Asignacion-estrategica-de-eyaculados-en-la-mariposa-leptophobia-aripa-lepidoptera-pieridae

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS 
INSTITUTO DE ECOLOGÍA 
 
 
ASIGNACIÓN ESTRATÉGICA DE EYACULADOS EN LA MARIPOSA 
LEPTOPHOBIA ARIPA (LEPIDOPTERA: PIERIDAE). 
 
 
TESIS 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
DOCTORA EN CIENCIAS 
 
 
P R E S E N T A : 
NUBIA CABALLERO MENDIETA 
 
 
TUTOR PRINCIPAL: DR. CARLOS RAFAEL CORDERO MACEDO, 
 INSTITUTO DE ECOLOGÍA 
 
COMITÉ TUTOR: DRA. MARGARITA MARTÍNEZ GÓMEZ, 
 INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS. 
 DR. ALEJANDRO CÓRDOBA AGUILAR, 
 INSTITUTO DE ECOLOGÍA. 
CIUDAD DE MÉXICO, FEBRERO 2016 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
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Agradezco: 
 
A mi Director de Tesis, el Dr. Carlos Cordero Macedo, por ser parte de mi vida y 
formación académica. ¡¡Gracia por todo!! 
 
A mi Comité Tutor, la Dra. Margarita Martínez Gómez y al Dr. Alejandro Córdoba Aguilar, 
por brindarme comentarios, sugerencias y sobre todo haberme otorgarme su apreciado 
tiempo. 
 
A los miembros de mi jurado la Dra. Diana Pérez Staples, Dra. Robyn Elizabeth Hudson, 
Dr. Raúl Cueva del Castillo Mendoza, Dr. Constantito de Jesús Macías García y Dr. 
Carlos Rafael Cordero Macedo por la revisión de esta tesis, gracias por su tiempo, 
sugerencias y comentarios tan valiosos que enriquecieron el manuscrito final, así como 
por fungir como miembros del jurado evaluador. 
 
Al M. en C. Raúl Iván Martínez Becerril por su apoyo técnico a lo largo del proyecto. 
 
A mi Alma máter la Universidad Nacional Autónoma de México, por apoyar a todas las 
personas que forjan su vida realizando ciencia básica, porque un país que no apuesta por 
el desarrollo de estos proyectos, no generará los conocimientos necesarios para los 
cimientos del futuro. 
 
Al Instituto de Ecología, UNAM, y a todas aquellas personas que lo integran e hicieron 
posible se concretara este proyecto. 
 
Al Posgrado en Ciencias Biomédicas por haberme brindado el apoyo económico y 
académico para la realización de este proyecto de vida. 
 
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT; No. de becario 164946) y 
Programa de Apoyo a Proyectos Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT; 
IN213011) porque sin su financiamiento simplemente no hubiera sido posible la 
realización de este trabajo. 
 
 
 
Agradezco: 
 
A mis padres, porque con sus enseñanzas sembraron en mí el amor a la naturaleza y a 
preguntarme más allá de lo que me enseñaban en clase. Por su apoyo incondicional a lo 
largo de mi formación académica, por ser mis pilares, nunca terminaré de agradecerles 
por tantas cosas que han hecho por mí, como sembrar plantas en el jardín para que 
comieran mis hijas (chinches o mariposas), por cambiarnos de casa, por cargar cajas de 
aquí para allá y de regreso, por comprar anaqueles, por entender mis "tiempos", pero 
sobre todo por no romper el sueño de una niña que siempre quiso ser Bióloga. 
 
A mi familia (Caballero y Mendieta), por siempre preguntar:"¿cuál es el pH de la coca?" y 
"¿....es cierto que...?; por no juzgarme por sea tan desprendida, por agarrar insectos 
aunque no querían, porque siempre están conmigo ¡los quiero!. 
 
A mis amigas y amigos del CCH porque aunque no estuvieron atrapando mariposas ni 
criándolas, supieron entender y cambiar fechas si no podía ir a tomar malteadas con ellos, 
por pasar de ser mis amigos a compadres y hermanos del alma. Sé que me matarán por 
no enlistar nombres, pero no quiero olvidar a nadie, a todos los quiero de a montón. Al 
único que mencionaré por esta ocasión es a Brendy y ya sabrán por qué, gracias 
chamaco por permitirme ser tu amiga, ve en paz que sabré cumplir promesas. 
 
A Mela y Sybyl por ser mis amigas, por darnos la oportunidad de reencuentros gratos con 
esas pláticas interminables y terapias de "comerse a besos a Fadi" y seguir con esta 
amistad, las quiero chicas, claro aunque a veces la quiera estrangular un poco, pero para 
eso son las amigas, para ser como sos. 
 
A todos y cada uno de los miembros del Laboratorio de Ecología de la Conducta de 
Artrópodos, por contagiarme con su entusiasmo y darme enormes lecciones de vida. 
 
Y con un especial agradecimiento a ti mi vida, porque por sobre todas las cosas eres mi 
confidente, amigo, empuje y equilibrio, porque con eso se construye la mitad del camino y 
la otra mitad con "chocolates" eternos. Me cambiaste la vida J. Guillermo JC. Te amo de 
aquí a la galaxia más lejana y de regreso. 
 
Y a mi hermano querido y adorado, porque sé siempre me cuidas y lo seguirás haciendo 
el resto de mi vida. 
 
 
Táctica y estrategia 
Mario Benedetti 
 
Mi táctica es 
mirarte 
aprender como sos 
quererte como sos 
 
mi táctica es 
hablarte 
y escucharte 
construir con palabras 
un puente indestructible 
 
mi táctica es 
quedarme en tu recuerdo 
no sé cómo ni sé 
con qué pretexto 
pero quedarme en vos 
 
mi táctica es 
ser franco 
y saber que sos franca 
y que no nos vendamos 
simulacros 
para que entre los dos 
no haya telón 
ni abismos 
 
Mi estrategia es 
en cambio 
más profunda y más 
simple 
 
Mi estrategia es 
que un día cualquiera 
no sé cómo ni sé 
con qué pretexto 
por fin me necesites. 
ÍNDICE 
Resumen............................................................................................................. 1 
Abstract..............................................................................................................
. 
3 
Introducción general......................................................................................... 5 
Capítulo 1 
Male mating costs in a butterfly that produces small ejaculates..................
 
 
18 
1.1 Introduction.................................................................................................. 19 
1.2 Material and Methods.................................................................................... 20 
1.3 Results......................................................................................................... 21 
1.4 Discussion.................................................................................................... 22 
1.5 References.................................................................................................. 25 
Capítulo 2 
Strategic ejaculation in response to female size in a butterfly that 
produces small ejaculates................................................................................
 
 
27 
 
2.1 Abstract..........................................................................................................
 
28 
2.2 Introduction.................................................................................................. 29 
2.3 Material and Methods.................................................................................. 32 
2.4 Results......................................................................................................... 36 
2.5 Discussion.................................................................................................... 40 
2.6 References.................................................................................................. 47 
Discusión General.........................................................................................60 
Conclusiones generales ............................................................................... 66 
Apéndice 
Enigmatic liaisons in Lepidoptera: A review of same-sex courtship and 
copulation in butterflies and moths................................................................ 
 
 
67 
 
Literatura citada ............................................................................................ 
 
