Genotipificacion-de-trypanosoma-cruzi-en-triatominos-Hemiptera-Reduviidae-de-la-Reserva-de-la-Biosfera-de-Los-Tuxtlas-Veracruz-Mexico

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
 DE MÉXICO 
 
 FACULTAD DE CIENCIAS 
 
 
Genotipificación de Trypanosoma cruzi en triatominos 
(Hemiptera: Reduviidae) de la Reserva de la Biosfera de 
Los Tuxtlas, Veracruz, México. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
T E S I S 
 
 
 QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
 B I O L O G A 
 P R E S E N T A : 
 
J O S E L I N D Í A Z V A L D E Z 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
D I R E C T O R A D E T E S I S: 
DRA. BERTHA JOSEFINA ESPINOZA GUTIÉRREZ 
2017 
 
 
 
usuario
Texto escrito a máquina
 CIUDAD UNIVERSITARIA, CDMX
 
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VmVE(\'\DAD NAqONAL 
AvToN°MA DE 
MEZIc:,O 
FACULTAD DE CIENCIAS 
Secretaría General 
División de Estudios Profesionales 
Votos Aprobatorios 
LIC. I V ON NE RAMÍREZ WEN CE 
Directora General 
Dirección General de Administración Escolar 
Presente 
Por este medio hacemos de su conocimiento que hemos revisado el trabajo escri to titulado: 
Genotipificación de Trypanosoma cruzi en triatominos (Hemiptera: Reduviidae) de 
la Reserva de la Biosfera Los Thxtlas, Veracruz, M éxico 
realizado por Joselin Díaz Valdez con número de cuenta 308216875 quien ha decidido 
titularse mediante la opción de tesis en la licenciatura en Biología. Dicho trabajo cuenta con 
nuestlo voto aprobatollo. ---/ 
Propietario Or GUillermo Salgado Maldonad~ u..i.\lc.\\ti.J pJ.~ ~(~Q, 
Propietaria 
Propietaria 
Tutora 
Suplente 
Suplente 
. D~CY~. 
Ora. Bertha Josefina Espinoza Gutiérrez ~ I _ 
~~I!-
Dra. Deyanira Pérez Morales 
M. en C. Isabel Cristina Cañeda Guzmán 
M. en C. Ignacio Martínez wlartínez 
Atentamente 
" POR MI RAZA HABLARÁ EL ESPÍRITU H 
CIUDAD UNIVERSITARIA, CD. Mx., A 22 D E AGOSTO DE 2016 
JEFE DE LA DIVISIÓN DE ESTU DIOS PROFESION ALES 
ACT. MAU RIC IO AGUILAR GO NZÁLEZ 
Señor sinod a l: antes de firmar este documento, solicite al estudiante que le muestre 
la versión digital de su trabajo y verifique que la misma incluya todas las 
observaciones y correcciones que usted hizo sobre el mismo. 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
A la Dra. Bertha Josefina Espinoza Gutiérrez por el apoyo y la asesoría para la realización 
de este proyecto. 
 
 
Al M. en C. Ignacio Martínez Martínez por su asesoría y aportaciones para la realización de 
las estandarizaciones de extracción de DNA de triatominos y PCR´s realizados en este 
trabajo. 
 
 
A Cristina Bastida Jaime por su asesoría para la extracción de DNA de Trypanosoma cruzi. 
 
 
Al Biólogo Luis Adrián De Jesús Gonzales por su asesoría para la realización de 
electroforesis en geles de poliacrilamida. 
 
 
Al proyecto DGAPA-PAPIIT-IN209314 "Análisis de la dinámica y prevalencia de tres 
zoonosis emergentes en mamíferos pequeños silvestres en condiciones ambientales 
contrastantes" por el financiamiento que permitió la colecta en campo y apoyo parcial en 
el análisis molecular de las muestras de triatominos. 
 
 
A los doctores Víctor Sánchez Cordero Dávila, Ángel Rodríguez Moreno y Gabriel Gutiérrez 
Granados del Instituto de Biología, UNAM por los triatominos donados para la realización 
de este proyecto. 
 
 
A mis sinodales por las aportaciones a este trabajo: 
Dr. Guillermo Salgado Maldonado 
Dra. Deyanira Pérez Morales 
Dra. Bertha Josefina Espinoza Gutiérrez 
M. en C. Isabel Cristina Cañeda Guzmán 
M. en C. Ignacio Martínez Martínez 
 
 
Al Sr. Osvaldo Martínez Garay, por su apoyo como laboratorista en la limpieza y esterilizado 
de material. 
 
 
A la Sra. Martha Ramírez, por su apoyo como auxiliar de laboratorio. 
 
A mis compañeros de laboratorio Génesis, Paulina, Cristina, Karla, Esteban, Lucio, 
Edgar y Luis, por su apoyo y consejos para la realización de este trabajo. 
 
 
 
 
 
DEDICATORIAS 
 
A mi mama, por ser mi apoyo incondicional, mi padre y madre a la vez, tú me enseñaste a 
luchar por mis sueños contra viento y marea. Gracias por creer en mí y motivarme a seguir, 
¡lo logramos mami! 
 
A mis hermanos Jonathan y Gustavo, por el apoyo, consejos y cuidados que siempre me 
han dado. Gracias, sin su guía quizás sería una abogada o arquitecta, ustedes me 
enseñaron lo divertido que es aprender cómo funciona el mundo. 
 
A Luis por siempre estar conmigo durante toda esta aventura, desde las siete de la mañana 
del primer día de clases. Gracias por oírme, apoyarme, aconsejarme y sobre todo 
consolarme en los momentos de total aciago, que durante este trabajo fueron muchos. 
 
A mi Bilma, tu siempre me has acompañado en cada desvelo. 
 
A mi abuelita y mi tía Blanca, donde quiera que estén sé que comparten esta alegría 
conmigo. 
 
A la Dra. Bertha Espinoza Gutiérrez y al M. en C. Ignacio Martínez Martínez, por todo lo 
que en han enseñado, sus consejos, apoyo, regaños y paciencia que me han tenido, 
gracias. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ÍNDICE 
 
1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 1 
1.1 Generalidades de Trypanosoma cruzi ............................................................................ 1 
1.2 Manifestaciones clínicas de la Enfermedad de Chagas .............................................. 2 
1.3 Distribución y epidemiologia de la Enfermedad de Chagas. ....................................... 3 
1.4 Datos epidemiológicos en México ................................................................................... 3 
1.5 Biología del parásito T. cruzi ........................................................................................... 4 
1..5.1 Morfología de T. cruzi ............................................................................ 4 
1.5.2 Ciclo de vida de T. cruzi .......................................................................... 6 
1.5.3 Genética de T. cruzi ................................................................................ 7 
1.6 Biología de los triatominos (Hemiptera: Reduviidae) ................................................... 9 
1.6.1 Especies de vectores en México ........................................................... 12 
1.6.3 Prevalencia de T. cruzi en vectores de México ..................................... 14 
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................................... 17 
3. JUSTIFICACIÓN ....................................................................................................................... 18 
4. HIPÓTESIS ................................................................................................................................ 18 
5. OBJETIVO .................................................................................................................................. 18 
5.1 Objetivos particulares ..................................................................................................... 18 
6. MÉTODOS .................................................................................................................................. 19 
6.1 Descripción del área de estudio (Laguna Escondida) ................................................ 19 
6.2 Colecta de triatominos .....................................................................................................20 
6.3 Estandarización de la extracción de DNA de triatominos .......................................... 20 
6.4 Estandarización de la verificación de la calidad del DNA extraído de triatominos 
por ensayo de electroforesis y PCR de citocromo b del vector ............................... 21 
6.5 Extracción de DNA de triatominos de Los Tuxtlas, Veracruz .................................. 22 
6.6 Extracción de DNA de cepas control de T. cruzi ....................................................... 22 
6.7 Estandarización del PCR de kDNA mini círculo de kDNA de T. cruzi. ................... 23 
6.8 PCR de mini circulo de kDNA de T. cruzi en triatominos de Los Tuxtlas, Veracruz
 ........................................................................................................................................... 24 
6.9 Genotipificación de T. cruzi en triatominos de Los Tuxtlas, Veracruz. ................... 24 
6.9.1 Estandarización del PCR mini exón de T. cruzi ..................................... 25 
6.9.2 PCR de mini exón de T. cruzi en triatominos de Los Tuxtlas, Veracruz. 25 
6.9.3 PCR de 18S de rDNA T. cruzi en triatominos de Los Tuxtlas, Veracruz.26 
 
 
6.9.4 PCR de 24S de rRNA de T. cruzi en triatominos de Los Tuxtlas, 
Veracruz. .................................................................................................. 26 
7. RESULTADOS ........................................................................................................................... 28 
7.1 Colecta de triatominos en la Reserva de la Biosfera de Los Tuxtlas, Veracruz .... 28 
7.2 Estandarización del PCR de mini círculo de kDNA de T. cruzi. ............................... 29 
7.2.1 Estandarización del programa de amplificación del PCR de mini circulo 
de kDNA de T. cruzi .................................................................................. 29 
7.2.2 Estandarización del protocolo de extracción y verificación de la calidad 
de DNA de triatominos de Jalisco. ............................................................ 30 
7.3 Identificación de T. cruzi en triatominos de Los Tuxtlas, Veracruz .......................... 33 
7.3.1 Extracción de DNA de triatominos de Los Tuxtlas, Veracruz ................ 33 
7.3.2 PCR de citocromo b de triatominos de Los Tuxtlas, Veracruz ............... 33 
7.3.3 PCR de mini circulo de kDNA de T. cruzi en triatominos de Los Tuxtlas, 
Veracruz ............................................................................................... 34 
7.4 Genotipificación de T. cruzi en muestras de triatominos de Los Tuxtlas, Veracruz
 ........................................................................................................................................... 36 
7.4.1 Estandarización del programa de amplificación del PCR mini exón de T. 
cruzi con cepas control ......................................................................... 36 
7.4.2 PCR de mini exón de T. cruzi en triatominos de Los Tuxtlas, Veracruz 37 
7.4.3 PCR de 18S de T. cruzi en triatominos de Los Tuxtlas, Veracruz ......... 39 
7.4.4 PCR de 24S de T. cruzi de triatominos de Los Tuxtlas, Veracruz ......... 41 
8. DISCUSIÓN ............................................................................................................................... 44 
9. CONCLUSIÓN ........................................................................................................................... 50 
10. PERSPECTIVAS .................................................................................................................... 51 
11. REFERENCIAS ....................................................................................................................... 52 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1 
1. INTRODUCCIÓN 
 
1.1 Generalidades de Trypanosoma cruzi 
 
El parásito Trypanosoma cruzi es el agente causal de la Enfermedad de Chagas o 
Tripanosomiasis Americana. Dicho parásito es un organismo unicelular eucarionte con 
reproducción por fisión binaria longitudinal, un único flagelo originado en un bolsillo flagelar, 
una ranura (citostoma) empleada para ingesta o captura de alimento y un cinetoplasto 
(kinetoplasto) dentro de su única mitocondria con crestas discoidales (Figura 1) (Adl, et al., 
2012; Corliss, 1994). El cinetoplasto se ubica perpendicularmente al flagelo y está 
compuesto por una red de DNA del cinetoplasto (kDNA) que representa aproximadamente 
el 30% del DNA celular total (orden Trypanosomatida), organizado en moléculas circulares 
denominados mini círculo (0.5 a 2.5 kb) y maxi círculo (20 a 40 kb) (De Souza, et al., 2010) 
 
