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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE CIENCIAS Expresión de FAT1 células epiteliales de pulmón humano. T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: B I Ó L O G A P R E S E N T A : LUCÍA MEDRANO VIDAL DIRECTOR DE TESIS: DR. JORGE ANTONIO GARCÍA ÁLVAREZ Ricardo Texto escrito a máquina Ciudad Universitaria, Cd. Mx. 2016 Ricardo Texto escrito a máquina UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Expresión de FAT1 células epiteliales de pulmón humano. 2 “Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano” Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Bioquímica de la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional Autónoma de México, bajo la dirección del Dr. Jorge Antonio García Álvarez. Investigación realizada gracias al Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) de la UNAM, proyecto IN220716 “Identificación de los mecanismos celulares regulados por FAT1 en Fibrosis Pulmonar Idiopática”. Agradecimientos A la Dra. Annie Pardo Cemo y al Dr. Moisés Selman por su apoyo y el de todo su equipo de trabajo. Al Dr. Jorge Antonio García Álvarez por su dirección y apoyo. Al M. en C. David Medina Pérez por su asesoría en las técnicas de cultivo celular y su apoyo en el procesamiento de los datos experimentales. A Jorge Gerzon Gutiérrez Hernández por su apoyo en la obtención y procesamiento de los datos experimentales. Expresión de FAT1 células epiteliales de pulmón humano. 3 Datos del alumno Medrano Vidal Lucía Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Ciencias Biología No. Cta. 305283656 Datos del asesor Dr. Jorge Antonio García Álvarez Datos de la tesis Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 60pp. 2016 Palabras clave Fibrosis Pulmonar Idiopática, epitelio alveolar, cadherinas, TGF-β1, Fat1. Expresión de FAT1 células epiteliales de pulmón humano. 4 Índice Abreviaturas- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 6 Introducción- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 7 Estructura y función pulmonar - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 7 Sistema Respiratorio - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 7 Estructura alveolar - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 8 La respiración - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 10 Enfermedades respiratorias - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 11 Fibrosis Pulmonar Idiopática (FPI) - - - - - - - - - - - - - - - - - - 12 Factor de Crecimiento Transformante beta 1 (TGF-1) - - - 17 Cadherinas - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 18 Fat 1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 21 Justificación - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 26 Hipótesis - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 27 Objetivo - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 27 Materiales y métodos - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 28 Cultivo de células epiteliales alveolares (línea inmortalizada de neumocitos tipo II, A549) - - - - - - - - - - - 28 Separación y conteo celular- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29 Estimulación celular con TGF-β1- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 30 Extracción de RNA- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 31 Cuantificación de RNA- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 32 Tratamiento con DNasa- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 33 Síntesis del cDNA- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - PCR en tiempo real- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 33 35 Expresión de FAT1 células epiteliales de pulmón humano. 5 Resultados - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 36 Estimulación con TGF-β1- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 36 Cuantificación de RNA- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 37 Síntesis del cDNA- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 39 PCR en Tiempo Real- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 39 Expresión de Fat1 en células A549- - - - - - - - - - - - - - - - - - 43 Discusión - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 47 Conclusión - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Literatura consultada - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Anexo-Preparación de reactivos- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 52 53 58 Expresión de FAT1 células epiteliales de pulmón humano. 6 Abreviaturas OMS: Organización Mundial de la Salud EPID: Enfermedades Pulmonares Intersticiales Difusas NII: Neumonías Intersticiales Idiopáticas NIU: Neumonía Intersticial Usual FPI: Fibrosis Pulmonar Idiopática NINE: Neumonía Intersticial No Específica NID: Neumonía Intersticial Descamativa BR-EIP: Bronquiolitis Respiratoria asociada a Enfermedad Intersticial Pulmonar NO: Neumonía Organizada NIA: Neumonía Intersticial Aguda NIL: Neumonía Intersticial Linfocítica MMP: Metaloproteinasas de matriz TGF-β1: Factor de Crecimiento Transformante-β1 TEM: Transición Epitelio-Mesénquima BMP´s: Proteínas morfogenéticas de hueso FGF-2: Factor de crecimiento de fibroblastos-2 EGF: Factor de Crecimiento Epitelilal IL-1: Interleucina-1 HGF: Factor de Crecimiento Hepático kDa: Kilodaltones Cad-rpts: repeticiones tipo Cadherina Fat1: Gen que codifica una proteína de la familia de las Cadhereinas. µg: Microgramo µl: Microlitro DNA: Ácido desoxirribonucleico cDNA: Ácido desoxirribonucleico complementario DEPC: Dietilpirocarbonato RNA: Ácido ribonucleico GAPDH: Gliceraldehído fosfato deshidrogenasa MgCl2: Cloruro de Magnesio mRNA: Ácido ribonucleico mensajero PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa RT-PCR: Retrotranscripción-Reacción en Cadena de la Polimerasa rRNA 18s: RNA ribosomal 18s Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 7 Introducción Estructura y función pulmonar Sistema respiratorio El sistema respiratorio está formado por estructuras muy especializadas que incluyen la cavidad nasal, laringe, tráquea, bronquios, bronquiolos y pulmones (Figura 1), y facilita el paso de oxígeno desde el aire hacia dentro del cuerpo donde es capturado por la sangre (1). Los pulmones son dos estructuras semejantes a sacos, localizados dentro de la cavidad torácica, en los cuales se lleva a cabo el proceso de intercambio gaseoso, entre ellos se encuentra el mediastino que contiene el corazón, los grandes vasos y el esófago; eldiafragma los separa de las vísceras abdominales. Presentan cisuras, que son hendiduras que separan porciones del parénquima pulmonar de forma parcial; visibles en la superficie, profundizan en el interior de los pulmones para dividirlos en lóbulos. El pulmón izquierdo se divide en dos lóbulos, superior e inferior, y el pulmón derecho está dividido en tres lóbulos, superior, medio e inferior. Los pulmones tienen un sistema vascular al servicio del intercambio gaseoso llamado vasa publica formado por arterias y venas pulmonares y un sistema al servicio de su propia nutrición, llamado vasa privata formado por arterias y venas bronquiales (2). En el proceso respiratorio el aire es tomado por la cavidad nasal, pasa a través de la laringe y luego entra a la tráquea, que es la vía respiratoria principal hacia los pulmones. La tráquea se divide en dos vías respiratorias, llamadas bronquios, cada uno suministra aire a un pulmón. La tráquea y los bronquios están sujetos por tejido cartilaginoso en forma de aros que los previenen de colapsar durante la respiración, asegurando que el flujo de aire se mantenga con una resistencia mínima. Los bronquios primarios se dividen en pequeños bronquios secundarios y de nuevo en finos bronquiolos. Esta división continúa hasta que Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 8 los bronquiolos terminales tienen un diámetro de 1mm. Los bronquiolos más finos terminan en un tejido en forma de diminutos sacos de paredes delgadas, los alveolos, donde el intercambio gaseoso por difusión tiene lugar. Como resultado de este patrón de división, cada pulmón está formado por varios millones de alveolos que proveen una gran superficie, vascularizada por pequeños vasos sanguíneos, llamados capilares pulmonares. Cada alveolo alinea sus células epiteliales en contacto íntimo con el endotelio de estos capilares y como resultado, la distancia de difusión del alveolo hacia el capilar es extremadamente corta (aproximadamente 2µm) (3). Figura 1. Estructura del Sistema Respiratorio. (http://crhvscience.blogspot.mx/2010/10/el-sistema-respiratorio.html). Estructura alveolar Los alveolos están separados unos de otros por la pared alveolar, formada por un entramado de tejido conjuntivo muy rico en capilares sanguíneos, comprendido entre las células epiteliales de cada alveolo. El tejido conjuntivo es rico en fibras elásticas, además, en el alveolo se encuentran células del sistema inmune, especialmente macrófagos, que sirven para eliminar partículas inhaladas o bacterias que hayan llegado hasta los alveolos. En muchas zonas, el tejido conjuntivo es muy delgado (representado por la membrana basal) y es en donde los capilares contactan con las células alveolares (2). Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 9 En el pulmón, el epitelio alveolar es la unidad respiratoria y está caracterizada por dos tipos de células: neumocitos tipo I y neumocitos tipo II (Figura 2). Los neumocitos tipo I son células con forma aplanada y un núcleo que sobresale dentro de la superficie alveolar, mientras que los neumocitos tipo II tienen bordes redondeados, una superficie con microvellosidades y secretan líquido surfactante, una capa de fosfolípido que cubre los alveolos y que tiene como función neutralizar la tensión superficial que las moléculas líquidas ejercen en la pared alveolar, que reducen y colapsan la superficie alveolar (1-2). El epitelio alveolar representa la interfase entre el oxígeno introducido desde el exterior y los capilares sanguíneos (1). Figura 2. Estructura alveolar. (http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch23/ch23.htm). Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 10 La respiración La respiración es una de las funciones esenciales de los seres vivos; es un proceso metabólico en el cuál se lleva a cabo el intercambio gaseoso de O2 y CO2 que es necesario para obtener energía y mantener activo el metabolismo en todos los tejidos del cuerpo. La ventilación y la perfusión trabajan juntas para maximizar los gradientes de presión parciales cerca de las membranas alveolares. La ventilación entrega O2 a la superficie de intercambio, donde es difundido alrededor y es arrastrado por la sangre que lo lleva a todos los tejidos. Lo contrario sucede con el CO2 al ser expulsado de los tejidos. La perfusión entrega CO2 a la superficie de intercambio donde difunde y es arrastrado por el proceso de ventilación (Figura 3) (4). Figura 3. Membrana alveolo-capilar e intercambio gaseoso de O2 y CO2. (http://www.anatomiahumana.ucv.cl/morfo2/bronquios.html). La parte líquida de la sangre, el plasma, lleva algo de O2 en solución, pero su habilidad de transportar esta molécula es limitada ya que puede contener cerca de 0.3ml de O2 por 100ml de plasma lo cual es insuficiente para mantener un metabolismo basal. Existen muchas moléculas de transporte de O2 en el reino animal, pero en vertebrados este rol es llevado a cabo por la hemoglobina, una proteína que está contenida en las células sanguíneas y que incrementa la capacidad de la sangre para llevar 60 veces más O2 del que se puede llevar en solución, haciendo posibles altas tasas metabólicas. La hemoglobina Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 11 consiste de cuatro subunidades polipeptídicas y cada una rodea un grupo hemo, una estructura molecular en forma de anillo que contiene hierro y que puede unir de forma reversible una molécula de O2. Así cada molécula de hemoglobina puede unir y liberar cuatro moléculas de O2, permitiendo a la sangre llevar una gran cantidad de O2 a los tejidos corporales (4). El sistema respiratorio requiere un delicado balance para mantener su homeostasis y el ambiente determina en gran medida la propia funcionalidad del sistema. Cuando las funciones de mantenimiento son llevadas al límite, los mecanismos de control se sobrecargan y surgen enfermedades que pueden afectar la calidad de vida de los individuos. Enfermedades respiratorias La Organización Mundial de la Salud ha clasificado las enfermedades respiratorias en diversos grupos (1): o Enfermedades que afectan el tracto respiratorio superior (cavidad nasal, laringe, faringe, etc.) debido a microorganismos. o Enfermedades que afectan el tracto respiratorio inferior (bronquios y bronquiolos). Se divide en enfermedades causadas por microorganismos y causadas por agentes externos (como el humo de cigarro). o Condiciones alveolares causadas por presencia crónica de partículas presentes diariamente o por inhalación aguda de sustancias irritantes o toxinas. o Enfermedades que alteran la estructura alveolar, evitando el intercambio gaseoso. Precisamente de este último grupo hablaremos en el presente trabajo, específicamente de la Fibrosis Pulmonar Idiopática, que es una de las enfermedades que causan una reestructuración del alveolo, que disminuye y eventualmente termina con la presencia de los capilares alveolares dentro de dicha estructura, haciendo imposible el intercambio gaseoso. Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 12 Fibrosis Pulmonar Idiopática (FPI) Existe un grupo amplio y heterogéneo de enfermedades que afectan al parénquima respiratorio conocidas como Enfermedades Pulmonares Intersticiales Difusas (EPID). Estos padecimientos afectan no sólo al intersticio pulmonar sino también a las unidades alveolo- capilares, y frecuentemente a las vías aéreas pequeñas incluyendo bronquiolos terminales, bronquiolos respiratorios y ductos alveolares (5). Dentro de las EPID se encuentra un grupo específico llamado Neumonías Intersticiales Idiopáticas (NII) que son enfermedades pulmonares difusas caracterizadas por inflamación intersticial y fibrosis y que representan una respuestadeterminada a diversas agresiones pulmonares. Incluyen la Neumonía Intersticial Usual (NIU), Fibrosis Pulmonar Idiopática (FPI), Neumonía Intersticial No Específica (NINE), Neumonía Intersticial Descamativa (NID), Bronquiolitis Respiratoria asociada a Enfermedad Intersticial Pulmonar (BR-EIP), Neumonía Organizada (NO), Neumonía Intersticial Aguda (NIA) y Neumonía Intersticial Linfocítica (NIL) (6-8). La FPI representa la forma más común de las Neumonías Intersticiales Idiopáticas, es una enfermedad pulmonar crónica, progresiva, irreversible y letal de causa desconocida (9). En el pasado el término Fibrosis Pulmonar Idiopática fue usado para nombrar un grupo de desórdenes intersticiales pulmonares de causa desconocida, ahora es definido como una entidad clínica distinta con ciertas características clínicas, radiológicas y morfológicas especialmente asociadas con el patrón de las Neumonías Intersticiales Usuales; es decir, los pulmones presentan una apariencia heterogénea con áreas de fibrosis subpleural y paraseptal con depósitos de colágena (9-10). La FPI se presenta mayormente en pacientes con una edad promedio de 66 años y uno de los factores de riesgo para desarrollar la enfermedad es principalmente el humo de tabaco, ya que se ha encontrado que la mayoría de los pacientes con FPI son hombres fumadores activos o pasivos; otro de los factores de riesgo pueden ser exposición a polvo de metales, polvo de madera o infecciones virales crónicas. La supervivencia media es de 2.5-3.5 años Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 13 después del diagnóstico (9-11). Los signos clínicos más frecuentes incluyen disnea progresiva (dificultad para respirar), tos y crepitación inspiratoria (ruidos de tonalidad gruesa y seca, tipo “velcro”) durante la auscultación (10). Como se mencionó anteriormente, la prognosis de la enfermedad empeora con la edad (> 70 años), el uso de cigarro, bajo índice de masa corporal, alteraciones fisiológicas graves e hipertensión pulmonar (9). En la FPI, al contrario de otras enfermedades pulmonares, el daño epitelial en ausencia de inflamación es suficiente para estimular el desarrollo de fibrosis (12-14). El mecanismo patogénico aún no es claro, pero existe evidencia que indica que la enfermedad es el resultado de un comportamiento anormal de las células del epitelio alveolar en respuesta a un daño externo que provoca la muerte por apoptosis de los neumocitos tipo I y la migración, proliferación y activación de fibroblastos y miofibroblastos que secretan cantidades exageradas de moléculas de matriz extracelular con la subsecuente destrucción de la arquitectura del pulmón, que incluye reducción de vascularización, disminución del lumen alveolar y pérdida del intercambio gaseoso (9, 15). Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 14 Talmadge, Selman y Pardo (9) proponen los mecanismos que están involucrados en la patogénesis de la FPI (Figura 4): Figura 4. Mecanismos propuestos involucrados en la patogénesis de la Fibrosis Pulmonar Idiopática (9). A. El pulmón susceptible es expuesto a un daño repetitivo (humo de cigarro, microaspiración, virus) lo que provoca la muerte por apoptosis de las células epiteliales, neumocitos tipo I y tipo II. B. Después del daño y la apoptosis, la incrementada permeabilidad vascular a proteínas (fibrinógeno, fibronectina, etc.) causa la formación de una matriz extracelular provisional. C. Este proceso patológico es seguido por la migración y proliferación de células epiteliales alveolares y bronquiolares en un intento fallido de reparación pulmonar (activación aberrante de las células epiteliales). Varios factores de crecimiento Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 15 epidérmicos participan en la respuesta proliferativa. Además las metaloproteinasas de matriz MMP1 Y MMP7 contribuyen a la migración de células epiteliales. En éste microambiente, las células epiteliales son activadas anormalmente y producen diversos factores de crecimiento y quimiocinas, induciendo la migración de fibroblastos residentes y fibrocitos hacia los sitios donde el daño está ocurriendo. Adicionalmente, secretan y activan el Factor de Crecimiento Transformante-β1 (TGF-β1) latente que promueve la Transición Epitelio-Mesénquima (TEM) y la diferenciación de los fibroblastos a miofibroblastos. D. Juntas, en proporciones desconocidas, estas células (fibrocitos, células mesenquimales locales y miofibroblastos derivados de la TEM) participan en la formación de focos de fibroblastos y miofibroblastos. Metaloproteinasas de matriz, como la MMP2 y la MMP9, contribuyen a la activación de TGF-β1 y a la ruptura de las membranas basales. E. En el epitelio alveolar el complejo FactorTisular-FactorVIIa-FactorX activado (TF- FVIIa-FX) es ensamblado con la subsecuente transformación del Factor-X (FX) a Factor-X activado (FXa). Este estado de procoagulación provoca un medio hipercoagulable que evita la degradación de la matriz extracelular provisional y mantiene el medio fibrogénico. F. En los focos, los miofibroblastos secretan cantidades excesivas de proteínas de la matriz extracelular, principalmente colágenas fibrilares, y pueden también provocar apoptosis epitelial adicional a través de peróxido de hidrógeno y otras moléculas. En este remodelado anormal pulmonar, varias cicatrices vecinas, junto con la secreción desproporcionada de algunas enzimas (por ejemplo MMP1) pueden provocar la formación de panalización (zonas pulmonares normales intercaladas con zonas fibróticas). Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 16 A pesar del daño epitelial y la apoptosis, se puede notar un incremento en el número de neumocitos tipo II hiperplásicos e hipertróficos en la FPI, ya que son los progenitores de la reparación del epitelio alveolar después del daño siendo capaces tanto de su propia renovación como de dar lugar a neumocitos tipo I, señal que en FPI es aberrante por lo que no se lleva a cabo la reparación del daño (9, 14-15). Existen evidencias (15-16) que indican que las células del epitelio alveolar son la fuente primaria de mediadores que funcionan como factores quimiotácticos o mitógenos para las células mesenquimales, incluyendo el Factor de Crecimiento Transformante derivado de plaquetas, TGF-β1, Factor de Necrosis Tumoral α y la endotelina 1 (9). Estos factores probablemente contribuyen mayormente a la migración, proliferación y diferenciación de células mesenquimales residentes. El epitelio puede contribuir directamente a la expansión de la población de los fibroblastos y miofibroblastos a través de la Transición Epitelio-Mesénquima (TEM). En este proceso las células epiteliales adquieren propiedades mesenquimales a través de las que incrementan su capacidad para moverse y sintetizar matriz extracelular (9), presentan una baja regulación de E-cadherina, sobreexpresan moléculas como la fibronectina (que sobrerregula la diferenciación de miofibroblastos (17) y se observa un incremento en la producción de colágena 1 y de N-cadherina (14-15). Así, la TEM se ve como un proceso de diferenciación morfogenética en la que nuevos tejidos son generados durante la embriogénesis y que en la vida adulta contribuye a la patogénesis de enfermedades como la metástasis del cáncer o la formación de tejidos fibróticos en el hígado, la retina o los pulmones, como es el caso de la FPI. Estudios sobre la expresión génica en FPI, han demostrado que se presentan cambios transcripcionales en el parénquima pulmonar; estos cambios son muy evidentes e involucran numerosos genes (18). Los pulmones con FPI expresan fuertemente genes de una variedad de componentes de matriz extracelular, así como genes músculo-específicos y genes involucradosen la movilidad celular y la contracción muscular, lo que sugiere actividad significativa en la remodelación del tejido y su reorganización. Genes que codifican moléculas de matriz extracelular son altamente expresados en la FPI, incluyendo Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 17 colágenas (tipos 3, 4, 7, 14, 15, 17, 18 y 27), tenascina N, versican y asporina; también están presentes miembros de la familia de las desintegrinas (ADAMs) y las metaloproteinasas de matriz. La actividad de las células epiteliales alveolares y bronquiolares expresan la mayor parte de factores de crecimiento y quimiocinas responsables de la migración, proliferación y activación de los fibroblastos. Aún el TGF-β1, uno de los principales actores en la respuesta fibrótica, es producido por las células epiteliales alveolares (6, 14, 16). Factor de Crecimiento Transformante-β1 (TGF-β1) La Superfamilia del Factor de Crecimiento Transformante (TGF-β) es un gran grupo de ligandos estructuralmente relacionados que regulan una variedad de procesos, incluyendo el ciclo y diferenciación celular, funciones reproductivas, desarrollo, movilidad, adhesión, crecimiento neuronal, morfogénesis de hueso, cierre de heridas y también participa en el sistema inmune (19). El TGF-β existe en tres isoformas (TGF-β1-3) que son altamente conservadas, todas son sintetizadas dentro de las células como grandes precursores proteínicos. Cada uno tiene un péptido señal N-terminal que es requerido para su secreción de la célula, una pro-región (péptido asociado a latencia, PAL), y una porción C-terminal que se adhiere a la pro-región para dar lugar a la molécula madura de TGF-β (17). El TGF-β1 ha sido implicado como un “switch maestro” en la inducción de fibrosis en muchos tejidos incluyendo el pulmón. Está sobre-regulado en los pulmones de pacientes con FPI; la expresión de TGF-β1 activo en pulmones de ratas induce una dramática respuesta fibrótica. Es el mayor inductor de la TEM durante el desarrollo embrionario, carcinogénesis y fibrosis con diferentes isoformas mediando varios efectos dependientes del contexto celular. El TGF-β1 fue descrito como el inductor de la TEM en células epiteliales mamarias normales y se ha demostrado que media la TEM in vitro en un número de diferentes células epiteliales de riñón, oculares y alveolares (14). Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 18 Por otro lado, existen tres principales factores que conducen a la diferenciación de fibroblastos en miofibroblastos y garantizan el mantenimiento del fenotipo contráctil en FPI (9): 1) alto estrés mecánico; 2) incremento local de TGF-β1 (principalmente inducido por las células del epitelio alveolar que originan miofibroblastos en la FPI (17) y 3) la presencia de proteínas especializadas de matriz. La eliminación de miofibroblastos por apoptosis es esencial durante el cierre de herida, sin embargo, este proceso parece no ocurrir en la FPI. Las señales microambientales como TGF-β1 y la endotelina pueden promover la resistencia a la apoptosis. Dentro de la Superfamilia del Factor de Crecimiento Transformante-β se encuentran las Proteínas morfogenéticas de hueso que están relacionadas con el incremento de TGF-β1, ya que el incremento en la expresión de Gremlin, un fuerte antagonista de BMP’s, ha sido reportada en fibroblastos de pulmones con FPI. Este incremento puede atenuar la fosforilación mediada por las BMP’s en los pulmones, llevando al incremento de TGF-β1 inducido por la TEM, con lo que decrece la apoptosis de fibroblastos. La matriz provisional, formada por fibrina y fibronectina, puede estimular la TEM aún en la ausencia de TGF-β1 (15), sin embargo la mayoría de las rutas de señalización en el desarrollo mediadas, por ejemplo, por RTk, Notch, Wnt, Factor de Crecimiento de Fibroblastos-2 (FGF-2), Factor de Crecimiento Epitelilal (EGF), EGF-II, Interleucina-1 (IL-1), Factor de Crecimiento Hepático (HGF) y TGF-β1 proveen los recursos primarios que cambian el destino de las células epiteliales embrionarias a derivados mesenquimales (14, 20). Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 19 Cadherinas Uno de los hallazgos más importantes en los estudios sobre FPI ha sido la sobreexpresión de la N-cadherina, una cadherina mesenquimal expresada en células migratorias del tejido conectivo. Selman, Pardo, Barrera y colaboradores (6) durante un ensayo de microarreglos en el cual compararon pulmones de pacientes con FPI versus controles (Neumonitis por Hipersensibilidad, una entidad patológica diferente), identificaron un grupo de genes sobre- expresados en la FPI, donde se encontró la N-cadherina en células del epitelio alveolar. La N-cadherina media la adhesión célula-célula y modula la migración celular y la invasión tumoral, mostrando el efecto contrario a la E-cadherina (Figura 5). Figura 5. Genes sobre expresados en la Fibrosis Pulmonar Idiopática (6). Los tejidos de células epiteliales están basados en la formación de uniones adherentes estrechas llevadas a cabo por moléculas de adhesión que han sido clasificadas en cuatro Superfamilias mayores: la Superfamilia de inmunoglobulinas, la Superfamilia de las integrinas, la Superfamilia de las selectinas y la Superfamilia de las cadherinas (21). Las cadherinas son glicoproteínas transmembranales que median la adhesión célula-célula dependiente de calcio en una gran variedad de tejidos y especies. Tienen un rol crítico en la morfogénesis, ya que están involucradas en las interacciones celulares y tienen un patrón Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 20 complejo de expresión espacio-temporal durante el desarrollo embrionario (22). Esta familia de moléculas de adhesión está formada por más de 100 miembros que son divididos en 6 subgrupos: Tipo I o clásicas, Tipo II o atípicas, desmocolinas, desmogleínas, protocadherinas y cadherinas flamingo (23). Las tres primeras cadherinas clásicas que se descubrieron se nombraron de acuerdo a los tipos de tejidos en los que fueron encontrados: E-cadherina en células epiteliales y algunas partes del cerebro; P-cadherina en células de placenta y epidermis; N-cadherina en nervios y músculos (24). Figura 6. Estructura de la Superfamilia de las cadherinas. a) Plegamiento típico del dominio extracelular tipo Cadherina en su representación de listón. Siete bandas-β antiparalelas (A-G) se arreglan en dos hojas-β. b) Representación esquemática de la organización de dominios de algunos miembros seleccionados de la Superfamilia de las cadherinas. Todas las cadherinas tienen dos o más dominios extracelulares tipo cadherina (óvalos numerados desde los más distales hasta los más proximales a la membrana celular), que pueden contener dominios-no extracelulares tipo cadherina como las EGF-rpts (rectángulos verdes), dominios de laminina AG (diamantes azules) y cajas flamingo (óvalos rosas). Algunas cadherinas tienen, adherido al péptido señal, un pro dominio (óvalos grises) que es removido por una proteasa en la superficie celular (25). Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 21 La estructura de una Cadherina es la siguiente: la región extracelular o N-terminal que contiene los sitios que determinan la especificidad de la molécula para unirse a otras y al calcio, formada por cinco o más repeticiones de secuencias de aminoácidos altamente conservadas llamadas Cad-rpts ; la región transmembranal y la región intracelular o C- terminal, que conecta a las Cadherinas con los filamentos de actina del citoesqueleto, unión que es necesaria para estabilizar la adhesión intercelular dependiente de Cadherinas (Figura 6). La expresión de este grupo de genes reportados por Selman, Pardo, Barrera y colaboradores (6) podría indicar uncambio crítico en el fenotipo celular ya que cuando las proteínas involucradas en el proceso de adhesión célula-célula son reguladas de manera aberrante, se originan patologías celulares, incluyendo cáncer, enfermedades autoinmunes o de riñón. En estas funciones participan de manera importante las cadherinas, dentro de las cuales se encuentra el grupo de las cadherinas gigantes denominado Fat. Fat 1 Muchas moléculas de adhesión se encuentran conservadas entre Drosophila melanogaster y los vertebrados, indicando que las moléculas de adhesión involucradas en la morfogénesis de los tejidos existen desde tiempo antes de la divergencia entre artrópodos y cordados. El gen fat de Drosophila no pertenece a la familia de genes de las cadherinas clásicas, sino a las protocadherinas. Este locus codifica un gen supresor de tumores en Drosophila que tiene un importante rol en la regulación del crecimiento. Todas las cadherinas Fat son receptores transmembranales de inserción sencilla y con un gran número de repeticiones extracelulares tipo cadherina lo cual predice una estructura de peso molecular que va en un rango de 500 – 600 kDa para cada cadherina Fat (21). Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 22 El gen Fat1 tiene 14,756 pares de bases y codifica para una proteína de 4,594 residuos. En su estructura tiene una región N-terminal cargada positivamente, una región central hidrofóbica de 11 residuos y una región C-terminal polar. También presenta 34 repeticiones tipo cadherina (Cad-rpts) de aproximadamente 110 residuos, con homología en la Superfamilia de las cadherinas, en las que existen 28 sitios para la N-glicosilación. En vertebrados existen cuatro genes: Fat1, Fat2, Fat3 y Fat4. El gen humano Fat1 se clonó como un homólogo del gen supresor de tumores de Drosophila a partir de una línea celular de linfocitos-T y consta de 27 exones (Figura 7) y está localizado en el cromosoma 4q34-35 (21, 26-27). En la estructura de la molécula del grupo Fat se presentan dos bloques de residuos que aparecen conservados en miembros de la Superfamilia de las cadherinas clásicas. El primer bloque de 137 aminoácidos, llamado FC1 es seguido inmediatamente por un segundo bloque relacionado de 84 aminoácidos, llamado FC2. Se encontró que FC1 y FC2 coinciden en una región de colas citoplasmáticas en algunas cadherinas; FC1 tiene una mayor coincidencia que FC2, esto puede indicar que estas regiones interactúan con diferentes proteínas. La distribución de los transcritos de Fat1 fue determinada por hibridación in situ por Dunne y colaboradores (21). Niveles altos de transcritos de Fat1 fueron encontrados en epitelio fetal; en el riñón, en el epitelio distal tubular, en el asa de Henlé y los glomérulos hepáticos; en los pulmones y en el epitelio de las vías respiratorias. Los ojos contienen mRNA de Fat1 en el epitelio del cristalino y también se encuentra en el músculo liso arterial y las paredes de la retina en desarrollo. En tejidos adultos se han encontrado niveles bajos de mRNA de Fat1 en las células epiteliales del riñón, pulmón y páncreas, en el útero no aparece. Se han encontrado niveles altos en epitelio de intestino delgado y colon, estos tejidos han estado inflamados o en proceso tumoral. El epitelio tumoral contiene altos niveles de transcritos de Fat1 (21). Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 23 Figura 7. Estructura del gen ortólogo Fat en Drosophila melanogaster, humano y ratón (28). Las funciones mejor definidas y atribuidas a Fat1 involucran migración celular, polaridad y adhesión célula-célula, donde Fat1 parece regular directamente estos procesos vía efectos sobre la red de actina en relación con la vía de Ena/VASP, Homer 3 y β-catenina-Wnt. Por otro lado Fat1 también está involucrado en la estructura y función de las hendiduras glomerulares de los podocitos y en el desarrollo del cerebro (27, 30-31). La familia de proteínas Ena/VASP tiene un papel importante en la vinculación de las vías de señalización para la remodelación del citoesqueleto de actina. La migración celular requiere regulación coordinada de protuberancias celulares, célula-matriz o de adhesión célula- célula, fuerzas de contracción y desprendimiento posterior. En los fibroblastos, las proteínas Ena/VASP regulan el paso de protrusión de la movilidad mediante el control de la geometría de las redes de actina dentro de los lamelipodios (31). El gen Fat1 de rata mostró que la expresión fue iniciada en la preimplantación de los embriones cuando las células comienzan a compactarse (32). Esta expresión fue sub- regulada cuando las células ya no se dividieron y es que, en general su expresión es sub- regulada o ausente después de la organogénesis y la diferenciación terminal. El ratón deficiente de Fat1 no es letal en el embrión, pero todos los homocigotos carentes de este gen mueren dentro de las 48 horas después de su nacimiento. Esta muerte perinatal fue atribuida a la fusión anormal de los podocitos dentro del riñón, resultando en la pérdida de Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 24 espacio entre las uniones. Los autores argumentan que el gran tamaño de Fat1 lo hace un candidato para proveer espacio entre las células en el riñón (33). Un segundo mecanismo por el cual Fat1 puede regular la migración celular es vía la unión del Represor transcripcional atrofina. La interacción fue reconocida primero en Drosophila donde Fat1 interactúa con la atrofina y presenta efectos funcionales sobre la polaridad celular en mamíferos (34). Las cadherinas pueden interactuar con la β-catenina y secuestrarla de la periferia celular regulando su actividad transcipcional. Si no es secuestrado en la membrana celular, la β- catenina se une a las proteínas del Factor de Células-T (TCF) que translocan al núcleo y activan los genes diana de la vía de señalización Wnt, lo que promueve la proliferación celular y el crecimiento tumoral (35). Nishikawa y colaboradores (27) demostraron que la pérdida del transcrito del gen Fat1 tiene un rol importante en la metamorfosis de las características de células de carcinoma en la que se incluye la pérdida de adhesión célula- célula, la polaridad celular y cambios en la morfología asociados a la desorganizada localización de la β-catenina; así la adhesión célula-célula limitada puede resultar en tumores que pueden ser altamente diseminados. Sin embargo, el silenciamiento Fat1 suprime la movilidad de las células de carcinoma en los ensayos de cierre de herida y migración. Una expresión inhibida de Fat1 en esos experimentos fue asociado con la desorganización drástica de la β-catenina. Esto podría indicar que Fat1 se une con el dominio citoplásmico de β-catenina; mientras que la pérdida de Fat1 resulta en la localización difusa de β-catenina en el citoplasma y el núcleo. Por otro lado, la ausencia del complejo Fat1-β-catenina puede resultar en la pérdida de polaridad celular y migración; lo que podría estar ligado a una mejor prognosis del carcinoma. Por otro lado, Hou y colaboradores (36) encontraron que la expresión de Fat1 en células vasculares de músculo liso incrementó significativamente después de un daño a la arteria carótida de rata o su estimulación con factores de crecimiento. De manera interesante, la Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 25 expresión del KO de Fat1 limitó la migración de células vasculares de músculo liso pero aumentó su crecimiento. Este efecto antiproliferativo parece ser mediado por el dominio intracelular de Fat1, que interactúa con la β-catenina, evitando su translocación nuclear y limitando su actividad transcripcional. La inactivación de Fat1 por lo tanto promueve la señalización de Wnt y la formación de tumores (35). En 2003 Ciani L y col.diseñaron el ratón KO de Fat1 y se dieron cuenta que los ratones morían dentro de las 48 horas después del nacimiento, esto se debe a una falla en la unión de los podocitos en el riñón (33). Por otro lado se ha encontrado que la cola citoplásmica de Fat1 humano se une con miembros de la familia HOMER, específicamente a HOMER-1 y HOMER-3 que son proteínas de andamiaje y tienen papeles específicos en señalización del sistema immune y el desarrollo y mantenimiento del sistema nervioso, es por esto que si se alteran las interacciones Fat1-HOMER se puede explicar la penetrancia parcial de los fenotipos de sistema nervioso central observados en el ratón KO de Fat1 (21). Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 26 Justificación Datos experimentales muestran que el mRNA de Fat1 tiene una tendencia a la sobre- expresión en FPI al compararlo contra controles de Neumonitis por hipersensibilidad (Figura 8) (6, 15); además, los datos experimentales obtenidos por Ferrer (5) muestran que células epiteliales en el pulmón con FPI expresan la proteína de la Protocadherina Fat1 en el tejido con FPI (Figura 9a). De manera interesante, estudios preliminares de nuestro grupo de trabajo indican que la citosina profibrosante TGF-β1 induce la sobreexpresión del gen Fat1 (figura 9b). Por estas razones, Fat1 podría ser una molécula clave en la diferenciación aberrante de las células epiteliales en FPI. Figura 8. Genes sobre expresados en la Fibrosis Pulmonar Idiopática (15). a) b) Figura 9. Expresión de Fat1. a) Inmunohistoquímica de tejido epitelial pulmonar de pacientes con FPI, las flechas muestran la tinción positiva para Fat1; b) células de epitelio pulmonar A549 estimuladas con TGF-β1 a 6 horas, ensayo único (5). Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 27 Hipótesis Al estimular cultivos de células epiteliales de la línea A549 con TGF-β1, que es un factor de crecimiento profibrosante, se regulará de manera diferencial la expresión del gen Fat1 con una tendencia a la sobreexpresión. Objetivo Analizar la expresión de Fat1 en células epiteliales alveolares (línea celular inmortalizada A549 de neumocitos tipo II) al ser estimuladas con TGF-β1 en periodos de tiempo de 3, 6, 9, 12, 24 y 96 horas. Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 28 Materiales y métodos Cultivo de células epiteliales alveolares (línea inmortalizada de neumocitos tipo II, A549) Se prepararon 950 ml de medio F-12K (Anexo 1, Tabla 1) dividiéndolo en dos partes para su uso de la siguiente manera: a 450 ml del medio se le agregaron 50 ml de Suero fetal bovino (SFB) (GIBCO) obteniendo un volumen final de 500 ml de medio F-12K con suero; el resto del medio (500 ml) se mantiene sin alteraciones (F-12K sin suero). Ambos medios se filtran al vacío para asegurar su esterilización utilizando unidades de filtración de 22µm (Corning) y se mantienen en refrigeración. El Suero fetal bovino aporta factores de crecimiento, hormonas, minerales, lípidos y otros micronutrientes, que al ser usados en concentraciones apropiadas en el medio de cultivo, suplen satisfactoriamente los requerimientos metabólicos que garantizan la propagación y adhesión celular (37). Los medios F-12K sin suero y F-12K con suero se utilizaron como medio de crecimiento celular de la línea inmortalizada A549 de células epiteliales alveolares y fueron preparados constantemente conforme lo requirió el trabajo de laboratorio. Las células inmortalizadas de la línea A549 que se utilizaron en este trabajo se adquirieron de la compañía American Type Cell Culture (USA), se encuentran en alícuotas de 1ml con Suero fetal bovino más dimetilsulfóxido (DMSO) al 10% y son crio-preservadas en N2 líquido (-195.8˚C) en el Laboratorio de Bioquímica de la Facultad de Ciencias de la UNAM. Se cultivaron las células A549 dentro de cajas T25 (25 cm2 de superficie) colocando 1 ml de células descongeladas más 4 ml de medio F-12K con suero distribuyendo las células dentro de toda la superficie de la caja para una adhesión y crecimiento uniforme. Se mantuvieron las cajas en incubación a 37°C durante 24 horas en una estufa de cultivo (Thermo scientific) Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 29 en la que se llevó a cabo el aumento de confluencia celular manteniendo la tapa de las cajas ligeramente abierta, para así asegurar la entrada de oxígeno y CO2 al 5%. Una vez pasadas 24 horas del cultivo celular, las cajas fueron observadas bajo un microscopio invertido (Nikon, ECLIPSE TE2000-S) para comprobar la adhesión de las células su confluencia. Una vez que la confluencia celular aumentó, se separaron las células de la superficie de la caja (proceso detallado más adelante) y se trasladaron a cajas T75 (75 cm2 de superficie) continuando con el lavado y el reemplazo de medio, anteriormente descrito, aumentando la cantidad de medio a 7 ml. El lavado y reemplazo del medio de cultivo fue recurrente durante el trabajo de laboratorio asegurando así los nutrientes y factores de crecimiento para la vida y proliferación de las células A549. Separación y conteo celular Una vez que la proliferación celular alcanzó un nivel adecuado (70-90% de confluencia) se procedió a separar las células de la superficie de la caja de cultivo para trasladarlas a otra caja de cultivo con 6 pozos en la que se realizaron los experimentos de estimulación celular con el Factor de Crecimiento Transformante β-1 (human recombinant TGF-β1 [Peprotech]). El proceso de separación se realizó de la siguiente manera: previo lavado celular con medio F-12K sin suero, se agregaron 2 ml de tripsina preparada (Anexo, tabla 2) a la caja de cultivo y se incubó durante 3 min a 37°C, observando bajo el microscopio las células deben verse desprendidas de la superficie de la caja. Inmediatamente después de la incubación, se agregan 4 ml de medio F-12K con suero (el suero contiene un inhibidor de tripsina), se trasladan a un tubo de 15 ml y se centrifuga a 1300 rpm por 5 minutos. Una vez centrifugado, se extrae el sobrenadante y el pellet de células que se ha formado se resuspendió, se tomaron tres alícuotas de 1 ml a las que se agregaron 2 ml de SFB con DMSO al 10% cada una (para disminuir el punto de congelación celular, así las células se congelan más lentamente y se mantienen vivas), para ser crio-preservadas en N2 líquido en la Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 30 colección del Laboratorio de Bioquímica de la Facultad de Ciencias para ser utilizadas en posteriores estudios. De la resuspensión de células A549, mencionada anteriormente, se tomaron 10 µl y se le agregaron 10 µl más de azul tripano que se colocaron en una celda Countess (Cell Counting Chamber Slide) (Invitrogen) con lo que se realizó el conteo celular que tuvo los siguientes resultados: o 2.6 x 106 células vivas o 2.3 x 105 células muertas o 92% de viabilidad Con estos datos se realizaron los cálculos para conocer el volumen de suspensión correspondiente a 300 mil células, es decir 120 µl que fueron colocados en nuevas cajas de cultivo divididas en 6 pozos cada una (10 cm2 de superficie por pozo) (Corning) con 120 µl por pozo. Se agregó 1 ml de medio F-12K con suero a cada pozo y se incubaron a 37°C. El lavado y reemplazo del medio de cultivo celular en cada pozo fue constante, utilizando 2 ml de cada medio según el caso. Las células cultivadas en los pozos fueron utilizadas para realizar experimentos de estimulación celular con TGF-β1. Estimulación celular con TGF-β1 Las células que se cultivaron en los pozos fueron tratadas durante 24 horas con medio F- 12K sin suero para detener su ciclo celular yprepararlas para los experimentos de estimulación con TGF-β1 (human recombinant TGF-β1, Peprotech). La estimulación se realizó aproximadamente a 50% de confluencia (dato arbitrario, depende del investigador), lavando y re-estimulando a las 48 horas (43), por triplicado; se utilizaron triplicados porque en nuestra experiencia, generalmente uno de los datos obtenidos con triplicados es diferente a los otros dos. Con esta finalidad y para evitar generar una desviación estándar Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 31 muy alta, los resultados se trabajaron por duplicado eliminando uno de los datos (generalmente el que se comporta distinto del resto). Aunque esta estrategia podría tener sus limitantes, se seleccionó esta forma de análisis desde el diseño del experimento. Se extrajo el medio y se agregó una solución de 5 ng/ml de TGF-β1+F-12K a la mitad de los pozos, el resto se mantuvo con medio F-12K sin suero, nuevo y se dejaron en incubación a 37°C durante 3, 6, 9, 12, 24 y 96 horas respectivamente (Figura 10). Células A549 Control (sin TGF-β1 ) Células A549 estimuladas con TGF- β1 por 3, 6, 9, 12, 24 y 96 horas. Figura 10. Modelo experimental de células A549 controles y estimuladas con TGF-β1. Extracción de RNA Para el protocolo de extracción de RNA se utilizó la técnica con el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad CA); que consiste en el siguiente protocolo: Una vez pasado el tiempo de estimulación para cada caso, se sacaron las células de la incubación, se les retiró el medio de cultivo e inmediatamente después se les agregó 1ml de TRIzol, homogeneizandolo y dejándolo incubar por 5 minutos a temperatura ambiente. El contenido de cada pozo se trasladó a tubos Eppendorf de 2 ml, debidamente etiquetados y se les agregó 200 µl de cloroformo, se homogeneizaron con un agitador tipo Vortex (Scientific Industries) y se dejaron reposar de 2 a 3 minutos a temperatura ambiente. Se Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 32 centrifugaron los tubos (Centrifuga Heraeus, Megafuge 16R, Thermo Scientific) a 