Descarga la aplicación para disfrutar aún más
Vista previa del material en texto
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE CIENCIAS “EVALUACIÓN FUNCIONAL DE NEUTRÓFILOS DE SANGRE PERIFÉRICA DE PACIENTES CON CÁNCER PULMONAR" T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: B I Ó L O G O P R E S E N T A : MARÍA DE LOS ÁNGELES GARCÍA VICENTE DIRECTOR DE TESIS: DRA. LOURDES MARÍA BARRERA RAMÍREZ Cd. Universitaria, D. F. 2015 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 2 1. Datos del alumno. García Vicente María de los Ángeles 67304350 Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Ciencias Biología 307231048 2. Datos del tutor. Dra Lourdes María Barrera Ramírez 3. Datos del sinodal 1 Dra María de Lourdes Segura Valdez 4. Datos del sinodal 2 Dr Luis Felipe Montaño Estrada 5. Datos del sinodal 3 Dra Erika Patricia Rendón Huerta 6. Datos del sinodal 4 M en C Oscar Gerardo Arrieta Rodríguez 7. Datos del trabajo escrito. Evaluación funcional de neutrófilos de sangre periférica de pacientes con cáncer pulmonar. 60p 2015 3 AGRADECIMIENTOS A la Universidad Nacional Autónoma de México por todos los conocimientos y valores adquiridos desde la preparatoria. A la Facultad de Ciencias por abrirme la puerta al conocimiento científico, por fomentar en mí el amor a la Biología y por brindarme un sinfín de herramientas que me permitirán desarrollarme como una buena profesionista y ciudadana. A la Dra. Lourdes María Barrera Ramírez por ayudarme a desarrollar un pensamiento científico y crítico, gracias también por la toda la confianza para llevar a cabo este proyecto, así como el apoyo económico para desarrollar esta investigación. Al laboratorio de Inmunología Integrativa del INER, especialmente a la Dra. Isabel Sada por todo el apoyo para concluir este proyecto, gracias por todas las críticas y gracias por las valiosas clases tanto en el taller “Inmunología Molecular del Pulmón”, como en los seminarios. Al Dr. José G. Cisneros Lira, por todo el apoyo brindado desde el comienzo del proyecto, gracias por todo el conocimiento compartido y gracias por el excelente trabajo docente desempeñado durante el taller “Inmunología Molecular del Pulmón”. A mis sinodales: Dra Lourdes Segura Valdez, Dr Luis Felipe Montaño Estrada, Dra Erika Patricia Rendón Huerta y Dr Oscar Gerardo Arrieta Rodríguez por sus importantes aportaciones a este trabajo. 4 AGRADECIMIENTOS PERSONALES A mi familia; mi mamá Irma Vicente, mi papá Mario García, muchas gracias por su apoyo incondicional, por todos los esfuerzos realizados para que yo alcance mis metas, gracias por la excelente educación que me han proporcionado, por todos los consejos, por escucharme y orientarme, pero sobre todo por el amor, el cariño y por enseñarme a siempre esforzarme para lograr mis objetivos y dar lo mejor de mí. Gracias a mi Hermano José Ramón García Vicente, por siempre apoyarme, por todo el cariño, por siempre ayudarme a encontrar la respuesta. Gracias a mi tío José Vicente, por siempre darme excelentes consejos, por apoyarme incondicionalmente y siempre confiar en mí. Gracias a mi abuelita Felipa Cruz Martínez, en donde te encuentres, muchas gracias por todo el cariño que siempre me diste, por todos los consejos y por enseñarme el valor de la dedicación y a siempre esforzarme. A mi mis hermanos-primos Claudia López Vicente, Carlos López Vicente y José Luis López Vicente y a mi tía Tere Vicente, por su invaluable apoyo y cariño. A todos mis amigos, Rosalba Pacheco, Eva Mejia, Zayra López, Sandra Antonio, Annette Rivera, Gabriela Venegas, Yazmín Valenzuela, Alfonso García, Abraham Sánchez y Beatriz Hernández, por aguantar mis locuras, por todos los consejos, el cariño y los muy buenos momentos. A Tania Mena, por el apoyo incondicional por siempre estar ahí cuando lo necesite, tu ayuda ha sido invaluable y muy importante. A los Nerds, Fernanda Toscano y Marco Espina, muchas gracias por todos los momentos divertidos, por todo el apoyo para concluir este trabajo y para continuar esforzándome. A mis amigos del INER, Renato Morales, Ángel Gómez, Angélica Rodríguez y José Luis Bañales por todo el apoyo para concluir este proyecto, por todas las pláticas enriquecedoras y los momentos divertidos y agradables. Finalmente quiero agradecer a todos los pacientes y donadores que permitieron llevar a cabo este proyecto. 5 ÍNDICE LISTA DE ABREVIATURAS ......................................................................................... 7 ÍNDICE DE FIGURAS .................................................................................................... 8 ÍNDICE DE TABLAS ...................................................................................................... 9 RESUMEN ..................................................................................................................... 10 INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 11 I. ANTECEDENTES .............................................................................................. 13 1.1 Cáncer ............................................................................................................... 13 1.1.1 Epidemiología del cáncer ................................................................................... 13 1.1.2 Etiología del cáncer ............................................................................................ 14 1.2 Cáncer pulmonar .................................................................................................... 15 1.2.1 Epidemiología ..................................................................................................... 15 1.2.2 Etiología ............................................................................................................. 17 1.2.4 Clasificación histopatológica del cáncer de pulmón. ........................................... 18 1.2.4.1. Cáncer de pulmón de células pequeñas ................................................... 18 1.2.4.2 Cáncer de pulmón de células no pequeñas. .............................................. 19 1.3 Inmunología del cáncer .......................................................................................... 20 1.4 Apoptosis ............................................................................................................... 22 1.4.1 Caspasas. .......................................................................................................... 23 1.4.2 Vía extrínseca De La Apoptosis.......................................................................... 24 1.4.3 Vía Intrínseca De La Apoptosis .......................................................................... 24 1.4.4 La vía efectora. ................................................................................................... 25 1.4.5 Papel de la apoptosisen cáncer. ........................................................................ 26 1.5 Especies Reactivas De Oxígeno. ........................................................................... 26 1.6 Neutrófilos. ............................................................................................................. 26 1.6.1 Desarrollo del linaje de neutrófilos. ..................................................................... 28 1.6.2 Neutrófilos e inflamación. ................................................................................... 29 1.6.3 Función de las especies reactivas de oxígeno en los neutrófilos. ....................... 29 1.6.4 Apoptosis en neutrófilos ..................................................................................... 30 1.6.5 El papel de los neutrófilos en la biología del cáncer. .......................................... 30 II. Justificación. ..................................................................................................... 32 III. HIPÓTESIS ......................................................................................................... 33 IV. OBJETIVOS ........................................................................................................ 34 6 4.1 Objetivo general ..................................................................................................... 34 4.2 Objetivos específicos.............................................................................................. 34 V. MATERIALES Y MÉTODOS............................................................................. 35 5.1 Población de estudio .............................................................................................. 35 5.2 Criterios de inclusión .............................................................................................. 35 5.3 Criterios de exclusión ............................................................................................. 36 5.4 Inmunofenotipificación por citometría de flujo. ........................................................ 36 5.5 Obtención de granulocitos de sangre periférica ...................................................... 36 5.6 Cultivo de células ................................................................................................... 37 5.7 Evaluación de apoptosis por citometría de flujo. ..................................................... 37 5.8 Evaluación de la expresión de caspasas por microscopia de fluorescencia. .......... 37 5.10 Cuantificación relativa de ERO intracelulares por citometría de flujo. ................... 38 5.11 Análisis estadístico ............................................................................................... 