79 
 
 1 
RESUMEN 
En muchos insectos los machos invierten recursos en la producción de sus eyaculados. 
En lepidópteros el eyaculado está compuesto por un espermatóforo y otras sustancias 
adicionales. Además de la fertilización de los huevos, los machos obtienen diversos 
beneficios de los componentes del eyaculado, como la reducción de la competencia 
espermática al provocar una disminución de la receptividad sexual de las hembras o un 
incremento en las tasas de ovogénesis y oviposición. La teoría predice que sólo en 
especies poliándricas, con alta probabilidad de competencia espermática, en las cuales 
los machos invierten en producir largos y nutritivos eyaculados, lo que les genera costos 
asociados a la producción de eyaculados como disminución en su longevidad o en la 
cantidad de recursos que pudieran invertir en otros apareamientos. Por lo que en 
especies poliándricas se espera que los machos distribuyan los recursos de eyaculados 
de manera que se optimice su éxito reproductivo. Sin embargo, existe poca información 
acerca de si en especies con relativa poca inversión en sus eyaculados como en especies 
monándricas, responden a dichas presiones de selección. En la presente tesis se 
muestran un conjunto de estudios en la mariposa monándrica Leptophobia aripa 
(Lepidoptera: Pieridae) sobre los costos fisiológicos de los eyaculados y cómo la calidad 
de la hembra afecta la inversión del macho sobre sus eyaculados. La primera parte es un 
estudio sobre el efecto del tamaño del macho (una estimación de la cantidad de recursos 
almacenados) en la producción de eyaculados y en los costos de supervivencia de 
apareamientos múltiples. Los principales resultados fueron que los machos vírgenes 
transfirieron en su primera cópula los eyaculados más pequeños registrados hasta el 
momento en Lepidoptera. El apareamiento es costoso para los machos en términos de 
supervivencia, número de eventos reproductivos y tamaño de eyaculados transferidos. 
Los machos pequeños produjeron espermatóforos pequeños y sobrevivieron menos que 
 2 
los machos grandes, pero fueron capaces de producir eyaculados del mismo peso que los 
producidos por machos grandes, indicando que los primeros invierten más en substancias 
accesorias. En la segunda parte de esta tesis, se investigó cómo la calidad de la hembra 
(estimada mediante el tamaño y edad de la hembra) afecta la inversión de los eyaculados. 
Se encontró evidencia de que los machos de L. aripa presentan asignación diferencial de 
eyaculados en su primera cópula en respuesta al tamaño corporal de la hembra. Sin 
embargo, la edad de la hembra no afectó dicho patrón. A pesar de que los machos 
invirtieron una mayor cantidad de recursos a hembras grandes durante su primera cópula 
no se encontró evidencia de que esto tuviera un efecto en lo transferido en sus segundas 
cópulas. La última sección de este manuscrito, muestra evidencia de que las 
interacciones sexuales entre organismos del mismo sexo dentro del grupo Lepidoptera, 
son más comunes de lo que anteriormente se pensaba. Las pruebas sugieren que 
podrían ser resultado de la selección para producir algún tipo de daño o costo a otro 
macho, o algún subproducto de la selección sexual, favoreciéndose principalmente en 
especies con una competencia intensa por la obtención pareja. 
 3 
ABSTRACT 
In many insects, males invest in the production of ejaculates. In Lepidoptera these are 
composed of a spermatophore and additional substances. Males can benefit from their 
ejaculate aside from fertilizing eggs, other components of ejaculate can reduce sperm 
competition, decreased female sexual receptivity and/or increase the rate of oogenesis 
and oviposition. Investment in the ejaculate can be costly for males, because it can reduce 
their future reproductive success by reducing their longevity or the amount of resources 
that they could invest in other matings. Theory predicts that when ejaculates are costly to 
produce, males are expected to allocate their ejaculate resources over successive matings 
in a manner that optimizes their reproductive success, for example males should optimize 
their ejaculatory investment in accordance with female quality. There is little information 
about whether sexual selection could favor the evolution of the strategic allocation of 
ejaculates as a function of female quality for males of species with relatively low ejaculate 
investment. In this thesis a set of studies is presented on the monandrous moth 
Leptophobia aripa (Lepidoptera: Pieridae), on the physiological costs of ejaculates and 
how female quality affects ejaculate investment. The first part of the study is on the effect 
of male size (an estimate of the amount of resources stored) on ejaculate production and 
on survivorship costs of multiple mating. The main results were that: virgin males exhibit 
the smallest relative investment in ejaculate production recorded in Lepidoptera to date. 
Mating is costly for males and more costly for males with fewer resources stored. Small 
males produce smaller spermatophores, although male size has no effect on ejaculate 
size (spermatophore + accessory substances), indicating that small males make a 
relatively larger investment in the production of accessory substances. Multiple mating has 
a negative effect on male longevity and on ejaculate size and this effect depends on male 
size. In the second part of this thesis, we tested how female quality (measured as female 
 4 
size and age) affects ejaculate investment. The main results were that the size of 
ejaculates increased with female size, however, female age had no effect on the size of 
the ejaculates transferred by males. Although males transferred a greater amount of 
resources to large females during their first mating this did not affect their second matings. 
The last section of this manuscript shows that same-sex sexual interactions in Lepidoptera 
could be more common than previously thought. Evidence suggests that these behaviours 
could result from selection for imposing costs on other males, or could be a by-product of 
sexual selection favoring individuals that exhibit high sexual willingness. 
 5 
INTRODUCCIÓN GENERAL 
Darwin (1871) sugirió que la selección sexual es el mecanismo evolutivo por el cual se da 
lugar a la evolución de caracteres sexuales secundarios (i.e. aquellas características que 
no tienen que ver directamente con la reproducción). Dichos caracteres, se explicarían 
principalmente por dos procesos, uno derivado de la lucha entre los individuos de un 
mismo sexo (generalmente los machos) por aparearse con los individuos del sexo 
contrario, denominado selección intrasexual, mientras que el segundo proceso, sería el 
resultado de la elección de pareja (generalmente por parte de las hembras) para 
reproducirse y denominado selección intersexual. La evolución y mantenimiento de 
caracteres conspicuos (p. ej. un mayor tamaño corporal, astas, cuernos, presencia de 
espolones, etc.) por un lado, podrían conferir alguna ventaja a los machos que los 
poseyeran en comparación con los individuosque no los presentaran. En situaciones de 
combates por el acceso a las hembras, podrían ser más atractivos para las hembras y por 
ende preferidos (p. ej. machos con plumajes vistosos, cantos, el tamborileo en las arañas 
lobo, etc.). También se sabe que los caracteres sexuales secundarios podrían 
desarrollarse y evolucionar aunque éstos tuvieran un efecto negativo sobre la 
supervivencia del organismo que los poseyera (p. ej. Zahavi, 1976; Andersson, 1986). En 
éste caso lo único que se necesitaría es que sus efectos negativos (en la supervivencia) 
fueran menores que sus efectivos positivos (en la reproducción). 
 
Lo anterior, suponía que los procesos de selección ocurrían sólo previo a la cópula y una 
vez concretada la cópula se obtenía la descendencia (Darwin, 1871), provocando que 
todos los apareamientos fueran equivalentes y contribuyeran por igual al éxito 
reproductivo del macho. Sin embargo, Bateman (1948) razonó que la selección sexual 
 6 
produciría diferencias en el éxito reproductivo entre machos y hembras. Teniendo en 
cuenta sólo los aspectos precopulatorios, el éxito de los machos sería habitualmente 
proporcional al número de apareamientos, mientras que en las hembras dependería del 
número de hijos que pudieran tener y no directamente del número de machos con los que 
se aparearan. Esta idea fue reforzada por el supuesto de que la elaboración de los 
espermatozoides eran relativamente baratos de producir para los machos, en 
comparación de la producción de los óvulos en las hembras (Bateman, 1948; Trivers, 
1972; Arnold y Duval, 1994), por tal razón no existía ninguna restricción para el macho 
(más que el número de encuentros con diferentes hembras) para incrementar su éxito 
reproductivo con cada cópula adicional que lograse (Simmons, 2001). No obstante, 
existen múltiples razones para suponer que esto no siempre ocurre. Parker (1970) expuso 
claramente la idea de que la selección sexual podría continuar después del apareamiento. 
Si las hembras se aparean con varios machos antes de realizar la puesta, y los 
espermatozoides procedentes de los diferentes machos se almacenan en el interior de la 
hembra (como ocurre en la mayoría de los insectos), entonces se produciría una 
competencia entre los espermatozoides por la fertilización de los óvulos de la hembra; a 
dicho proceso se le denominó competencia espermática. La teoría también predice la 
tendencia a favorecer características que permitan a los machos aumentar su éxito en la 
fertilización (Parker, 1970), tales como cópulas prolongadas, elaboración de tapones 
nupciales, mayores cantidades de espermatozoides transferidos durante la cópula, entre 
otros. Sin embargo, estas características también se encuentran sujetas a presiones de 
selección natural, ya que le conllevan costos al individuo. Dewsbury (1982) mostró que los 
machos incurren en costos no triviales en la producción de los gametos masculinos, ya 
que los espermatozoides generalmente son liberados en lotes (eyaculados o 
espermatóforos) que incluyen millones de gametos. Además, los machos están limitados 
con respecto al número de eyaculados que pueden generar, y al tiempo requerido para 
 7 
restablecer las reservas agotadas. Por lo tanto, al ser los eyaculados un recurso limitado, 
la existencia de una discriminación de parejas por parte de los machos debería ser 
esperada, al menos con respecto al patrón de asignación de eyaculados transferidos a las 
hembras. En consecuencia, los machos podrían evolucionar diferentes adaptaciones, 
para variar la cantidad de recursos asignados en el apareamiento (p. ej. el tamaño del 
eyaculado, la duración de la cópula, el tiempo de resguardo de pareja, entre otras), 
dependiendo de varios factores, por ejemplo de conformidad a la calidad de la hembra 
como pareja o por la intensidad de la competencia espermática (Bonduriansky, 2001), 
fenómeno llamado elección críptica masculina. 
 