Las características antes descritas, además de estudios de filogenia molecular basados en 
secuencias nucleotídicas de rRNA ubican taxonómicamente a T. cruzi de acuerdo a Adl, et 
al. (2012) y Corliss (1994) en: 
 
T. cruzi tiene un ciclo de vida que involucra dos hospederos, un vector triatomino 
(Hemiptera: Reduviidae) y un vertebrado, generalmente mamífero. La transmisión natural 
de T. cruzi al humano y a otros reservorios vertebrados es por vía vectorial, descrita 
detalladamente más adelante (sección 1.2.3 Ciclo de vida T. cruzi). Sin embargo, este 
parásito puede transmitirse al humano por cinco vías más: 1) transfusión sanguínea, siendo 
aún más probable la transmisión en transfusiones de plaquetas ya que los tripomastigotes 
sanguíneos se separan predominantemente en la fracción de plaquetas durante la 
Figura 1: Morfología de T. cruzi (fase 
epimastigote). Azul: mitocondria, 
Amarillo: cinetoplasto, Rojo: bolsillo 
flagelar, Verde: citostoma (Modificada 
de De Souza, 1999). 
 Imperio: Eukaryota 
 Super-grupo: Excavata 
 Primer rango: Discoba 
 Segundo rango: Discicristata 
 Phylum: Euglenozoa 
 Clase: Kinetoplastea 
 Subclase: Metakinetoplastina 
 Orden: Trypanosomatida 
 Familia: Trypanosomatidae 
 Género: Trypanosoma 
 
 
2 
centrifugación; 2) trasplante de órganos o médula ósea de un donante crónico, donde se 
desarrolla una alta parasitemia, signos clínicos de la enfermedad de Chagas e incluso la 
muerte rápida debido al tratamiento con inmunosupresores; 3) transmisión congénita la cual 
se presenta en menos del 5% de los hijos de mujeres en fase crónica; 4) transmisión oral 
por la ingesta de alimentos o líquidos contaminados con el parásito que favorecen la 
sobrevivencia del mismo; 5) infección por accidentes en laboratorios de investigación o 
clínicos, donde se maneja a T. cruzi en estadios con potencial infectivo para humanos, es 
decir, tripomastigotes sanguíneos, amastigotes o tripomastigotes metacíclicos 
(Hontebeyrie, et al., 2010; Rassi, et al., 2012). 
 
 
1.2 Manifestaciones clínicas de la Enfermedad de Chagas 
 
La Enfermedad de Chagas se desarrolla en dos etapas: fase aguda y fase crónica, ésta 
última se divide en fase asintomática o indeterminada y fase sintomática (OMS, 2002). 
 
La fase aguda se caracteriza por la presencia de T. cruzi en sangre periférica, por lo que se 
diagnostica mediante exámenes microscópicos de frotis sanguíneo teñidos con Giemsa o 
detección de anticuerpos IgM específicos contra T. cruzi (Machado, et al., 2012). En dicha 
fase el 95 % de los individuos son asintomáticos, el resto pueden presentar los siguientes 
signos, inflamación temporal en la zona de la picadura del triatomino produciendo un 
chagoma (inflamación en la piel) o signo de Romaña (edema bipalpebral unilateral), fiebre, 
inflamación de los ganglios linfáticos (lifadenopatía), inflamación del hígado 
(hepatomegalia) e inflamación del bazo (esplenomegalia), además, síntomas como dolor 
en articulaciones (artralgia), dolor de cabeza, dolor muscular (mialgia) , anorexia y vómito 
(Machado, et al., 2012; OMS, 2002). En casos graves se produce meningoencefalitis o 
insuficiencia cardiaca en niñose individuos inmunosuprimidos (Develoux, et al., 2008; OMS, 
2002). 
 
La fase crónica asintomática (indeterminada) se desarrolla después de la fase aguda y se 
caracteriza por la ausencia de signos y síntomas. El diagnóstico se basa en la detección de 
anticuerpos IgG específicos contra T. cruzi. En esta etapa permanecen aproximadamente 
dos tercios (60-90%) de los individuos infectados con T. cruzi (Machado, et al., 2012; OMS, 
2002). 
 
La fase crónica sintomática comienza aproximadamente entre 10 y 30 años después de la 
infección inicial (Rassi, et al. 2012), donde se pueden desarrollar tres tipos de afecciones: 
1) cardiopatías chagasicas crónicas (CCC), desarrollada en el 90 a 94.5% de individuos en 
fase crónica con manifestaciones clínicas como insuficiencia cardiaca, arritmia cardiaca, 
agrandamiento del corazón y muerte súbita (Machado, et al., 2012; OMS, 2002), 2) aumento 
del tamaño del esófago (megaesófago) o colon (megacolon) que producen alteraciones en 
la motilidad esofágica o en el colon (OMS, 2002), y 3) sistema nervioso central, (10% de 
individuos en fase crónica) se produce una pérdida de la enervación autónoma, 
https://translate.googleusercontent.com/translate_f#51
 
 
3 
disminución de reflejos y sensibilidad principalmente en los miembros inferiores, así como 
meningoencefalitis (Machado, et al., 2012; OMS, 2002). 
 
1.3 Distribución y epidemiologia de la Enfermedad de Chagas. 
 
Se estima que en el mundo hay entre 7 y 8 millones de personas infectadas con T. cruzi, 
dándose la mayoría de los casos en América Latina, zona endémica de la enfermedad, 
además es considerada la infección parasitaría más importante de esta zona y una de las 
enfermedades tropicales desatendidas (ETD) (WHO, 2013; Zingales, et al., 2012). La 
distribución de la Enfermedad de Chagas sigue la misma distribución que los triatominos 
vectores de T. cruzi, desde el sur de Estados Unidos hasta Sudamérica (Figura 2), teniendo 
una distribución endémica en 21 países de América Latina (Argentina, Belice, Venezuela, 
Brasil, Chile, Colombia, Costa Rica, Ecuador, El Salvador, Guyana Francesa, Guatemala, 
Guyana, Honduras, México, Nicaragua, Panamá, Paraguay, Perú, Bolivia, Surinam y 
Uruguay) (Rassi, et al., 2012; WHO, 2013). 
 
Los reportes de la Enfermedad de Chagas en regiones no endémicas como Canadá, 
Estados Unidos, Pacifico occidental (Australia y Japón) y Europa (Bélgica, Francia Italia 
España, Suiza, Inglaterra, Alemania, Austria, Croacia, Dinamarca, Luxemburgo, Países 
Bajos, Noruega, Portugal, Rumania y Suecia) (Figura 2) son producto principalmente de 
migración humana, sin embargo, también son causados por transfusión sanguínea, 
trasplante de órganos y trasmisión congénita (Rassi, et al., 2012; WHO, 2010). 
 
1.4 Datos epidemiológicos en México 
 
En México el Centro Nacional de Transfusión Sanguínea (CNTS) se encarga de la vigilancia 
y cumplimiento de la Norma Oficial Mexicana para la disposición de sangre humana y sus 
Figura 2. Distribución geográfica de la Enfermedad de Chagas. De acuerdo a la 
estimación del número de casos reportados de la Enfermedad de Chagas, en las zonas 
no endémicas se observa un menor número de personas infectadas con T. cruzi (círculos 
1), mientras que los países que forman parte de la distribución endémica de T. cruzi y su 
vector (América, excepto Canadá) muestran un mayor número de personas infectadas 
con T. cruzi (círculos 2, 3 y 4) (WHO, 2013). 
1) <800 
2) 900 a 89 999 
3) 90 000 a 89 999 
4) ≥ 900 000 
 
 
4 
componentes con fines terapéuticos (NOM-253-SSA1-2012), que establece entre otras 
cosas la implementación del tamizaje para T. cruzi en dichas muestras. Sin embargo, hasta 
2012 sólo se realizaba dicho ensayo en el 95% de las instalaciones receptoras de 
donaciones de sangre, lo cual representa el tamizaje del 90.6% de las muestras de sangre 
(Secretaría de Salud, 2015; Secretaría de Salud y Sistema Nacional de Salud, 2014). 
Además, la Norma Oficial Mexicana para la vigilancia epidemiológica, prevención y control 
de enfermedades transmitidas por vector (NOM-032-SSA2-2010) decreta la formación de 
la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP) para la realización de pruebas 
confirmatorias de casos reactivos a T. cruzi. Dicha red está integrada por 31 laboratorios 
dirigidos por la Secretaría de Salud y el INDRE (Instituto de Diagnóstico y Referencia 
Epidemiológica) (INDRE-DGE-Secretaria de Salud, 2015; Secretaria de Salud, 2015). 
 
Dichas normas oficiales mexicanas para la detección de la Enfermedad de Chagas han 
permitido diagnosticar clínica y serológicamente 5 463 casos de 2000 a 2012, de los cuales 
4.5% (247) fueron agudos, 3.1% (171) crónicos sintomáticos y 92.3% (5 045) crónicos sin 
síntomas aparentes (indeterminados). Reportándose un incremento en la incidencia por 
cada 100 000 habitantes de 0.7, siendo el grupo de 25 a 44 años quienes registraron el 
45.5% del total de casos reportados. Los estados con mayor número de reportes son: 
Morelos (53.4%), Veracruz (17.4%), Jalisco (6%) e Hidalgo (4%). La mayor prevalencia de 
individuos con afectaciones (fase crónica) como cardiopatía chagásica crónica (CCC) se 
han reportado en Veracruz (36%), Morelos (18.9%) y Guerrero (18.7%) (Secretaría de 
Salud, 2014). En el mismo periodo se reportó una incidencia en defunciones de 0.03 por 
cada 100 mil habitantes (371 defunciones), siendo los estados con mayor número de casos 
Oaxaca (43.3%), Guerrero (14.3%), Distrito Federal (4.3%) Chiapas (3.2%) y Veracruz con 
(3.2%) (Secretaría de Salud y Sistema Nacional de Salud, 2014). 
 
La Enfermedad de Chagas es reconocida actualmente por la Secretaría de Salud como un 
padecimiento sub registrado distribuido en todo el territorio nacional (Secretaría de Salud y 
Sistema Nacional de Salud, 2014). La OPS-OMS (2006) estima 1 100 000 personas 
infectadas con T. cruzi, 7 700 nuevos casos anuales por transmisión vectorial, 1 100 casos 
anuales por transmisión congénita y existen 99 143 personas con cardiopatía chagásica 
crónica (CCC), además se estima una prevalencia en bancos de sangre de 0.60%. Aunque 
otras estimaciones calculan 1.6 millones de personas infectadas (Guzmán-Bracho, 2001), 
e incluso 5.5 millones de personas infectadas (Carabarin-Lima, et al., 2013). 
 
 
1.5 Biología del parásito T. cruzi 
 
1..5.1 Morfología de T. cruzi 
 
T. cruzi presenta tres fases o estadios básicos durante su ciclo de vida: tripomastigote, 
epimastigote y amastigote. Definidos por tres criterios: (1) forma general de la célula, (2) 
posición del cinetoplasto en relación con el núcleo, (3) región de la que emerge la bolsa 
flagelar (De Lana y De Menezes, 2010). 
 