39 VI. RESULTADOS. .................................................................................................. 40 6.1 Características demográficas y clínicas de los pacientes. ...................................... 40 6.2 Evaluación de la población de neutrófilos en pacientes con Cáncer Pulmonar. ...... 41 6.3 Expresión de los marcadores CD66b, CD16 y CD11b en pacientes con Cáncer Pulmonar. ..................................................................................................................... 44 6.4 Evaluación de la apoptosis en los neutrófilos de los pacientes. .............................. 45 6.5 Evaluación de la producción de especies reactivas de oxígeno en neutrófilos de pacientes. ..................................................................................................................... 49 VII. DISCUSIÓN ........................................................................................................ 52 VIII. CONCLUSIÓN .................................................................................................... 57 IX. REFERENCIAS .................................................................................................. 58 7 LISTA DE ABREVIATURAS 7-AAD: 7-Amino- Actinomicina-D. AnnexV: Anexina V. CCECC: Carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello. CP: Cáncer de pulmón. CPCNP: Cáncer de pulmón de células no pequeñas. CPCP: Cáncer de pulmón de células pequeñas. ERO: Especies reactivas de oxígeno. EGFR: Receptor del factor de crecimiento epidérmico. IMF: Intensida media de fluorescencia. NAT: Neutrófilos asociados a tumores. PBS: Buffer Fosfato Salino. PMA: Forbol-12 miristato-13acetato. PMN: Neutrófilos polimorofonucleares. RPMI: Roswell Park Memorial Institute medium. SFB: Suero Fetal Bovino. OMS: Organización Mundial de la Salud TNF: Factor de necrosis tumoral. NLR: Relación neutrofilos linfocitos. GM-CSF: Factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos. MPO: Mieloperoxidasa. MMP-9: Metaloproteinasa de matriz 9. VEGF: Factor de crecimiento endotelial vascular. GMDSCs: Células mieloides supresoras de tipo granulocitico. MDSCs: Células mieloides supresoras. RCC: Carcinoma de células renales. IASLC: Asociación internacional para el estudio del cáncer de pulmón. 8 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Tasas de Incidencia y Mortalidad del cáncer estandarizadas por edad para ambos sexos. ....................................................................................................................... 14 Figura 2. Mortalidad por cáncer a nivel mundial. .............................................................. 16 Figura 3. Tasas de Incidencia y Mortalidad del cáncer estandarizadas por edad para ambos sexos en México. ...................................................................................................... 16 Figura 2. Histología del CPCP ......................................................................................... 18 Figura 3. Histología del cáncer de pulmón de células escamosas ................................... 19 Figura 4. Histología del adenocarcinoma ......................................................................... 19 Figura 7. Asociación entre cáncer e inflamación. ............................................................. 21 Figura 8. Estructura de las caspasas ............................................................................... 23 Figura 9. Eventos de la apoptosis. .................................................................................. 25 Figura 10. Diferenciación, liberación, reclutamiento y activación de neutrófilos. .............. 27 Figura 11. Desarrollo del linaje de neutrófilos. ................................................................. 28 Figura 12. La dicotomía de los neutrófilos en el cáncer. ................................................. 31 Figura 13. Estrategia de análisis para identificar el fenotipo de los neutrófilos. ................ 42 Figura 14. Los neutrófilos se encuentran incrementados en los pacientes con cáncer de pulmón. ..................................................................................................................... 43 Figura 15. Expresión de marcadores de maduración en neutrófilos. ................................ 44 Figura 16. Estrategia de análisis para identificar la expresión de fosfatidilserina y 7AAD en neutrófilos. ................................................................................................................ 46 Figura 17. Apoptosis de neutrófilos a las 24h de cultivo. .................................................. 47 Figura 18. Expresión de caspasas 3 y 7 en neutrófilos a las 4h y 24h de cultivo. ............ 48 Figura 19. Estrategia de análisis para evaluar la producción de ERO. ............................. 49 Figura 20. Incremento en la producción de ERO en pacientes con Adenocarcinoma de pulmón. ..................................................................................................................... 50 9 ÍNDICEDE TABLAS Tabla 1. Características demográficas y clínicas. ............................................................ 40 Tabla 2. Características clínicas. ..................................................................................... 41 Tabla 3. Frecuencia de la población CD66b+CD16+CD11b+. ......................................... 43 Tabla 4. IMF de CD66b. ................................................................................................... 45 Tabla 5. Expresión de las caspasas 3 y 7 a las 24 horas de cultivo. ................................ 48 Tabla 6. IMF de ERO en neutrófilos estimulados con 30nM de PMA. .............................. 51 10 RESUMEN En México, el cáncer de pulmón es la segunda causa de muerte por cáncer en los hombres mientras que en las mujeres es la quinta causa de muerte por esta patología. Durante el desarrollo tumoral ocurre la activación células del sistema inmune innato y adaptativo; los neutrófilos son una de las poblaciones celulares que en años recientes se ha visto implicada en el desarrollo y progresión de diversos tipos de cáncer. En sangre periférica de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas se ha observado un incremento en la frecuencia de neutrófilos, sin embargo la información sobre su participación en el desarrollo de esta enfermedad es limitada. El objetivo de este trabajo fue investigar si existen diferencias en las funciones biológicas de los neutrófilos de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas y los neutrófilos de donadores sanos. Se evaluó el fenotipo de los neutrófilos de sangre periférica con los marcadores CD11b, CD16 y CD66b. En neutrófilos aislados a partir de un gradiente de densidad, se evaluó la apoptosis a las 4 y 24 horas y se evaluó la producción de especies reactivas de oxígeno después de la activación in vitro con PMA. Los resultados obtenidos muestran un incremento en la frecuencia de neutrófilos CD11b+CD16+CD66b+ en muestras de pacientes con CPCNP comparados con donadores sanos. También se observa un incremento en la IMF de CD66b en pacientes en comparación con el grupo control. Los neutrófilos de los pacientes mostraron un retraso en el proceso de apoptosis comparados con los neutrófilos presentes en muestras de donadores sanos a las 24 horas de cultivo. Entre ambos tipos de muestras no se encontraron diferencias en la expresión de fosfatidilserina y 7-AAD entre ambos grupos de estudio sin embargo, se reporta una disminución en la expresión de las caspasas 3 y 7 en los pacientes a las 24 horas de cultivo. Por otro lado los neutrófilos de los pacientes mostraron un incremento en la producción de especies reactivas de oxigeno intracelulares después de activación in vitro comparados con los donadores sanos. El hallazgo del retraso en el proceso de apoptosis de los neutrófilos en los pacientes, podría explicar su incremento en sangre periférica. Este estudio demuestra la importancia de una investigación más amplia en estas células inflamatorias en CPCNP. 