ASIGNACIÓN ESTRATÉGICA DE EYACULADOS 
Una de las adaptaciones por las cuales se puede llevar a cabo la elección críptica 
masculina es mediante la asignación estratégica de eyaculados (Burley, 1988; Parker, 
1998; Sheldon, 2000; Simmons, 2001; Wedell et al., 2002). Algunas de las condiciones 
para que los machos puedan generar dicha adaptación son: 1) Competencia espermática 
y factores femeninos variables que influyan en la estructura óptima del eyaculado, 2) 
Costos no triviales de la espermatogénesis, tanto en términos de gasto energético, así 
como en el mantenimiento de los espermatozoides maduros para las diversas 
oportunidades de apareamiento y 3) Desarrollo de mecanismos que permitan, a través de 
sus apareamientos, la distribución de los espermatozoides en lotes, ya sea en forma de 
eyaculado o espermatóforos (Wedell et al., 2002). 
 
Al considerar los aspectos antes mencionados, los insectos y en especial los lepidópteros 
son un modelo conveniente para el estudio de la teoría de la asignación estratégica de 
 8 
eyaculados, puesto que una de las principales condiciones para que ésta se establezca, 
depende de los costos que les genere a los machos producir los diferentes componentes 
de los eyaculados (Dewsbury, 1982; Cordero, 2000; Simmons, 2001; Poiani, 2006). En 
Lepidóptera, existen varias características que nos permiten inferir dichos costos, por 
ejemplo, los machos invierten diversos recursos para la elaboración de sus eyaculados, 
los cuales están constituidos por un espermatóforo (paquete conformado por 
espermatozoides y otros fluidos seminales), así como de sustancias adicionales, ambos 
elementos transferidos a la hembra durante la cópula (Simmons, 2001; Gillott, 2003; Avila 
et al., 2011; Chapman, 2013). Estos componentes del eyaculado; pueden llegar a 
representar en promedio, en machos vírgenes entre el 1.3% y hasta un 15.5% del peso 
total de su cuerpo (Marshall, 1985; Wiklund y Kaitala, 1995; Cordero, 1998). Los machos 
necesitan un periodo de “recuperación” (generalmente de varios días) antes de producir 
un nuevo eyaculado similar en tamaño y calidad al de su primer apareamiento (Svärd y 
Wiklund, 1989; Cordero, 1993, 1998; Cook y Wedell, 1996; Ryne et al., 2001). La 
producción de los eyaculados puede llegar a afectar negativamente otros aspectos en la 
adecuación de los machos, entre ellos su longevidad (Amoaka-Atta, 1976; Shapiro, 1982; 
Cordero, 2000; Hughes et al., 2000; Ferkau y Fischer, 2006). Además, diversos estudios 
han encontrado que la variación en la dieta de los machos (calidad y cantidad) durante la 
etapa larval, puede tener una gran influencia en el número de espermatozoides 
contenidos dentro del espermatóforo (Gage y Cook, 1994), en la calidad de proteínas en 
el fluido seminal (Bissoondath y Wiklund, 1995, 1996a, b; Wedell, 1996) y en la efectividad 
de los eyaculados para ganar fertilizaciones (Sait et al., 1994, 1998). Estos elementos 
hacen factible determinar que la producción de eyaculados en lepidópteros pueda ser 
costosa para los machos en términos energéticos, en inversión de tiempo así como en la 
distribución de nutrientes. Sin embargo, a pesar de los costos se ha demostrado que los 
machos de Lepidóptera pueden obtener beneficios a través del eyaculado, por ejemplo, 
 9 
les pueden proporcionar a las hembras directamente sustancias nutritivas que les sirven 
para cubrir sus necesidades nutricionales y la de su descendencia (Marshall, 1982, 1985; 
Boggs, 1990; Bissoondath y Wiklund, 1995; Wiklund y Kaitala, 1995); o que estimulan la 
ovogénesis y oviposición (Leopold, 1976; Marshall, 1982; Gwynne, 1984; Watanabe, 
1988; Gillott, 2003; Poiani, 2006; South yLewis, 2011). Además pueden contener 
sustancias que disminuyen o evitan la competencia espermática, tales como inhibidores 
de la receptividad sexual de las hembras; supresores de síntesis de feromonas, 
reguladores del almacenamiento o desplazamiento de los espermatozoides; entre otras 
sustancias (Chen, 1984; Kingan et al., 1995; Eberhard, 1996; Simmons, 2001; Gillott, 
2003; Poiani, 2006; Avila et al., 2011; Perry et al., 2013). Por otra parte, se ha detectado 
que el tamaño del eyaculado puede ser utilizado como un inhibidor mecánico, puesto que 
las hembras recientemente apareadas disminuyen su receptividad sexual durante un 
periodo de tiempo (denominado periodo refractario), cuya duración puede ser 
directamente proporcional al tamaño del eyaculado almacenado en la hembra (Sugawara, 
1979; Torres-Vila et al., 1997). Estas características del eyaculado, favorecerían la 
evolución de adaptaciones masculinas para prolongar la duración del periodo refractario, 
como por ejemplo la producción de espermatóforos de mayor tamaño (Cordero, 2005). 
 
Producto del análisis de costos - beneficios implicados en la producción y transferencia de 
eyaculados, se han propuesto diferentes factores para que la selección sexual favoreciera 
la asignación de recursos para la producción de eyaculados de forma “prudente” en 
machos de Lepidóptera, de tal manera que sea acorde a sus costos y beneficios para que 
resulte en un mayor éxito reproductivo (Wedell et al., 2002). Se predice que cuando los 
machos se enfrenten a un bajo riesgo de competencia de espermatozoides o escasa 
rentabilidad de fecundidad, se deberían conservar los eyaculados. Por el contrario, 
 10 
cuando se enfrenten a altos riesgos de competencia espermática o elevada fecundidad 
potencial de las hembra, deberían de invertir en eyaculados más grande para aumentar la 
probabilidad de fertilización (Wedell et al., 2002; Kelly y Jennions, 2011). 
 
Algunos de los factores que pueden influir para que se lleve a cabo una asignación 
estratégica de eyaculados son: calidad de la hembra, estado reproductivo de la hembra, 
competencia espermática, entre otros (Wedell et al., 2002). Se predice por ejemplo que en 
especies donde las hembras varían en su calidad reproductiva, los machos alcanzarían 
un mayor éxito reproductivo asignando estratégicamente sus espermatozoides a las 
hembras que ofrecieran mayores beneficios en la fertilización (Wedell et al., 2002). Una 
forma a través de la cual los machos pudieran evaluar esta "calidad" de las hembras, es 
por medio del potencial que tienen para producir descendencia (Bonduriansky, 2001). 
Esto usualmente está relacionado con el tamaño y la edad de la hembra. En muchos 
grupos de insectos, incluyendo lepidópteros, el tamaño corporal de la hembra es 
generalmente un predictor positivo de su fecundidad (Gage, 1998; Torres-Vila et al., 1999; 
Hughes et al., 2000; Boggs y Freeman, 2005; McNamara et al., 2009). La teoría indica 
que una hembra grande, representaría para un macho un mayor número de huevos por 
producir. Por ende éstos invertirían más en los componentes de sus eyaculados, 
transfiriendo eyaculados grandes y/o con mayor cantidad de espermatozoides (Gage, 
1998; Wedell y Cook, 1999). Por otra parte, la edad de la hembra también puede ser un 
factor que los machos evaluarían, incluso en hembras vírgenes. Por ejemplo, Cook y 
Gage (1995) encontraron que los machos de lepidópteros invierten mayor cantidad de 
espermatozoides en hembras vírgenes jóvenes en comparación con hembras vírgenes 
viejas. Posiblemente debido a que el riesgo de futuros apareamiento se ve reducido en 
hembras viejas, ya que es improbable que vivan un mayor tiempo al del periodo 
 11 
refractario producto de la transferencia de un primer eyaculado. De igual manera, diversos 
estudios han comprobado que la edad de la hembra afecta su potencial reproductivo. 
Hembras de mayor edad disminuyen su producción de huevos (Marshall, 1990; Proshold, 
1996; Oberhauser, 1997; Torres-Vila et al., 1999; Stelinski y Gut. 2009). 
 
Es importante considerar que la fecundidad de la hembra y la edad podrían co-variar en 
relación al riesgo de competencia espermática, por ejemplo hembras viejas podrían 
proveer un menor potencial de fecundidad y al mismo tiempo alto riesgo de competencia 
espermática, dada la posibilidad de cópulas previas. Los machos por tanto deberían de 
reducir la inversión a sus eyaculados, considerando la alta probabilidad de riesgo de 
competencia espermática. Similarmente, hembras más grandes (pesadas) y más 
fecundas, también podrían incrementar la atención de los machos (Gage, 1995), lo que 
implicaría una mayor competencia espermática, por consiguiente, se espería que los 
machos balancearan su inversión. 
 