 
5 
 
Los amastigotes (Figura 3A y 3B) son formas esféricas de aproximadamente 2 a 4 µm de 
diámetro y un flagelo corto, el cual es visible únicamente por microscopia electrónica, por 
lo que es inmóvil, se encuentran dentro de las células del vertebrado (intracelulares), donde 
se replican por fisión binaria (Apt, et al., 2013; De Lana y De Menezes, 2010). 
 
Los epimastigotes (Figura 3C y 3D) son una fase replicativa por fisión binaria longitudinal 
de forma fusiforme, con un núcleo ubicado en el centro, un flagelo libre que surge de una 
(A) (B) 
(C) (D) 
Figura 3. Morfología de T. cruzi: amastigote, epimastigote y tripomastigote. A) Tinción 
Giemsa de amastigotes señalados en la imagen con una flecha, B) Esquema en 3D de 
las principales estructuras celulares de la fase amastigote, C) Tinción Giemsa de 
epimastigotes, D) Esquema en 3D de las principales estructuras celulares de la fase 
epimastigote, E) Tinción Giemsa de tripomastigotes sanguíneos, F) Esquema en 3D de 
las principales estructuras celulares de la fase tripomastigote (Modificado de De Lana y 
De Menezes, 2010; Teixeira, et al., 2012). 
(E
) 
(F) 
 
 
6 
bolsa flagelar anterior al núcleo, además de una membrana ondulante asociada al flagelo y 
un cinetoplasto entre la bolsa flagelar y el núcleo (De Lana y De Menezes, 2010; Martins,et al., 2012). Tiene una dimensión aproximada de 20-40 µm de largo por 2 µm de ancho y 
se encuentra en el intestino de triatominos (Apt, et al., 2013; De Lana y De Menezes, 2010). 
 
Los tripomastigotes (Figura 3E y 3F) son una fase no replicativa de aproximadamente 20 a 
25 µm de longitud por 2 µm de ancho (forma fusiforme), con un núcleo ubicado en el centro, 
un cinetoplasto posterior al núcleo y una bolsa flagelar libre entre el cinetoplasto y el núcleo, 
es decir un cinetoplasto apical (Apt, et al.,2013; De Lana y De Menezes, 2010), además de 
una membrana ondulante asociada al flagelo (Martins, et al., 2012). Este estadio se clasifica 
en tripomastigotes metacíclicos y tripomastigotes sanguíneos, los cuales se encuentran en 
el intestino posterior de los triatominos y en el torrente sanguíneo, respectivamente (Apt, et 
al., 2013; De Lana y De Menezes, 2010). 
 
 
1.5.2 Ciclo de vida de T. cruzi 
 
T. cruzi tiene un ciclo de vida en el cual interviene un vector triatomino hematófago y un 
hospedero vertebrado (Figura 4). El vector se infecta al alimentarse de sangre con 
tripomastigotes sanguíneos, los cuales, en el intestino anterior (estómago) del vector se 
diferencian en epimastigotes. Estos migran al intestino medio, donde se adhieren a la 
membrana perimicrovellosa secretada por las células epiteliales intestinales y se multiplican 
por fisión binaria longitudinal (De Lana y De Menezes, 2010). Una porción de epimastigotes 
migran al recto, donde se adhieren a la cutícula rectal y se transforman en tripomastigotes 
metacíclicos por un proceso llamado metaciclogénesis (García, et al., 2007). 
 
Los tripomastigotes metacíclicos del recto son excretados durante la alimentación del 
vector. Dicha fase es infectiva para el hospedero vertebrado, al ingresan a torrente 
sanguíneo como consecuencia de laceraciones en la piel provocadas por el vertebrado a 
causa del prurito por la picadura, que propicia la entrada del parásito o el arrastre del mismo 
a mucosas (WHO, 2010). Una vez dentro del hospedero pueden invadir una gran variedad 
de células como fibroblastos, macrófagos, células epiteliales y células musculares, 
mediante diferentes procesos que desencadenan fagocitosis y endocitosis inducida por el 
parásito, dándose la invasión celular (De Souza, et al. 2010). Cuando el parásito invade 
una célula se forma una vacuola parasitófora (VP), dentro de ésta el tripomastigote 
comienza a redondearse gradualmente, diferenciándose en amastigote. El amastigote 
secreta enzimas que rompen la vacuola parasitófora, liberando amastigotes y 
tripomastigotes sanguíneos al citosol de la célula huésped, ambos con potencial para 
infectar otras células. Además, los tripomastigotes sanguíneos pueden volver a circular por 
el torrente sanguíneo e invadir otros tejidos (De Souza, et al. 2010). 
 
 
 
 
7 
 
 
1.5.3 Genética de T. cruzi 
 
T. cruzi presenta un alto grado de variación o polimorfismo genético, reportado tanto en el 
DNA del núcleo como en el kDNA (DNA del cinetoplasto) y reportado por primera vez por 
Dvorak, et al., (1982). Dicha diversidad ha sido comprobada con los siguientes métodos: 
electroforesis de enzimas multilocus (MLEE), en el que se observaron patrones variables 
(zimodemos) que dividieron a T. cruzi en tres grupos, denominados Z1, Z2 y Z3; la técnica 
de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción de kDNA (RFLP) comprobó la 
variación del mini círculo de kDNA, según la cual se propusieron cuatro grupos nombrados 
esquizodemas A, B, C y D (Morel, et al., 1980); la técnica RAPD (DNA polimórfico 
amplificado al azar) (Tibayrenc, et al., 1993); el polimorfismo del gen de mini-exón (región 
Figura 4. Ciclo de vida de T. cruzi. El vector se alimenta e ingiere tripomastigotes 
sanguíneos (1), los cuales se diferencian a epimastigotes (2), fase que se multiplica (3) 
y posteriormente se transforma en tripomastigote metacíclico (4), esta fase es 
excretada e ingresan en torrente sanguíneo por laceraciones en piel o contacto con 
mucosas de hospederos vertebrados (5). Los tripomastigotes metacíclicos penetran a 
las células del vertebrado (6), una vez dentro forman la vacuola parasitófora (7) donde 
se diferencian a amastigotes (8). Los amastigotes se multiplican dentro de la célula (9) 
y se diferencian a tripomastigotes sanguíneos (10), esto produce la lisis de la célula, 
liberándose amastigotes (15) y tripomastigotes sanguíneos (12). Los amastigotes 
liberados (15) pueden ingresar a otra célula (16), mientras que los tripomastigotes 
sanguíneos (12) van a torrente sanguíneo (13) o penetran otra célula (14) (Modificado 
de García, et al., 2007 y Teixeira, et al., 2012). 
Invasión celular 
12
0 
16 
15 
13
0 
1 
11
0 
10
0 
9 
8 
7 
6 
5 
4 
3 
2 
sanguíneos 
14
0 
 
 
8 
intergenica de spliced-leader o SL-IR) clasificó a T. cruzi en dos linajes, denominados linaje 
1 y linaje 2 (Souto, et al., 1996). 
 
El uso conjunto de los métodos MLEE y RAPD dividieron al linaje 2 según el mini exón de 
T. cruzi en cinco grupos llamados TcII a, TcII b, TcII c y TcII d, mientras, el linaje 1 fue 
renombrado como TcI (Brisses, et al., 2000). Dicha clasificación fue confirmada utilizando 
los genes 24Sα rRNA en su dominio divergente D7 y 18S rRNA (Brisse, et al., 2001). 
Actualmente los seis linajes son conocidos como Unidades Discretas de Tipificación 
(DTU´s) y la nomenclatura cambio a TCI, TCII, TCIII, TCIV, TCV y TCVI (Tabla 1) (Zingales, 
et al., 2009). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El termino DTU se ha empleado en organismos subdividos por marcadores moleculares, 
genéticos, bioquímicos o inmunológicos, y con una historia evolutiva con eventos de 
hibridación (Tibayrenc, et al., 2010; Zingales, et al., 2012). 
 
La historia evolutiva de T. cruzi se explica a partir de una población clonal, con una cierta 
cantidad de recombinación genética (Tibayrenc, et al., 2010; Zingales, et al., 2012). Dicho 
origen híbrido es explicado por dos modelos evolutivos: 
 
1) Modelo evolutivo con dos eventos de hibridación mayores (Figura 5A), propuesto por 
Westenberger, et al. (2005). Este modelo comprende eventos de hibridación en 
diferentes periodos evolutivos, partiendo de dos linajes ancestrales (TCI y TCII) con 
evolución clonal, descendientes de un ancestro común (DTU universal). TCI y TCII se 
fusionan y forman un híbrido (híbrido I/II). El híbrido pierde su heterocigosis y por 
evolución clonal independiente derivó en dos híbridos homocigotos (TCIV y TCIII). El 
segundo evento de hibridación se dio entre un linaje híbrido (TCIII) y un linaje parental 
original (TCII), por lo que produjo dos híbridos heterocigoto, TCV y TCVI 
(Westenberger, et al., 2005; Zingales, et al., 2012). 
 
2) Modelo evolutivo con tres linajes ancestrales (Figura 5B), propuesto por De Freitas, et 
al., 2006. Dicho modelo define a tres linajes como ancestrales (TCI, TCII y TCIII), entre 
los cuales hubo dos eventos de hibridación entre TCII y TCIII, que formaron dos 
DTU´s Linajes por MLEE/RAPD Linajes por mini exón Zimodemo 
TCI TcI Linaje 2 Z1 
TCII TcII b Linaje 1 Z2 
TCIII TcII c Linaje 1 Z3/Z1 (Z3-A) 
TCIV TcII a Linaje 1 Z3 (Z3B) 
TCV TcII d Linaje 1 Z2 
TCVI TcII e Linaje 1 Z2 (ZB) 
Tabla 1: Clasificaciones genéticas de T. cruzi. 
La clasificación actual de T. cruzi lo clasifica en seis DTU´s, nombrados TCI a TCVI, sin 
embargo, se han propuesto tres clasificaciones diferentes empleando los marcadores 
MLEE/RAPD, mini exón y zimodemo (Modificado de Brisse, et al., 2001) 
 
 
9 
híbridos (hibrido I/II) con progenie evolutivamente viable que finalmente derivó en TCV 
y TCVI (De Freitas, et al., 2006). 
 
