentro de la célula es reducido a vanadilo V4+ por una reacción dependiente de NADPH, se produce anión superóxido (O2·) y es reducido por la SOD, generando peróxido dehidrógeno (H2O2) (Korbecki, 2012). El vanadilo V4+ reacciona con el H2O2 a través de la reacción de tipo Fenton y genera vanadato y radicales hidroxilo OH·, alternativamente se generan especies de peroxovanadio. La enzima superóxido dismutasa actúa en la dismutación de O2· generada por la oxidación de NADPH dependiente de vanadato, incrementando la formación de H2O2 el cual reacciona con los iones vanadilo, la tiourea actúa como un eliminador de OH· (Figura 1) (Capella, et. al., 2002). Figura 1. Mecanismo de acción de toxicidad del vanadio. Modificado de Capella, et. al., 2002. De los radicales libres más importantes que se han reportado, son el radical anión superóxido (O2-) y el radical hidroxilo (OH·). Las especies reactivas incluyen a las ERO, que puede ser el peróxido de hidrógeno (H2O2), estas a su vez originan a los radicales libres como es el caso del hidroxilo (OH·) (Fina, 2009). 29 Los radicales hidroxilo pueden dar lugar a modificaciones en los aminoácidos como en la formación de meta-tirosinas y orto-tirosinas a partir de fenilalanina, así como modificaciones en los hidratos de carbono e iniciación de la peroxidación lipídica (Fina, 2009). De los radicales secundarios u orgánicos, se encuentra el radical peroxilo (ROO), el hidroperóxido orgánico (ROOH) y los lípidos peroxidados (Elejalde, 2001). 4.4 Peroxidación Lipídica La peroxidación lipídica representa un mecanismo importante de daño tisular asociado al envejecimiento celular. Uno de los criterios más utilizados en la valoración del estrés oxidante es el análisis de los productos de la peroxidación lipídica (Miranda y Castillo, 2008). El vanadio al ser capaz de disminuir la función antioxidante de diferentes enzimas como la superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa (GPX) y catalasa, induce lipoperoxidación en los organismos, por el incremento de los pro-oxidantes (Mussali- Galante, et. al., 2007). Este mecanismo de daño, mediado por ERO se divide en tres etapas: iniciación, propagación y terminación (Halliwell, 1994). Ø La iniciación de la peroxidación lipídica, ocurre cuando un radical libre ataca a un carbono de la cadena alifática de un ácido graso y se aísla el hidrógeno y se forma un radical alquílico. Ø La propagación es la etapa en la que ocurre una reacción en cadena con la extensión del daño y la formación de más radicales, que reaccionan con el oxígeno y forman el radical peroxilo (ROO), que puede reaccionar con otros ácidos grasos y originar un hidroxiperóxido (ROOR) o lipoperóxido (ROOH) y un radical alquílico (Miranda y Castillo, 2008), sustrayendo los átomos de hidrógeno adicionales (Catalá, 2009). Ø La terminación, ocurre cuando los hidroxiperóxidos formados se descomponen en etano, pentano, aldehídos reactivos y cetonas. Los aldehídos formados como el malonildialdehído y el 4-hidroxinonenal, pueden reaccionar con proteínas y ácidos nucleicos, provocando efectos citotóxicos, genotóxicos y mutagénicos (Miranda y Castillo, 2008), así como el bloqueo del mecanismo antioxidante de las enzimas SOD, CAT, GSH y GPx (Yang, et. al., 2003). 30 4.5 Antioxidantes El sistema de defensa antioxidante está constituido por sustancias que al estar presentes en bajas concentraciones con respecto al sustrato oxidable, retrasan o previenen significativamente la oxidación de éste. El daño oxidante puede ser prevenido por moléculas antioxidantes, las cuales son capaces de donar electrones para estabilizar a los radicales libres y neutralizar sus efectos dañinos (Uttara, et. al., 2009). Los antioxidantes se pueden clasificar en endógenos (enzimáticos), fabricados por la propia célula y los exógenos (no enzimáticos) que ingresan al organismo a través de la dieta presentes