La mayoría de los trabajos realizados para comprobar los factores antes expuestos, se 
han llevado a cabo en especies poliándricas de lepidópteros, en las cuales los machos 
tienden a realizar grandes inversiones en sus eyaculados, producto de las mismas 
presiones de la selección sexual (Svärd y Wiklund, 1989; Bissoondath y Wiklund, 1995). 
Sin embargo, poco se sabe acerca de lo que sucede en aquellas especies en las cuales 
los machos invierten relativamente poco en sus eyaculados, como lo son especies que 
tienden a la monandria, pero que aún así el apareamiento les implica costos masculinos, 
tales como reducción de la masa del eyaculado, aumento en la duración de la cópula y 
reducción en la supervivencia del macho (Hughes et al., 2000). La teoría predice que bajo 
 12 
estas circunstancias, la selección sexual favorecería en los machos, a pesar de su baja 
inversión a los eyaculados, que dependiendo la calidad de la hembra, se asignaran 
diferencialmente los eyaculados. Motivo por el cual, el objetivo general del presente 
trabajo fue evaluar si en la mariposa Leptophobia aripa, una especie con tendencia a la 
monandria y con baja inversión en eyaculados (Caballero-Mendieta y Cordero, 2013), los 
machos muestran asignación diferencial de eyaculados en respuesta a factores como el 
tamaño y la edad de la hembra. 
 
El presente trabajo tiene una serie de características que permiten se realice una 
contribución significativa al estudio de la evolución de características masculinas por 
selección sexual, debido a que existen pocos trabajos experimentales en especies 
monándricas de lepidópteros en los cuales se haya abordado la distribución diferencial de 
eyaculados, ante diferentes condiciones de las hembras. 
 
SUJETO DE ESTUDIO 
Leptophobia aripa elodia, Boisduval, (Lepidoptera: Pieridae). 
La especie es un Lepidóptero diurno comúnmente denominado mariposa blanca. Los 
adultos son de color blanco-crema con las puntas negras (Saunders et al., 1998). L. aripa 
es un buen modelo de estudio debido al conocimiento de su ciclo de vida y su fácil 
mantenimiento en condiciones de laboratorio (De Roman y De Hamity, 1983; Escalera, 
2006). En México es un mariposa multivoltina, con traslape de generaciones (Franco et 
al., 1989; Salas-Araiza et al., 1993; Díaz-Batres y Llorente, 2011). Las larvas de L. aripa 
se alimentan de diversas especies de plantas, aunque se especializan en la familia 
 13 
Brassicaceae, son una importante plaga de cultivos de col, coliflor y brócoli en el centro y 
sureste de México, Centro América y el Caribe (Carazo et al., 1990; Trujillo-Vázquez y 
García-Barrios, 2001; Santiago et al., 2006; Pérez et al., 2012). En la Reserva Ecológica 
del Pedregal de San Ángel de la Universidad Nacional Autónoma de México (localizado al 
sur de la Ciudad de México), principal lugarde la recolección de los organismos adultos 
para los experimentos descritos en esta tesis, las larvas se alimentan de Tropaeolum 
majus (De Roman y De Hamity 1983; Salas-Araiza et al., 1993; Escalera 2006). Las 
hembras de esta especie, se aparean en promedio 1.19 ± 0.04 (promedio ± error 
estándar) en su vida (Caballero-Mendieta y Cordero, 2013). L. aripa es una de las 
especies de lepidópteros con menor inversión en sus eyaculados, ya que los machos 
durante su primer apareamiento transfieren eyaculado que representan en promedio el 
0.83% de su peso corporal (Caballero-Mendieta y Cordero, 2013). 
 
ESTRUCTURA DE LA TESIS 
Una de las condiciones principales para que los machos puedan presentar asignación 
estratégica de eyaculados, es el costo de producción de estos eyaculados, por tanto en la 
primera parte de la presente tesis se investigó experimentalmente la hipótesis sobre que 
la producción de los diferentes componentes de los eyaculados es costosa para los 
machos, y que además esto pudiera estar correlacionado con el tamaño corporal de los 
machos. La predicción era encontrar costos fisiológicos desiguales entre machos de 
diferente tamaño sujetos a múltiples apareamientos. La variación experimental realizada 
al tamaño de los machos, fue producto de la restricción de alimento durante su último 
estadio larval, lo que produjo machos pequeños. En términos generales, se encontró que 
los machos vírgenes transfirieron en su primera cópula los eyaculados más pequeños 
registrados hasta el momento en todo Lepidóptera. Además, los machos pequeños 
 14 
produjeron espermatóforos pequeños, pero fueron capaces de producir eyaculados 
(espermatóforo + sustancias accesorias) del mismo peso que los producidos por machos 
grandes. Esto indica que los machos de L. aripa son capaces de modificar la cantidad 
relativa de los recursos invertidos en la producción de sus eyaculados. Se comprobó que 
la longevidad de los machos es afectada por el número de cópulas y este efecto dependió 
de su tamaño corporal. La longevidad de los machos pequeños disminuyó después de 
una sólo cópula, mientras que la longevidad de machos grandes vírgenes y apareados en 
una sola ocasión fue similar y sólo se redujo hasta que copularon dos o más veces 
(Caballero-Mendieta y Cordero, 2013). 
 
El segundo objetivo de la presente tesis, al considerar los antecedentes del primer 
experimento, fue establecer si en L. aripa, a pesar de que es una de las especies de 
lepidóptero con menor inversión en sus eyaculados, presentaba las condiciones 
necesarias para favorecer la existencia de eyaculación estratégica, una vez demostrado la 
presencia de costos de producción de los eyaculados. Se evaluó la hipótesis de que los 
machos transferirían eyaculados de un tamaño que estuviera correlacionado directamente 
con el estado reproductivo de la hembra. Esta idea fue puesta a prueba, con el tamaño y 
edad de la hembra como estimaciones de calidad de la hembra, en el supuesto que 
hembras más grandes y más jóvenes producen más huevos (Boggs y Freeman, 2005; 
McNamara et al., 2009; Stelinski y Gut, 2009). La primera predicción fue que los machos 
vírgenes transferirían eyaculados más grandes a las hembras vírgenes grandes o jóvenes 
en comparación con los eyaculados transferidos por machos apareados con hembras 
pequeñas o viejas. Además, aunque el tamaño del eyaculado disminuye en cópulas 
consecutivas (Caballero-Mendieta y Cordero, 2013), se pronosticaba que los machos 
recién apareados transferirían en cópulas posteriores, eyaculados más grandes a las 
 15 
hembras de mayor calidad (es decir, a hembras grandes o jóvenes). Una segunda 
predicción fue que machos que transfirieran eyaculados más grandes en una primera 
cópula (es decir, aquellos apareados por primera vez con hembras grandes o jóvenes) 
pagarían un costo y producirían eyaculados más pequeños, que los machos apareados 
por primera vez con hembras pequeñas o viejas. Se probaron ambas predicciones 
mediante la realización de dos experimentos que cuantificaban los efectos del tamaño y 
edad de las hembras respectivamente, sobre el tamaño de los eyaculados producidos en 
apareamientos consecutivos. Los resultados mostraron que los machos de L. aripa son 
sensibles al tamaño de las hembras. Durante su primera cópula, los machos transfirieron 
eyaculados más grandes a hembras grandes en comparación de lo transferido a hembras 
pequeñas. Sin embargo, no se encontraron evidencias de distribución diferencial de 
eyaculados cuando los machos fueron apareados con hembras de distinta edad. Es 
importante recalcar que a pesar de que los machos invirtieron una mayor cantidad de 
recursos en hembras grandes durante su primera cópula no se encontró evidencia de que 
lo anterior tuviera un efecto en lo transferido en sus segundas cópulas. De igual manera, 
no se encontró ningún patrón de distribución diferencial cuando el factor a evaluar fue la 
edad de la hembra. En todos los casos, los machos durante sus segundas cópulas 
transfirieron eyaculados más pequeños. 
 
Se presenta una discusión general de los resultados obtenidos a lo largo del presente 
trabajo, primero considerando la producción de eyaculado como un recurso costoso, 
inclusive en especies monándricas, como L. aripa, con baja inversión en sus eyaculados. 
Posteriormente se trata la relación que podría existir entre los costos del eyaculado y la 
evolución de estrategias reproductivas en especies monándricas, lo que vuelve a estos 
machos mucho más selectivos de lo que hasta hace pocos años se habían considerado. 
 16 
Se proponen diversas líneas de investigación en el tema, por ejemplo estudios sobre la 
composición química de los eyaculados, con especial énfasis en las substancias 
accesorias. 
 