 
Actualmente aún hay debate sobre los mecanismos por lo que T. cruzi ha lleva a cabo los 
eventos de hibridación, así como el origen hibrido de los DTU´s TCIII y TCIV. Por esta razón 
el modelo propuesto por Westenberger y colaboradores es el más aceptado, según el cual 
TCI a TCII son los grupos más distantes genéticamente y los DTU´s TCV y TCVI son 
producto de la hibridaciónde TCII y TCIII (Muñoz, et al., 2013; Zingales, et al., 2012) 
 
 
1.6 Biología de los triatominos (Hemiptera: Reduviidae) 
 
Los vectores trasmisores de la Enfermedad de Chagas pertenecen al orden Hemiptera, 
familia Reduviidae, subfamilia Triatominae, esta última dividida en cinco tribus y 15 géneros 
(Noireau y Dujardin, 2010). Dentro de la subfamilia Triatominae (Reduviidae) actualmente 
se reconocen 140 especies, habitando en su mayoría (125 especies y 15 géneros) 
exclusivamente en América (latitud 42°N y 46°S) desde Estados Unidos hasta Argentina 
(Gorla y Noireau, et al., 2010; Schofield y Galvão, 2009). Sin embargo, los generos 
Rhodnius (16 especies), Pastrongylus (13 especies) y Triatoma (80 especies) suman el 
88% de las especies presentes en América (Gorla y Noireau, et al., 2010; Schofield y 
Galvão, 2009). El género Rhodnius se distribuye desde Centro América hasta el norte de 
Argentina, el género Pastrongylus se encuentra desde México hasta Argentina y el género 
Triatoma se encuentra desde Norte América hasta Argentina (Gorla y Noireau, et al., 2010). 
 
No todas las especies son vectores eficaces para la transmisión de T. cruzi hacia los 
humanos. Los vectores eficaces de T. cruzi cumplen las siguientes características: 1) 
Figura 5. Modelos evolutivos sobre el origen de los linajes de T. cruzi. A) Modelo evolutivo 
con dos eventos de hibridación mayores, propuesto por Westenberger et al. (2005) B) 
Modelo evolutivo con tres linajes ancestrales, propuesto por De Freitas, et al. 2006 (Figura 
tomada de Zingales, et al., 2012). 
B. Modelo de De Freitas A. Modelo de Westenberger 
 
 
 TCI 
 
 TCI 
TCI TCVI TCIII 
 TCIV TCIII
Hibrido I/II 
Hibrido II/III 
 TCV TCVI TCII 
 TCII 
 TCII 
 TCII TCI 
 TCII TCI 
Hibrido 
II/III 
 TCIII TCIV 
Hibrido 
II/III 
 TCV TCVI 
 TCIII 
Ancestral TC 
Ancestral TC 
 
 
10 
adaptación a viviendas (hábitat doméstico), 2) alto grado de antropofilia, 3) periodo corto 
entre alimentación y eyección de heces, 4) amplia distribución geográfica (Lent y 
Wygodzinsky, 1979). De acuerdo a los criterios anteriores, tres especies son 
epidemiológicamente importantes en el continente: T. dimidiata, T. infestans y R. prolixus 
(Lent y Wygodzinsky, 1979). 
 
Los triatominos son insectos hematófagos de tamaño variable, entre 5 mm (Alberprosenia 
goyovargasi) a 44 mm (Dipetalogaster maximus) de largo, generalmente de color negro o 
marrón oscuro, con detalles en amarillo claro, rojo, naranja o verde claro (Lent y 
Wygodzinsky, 1979). Su cuerpo se divide en tres secciones: cabeza, tórax y abdomen 
(Figura 6). 
 
 
La cabeza es de forma cilíndrica, tres veces más larga que ancha, con un rostrum 
(proboscis), órgano ubicado en la parte ventral de la cabeza (Figura 6) (Cáceres, 2005; Lent 
y Wygodzinsky, 1979). La forma del rostrum diferencia a los triatominos de otros insectos 
redúvidos y está relacionada con las tres formas de alimentación de los redúvidos: (1) los 
reduvios hematófagos tienen una proboscis recta, alargada, delgada y perpendicular a la 
cabeza (Figura 7A), formada por tres segmentos desiguales; (2) los reduvios predadores 
tienen una proboscis curva y alargada dividida en tres segmentos (Figura 7B); (3) la 
proboscis de reduvios fitófagos es larga y dividida en cuatro segmentos (Figura 7C) 
(Calderón, 2008; Lent y Wygodzinsky, 1979). Los triatominos vectores de T. cruzi tienen 
una cabeza característica de redúvidos hematófagos (Figura 7A). 
Figura 6. Morfología general de triatomino, en vista dorsal. El cuerpo de los 
triatominos se divide en tres secciones: cabeza (dos tuberculos anteniferos, dos 
antenas, dos ojos y dos ocelos), tórax (pronoto, escutelo y tres pares de patas) y 
abdomen (dos pares de alas y conexivo) (Lent y Wygodzinsky, 1979). 
 
 
11 
 
El tórax se divide en protórax, mesotórax y metatórax. El protórax está formado por el 
pronoto, el mesotórax es el escutelo y en el metatórax se insertan los dos pares de alas 
(anteriores y posteriores), además de los tres pares de patas (Cáceres, 2005; Lent y 
Wygodzinsky, 1979). 
 
El abdomen es ovalado, con una banda lateral denominado conexivo que permite la 
expansión del abdomen durante la alimentación, e internamente se divide en 11 segmentos 
dorsales (urotergito) y ventrales (uroesternito) (Figura 8) (Cáceres, 2005; Lent y 
Wygodzinsky, 1979). El octavo y séptimo uroestergito son distintivos para hembras y 
machos, el octavo no es visible en machos mientras en hembras es pequeño, el séptimo 
urotergito en machos es redondeado y está comunicado con el noveno segmento. Los 
segmentos VIII A IX forman los genitales externos, mientras que los segmentos X a XI el 
ano (Lent y Wygodzinsky, 1979). 
 
El ciclo de vida de un triatomino está integrado por un huevo, cinco estadios ninfales y un 
adulto. Los cinco estadios ninfales se alimentan de sangre, siendo capaces de infectarse y 
trasmitir a T. cruzi. El primer estadio ninfal se caracteriza por el color rosado abdominal, el 
segundo estadio ninfal es similar al primer estadio, difiriendo de este por su mayor tamaño. 
El tercer estadio presenta protuberancias dorsales que formarán las alas, siendo más 
notorias estas estructuras en el cuarto estadio. El quinto estadio presenta desarrollo parcial 
de las alas (Lent y Wygodzinsky, 1979). En general, las ninfas tienen un desarrollo parcial 
Figura 7. Variaciones del rostrum (proboscis) y su relación con el tipo de alimentación en 
insectos de la familia Reduviidae, desde una vista lateral. A) Redúvido con alimentación 
hematófaga, B) redúvido con hábitos predadores y C) redúvido con alimentación fitófaga 
(Calderón, 2008). 
Figura 8. Abdomen de triatomino. A) Vista dorsal del abdomen. B) Vista ventral del 
abdomen de hembra. C) Vista ventral del abdomen de macho (Modificado de Lent y 
Wygodzinsky, 1979). 
 B 
UROTERGITO UROESTERNITO 
 CONEXIVO CONEXIVO 
A C 
 
 
12 
de las alas (excepto primer y segundo estadios 
ninfales), menor tamaño, ausencia de ocelos y 
genitales parcialmente desarrollados 
(Cáceres, 2005; Lent y Wygodzinsky, 1979; 
Noireau y Dujardin, 2010). Entre los adultos 
existe dimorfismo sexual, el tamaño de las 
hembras generalmente es más grande, 
además, el abdomen de las hembras termina 
en forma puntiaguda (octavo uroestergito 
visible) y en machos es redonda (octavo 
uroestergito invisible, además el séptimo 
uroternito se conecta con el octavo y noveno 
uroternito) (Lent y Wygodzinsky, 1979). La 
duración del ciclo de vida depende de la 
especie, temperatura, humedad y 
disponibilidad de fuentes de alimento (Dorn, et 
al., 2007), sin embargo, en promedio el 
desarrollo se completa en aproximadamente 5 
a 6 meses a una temperatura de 20 a 30 °C 
(Noireau y Dujardin, 2010). 
 
El hábitat de los triatominos se clasifica en tres: 1) silvestre (>10 m alrededor del domicilio), 
las cuales viven en madrigueras o nidos de animales silvestres como mamíferos, aves, 
anfibios y reptiles, 2) doméstico, especialmente en viviendas rurales en condiciones 
precarias, donde habitan en lugares oscuro como grietas en la pared, 3) peridomésticas, 
habitan alrededor del domicilio sin colonizar el mismo (10 m alrededor), viven en pilas de 
madera alimentándose de animales domésticos y ocasionalmente del humano (Dirección 
General de Salud Ambiental, Ministerio de Salud, 2002; Lent y Wygodzinsky, 1979). Dicha 
clasificación es importante para la determinación de los indicen entomológicos, para la 
vigilancia de presencia de triatominos, grado de infestación en domicilio y porcentaje de 
infección con T. cruzi, estudiado sobre todo en triatominos domiciliados y peridomiciliados 
(Dirección General de Salud Ambiental, Ministerio de Salud, 2002). 
 
 
1.6.1 Especies de vectores en México 
 
México es el segundo país con mayor número de especies de triatominos en América, con 
31 especies de triatominos (Figura 10), pertenecientes a seis géneros: Triatoma, Eratyrus, 
Belmimus, Paratriatoma, Dipetalogaster y Pastrongilus.Las especies reportadas en nuestro 
país son: Triatoma incrassata, Triatoma indictvia, Triatoma lecticularia, Triatoma barberi, 
Triatoma neotomae, Triatoma nítida, Triatoma peninsularis, Triatoma protracta, Triatoma 
sinaloensis, Triatoma rubida, Triatoma bassolsae, Triatoma brailovskyi, Triatoma bolivari, 
Triatoma gerstaeckeri, Triatoma longipennis, Triatoma mazzotti, Triatoma mexicana, 
Triatoma pallidipennis, Triatoma phyllosoma, Triatoma picturata, Triatoma recurva, 
Figura 9. Ciclo de vida de triatomino 
(Calderón G., 2008). 
 
 
13 
Triatoma dimidiata, Triatoma hegneri, Triatoma infestans, Belminus costaricensis, 
Dipetalogaster maximus, Eratyrus cuspidatus, Pastrongylus rufotuberculatus, Pastrongylus 
geniculatus, Paratriatoma hirsuta y Triatoma gomeznunezi (Ramsey, et al., 2015; Sandoval-
Ruiz, et al., 2012; Velazco-Castrejón y Guzmán-Bracho, 1986). 
 
Las 31 especies de triatominos se encuentran distribuidas en el 91.2% del territorio 
nacional, por lo que potencialmente tienen contacto con el 88.9% de la población, lo cual 
equivale a 99 911 867 habitantes, dato similar en áreas urbanas (88.1 %) y rurales (89.4%) 
(Ramsey, et al., 2015; Sandoval-Ruiz, et al., 2012). 
 
Figura 10. Distribución geográfica de las 31 especies de triatominos presentes en México 
(Revisión del Laboratorio de Tripanosomiasis Americana a cargo de la Dra. Bertha 
Josefina Espinosa Gutiérrez). 
 
 
14 
1.6.2 Identificación de T. cruzi en vectores 
 
La identificación de T. cruzi en triatominos se realiza por tres métodos: 1) análisis de heces 
del vector al microscopio óptico (examen coproparasitológico), 2) detección de trazas de 
DNA de T. cruzi por ensayos de PCR (Reacción en Cadena de la Polimesa) en muestras 
de tejido o heces de triatominos; y 3) ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) en muestras de 
heces de triatominos (Dirección General de Salud Ambiental, Ministerio de Salud, 2002; 
Molina-Garza, et al., 2007). 
 