en frutas, verduras y cereales (Criado y Moya, 2009). Dentro de los endógenos se encuentran: la coenzima Q, el ácido tióctico, enzimas como SOD, CAT, GPX, glutatión reductasa y la carnosina (Dorado, et. al., 2003). Dentro de los exógenos se encuentran: la vitamina A, la vitamina C, la vitamina E, el betatacaroteno, los flavonoides y el licopeno (Criado y Moya, 2009). Sin embargo, cuando la carnosina se administra de manera oral, se clasifica como exógena. Los antioxidantes no enzimáticos, ceden sus electrones a los radicales libres para hacerlos estables y evitar que dañen a las biomoléculas al reaccionar más rápido con los radicales libres y con las ERO que con el resto de las moléculas presentes, ya sea en el interior o exterior de la célula o a nivel de membrana (Venereo, 2002). Dado que los antioxidantes actúan reduciendo las especies reactivas y a los oxidantes en general, todos los sistemas antioxidantes desembocan en la oxidación del glutatión y NADPH (para reducir al glutatión oxidado), por lo que los sistemas que reducen a la NADPH+, regeneran al NADPH para mantener el flujo de electrones e hidrógenos en todo el sistema amortiguador y así ejercer su función antioxidante (Escorza, 2009). 4.5.1 Carnosina La carnosina es un dipéptido endógeno formado por β−alanina y L-histidina, está ampliamente distribuido en el músculo esquelético humano con una concentración de hasta 20 µM y en menor cantidad en el tejido nervioso, en la corteza cerebral y en el plexo coroideo con una concentración de 10-1000 µMol/L. Puede traspasar la barrera hematoencefálica debido a que es altamente hidrofílica (Bellia, et. al., 2011, Boldyrev, et. al., 2008). 31 La L-histidina parece ser el primer componente bioactivo, mientras que la β−alanina regula principalmente la síntesis del dipéptido (Boldyrev, et. al., 2013). Es sintetizada a través de la enzima carnosina sintetasa y es degradada por la enzima carnosinasa (Prieto, 2009). El uso de dicho antioxidante se debe a la acción de las carnosinasas, ya que son estables a la mayoría de las proteasas comunes, se hidrolizan rápidamente en el suero y en el entorno intracelular de algunos tejidos, sin embargo, una excesiva actividad de éstas podría impedir el efecto protector de la carnosina (Sale, et, al., 2013). La carnosina es un secuestrador de los radicales libres, en especial del radical OH· y radical O2·, (Boldyrev, et. al., 1997), es capaz de neutralizar los daños ocasionados por los aldehídos resultantes de la lipoperoxidación (Corona, et. al., 2011). A la carnosina además, se le ha atribuido una amplia variedad de propiedades benéficas entre las que destacan aplicaciones farmacéuticas (48%), alimenticias (21%), cosméticas (31%) (Bellia, et. al., 2011). Dentro de las funciones bioquímicas de la carnosina se pueden mencionar, la capacidad amortiguadora de pH, la quelación de iones metálicos, la capacidad de proteger contra la formación de productos de la glicación y lipoxidación y la capacidad antioxidante en la disminución de especies reactivas de oxígeno, por lo que la administración de suplementos de carnosina se ha probado en numerosas enfermedades en las que el estrés oxidante está involucrado (Boldyrev, et. al., 2013). Los efectos antioxidantes sobre la mayoría de los trastornos neurodegenerativos ocasionados por estrés oxidante, hacen a la carnosina una molécula muy exitosa en el tratamiento o prevención de enfermedades oxidantes, pues se ha demostrado que retrasan la aparición de muchos indicadores de daño oxidante, como la disminución de radicales libres (Bellia, et. al., 2011). En los experimentos in vivo en ratas, con administración de carnosina en condiciones de hipoxia hipobárica, disminuyó su tiempo de recuperación, en pacientes con enfermedad de Parkinson se observó restauración pronunciada de SOD y disminución de los síntomas (Boldyrev, et. al., 1997, 2008). Además, se ha observado en estudios previos con nuestro modelo de inhalación a vanadio (0.02M) y con administración de carnosina (1mg/km/día) durante cuatro semanas, que hay neuroprotecciónen las espinas dendríticas de las células de la granulosa en el bulbo olfatorio de ratones, ya que redujo su pérdida (Reséndiz, 2014). 