Por último, en el apéndice se presenta el tema desarrollado como actividad 
complementaria del doctorado, el cual surgió del cuestionamiento a los pilares principales 
de esta tesis: Por qué en diversas especies de animales, incluyendo Lepidópteros, se 
presentan interacciones sexuales entre organismos del mismo sexo, denominado por sus 
siglas en inglés: SSSI (same-sex sexual interactions); es decir, comportamientos que no 
producen descendencia (Bagemihl, 1999; Roughgarden, 2004; Bailey y Zuk, 2009). Si 
bajo los argumentos principales de la presente tesis, se establecen que existen costos no 
triviales de reproducción para los machos (Shapiro 1982; Svärd,1985; Rutowski et al., 
1987; Cordero 2000; Bonduriansky 2001; Ferkau y Fisher 2006) y dichos costos pueden 
generar que la selección sexual promueva la evolución de adaptaciones masculinas para 
la obtención de un mayor éxito reproductivo (Bonduriansky, 2001; Wedell et al., 2002), 
entonces conductas como SSSI no estarían presentes en lepidópteros. El objetivo 
principal de dicha investigación fue determinar la frecuencia de las SSSI en las especies 
de lepidópteros, así como presentar diversas hipótesis sobre la fijación de estas 
conductas en la población. Se encontró que en Lepidóptera las SSSI pueden presentarse 
más comúnmente de lo que anteriormente se pensaba. Las hipótesis expuestas para 
explicar dichas conductas no pueden probarse por la escasez de datos. Sin embargo, la 
evidencia sugiere que en lepidópteros podrían ser resultado de la selección para producir 
algún tipo de daño o costo a otro macho, o pudieran ser un subproducto de la selección 
sexual, favoreciendo a aquellos individuos que exhiben una gran disposición sexual. De 
conformidad con estas dos hipótesis, las especies en las cuales se encontró alguna 
 17 
interacción de este tipo yque además, es conocido su sistema de apareamiento, se 
detectó en general, que tienen una intensa competencia por la obtención pareja, lo que 
podría ser el factor determinante para que se presenten dichas conductas. 
 18 
 
 
 
CAPÍTULO 1 
 
 
 
 
Male mating costs in a butterfly that produces small 
ejaculates 
 
 
 
 
 
Publicado en: 
 
Physiological Entomology (2013) 38: 318-325 
 
 
 
 
 19 
 
 20 
 
 21 
 
 22 
 
 23 
 
 24 
 
 25 
 
 26 
 
 27 
 
 
 
CAPÍTULO 2 
 
 
 
 
 
Strategic ejaculation in response to female size in a 
butterfly that produces small ejaculates 
 
 
 
 
 
 
*
 28 
2.1 Abstract 
Theory predicts that when ejaculates are costly to produce, males are expected to allocate 
their ejaculate resources over successive matings in a manner that optimizes their 
reproductive success, for example males should optimize their ejaculatory investment in 
accordance with the risk of sperm competition and female quality. There is little information 
about whether males of species with relatively low ejaculate investment respond to 
variation in the quality of females. In our study we investigated how female quality 
(measured as female size and age) affects ejaculate investment in the monandrous 
Leptophobia aripa, the butterfly with the smallest relative ejaculate investment reported to 
date. We found evidence that the size of ejaculates increased with female size but was not 
affected by female age. Males in subsequent matings never produced another ejaculate as 
large as that transferred by males mating for the first time. 
 29 
2.2 Introduction 
Since the size of male gametes is small compared to those produced by females, the 
production of ejaculates has long been considered unlimited and cheap (Trivers, 1972; 
Thornhill and Alcock, 1983). However, in several insect groups the ejaculate is composed 
of accessory gland secretions that may be used by females for somatic maintenance or to 
enhance fecundity (Boggs and Gilbert, 1979; Boggs, 1981; Boggs and Watt, 1981; 
Thornhill and Alcock, 1983; Rutowski, 1984; Gillott, 2003; Poiani, 2006; Avila et al., 2011; 
South and Lewis, 2011). Empirical evidence suggests that the cost of producing ejaculates 
may limit male access to females (Rutowski, 1979; Dewsbury, 1982; Marshall, 1982; 
Svärd and Wiklund, 1986; Poiani, 2006; Kelly and Jennions, 2011). Moreover mating may 
be costly for males, because they must seek and court females (Cook and Gage, 1995; 
Ferkau and Fischer, 2006). Therefore "prudence" is expected with respect to patterns of 
ejaculate allocation (Dewsbury, 1982; Wedell et al., 2002; Kelly and Jennions, 2011). 
Theory predicts that males should allocate their ejaculates strategically in response to the 
reproductive value of a female, thereby maximizing their reproductive success (Parker, 
1998). Moreover males should conserve ejaculate resources for later copulations, and 
hence allocate more prudently over successive copulation, when variation in female quality 
is large (Reinhold et al., 2002; Kelly and Jennions, 2011). For example, in some species 
males ejaculate more sperm when mating with females which provide higher fecundity 
returns, thus increasing their reproductive success (Reinhold et al., 2002). 
 
In Lepidoptera, males assess female reproductive quality by using phenotypic indicators of 
the potential to produce offspring, such as female size and age (Lederhouse, 1981; 
Gilbert, 1984; Haukioja and Neuvonen, 1985; Marshall, 1990; Oberhauser, 1997; Gage, 
1998; Xu and Wang, 2009). For example, heavier females of the butterfly Pararge aegeria 
 30 
can produce more eggs and have higher lifetime fecundity than lighter females (Karlsson 
and Wickman, 1990). There is also evidence that the reproductive value of female 
Lepidoptera decreases with age. Egg production, egg viability and egg mass decline over 
female lifetime (Jones et al., 1982, 1986; Boggs, 1986; Svärd and Wiklund, 1988; 
Marshall, 1990; Proshold et al., 1982; Oberhauser, 1997; Torres-Vila et al., 2002; 
Michereff et al., 2004). For example, females of the monarch butterfly Danaus plexippus 
lay smaller eggs as they age (Oberhauser, 1997). Furthermore, since mated females 
usually have lower reproductive value than virgin females, it may be unprofitable for males 
to invest in large ejaculates when mating with older females that could have mated before. 
It is also possible that there is a preference to mate with virgin females (Rutowski, 1982). 
 
Female fertility and age could co-vary in their effects on female quality, for example old 
females could combine a lower potential fecundity with a high risk of sperm competition, 
considering their higher probability of previous copulations and oviposition. Males 
therefore should reduce their ejaculate investment, given the high risk of sperm 
competition and lower future fecundity. Similarly, heavier and more fertile females may 
also attract more males (Gage, 1995), increasing the risk of sperm competition, so that 
males should balance their investment according to several variables. 
 
Here we studied the mountain white butterfly Leptophobia aripa (Pieridae) a species that 
tends to be monandrous and in which males transfer ejaculates of the smallest relative 
size recorded to date, representing on average 0.83% in weight of the virgin male. Despite 
this small investment, the male pays substantial costs of multiple mating as indicated by 
the reduction in ejaculate mass and increased copulation duration observed in consecutive 
 31 
copulations, as well as by the reduction in male lifespan with increasing number of matings 
(Caballero-Mendieta and Cordero, 2013). This suggests that despite the small relative size 
of ejaculates, in L. aripa sexual selection could favor the evolution of strategic ejaculate 
allocation as a function of female quality (Simmons, 2001; Wedell et al., 2002; Kelly and 
Jennions, 2011). We investigated this idea by using female size and age as estimates of 
quality, on the assumption that larger and younger females produce more eggs 
(Dewsbury, 1982; Boggs and Freeman, 2005). Specifically, we tested the hypothesis that 
both virgin and previously mated males will transfer ejaculates of a size that is directly 
correlated with the expected reproductive output of the female. Since larger and younger 
females are expected to produce more eggs (Karlsson and Wickman, 1990; Foster et al., 
1995; Proshold, 1996; Oberhauser, 1997; Hughes et al., 2000; Calvo and Molina, 2005; 
Boggs and Freeman, 2005; McNamara et al., 2009), our first prediction was that virgin 
males will transfer larger ejaculates to large and young virgin females in comparison with 
those transferred to small and old virgin females. Due to the cost of mating,our second 
prediction was that males that transferred larger ejaculates in first copulations (i.e. those 
copulating for the first time with large or young females) will transfer smaller ejaculates 
when subsequently mating with high quality females, than males that transferred smaller 
ejaculates in first copulations. 
 
We tested these predictions by performing two experiments that measured the effects of 
female size and female age, respectively, on the size of the ejaculates produced by males 
in their first two consecutive copulations. In both experiments, a group of virgin males 
matched for size and age was divided in two groups: the first group copulated with large 
(or young) females and the second with small (or old) females. The first prediction (males 
will transfer larger ejaculates to large/young females) was tested by comparing the size of 
 32 
the ejaculates transferred to each type of female. Mated males of each group were then 
divided in two groups, one group copulated with “low quality” (small/old) females and the 
other with "high quality” (large/young) females. We tested the second prediction by 
comparing the decrease in ejaculate size in the four groups of males. 
 