Las muestras de heces de vectores son obtenidas por tres métodos: 1) presionando el 
abdomen, con una pinza o estilete, sobre una gota de solución salina en un portaobjetos; 
2) lavado de la ampolla rectal, cuando los ejemplares están muertos o son ninfas; 3) 
alimentación del triatomino con sangre y colocarlo sobre una caja petri hasta obtener una 
muestra de heces (Dirección General de Salud Ambiental, Ministerio de Salud, 2002; 
García-Jordán, et al., 2015; INDRE-DGE-Secretaría de Salud, 2015). En México la 
observación de heces al microscopio es el 
método más ampliamente usado en los 
estudios epidemiológicos realizados en 
triatominos (INDRE-DGE-Secretaría de 
Salud, 2015). La obtención de muestras de 
heces no se puede realizar en ejemplares 
fijados en alcohol, ya que se necesita 
mantener vivos y alimentados a los 
triatominos (INDRE-DGE-Secretaría de 
Salud, 2015). 
 
La detección de T. cruzi por PCR se basa en 
la utilización de cebadores específicos para 
las cuatro secuencias conservadas de 120 pb 
ubicadas en el mini círculo del kinetoplasto 
(Figura 11), secuencias descubiertas por 
Degrave, et al. (1988). Dichas secuencias son 
empleadas para la amplificación de la región 
variable del mini círculo, método que tiene 
mayor sensibilidad y especificidad que la detección por microscopia óptica, ya que permite 
diferenciar a especies morfológicamente parecidas como T. rangeli. Además, la detección 
por PCR no necesita mantener vivo al triatomino, ya que se pueden utilizar heces o tejido 
del vector para la obtención de DNA (Dorn, et al., 1999). 
 
 
1.6.3 Prevalencia de T. cruzi en vectores de México 
 
En México el estudio de la prevalencia en triatominos se concentra en vectores de ciclo de 
vida doméstico y peridomésticos, los cuales tienen contacto con humanos y animales 
Figura 11. Estructura del mini círculo del 
kinetoplaso de T. cruzi y localización de los 
cebadores usados en el PCR (Modificado 
de Campos, et al., 1999). 
 
 
15 
domésticos. Sin embargo, debido a que dichos insectos tienen dispersión activa 
(desplazamiento del insecto) y pasiva (a través de un huésped vertebrado) los vectores 
clasificados como silvestres pueden colonizar ambientes domésticos. Por otro lado, solo 5 
de las 31 especies de triatominos reportadas en nuestro país son consideras de alta 
importancia epidemiológica de acuerdo a su abundancia regional, índices de infección y 
contacto con el humano (hábitos doméstico o peridomésticos). Los triatominos de mayor 
importancia epidemiológica son: T. longipennis (costa oeste), T. gerstaeckeri (región 
noroeste), T. dimidiata (región sureste), T. barberi (región suroeste) y T. pallidipennis 
(región centro) (Martínez-Ibarra, et al., 2001; Velasco-Castrejón y Rivas-Sánchez, 2008). 
En dichas especies se reportan variaciones en la prevalencia de T. cruzi entre los siguientes 
rangos: T. longipennis entre 20.6 a 67.5% (Gómez-Hernández, et al., 2008; López-
Cárdenas, et al., 2005; Martínez-Ibarra, et al., 2001; Martínez-Ibarra, et al., 2011; Martinez-
Ibarra, et al., 2012) , T. gerstaeckeri entre 28 a 59.61% (Martínez-Ibarra et al. 1992; Molina-
Garza, et al., 2007), T. dimidiata entre 3.7 a 76.5% (Koyoc-Cardeña, et al., 2015; López-
Cancino, et al., 2015; Martínez-Ibarra, et al., 2011; Monteon, et al., 2013; Pineda-Rodríguez, 
et al., 2015; Ramos-Ligonio, et al., 2012; Rebollar-Téllez, et al., 2009; Reyes-Nocelo, et al., 
2013; Salazar, et al., 2005; Salazar, et al., 2007; Torres-Montero, et al., 2012), T. barberi 
entre 19 a 83.3% (Gómez-Hernández, et al., 2008; López-Cárdenas, et al., 2005; Martínez-
Ibarra, et al., 2011) y T. pallidipennis entre 7.7 a 97.4 % (López-Cárdenas, et al., 2005; 
Martínez-Ibarra, et al., 2011; Medina-Torres, et al., 2010; Ramsey, et al., 2005). De los 
reportes de la prevalencia de T. cruzi en triatominos antes mencionados, únicamente dos 
pertenecen a vectores silvestres de las especies T. gerstaeckeri y T. dimidiata, el resto es 
de triatominos de hábitos peridomésticos y domésticos. Las grandes variaciones en los 
porcentajes de prevalencia en las especies T. dimidiata y T. pallidipennis, especialmente 
los valores mínimos se deben probablemente al bajo número de ejemplares examinados 3 
y 13, respectivamente. 
 
Otro factor importante para considerar la relevancia de una especie de triatomino como 
vector de T. cruzi, es el tiempo que trascurre entre el inicio de la alimentación y la 
defecación, ya que de este tiempo depende la posibilidad de transmisión de este parasito 
desde el vector al huésped vertebrado. Dicho periodo de tiempo varía según la especie e 
incluso según el estadio ninfal, específicamente T. barberi es el vector con el tiempo más 
corto entre la alimentación y defecación con 10 minutos, mientras que dicho tiempo se 
estima en 10 a 15 min y 20 a 30 min para T. pallidipennis y T. dimidiata respectivamente, 
sin embargo, las ninfas de quinto estadio de T. dimidiata se ha observado un tiempo mínimo 
de 4.16 min (De Fuentes-Vicente, et al., 2016; Salazar-Schettino, de Haro-Arteaga y 
Cabrera-Bravo, 2005). Además según el potencial de colonización, el cual es medido con 
el índice de colonización o IC (número de ninfas recolectadas por cada domicilio con 
presencia de triatomino), el índice de dispersión o IDD (número de localidades con 
triatominos entre el número de localidades examinadas) y el índice de infestación (número 
de domicilios con triatominos entre el número de domicilios muestreados), dichos índices 
está relacionado con el contacto vector-humano y por tanto con el riesgo de transmisión de 
T. cruzi por vía vectorial (De Fuentes-Vicente, et al., 2016; Martínez-Ibarra, Galaviz-Silva y 
González-Rodríguez, 1992). De acuerdo a los criterios anteriores se les define como 
 
 
16 
triatominos de ciclo doméstico o peridomésticos, T. longipennis y T. barberi son 
predominantemente doméstica, mientras a T. gerstaeckeri y T. dimidiata son consideradas 
predominantemente peridomésticas en proceso de domiciliación, finalmente T. pallidipennis 
es una mezcla de doméstica y peridomésticas(Martinez-Ibarra, et al., 2012; Martinez-
Ibarra, Galaviz-Silva y González-Rodríguez, 1992; Martínez-Tovar, et al., 2013; Salazar, de 
Haro-Arteaga y Cabrera-bravo, 2005) 
 
Particularmente el estado de Veracruz es el 
segundo estado con mayor número de casos de 
la Enfermedad de Chagas, además es el estado 
con mayor prevalencia de individuos con 
afectaciones (fase crónica) como cardiopatía 
chagasica crónica (CCC) (Secretarial de Salud, 
2014) y uno de los cinco estados con mayor 
número de defunciones asociadas a la 
Enfermedad de Chagas, por lo que en este 
trabajo se estudió la prevalencia de T. cruzi en 
los vectores de la región. En dicho estado se ha 
reportado 10 especies de triatominos: Belminus 
costaricensis, Eratyrus cuspidatus, Triatoma 
pallidipennis, Pastrongylus geniculatus, 
Pastrongilus rufotuberculatus, Triatoma barberi, 
Triatoma dimidiata, Triatoma gerstaeckeri, 
Triatoma infestans y Triatoma rubida (Sandoval-
Ruiz C. A., et al., 2012). Siendo T. dimidiata el 
triatomino más abundante y ampliamente 
distribuido en esta región (Figura 12) (Sandoval-
Ruiz C. A., et al., 2012), razón por la cual es la 
única especie de la que existen estudios de 
prevalencia de T. cruzi en la región, dicha cifra 
oscila entre 8 a 13.7% (Ramos-Ligonio, et al., 
2012; Salazar, et al., 2005; Salazar, et al., 2007; 
Torres-Montero, et al., 2012). En este estado se 
reportó por primera vez la presencia de un DTU 
diferente a TCI (TCII, TCIII, TCIV y TCV) en 
vectores de nuestro país, lo cual estableció al 
estado de Veracruz como un estado 
epidemiológicamente importante (Ramos-
Ligonio, et al., 2012). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 12: Distribución de T. dimidiata en el 
estado de Veracruz (Sandoval-Ruiz., et al., 
2012). 
 
 
 
 
17 
 
 
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 
 
En México se conoce parcialmente la distribución y abundancia de triatominos, ya que no 
hay iniciativas para el monitoreo de la presencia de éstos y tampoco existen datos de 
prevalencia de T. cruzi en dichos vectores en la República Mexicana (Carabarin-Lima, et 
al., 2013; Guzmán-Bracho, 2001; Ramsey, et al., 2015). Adicionalmente se ha planteado 
una relación entre el desarrollo de patologías específicas con la infección con un DTU 
específico, entre otros factores. Sin embargo, en México sólo existen siete reportes de 
genotipificación de T. cruzi en triatominos procedentes de los estados de Jalisco, Veracruz, 
Campeche y Michoacán, donde el DTU predominante es TCI, que se ha relacionado con 
cardiopatía chagásica crónica o CCC, patología más frecuente en este país, (Bosseno, et 
al., 2002; Bosseno, et al., 2009; Carabarin-Lima, et al, 2013; Brenière, et al., 2007; Ibañez-
Cervantes, et al., 2013; López-Cancino, et al. 2015; López-Olmos, et al., 1998; Monteon, et 
al., 2013; Ramos-Ligorio, et al., 2012; Zingales, et al., 2012) Específicamente, la región 
centro del estado de Veracruz tiene la mayor diversidad, reportando cinco DTU´s: TCI, TCII, 
TCIII, TCIV y TCV (Ramos-Ligonio, et al., 2012), no obstante, se desconoce la prevalencia 
y genotipos presentes en los triatominos procedentes de la región sur del estado de 
Veracruz, zona que fue estudiada en este trabajo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
18 
 
3. JUSTIFICACIÓN 
 
Para comprender la dinámica epidemiológica de la Enfermedad de Chagas es fundamental 
conocer la abundancia y distribución de los triatominos, así como la relación de T. cruzi con 
su vector, mediante el estudio de prevalencia y genotipificación (determinación de DTU´s) 
de este parásito en el vector. Los datos anteriores son fundamentales para el 
establecimiento de planes de control vectorial, así como para la generación de mapas de 
riesgo para la población. En México no existen planes de control vectorial, ni datos de la 
prevalencia de T. cruzi en humanos o vectores de todo el país. Por lo que el presente trabajo 
ayudara a ampliar los conocimientos, aportando datos de la prevalencia de T. cruzi en 
vectores de ciclo selvático y peridomésticos procedentes de Los Tuxtlas, Veracruz, una 
zona sin reportes previos de vectores infectados. Además, aportará el primer dato sobre la 
diversidad genética de T. cruzi (DTU´s) en vectores presentes en dicha zona. 
 
 
 
 
4. HIPÓTESIS 
 
Si en México, el estado con mayor diversidad genética de T. cruzi (DTU´s) es Veracruz; 
entonces en una colecta de triatominos procedentes de Los Tuxtlas, Veracruz se 
encontrarán también diferentes DTU´s. 
 
 
 
 
 
5. OBJETIVO 
 
Determinar la prevalencia y genotipo de T. cruzi presente en triatominos de Los Tuxtlas, 
Veracruz. 
 
 
 
5.1 Objetivos particulares 
 
 Determinar la prevalencia de T. cruzi en triatominos de Los Tuxtlas, Veracruz, 
de acuerdo al sexo y estadio ninfal del vector, año de colecta (2011, 2012 y 
2013) y temporada del año. 
 
 
 
19 
 Determinar la presencia y variaciones de cada DTU (TCI a TCVI) de T. cruzi en 
los triatominos infectados. 
6. MÉTODOS 
 
6.1 Descripción del área de estudio (Laguna Escondida) 
 
El área de estudio fue Laguna Escondida, la cual se ubica en la parte sureste del estado de 
Veracruz dentro de La Reserva de la Biosfera Los Tuxtlas. Dicha reserva fue decretada el 
23 de noviembre de 1998 en el Diario Oficial de la Federación (DOF) un área natural 
protegida, con el fin de proteger la selva húmeda neotropical ubicada en el límite boreal 
extremo de las selvas tropicales en el continente americano, lo cual la ha hecho objeto de 
múltiples investigaciones. Su ubicación cercana al mar permite la entrada de vientos 
húmedos provenientes del Golfo de México, además, es una zona con un amplio gradiente 
altitudinal que le confiere una gran variedad de suelos y de condiciones microclimáticas 
favorables a una gran diversidad de hábitats y especies (Diario Oficial de la Federación, 
1998). La Reserva de la Biosfera Los Tuxtlas se localiza dentro de ocho municipios: San 
Andrés Tuxtla, Catemaco, Soteapan, Tatahuicapan de Juárez, Pajapan, Santiago Tuxtla, 
Mecayapan y Ángel R. Cabada. Cuenta con una superficie total de Area Natural Protegida 
de 155 122 a 155 190 ha, divididas en tres zonas núcleo: Volcán San Martín Tuxtla (9 805 
a 9 856 ha), Sierra Santa Martha (18 031 a 18 080 ha) y San Martín Pajapan (1 883-1 856 
ha); además de una zona de amortiguamiento (125 401 a 125 497 ha), según las 
especificaciones del decreto presidencial publicado en el DOF de 1998. 
 
El área de estudio, Laguna Escondida, se ubica en la periferia de la zona núcleo Volcán 
San Martín Tuxtla, cercana a seis asentamientos humanos: Ejido Laguna Escondida, 
Alfonso Ruíz Cortines, Montepío, Miguel Hidalgo y Costilla, Las Palmas y Las Margaritas 
(Figura 13). 
Figura 13: Ubicación geográfica de la zona de colecta (azul), poblaciones 
humanas (círculo negro), zona núcleo Volcán San Martín Tuxtla (verde) y 
Reserva de la Biosfera Los Tuxtlas (rojo). 
MIGUEL HIDALGO Y COSTILLA 
CUAUHTEMOC 
EL DELIRIO 
COXCOAPAN 
EL MIRADOR 
ALFONSO LOPEZ MATEOS 
LA NUEVA VICTORIA 
 
 
20 
6.2 Colecta de triatominos 
 
En Laguna Escondida en la Reserva de la Biosfera Los Tuxtlas en Veracruz se colectaron 
manualmente 100 triatominos (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae) silvestres, que fueron 
fijados en etanol al 70% para su posterior clasificación taxonómica por el laboratorio a cargo 
de los doctores Víctor Sánchez Cordero Dávila, Ángel Rodríguez Moreno y Gabriel 
Gutiérrez Granados del Instituto de Biología, UNAM. La colecta de triatominos fue realizada 
de 2011 a 2013 y consta de adultos tanto machos (23 ejemplares) como hembras (38 
ejemplares), así como ninfas (39 ejemplares). 
 
Los vectores colectados, etiquetados y debidamente identificados fueron conservados en 
viales con etanol al 70% hasta ser llevados al laboratorio para su posterior análisis. 
 
 
6.3 Estandarización de la extracción de DNA de triatominos 
 
Se utilizaron 26 triatominos procedentes de Jalisco, México, donados por el laboratorio de 
los doctores Víctor Sánchez Cordero Dávila, Ángel RodríguezMoreno y Gabriel Gutiérrez 
Granados del Instituto de Biología, UNAM. La obtención de muestras de tejido de los 26 
triatominos fueron realizadas por dos métodos (grupo 1 y grupo 2) con las siguientes 
características: 
 
 
CONDICIONES GRUPO 1 GRUPO 2 
Material sanitizado por alcohol y cloro   
Puntas con filtro   
Superficie de trabajo sanitizada con alcohol y cloro   
Área de trabajo irradiada con luz UV por 15 min  
Área de trabajo y material irradiado con luz UV 
entre cada ejemplar (por 10 min) 
 
Superficie de trabajo sanitizada con cloro y alcohol 
entre cada ejemplar  
 
Extracción de tejido dentro de una campana de 
flujo laminar 
 
Extracción de tejido en una mesa de trabajo  
 
De ambos grupos se extrajo el contenido abdominal del triatomino, mediante una incisión 
en el esternito VII o IX hasta el tórax por ambos lados (alrededor del conexivo). Cada 
muestra de tejido fue guardada en 500 µl de PBS a -4°C por 16 horas para hidratar el tejido. 
Tabla 2: Condiciones en las que se realizó la extracción de DNA de triatominos. 
 
 
21 
Además, en cada grupo se extrajeron controles negativos para DNA de T. cruzi, 
procedentes del músculo torácico de triatominos, obtenido por una incisión en el pronoto. 
 
La extracción de DNA de las muestras de los grupos 1 y 2 descritos previamente (Tabla 2) 
se realizó modificando el protocolo de Jiménez y colaboradores (2007). Las muestras de 
tejido se centrifugaron a 12 000xg (centrífuga Eppendoff 5410) por 10 minutos, para 
después eliminar el sobrenadante. El pellet fue macerado en 500 µl de buffer de lisis (EDTA 
0.5 M a pH 8, SDS 1%, Tris Base 1M, proteínasa K a 0.1 mg/ml). El macerado se incubó 
por 2 horas a 52°C, dicha temperatura activó a la proteínasa K. Terminado el tiempo de 
incubación se agregaron 500 µl de fenol: cloroformo: alcohol isoamilico (P-2064, Sigma) y 
se centrifugó (centrífuga Eppendoff 5410) a 12 800xg. Se tomó la fase acuosa (fase 
superior), a la que se le adicionó etanol absoluto frío (-20°C) e incubó a -20°C por 16 horas, 
después se centrifugó (centrífuga SORVAL-Fresco) a 13 000 xg por 15 minutos para 
producir la precipitación del DNA. El pellet se resuspendió en etanol al 70% a -20°C, 
posteriormente se centrifugó (centrifuga SORVAL-Fresco) a 13 000 xg. Finalmente, el pellet 
se resuspendió en agua ´reviamente estérilisada e irradiada con luz UV, para ser 
cuantificado en un nanofotómetro (NanoDrop 1000 Spectrophotometer V3.7). El DNA 
obtenido fue almacenado a -20°C hasta su uso. 
 
 
6.4 Estandarización de la verificación de la calidad del DNA extraído de 
triatominos por ensayo de electroforesis y PCR de citocromo b del 
vector 
 
La verificación de la calidad del DNA extraído de los grupos antes descritos (Tabla 2) se 
realizó por dos métodos: electroforesis de 500 ng de DNA extraído de triatomino y 
amplificación del gen de citocromo b del vector. La electroforesis se realizó en un gel de 
agarosa 1%, en un buffer de corrida de TBE 5%, cargando en cada pozo 10 µl de muestra 
con 2.5 µl de buffer de carga 6X (0.25% Azul de bromofenol, 30% glicina en agua) a 100 V. 
Donde se esperaba en muestras con un buen patrón de integridad de DNA, la mayor parte 
de la muestra ubicada en el gel por arriba de los 2 000 pb. 
 
El PCR de citocromo b del vector se realizó con dos controles negativos (agua inyectable) 
y un control positivo (DNA de Triatoma pallidipenis), así como los cebadores: CYTBR02 (5´ 
TATGCRAATAGGAARTARCATTC 3') y CYTBF01 (5´ CGAATTAGTTAAATGATTRTGRG 
G 3'), los cuales amplificaron un producto de 330 pb, utilizando 250 ng de DNA. Las 
reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 25 µl con: buffer 1X de PCR (20 mM 
Tris-HCl pH 8.4, 50 mM KCl), MgCl2 2.7 mM, dNTP´s 1.38 mM, cebadores 1.1 mM y 4 U 
de Taq platinum por reacción. Se empleó un programa de amplificación con una fase inicial 
de 5 minutos a 94°C; seguido de 30 ciclos de amplificación: 94°C por 1 minuto, 55°C por 1 
minuto y 72°C por 2 minutos; finalmente una fase terminal a 72°C por 7 minutos (PTC-100® 
Thermal Cycler). 
 
 
 
22 
Los productos de amplificación fueron visualizados realizando una electroforesis en un gel 
de agarosa al 1%, en un buffer de corrida de TBE 0.5%, cargando en cada pozo 10 µl de 
muestra con 2.5 µl de buffer de carga 6X (0.25% Azul de bromofenol, 30% glicina en agua) 
a 100 V. Con las muestras que no presentaron amplificado en el primer PCR usando 250 
ng de DNA, se realizó un segundo ensayo de PCR usando el doble de DNA (500 ng). Las 
muestras del segundo ensayo de PCR que no mostraron amplificado con el método de 
visualización antes descrito fueron descartadas para el análisis posterior para la 
identificación de T. cruzi. 
 
Debido a que no se observó relación en todos los casos entre un buen patrón de integridad 
del DNA y la obtención de amplificado en los ensayos de PCR de citocromo b del vector, 
se decidió únicamente realizar el ensayo de PCR de citocromo b del vector, como único 
control de calidad del DNA extraído. 
 
 
6.5 Extracción de DNA de triatominos de Los Tuxtlas, Veracruz 
 
Una vez estandarizadas las condiciones de extracción de DNA y verificación de la calidad 
del mismo (PCR de citocromo b) se trabajó con los 100 triatominos adultos y ninfas 
procedentes de Laguna Escondida en la Reserva de la Biosfera Los Tuxtlas, Veracruz 
(Sección 6.2). Utilizando las condiciones de extracción del grupo 2 (Tabla 2, sección 6.3), 
se les extrajo el contenido abdominal del cual se obtuvo DNA y se amplificó el gen de 
citocromo b (Sección 6.4) como se describió anteriormente. 
 
 
6.6 Extracción de DNA de cepas control de T. cruzi 
 
El DNA de T. cruzi usado como control en los PCR´s de mini círculo, mini exón, 24S y 18S 
fue extraído de las cepas Querétaro (TCI), Y (TCII), Peruvian (TCII) Can III (TCIV) y CL-
Brener (TCVI) cultivadas en medio liquido LIT (Liver Infusion-Triptosa) suplementado con 
SFB (suero fetal bovino) al 10% y hemina 25 µg/ml. De cada cepa se utilizó 1 ml de medio 
de cultivo con un contenido máximo de 1 X 109 parásitos/ml. La muestra fue centrifugada a 
1 520 xg (centrifuga Eppendoff 5410) por 15 min, el sobrenadante fue descartado. El pellet 
obtenido se centrifugó dos veces en las condiciones antes descritas, para lo cual primero 
se resuspendió en PBS estéril y el segundo pellet se resuspendió en buffer de lisis (NaCl 
80 mM, EDTA 45 mM pH 8.0, y SDS 1%) con proteasa K (P-8044, Sigma) a una 
concentración final de 0.1 mg/ml, posteriormente fue agitado por inversión e incubado por 
16 horas a 37 °C en un horno de calor seco (LC- Mod 204, Lab-Lin). Después se le agregó 
un volumen de Fenol saturado (P-4557, Sigma) y se agitó por inversión hasta formar una 
emulsión uniforme que fue centrifugada (centrifuga Eppendoff 5410) a 12 800 xg por 10 
min, de la que únicamente se recuperó la fase acuosa, a la que se le agregó un volumen 
de Fenol: Cloroformo: Alcohol isoamilico en proporción 25:24:1 (P-2064, Sigma) y se agitó 
por inversión hasta que se obtuvo una emulsión uniforme que fue centrifugada (centrifuga 
Eppendoff 5410) a 12800 xg por 10 minutos y se recuperó la fase acuosa, a la que se le 
 
 
23 
agregaron dos volúmenes de etanol absoluto (E-7023, Sigma), se agitó por inversión y se 
almacenó a -20°C por una hora. Tiempo después del cual se centrifugo nuevamente en las 
condiciones anteriores y únicamente el pellet fue resuspendido en 400 µl de etanol al 70%, 
lo cual se centrifugó nuevamente en iguales condiciones y el pellet se dejó secar a 
temperatura ambiente. El pellet de DNA seco se resuspendió en 50 µl de agua estéril y la 
muestra fue cuantificada en un el nanofotómetro (NanoDrop 1000 Spectrophotometer V3.7) 
a 260 nm, lo cual dio datos sobre la pureza del DNA obtenido (relación 260/280) y la 
concentración del mismo en la muestra (ng/µl). El DNA obtenido se almacenó hasta su uso 
a -20°C. 
 
 
6.7 Estandarización del PCR de kDNA mini círculo de T. cruzi. 
 
La estandarización de la amplificación delgen de mini círculo de kDNA de T. cruzi se realizó 
con el fin de identificar a triatominos infectados con T. cruzi, para lo cual, se probaron tres 
programas de amplificación denominados grupo A, B y C (Tabla 3) con las dos condiciones 
de extracción de DNA de triatominos, denominas grupo 1 (uso de campana de flujo laminar 
y luz UV) y grupo 2 (sin uso de campana de flujo laminar). Posteriormente se eligió el mejor 
proceso de extracción de DNA de triatominos. 
 
 PROGRAMAS DE AMPLIFICACIÓN 
Grupo 
A 
Fase inicial: 95 °C por 10 minutos 
2 ciclos: 98 °C por 1 minuto y 64 °C por 1 minuto 
35 ciclos: 94 °C por 1 minuto, 64 °C por 1 minuto y 72 °C por 1 minuto con 12 segundos 
Fase final: 72 °C por 10 minutos 
Grupo 
B 
Fase inicial: 95 °C por 10 minutos 
2 ciclos: 98 °C por 1 minuto y 64 °C por 1 minuto 
30 ciclos: 94 °C por 1 minuto, 64 °C por 1 minuto y 72 °C por 1 minuto con 12 segundos 
Fase final: 72 °C por 10 minutos 
Grupo 
C 
Fase inicial: 95 °C por 10 minutos 
2 ciclos: 98 °C por 1 minuto y 64 °C por 1 minuto 
25 ciclos: 94 °C por 1 minuto, 64 °C por 1 minuto y 72 °C por 1 minuto con 12 segundos 
Fase final de 72 °C por 10 minutos 
 
En cada grupo (Tabla 3) se emplearon tres controles: el control positivo fue DNA de T. cruzi 
cepa Querétaro, así como dos controles negativos que fueron agua inyectable (al principio 
y el final del ensayo). Además, como prevención adicional, el ensayo de PCR fue realizado 
en áreas separadas (se empleó una zona para la mezcla de reactivos y una segunda zona 
para la adición de las muestras de DNA a la mezcla de reactivos). 
 
El PCR de mini circulo de kDNA de T. cruzi se realizó modificando el protocolo de Pacheco-
Álvarez (2000) al utilizar utilizando 375 ng de DNA templado. Se emplearon dos 
cebadores: 121 (5' AAATAATGTACGGGKGAGATGCATGA 3') y 122 (5' GGTTCGATTG 
Tabla 3: Programas de amplificación del PCR de mini círculo de kDNA de T. cruzi. 
 
 
24 
GGGTTGGTGTAATATA 3'), los cuales amplificaron un producto de 330 pb en una mezcla 
con: buffer 1X para PCR (20 mM Tris-HCl pH 8.4, 50 mM KCl), MgCl2 4.5 mM, dNTP´s 2.5 
mM, cebadores a 200 ng/µl y 2.5 U de Taq platinum por reacción. Los productos de PCR 
fueron corridos en geles de agarosa al 1% en buffer de corrida TBE 0.5x, cargando en cada 
pozo 10 µl de muestra con 2.5 µl de buffer de carga 6X (0.25% Azul de bromofenol, 30% 
glicina en agua) a 100 V. 
 
 
6.8 PCR de mini círculo de kDNA de T. cruzi en triatominos de Los Tuxtlas, 
Veracruz 
 
Una vez estandarizadas las condiciones de PCR del mini círculo de kDNA de T. cruzi se 
amplificó dicho gen según las condiciones descritas para el grupo C (Tabla 3, 25 ciclos de 
amplificación) en los triatominos procedentes de Laguna Escondida (Sección 6.2). 
 
 
6.9 Genotipificación de T. cruzi en triatominos de Los Tuxtlas, Veracruz. 
 
La identificación del genotipo de T. cruzi se realizó de acuerdo el siguiente diagrama, 
utilizando tres ensayos de PCR que amplifican los marcadores moleculares: mini exón, 24S 
rRNA y 18S rRNA, en las muestras de DNA de triatominos identificados como infectados 
con T. cruzi por el ensayo de PCR de mini círculo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PCR de mini circulo de T. cruzi 
PCR de mini exón de T. cruzi 
PCR de 18S de T. cruzi 
TCI 
TCII, TCIII, TCIV, TCV y/o TCVI 
PCR de 24S de T. cruzi 
330 pb 
300 pb 
350 pb 
TCIII y/o TCIV 
Sin amplificado 
TCII 
 TCIII 
 TCV 
TCII 
TCVI TCV TCIII TCIV 
165 pb 155 pb Sin amplificado 
TCIV 
125 pb 110 pb 
110 pb 
125 pb 
130 pb 
120 pb 
TCV 
 
 
25 
 
 
 
6.9.1 Estandarización del PCR mini exón de T. cruzi 
 
El DNA de T. cruzi (Sección 6.6) obtenido de las cepas control Querétaro TCI (Espinoza, et 
al., 2010), Ninoa TCI (Espinoza, et al., 2010), Peruvian TCII (Zingales, et al., 2009), Y TCII 
(Grosso, et al., 2010, Zingales, et al., 2009), Can III TCIV (Brisse, et al., 2001, Brisse, et al., 
2000, Zingales, et al., 2009) y CL-Brener TCVI (Zingales, et al., 2009, Brisse, et al., 2000, 
Brisse, et al., 2001, Marcet, et al., 2006) fue utilizado para el ensayo de PCR de mini exón 
con el cual se obtuvieron dos amplificados: 350 pb para TCI (linaje 2) y 300 pb para TCII-
TCVI (linaje 2) (Souto, et al. 1996), aunque también se han reportado los amplificados 
descritos en la tabla 4. Se empleó un control negativo (agua estéril), 375 ng DNA de las 
cepas antes mencionadas, con una mezcla de 200 ng/µl de los iniciadores: TC1 (5´ 
GTGTCCGCCACC TCCTTCGGGCC 3´), TC2 (5´ CCTGCAGGCACACGTGTGTGT G 3´) 
y TCC (5´ CCCCCC TCCCAGGCCACACTG 3´), 1.5 mM de MgCl2 (invitro gen), 0.2 mM de 
dNTP´s, 2.5 U de Taq platinum por reacción y buffer 1X para PCR (20 mM Tris-HCl pH 8.4, 
50 mM KCl). Se utilizaron las siguientes condiciones de temperatura: una temperatura inicial 
desnaturalizante de 94 °C por 10 minutos; seguido de 35 ciclos con 94 °C por 30 segundos 
(desnaturalización), 55 °C por 30 segundos (hibridación) y 72 °C por 30 segundos 
(extensión); terminando con una etapa de extensión de 72 °C por 10 min (PTC-100® 
Thermal Cycler). Los productos del PCR fueron corridos en geles de agarosa 1.5% en las 
condiciones antes descritas para electroforesis (Rojas-Ortega, 2012). 
 
 
6.9.2 PCR de mini exón de T. cruzi en triatominos de Los Tuxtlas, Veracruz. 
 
En este ensayo se utilizaron 48 muestras de DNA de triatominos de Laguna Escondida 
(Sección 6.2) identificados como infectados con T. cruzi por el PCR de kDNA de mini círculo 
del mismo antes descrito (Sección 6.8) para clasificar las muestras en dos grupos, 
denominados linaje 2 (TCI) y linaje 1 (TCII a TCVI) de mini exón (Souto, et al. 1996). Se 
emplearon las condiciones de amplificación antes descritas, así como dobles controles 
 Cebadores TCI TCII (TcII b) 
TCIII 
(TcII c) 
TCIV 
 (TcII a) 
TCV 
(TcII d) 
TCVI 
(TcII e) 
Mini 
exón 
TCC 
TC1 
TC2 
350 A,B, C 300 A,B, C 
300A,B 
o 
Sin 
amplificado 
o 
250C 
300 A,B 
o 
Sin 
amplificado 
o 
400 C 
300 A,B, C 
 300
 A,B, C 
ABrisse, et al., 2001 
BSouto, et al., 1996 
CYeo M., et al., 2005 
Tabla 4: Amplificados esperados para el PCR de mini-exón de T. cruzi. 
 
 
 
26 
negativos (agua estéril, al inicio y al final de la tecnica), así como doble control positivos 
DNA de las cepas de T. cruzi Querétaro (TCI) y CL-Brener (TCVI), para la identificación de 
cada genotipo. 
6.9.3 PCR de 18S de rRNA T. cruzi en triatominos de Los Tuxtlas, Veracruz. 
 