12,000 xg por 15 minutos a 4°C, en este paso se ven las 3 fases de la solución. Se tomó sólo la fase acuosa de cada tubo, aproximadamente 400 µl que contienen el RNA, y se transfirieron a un nuevo tubo, debidamente etiquetado, agregándole 0.5 ml de isopropanol al 100%. Se homogenizó y se dejó reposar durante 24 horas a -80°C (trabajos anteriores han demostrado que se obtiene un mayor rendimiento). Pasadas 24 horas, se descongelan los tubos y se centrifugaron a 12,000 xg por 10 minutos a 4°C. Se retiró el sobrenadante y el pellet de RNA se resuspendió en 1 ml de Etanol al 75%, homogeneizándolo y se centrifugó a 7500 xg por 5 minutos a 4°C. Se retiró el sobrenadante y se dejó secar el pellet de RNA hasta que se hubo evaporado completamente el etanol. Se resuspendió con 12 µl de agua con dietilpirocarbonato (DEPC) al 0.1%. Se dejó reposar 24 horas a -80°C. Cuantificación de RNA Pasado el tiempo de reposo del RNA, se descongelaron las muestras, se homogeneizaron con un agitador tipo Vortex y se pasaron rápidamente por centrifugación para colocarlas inmediatamente en hielo. Se procedió a cuantificar el RNA utilizando un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific, Wilmington, Delaware) en el que, previa limpieza con agua con DEPC al 0.1%, se colocó 1 µl de cada muestra y se contabilizó con el programa NanoDrop 2000, que utiliza como base el coeficiente de extinción del RNA (que es de 40.0) y la máxima absorbancia de los ácidos nucleicos (que ocurre a una longitud de onda de 260nm) llevando a cabo el cálculo de la concentracón con la siguiente fórmula (29): [RNA] µg/µl = (A260 x dilución x 40) / 1000 Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 33 Tratamiento con DNasa Para destruir cualquier rastro de DNA que hubiera quedado durante la extracción de RNA, se realizó un tratamiento con DNAsa (Anexo 1, tabla 3) con el siguiente protocolo: Se incubaron los tubos con DNAsa a 25°C por 15 minutos. Se agregó 1 µl de EDTA 25 mM. Se calentó a 64°C por 10 minutos, en un termociclador BioRad CFX96, para desnaturalizar la DNAsa. Síntesis del cDNA. Se utilizó el RT-for-PCR Kit (Clontech, Mountain View, California), siguiendo las indicaciones del proveedor: La muestra tratada con DNAsa se colocó rápidamente en hielo, se agregó 1 µl de hexámeros al azar 20 pmol (Kit Clontech) mas 1.5 µl de agua con DEPC al 0.1%, se calentó a 75°C por dos minutos en el termociclador BioRad CFX96 y se incubó inmediatamente en hielo para evitar la formación de estructura secundaria. Después se agregó la mezcla de reacción (Kit Clontech) preparada de la siguiente forma (cantidades para una muestra): Se mezcló cada muestra con la micropipeta y se incubó nuevamente en el termociclador BioRad CFX96: 42°C por una hora, 94°C por 5 minutos y 4°C por 5 minutos. Finalmente se agregaron 80µl de agua con DEPC al 0.1% para tener una concentración teórica final de cDNA 10ng/µl. Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 34 Para corroborar la obtención de cDNA, se realizó una PCR de punto final convencional para amplificar el gen constitutivo de la enzima Gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa que cuenta con 396 pares de bases, con los siguientes oligonucleótidos específicos: Sentido 5´CCCCTTCATTGACCTCAACT3´ Antisentido 5´TTGTCATGGATGACCTTGGC3´ La mezcla de reacción se realizó con los reactivos especificados en el Anexo 1, tabla 5. La reacción de PCR se llevó a cabo en el termociclador BioRad CFX96 con los siguientes ciclos: o 94°C por 2 minutos o 94°C por 20 segundos o 60°C por 20 segundos 30 ciclos o 72°C por 25 segundos o 72°C por 5 minutos o 4°C por 10 minutos Para conocer el resultado los productos se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 2%, teñido con bromuro de etidio. Se utilizó el marcador molecular Tracklt de 100 pb (Invitrogen, Carlsbad CA) y las muestras fueron depositadas en los pozos junto con el loading buffer Blue Juice (Invitrogen, Carlsbad CA). El gel fue fotografiado usando el Molecular Imager de BIO RAD ChemiDoc XRS+ y observado con el programa Quantity One. Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 35 PCR en tiempo real Una vez corroborada la obtención de cDNA de las muestras, se realizó la técnica de PCR en tiempo real para cuantificar la expresión del gen Fat1, ya que resulta ser un análisis de mayor calidad y certeza para un solo gen. Se utilizaron dos Sondas TaqMan (Applied Biosystems) marcadas con un fluoróforo en el extremo 5´ y con una molécula inactivadora en el extremo 3´ (38); para amplificar el gen constitutivo rRNA 18s, así como para amplificar el gen blanco, Fat1. La reacción se realizó para todas las muestras (3, 6, 9, 12, 24 y 96 horas de estímulo y controles) por duplicado en una placa de 96 pozos debidamente etiquetados incluyendo pozos negativos o NTC (Not Template Control). La mezcla de reacción se realizó con los reactivos especificados en el Anexo 1, tabla 6. La PCR en Tiempo Real fue realizada en el termociclador BioRad CFX96 acoplado al programa CFX Manager con los siguientes ciclos (protocolo Applied Biosystems): o 95°C por 3 minutos o 95°C por 15 segundos o 55°C por 30 segundos 40 ciclos Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 36 Resultados Estimulación con TGF1 De acuerdo a lo reportado en una publicación de nuestro grupo de trabajo (43), en el presente estudio se realizó el protocolo de cultivo celular, estimulando mediante TGF1 (5 ng/ml) las células A549. En la figura 11 se pueden apreciar imágenes representativas(obtenidas durante el protocolo experimental) comparando a las células control vs tratadas a las 96 horas (4 días) en las que se puede apreciar cómo el fenotipo celular ha cambiado, observándose células tipo fibroblasto después del tratamiento. Este resultado muestra que la proteína recombinante funcionó adecuadamente, por lo que se procedió a la extracción del RNA. a) b) Figura 11. Imágenes representativas de los cultivos de la línea celular A549, a) controles b) tratadas con TGF1 (5ng/ml). Obsérvese el cambio de fenotipo. Aumento de 100 veces. Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 37 Cuantificación de RNA La cuantificación del RNA extraído de las células controles y estimuladas con TGF-β1 para 3, 6, 9, 12, 24 y 96 horas fue realizado con un espectrofotómetro acoplado al programa NanoDrop 2000. Los resultados fueron los siguientes: Muestra Concentración µg/µl A260 A280 A260/A280 µl para 1 µg de muestra C1 3h 0.9747 24.368 12.501 1.95 1.02 C2 3h 0.9492 23.729 12.116 1.96 1.05 C3 3h 1.3501 33.752 16.662 2.03 0.74 T1 3h 0.9717 24.292 12.418 1.96 1.02 T2 3h 0.9600 24.014 12.059 1.99 1.04 T3 3h 1.3572 23.929 17.437 1.95 0.73 C1 6h 1.2188 30.470 15.357 1.98 0.59 C2 6h 1.2195 30.486 15.176 2.01 0.82 C3 6h 1.4477 36.194 18.036 2.01 0.69 T1 6h 1.1794 29.480 14.927 1.98 0.84 T2 6h 1.237 30.928 15.614 1.98 0.80 T3 6h 1.2121 30.303 15.602 1.94 0.82 C1 9h 0.5312 10.624 6.450 1.65 1.88 C2 9h 0.3124 7.823 4.192 1.87 3.20 C3 9h 0.6799 16.922 8.833 1.92 1.47 T1 9h 0.3391 8.478 3.990 2.13 2.94 T2 9h 0.4207 10.517 5.689 1.85 2.37 T3 9h 0.5896 14.739 2.206 2.03 1.69 C1 12h 0.9544 23.860 12.3309 1.93 1.04 C2 12h 0.6615 16.537 8.639 1.91 1.51 C3 12h 0.6960 17.401 9.810 1.98 1.43 T1 12h 0.6515 16.287 8.713 1.87 1.53 T2 12h 0.7532 18.829 9.994 1.88 1.32 T3 12h 0.7551 18.877 9.891 1.91 1.32 Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 38 Continuación de tabla. Muestra Concentración µg/µl A260 A280 A260/A280 µl para 1 µg de muestra C1 24h 0.7157 17.891 9.331 1.92 1.39 C2 24h 0.9536 23.841 12.391 1.92 1.04 C3 24h 0.8006 20.015 10.686 1.87 1.24 T1 24h 0.3957 9.892 5.351 1.85 2.52 T2 24h 0.7735 19.339 8.896 2.17 1.29 T3 24h 0.9089 22.722 12.489 1.82 1.1 C1 96h 0.3013 7.533 3.995 1.89 3.29 C2 96h 0.3354 8.386 4.767 1.76 2.98 C3 96h 0.3331 8.327 4.484 1.86 3.00 T1 96h 0.4481 11.202 6.673 1.68 2.23 T2 96h 0.4367 19.339 8.896 1.89 2.28 T3 96h 0.4776 11.94 7.267 1.64 2.09 Tabla 1. Cuantificación de RNA por espectrofotometría. Se observa la concentración de cada muestra, la absorbancia a 260 nm, 280 nm y el radio de 260nm/280nm (grado de pureza del RNA) y la cantidad en µl para obtener 1 µg de muestra. Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 39 Síntesis del cDNA La obtención de cDNA fue corroborada por PCR para GAPDH de células A549 tratadas con TGF-β1 por 12 horas. La figura 12 muestra, como ejemplo, la fotografía de la electroforesis en gel de agarosa al 2%, teñido con bromuro de etidio, en el que se observan 6 productos de PCR. Figura 12. Electroforesis de PCR para GAPDH de células A549 tratadas con TGF-β1 por 12 horas. 1) marcador molecular Tracklt de 100 pb (Invitrogen, Carlsbad CA); 2-4) muestras control, 12 horas; 5-7) muestras estimuladas con TGF-β1, 12 horas; 8) control negativo. PCR en Tiempo Real Los datos de fluorescencia se analizaron con el software CFX Manager acoplado al termociclador. Los datos obtenidos para rRNA 18s fueron utilizados para normalizar los datos de la expresión de Fat1 analizando el ciclo umbral (Ct) (medida relativa de la concentración de la secuencia o gen blanco (38) de ambos genes para cada muestra por duplicado, con la técnica de Ct comparativo siguiendo las siguientes fórmulas: ΔCt = Ct gen blanco – Ct gen endógeno 2^- ΔCt = expresión relativa del gen blanco Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 40 A continuación se muestran los datos obtenidos de los cálculos de Ct comparativo para cada uno de los tratamientos con TGF-β1 y sus respectivos controles. Es importante mencionar que debido a inconsistencias en los valores de rRNA 18s para las muestras de 9 horas, estos datos no se reportan. Expresión de Fat1 - 3 horas Control Fat1 Control 18s ΔCt 2^-ΔCt x 100,000 28.79 12.75 16.04 1.484153667 29.45 13.51 15.94 1.590676515 TGF-β1 Fat1 TGF-β1 18s ΔCt 2^-ΔCt x 100,000 28.25 11.59 16.66 0.96569564 28.14 11.54 16.6 1.006704644 Tabla 2. Expresión de Fat1 en células A549 controles y estimuladas con TGF-β1 por 3 horas. Expresión de Fat 1 - 6 horas Control Fat1 Control 18s ΔCt 2^-ΔCt x 100,000 28.64 13.1 15.54 2.098910245 28 12.58 15.42 2.280958937 TGF-β1 Fat1 TGF-β1 18s ΔCt 2^-ΔCt x 100,000 27.15 13.14 14.01 6.061355563 28.72 14.77 13.95 6.318755639 Tabla 3. Expresión de Fat1 en células A549 controles y estimuladas con TGF-β1 por 6 horas. Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 41 Expresión de Fat1 - 12 horas Control Fat1 Control 18s ΔCt 2^-ΔCt x 100,000 27.53 12.08 15.45 2.23401748 29.43 13.19 16.24 1.292030811 TGF-β1 Fat1 TGF-β1 18s ΔCt 2^-ΔCt x 100,000 29.41 12.68 16.73 0.919958365 31.34 12.77 18.57 0.256964412 Tabla 4. Expresión de Fat1 en células A549 controles y estimuladas con TGF-β1 por 12 horas. Expresión de Fat1 - 24 horas Control Fat1 Control 18s ΔCt 2^-ΔCt x 100,000 30.02 16.99 13.03 11.95581418 30.35 17.32 13.03 11.9558142 TGF-β1 Fat1 TGF-β1 18s ΔCt 2^-ΔCt x 100,000 29.8 14.31 15.49 2.172928155 30.23 16.41 13.82 6.914574495 Tabla 5. Expresión de Fat1 en células A549 controles y estimuladas con TGF-β1 por 24 horas. Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 42 Expresión de Fat1 - 96 horas Control Fat1 Control 18s ΔCt 2^-ΔCt x 100,000 26.58 21.81 4.77 1.144438926 27.79 23.26 4.53 1.646771601 TGF-β1 Fat1 TGF-β1 18s ΔCt 2^-ΔCt x 100,000 28.02 23.86 4.16 1.992583904 27.4 24.53 2.87 1.68721108 Tabla 6. Expresión de Fat1 en células A549 controles y estimuladas con TGF-β1 por 96 horas. Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 43 Expresión de Fat1 en células A549 A continuación se muestran los gráficos del Ct comparativo para cada uno de los tratamientos con TGF-β1 y sus respectivos controles. Debajo de cada gráfico se muestra de igual forma una tabla que contiene los datos del promedio y desviación estándar para las muestras control y estimuladas con TGF-β1 respectivamente. Promedio Control 1.537415091 Promedio TGF-β1 0.98620014 D.E. Control 0.07532303 D.E. TGF-β1 0.02899774 Figura 13. Gráfica de la expresión de Fat1 en células A549 controles y estimuladas con TGF-β1 por 3 horas con Promedio y Desviación Estándar (D.E.). 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 2 ^- Δ C t (F at 1 -1 8 s) x 1 0 0 ,0 0 0 Promedio Control Promedio TGF-β1 Expresión de Fat1 - 3 horas Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 44 Promedio Control 2.189934591 Promedio TGF-β1 6.190055601 D.E. Control 0.128727864 D.E. TGF-β1 0.182009339 Figura 14. Gráfica de la expresión de Fat1 en células A549 controles y estimuladas con TGF-β1 por 6 horas con Promedio y Desviación Estándar (D.E.). Promedio Control 1.763024146 Promedio TGF-β1 0.588461388 D.E. Control 0.666085162 D.E. TGF-β1 0.46880752 Figura 15. Gráfica de la expresión de Fat1 en células A549 controles y estimuladas con TGF-β1 por 12 horas con Promedio y Desviación Estándar (D.E.). 0 2 4 6 8 2 ^- Δ C t (F at 1 -1 8 s) x 1 00 ,0 0 0 Promedio Control Promedio TGF-β1 Expresión de Fat1 - 6 horas 0 1 2 3 2 ^- Δ C t (F at 1 -1 8 s) x 1 0 0 ,0 0 0 Promedio Control Promedio TGF-β1 Expresión de Fat1 - 12 horas Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 45 Promedio Control 11.95581419 Promedio TGF-β1 4.54375133 D.E. Control 0.00141421 D.E. TGF-β1 3.35285028 Figura 16. Gráfica de la expresión de Fat1 en células A549 controles y estimuladas con TGF-β1 por 24 horas con Promedio y Desviación Estándar (D.E.). Promedio Control 1.39560526 Promedio TGF-β1 1.83989749 D.E. Control 0.35520284 D.E. TGF-β1 0.21593119 Figura 17. Gráfica de la expresión de Fat1 en células A549 controles y estimuladas con TGF-β1 por 96 horas con Promedio y Desviación Estándar (D.E.). 0 5 10 15 2 ^- Δ C t (F at 1 -1 8 s) x 1 0 0 ,0 0 0 Promedio Control Promedio TGF-β1 Expresión de Fat1 - 24 horas 0 0.5 1 1.5 2 2.5 2 ^- Δ C t (F at 1 -1 8 s) x 1 0 0 ,0 0 0 Promedio Control Promedio TGF-β1 Expresión de Fat1 - 96 horas Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 46 Un resumen de los resultados obtenidos muestra una gráfica realizada con los valores del incremento, resultado de la estimulación de las células A549 con TGF-β1 5ng/ml vs. Controles, o Fold change. El Fold change está definido como la diferencia del promedio de las muestras tratadas y el promedio de las muestras control (figura 18), y se utiliza en el análisis diferencial de la expresión de un gen en particular (39-40). Fold-change (TFG-β1 - Control) 3h -0.551214951 6h 4.00012101 12h -1.174562757 24h -7.412062854 96h 0.444292228 Figura 18. Gráfica del incremento TGF-β1 vs. Controles o Fold Change (la diferencia del grupo tratado menos el grupo control) con los valores correspondientes a cada grupo de muestras. -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 3h 6h 12h 24h 96h Fo ld c h a n g e (T FG -β 1 -C o n tr o l) Tiempo de estimulación con TFG-β1 Fold change (TFG-β1 - Control) Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 47 Discusión La Fibrosis Pulmonar Idiopática es una enfermedad que afecta la estructura alveolar y disminuye la función respiratoria, lo que la define como una enfermedad crónica y letal para las personas que la padecen. Dicha estructura es modificada por diversas moléculas que se expresan en estos epitelios alveolares y que, de manera importante, podrían participar en las uniones célula-célula dando lugar a una remodelación anormal del tejido epitelial. Entre la gran diversidad de moléculas que participan en las uniones célula-célula, y que se ven afectadas cuando un paciente desarrolla FPI, se encuentra la Superfamilia de las cadherinas y dentro de ella, el grupo de las Protocadherinas, del cual forma parte la proteína codificada por el gen Fat1, motivo de este estudio. Es importante considerar el estudio de los genes que están involucrados en esta enfermedad ya que observando los datos clínicos y experimentales, se infiere que estos juegan un papel de gran importancia en el desarrollo de la FPI a diversos niveles moleculares y de interacción celular, por lo que Selman, Pardo y Barrera (6) realizaron un estudio de microarreglos para elucidar cuáles genes se encuentran sobreexpresados en la FPI y se observaron genes involucrados en las adhesiones célula-célula (Figura 5). En un estudio más reciente, Ferrer (5) encontró una sobreexpresión de Fat1 en células A549 (neumocitos tipo II) resultado de la realización de un ensayo único de estimulación con TGF-β1 por 6 horas (Figura 8). La línea celular A549 fue desarrollada por D.J. Giard y colaboradores (41) a través de la remoción y cultivo de tejido pulmonar canceroso, las células producidas fueron epiteliales alveolares (neumocitos tipo II) con adenocarcinoma y crecen en forma de monocapa adherente. Los neumocitos tipo II en un pulmón normal, son células escamosas y realizan la función de difusión de agua y electrolitos a través de la superficie alveolar. Así, Foster y colaboradores (42) realizaron la caracterización de esta línea celular como un modelo de metabolismo de medicamentos en epitelio pulmonar y concluyeron que las células A549 Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 48 son útiles como modelo de estudio de los procesos metabólicos y macromoleculares en las células alveolares. En el Laboratorio de Bioquímica de la Facultad de Ciencias se ha utilizado la línea celular A549, entre otras, como modelo básico de las células epiteliales alveolares para los estudios realizados en pro de la investigación sobre la FPI mostrando resultados confiables, por lo cual se determinó utilizar dicha línea celular para el presente trabajo. Es importante destacar la dificultad que implica obtener muestras de pulmón humano, no solo células epiteliales, ya que comúnmente las cantidades de tejido pulmonar extraídas de una biopsia son muy pequeñas, resultando insuficientes para llevar a cabo un protocolo experimental de este tipo, además del costo que implica la obtención de otras líneas celulares pulmonares. Por estas razones y a pesar de tener un fenotipo y comportamiento intrínsecamente canceroso, las células A549 han sido utilizadas para tratar de aproximarnos a la comprensión de los procesos celulares realizados en las células epiteliales pulmonares y, de manera específica en este trabajo, en el epitelio alveolar afectado por Fibrosis Pulmonar Idiopática. Tomando los datos anteriores como antecedentes, se realizó un análisis en un modelo experimental con células A549 (neumocitos tipo II) estimuladas con TGF-β1 ampliando el espectro temporal a diferentes periodos: 3, 6, 9, 12, 24 y 96 horas, con el objetivo de observar la distribución en la expresión del gen Fat1; este tipo de experimentos nos permiten comprender como se regula el gen y cuál puede ser su importancia dentro del desarrollo de la FPI. La hipótesis de este trabajo se confirma, es decir, sí se observa una regulación diferencial en la expresión del gen Fat1 en las células tratadas con TGF-β1. En el tratamiento de estimulación por 3 horas con TGF-β1 (figura 13), el promedio del grupo Control es de 1.537415091 y el promedio del grupo tratado con TGF-β1 es de 0.98620014; las desviaciones estándar de ambos grupos (Control= 1.537415091; TGF-β1= 0.98620014); se observa con base en los datos de promedios, que aunque no hay una sobre expresión de Fat1 en las células tratadas con TGF-β1 para este tratamiento, existe la tendencia a la Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 49 subregulación del gen de interés con respecto al control. A diferencia del tratamiento anterior, los datos obtenidos en el periodo de 6 horas (figura 14) muestran un incremento en la expresión del gen Fat1, la desviación estándar es muy pequeña para ambos grupos (Control= 0.128727864; TGF-β1= 0.182009339), lo que nos indica que existe una tendencia a la sobre expresión del gen Fat1 en este tratamiento. Este resultado corrobora los datos obtenidos por Ferrer (5). A diferencia de los tratamientos anteriores, en el tratamiento por 9 horas, los datos obtenidos mostraron mucha dispersión, esto puede ser debido a la baja pureza del RNA recuperado de la extracción. La relación de absorbancia 260 nm / 280 nm es utilizada para evaluar la pureza del DNA y del RNA. Un valor de ~2.0 para el RNA es generalmente aceptado como puro. Si el valor apreciado es menor, como se observa en la tabla 7 para los valores de este tratamiento, puede indicar la presencia de proteínas, fenol o cualquier otro contaminante con absorbancia mayor o cercana a 280 nm (51); debido a esto y a la nula reproducibilidad de los datos, no se tomaron en cuenta para el análisis. Para los tratamientos de12, 24 y 96 horas (figura 15-17) en base a los datos de promedios y desviación estándar, se observa que existe una tendencia a la sub regulación del gen Fat1. A manera de resumen, se realizó la gráfica de la figura 18 que muestra los valores de incremento entre los grupos control y tratados con TGF-β1 con una medida estadística llamada Fold change, es decir la diferencia de incremento en la expresión génica entre ambos grupos. En esta gráfica se aprecia el comportamiento en la expresión del gen Fat1. En el tratamiento de 3 horas se observa un valor negativo (-0.551214951), seguido por un incremento en el tratamiento de 6 horas (4.00012101), lo que se observa también en la primera gráfica de la figura 14. Posteriormente, en 12, 24 y 96 horas se muestra la tendencia a la sub regulación del gen. Así, tenemos solamente un tiempo en el cual hay incremento en la expresión del Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 50 gen Fat1, a las 6 horas; los datos sugieren que antes y posterior a este punto, la expresión está disminuida. Estos resultados se encuentran relacionados directamente con el efecto del TGF-β1 como factor profibrosante en las células A549. Se ha reportado que el mayor efecto de TGF-β1 es que promueve la proliferación de células mesenquimales cultivadas, como fibroblastos y osteoblastos; así también es importante en el control de la homeostasis de la matriz extracelular ya que puede causar remodelaciones por la estimulación celular simultánea para incrementar la síntesis de la mayoría de las proteínas de matriz, disminuye la producción de algunas proteasas que degradan matriz incrementando los inhibidores de dichas proteasas y modula la expresión de las integrinas y otras moléculas de adhesión celular (44). En diversos trabajos se ha demostrado la respuesta proliferativa y profibrosante que tienen las células que han sido tratadas con TGF-β1 por cortos periodos de tiempo. En ensayos de cierre de herida, Yang y colaboradores (45) encontraron que la actividad proliferativa comienza en 1 hora seguida por una segunda ola de activación algunos días después. Sime y colaboradores (46) encontraron una respuesta fibrótica elevada en el epitelio bronquial de rata a las 24 horas después de ser tratado con TGF-β1, actividad que se mantuvo de 7 a 10 días. Roberts y colaboradores (47) trabajaron con ratones recién nacidos administrándoles TGF-β1 y comenzaron a notar tejido de granulación en 2 a 3 días. Terrel y colaboradores (48), encontraron fibrosis renal y hepática en ratas tratadas por dos semanas. Zugmaier y colaboradores (49) administraron TGF-β1 a ratones desnudos y encontraron tejido fibrótico en 10 días. Todos estos resultados sugieren que el TGF-β1 participa en la proliferación y migración celular en periodos cortos de tiempo y que inicia una respuesta fibrótica local, pero la persistencia de la fibrosis puede ser independiente de la producción y mantenimiento de TGF-β1 (44). Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 51 De acuerdo a estos antecedentes y a las características del gen Fat1, se puede observar que la participación del TGF-β1 en la sobreexpresión del Fat1 en células A549, y de manera global en la Fibrosis Pulmonar Idiopática, va de la mano con su bien conocido papel como factor profibrosante. Los resultados de Ferrer (5) y los obtenidos en el presente trabajo, sugieren que el TGF-β1 también regula la expresión de Fat1, gen que tiene una importante relación con la estructura y conducta celulares, ya que favorece la migración de algunos tipos celulares modificando la estructura de los filamentos de actina, por interacción con proteínas de anclaje esenciales para el ensamble de los estos microfilamentos como ENA/VASP (30) y HOMER 1 y 2 (52) además de que la proteína de Fat1 se ha observado en estructuras de migración como lamelipodios y filopodios (53). En células epiteliales de rata, se ha observado que la ausencia de Fat1, retrasa la migración celular y esto puede deberse a una mala formación de las redes de actina y/o al inapropiado reclutamiento de proteínas de señalización celular como β-catenina (50). Es importante mencionar que en la línea celular NRK-52E (línea celular de riñón de rata), los efectos regulatorios de Fat1 sobre la migración celular han sido atribuidos al empalme alternativo del dominio citoplásmico. En estas células, la migración es atribuida a una isoforma que tiene 12 residuos de aminoácidos más en la cola citoplásmica, mientras que las células que expresan Fat1 silvestre permanecen quiescentes (54). En humanos, se ha detectado la isoforma equivalente de +12 residuos de aminoácidos en células de cáncer que están realizando transición epitelio- mesénquima (55). En este estudio, no es posible diferenciar las isoformas, pero lo que si se observa es que solo a las 6 horas tenemos sobre-expresión y que, será importante determinar si en ese tiempo a) existe un incremento en la migración y b) si este es regulado por Fat1. Así, Fat1 podría participar en los patrones de reestructuración del epitelio alveolar, un aspecto que desempeña un papel decisivo en el desarrollo de la FPI. Los resultados del presente trabajo refuerzan resultados anteriores y nos acercan más a conocer la relevancia del gen Fat1 en el desarrollo de la FPI, sin embargo solo es el comienzo de la investigación al respecto. Sería necesario ampliar el número de muestras control y tratadas con TGF-β1 para obtener resultados más confiables, con un nivel de significancia Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 52 mayor y disminuir la dispersión de los datos, como fue el caso del grupo de tratamiento por 9 horas. También sería conveniente, evaluar la presencia de la E-cadherina para confirmar la Transición Epitelio Mesénquima en las células A549; además, se tendrá que validar estos resultados en otra línea celular, como la línea de células de epitelio bronquiolar HBE-E6E7 (ATCC), y comenzar a dilucidar como actúa el gen Fat1 dentro de la Fibrosis Pulmonar Idiopática. Finalmente, una opción interesante para ampliar el conocimiento acerca del gen Fat1 dentro del desarrollo de la Fibrosis Pulmonar Idiopática (en los modelos in vitro de células epiteliales), sería llevar a cabo el silenciamiento del gen y analizar las tasas de proliferación, viabilidad, migración y apoptosis de las células epiteliales alveolares, ya que como se mencionó anteriormente, al silenciar a Fat1 algunos investigadores han encontrado un aumento en las tasas de proliferación, migración e invasión en diversos tejidos tumorales (27, 32-33, 35-36), sugiriendo la relación entre Fat1 y su papel en estos procesos, lo que en la FPI podría mantener la remodelación anormal del tejido, característica de la enfermedad. Conclusión Se llevó a cabo un curso temporal de estimulación con TGF-β1 sobre células del epitelio alveolar (línea celular A549) para observar la expresión del gen Fat1. Tras analizar los resultados obtenidos podemos concluir que el TGF-β1 regula, de manera diferencial, la expresión de Fat1, siendo subregulado a las 3 horas y sobreexpresado a las 6 horas de tratamiento. Expresión de FAT1 en células epiteliales de pulmón humano. 53 Literatura consultada 1) Heinrich M, Jäger AK. Ethnopharmacology. Jhon Wiley & sons. 2015, 147-157 pp. 2) García-Porrero J, Hurlé J. Anatomía humana. McGraw Hill Interamericana. 2005, 450-471 pp. 3) Morris J, Hartl A. Biology. How life works. W.H. Freemand and company. 2012, 39.6- 39.13 pp. 4) Sadava, Hillis. Life. The science of Biology. 10a edición. McMillan International Edition. 2014, 1013-1022 pp. 5) Ferrer-Bolaños A E. Expresión de FAT1 en fibrosis pulmonar idiopática. Tesis de Licenciatura. Biología, Facultad de Ciencias, UNAM, 2016. 6) Selman M, Pardo A,
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