32 También se observó aumento en la actividad de la glutatión reductasa del bulbo olfatorio, así como reducción del daño ultraestructural en las neuronas piramidales del hipocampo, en la región CA1 (Colín-Barenque, et. al., 2012). Se ha demostrado en testículos de ratones albinos, sometidos a radiación gamma durante 8 semanas y pretratados con carnosina administrada vía intraperitoneal, que disminuye el número de células apoptóticas, aumenta el grosor del epitelio seminífero y el número de células germinales (Haeri, et, al., 2014). 4.5.2 Metabolismo de la Carnosina Cuando la carnosina es ingerida, es absorbida por el intestino delgado mediante el transportador PEP1 de la membrana de los enterocitos en la mucosa yeyunal, posteriormente es hidrolizada antes de llegar al torrente sanguíneo en β−alanina y L- histidina por la carnosinasa 2 (CN2) y dado que la actividad enzimática yeyunal es baja, es muy probable que la carnosina alcance el torrente sanguíneo por los transportadores de aminoácidos, sin embargo, una vez que llega a éste, se puede hidrolizar rápidamente por la actividad de la carnosinasa 1 (CN1) (Sale, et. al., 2013) (Figura 2). Figura 2. Metabolismo de la carnosina en el intestino delgado. Modificado de Boldyrev, et, al., 2013. 33 La carnosina en el músculo se sintetiza in situ, depende de la actividad de la carnosinasa y de la disponibilidad de la β−alanina en la dieta. La β−alanina se transporta en el cerebro a través de transportadores de b-aminoácidos dependientes de Na+, algunas células neuronales tienen el oligopéptido transportador 2 (PEPT2) de carnosina. Finalmente, la carnosina puede encontrarse en la orina, después de 4 horas de ser ingerida (Figura 3) (Sale, et. al., 2013). Figura 3. Metabolismo de la carnosina en el cerebro y en el músculo, por ingestión oral. Modificado de Sale, et. al., 2013. 4.6 Reprotoxicidad por Vanadio Estudios realizados en modelos animales han demostrado que el vanadio ocasiona alteraciones en células testiculares y estructuras que conforman el aparato reproductor masculino y femenino, así como la disminución de fertilidad e incremento de esterilidad al administrar un tratamiento con tetraóxido de vanadio (V2O4) en ratones por vía intraperitoneal a diferentes concentraciones (4.7 mg/kg, 9.4 mg/kg y 18.8 mg/kg) durante 60 días, pues causa modificaciones en los epitelios germinales de los túbulos seminíferos, 34 disminución en la motilidad y viabilidad del esperma, disminución en el número de espermatozoides, así como aumento en la frecuencia de malformaciones espermáticas, tales como: macrocefalia (aumento del tamaño de la cabeza del espermatozoide) y microcefalia (disminución del tamaño de la cabeza del espermatozoide) (Aragón y Altamirano-Lozano, 2001). Se ha demostrado que el estrés oxidante está involucrado en la disminución de la fertilidad masculina, por la generación de radicales libres, provocando la disfunción testicular (Sydney, 2013). Se ha descrito que el vanadio produce toxicidad mediante el aumento de la generación de radicales libres en el aparato reproductor, cuando se administra un tratamiento de 0.4 mg/kg de metavanadato de sodio (NaVO3) a ratas albinas durante 26 días, pues reduce el crecimiento de los testículos y los órganos sexuales accesorios por degeneración de los lípidos y de las proteínas y también por la reducción de la biodisponibilidad de andrógenos a los tejidos, además el vanadio disminuye el número de espermatogonias tipo A, el nivel sérico de la hormona folículo estimulante (FSH) y perjudica la conversión de todas las células que participan en el proceso de espermatogénesis, por lo que no se alcanza la maduración de los espermatozoides (Chandra, et. al., 2007). Se ha demostrado que la administración de sulfato de vanadio por vía oral en ratas, tiene efectos perjudiciales sobre la espermatogénesis (Dehghani, et. al., 2002). En nuestro modelo de inhalación, se ha visto que el vanadio produce necrosis, alteraciones morfológicas en las células de Sertoli y en los espermatocitos, así como modificaciones nucleares en espermatogonias (pseudoinclusiones) (Fortoul, et. al., 2007). También se observó que el pentóxido de vanadio causa edema mitocondrial, vacuolización del citoplasma, disminución de las crestas mitocondriales y alteraciones en la espermatogénesis (Fortoul, et. al., 2011). Rodríguez-Lara y colaboradores (2013), vieron que el vanadio puede disminuir la concentración de la actina en los túbulos seminíferos y disminución de la gamma-tubulina en las células germinales, en las células de Sertoli y en las células de Leydig de una manera dependiente del tiempo de exposición (Mussali-Galante, et. al., 2005). 35 4.7 Aparato reproductor masculino El sistema reproductor masculino de los mamíferos está formado por los testículos, los epidídimos, los conductos espermáticos, las glándulas sexuales anexas y el pene (Ross, 2007). Su función principal es producir espermatozoides competentes morfológica y fisiológicamente para completar la fertilización, así como para producir y secretar testosterona (Sharpe, 1994). La secreción de testosterona y la producción de espermatozoides dependen de la estimulación testicular por las gonadotropinas (LH y FSH) en respuesta a la hormona de liberación de gonadotropina. El sistema reproductor del ratón está conformado por los testículos, el pene, los conductos deferentes y glándulas anexas de tipo endócrino y exócrino como son: vesículas seminales, glándulas ampulares, próstata y glándulas bulbouretrales (Estrada- Flores y Uribe-Aranzabal, 2002). La red testicular está formada por tubos rectos que desembocan a la región posterior del epidídimo y los espermatozoides pueden pasar rápidamente por ellos, están limitados por epitelio plano o cúbico simple. El epidídimo es un conducto ampliamente contorneado, limitado por epitelio simple que puede almacenar espermatozoides y los conductos deferentes son por los cuales salen los espermatozoides hacia la uretra (Estrada-Flores y Uribe-Aranzabal, 2002). La próstata y la vesícula seminal son glándulas asociadas a los conductos eyaculadores y uretra, son los responsables de la formación del líquido seminal, las glándulas de Cowper o bulbouretrales liberan líquido lubricante durante la excitación. El pene está compuesto por el cuerpo esponjoso, los cuerpos cavernosos y por el glande (Megías, et. al., 2016). 4.7.1 El Testículo de ratón Los testículos son órganos ovoides pares que están situados en las bolsas escrotales, ubicados fuera de la cavidad abdominal, están rodeados por una cápsula de tejido conjuntivo fibroso llamada túnica albugínea, de la cual parten trabéculas al interior del testículo donde se localizan los túbulos seminíferos, rodeados de tejido intersticial (Estrada-Flores y Uribe-Aranzabal, 2002). 36 La túnica albugínea se divide en dos capas: una externa que está formada por tejido conectivo fibroelástico denso, con algunas células musculares lisas y una capa más interna llamada túnica vasculosa (Megías, et. al., 2016), que está compuesta de tejido conjuntivo laxo con vasos sanguíneos, linfáticos, fibras nerviosas y las células de Leydig (Estrada-Flores y Uribe-Aranzabal, 2002). 