2.3 Materials and methods 
Study species 
Leptophobia aripa (Boisduval) is a multivoltine butterfly with overlapping generations 
(Franco et al., 1989; Salas-Araiza et al., 1993; Díaz-Batres and Llorente, 2011). L. aripa 
caterpillars feed on several plant species, and are an important pest of cabbage, broccoli 
and cauliflower crops in Southeastern Mexico, Central America and the Caribbean 
(Carazo et al, 1990). In our main collection site, the Pedregal de San Angel Ecological 
Reserve of the Universidad Nacional Autónoma de México, the larvae of L. aripa feed 
mainly on Tropaeolum majus (De Roman and De Hamity, 1983; Salas-Araiza et al., 1993; 
Escalera, 2006). In this species, females mate on average 1.19 ± 0.04 (mean ± s.e.) times 
in their lives (Caballero-Mendieta and Cordero, 2013). Recent research has shown that 
virgin males transfer the smallest relative amount of ejaculate recorded to date in 
Lepidoptera, an average (±s.e.) of 0.83% (±0.05%) of their eclosion weight during their first 
mating. Interestingly, small males resulting from experimental resource restriction during 
the last larval stage produce ejaculates of similar weight to that of large males raised ad 
libitum (for this reason their relative investment in ejaculates during their first mating is 
larger than that of males raised ad libitum: 1.2%±0.09%). However, mating has a negative 
effect on male longevity and this effect is stronger in small males (Caballero-Mendieta and 
Cordero, 2013). 
 33 
Laboratory rearing 
The experimental butterflies were offspring from adults raised from eggs and larvae 
collected in October–November 2009 (Experiment 1) and February–March 2010 
(Experiment 2) in the Pedregal de San Angel. The larvae were reared individually in plastic 
containers (11.5 cm diameter X 4.5 cm high) and fed ad libitum fresh T. majus leaves that 
were replaced as required. Humidity was maintained inside the plastic container by adding 
from three to five drops of water every three days. 
 
The day they emerged, adults were individually marked on the hind wings with a 
permanent marker (Sharpie® ultra fine), weighed on an analytical balance (Scientech) 
after meconium had been discarded, and their forewing (from the apex to its insertion in 
the thorax) measured with a caliper, which is good indicator of body mass in butterflies 
(Wiklund and Forsberg, 1991). The adults were kept in unisexual groups in cages made of 
a wooden frame covered with mesh cloth (32 X 54.5 X 45 cm) in an insectary (12h 
light:12h dark cycle and 22ºC average temperature). Every morning, adults were fed ad 
libitum a 10% glucose solution imbibed in small cubes of plastic foam. 
 
Experimental protocol 
Experiment 1: The effect of female size 
To assess if female size affects the allocation of ejaculates (= spermatophore + accesory 
substances), a group of virgin males fed ad libitum throughout the larval stages and 
matched for weight, wing length and age (Table 1) were mated with virgin females of two 
different sizes, but similar age (Table 1). For this purpose, we raised females from larvae 
 34 
assigned to one of two diets: larvae starved during their last (fifth) instar (hereafter, Small 
females), which causes a significant reduction in adult body size (a few, not counted, 
larvae died during this procedure), or fed ad libitum (referred to as Large female) during 
their last larval instar. Males were randomly assigned to one of two treatments referred to 
as “female size”. The first group was mated with Small females (N = 24) and the second 
group mated with Large females (N = 24). Mated males of each group were then divided in 
two, one half copulated in a second occasion with Small females and the other half mated 
with Large females, thus producing four groups, each of 12 individuals, designated 
Small/Small when the males mated in both occasions with small females, Small/Large 
when the males mated first with small females and then with large females, and so on. 
 
Experiment 2: The effect of female age 
To assess if female age affects the allocation of ejaculates, a group of virgin males, fed ad 
libitum throughout the larval stages and matched for weight, wing length and age (Table 1) 
were mated with virgin females from two different age categories, but with similar body 
weight and wing length (Table 1). Males were randomly assigned to one of two treatments 
referred to as “female age”. The first group (called Young females), was composed of 
females less than 3 days of age, whereas the second group (Old females) was formed by 
females older than 4 days (Young females; N = 21; Old females, N = 22; Table 1). Mated 
males of each group were then divided in two groups, one group copulated in a second 
occasion with Old females (Young/Old, N = 11; Old/Old, N = 10) and the other group 
mated with Young females (Young/Young, N = 10; Old/Young, N = 12). One male from the 
Old/Young treatment did not transfer a second spermatophore and was excluded from the 
analyses. 
 35 
Matings and ejaculate measurement 
Copulations were obtained by placing an experimental male and a virgin female in a cage 
made of a plastic tube frame covered with mesh cloth (44 X 44 X 44 cm). Mating cages 
were placed outdoors in a garden adjacent to the Pedregal de San Angel for up to 6 h 
(between 10:00 and 16 hours) during sunny days. Butterflies were observed continuously 
to determine the start of copulations; copula duration was measured. After copulation, the 
mated female was replaced by the second virgin female. The 11 males who refused to 
mate after three days of their first mating and the 11 males that died before remating were 
removed from the experiment. After their second copulation, males were kept in groups in 
cages and fed ad libitum until death. Unmated females were moved to a different cage 
until used for further mating. After copulation, females were euthanized by freezing and 
kept frozen until dissection. The corpus bursa of mated females was dissected out in 
saline solution and cleared with potassium hydroxide solution (10%) during approximately 
3 min. After eliminating excess liquid by placing it on a paper towel for 30 min, the corpus 
bursa was weighed in a microbalance (model Orion Cahn C-33; Thermo Electron 
Corporation, Waltham, Massachusetts) and photographed with a digital camera (Sony 
DSC-P50 Cyber-Shot 2.1)mounted on a dissection microscope (Olympus SZH10) at 2X 
magnification. The area covered by the ejaculate, observed through the transparent wall of 
the corpus bursa, was measured on the digital images with the software Image Tool 3.00. 
Subsequently, the spermatophore was carefully dissected out of the corpus bursa, excess 
liquid was eliminated by placing it on a paper towel for 30 min, and it was weighed and 
measured in the same way as the corpus bursa. 
 
 
 36 
Statistical Analyses 
We used a Mann-Whitney U-test to test the prediction that males will transfer larger 
ejaculates to high quality females (i.e. Large females in the first experiment and Young 
females in the second) than to low quality females (i.e. Small females in the first 
experiment and Old females in the second). We compared copula duration and the size of 
the ejaculates (weight and area of the ejaculate and the spermatophore) transferred by 
males during their first copulation. We tested the prediction that males that first mated with 
high quality females (Large or Young) will show a larger reduction in ejaculate size 
transferred during a second copulation than males first mated with low quality females 
(Small or Old) by using Kruskal-Wallis Tests to compare the proportional decrease in the 
size of ejaculates transferred in consecutive matings by males of each of the four 
treatments in both experiment. For significant results, we conducted non-parametric post 
hoc procedures, the procedure involved taking the difference between the mean ranks of 
the different groups and comparing this to a value based on the value of z (corrected for 
the number of comparisons being done) and a constant based on the total sample size 
and the sample size in the two groups being compared. These analyses were conducted 
using SPSS version 20. Throughout the text statistics reported are median (Q25%-Q75%). 
 
2.4 Results 
Experiment 1: The effect of female size 
Effects of larval diet in the size of the adult female 
The manipulation of female size was successful. Females subjected to food restriction 
during the last (= fifth) larval instar (Small females; N = 24) were smaller and had shorter 
 37 
right wing length than females fed ad libitum (Large females; N = 24) throughout the larval 
stage (Table 1). 
 
Copula duration 
First matings with Large and Small females were of similar duration (Table 1). In this 
experiment, 11 males (out of 48) had their two copulations on the same day and, as 
usually happens in butterflies, the second lasted much longer than the first (first 
copulation: 63 [50−65] min; second copulation: 905 [710−942] min; Wilcoxon Matched 
Pairs Test, Z = 2.93, P = 0.003): two of these males belonged to the Small/Small 
treatment, four to the Small/Large treatment, three to the Large/Small treatment, and two 
to the Large/Large treatment. Excluding these 11 second copulations of the same day 
from the analysis, there were not differences in the duration of consecutive copulations by 
the same male (first copulation: 70 [57−80] min; second copulation: 73 [60−110] min; 
Wilcoxon Matched Pairs Test, N = 37, Z = 1.35, P = 0.18). 
 
Effects on ejaculate size 
Female size had an effect on the size of ejaculates (spermatophore + accessory 
substances) transferred by males in their first mating. As expected, Large females 
received heavier and larger ejaculates than Small females (Table 1). Although the area of 
the spermatophores transferred to Large females was larger than that transferred to Small 
females, the weight of the spermatophores received by Large and Small females was 
similar (Table 1; Fig. 1). 
 