Se utilizaron muestras de DNA de triatominos de Laguna Escondida (Sección 6.2) 
identificados como infectados con T. cruzi tipo no TCI (linaje 2 de mini exón, Sección 6.8). 
Se emplearon seis controles, un doble control negativo a DNA de T. cruzi (agua inyectable, 
al inicio y final de la técnica), así como cinco controles positivos con DNA de las cepas de 
T. cruzi: Querétaro (TCI), Perú (TCII), Y (TCII), Can III (TCIV) y CL-Brener (TCVI). Además, 
se emplearon 375 ng de la muestra de DNA de triatomino, buffer para PCR (20 mM Tris-
HCl pH 8.4, 50 mM KCl), 1.6 mM de MgCl2, 1.6 mM de dNTP`s, 2.5 U de Taq platinum por 
reacción y dos cebadores a una concentración de 200 ng por reacción denominados V1 (5´ 
CAAGCGGCTGGGTGGTTATTCCA) y V2 (5´ TTGAGGGAAGGCATGA CACATGT), con 
los cuales se espera observar las amplificados de la tabla 5 usando las siguientes 
condiciones: una temperatura inicial desnaturalizante de 94 °C por 10 minutos, seguido de 
30 ciclos con: 94 °C por un minuto (desnaturalización), 55 °C por un minuto (hibridación) y 
72 °C por un minuto (extensión), después de dichos ciclos se terminó con una etapa de 
extensión a 72 °C por 5 minutos (PTC-100® Thermal Cycler). Finalmente, los productos del 
PCR fueron corridos en geles de poliacrilamida al 12% en buffer de corrida TBE 1x, 
cargando en cada pozo 10 µl de muestra con 2.5 µl de buffer de carga 6X (0.25% Azul de 
bromofenol, 30% glicina en agua) a 75 V (Brisse, et al., 2001). 
 
 
 
6.9.4 PCR de 24S de rRNA de T. cruzi en triatominos de Los Tuxtlas, Veracruz. 
 
Se utilizaron 375 ng de las muestras de DNA detriatominos de Laguna Escondida (Sección 
6.2) identificados como infectados con T. cruzi con el genotipo no TCI (linaje 1 de mini exón) 
para el PCR de 24S de rRNA de T. cruzi, junto con seis controles descritos en la sección 
anterior. Se utilizó una mezcla de buffer para PCR (20 mM Tris-HCl pH 8.4, 50 mM KCl), 
1.6 mM de MgCl2, 1.6 mM de dNTP`s, 2.5 U de Taq platinum por reacción y dos cebadores: 
 Cebadores TCI TCII (TcII b) 
TCIII 
(TcII c) 
TCIV 
(TcII a) 
TCV 
(TcII d) 
TCVI 
 (TcII e) 
18S 
rRNA 
V1 
V2 
175 A 
o 
165 A 
o 
160 A, C 
o 
170+180 A 
165 A, C 165 A, C 155A, C 165 A,C NA A 
o 
165 A, B, C 
 
ABrisse, et al., 2001 
BMarcet, et al., 2006 
CYeo M., et al., 2005 
Tabla 5: Amplificados esperados para el PCR de 18S rRNA T. cruzi. 
 
 
27 
D71 (5´ AAGGTGCGTCGACAGTGTGG) y D72 (5´ TTTTCAGAATGGCCGAACAGT), con 
los cuales se espera observar las amplificados de la tabla 6 en el siguiente programa de 
amplificación: temperatura inicial de 94 °C por 5 minutos; seguido de 30 ciclos con: 94 °C 
por 1 minuto, 60 °C por 1 minuto y 72 °C por 1 minuto; después de los cuales se terminó 
con una etapa final de extensión a 72 °C por 5 minutos (PTC-100® Thermal Cycler). Por 
último, los productos de PCR fueron corridos en geles de poliacrilamida a 12% en las 
condiciones antes descritas (Sección 6.9.3) (Brisse, et al., 2001). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Cebadores TCI TCII (TcII b) 
TCIII 
(TcII c) 
TCIV 
 (TcII a) 
TCV 
(TcII d) 
TCVI 
 (TcII e) 
24Sα rRNA D71 D72 
110A,D 125A,D 
 
110A,D 120A, D 
o 
125A 
o 
130A 
110A 
o 
110+125 D 
125 A,D 
ABrisse, et al., 2001 
BSouto, et al., 1996 
cMarcet, et al., 2006 
DYeo M., et al., 2005 
 
Tabla 6: Amplificados esperados para el PCR de 24S de rRNA de T. cruzi. 
 
 
28 
 
7. RESULTADOS 
 
7.1 Colecta de triatominos en la Reserva de la Biosfera de Los Tuxtlas, 
Veracruz 
 
En Laguna Escondida, localidad de la Reserva de la Biosfera de Los Tuxtlas, Veracruz se 
colectaron entre los años 2011 a 2013, 100 triatominos (Hemiptera: Reduviidae: 
Triatominae) en áreas silvestres perturbadas por actividades de cultivo y pastoreo, así como 
en áreas peridomésticas. Posteriormente, los organismos fueron fijados en etanol al 70%, 
para su clasificación taxonómica en el laboratorio del Dr. Víctor Sánchez Cordero del 
Instituto de Biología, UNAM. En dicha colecta se identificaron 39 % hembras, 23 % machos 
y el 38 % ninfas de 1, 2, 3 y 5 estadios. Se identificaron dos especies, siendo T. dimidiata 
la especie predominante con un 95% de representatividad, contra un 5% de Panstrongylus 
rufotuberculatus (Gráfica 1). 
 
Durante los tres años de colecta de triatominos se capturaron diferente número de 
ejemplares por año. El primer año (2011) representó el 15% (15/100) de los ejemplares 
totales de los cuales el 40% (6/15) fueron hembras, 26.7% (4/15) machos y 33.3 % (5/15) 
ninfas; el segundo año (2012) se capturó el 50% (50/100) de la colecta de los que 30% 
(15/50) fueron hembras, 20% (10/50) machos y 50% (25/50) ninfas; el último año (2013) 
Gráfica 1: Representatividad de la colecta de triatominos en Los Tuxtlas, Veracruz por 
especie. La mayor proporción de los triatominos colectados pertenece a la especie T. 
dimidiata (B) y la menor proporción a P. rufotuberculatus (A). 
 
T. dimidiata 
95 % 
P. rufotuberculatus 
5% 
95 % 
 
 
29 
representó el 35 % (35/100) de la colecta, siendo el 51.4 % (18/35) hembras, 22.9% (8/35) 
machos y 25.7% (9/35) ninfas (Gráfica 2). 
 
 
7.2 Estandarización del PCR de mini círculo de kDNA de T. cruzi. 
 
7.2.1 Estandarización del programa de amplificación del PCR de mini círculo de 
kDNA de T. cruzi 
 
La primera técnica que se estandarizó fue el PCR del mini círculo de T. cruzi, para lo cual 
se probaron tres programas de amplificación: grupos A (35 ciclos de amplificación), B (30 
ciclos de amplificación) y C (25 ciclos de amplificación) (sección 6.7, tabla 3), en los cuales 
se obtuvo un amplificado esperado correspondiente a 330 pb observado en la electroforesis 
de los productos de PCR. Se utilizó DNA de T. cruzi de la cepa Querétaro, dos controles 
negativos (agua estéril) preparados al inicio y al final del ensayo (Figura 14). 
 
En los grupos A y B se obtuvieron dos amplificados, además del esperado de 330 pb en las 
muestras de DNA de T. cruzi. Mientras los controles negativos mostraron dos amplificados 
además del de 330 pb en el grupo A (Figura 14, 1) y sólo un amplificado de 330 pb en el 
grupo B (Figura 14, 2). Por lo que se consideró que en los anteriores programas de 
amplificación del PCR de mini círculo existió la presencia de amplificados inespecíficos. 
 
En el grupo C, se obtuvo únicamente el amplificado esperado de 330 pb en la muestra con 
DNA de T. cruzi y se eliminaron totalmente los amplificados inespecíficos en los controles 
negativos, ya que estos últimos no mostraron amplificados (Figura 14, 3). 
Gráfica 2: Representatividad de la colecta de triatominos de Los Tuxtlas, Veracruz. 
En (A) se muestra el porcentaje de triatominos colectados por año, mientras que en 
(B) se presenta el porcentaje de hembras, machos y ninfas por año de colecta. 
 
 
30 
. 
 
7.2.2 Estandarización del protocolo de extracción y verificación de la calidad de 
DNA de triatominos de Jalisco. 
 
Con base en los resultados anteriores se decidió utilizar el programa de amplificación del 
grupo C con 25 ciclos de amplificación (Tabla 4, sección 6.7) para la identificación de 
triatominos infectados con T. cruzi. Para evitar la obtención de falsos positivos en el ensayo 
de PCR de mini círculo se diseñaron dos métodos de extracción de DNA, denominados 
grupo 1 (extracción sin uso de campana de flujo laminar y luz UV) y grupo 2 (extracción con 
uso de campana de flujo laminar y luz UV), ambos métodos descritos en la Tabla 2 (Sección 
6.3). Para dicho propósito se usaron 26 triatominos procedentes de Jalisco, México 
proporcionados por el laboratorio del Dr. Ángel Rodríguez Moreno del Instituto de Biología 
de la UNAM. De estos se obtuvo DNA del 100% de los ejemplares con ambas técnicas. Las 
muestras de DNA obtenidas por ambos métodos de extracción fueron examinadas por un 
330 pb 
600 pb 
2 050 pb 
MP C-1 C-2 C+ 
C+ 
600 pb 
2 050 pb 
330 pb 
 MP C-1 C-2 C+ 
Figura 14. Electroforesis en gel de agarosa de los productos de PCR de mini círculo 
de kDNA de T. cruzi usando 35, 30 o 25 ciclos de amplificación, denominados grupos 
A, B y C respectivamente. 1: grupo A, 2: grupo B, 3: grupo C, MP: marcador de peso 
molecular, C-1 y C-2: controles negativos (agua estéril, al inicio y final de la técnica 
respectivamente), C+: DNA de T. cruzi (cepa Querétaro). 
330 pb 
600 pb 
2 050 pb 
 MP C-1 C-2 C+ 
 
 
31 
ensayo de electroforesis en geles de agarosa 1% para la verificación de la integridad del 
mismo. Para considerar que la muestra de DNA estuviera integra, se esperaba observar la 
mayor parte de la muestra de DNA de triatomino por arriba de 2 000 pb en el gel de agarosa. 
Se consideraron como muestras con DNA degradado aquellas con la mayor cantidad de 
muestra por debajo de 600 pb. De acuerdo a los parámetros anteriores se obtuvo en los 
dos grupos un 30% de las muestras con DNA degradado (carriles 1, 7, 10, 11 y 12 de la 
Figura 15). El 70% de las muestras presentó un DNA en buenas condiciones (Figura 15: 
carriles 2, 3, 4, 5, 6, 8 y 9). 
 
 
Sin embargo, en el segundo método usado para evaluar la calidad del DNA del vector 
(amplificación del gen de citocromo b del vector). Se obtuvo un amplificado de 330 pb en 
93.8 % del grupo 1 y 100 % del grupo 2. Resultados ejemplificados en la figura 16. 
 
Después, el DNA extraído de los 26 triatominos de Jalisco fue utilizado para el ensayo de 
PCR de mini círculo de kDNA de T. cruzi en las condiciones de amplificación del grupo C 
(25 ciclos de amplificación).