4.7.2 Túbulos seminíferos y células de Leydig En los túbulos seminíferos ocurre la formación de los espermatozoides a través del proceso de espermatogénesis, que comprende la diferenciación desde las espermatogonias hasta la formación de los espermatozoides. Las células de Sertoli forman un epitelio de células alargadas e irregulares, su núcleo es basal, claro y esféricoy muestran uniones intercelulares que determinan la formación de la barrera hemato- testicular (Estrada-Flores y Uribe-Aranzabal, 2002). Cada túbulo seminífero de ratón mide aproximadamente 200 µm de diámetro (Figura 4) y se estima que existen de 15 a 20 túbulos en cada testículo, con una longitud total de 2 metros (Guzmán, et. al., 2005). Los túbulos seminíferos están rodeados por una capa de tejido conectivo fibroso denominada capa limitante o peritubular (Megías, et. al., 2016). En su interior se encuentran las células de Sertoli, las cuales son de gran importancia para la formación de las células germinales, ya que las nutren y sostienen (Estrada-Flores y Uribe-Aranzabal, 2002). En ratones un ciclo espermático completo dura 35 días (Guzmán, et. al., 2005). Las células de Leydig se localizan entre los túbulos seminíferos (Figura 4B), están aisladas o formando pequeños grupos en el tejido intersticial, son ovoides o irregulares, con un núcleo denso esférico y citoplasma granular y con inclusiones lipídicas, son las encargadas de secretar la testosterona, la cual es esencial para promover la espermatogénesis (Estrada-Flores y Uribe-Aranzabal, 2002). 37 Figura 4. A] Túbulos seminíferos y B] células de Leydig de ratón. Recuperado de Megías, et. al., 2016. Células de Leydig Túbulos seminíferos 38 5. Justificación Es importante evaluar el efecto de la carnosina, ya que su poder antioxidante es muy amplio en los diferentes sistemas y aparatos de los mamíferos, sin embargo, los informes que existen no describen el efecto de la carnosina en el aparato reproductor masculino, por lo que es de gran importancia determinar si disminuye o evita el daño reprotóxico en el testículo ocasionado por la inhalación de vanadio. Además, es importante ampliar los estudios previos que informan el daño por inhalación de vanadio y con ello, evaluar la presencia de estrés oxidante en las células testiculares, ya que se ha comprobado que la contaminación atmosférica en la Zona Metropolitana del Valle de México tiene una concentración elevada de partículas suspendidas, a las que se adosan metales pesados como el vanadio que pueden causar peroxidación lipídica en las células testiculares disminuyendo su función reproductora. 6. Hipótesis Si la inhalación de vanadio produce estrés oxidante en los túbulos seminíferos y en las células de Leydig, entonces se observará un aumento en la intensidad de la marca de 4- HNE como marcador de peroxidación lipídica, la cual será disminuida o inhibida por la administración de carnosina como agente antioxidante. 7. Objetivos 7.1 Objetivo general Determinar el efecto antioxidante de la carnosina sobre la producción de estrés oxidante en células testiculares generado por la inhalación subaguda de vanadio en un modelo murino. 39 7.2 Objetivos particulares Identificar la presencia de peroxidación lipídica como resultado del estrés oxidante en los túbulos seminíferos y células de Leydig por la inhalación de vanadio mediante la técnica de inmunohistoquímica para 4-hidroxinonenal como marcador de peroxidación lipídica. Evaluar el efecto antioxidante de la carnosina en los túbulos seminíferos y células de Leydig de ratones CD-1 con y sin exposición a vanadio por medio de inmunohistoquímica para 4-hidroxinonenal como marcador de peroxidación lipídica por estrés oxidante. 40 8. Método De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999 “Uso y cuidado de los animales de laboratorio”, los ratones utilizados en los experimentos fueron tratados adecuadamente, considerando los criterios establecidos para su correcta regulación. Fueron utilizados 40 ratones macho de la cepa CD-1, con un peso de 30 a 35 gramos, bajo condiciones controladas de luz y oscuridad 12/12 L:O. El alimento y agua fueron proporcionados ad libitum. 8.1 Modelo de inhalación El modelo de inhalación consistió en la colocación de los animales en una caja de acrílico (35 cm de ancho, 45 cm de largo y 20 cm de alto) conectada a un ultranebulizador (Yue Hua®, modelo: WH-802, Taiwan), que fue utilizado para la nebulización de una solución de pentóxido de vanadio (Sigma, St Louis, Missouri, USA) al 0.02M, manteniendo un flujo constante de 10L/min durante una hora con una concentración de vanadio en caja de 1436 µg/m3 y un diámetro de partícula de 0.5-5 µm (Fortoul, et al., 2014). Los 40 ratones fueron divididos al azar en cuatro grupos: control, vanadio, vanadio + carnosina y carnosina, organizados de la siguiente manera: § Grupo control: Los ratones de este grupo inhalaron solución salina por una hora, dos veces por semana, durante cuatro semanas. § Grupo vanadio: Los ratones de este grupo inhalaron una concentración de 0.02M (1436 µg/m3) de vanadio una hora, dos veces por semana, durante cuatro semanas. § Grupo vanadio + carnosina: Los ratones de este grupo inhalaron una concentración de 0.02M (1436 µg/m3) de vanadio una hora, dos veces por semana, durante cuatro semanas y se les administró simultáneamente un tratamiento de carnosina; 1mg x kg al día, durante cuatro semanas, por vía oral. § Grupo carnosina: Los ratones de este grupo inhalaron solución salina, una hora, dos veces por semana, durante cuatro semanas y se les administró un tratamiento de carnosina; 1mg x kg al día, durante cuatro semanas, por vía oral. 41 Al término de los tratamientos, después de las cuatro semanas, los animales fueron sacrificados. Para ello se anestesiaron con una dosis de pentobarbital sódico (0.5 ml para cada ratón) y fueron perfundidos por vía intracardíaca con solución salina a una concentración de 0.9% y pH de 7.4. Posteriormente fueron fijados por perfusión con paraformaldehído al 4% y se obtuvieron los testículos de cada ratón, también fueron postfijados en paraformaldehído al 4% y pH 7.4 por dos horas y después se colocaron en PBS. Fueron lavados, deshidratados e incluidos en parafina. Se realizaron cortes logitudinales, seriados de cada testículo de 3 micrómetros de espesor para determinar la marca por estrés oxidante, a través de la técnica de inmunohistoquímica. 8.2 Inmunohistoquímica para 4-hidroxinonenal Se tomaron cortes de los testículos a nivel medial, 20 para túbulos seminíferos y 25 para células de Leydig, de 3 µm de espesor y se desparafinaron por 45 minutos a 70ºC, posteriormente fueron hidratados a través de un tren de hidratación comenzando con xilol y siguiendo con alcohol en orden decreciente: de alcohol absoluto, a alcohol al 90%, hasta llegar a alcohol al 50% y por último con agua. La recuperación del antígeno se llevó a cabo en DIVA Decloaker 20X (BioCare Medical) en una olla de presión a 25 lb. durante 1 minuto y con peróxido de hidrógeno (H2O2) al 0.9% se bloqueó la peroxidasa endógena. Para evitar la interacción del anticuerpo con proteínas inespecíficas de la muestra, se incubó en PBS-albúmina (Albúmina Sérica Bovina Fracción V, MP Biomedicals) por 15 minutos, posteriormente se realizaron lavados de 30 segundos con PBS-tween (tween 20, 0.1%). Después se incubaron con anticuerpo monoclonal anti 4-hidroxinonenal (R&D Systems) dilución 1:50 a temperatura ambiente por 45 minutos, fueron lavados con PBS-Tween, se incubaron con el anticuerpo secundario (Byotinylated Link Universal. Dako®) por 30 minutos y se lavaron con PBS-tween. Posteriormente se incubaron con HRP (Horseradish peroxidase) por 30 minutos (Dako LSAB® + System-HRP; Biotinylated Link Universal; Streptavidin HRP) y se hizo un nuevo lavado con PBS-tween. Finalmente, se revelaron con el cromógeno diaminobencidina (Invitrogen DAB-Plus Substrate Kit, invitrogen®), se contratiñeron con hematoxilina, se
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