 38 
We found ejaculate size differences within the same group of males matched for the first 
time with Small females [group of males divided a posteriori for this analysis by those who 
would mate with Small females (N=12) or Large females (N =12)], and within the group of 
males matched for the first time with Large females. We found significant differences 
between groups of males mated for the first time with Larger females in the ejaculate 
weight (U = 25.5, P = 0.006), but not in the other characteristics of the ejaculates 
(Ejaculate area: U = 40, P = 0.068; Spermatophore weight: U = 68, P = 0.843; 
Spermatophore area: U = 40, P = 0. 068). In the case of males matched for the first time 
with Small females, we found the same significant effects, except that spermatophore area 
was also affected (Ejaculate weight: U = 20, P = 0.002; Ejaculate area: U = 43.5, P = 
0.101; Spermatophore weight: U = 49, P = 0.198; Spermatophore area: U = 37.5, P = 
0.045). 
 
Whole ejaculates and spermatophores produced in first copulations were larger than 
ejaculates produced in second copulations (ejaculate weight: 1st copulation: 0.655 
[0.441−0.777] g, 2nd copulation: 0.238 [0.176−0.324] g, Wilcoxon Matched Pairs Test: Z = 
6.01, P < 0.001; spermatophore weight: 1st copulation: 0.234 [0.184−0.337] g, 2nd 
copulation: 0.073 [0.038−0.109] g, Z = 5.8, P < 0.001; ejaculate area: 1st copulation: 2.46 
[2.19−2.86] mm, 2nd copulation: 2.05 [1.75−2.27] mm, Z = 5.38, P < 0.001; and 
spermatophore area: 1st copulation: 2.18 [1.99−2.4] mm, 2nd copulation: 1.47 [1.21−1.88] 
mm, Z = 5.47, P < 0.001; Fig. 1). The proportional decrease of ejaculate and 
spermatophore weigth and size between treatments (calculated as the first copulation 
divided by the second copulation) was similar between the four treatments (Kruskal-Wallis 
Test; ejaculate weight: P = 0.87; ejaculate area: P = 0.075; spermatophore weight: P = 
0.39; spermatophore area: P = 0.6). 
 39 
Experiment 2: The effect of female age 
Copula duration 
The first matings with Young and Old females were of similar duration (Table 1). As in 
experiment 1, five males (out of 43) remated on the same day and the second lasted much 
longer than the first (first copulation: 66 [40−95] min, second copulation: 855 [847.5−896.5] 
min, Wilcoxon Matched Pairs Test, N = 5, Z = 2.02, P = 0.043); two of these males 
belonged to the Young/Young treatment, one to the Young/Old treatment and two to the 
Old/Young treatment. Excluding these five second copulations of the same day from the 
analysis, there were differences in the duration of consecutive copulations by the same 
male (first copulation: 67 [60−75.75] min, second copulation: 90 [68.75−110] min, 
Wilcoxon Matched Pairs Test, N = 38, Z = 4.16, P < 0.001). 
 
Effects on ejaculate size 
Female age had no effect on the weight and size of the ejaculates and spermatophores 
transferred by males in the first mating; both Young and Old females received ejaculates 
and spermatophores of similar weight and size (Table 1; Fig. 2). 
 
Ejaculates produced in first copulations were larger than ejaculates produced in second 
copulations (ejaculate weight: 1st copulation: 0.62 [0.512−0.759] g; 2nd copulation: 0.277 
[0.185−0.362] g, Wilcoxon Matched Pairs Test: Z = 5.65, P < 0.001); spermatophore 
weight: 1st copulation: 0.347 [0.26−0.432] g; 2nd copulation: 0.096 [0.054−0.144] g, Z = 
5.65, P < 0.001; ejaculate area: 1st copulation: 2.76 [2.59−2.95] mm, 2nd copulation: 2.12 
 40 
[1.81−2.36] mm, Z = 5.65, P < 0.001; and spermatophore area: 1st copulation: 2.3 
[1.98−2.52] mm, 2nd copulation: 1.64 [1.35−1.83] mm, Z = 5.65, P < 0.001; Fig. 2). 
 
Although the global analysis detected significant differences in the proportional reduction 
of ejaculate weight (Kruskal-Wallis Test, P = 0.046), the non-parametric post hoc tests did 
not detectany significant difference between treatments. Thus, to avoid falling in a Type 1 
error, we conclude that there were no significant differences in the proportional decrease 
of ejaculate weight. There was no significant difference in the proportional decrease of the 
other three variables between treatments (Kruskal-Wallis Test; ejaculate area: P = 0.176; 
spermatophore weight: P = 0.166; spermatophore area: P = 0.458). 
 
2.5 Discussion 
Our study shows that in Leptophobia aripa, the butterfly species with the smallest relative 
investment in ejaculates recorded to date (Caballero-Mendieta and Cordero, 2013), larger 
females have larger ejaculates inside their genital tract (the corpus bursae) after mating 
with virgin males, suggesting strategic ejaculation by the males (Wedell et al., 2002; Kelly 
and Jennions, 2011). This result is similar to other studies with lepidopterans (Boggs 1981; 
Gage, 1998; Win et al., 2015). Males of the monandrous moth Ostrinia scapulalis 
transferred spermatophores of smaller size and with less protein to smaller females (Win 
et al., 2015). Gage (1998) also found that males of the polyandrous moth Plodia 
interpunctella produce a larger ejaculate when mating with larger females. However, in 
other cases female condition have been found to have no discernible effect on the amount 
of ejaculate transferred (Rutowski, 1984), for example, in Jalmenus evagoras a 
monandrous species, female characteristics in general did not affect ejaculate mass 
 41 
(Hughes et al., 2000). This pattern of ejaculate allocation is expected when females vary in 
quality and ejaculate production is costly for males. Although we have not measured the 
effect of female size on fecundity in L. aripa, variation in female size is relatively wide in 
this species (e.g. Table 1) and in most butterfly species studied to date a positive 
correlation between female size and number of eggs laid has been found (Lederhouse, 
1981; Gilbert, 1984; Haukioja and Neuvonen, 1985; Marshall, 1990; Oberhauser, 1997), 
thus we assume this is likely the case in the species we studied. On the other hand, we 
have previously shown that ejaculate production is costly for male L. aripa because there 
is a negative correlation between the number of ejaculates produced on male longevity 
and because ejaculate size decreases in consecutive copulations (Caballero-Mendieta 
and Cordero, 2013). This is interesting because it shows that although males of species 
that tend to be monandrous are selected to produce smaller ejaculates (Svärd, 1985; 
Svärd and Wiklund, 1989; Hughes et al., 2000; Wiklund, 2003; Kelly and Jennions, 2011), 
the reduced size of their ejaculates does not release them from paying significant costs. It 
will be interesting to study the chemical composition of ejaculates to understand why they 
are costly despite being produced in relatively small quantities. 
 
As in several other lepidopterans (e.g. Svärd, 1985; Svärd and Wiklund, 1986; Rutowski et 
al., 1987; Hughes et al., 2000; Velde et al., 2011), the ejaculate of L. aripa is composed of 
a spermatophore and accessory amorphous or liquid substances. Virgin males transferred 
spermatophores of similar size and weight to Large and Small females, and the 
differences found in the size and weight of the corpus bursae were due to differences in 
additional substances. This same pattern was found even within the same groups of Small 
or Large females even when they mated with males with similar physical characteristics. In 
this context, based on the standard explanation for the transference of larger ejaculates to 
 42 
higher quality females (Large females in our case), the result suggest that males 
compensate the ejaculate size by increasing the amount of accessory substances, and 
that this would reduce sperm competition because the degree of distention of the corpus 
bursae is frequently negatively correlated to the duration of the postmating period during 
which there is a decrease in female sexual receptivity (Sugawara, 1979; Oberhauser, 
1989; Wiklund, 2003; Wedell, 2005). However, this explanation seems unlikely for a 
butterfly that tends to be monandrous as L. aripa. In cases like this, the hypothesis that 
selection for paternal investment favors males transferring larger ejaculates to more 
fecund females seems more likely (Boggs, 1981; Win et al., 2015). In both explanations, 
the differences between the patterns of ejaculate production to females result in added 
accessory substances and the ability to allocate ejaculate components strategically (Svärd 
and Wiklund, 1986; Wedell and Cook, 1999; Bonduriansky, 2001; Larsdotter-Mellström 
and Wiklund, 2009). It also implies production costs for the full ejaculate, despite the small 
investment in ejaculate (Caballero-Mendieta and Cordero, 2013). However, males only 
invest in accessory substances and not in resources to produce spermatophore. This fact 
is considered as evidence of physiological constraints on ejaculate production (Hughes et 
al., 2000). It will be interesting to determine whether the cost of increasing the amount of 
accessory substances are lower than those of increasing spermatophore weight, 
comparing the chemical composition of spermatophores and accessory substances from 
the perspective of paternal investment. For example, males of O. scapulalis, a 
monandrous species, transfer spermatophores with less protein to older and smaller 
females than to younger and larger females (Win et al., 2015). However, an alternative 
explanation for the effect of female size on ejaculate size, that does not involve strategic 
ejaculation, is that the storage capacity of the corpus bursae of Small females is smaller 
that of Large females and males simply transfer as much accessory substances as the 
female can receive (Boggs, 1981; Torres-Vila et al., 1997). Although, other studies have 
 43 
not found an association between bursal weight and body weight (Gage, 1998). Given that 
the corpus bursae of L. aripa seems to be very elastic, the study of its storage capacity will 
be technically challenging. 
 