11 INTRODUCCIÓN A nivel mundial el cáncer representa la causa principal de muerte. El cáncer de pulmón (CP) es el cáncer con mayor tasa de incidencia en el mundo, se encuentra entre los primeros lugares de incidencia para ambos sexos 1. Durante el desarrollo tumoral se llevan a cabo interacciones entre variantes genéticas y factores ambientales. Algunas condiciones como la inflamación crónica se han asociado con un incremento en el riesgo a desarrollar cáncer. La inflamación crónica involucra la activación y reclutamiento de diversos leucocitos y dentro de estos se encuentran los neutrófilos 2. En humanos los neutrófilos representan del 50 al 70% de leucocitos circulantes totales, la mayoría de las veces presentan un ciclo de vida corto, de 8 a 20 horas en circulación 3, son células que ejercen un efecto negativo durante condiciones de inflación crónica y evidencia reciente indica que estas células tienen un papel clave en el desarrollo tumoral 4. El estudio de los neutrófilos se ha enfocado principalmente en la respuesta inmune que montan contra micro-organismos invasores; sin embargo, se ha observado que son una fuente importante de mediadores pro-inflamatorios que inducen mutación, promueven el crecimiento tumoral, metástasis e incrementan la angiogénesis 5. Los neutrófilos se originan de un progenitor mieloide en la medula ósea, con lo que se genera un grupo jerárquico de células que va de neutrófilos inmaduros a maduros o segmentados, durante su desarrollo los neutrófilos cambian la expresión de sus moléculas de superficie y adquieren funciones efectoras específicas 6. En sangre periférica se identifican principalmente neutrófilos segmentados pero es posible encontrar neutrófilos inmaduros en menor proporción 7. Bajo condiciones patológicas el patrón de distribución de estas células se invierte, en algunos tipos de cáncer se ha reportado un incremento en la frecuencia de neutrófilos inmaduros 8. En condiciones normales, los neutrófilos de sangre periférica mueren por apoptosis espontanea 9. El retraso en la muerte de este tipo celular comúnmente resulta en neutrofilia10. La neutrofilia favorece la liberación excesiva de metabolitos tóxicos, causando daño tisular. En pacientes con cáncer se ha reportado esta condición en sangre periférica pero el mecanismo por el cual los tumores inducen neutrofilia se desconoce 5. Por otro lado las especies reactivas de oxigeno (ERO) tienen un papel importante en el desarrollo tumoral ya que participan en la migración y metástasis pero también están 12 involucradas en actividades antitumorales y pueden ser uno de los mediadores de apoptosis en neutrófilos 11. En el presente trabajo se llevó a cabo una evaluación del estado funcional de neutrófilos de sangre periférica de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas; en el que se analizó el estado de maduración, la muerte por apoptosis y la producción de especies reactivas de oxígeno. 13 I. ANTECEDENTES 1.1 Cáncer. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), el cáncer también referido como tumores malignos o neoplasias malignas, es un término genérico usado para designar un grupo de enfermedades que pueden afectar cualquier parte del cuerpo. Una característica de esta enfermedad es la rápida proliferación de células anormales que se desarrollan más allá de sus límites normales, las cuales tienen la capacidad de invadir zonas adyacentes o diseminarse a otros órganos, este último proceso es llamado metástasis 12. Todos los tumores ya sean benignos o malignos, tienen dos componentes básicos; el parénquima en donde se encuentran células neoplásicas clonales y el estroma que está formado por tejido conjuntivo, vasos sanguíneos y cantidades variables células del sistema inmune 13. Los tumores malignos reciben su nombre de acuerdo con el tipo celular a partir del cual se originaron. Es así como los tumores del tejido mesenquimatoso se llaman sarcomas, las neoplasias malignas que se originan en el epitelio son llamadas carcinomas y los linfomas son neoplasias del tejido linfoide. Por otro lado las leucemias son un tipo de cáncer que se origina en los leucocitos. Los sarcomas, los carcinomas y los linfomas son ejemplos de tumores sólidos mientras que las leucemias generalmente no forman tumores sólidos 13. 1.1.1 Epidemiología del cáncer. Según la OMS el cáncer es la causa principal de muerte a nivel mundial, para el 2012 se reportaron 14.1 millones de casos nuevos, se le atribuían 8.2 millones de defunciones y 32.6 millones de personas padecían cáncer 14. Las tasas de incidencia y mortalidad son las medidas de ocurrencia del cáncer usadas con mayor frecuencia, la primera indica la cantidad de casos nuevos reportados y la segunda el número de muertes reportadas 15. Losdiferentes tipos de cáncer varían en ocurrencia de acuerdo con el género, la edad, el estatus socioeconómico, la raza, la localización geográfica y el periodo de tiempo (Figura 1). Por otra parte se sabe que el 65% de las muertes por cáncer a nivel mundial ocurren en países en desarrollo 12. En México el cáncer representa la tercera causa de muerte, con 71, 350 defunciones 16. 14 Figura 1. Tasas de Incidencia y Mortalidad del cáncer estandarizadas por edad para ambos sexos. El cáncer de mama es el cáncer con mayor incidencia seguido del cáncer de próstata, el cáncer de pulmón se ubica en tercer lugar de incidencia pero es la principal causa de muerte por cáncer. Fuente: GLOBOCAN 2012. 1.1.2 Etiología del cáncer. Las alteraciones que conducen a la transformación de una célula normal en tumoral, son el resultado de la interacción entre los factores genéticos del paciente y tres categorías de agentes externos. Los carcinógenos físicos, como las radiaciones ultravioleta; carcinógenos químicos, como los componentes del humo de tabaco y carcinógenos biológicos, como las infecciones causadas por determinados virus, bacterias o parásitos,12. Diversos agentes ocasionan alteraciones en los genes encargados de la división celular; estos genes alterados reciben el nombre de oncogenes. Mientras que los genes supresores de tumores codifican para proteínas reguladoras que bloquean el ciclo celular en respuesta a algún daño del DNA 17. El cáncer promueve una desregulación celular y molecular a distintos niveles. Las células pueden reparar los daños ocasionados en su información genética pero si estos no se 15 corrigen adecuadamente promueven que la célula se vuelva cancerosa e inicie un proceso acelerado de multiplicación. Las células cancerosas se caracterizan por su capacidad para proveerse sus propias señales de crecimiento, ignorar las señales de inhibición del crecimiento, evadir la muerte celular, replicarse sin límites, invadir tejidos atravesando las paredes de los capilares y las membranas basales y promover la angiogénesis 18. 1.2 Cáncer pulmonar. El cáncer de pulmón se forma en los tejidos del pulmón, generalmente en las células que recubren las vías aéreas 19. El pulmón es un órgano altamente complejo con alrededor de 40 tipos celulares diferentes. El cáncer de pulmón surge en el epitelio de revestimiento de los bronquios, en la periferia de los pulmones. Los tumores en el pulmón tienden a hacer metástasis hacia los ganglios linfáticos en el cuello, el pecho, la pleura, el hígado, las glándulas suprarrenales y hueso 20. De manera clínica e histológica el cáncer pulmonar se divide en dos categorías; el de células no pequeñas (CPCNP) con el 85% de los casos y el de células pequeñas (CPCP) con el 15% 21. 1.2.1 Epidemiología. El cáncer de pulmón es uno de los cánceres con mayor incidencia a nivel mundial, en el 2012 se reportaron 1.8 millones de casos nuevos. Este cáncer también representa la causa principal de muerte por cáncer en hombres y mujeres en todo el mundo con 1.6 millones de muertes 22 (Figura 2). A pesar de los avances terapéuticos solo el 16.6% de los pacientes con CP seguirán vivos 5 años después del diagnóstico 23. La incidencia de cáncer de pulmón se elevó precipitadamente a partir del siglo XX, debido al incremento del tabaquismo pero actualmente se ha reducido en países que han logrado disminuir el tabaquismo en su población 24. 16 Figura 2. Mortalidad por cáncer a nivel mundial. El cáncer pulmonar es la principal causa de muerte por cáncer en el mundo. Fuente: GLOBOCAN 2012. En México, el cáncer pulmonar es la segunda causa de muerte por tumores malignos en los hombres con 4,318 defunciones, mientras que en mujeres es la quinta causa de muerte por neoplasias malignas 16 (Figura 3). Figura 3. Tasas de Incidencia y Mortalidad del cáncer estandarizadas por edad para ambos sexos en México. En mujeres el cáncer de mama y cervicouterino representan las principales causas de muerte e incidencia mientras que en los hombres el cáncer de próstata y pulmón ocupan el primero y segundo lugares de incidencia y mortalidad respectivamente. Fuente: GLOBOCAN 2012. 17 1.2.2 Etiología. Uno de los acontecimientos más importantes en la historia del cáncer es el descubrimiento del efecto carcinogénico del tabaco. La incidencia del CP aumenta a medida que se incrementa el número de fumadores; por otro lado, el riesgo de padecer cáncer pulmonar es mayor en aquellas personas que comenzaron a fumar desde muy jóvenes y continúan haciéndolo a lo largo de su vida 25. El tabaquismo es la causa principal de todos los tipos de cáncer de pulmón sin embargo, se asocia principalmente con el cáncer de pulmón de células no pequeñas y el cáncer de células escamosas mientras que el adenocarcinoma es el tipo de cáncer que se presenta con mayor frecuencia en mujeres y en personas que nunca han fumado 26. Aproximadamente el 25% de todos los casos de CP se observan en pacientes que nunca han fumado, el cáncer de pulmón en estos pacientes se asocia con factores ambientales que incluyen a los fumadores de segunda mano o fumadores pasivos, la contaminación del aire, la exposición al radón, exposición ocupacional a carcinógenos, humo producido por el aceite de cocina y el humo de leña. Otros factores relacionados son las infecciones, factores hormonales y de la dieta y la diabetes mellitus 27. Estudios han demostrado una asociación entre el riesgo de padecer cáncer de pulmón y los niveles de contaminación de partículas finas, independientemente de la condición de fumador, aunque es más relevante en los no fumadores.26. Una vez que los carcinógenos entran a las células promueven mutaciones que conducen a transformaciones oncogénicas 24. El humo de tabaco contiene cerca de 400 sustancias de las cuales 60 son carcinógenas. Las moléculas más importantes implicadas en el desarrollo del cáncer son los hidrocarburos policíclicos aromáticos y las nitrosaminas 28. Aproximadamente 10% de las muertes por cáncer de pulmón son atribuidas a la exposición por radón en los hogares 26 y existen individuos que desarrollan la enfermedad de manera espontánea, por ejemplo algunos hombres jóvenes tienen una translocación de las proteínas EML4 y ALK 24. En años recientes has sido posible la identificación de mutaciones específicas que tienen implicaciones en el pronóstico y tratamiento de la enfermedad, una de ellas es la mutación del EGFR en adenocarcinoma de no fumadores 28. 18 Por otro lado la heterogeneidad tumoral es la principal razón por la que los pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas con estadios clínicos e histologías similares tienen resultado clínicos y respuesta al tratamiento tan diferentes 28. 1.2.4 Clasificación histopatológica del cáncer de pulmón. De forma clínica e histológica, el cáncer de pulmón se divide en dos categorías; el cáncer de pulmón de células pequeñas y el cáncer de pulmón de células no pequeñas, las cuales requieren diferente manejo y tratamiento, esta clasificación está basada en sus características histológicas 29. 1.2.4.1. Cáncer de pulmón de células pequeñas. El CPCP se caracteriza por una progresión más rápida en comparación con el CPCNP aunque es relativamente más sensible al tratamiento. El CPCP comprende del 20 al 25% de los cánceres de pulmón, morfológicamente se compone de células redondas, ovaladas y con escaso citoplasma 20 (Figura 4). La media de la sobrevida para los pacientes con un estado no avanzado es de aproximadamente 18 meses y en aquellos pacientes con un estado avanzado de la enfermedad es de aproximadamente 9 meses 20. El CPCP se origina en las células de Kulchitsky en el pulmón, estas células se caracterizan por producir hormonas y contener gránulos secretores 24. Está enfermedad en etapaavanzada se trata principalmente con quimioterapia que conduce a una tasa de respuesta del 20 al 30% 20. Figura 2. Histología del CPCP. Células principalmente ovaladas con escaso citoplasma. Modificado de Jadus et al., 2012. 19 1.2.4.2 Cáncer de pulmón de células no pequeñas. El CPCNP comprende entre el 75% y 80% de los casos de cáncer de pulmón, es un grupo morfológicamente muy diverso, dentro de este grupo se encuentra el carcinoma de células escamosas, el cáncer de pulmón de células grandes y el adenocarcinoma 20. El carcinoma de células escamosas se caracteriza por un incremento en la queratinización y en las uniones tipo desmosoma 20 (Figura 5). Comúnmente se localiza las vías aéreas superiores 20. Figura 3. Histología del cáncer de pulmón de células escamosas. Células queratinizadas. Modificado de Jadus et al., 2012. El adenocarcinoma es el subtipo histológico representa el 40% de todos los cánceres de pulmón, surge en las vías aéreas inferiores, frecuentemente en la periferia del pulmón. Muestra una diferenciación glandular con un patrón acinar, papilar, solido o mixto y la producción de moco 20 (Figura 6). El adenocarcinoma es el subtipo histológico más frecuente a nivel mundial. El adenocarcinoma constituye la mayoría de los cánceres de pulmón en mujeres, hombres jóvenes, ex fumadores y no fumadores, 24. Figura 4. Histología del adenocarcinoma. Se observan estructuras tipo glandular arregladas en acinos. Modificado de Jadus et al., 2012. 20 El carcinoma de células grandes es un tipo de CP no diferenciado, en muchos de los casos no es posible hacer una discriminación citológica. Este tipo de cáncer aparece en cualquier parte del pulmón 29 1.3 Inmunología del cáncer. Durante el inicio del desarrollo tumoral ocurre el escape a la respuesta inmune del individuo, con lo que se evita la destrucción de las células tumorales y se promueve la invasión y metástasis. Ésta estrategia de supervivencia y progresión, comprende a la liberación de factores solubles inmunomoduladores al microambiente y promueve el reclutamiento y activación de células con potentes efectos inmunosupresores. Las interacciones que se llevan a cabo entre las células cancerosas y las células normales que se encuentran a sus alrededores son las causantes de que lo tumores sean muy diversos y complicados en sus características biológicas y una diferencia importante es la capacidad de las células malignas para evadir al sistema inmune o bien, hacer que éste favorezca su desarrollo 30. El daño causado por las células cancerosas puede ser letal, sin embargo, numerosos mecanismos de evasión tumoral intrínsecos y extrínsecos previenen su desarrollo. Los mecanismos de supresión tumoral extrínsecos son mecanismos que las células no transformadas usan para censar la presencia de células anormales y así contrarrestar su desarrollo, mientras que los mecanismos intrínsecos son aquellos que ocurren en las células normales y que promueven la activación de la senescencia, la reparación celular o la apoptosis para evitar la transformación 31. El sistema inmune tiene la capacidad de prevenir la formación de tumores mediante varios mecanismos, estos son; proteger al hospedero de oncovirus, eliminando o suprimiendo la infección causada por estos; la oportuna eliminación de patógenos y pronta resolución de la inflamación y la eliminación de células anormales en base a su expresión antigénica, 31. Existen dos procesos inmunológicos importantes durante el desarrollo y progresión del cáncer; la inmunovigilancia y la inmunoedición. La inmunovigilancia es un mecanismo que permite que el sistema inmune reconozca y elimine a células precursoras de cáncer antes de que sean clínicamente evidentes 32. Por otro lado la inmunoedición es un proceso continuo durante la tumorogénesis en el que el sistema inmune protege al hospedero contra el desarrollo de tumores y por otra parte promueve su progresión 31. 21 La inmunidad anit-tumoral involucra todos los tipos de células inmunes, estas células tienen la capacidad de infiltrarse en el tumor, sin embargo no siempre favorecen la respuesta antitumoral 33. Figura 7. Asociación entre cáncer e inflamación. El cáncer y la inflamación están conectados por dos vías: la intrínseca y la extrínseca. En la vía intrínseca las células que se transforman producen mediadores de inflamación, con lo que se origina un microambiente inflamatorio. Por otro lado en la vía extrínseca, condiciones inflamatorias aumentar el riesgo de desarrollar cáncer en ciertos sitios anatómicos. En las dos vías ocurre la activación de factores de transcripción en células tumorales. Dichos factores de transcripción promueven la producción de mediadores inflamatorios, incluyendo citocinas y quimiocinas, además reclutan y activan diversas células inflamatorias. Las citocinas a su vez activan factores de transcripción en las células inflamatorias, las células del estroma y las células tumorales, lo que resulta en la producción de más mediadores inflamatorios, lo que genera un microambiente inflamatorio relacionado con el cáncer. Modificado de Mantovani et al. 2008. Diversos estudios epidemiológicos han demostrado una asociación entre la inflamación crónica y el desarrollo de varios tipos de cáncer. Esta conexión ha sido descrita en dos vías, la extrínseca, en la cual condiciones inflamatorias incrementan el riesgo de desarrollar 22 cáncer, por ejemplo inflamación intestinal crónica y la vía intrínseca, dirigida por alteraciones genéticas que promueven inflamación y neoplasia, por ejemplo oncogenes. En ambas vías, uno de los sellos característicos de la inflamación relacionada con el cáncer es la presencia de células inflamatorias tales como macrófagos, células cebadas, neutrófilos, entre otras y la presencia de mediadores inflamatorios como quimiocinas, citocinas y prostaglandinas. Todos estos componentes tienen un efecto directo sobre el desarrollo tumoral ya que promueven la proliferación y supervivencia de células tumorales, angiogénesis y metástasis 2 (Figura 7). 1.4 Apoptosis. El termino apoptosis fue usado por primera vez en 1972 por Kerr, Wyllie y Currie para describir un tipo de muerte diferente a los descritos anteriormente, su nombre alude al termino griego “degeneración” dado el aspecto morfológico de los cuerpos apoptóticos rodeados de membrana 34. La apoptosis es un tipo de muerte genéticamente programada que ha sido conservada evolutivamente, es un proceso muy complejo y altamente regulado que se inicia dentro de la célula en respuesta a estímulos intracelulares o extracelulares35. La apoptosis ocurre normalmente en muchos procesos fisiológicos como el desarrollo embrionario, el mantenimiento de la homeostasis en los tejidos y en la actividad del sistema inmune 35. La células apoptoticas muestran diversa modificaciones a nivel morfológico y bioquímico dentro de las que destacan disminución del tamaño celular, empaquetamiento de los organelos, fragmentación del DNA, escisión de proteínas vitales, la expresión de receptores de reconocimiento para células fagociticas, la formación de cuerpos apoptoticos y depende de la activación de un grupo de proteínas proteasas de cisteína llamadas caspasas 34. Se distinguen dos vías principales de muerte por apoptosis la intrínseca o vía de la mitocondria y la extrínseca o vía dependiente de receptores de muerte. Ambas vías pueden estar asociadas e influenciar la una a la otra, todas las vías convergen en la activación de las caspasas 3 o 7 36. Por otro lado la apoptosis desempeña un papel esencial en la prevención de la formación de tumores y su desregulación está involucrada en la patogénesis de diversas enfermedades incluido el cáncer. Una desregulada proliferación junto con una supresión de la muerte celular promueven la progresióndel cáncer 37. 23 1.4.1 Caspasas. La caspasas son proteasas de cisteína intracelulares que tienen un papel fundamental en la iniciación y ejecución de la apoptosis, necrosis e inflamación 36. Son sintetizadas en forma de zimógeno llamado procaspasa el cual es activado por proteólisis con lo que se genera una enzima activa que a su vez media la proteólisis de otras caspasas o proteínas celulares 36. Una caspasa activa consta de dos subunidades largas y dos subunidades pequeñas, formando un heterodímero que se encuentra asociado en un tetrámero (Figura 8). Las caspasas reconocen un una secuencia de 4 a 5 aminoácidos en el substrato el cual debe tener un residuo de ácido aspártico en el sitio P4. La segmentación de la proteína blanco ocurre en el carbonilo terminal del residuo del ácido aspártico 37. Figura 8. Estructura de las caspasas. A) Organización de las procaspasas iniciadoras de mamífero. B) Vista esquemática de la activación de la procaspasa-8. Modificado de Rastogi y Sinha, 2009. Las procaspasas se activan por un mecanismo autoproteolítico o por la acción de otras proteasas, una vez que una procaspasa se ha activado, tiene la capacidad de activar a otras procaspasas provocando la iniciación de una casada de señalización 38. 24 En mamíferos se han descrito 13 caspasas que se dividen en tres grupos funcionales; las iniciadoras, caspasa 2, 8 y 9; las efectoras, caspasas 3, 6 y 7; las inflamatorias, caspasas 1, 4, 5, 11, 12 y 13 36. 1.4.2 Vía extrínseca de la apoptosis. La vía extrínseca de la apoptosis es también conocida como vía de receptores de muerte, ya que involucra la interacción de receptores transmembranales en la célula blanco con sus ligados de muerte. Entre los receptores que participan en esta vía se encuentra la superfamilia TNF (Factor de Necrosis Tumoral, por sus siglas en ingles). Los ligandos y receptores de muerte mejor caracterizados son FasL / FasR, TNF-α/TNFR1, Apo3L/DR3, Apo2L/DR4 y Apo2L/DR5 39. En humanos los ligandos de muerte atraen a FADD (Dominio de muerte asociado a Fas por sus siglas en ingles), que a su vez recluta a las procaspasas 8 o 10, la proximidad entre los zimógenos promueve su dimerización y autoctálisis 40 (Figura 9). 1.4.3 Vía Intrínseca de la Apoptosis. La vía intrínseca de la apoptosis mejor conocida como vía de la mitocondria, no involucra receptores de muerte, es mediada por señales intracelulares que actúan directamente en la célula blanco y son dependientes los eventos que ocurren en la mitocondria. Las señales intracelulares provocan cambios en la membrana interna mitocondrial que resultan en la formación de un poro mitocondrial, pérdida del potencial de membrana mitocondrial y la liberación de dos grupos de proteínas pro-apoptóticas. En el primer grupo se encuentra el citocromo C, Smac/DIABLO y la serin-proteasa HtrA2/Omi, estas proteínas activan la cascada de caspasas. El segundo grupo de proteínas lo conforman AIF, la endonucleasa G y CAD que son liberadas de la mitocondria durante la apoptosis 41. El citocromo c, liberado de la mitocondria dañada, produce un cambio conformacional en Apaf-1 (factor de activación de proteasas apoptóticas-1, por sus siglas en ingles), con lo que se promueve el reclutamiento y oligomerización de la procaspasa-9, lo que favorece la formación de un complejo conocido como apoptosoma 39. Por otro lado Smac/DIABLO y HtrA2/Omi promueven la activación de caspasas por su unión a proteínas inhibidoras de la apoptosis (Inhibitor of apoptosis proteins, IAP por sus siglas en inglés) (Figura 9). 25 Figura 9. Eventos de la apoptosis. Las dos principales vías de apoptosis son la extrínseca y la intrínseca. Modificado de Wong 2011. 1.4.4 La vía efectora. La fase de ejecución de las apoptosis involucra la activación de una serie de caspasas, ambas vías convergen en la caspasa 3 (Figura 9), la caspasa 9 y 8 promueve la activación de la procaspasa 3 37. La caspasa 3, escinde al inhibidor de la caspasa-desoxirribonucleasa activado. Además, las caspasas río abajo inducen la escisión de proteínas cinasas, proteínas del citoesqueleto y proteínas de reparación del DNA. También tienen un efecto en el citoesqueleto, ciclo 26 celular y las vías de señalización, que en conjunto contribuyen a los cambios morfológicos típicos de la apoptosis 42. 1.4.5 Papel de la apoptosis en cáncer. El cáncer es un ejemplo de cómo los mecanismos que ocurren normalmente en la regulación del ciclo celular son disfuncionales 34. La supresión de la apoptosis durante la carcinogénesis tienen un papel fundamental en el desarrollo y progresión del cáncer, dado que alteraciones en la apoptosis no solo funciona para preservar a las células neoplásicas, también facilitan la metástasis 43. Las células tumorales adquieren resistencia a la apoptosis mediante la expresión de proteínas anti-apoptóticas de la familia BcL-2 o bien por la desregulación o mutación de las proteínas pro-apoptóticas de la misma familia como Bax 34. 1.5 Especies Reactivas De Oxígeno. Las ERO no representan una sola entidad de moléculas; son un grupo muy diverso de moleculas que difieren en su estabilidad, rectividad y pemeabilidad de membrana, sin embago todas tienen la capacidad de ejerecer un daño a otras moléculas. En este grupo se encuentran radicales como el anion superóxido, el hidroxilo, el peroxilo y el alcoxilo, asi como el peroxido de hidrogeno 44. El complejo NADH oxidasa se ensambla en las membranas celulares, una vez formado el complejo se activa una casada reactiva de oxígeno en la que se reduce el oxígeno molecular presente dentro de la célula al ion superóxido. El ion superóxido no es un fuerte oxidante por lo que puede ser convertido fácilmente a peróxido de hidrogeno además el superóxido puede reaccionar con el óxido nítrico generado en los sitos de inflamación con lo que se convierte a peroxinitrito un fuerte oxidante 45. 1.6 Neutrófilos. El sistema inmune comprende diferentes tipos de células, dentro de éstas encontramos a los neutrófilos 46. Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes, en humanos representan del 50 al 70% de los leucocitos circulantes; los neutrófilos maduros también se conocen como neutrófilos polimorfonucleares (Polymorphonuclear neutrophils, PMN por 27 sus siglas en inglés), debido a que el núcleo de las células maduras presenta de 2 a 4 lóbulos unidos por fragmentos de cromatina 47. Junto con los basófilos y los eosinófilos, los neutrófilos pertenecen al grupo de los granulocitos, caracterizados por la presencia de gránulos en su citoplasma 45. Tradicionalmente los neutrófilos son reconocidos por ser las primeras células que actúan en las infecciones e inflamación aguda. Durante mucho tiempo fueron vistos y caracterizados como células que poseían una limitada capacidad de biosíntesis a pesar de su habilidad para fagocitar, liberar enzimas líticas y producir ERO. Evidencia reciente indica que los neutrófilos producen moléculas anti-inflamatorias, así como factores que promueven la resolución de la inflamación (Mantovani et al. 2011) (Figura 10). Por otra parte datos recientes siguieren que el fenotipo de los neutrófilos puede polarizarse en respuesta distintas señales ambientales 48. Figura 10. Diferenciación, liberación, reclutamiento y activación de neutrófilos. Los neutrófilos se diferencian en la medula ósea y los neutrófilos maduros son liberados en sangre periférica. En condiciones de inflación e infección, la producción de neutrófilos incrementa y los neutrófilos maduros e inmaduros pueden ser liberados de la medula ósea. Los neutrófilos maduros no proliferan y experimentan apoptosis constitutiva. En humanos en condiciones basales los neutrófilos en sangre periférica tienen un ciclo de vida corto. Los neutrófilos son rápidamente reclutadosa los sitios de infección en respuesta a estímulos por citocinas tales como la IL-8. Una baja afinidad por las selectinas promueve el movimiento de neutrófilos a través de los vasos sanguíneos, también ocurre la sobrexpresión de los marcadores CD11b/CD18 que a su vez interactúan con moléculas de adhesión en las células endoteliales y a continuación los neutrófilos migran hacia los tejidos donde son requeridos. Modificado de Eyles et al. 2006. 28 Los neutrófilos son esenciales en el sistema inmune innato, sobre todo durante la resistencia a las invasiones por patógenos 48. En los sitios donde son requeridos, la activación de los neutrófilos promueve la producción de especies reactivas de oxígeno y la movilización de los gránulos citoplasmáticos. Los gránulos pueden fusionarse con el fagosoma o bien fusionase con la membrana para liberar su contenido antimicrobiano fuera de la célula 45. 1.6.1 Desarrollo del linaje de neutrófilos. Los neutrofilos se desarrollan en la medula ósea a partir de células madre hematopoyeticas en un proceso conocido como granulopoyesis, debido a señales provenientes de factores de crecimiento como el GM-CSF entro otras citocinas, las células madre hematopoyeticas se diferencian en una población celular que dará origen a los granulocitos 50. Figura 11. Desarrollo del linaje de neutrófilos. Se observan los estados de maduración y los marcadores de superficie que ayudan a identificar las diferentes etapas durante todo el proceso de maduración. En los dibujos de abajo se ilustran las modificaciones por las que atraviesa el núcleo hasta convertirse en células maduras con el núcleo segmentado. 29 El linaje de neutrófilo puede dividirse en tres grandes grupos: el primero compuesto por un pool de células madre hematopoyéticas y progenitores pluripotenciales; un pool de células mitóticas capaces de proliferar en un linaje comprometido a generar mieloblastos, promielocitos y mielocitos; finalmente un pool de células no mitóticas compuesto por metamielocitos, células en banda y neutrófilos maduros o segmentados 50 (Figura 11). Los neutrófilos no mitóticos constituyen el 95% del total de neutrófilos en los humanos, la liberación neutrófilos segmentados o maduros desde la médula ósea es regulada por quimiocinas, que controlan el paso de los PMN a la circulación y además mantienen un pool de células listas para ser liberadas en caso de ser requeridas 45. El factor estimulante de colonias de granulocitos (Granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF por sus siglas en inglés) es el principal factor regulador del ciclo de vida de los neutrófilos pues actúa sobre la proliferación celular, la supervivencia, la diferenciación, la movilización, la expresión de proteínas anti-apoptoticas 50. 1.6.2 Neutrófilos e inflamación. La liberación del contenido de los gránulos citoplasmáticos de los neutrófilos contribuye con la creación de un medio antimicrobiano en los sitos de inflamación. 45. Los neutrófilos son las primeras células en ser reclutadas durante las infecciones, sin embargo la infiltración de los neutrófilos en los tejidos no se limita a condiciones de infección ya que el reclutamiento puede ser mediado por señales peptídicas, por quimiocinas y por la participación del inflamosoma 50. Los neutrófilos han sido considerados como las células efectoras finales durante la fase de resolución de la inflamación (Mantovani et al. 2011), también desempeñan un papel importante en condiciones de inflamación crónica y la inflamación crónica es un proceso que promueve el desarrollo tumoral 51. 1.6.3 Función de las especies reactivas de oxígeno en los neutrófilos. Una vez que han sido activados los neutrófilos comienzan a producir ERO, en inglés este proceso se conoce como “respiratory burst”. En el caso de los neutrófilos el complejo NADH oxidasa se ensambla en la membrana plasmática o en la membrana del fagosoma. En condiciones inflamatorias o durante la eliminación de patógenos la fusión de la membrana plasmática o de la membrana del fagosoma con los gránulos específicos promueve el 30 ensamblaje del complejo NADPH oxidasa, con lo que comienza la producción de ERO, estas especies reactivas serán liberadas dentro del fagolisosoma o hacia el exterior de la célula 45. Los fagosomas son estructuras que contienen importantes cantidades de mieloperoxidasa (Myeloperoxidase, MPO por sus siglas en inglés), cuando el peróxido de hidrógeno reacciona con la MPO dentro del fagosoma, se producen diversas especies reactivas dentro de las cuales destaca el ácido hipocloroso que es más reactivo que el superóxido y que tiene la capacidad de dañar al DNA 45. 1.6.4 Apoptosis en neutrófilos. Se ha observado que los neutrófilos de sangre periférica mueren por apoptosis en ausencia de un estímulo extracelular en un proceso llamado apoptosis constitutiva que es un tipo de apoptosis por la vía intrínseca 3. Por otro lado el incremento en la sobrevida de los neutrófilos es un proceso clave en la erradicación de infecciones causadas por patógenos y un desbalance en la muerte y eliminación de los neutrófilos en los tejidos puede contribuir con un daño al individuo, ya que si los neutrófilos no son fagocitados correctamente pueden experimentar necrosis secundaría 52. 1.6.5 El papel de los neutrófilos en la biología del cáncer. Los neutrófilos activados tienen la capacidad de producir especies reactivas de oxígeno y nitrógeno que pueden tener un efecto dañino sobre el DNA, la mayoría de las ocasiones este daño puede ser reparado pero en algunas células la reparación puede resultar deficiente por lo que se favorecen las mutaciones en los genes supresores de tumores. Los neutrófilos poseen la capacidad de secretar factores y moléculas como la MMP-9 que promueven la proliferación, migración y metástasis de células tumorales 53. Los neutrófilos también producen el factor de crecimiento vascular endotelial (Vascular endothelial growth factor, VEGF por sus siglas en inglés), que tiene un importante papel en la promoción de la angiogénesis 53. En algunos tipos de cáncer como por ejemplo el cáncer de colón y el cáncer de cabeza y cuello se ha reportado que los neutrófilos pueden tener un efecto inmunosupresor y en otros tipos de cáncer las células supresoras de origen mieloide de tipo granulocito (Granulocytes 31 myeloid-derived suppressor cells, G-MDSCs por sus siglas en inglés) se encuentran relacionadas con los neutrófilos pues aún no se cuenta con un marcador que permita diferenciar entre ambas células durante la supresión inmune 54. Adicionalmente la relación neutrófilo-linfocito (Neutrophil lymphocyte ratio, NLR por sus siglas en inglés) ha demostrado ser un factor pronóstico en diversos tipos de cáncer, en CPCN índices elevado han sido asociados con una disminución en la sobrevida de los pacientes 55. Por otro lado los neutrófilos también pueden mostrar un fenotipo anti-tumoral ya que lo mediadores antimicrobianos expresados por estas células también pueden tener una potente actividad para eliminar a las células tumorales 56 (Figura 12). Figura 12. La dicotomía de los neutrófilos en el cáncer. Diversos estudios han aportado evidencias en los que se indica que los neutrófilos muestran una actividad antitumoral directa a través de TRAIL y mediante la activación de células T locales. Por otro lado el principal mecanismo caracterizado por el cual los neutrófilos promueven la progresión del tumor es la angiogénesis, dado que expresan y liberan altos niveles de MMP9 y VEFG. Modificado de Brandau et al. 2013. 32 II. JUSTIFICACIÓN Los neutrófilos tradicionalmente se han estudiado en el contexto de su función antibacteriana sin embargo, se ha demostrado que desempeñan un papel importante en la biología del cáncer. Los tumores sólidos no soloactúan sobre las células del sistema inmune que se ubican en el ambiente tumoral sino que también provocan cambios sistémicos a nivel de sangre periférica. En pacientes con carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello se reportaron alteraciones funcionales en neutrófilos aislados de sangre periférica tales como el incremento en la poblaciones inmaduras, reducción en la apoptosis y una disminución en la producción de especies reactivas de oxígeno después de la activación in vitro 8. Estos mecanismos así como el papel que cumplen los neutrófilos circulantes en el desarrollo del cáncer de pulmón de células no pequeñas no han sido estudiados y debido al incremento de neutrófilos en sangre periférica de pacientes con CPCNP, el estudio de mecanismos que afectan su funcionalidad podrá aportar información relevante sobre el papel que desempeña esta población celular en el cáncer pulmonar. 33 III. HIPÓTESIS Los neutrófilos de sangre periférica de pacientes con cáncer pulmonar presentan alteraciones funcionales que se reflejan en un fenotipo inmaduro, aumento de la supervivencia y el incremento en la producción de especies reactivas de oxígeno. 34 IV. OBJETIVOS 4.1 Objetivo general. Evaluar el estado de maduración, la muerte por apoptosis y la producción de especies reactivas de oxígeno en neutrófilos de sangre periférica de pacientes con cáncer de pulmón. 4.2 Objetivos específicos. 1. Evaluar los marcadores de superficie CD66b, CD11b y CD16 en neutrófilos de sangre periférica. 2. Evaluar la expresión de Anexina-V y 7-AAD en neutrófilos CD66b+ a las 4 y 24 horas de cultivo. 3. Evaluar la presencia de caspasa-3 y 7 en neutrófilos CD66b+ a las 4 y 24 horas de cultivo. 4. Cuantificar la producción intracelular de especies reactivas de óxigeno en neutrófilos CD66b+. 35 V. MATERIALES Y MÉTODOS 5.1 Población de estudio. Los pacientes incluidos en el estudio fueron clasificados clínicamente según la estirpe histológica y el estadio de la enfermedad. Se seleccionaron sujetos con diagnóstico confirmado de cáncer de pulmón de células no pequeñas de la estirpe histológica adenocarcinoma, diagnosticados en el Instituto Nacional de Cancerología. La clasificación histológica se realizó de acuerdo los criterios de la IASLC. El estadio de la enfermedad se determinó según la combinación de criterios radiológicos, patológicos y quirúrgicos, de acuerdo con el sistema TNM para la clasificación del cáncer de pulmón, recomendado por la IASLC. Previo consentimiento informado y antes de recibir algún tratamiento, se obtuvieron muestras de sangre periférica, se tomaron 8 ml se sangre de cada sujeto incluido en el estudio, (pacientes y controles). 5.2 Criterios de inclusión. Pacientes con cáncer pulmonar: 1. Se incluyeron pacientes que junto con un cuadro clínico-radiológico compatible con cáncer de pulmón, cumplieron al menos una de las siguientes condiciones y se encontraban libres de tratamiento previo a la obtención de la muestra. 2. Citología positiva para malignidad en esputo, aspirado bronquial, cepillado bronquial, punción aspirativa pulmonar, líquido pleural o punción de otras localizaciones metastásicas. 3. Biopsia positiva para malignidad de origen bronquial, transbronquial, pleural, pulmonar, precutánea, pulmonar por toracotomía o de localizaciones metastásicas. Sujetos control: 1. Sujetos que estuvieron de acuerdo en participar en el estudio. 36 5.3 Criterios de exclusión. Pacientes con cáncer pulmonar: 1. Sujetos con infección por VIH. 2. Sujetos que no estuvieron de acuerdo en participar en el estudio. Sujetos control: 1. Sujetos en los que se tuviera sospecha de lesiones pulmonares de tipo neoplásico con los mismos criterios que rigieron para los pacientes con diagnóstico positivo para cáncer de pulmón. 2. Sujetos con enfermedades que comprometen seriamente al sistema inmune. 3. Sujetos que no estuvieron de acuerdo en participar en el estudio. 5.4 Inmunofenotipificación por citometría de flujo. La inmunofenotipificación de la población de neutrófilos se llevó a cabo con 500μL de sangre total de pacientes y controles. Se usaron los anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos de superficie de células de humano; anti-CD66b, anti-CD16 y anti-CD11b. Las muestras se tiñeron e incubaron con las combinaciones adecuadas de anticuerpos durante 20 minutos. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, las muestras fueron tratadas con RBC Lysis Buffer TM (BioLegend, Inc, San Diego, CA, E.U.A) durante 8 minutos. Se llevaron a cabo dos lavados con PBS (Buffer Fosfato Salino) más SFB al 1%. Las muestras se re-suspendieron en 250µL de PBS para su análisis. Las muestras fueron adquiridas en un citómetro de flujo FACSCanto II y analizadas con el Software FlowJo vX.0.7 (Treestar, Inc, Ashland, Or, E.U.A). En todos los casos se adquirieron 50,000 eventos. 5.5 Obtención de granulocitos de sangre periférica. En una campana de flujo laminar y bajo condiciones de esterilidad, a partir de sangre venosa heparinizada de los dos grupos estudiados, se aisló a la población de granulocitos por un gradiente de densidad con la solución PolymorphprepTM (AXIS-SHIELD, Oslo, 37 Norway) la cual permite separar a la fracción de granulocitos de las células mononucleares y los eritrocitos. Una vez aislada la fracción de granulocitos, ésta se trató con buffer de lisis durante 8 minutos para eliminar a los eritrocitos restantes en la muestra. La fracción de granulocitos se lavó con PBS y se determinó la viabilidad por microscopía óptica. 5.6 Cultivo de células. La fracción de granulocitos recuperada, se cultivó en tubos de polipropileno o en placas de 24 pozos con medio RPMI suplementado al 10% de SFB a 37°C, 5% de CO2. 5.7 Evaluación de apoptosis por citometría de flujo. En los ensayos de citometría de flujo, se usaron 2x106 células de la fracción granulocítica para teñir a las células en estado basal, también se cultivaron 2x106 células por tubo de la fracción de granulocitos y se incubaron durante 4 y 24 horas a 37°C, 5% de CO2. Para evaluar la muerte por apoptosis, las células se tiñeron con 5μL de Anexina V y 2.5 μL de 7-AAD. Debido a que el análisis de apoptosis se realizó en la población de neutrófilos, se utilizó el anticuerpo monoclonal dirigido contra antígenos de superficie de células de humano: anti-CD66b. Las muestras se re-suspendieron en el buffer Annexin V Binding Buffer TM (BioLegend, Inc, San Diego, CA, E.U.A), a continuación las muestras se tiñeron e incubaron durante 20 minutos, al término del tiempo las células se lavaron con Annexin V Binding BufferTM y se re-suspendieron en 400µL del mismo buffer para su análisis. Las muestras se adquirieron en el citómetro de flujo FACSCanto II y fueron analizadas con el Software FlowJo vX.0.7 (Treestar, Inc, Ashland, Or, E.U.A). En todos los casos se adquirieron 20,000 eventos. 5.8 Evaluación de la expresión de caspasas por microscopia de fluorescencia. En los ensayos de microscopia se sembraron 2.5x105 células por pozo, las células se mantuvieron a 37°C, 5% de CO2 durante 4 y 24h para ambos grupos de estudio, se midió la expresión de las caspasas 3 y 7 activas para lo cual se utilizó el Kit comercial CellEvent™ Caspase-3/7 Green Detection Reagent (Life technologies, Eugene, Oregon, E.U.A. Este kit utiliza un sustarto de cuatro aminoácidos conjugado con un colorante fluorescente (Alexa- 38 488) de unión a ácidos nucleicos que se escinde en presencia de caspasa-3 o caspasa-7 activas, lo que permite que el colorante se una al DNA de células apoptóticas. El reactivo se agregó directamente a las células en cultivo a una concentración final de 5μM, las células se incubaron con el reactivo durante 30 minutosa 37°C. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, las muestras se observaron en el microscopio FLoid® Cell Imaging Station (Life technologies, Eugene, Oregon, E.U.A) con el objetivo 20x. Los datos fueron analizados con el Software ImageJ v 1.49h (NIH, E.UA) contando el número de células positivas en 5 campos diferentes para cada muestra. 5.9 Inducción de la producción de ERO. Se cultivaron 1x106 células de la fracción de granulocitos por tubo, las células se incubaron a una concentración de 30nM de phorbol 12-myristat 13-acetato (PMA por sus siglas en inglés) o sin estímulo durante 25 minutos a 37°C, 5% de CO2. 5.10 Cuantificación relativa de ERO intracelulares por citometría de flujo. Se utilizó el Kit Reactive Oxygen Species (ROS) Detection reagents (Life technologies, Eugene, Oregon, E.U.A) para detectar la presencia de ERO dentro de las células. Este kit usa un reactivo derivado de la fluoresceína reducida, el CM-H2 DCFDA, esta molécula esta reducida y acetilada y no emite fluorescencia hasta que los grupos acetato son removidos por esterasas intracelulares con lo que se vuelve sensible a oxidación. La escisión por esterasas produce una forma cargada del colorante que se retiene mejor dentro de las células que el compuesto original. La oxidación se detectó por fluorescencia. Las muestras se re-suspendieron en PBS y se agregó el reactivo a una concentración final de 2.5μM, las células se incubaron por 30 minutos a 37°C 5% de CO2. Transcurrido el tiempo de incubación las muestras se lavaron con PBS, y se re-suspendieron en Cell Staining Buffer (BioLegend, Inc, San Diego, CA, E.U.A). El análisis de ERO se llevó a cabo en la población de neutrófilos por lo que se utilizó el anticuerpo monoclonal dirigido contra antígenos de superficie de células de humano: anti- CD66b para identificar a esta población. Las muestras teñidas se incubaron por 20 minutos, al término del tiempo las células fueron lavadas y re-suspendidas en 250µL de PBS. A continuación las muestras se adquirieron en el citómetro de flujo FACSCanto II y fueron 39 analizadas con el Software FlowJo vX.0.7 (Treestar, Inc, Ashland, Or, E.U.A). En todos los casos se adquirieron 20,000 eventos. 5.11 Análisis estadístico. Los valores obtenidos de los experimentos se analizaron con la prueba estadística Shapiro- Wilk para conocer si los datos presentaban una distribución normal. Se realizaron pruebas t de Student o U de Man-Whitney según la distribución de los datos. Se consideró un valor significativo de p cuando éste era ≤ 0.05. Se utilizaron los softwares Graph Pad Prism v. 6.0.1. (GraphPad, Inc, La Jolla, CA, E.U.A) y SPSS Statistics v.20 (IBM, Inc, E.U.A). 40 VI. RESULTADOS 6.1 Características demográficas y clínicas de los pacientes. En este estudio se incluyeron 12 pacientes con cáncer pulmonar de células no pequeñas, las muestras sanguíneas de los pacientes fueron comparadas con un grupo de donadores sanos. La media de edad fue de 67.5 ± 14.07 años, 7 mujeres y 5 hombres en los pacientes mientras que en los donadores la media de la edad fue de 58,6 años ± 3.1, 2 mujeres y 3 hombres. El 41,7% de los pacientes presentaron antecedentes de tabaquismo y el 50% de los pacientes estuvieron expuestos a humo de leña. No se encontraron diferencias en la edad y el género entre ambos grupos (Tabla 1). Tabla 1. Características demográficas y clínicas. Característica Donadores Sanos % (n= 5) Pacientes % (n= 12) P Edad* 58.6 ± 3.1 67.5 ± 14.07 0.23 Genero Mujeres 40 (2) 58,3 (7) 0.57 Hombres 60 (3) 41,7 (5) Tabaquismo Negativo 60 (3) 58,3 (7) 0.95 Positivo 40 (2) 41,7 (5) Humo de leña Negativo 100 (6) 50 (6) 0.13 Positivo 0 (0) 50 (6) Se presentan los porcentajes y número de casos (n) correspondientes a los grupos de estudio. (*) Valor de media y DE 41 El 100% de los pacientes pertenecían a la estirpe histopatológica Adenocarcinoma, el 75% de los pacientes se encontraban en la etapa clínica IV. El 83,3% de los pacientes tenían un ECOG de 1, 58.3% de los casos presentaron derrame pleural y el 75% desarrollaron metástasis (Tabla 2). Tabla 2. Características clínicas. Característica Pacientes % (n= 12) Histología Adenocarcinoma 100 (12) Estadio Clínico III 25 (3) IV 75 (9) ECOG 1 83,3 (10) 2 y 3 16,7 (2) Derrame pleural Negativo 5 (41,7) Positivo 7 (58,3) Metástasis Negativo 3 (29) Positivo 9 (75) Se presentan los porcentajes y número de casos (n) correspondientes a los grupos de estudio. 6.2 Evaluación de la población de neutrófilos en pacientes con Cáncer Pulmonar. La caracterización fenotípica de los neutrófilos se realizó mediante marcaje directo en células de sangre periférica en ambos grupos de estudio. Los datos mostrados representan las frecuencias de células positivas en una población total de 50,000 eventos para todas las muestras. El análisis se realizó inicialmente a partir de una ventana de tamaño y complejidad [Forward Scatter (FSC) vs. Side Scatter (SSC)]. Dado que existe la posibilidad de identificar a poblaciones inmaduras del linaje de neutrófilos en regiones diferentes a las ya establecidas se seleccionaron todos los leucocitos y a partir 42 de estos se hizo un análisis de SSC vs CD66b, la población CD66b+ representa a todos los neutrófilos presentes en la muestra (Figura 13). Figura 13. Estrategia de análisis para identificar el fenotipo de los neutrófilos. A partir de la región de leucocitos se seleccionó a la población CD66b+, sobre la cual se llevó a cabo el análisis de los marcadores de maduración CD11b y CD16. A) Paciente con CPCNP B) Donador sano. A) DONADOR SANO B) PACIENTE CON ADENOCARCINOMA 43 Sobre la población CD66b+ se midió la IMF (Intensidad Media de Fluorescencia) de dicho marcador y se llevó a cabo el análisis del marcador CD11b. En la población CD66b+, CD11b+ se midió la IMF del marcador CD11b, a continuación se analizó la frecuencia de la población CD11b+CD16+ dentro de la población CD66b+. Finalmente se midió la IMF del marcador CD16 en la población CD66b+, CD11b+, CD16+. Se observó un incremento de la población CD66b+ en los pacientes con adenocarcinoma comparados con los donadores sanos (Figura 14A). Por otro lado existe un incremento en la población CD66b+, CD11b+, CD16+ en los pacientes comparados contra el grupo control (Figura 14B) (Tabla 3). Figura 14. Los neutrófilos se encuentran incrementados en los pacientes con cáncer de pulmón. A partir de la región de leucocitos se seleccionaron las células CD66b+. A) Se observa un incremento en la frecuencia en la población CD66b+ en los pacientes comparados con sujetos control (p=0.0039). B) La población de neutrófilos CD66b+CD16+CD11b+ se encuentra incrementada (p=0.00061) en sangre periférica de pacientes adenocarcinoma comparados con donadores sanos. (n=6 en pacientes y n=5 en donadores). Tabla 3. Frecuencia de la población CD66b+CD16+CD11b+. Donadores Pacientes P % CD66b+CD16+CD11b+ n= 5 n= 12 36 (11.2-49.9) 67.5 (39.5-88.2) 0.0061 Valores de mediana y de máximos y mínimos, se aplicó U de Mann-Whitney. A) B) 44 6.3 Expresión de los marcadores CD66b, CD16 y CD11b en pacientes con Cáncer Pulmonar. Debido a que se quería conocer el estado de maduración en el que se encuentran los neutrófilos de sangre periférica de pacientes con adenocarcinoma de pulmón, se llevó a cabo el análisis de los marcadores de maduración CD11b y CD16. En ambos grupos de estudio el 90% de las células en la población CD66b+ son también dobles positivas para los marcadores C11b y CD16 (Figura 15A). Figura 15. Expresión de marcadores de maduración en neutrófilos. A) En ambos grupos de estudio el 90% de las células CD66b+ son dobles positivas para los marcadores CD11b yCD16 (p= 0.72). B) Incremento en la intensidad media de fluorescencia del marcador CD66b en pacientes con adenocarcinoma comparados con donadores sanos (p=0.036). C) Ejemplo comparativo de los histogramas de intensidad media de fluorescencia del marcador CD66b entre un paciente (rojo) y un donador sano (azul), en verde el control de tinción. D) No se observan diferencias en la intensidad media de fluorescencia del marcador CD11b en pacientes comparados con donadores sanos (p=0.41). E) No se observaron diferencias entre ambos grupos de estudio en la intensidad media de fluorescencia del marcador CD16 (p=0.12). (n=6 en pacientes y n=5 en donadores). B) A) C) D) E) 45 CD66b es un marcador constitutivo del linaje de neutrófilos, se observa un incremento en la IMF de CD66b en los pacientes con cáncer en comparación con los donadores (Figura 15 B y C) (Tabla 4). CD11b está presente en el linaje de neutrófilos a partir de la etapa de mielocito mientras que CD16 se observa a partir de la etapa de banda. No se reportan diferencias en la IMF de CD11b entre pacientes y donadores (Figura 15D), tampoco existen diferencias en la IMF de CD16 en pacientes comparados con el grupo control (Figura 15E). Tabla 4. IMF de CD66b. Donadores Pacientes P IMF de CD66b n= 5 n= 12 2994 (1312-7129) 6938 (2616-10508) 0.036 Valores de mediana y de máximos y mínimos, se aplicó U de Mann-Whitney. 6.4 Evaluación de la apoptosis en los neutrófilos de los pacientes. Para evaluar la muerte por apoptosis de los neutrófilos, se realizó un gradiente de densidad a partir del cual se recuperó a la fracción granulocítica, esta fracción se cultivó durante 4 y 24h. En todos los casos se utilizó el anticuerpo monoclonal anti-CD66b para seleccionar a la población de neutrófilos. Inicialmente se realizó un análisis de complejidad vs CD66b+, a partir de la población CD66b+ se llevó a cabo el análisis de la expresión de fosfatidilserina en la superficie de las células y la expresión del colorante que tiñe DNA, 7AAD. Los datos mostrados representan porcentajes de células positivas en una población total de 20,000 eventos para todas las muestras (Figura 16). 46 Figura 16. Estrategia de análisis para identificar la expresión de fosfatidilserina y 7AAD en neutrófilos. Neutrófilos obtenidos a partir de un gradiente de densidad se cultivaron durante 4 y 24 horas, las muestras se analizaron por citometría de flujo. A partir de un análisis de complejidad VS CD66b se seleccionó a la población CD66b+, sobre la cual se llevó a cabo el análisis de Anexina V y 7/AAD. A) Paciente con CPCNP a las 24 horas de cultivo B) Donador sano a las 24 horas de cultivo. No se observaron diferencias en los porcentajes de expresión de fosfatidilserina y 7AAD en ninguno de los tiempos de cultivo entre los dos grupos de estudio. En ambos grupos se observó una disminución en la viabilidad a las 24 horas de cultivo (Figura 17 A). A pesar de no reportarse diferencias en el porcentaje de células apoptóticas entre pacientes y controles a las 24h, se observa una tendencia a la disminución en el porcentaje de células apoptóticas en los pacientes (Figura 17 B). B) PACIENTE CON ADENOCARCINOMA A) DONADOR SANO 47 Figura 17. Apoptosis de neutrófilos a las 24h de cultivo. A) Porcentaje de células vivas es decir CD66b+AnexinaV- /7AAD- de todas las condiciones de estudio. B) Porcentaje de células AnexinaV+,7AAD- a las 24 horas de cultivo. Se observa una tendencia a la disminución de la apoptosis en los pacientes con adenocarcinoma de pulmón (n=6) comparados con sujetos control (n=5). También se llevó a cabo el análisis de la expresión de las caspasas efectoras 3 y 7 en neutrófilos que habían sido cultivados durante 4 y 24 horas. A las células en cultivo se les agrego un reactivo que difunde fácilmente al citoplasma celular y que es escindido por las caspasas 3 y 7, con lo que emite fluorescencia en Alexa 488. Existe un incremento en la expresión de las caspasas 3 y 7 en neutrófilos de pacientes comparados con los donadores sanos a las 24 horas de cultivo (Figura 18 A y B) (Tabla 5). A) B) 48 Figura 18. Expresión de caspasas 3 y 7 en neutrófilos a las 4h y 24h de cultivo. Neutrófilos obtenidos a partir de un gradiente de densidad se cultivaron durante 4 y 24 horas, las muestras se analizaron por microscopia de fluorescencia. A) En la imagen de la izquierda un donador y a la derecha un paciente a las 24 horas de cultivo. B) Se muestran los resultados a las 4 horas. C) Se muestran los resultados a las 24 horas. (n=6 en pacientes y n=5 en donadores). Tabla 5. Expresión de las caspasas 3 y 7 a las 24 horas de cultivo. Controles Pacientes P n= 5 n= 6 0.049 24h 247 (118-344) 73.5 (24-189) Valores de mediana y de máximos y mínimos, se aplicó U de Mann-Whitney. A) B) C) DONADOR PACIENTE 49 6.5 Evaluación de la producción de especies reactivas de oxígeno en neutrófilos de pacientes. A partir de un gradiente de densidad se recuperó la fracción granulocítica, esta fracción se cultivó durante 25 minutos con 30nM de PMA o sin estímulo. En todos los casos se utilizó el anticuerpo monoclonal anti-CD66b para seleccionar a la población de neutrófilos. El inicial análisis se realizó a partir de una ventana SSC vs CD66b+, en la población CD66b+ se llevó a cabo el análisis de las ERO. El análisis de la IMF de ERO se llevó a cabo sobre la población CD66b+, ERO+. Los datos mostrados representan porcentajes de células positivas en una población total de 20,000 eventos para todas las muestras (Figura 19). Figura 19. Estrategia de análisis para evaluar la producción de ERO. Neutrófilos obtenidos a partir de un gradiente de densidad se cultivaron durante 25 minutos con 30nM de PMA, las muestras se analizaron por citometría de flujo. Se evaluó la producción de ERO en la población CD66b+. A) Paciente con CPCNP estimulado con 30nM de PMA B) Donador sano estimulado con 30nM de PMA. A) DONADOR SANO B) PACIENTE CON ADENOCARCINOMA 50 Se evaluó la producción de especies reactivas de oxígeno en neutrófilos enriquecidos a partir de un gradiente de densidad. Las células fueron cultivadas con 30nM de PMA o sin estímulo, al cultivo celular se agregó el reactivo con el que fue posible identificar a las ERO intracelulares. El análisis de las ERO se realizó sobre la población CD66b+. No existen diferencias en la producción de ERO en condición basal entre ambos grupos de estudio (Figura 20 A). Se observó un incremento en la producción intracelular de ERO en neutrófilos activados con 30nM de PMA en pacientes con adenocarcinoma de pulmón comparados con los donadores sanos (p=0.029) (Figura 20 B y C) (Tabla 6). Figura 20. Incremento en la producción de ERO en pacientes con Adenocarcinoma de pulmón. A) Expresión basal ERO expresada en IMF para ambos grupos de estudio (p=0.66). B) Incremento en la IMF de ERO en pacientes con adenocarcinoma de pulmón comparados con donadores sanos (p=0.029). C) Ejemplo comparativo de los histogramas de Intensidad Media de Fluorescencia de ERO entre un paciente (rojo) y un donador sano (azul), en naranja el control de tinción. (n=4 en pacientes y n=4 en donadores). A) B) C) 51 Tabla 6. IMF de ERO en neutrófilos estimulados con 30nM de PMA. Controles Pacientes P IMF de EROs en CD66b+ n= 4 n= 4 0.029 19061 34405 (14307-27499) (28664-47540) Valores de mediana y de máximos y mínimos, se aplicó U de Mann-Whitney. 52 VII. DISCUSIÓN En cáncer ocurren interacciones entre las variantes genéticas de un individuo y diversos factores ambientales 57. Se ha observado que la inflamación crónica desempeña un papel importante en la carcinogénesis ya que promueve la transformación celular, supervivencia,
Compartir