The above explanations assume that all the accessory substances found in the corpus 
bursa after mating were transferred by the male. This assumption has been made by all 
previous authors studying butterflies in which substantial amounts of accessory 
substances are found in the corpus bursae of mated females (e.g. Svärd, 1985; Svärd and 
Wiklund, 1986; Rutowski et al., 1987; Hughes et al., 2000; Velde et al., 2011). However, 
the fact that insect ejaculates contain substances that influence the reproductive 
physiology and behavior of females in a way that benefit males (for example, they could 
increase the duration of the sexually-refractory period and oviposition rate; Cordero, 1995; 
Gillott, 2003; Poiani, 2006; Avila et al., 2011; South and Lewis, 2011), and the fact that this 
is sometimes done at the expense of female fitness (for example, delayed remating could 
prevent females from obtaining enough ejaculate derived nutrients; Karlsson, 1998; Gillott, 
2003; Poiani, 2006), led us to propose that selection should favor the production by 
females of chemicals that interact with ejaculate substances within the corpus bursa (and 
possibly within the spermatheca). In fact, recent studies of the fine structure and 
transcriptomics of the corpus bursa of several Lepidoptera lend support to this idea 
(Lincango et al., 2013; Al-Wathiqui et al., 2014; see also Cordero and Baixeras, 2015). 
Returning to L. aripa, therefore, an alternative (or possibly complementary) hypothesis to 
explain the differences in ejaculate quantity that we found isthat Large females are able to 
secrete larger amounts of substances than Small females. This is a virtually unexplored 
aspect of sexual interactions that almost certainly will produce fascinating insights of 
sexual coevolution. 
 44 
Several studies indicate that the reproductive potential of female Lepidoptera decreases 
with age both in polyandrous (Ellis and Steele, 1982; Proshold et al., 1982; Rogers and 
Marti, 1996; Huang and Subramanyam, 2003; Xu and Wang, 2009) and monandrous 
species (Barrer, 1976; Boggs, 1986; Unnithan and Paye, 1991; Fadamiro and Baker, 
1999; Torres-Vila et al., 2002; Jiao et al., 2006), suggesting that in L. aripa younger 
females are more valuable as mates. Studies in polyandrous species males show 
preferences to mate with younger females (Rogers and Marti, 1994, 1996, 1997; Huang 
and Subramanyam, 2003; Jiménez-Pérez and Wang, 2004). However, we found no effect 
of female age on the amount of ejaculate stored after mating with virgin males. 
Considering that this species has a strong tendency to monandry, that their densities tend 
to be high (they are considered an important pest of cabbage, broccoli and cauliflower 
crops; Carazo et al, 1990), and that females appear to be able to mate soon after eclosion 
(C. Cordero, personal observations), it is likely that in the wild females are mated soon 
after eclosion and that there has been no selection in favor of male mate choice based on 
age because males almost never find older receptive females. 
 
The variation in the age of female L. aripa had no effect on the size of the ejaculates 
transferred to females in consecutive copulations. Therefore, the expectation of finding 
some discrimination regarding their ejaculates allocation pattern was unsuccessful, 
suggesting that female L. aripa of a wide age range are able to attract and copulate with 
males, or that males have not yet developed the ability to assess female age (Rutowski, 
1981). This result is similar to another study with the monandrous species O. scapulalis, 
where spermatophore size was not related to female age (Win et al., 2015). This contrasts 
with the effect observed in females of other monandrous species, for example aged 
Lymantria dispar females were less likely to mate or receive a full complement of sperm 
 45 
than females exposed to males within the first few days after eclosion (Proshold, 1996). 
Similarly, in P. interpuncella a polyandrous species, older females received lower numbers 
of apyrene and eupyrene sperm, suggesting that males may reduce eupyrene sperm 
numbers to older virgin females since aged females are of a lower reproductive value. 
Older virgin females will live and reproduce for only a short period after mating, and also 
have low risks of generating future sperm competition, because they have less time 
available to remate (Cook and Gage, 1995). 
 
Considering that the resources invested in ejaculates are non-renewable, why do males 
invest in larger ejaculates during first copulations even though this means producing 
smaller ejaculates in subsequent copulations? It is likely that in L. aripa the tendency to 
monandry, the relatively high densities, and the apparent ability of females to mate soon 
after eclosion mentioned above also explain why males transfer larger ejaculates during 
their first copulations at the beginning of the mating season, when virgin females are 
recently eclosed; later in the season the probability of finding receptive (mainly virgin) 
females decreases and the expected fitness returns from the resources invested in 
ejaculates decrease, as in other species of Lepidopterans (Svärd and Wiklund, 1986), thus 
favoring the observed pattern of ejaculate transfer in subsequent copulations of the same 
male. The fact that the proportional decrease of ejaculate size and weight was similar in 
males from the different treatments in the experiment in which female size was 
manipulated is difficult to understand, particularly for the treatment in which males 
transferred smaller ejaculates to smaller females during their first copulation and then were 
paired with larger females. Why did these males not transfer larger ejaculates even though 
they presumably had more resources for the second ejaculate, compared to males that 
transferred larger ejeculates to larger females during their first copulations? 
 46 
Finally, the size of the ejaculates produced in L. aripa decreases in consecutive 
copulations, as in most lepidopterans (Svärd, 1985; Svärd and Wiklund, 1986, 1989; 
Bissoondath and Wiklund, 1995; Hughes et al., 2000; Ferkau and Fischer, 2006; Velde et 
al., 2011). This result suggests that male capacity in L. aripa to produce large ejaculates is 
limited, additionally given that it is a mostly monandrous species, there is low opportunity 
for males to remate with virgin females, so it is likely that there is selection pressure on the 
male's ability to produce a large first ejaculate but small successive ejaculates 
(Bissoondath and Wiklund, 1996). Further, we found as in other studies, that when males 
copulate twice on the same day, the second copulation lasts much longer than the first 
(Rutowski, 1979; Svärd and Wiklund, 1986; Rutowski et al., 1987; Bissoondath and 
Wiklund, 1996; Watanabe et al., 1998; Wedell and Cook, 1999). Copulation duration has 
generally been interpreted as a mechanism to increase male fitness by reducing the 
probability of further mating by the female (Parker, 1979). However, in a species such as 
L. aripa, where the female mates only once (Caballero-Mendieta and Cordero, 2013), and 
where sperm displacement is presumably not an issue, the adaptive nature of prolonged 
copulation is not clear, especially as it imposes costs on both sexes (e.g. Cook, 1999). It 
therefore seems likely that the decreases of size of the ejaculates in consecutive 
copulations and increasing copulation times are evidence of physiological constraints on 
ejaculate production (Hughes et al., 2000). 
 
In conclusion, our study shows that males of monandrous species L. aripa with relative low 
investment in ejaculates respond to variation in the quality of females. Males perform mate 
choice during copulation by allocating more ejaculate to larger females with higher 
reproductive potential, thereby maximizing their total reproductive success. However, 
female age had no effect on the size of the ejaculates transferred by males. These results 
 47 
highlight the importance of considering the variation in the quality of females as 
determinants of the amount of investment resources transferred to females. 
 
Acknowledgements 
We thank Margarita Martínez-Gómez, A. Córdoba and Guillermo Jiménez-Cortés for 
comments on the project. This research is part of the Doctoral thesis of N. C-M in the 
Posgrado en Ciencias Biomédicas (Universidad Nacional Autónoma de México) and was 
supported by the Posgrado en Ciencias Biomédicas (Universidad Nacional Autónoma de 
México) and by a grant from PAPIIT-Universidad Nacional Autónoma de México 
(IN213011) to CC. N. C-M was supported by a CONACYT (México) scholarship. 
 
2.6 REFERENCES 
Al-Wathiqui N, Lewis SM, Dopman EB (2014) Using RNA sequencing to characterize 
female reproductive genes between Z and E strains of European Corn Borer moth 
(Ostrinia nubilalis). BMC Genomics 15:189 
Avila FW, Sirot LK, LaFlamme BA, Rubinstein CD, Wolfner MF (2011) Insect seminal fluid 
proteins: identification and function. Annu Rev Entomol 56:21 40 
Barrer PM (1976) The influence of delayed mating on the reproduction of Ephesia cautella 
(Lepidoptera: