Identificacion-de-bacterias-halofilas-presentes-en-queso-Cotija-por-metodos-independientes-de-cultivo

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UNIVERSIDAD NACIONAL 
 AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 FACULTAD DE QUÍMICA 
 
Identificación de bacterias halófilas presentes en 
queso Cotija por métodos independientes de cultivo 
 
TESIS 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
QUÍMICA DE ALIMENTOS 
 
PRESENTA 
Blanca Estela Gómez Castelo 
 
 
 MÉXICO, D.F. 2010 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE: Profesor: Raúl Genaro Aguilar Caballero 
VOCAL: Profesor: María Elena Cañizo Suárez 
SECRETARIO: Profesor: Maricarmen Quirasco Baruch 
1er. SUPLENTE: Profesor: Amelia María de Guadalupe Farrés González Saravia 
2° SUPLENTE: Profesor: Ismael Bustos Jaimes 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
LABORATORIO 312, DEPARTAMENTO DE ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA, 
CONJUNTO E, FACULTAD DE QUÍMICA, UNAM. 
 
ASESOR DEL TEMA: 
 
DRA. MARICARMEN QUIRASCO BARUCH 
 
 
SUPERVISOR TÉCNICO: 
 
DRA. CAROLINA PEÑA MONTES 
 
 
SUSTENTANTE: 
 
BLANCA ESTELA GÓMEZ CASTELO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“El hombre ha nacido para luchar, y es 
como se le define mejor, diciendo que es un 
guerrero nato y que su vida, desde el principio al 
fin, no es sino una batalla” 
 
Thomas Carlyle 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
A la máxima casa de estudios, la UNAM, por haberme albergado todos estos años, por proporcionarme lo 
necesario durante mi formación y darme las herramientas para salir y afrontar la vida. 
 
Al Colegio de Profesores de la Facultad de Química y a la sección 024 de la AAPAUNAM por el apoyo otorgado 
mediante la Cátedra Enrique García Galeano. 
 
A la Dra. Maricarmen Quirasco Baruch por darme la oportunidad de trabajar bajo su tutoría, por su confianza, 
conocimiento compartido y tiempo dedicado para resolver los problemillas que iban surgiendo, así como el dedicado 
al trabajo final. Por buscar la forma de que tuviera una beca, la cual logramos conseguir. 
 
A Caro por creer en mi trabajo, porque estuviste para apoyarme durante el desarrollo del proyecto siempre con 
paciencia, dedicación y una gran sonrisa; a pesar de la infinidad de trabajo que siempre tienes nunca recibí un no 
por respuesta. 
 
A las Doctoras Amelia Farrés y Amanda Gálvez por el tiempo dedicado a los seminarios, por los cuestionamientos 
que siempre son de gran ayuda para encaminar el proyecto y el conocimiento. Por ser ejemplos de mujeres exitosas y 
gran inteligencia. 
 
A Isra por tu gran ayuda, porque siempre tenías una pregunta que realizar, por ser tan directo y a veces tan 
molestón, por los jalones de oreja cuando los necesité, porque eres a tu manera un modelo de dedicación y amor a la 
ciencia pero sobre todo por tu amistad. 
 
A Minos por ser una gran persona que siempre está dispuesta a colaborar, porque me ayudabas a pensar y 
responder a mis preguntas, por tu entrega a la ciencia, por tu manera sutil, pero al final verdadera, de decir las 
cosas. Espero consevar tu amistad así como la de Pily, compartimos tantos momentos llenos de alegría fuera del 
labo que ojalá no terminen. 
 
A todos y cada uno de los que conformaron y conforman el laboratorio 312: Pily, Denise, Eliana, Ran, Carlos, 
Moles, Liliana, Serch, Myrnita, Lalo, Aline, Xime, Eva, Pao, Lu, Laura, Mary, Ricardo, Ale, José Luis, Katia y 
Luisa, ya que hicieron esta estadía más agradable, siempre todos dispuestos a contribuir y convivir dentro y fuera 
del lab, siempre dije que no pude haber llegado a un laboratorio mejor. 
 
 A los Doctores Carmen Wacher y Elpidio García por su cooperación con el material y equipo que necesitábamos 
para la realización del proyecto. 
 
A los sinodales, Raúl Aguilar y María Elena Cañizo, por el tiempo invertido en la revisión del trabajo y sus 
correcciones. 
 
 
 
 
 
DEDICATORIAS 
 
A DIOS, por guiarme y ponerme en este camino, gracias a ello he llegado a ser la persona que soy, porque sé que no 
nos das más de lo que podamos afrontar. 
 
A ti MAMÁ, por darme la vida, porque con mucho esfuerzo, sacrificio y tus posibilidades nos has sacado 
adelante, nos enseñaste valores; por tu gran fuerza como mujer, porque a pesar de todo siempre estás de pie, por 
ser tan abierta y la infinidad de consejos que a tu estilo nos das, gracias porque además de ser mi madre eres mi 
amiga, TQM. 
 
A ustedes hermanos, Lupita, Mario, Jorge y Adrián por ser la fuerza que me ha impulsado a salir adelante. Ojalá 
logre ser ejemplo para ustedes de que se puede ir en contra de los pronósticos. 
 
A mis tíos, Lourdes y Sergio, no me queda más que agradecerles por haberme apoyado cuando lo necesité, por 
hacerme parte de su familia y por los dolores de cabeza que les ocasioné. Gracias por la oportunidad que me dieron 
y aunque creyeron que nunca llegaría el día, después de mucho tiempo aquí está el resultado. 
 
A Diana y Luis, por ser como mis hermanos, un ejemplo de superación y metas alcanzadas. 
 
A mis sobrinos, Alfonso, Jeshua y el angelito que está por llegar, ya que son el ejemplo de la inocencia, sencillez y 
felicidad que nunca se deben perder. 
 
A Mitzi, porque sé que esta amistad no terminará, porque han sido años de experiencias inolvidables, de pláticas 
interminables, por la felicidad de un partido ganado y las lágrimas de los perdidos, que al final nos hicieron más 
fuertes , por tus grandes consejos, las locuras, porque seguimos siendo confidentes, porque eres mi amiga, madrina 
y también una hermana. 
 
A Diana, Wen, Mario, Jorge, Omar, Veci y Ergar, por la infancia compartida, porque desde entonces hemos 
formado un gran lazo, porque cada uno a su forma ha hecho cada momento inigualable, ya tenemos millones de 
experiencias que contarle a nuestros hijos, porque estamos en las buenas y en las malas. 
 
A mis grandes amigas de la facultad, Moni, Almitz, Claux, Paty y Thania, ya que por medio de ustedes aprendí 
que en muchas ocasiones la vida no es tan perfecta como lo parece ni tan cruel como en ocasiones lo sentimos, cada 
una ha sabido afrontar los retos puestos en el camino; porque cada una es tan diferente y especial, un ejemplo de 
fuerza, progreso, honestidad y trabajo. Las quiero mucho. 
 
A todos mis amigos y compañeros de la carrera: Rice, Jose, Puga, Tavo, Alex, Carlitos, Mike, Miguel, Ricardo, 
Tats, Susa, Sarai, Miris, Susi (q.e.p.d.), Rafa, Esteban, Evelyn, porque ayudaron a que este tiempo de mi 
formación como profesionista y ser humano fuera más sencillo y estuviera repleto de alegrías, miles de desveladas y 
también enojos, que al final ayudaron a que nos conociéramos mejor, respetar y valorar lo que cada uno es como 
persona. 
 
A todos aquellos que han formado de una u otra forma parte de mi vida, porque dejaron huella y sobre todo algo 
que aprender. 
 
¡¡¡¡INFINITAS GRACIAS A TODOS, LO LOGRAMOS!!!!
CONTENIDO 
 
 
- 1 - 
 
CONTENIDO 
Página 
I. Resumen ................................................................................................................. 3 
II. Introducción ............................................................................................................ 5 
 Queso 
 Definición .....................................................................................................5 
 Microbiota presente ..................................................................................... 6 
 Clasificación ................................................................................................ 7 
 Queso Cotija 
 Definición ..................................................................................................... 7 
 Clasificación ................................................................................................. 9 
 Proceso de elaboración ............................................................................. 10 
 Técnicas empleadas para identificar microorganismos en alimentos .............. 12 
 Métodos dependientes de cultivo .............................................................. 12 
 Métodos independientes de cultivo ........................................................... 13 
III. Antecedentes ........................................................................................................ 21 
IV. Justificación .......................................................................................................... 23 
V. Hipótesis ............................................................................................................... 25 
VI. Objetivos ............................................................................................................... 25 
VII. Metodología en diagrama de flujo .......................................................................... 26 
VIII. Metodología .......................................................................................................... 27 
Muestras .......................................................................................................... 27 
CONTENIDO 
 
 
- 2 - 
 
 Pre-enriquecimiento de microorganismos presentes en la sal ………………. 27 
 Enriquecimiento de microorganismos presentes en la sal .............................. 28 
 Recuperación del paquete celular a partir del queso ...................................... 28 
 Extracción de ADN .......................................................................................... 29 
 Análisis del ADN extraído ................................................................................ 29 
 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) ................................................ 30 
 Análisis de los amplicones .............................................................................. 31 
 DGGE .............................................................................................................. 32 
 Selección y tratamiento de las bandas ............................................................ 32 
 Re-amplificación de ADN ............................................................................... 33 
 Secuenciación ................................................................................................. 33 
 Análisis de las secuencias .............................................................................. 33 
 Árbol filogenético .............................................................................................. 34 
IX. Resultados y discusión ......................................................................................... 35 
X. Conclusiones ........................................................................................................ 52 
XI. Perspectivas ......................................................................................................... 53 
XII. Bibliografía ............................................................................................................ 54 
XIII. Anexos .................................................................................................................. 60 
 
 
RESUMEN 
 
 
- 3 - 
 
I. RESUMEN 
 
Las bacterias ácido lácticas (BAL) son benéficas para el hombre, no sólo porque 
mantienen la microbiota intestinal, sino por su amplia participación en procesos 
fermentativos, así como por la capacidad que tienen sus metabolitos de preservar 
alimentos. Existe un grupo de este tipo de bacterias que no ha sido muy estudiado, BAL 
halófilas, las cuales pueden tener un gran potencial de aplicación debido a las 
características del ambiente en las que pueden crecer. 
 
Existen reportes en nuestro grupo de trabajo de la presencia de BAL halófilas en 
muestras de queso Cotija, por lo cual, en el presente estudio se hizo uso de métodos 
independientes de cultivo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) seguida de la 
separación de amplicones por electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante 
(DGGE), con el fin de identificar más microorganismos de este grupo de bacterias. El 
queso Cotija posee un elevado porcentaje de sal (∼6.2% de NaCl) lo que lo hace un 
nicho probable de este tipo de microorganismos por el hecho de que se emplea sal de 
grano artesanal durante su elaboración. Por consiguiente también se identificaron este 
tipo de microorganismos en sal artesanal y comercial para determinar y comparar si 
éstas provienen de su incorporación y se conservan hasta el producto madurado. 
 
Por medio de cebadores específicos para la familia Firmicutes-BAL halófilas, se amplificó 
aproximadamente una tercera parte del gen 16S ADNr (final de la región V3 hasta la V8), 
logrando identificar tanto en las muestras de queso Cotija como en la sal las siguientes 
bacterias: Enterococcus asini, E. termitis, Lactobacillus sakei y Vagococcus carniphilus. 
 
 
 
 
 
 
RESUMEN 
 
 
- 4 - 
 
Resalta la presencia de los dos primeros, ya que son microorganismos relativamente 
nuevos y no han sido reportados en alimentos, así mismo para E. asini no hay reportes 
de que se trate de una bacteria halófila. L. sakei es un microorganismo común de 
productos fermentados y también existen reportes de su presencia en productos con alta 
concentración de sal; por último, V. carniphilus ya había sido reportada su presencia en 
el queso Cotija, en investigaciones previas del grupo de trabajo, como un 
microorganismo constante no dominante. 
 
INTRODUCCIÓN 
 
 
- 5 - 
 
II. INTRODUCCIÓN 
 
 QUESO 
 Definición 
Es el producto fresco o maduro, sólido o semisólido (Chamorro y Losada, 2002), mezcla 
de proteínas y grasas de origen lácteo, que se obtiene de la coagulación ácida o 
enzimática de las caseínas de la leche y/o productos obtenidos de ésta (Amiot, 1991). 
 
Se requieren 4 ingredientes básicos para producir la mayoría de los quesos: 
 Leche 
 Cuajo 
 Sal 
 Microorganismos (opcional) (Fox et al., 2000) 
 
Estos son procesados generalmente a través de diferentes etapas: 
 Coagulación: Modificaciones fisicoquímicas de las micelas de caseína que, bajo la 
acción de enzimas proteolíticas y/o ácido láctico, llevan a la formación de un 
entramado proteínico denominado coágulo o gel. 
 Desuerado: Consiste en la separación del suero tras la rotura mecánica del 
coágulo por moldeado o centrifugación, obteniendo al final la cuajada. 
 Salado: Incorporación de la sal a la cuajada, en la superficie o por inmersión en 
salmuera. Aporta sabor, y además actúa sobre el desarrollo de los 
microorganismos y la actividad enzimática. 
 Maduración: Conjunto de transformaciones bioquímicas de los componentes de la 
cuajada por la acción de enzimas, en gran parte de origen microbiano (Chamorro y 
Losada, 2002). 
 
 
 
 
INTRODUCCIÓN 
 
 
- 6 - 
 
 Microbiota presente 
Una gran variedad de microorganismos están involucrados en la maduración del queso, 
estos pueden estar de forma natural o ser adicionados intencionalmente; en el primer 
caso la composición yactividad microbiana son parámetros poco controlables, debido a 
la dinámica e interacciones que pueden presentarse (Beresford et al., 2001). 
 
La microbiota está compuesta por: 
 Bacterias ácido lácticas (BAL) iniciadoras: Son las responsables de la acidez 
desarrollada durante la producción del queso por la fermentación de la lactosa a 
ácido láctico, ocasionando un cambio en las proteínas, confiriéndole diferente 
textura, así como la formación de compuestos aromáticos y la inhibición de ciertos 
microorganismos. Dentro de las BAL iniciadoras se encuentran: Lactococcus 
lactis subesp. lactis, Lactococcus lactis subesp. cremoris, Streptococcus 
thermophilus, Lactobacillus helveticus y Lactobacillus delbrueckii subesp. 
bulgaricus. 
 BAL no iniciadoras: Mezclas complejas de bacterias, levaduras y hongos que 
conforman la microbiota secundaria; contribuyen con las características 
específicas de cada producto. Algunas de ellas son: Leuconostoc, 
Propionibacterium freundenreichii, Brevibacterium linen, Penicillium camembertii, 
Penicillium roqueforti (Early, 2000). 
 
Los aspectos fundamentales que influyen en la dinámica del ecosistema del queso son: 
a) Físicos: Humedad, concentración de sal y pH los cuales cambian durante el 
proceso de elaboración y están influenciados por la microbiota. 
b) Biológicos: Aquellos que resultan de las interacciones entre microorganismos 
(Beresford et al., 2001). 
 
Cada combinación de ingredientes y parámetros del proceso conllevan a un tipo 
específico de queso con propiedades únicas (Fox et al., 2000). 
 
INTRODUCCIÓN 
 
 
- 7 - 
 
 Clasificación 
Además de lo antes mencionado, se puede clasificar de forma sencilla a los quesos por 
su tiempo de maduración y textura en: 
 Quesos frescos: Aquellos que son consumidos inmediatamente después de su 
elaboración. 
 Quesos madurados: Los que llevan un proceso de fermentación antes de ser 
comercializados, estos a su vez pueden dividirse en: 
• Blandos 
• Semi-duros 
• Duros 
• Azules (Amiot, 1991) 
 Quesos fundidos: Mezcla, fusión y emulsión con tratamiento térmico y agentes 
emulsionantes de una o más variedades de queso, con o sin la adición de 
productos alimenticios como especias y vegetales (CODEX STAN A-8a-1978). 
 
 
 QUESO COTIJA 
(Álvarez et al., 2005) 
 Definición 
Se clasifica dentro de los quesos madurados, es un queso de pasta no cocida, dura, 
seca, desmoronable, salada, ácida; se elabora con leche cruda de vaca, siempre y 
cuando ésta mantenga un mínimo de 3.7% de grasa y 3.0% de proteína, obtenida de 
ganado criollo de doble propósito (Holstein-Cebú y Pardo Suizo-Cebú), el cual es 
alimentado por libre pastoreo; es nombrado así por la ciudad de Cotija de la Paz en el 
estado de Michoacán. 
 
 
 
 
 
INTRODUCCIÓN 
 
 
- 8 - 
 
Es un queso de forma cilíndrica de gran tamaño (aproximadamente 20 kg) (Figura 1), 
cuando está totalmente madurado presenta un color amarillento y posee un sabor 
pronunciado seco y fuerte. La fermentación de este queso se da a partir de la microbiota 
nativa presente tanto en la materia prima como en los utensilios con los que está en 
contacto. 
 
La composición básica del queso debe ser la siguiente: 
 Humedad máxima 36 % 
 Grasa mínima 23 % 
 Proteína mínima 25 % 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Queso Cotija (www.quesocotija.org.mx). 
 
Su periodo de elaboración se restringe a los meses de junio a octubre, ya que hay un 
aumento de vegetación debido a las lluvias y por lo mismo una mayor producción de 
leche, los cambios más importantes durante la maduración se llevan a cabo en los 
primeros 3 meses. 
 
Las características fisicoquímicas y organolépticas de este producto se ven afectadas por 
diferentes factores como las diversas prácticas de manufactura dependientes de la región 
geográfica en donde se elabore y el clima. 
INTRODUCCIÓN 
 
 
- 9 - 
 
Las comunidades productoras se localizan en las inmediaciones de los estados de 
Jalisco y Michoacán (Sierra de Jalmich), principalmente en los municipios de Santa María 
del Oro (Jalisco), Sur de Tocumbo y Cotija (Michoacán) (Figura 2). Se estima que 
actualmente se elaboran alrededor de 400 ton/año del lácteo. 
 
 
 Clasificación 
El queso Cotija Región de Origen puede subclasificarse comercialmente por: 
 Tiempo de añejamiento 
• Añejo. De 3 a 6 meses 
• Rendido. Más de 6 meses 
 Consistencia y características al corte 
• De tajo. No se desmorona al corte y las paredes se mantienen en su posición, 
debido al menor contenido de sal y mayor contenido de grasa sobre el total de 
la materia seca. 
• De grano. Se desmorona al corte por su mayor contenido de sal y materia seca. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Mapa de la Sierra de Jalmich. Región de origen del queso Cotija, la parte coloreada de verde y 
marrón indica la zona delimitada de producción (Álvarez et al., 2005). 
INTRODUCCIÓN 
 
 
- 10 - 
 
 Proceso de elaboración 
El proceso de elaboración de queso Cotija (Figura 3), lo llevan a cabo los productores de 
acuerdo a sus costumbres y con ciertas prácticas de higiene, los pasos principales se 
describen brevemente a continuación: 
 
1. Ordeña. La leche empleada debe ser fresca, del día y provenir de vacas ordeñadas 
durante los meses de lluvia (junio a octubre). 
2. Filtrado. La leche se pasa por un cedazo limpio para eliminar partículas sólidas. 
3. Adición del cuajo. Una vez que la leche alcanza la temperatura óptima, entre 20-24 
°C, se le adiciona cuajo comercial de origen animal (aprox. 10 mL de cuajo/ 100 L de 
leche). 
4. Corte del cuajo. Una vez alcanzada la consistencia deseada, se corta en cuadros de 
un tamaño aproximado de 1 cm. 
5. Desuerado. La mezcla del suero y cuajada se dejan reposar hasta que la cuajada 
cortada se asiente en el fondo del recipiente y se separe del suero. 
6. Salado. La sal es incorporada directamente a la cuajada drenada, es mezclada 
manualmente; generalmente se emplea sal de grano elaborada artesanalmente en el 
estado de Colima. La cantidad adicionada varía entre 138 y 140 g por cada 20 L de 
leche. 
7. Moldeado. La cuajada se coloca envuelta en yute o ixtle (fibra de maguey) dentro de 
un molde de acero inoxidable de forma cilíndrica para obtener la presentación 
tradicional, cuyas dimensiones son 40 cm de diámetro y 18 cm de altura, con un peso 
de alrededor de 20 kg. 
8. Prensado. Se realiza durante 18 a 24 horas de manera rústica con piedras de 50 a 
90 kg. 
9. Oreado. La pieza se voltea diariamente hasta que deja de escurrir suero durante 15 
días o hasta que adquiere la firmeza necesaria para poder ser manipulada. 
10. Madurado. El queso se voltea diariamente alternando la cara expuesta al medio 
durante los 3 primeros meses (Álvarez et al., 2005; Cortés, 2009). 
 
INTRODUCCIÓN 
 
 
- 11 - 
 
Figura 3. Diagrama general del proceso de elaboración de queso Cotija. 
 
 
Como se observa en la Figura 3, durante la elaboración de queso Cotija no hay ningún 
tratamiento térmico que garantice la inocuidad de éste. Al igual que en varios alimentos, 
se han empleado diferentes métodos de identificación microbiana tanto dependientes 
como independientes de cultivo, que ayuden a establecer la microbiota nativa y las 
interacciones que pueden presentarse entre estos. Por otro lado, se resalta en 
mayúsculas el proceso de salado, debido a que hay reportes de que éste influye en la 
microbiota final de los quesos (Ishikawa et al., 2007; García, V., 2010). 
 
Uno de los grupos más importantes de bacterias para la industria de alimentos y por 
tanto, en la elaboración del queso, son las bacterias ácido lácticas (BAL) debido a que 
se ha estudiado ampliamente su capacidad fermentativa y propiedades benéficas para el 
hombre, por lo que se les conoce como GRAS por su denominación en inglés (Generally 
Recognized As Safe). Es por ello que su correcta identificación es de especialimportancia tecnológica, ecológica y desde el punto de vista de seguridad (Temmerman 
et al., 2004). 
INTRODUCCIÓN 
 
 
- 12 - 
 
 TÉCNICAS EMPLEADAS PARA IDENTIFICAR MICROORGANISMOS EN 
ALIMENTOS 
 
El estudio de los alimentos para determinar la presencia, tipos y cantidades de 
microorganismos y/o sus productos, es básico para la microbiología de alimentos. A 
pesar de ello, ninguno de los métodos empleados comúnmente permite la determinación 
exacta de tipo de microorganismos presentes. Aunque algunos métodos de análisis son 
mejores que otros, cada uno tiene sus limitaciones (Jay, 2005). 
 
Al igual que en otros campos de la microbiología, la identificación de la microbiota en el 
queso puede evaluarse a través del uso de cualquiera de los métodos dependientes e 
independientes de cultivo (Jany y Barbier, 2008). 
 
 
 Métodos dependientes de cultivo 
Consisten en aislar y cultivar microorganismos antes de su identificación de acuerdo a 
sus características morfológicas, fisiológicas, bioquímicas (patrones de fermentación de 
carbohidratos) y perfil proteínico. En general, estos métodos son menos costosos 
comparado con los genotípicos. Sin embargo, consumen mucho tiempo debido a las 
técnicas elaboradas y los largos periodos de cultivo, así mismo, poseen una baja 
resolución taxonómica ya que sólo es posible identificar en la mayoría de los casos hasta 
género, limitando mucho el estudio (Temmerman et al., 2004). 
 
Por otro parte no es posible monitorear la dinámica de todas las comunidades 
microbianas durante la manufactura y maduración del queso. Además, especies que se 
encuentran en baja concentración son poco competitivas in vitro al lado de aquellas con 
mayor abundancia numérica (Jany y Barbier, 2008). 
 
 
 
INTRODUCCIÓN 
 
 
- 13 - 
 
Algunas bacterias poseen requerimientos especiales para crecer incluyendo la necesidad 
de algunos nutrientes, pH, temperaturas de crecimiento y niveles de oxígeno específicos 
que no son proporcionados por los medios de cultivo que se emplean generalmente. El 
crecimiento también puede verse afectado por la secreción de bacteriocinas de otras 
bacterias en los cultivos mixtos o por algunos compuestos antibacterianos propios del 
medio (Vartoukian et al., 2010). Por consiguiente, si las condiciones de cultivo son pobres 
y el número de aislamientos bajo, no se tendrá un número representativo de la 
comunidad, y la diversidad microbiana puede ser subestimada. 
 
Debido a dichos inconvenientes, los estudios se han centrado en los métodos 
independientes de cultivo, los cuales se basan en un análisis directo de ADN (o ARN) sin 
ningún paso previo de cultivo (Jany y Barbier, 2008), lo cual es una gran ventaja porque 
estos son independientes de las variaciones en las condiciones de crecimiento 
(Temmerman et al., 2004). 
 
 
 Métodos independientes de cultivo 
Estos métodos siguen protocolos donde el ADN (o ARN) es extraído directamente de la 
matriz alimentaria. Ya que son más rápidos y potencialmente más exhaustivos, son 
adecuados para analizar las comunidades microbianas a través del tiempo y 
proporcionan la posibilidad de explorar la dinámica de la microbiota del queso en detalle. 
A través de estos, es posible distinguir microorganismos a nivel de género y especie 
(Jany y Barbier, 2008). 
 
 
 
 
 
 
 
INTRODUCCIÓN 
 
 
- 14 - 
 
 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 
Muchos de estos métodos se basan principalmente en la Reacción en Cadena de la 
Polimerasa (PCR), la cual permite la rápida generación de grandes cantidades de 
secuencias específicas de ADN que son fáciles de purificar y menos dañadas (Clark, 
2005), por medio del uso de cebadores bajo condiciones de reacción controladas. Los 
amplicones obtenidos pueden ser secuenciados para la identificación del microorganismo 
(Temmerman et al., 2004). 
 
Los componentes involucrados en la reacción son: 
1. La molécula original de ADN que va a ser copiada, llamada templado, la cual contiene 
el segmento que va a ser amplificado, al que se le denomina secuencia blanco. Una 
cantidad pequeña (100-200 ng) de ADN templado es suficiente. 
2. Dos cebadores, los cuales son necesarios para iniciar la síntesis de ADN. Estos son 
pequeños fragmentos de ADN de cadena simple que coinciden con los extremos de la 
secuencia blanco del ADN. 
3. La enzima ADN polimerasa, la cual es indispensable para fabricar las copias de ADN. 
Dado que la PCR involucra varios pasos con altas temperaturas, se debe utilizar una 
enzima resistente al calor. Éstas provienen originalmente de bacterias que viven en 
aguas termales a temperaturas mayores a 90 ºC. 
4. Un suministro de desoxiribonucleótidos trifosfato (dNTP’s) es requerido por la 
polimerasa para generar el nuevo ADN. 
 
Otros componentes importantes son: el amortiguador de reacción, iones (magnesio, 
manganeso, potasio), albúmina, los cuales son fundamentales para la optimización de la 
reacción, ya que promueven la estabilidad de la polimerasa, incrementan la hibridación y 
la especificidad de la reacción, además de que algunos disminuyen los posibles 
inhibidores que aún existan como agentes quelantes. 
 
 
 
INTRODUCCIÓN 
 
 
- 15 - 
 
Una vez contando con todos los componentes, los pasos a seguir son (Figura 4): 
1. Un calentamiento por encima de 90 ºC por un minuto o dos con el fin de separar las 
hebras del ADN templado (Desnaturalización). 
2. Posteriormente hay una disminución en la temperatura a alrededor de 50 ºC a 60 ºC, 
permitiendo que los cebadores se unan a sus secuencias complementarias 
específicas en las hebras del templado (Alineación). 
3. Por último, la temperatura se mantiene en 68-72 ºC por un minuto o dos, dependiendo 
de la enzima utilizada, para que la polimerasa comience a elongar las nuevas hebras 
a partir de los cebadores (Extensión). 
4. El ciclo de eventos se repite en varias ocasiones (Clark, 2005). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Pasos de la PCR (www.biodist.com). 
 
 
http://www.biodist.com/�
INTRODUCCIÓN 
 
 
- 16 - 
 
Para la identificación de microorganismos, en procariontes la región que usualmente se 
amplifica es el ARN ribosómico (ARNr) 16S (Jany y Barbier, 2008), el cual es un 
poliribonucleótido de aproximadamente 1,500 pares de bases, codificado por el gen 
denominado ADN ribosomal 16S (ADNr 16S), a partir de cuya secuencia se puede 
obtener información filogenética y taxonómica bacteriana caracterizando la comparación 
de secuencias parciales o del gen completo (Rodicio, 2004) ya que presenta una 
extraordinaria homogeneidad entre especies (Jany y Barbier, 2008). 
 
El ARNr es un marcador universal bien conservado con funciones constantes y 
altamente definidas que se establecieron en etapas tempranas de la evolución, éste no 
se ve relativamente afectado por el ambiente (Mohania et al., 2008). El gen comprende 9 
regiones hipervariables, V1-V9 (Figura 5), que exhiben una considerable diversidad de 
secuencias entre especies. Estas regiones están flanqueadas por secuencias 
conservadas que sirven como anclas para los pares de cebadores universales o 
específicos empleados (Jany y Barbier, 2008). 
 
Sin embargo, existen algunos inconvenientes en su uso. Algunos de ellos son que a 
pesar de que es una herramienta poderosa y el gen es un marcador universal, distintos 
tipos de bacterias tienen diferente número de copias de éste; así mismo, la 
secuenciación de los genes ribosomales depende en gran medida de la confiabilidad y la 
cobertura taxonómica de las bases de datos disponibles; adicionalmente, la variación 
entre cepas y en la secuencia del inter-operon, en algunos casos, pueden generar 
confusiones en los resultados de la identificación (Temmerman et al., 2004). 
 
 
 
 
 
 
 
INTRODUCCIÓN 
 
 
- 17 - 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Estructura secundaria del gen 16S ARNr(Rodicio, 2004). Las regiones relativamente 
conservadas se presentan en líneas gruesas. Las regiones variables, en líneas finas, se designan V1-V9, 
teniendo en cuenta que V4 es exclusiva de eucariotas. Las regiones que se muestran en líneas 
discontinuas sólo están presentes en un número limitado de estructuras. 
 
La PCR también puede verse afectada por la creación de “artefactos” como (a) la 
formación de heteroduplexes, que surgen en los últimos ciclos de la PCR cuando la 
concentración de cebadores disminuye y la concentración de productos es lo 
suficientemente elevada para competir con la alineación de los cebadores y (b) formación 
de amplicones quiméricos, esto se presenta cuando hay competencia por la alineación 
entre cebadores con extensión incompleta y los cebadores originales cuando la 
concentración de los primeros es alta o cuando la concentración de ADN templado es 
bastante grande que permite la re-alineación de los templados antes o durante la 
extensión de los cebadores. 
 
 
INTRODUCCIÓN 
 
 
- 18 - 
 
Los artefactos pueden generar señales adicionales que no corresponden a genotipos de 
la muestra. Estos pueden ser minimizados utilizando un número menor de ciclos 
(Kanagawa, 2003). 
 
La amplificación del ADNr 16S ó segmentos de éste contenidos en una muestra de ADN 
obtenido a partir de una población de diferentes microorganismos generará amplicones 
del mismo tamaño pero que difieren en su secuencia. Uno de los métodos más utilizados 
en la actualidad para la separación de amplicones con mismo tamaño, es la 
Electroforesis en Gel con Gradiente Desnaturalizante (DGGE), por medio de la cual se 
han estudiado comunidades microbianas complejas de diferentes ambientes (Muyzer et 
al., 1993) y ha sido utilizada ampliamente para describir la diversidad bacteriana en 
quesos (Jany y Barbier, 2008). 
 
 
 Electroforesis en Gel con Gradiente Desnaturalizante (DGGE) 
Esta técnica hace uso del principio fisicoquímico de la unión de los pares de bases del 
ADN: el par adenina-timina presenta dos enlaces de hidrógeno, mientras que el de 
guanina-citosina es más fuerte con tres enlaces de hidrógeno (Green et al., 2009). Por lo 
cual, se presentan diferentes patrones de migración de las cadenas parcialmente 
desnaturalizadas del ADN en geles de poliacrilamida cuando son sometidas a un 
gradiente desnaturalizante que se incrementa de forma lineal (empleando generalmente 
una mezcla de urea y formamida) (Muyzer et al., 1993). 
 
Como resultado del cambio conformacional de la doble cadena a cadena sencilla, el 
paso del ADN a través del gel se ve drásticamente disminuido hasta que finalmente se 
detiene (Temmerman et al., 2004). De esta forma las variaciones particulares de cada 
fragmento de secuencia determinarán diferentes patrones de migración en el gel, como 
se observa en la Figura 6, provocado por el gradiente desnaturalizante y por lo tanto, 
pueden ser separadas de manera efectiva mediante este método (Muyzer et al., 1993). 
 
INTRODUCCIÓN 
 
 
- 19 - 
 
Con el fin de aumentar el número de cambios en los pares de bases que se pueden 
distinguir y para evitar la completa desnaturalización de los productos de PCR, se puede 
incorporar durante ésta una secuencia entre 30 y 50 pares de bases rica en G + C, la 
cual se conoce como grapa-GC, en uno de los extremos de alguno de los cebadores 
para que se modifique el comportamiento en la desnaturalización del fragmento de 
interés, lo que asegura que los productos de PCR no se desnaturalizan por completo 
durante el análisis (Figura 6). De este modo se pueden detectar cerca del 100% de todas 
las posibles variaciones de la secuencia (Myers et al., 1985; Sheffield et al., 1989; 
Temmerman et al., 2004). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Principio de DGGE, los productos de PCR que comparten la misma longitud son separados por 
electroforesis de forma dependiente a su secuencia con base en el contenido de G-C. El incremento del 
gradiente desnaturalizante a lo largo del gel le confiere al ADN pasar de doble cadena a cadena sencilla 
por medio de dominios de fusión lo cual disminuirá su movilidad (y por tanto su posición en el gel). Una 
grapa de GC unida al extremo 5’ de uno de los cebadores previene a los productos de una total 
desnaturalización. Diferentes secuencias darán origen a distintos dominios de fusión y en consecuencia 
diferentes posiciones en el gel donde el ADN se detiene (Temmerman et al., 2004). 
INTRODUCCIÓN 
 
 
- 20 - 
 
El DGGE podría ser utilizado para distinguir dos moléculas de ADN que difieren por lo 
menos en la sustitución de una sola base. Por este método es posible detectar 
aproximadamente 50% de todos los posibles cambios de una sola base en fragmentos 
de ADN que oscilan entre 50 a 1000 pares de bases. 
 
Una de las ventajas de esta técnica es que los amplicones pueden ser extraídos 
directamente del gel y secuenciados (Jany y Barbier, 2008). Así mismo, se considera una 
técnica útil para monitorear los cambios en la dinámica de mezclas de poblaciones 
bacterianas a través del tiempo (Mohania et al., 2008). No obstante, una identificación 
confiable de la secuenciación puede ser obstaculizada por el tamaño pequeño de los 
productos de PCR, que posiblemente no contengan suficiente información para una 
precisa clasificación taxonómica. Cabe señalar que diferentes secuencias pueden tener 
un patrón de movilidad idéntico, resultando en una comigración de diferentes fragmentos 
(Justé et al., 2008). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ANTECEDENTES 
 
 
- 21 - 
 
III. ANTECEDENTES 
 
Entre los microorganismos más estudiados se encuentran las bacterias ácido lácticas 
(BAL), por ser consideradas benéficas para los humanos. Se encuentran ampliamente 
distribuidas en la naturaleza y pueden aislarse de granos, plantas, vegetales 
fermentados, la mucosa de animales, productos lácteos y cárnicos; además de productos 
marinos como son algas, mariscos y pescados. Sin embargo, a pesar de la amplia 
información disponible de las BAL, son pocos los estudios de las BAL de origen marino. 
 
Las BAL de origen marino pueden tener un mejor potencial que el de las cepas terrestres 
debido a los nutrientes que proporcionan los biotipos marinos para permitir el crecimiento 
de las BAL, así como los ambientes extremos que existen. Por lo que este tipo de 
microorganismos y sus productos probablemente tengan la capacidad de ser aplicados 
en el procesamiento de alimentos, en la fermentación, en la industria farmacéutica y 
biopolímeros. 
 
Las bacterias pertenecientes a las familias Firmicutes, Cytophaga, Spirochaetes y 
Proteobacteria son abundantes en sedimentos marinos profundos. No obstante, sólo 
algunas cepas de BAL de origen marino son conocidas. Algunas de las especies que se 
han logrado aislar e identificar son: Carnobacterium funditum y C. alterfunditum (aislada 
de un Lago en Antártida), Marinilactobacillus psychrotolerance (aisladas de organismos 
vivos y muertos de la Península de Miura, Japón), Halolactibacillus halophilus y H. 
miurensis (Japón), y Trichococcus patagoniensis (Chile) principalmente (Kathiresan y 
Thiruneelakandan, 2008). 
 
Algunos de estos microorganismos han sido aislados de quesos y podrían participar 
durante su maduración. Varios autores reportan la presencia de Marinilactobacillus 
psychrotolerans en quesos madurados de pasta blanda (Maoz et al., 2003; Feurer et al. 
2004; Bockelmann et al., 2005). 
 
ANTECEDENTES 
 
 
- 22 - 
 
Ishikawa y colaboradores (2007) mencionan que este tipo de bacterias provenientes de 
ambientes marinos son añadidas al queso a través de la sal que se utiliza durante su 
elaboración, las cuales han encontrado un nicho en términos de salinidad, pH, 
temperatura, fuente de carbono y nutrientes orgánicos. 
 
En el grupo de trabajo, en 2009, Zúñiga identificó este mismo género en un estudiode la 
microbiota de queso Cotija en diferentes etapas de maduración al igual que García 
(2010), justificando este hallazgo por el uso de sal de mar durante su elaboración. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
JUSTIFICACIÓN 
 
 
- 23 - 
 
IV. JUSTIFICACIÓN 
 
En el equipo de trabajo se han logrado aislar BAL a partir de muestras de un queso 
madurado artesanal mexicano, las cuales pertenecen a los géneros Enterococcus y 
Lactobacillus, principalmente. Llama la atención su presencia en este producto, ya que se 
caracteriza por tener un alto contenido de sal, lo que indicaría una naturaleza halófila en 
los microorganismos presentes y, dada la importancia que tienen las BAL halófilas, es 
interesante su identificación para realizar estudios posteriores de aplicación de las 
mismas en diferentes áreas. 
 
Por otra parte, algunos resultados sugieren que la etapa donde se lleva a cabo la mayor 
inoculación de estos es durante el salado (García, 2010). Es por ello que en este estudio 
se pretende identificar BAL halófilas presentes en queso Cotija añejo y en la sal 
empleada como materia prima en su proceso de elaboración, con el fin de establecer si 
éstas provienen de la sal de mar y si se conservan hasta que el queso está madurado. 
 
El aislamiento de microorganismos de identidad desconocida a partir de ambientes no 
convencionales es complicado debido al desconocimiento de sus requerimientos 
nutricionales y condiciones de cultivo, por tanto la investigación de la ecología microbiana 
de este queso y la sal con que se elabora requiere de la utilización de métodos 
independientes de cultivo. Como ya se mencionó, estos se basan principalmente, en el 
análisis del ADN aislado directamente de la matriz del alimento, a través de la técnica de 
PCR, una posterior separación electroforética (DGGE) y secuenciación de los 
amplicones. En este caso, se emplearán cebadores específicos para el género 
Firmicutes previamente reportados en un estudio donde se identificaron BAL en 
sedimentos marinos de la costa de Yucatán (Rojas et al., 2008). 
 
 
 
 
JUSTIFICACIÓN 
 
 
- 24 - 
 
Existe una posible aplicación biotecnológica de los hallazgos de este trabajo, ya que una 
vez conocida la identidad de las BAL halófilas, se podrían diseñar medios de cultivo que 
permitan su aislamiento, estudio y selección, para poder utilizarlas en la elaboración de 
alimentos donde predomine un alto contenido de sal o en ambientes con actividad 
acuosa baja. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 
 
 
 
- 25 - 
 
V. HIPÓTESIS 
 
Si durante el salado se incorporan bacterias ácido lácticas halófilas al producto, 
entonces, éstas se encontrarán tanto en la sal utilizada como materia prima, como en 
el queso Cotija, y por su naturaleza halófila podrán encontrarse en el producto 
madurado. 
 
VI. OBJETIVOS 
General 
 Identificar las bacterias ácido lácticas halófilas presentes en muestras de queso 
Cotija y compararlas con las presentes en la sal empleada en su elaboración. 
Particulares 
 Extraer ADN directamente de 6 muestras diferentes de queso Cotija con 3 meses 
de maduración. 
 Extraer ADN de un cultivo enriquecido de una muestra de sal de grano empleada 
en la elaboración del queso Cotija. 
 Llevar a cabo reacciones de PCR con cebadores específicos para una región del 
gen ribosomal 16S que permite identificar individuos de la familia Firmicutes. 
 Emplear la técnica de DGGE para separar los amplicones obtenidos. 
 Secuenciar e identificar las bandas presentes en cada muestra. 
 Comparar los resultados obtenidos de la huella obtenida para cada queso y para 
la sal. 
 
 
 
METODOLOGÍA 
 
 
- 26 - 
 
VII. METODOLOGÍA EN DIAGRAMA DE FLUJO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
METODOLOGÍA 
 
 
- 27 - 
 
VIII. METODOLOGÍA 
 
 Muestras 
Se analizaron 6 muestras de queso Cotija provenientes de diferentes productores 
artesanales de la Sierra Jalmich (Tabla 1), las cuales se encontraban almacenadas a -70 
°C, una muestra de sal de grano artesanal de la costa de Colima empleada para la 
elaboración del queso Cotija y dos muestras de sal de grano comercial, Sal Cisne (Sales 
del Itsmo, S. A. de C. V., Coatzacoalcos, Veracruz) y Mar de Cortés (Sales del Valle S. A. 
de C. V., Cd. Obregón, Sonora). 
 
Tabla 1. Lugar de elaboración de las muestras de queso Cotija empleadas para el 
estudio. 
No. de muestra Lugar de Elaboración 
1 Rancho “El Saltrillo” (Cotija, Michoacán) 
2 Rancho “Piedra Amarilla” (Jilotlán de los Dolores, Jalisco) 
3 Rancho “La Plaza de Chávez” (Lourdes, Michoacán) 
4 Rancho “El Caracol” (Lourdes, Michoacán) 
5 Rancho “La Mesa del Aguacate” (Quitupán, Jalisco) 
6 Rancho “La Tortuga” (Jalisco) 
 
 Pre-enriquecimiento de microorganismos presentes en la sal 
Se colocaron 7 g de cada una de las muestras de sal en 100 mL de caldo nutritivo estéril, 
se incubaron durante 24 h a 37 °C con agitación orbital a 250 rpm (Innova 40, New 
Brunswick Scientific). 
 
 
 
METODOLOGÍA 
 
 
- 28 - 
 
 Enriquecimiento de microorganismos presentes en la sal 
Se tomó 1 mL del cultivo de pre-enriquecimiento de cada una de las muestras de sal y se 
colocó en 100 mL de medio MRS estéril, se incubaron durante 12 horas a 37°C con 
agitación orbital a 250 rpm. Una vez alcanzada una densidad óptica mayor a 0.7, se 
recuperó el paquete celular por centrifugación a 8500 rpm/15 min/ 4°C (Innova 40, New 
Brunswick Scientific). Posteriormente se procede a la extracción de ADN. 
 
 Recuperación del paquete celular a partir del queso 
Las muestras de queso Cotija se descongelaron en refrigeración a 4 °C por no más de 
18 h según lo establecido en la norma NOM-110-SSA1-1994 antes de ser utilizadas. 
Posteriormente se empleó el siguiente procedimiento experimental: 
1. Se pesaron en la campana de flujo laminar 15 g de cada una de las muestras 
dentro de bolsas para Stomacher (Seward). 
2. Se adicionó a cada muestra 50 mL de citrato de sodio al 2%, pH 8. 
3. Se homogenizó durante 2 min a alta velocidad dentro del Stomacher, para llevar a 
cabo una ruptura mecánica de la matriz del queso. 
4. Se adicionó 1 mL de solución de neutrasas (Novo Nordisk) dentro de la campana 
de flujo laminar, con el fin de romper la red proteínica del queso. 
5. Se mezcló a alta velocidad dentro del Stomacher durante 1 min. 
6. Se incubó durante 1 h a 100 rpm y 45 °C. 
7. Posteriormente se dividó la mezcla en 2 tubos estériles para centrífuga de 50 mL 
(Falcon). 
8. Se centrifugó a 3500 rpm durante 7 min a 4 °C para lograr separar las fracciones 
proteínica y grasa de las células de los microorganismos presentes en el queso. 
9. Se transfirió la fase intermedia, la cual contiene las células de los 
microorganismos, a un tubo de 50 mL estéril con ayuda de una micropipeta de 5 
mL. 
 10. Se centrifugó a 8500 rpm/5 min/ 4 °C. 
 11. Se desechó el sobrenadante y se lavó el pellet 3 veces con solución salina 0.85% 
 pH 7, se centrifugó en cada ocasión en las condiciones descritas en el punto 10. 
METODOLOGÍA 
 
 
- 29 - 
 
 12. Se re-suspendió el pellet en 1 mL de solución salina 0.85% pH 7, se transfirió a un 
 tubo de 2 mL (eppendorf). 
 13. Se centrifugó a 14000 rpm durante 10 min a 4 °C, se eliminó el sobrenadante. 
 Nota: Los paquetes celulares se almacenaron a -20 °C hasta su uso. 
 
 Extracción de ADN 
Se empleó un kit comercial de extracción y purificación de ADN (Fast ID®), basado en la 
ruptura celular con detergentes iónicos, la purificación se da por unión específica del 
ADN a una membrana de sílica. 
 
En resumen, el paquete celular obtenido del paso de enriquecimiento de la sal o del 
queso directamente, se trató con proteinasa K (10 mg/mL), solución de lisis (1 mL) y 
lisozima (~5-10 mg). Se incubó a 65 °C/ 600 rpm/30 min (Thermomixer, eppendorf). Se 
añadió cloroformo en relación 1:1, se agitó vigorosamente y posteriormente se centrifugó 
a 10000 rpm/ 5 min en una microcentrífuga (eppendorf). Se separó la fase acuosa 
superior transfiriéndola a un tubo eppendorf de 2 mL, se añadió buffer de unión en 
relación 1:1 y se transfirió a una columna que contiene la membrana de sílica. Se lavó la 
columna para eliminar sustancias que pudieran inhibir la reacción de PCR y por último se 
eluyó el ADN con buffer TE 1X a 65 °C. El ADN obtenido se conservó a -20 °C hasta su 
uso. Los pasos específicos se muestran en el Anexo I. 
 
 Análisis del ADN extraído 
Se verificó la pureza del ADN en geles de agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio (1 
µL/10 mL de agarosa)(Invitrogen), la electroforesis se llevó a cabo a 85 V por 45 min, 
utilizando como marcador el 100 bp DNA Ladder TrackIt™ de Invitrogen, se visualizó en 
el transiluminador de UV ColePalmer. La concentración se obtuvo midiendo la 
absorbancia a 260 y 280 nm en el espectro Biomate 3 (Thermo Scientific). 
 
 
 
METODOLOGÍA 
 
 
- 30 - 
 
 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 
Se amplificó una fragmento, aproximadamente 700 pb, del gen 16S del ADNr de 
bacterias ácido lácticas de la familia Firmicutes con los pares de cebadores 
FirR:1244/gcPedio2:64 (Invitrogen) (Tabla 2) empleados por Rojas et al. (2008), con los 
cuales identificó microorganismos provenientes de sedimentos marinos de la costa de 
Yucatán. 
 
Tabla 2. Secuencias y posiciones de los cebadores usados. 
Cebadores Secuencia 5’ → 3’ Posición Orientación 
Pedio2:644* GATTTATTGGGCGTAAAGCGA 562-581 Directa 
FirR:1244a TAGCCCARGTCATAAGGGGCATG 1239-1259 Reversa 
*Para realizar el DGGE se le adicionó una grapa de GC descrita por Muyzer, et al., 1993, 
(CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG). a Cebador degenerado: R = A o G. 
 
Las concentraciones y volúmenes requeridos de cada reactivo para la PCR se presentan 
en la Tabla 3. 
 
Tabla 3. Lista de reactivos utilizados para la reacción de PCR. 
Orden Reactivo Conc. inicial Conc. final Volumen (µL) 25 µL rx 
3 Buffer Pfu + MgSO4 10X 1X 2.5 
4 MgCl2 50 mM 5 mM 2.5 
2 BSA 2% 0.2% 2.5 
5 dNTP’s 10 mM 0.2 mM 0.5 
6 Cebador F 10 µM 0.2 µM 0.5 
7 Cebador R 10 µM 0.2 µM 0.5 
8 ADN -------- ≈100 ng ------- 
9 Pfu 2.5 U/µL 1.25 U/µL 0.25 
1 Agua -------- -------- cbp 25 µL 
Nota: Todos los reactivos se mantuvieron en hielo hasta su uso. 
METODOLOGÍA 
 
 
- 31 - 
 
La amplificación se realizó en el termociclador (MAXYGENE, AXYGENE), en la Tabla 4 
se muestran las condiciones de la PCR para la amplificar el fragmento deseado del gen 
16S del ADNr. 
 
Tabla 4. Condiciones empleadas para la amplificación. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Se llevaron a cabo tres reacciones de 50 µL de cada una de las muestras. Para cada 
muestra se juntaron los tres volúmenes de reacción en un tubo eppendorf de 1.5 mL y se 
concentraron hasta alcanzar un volumen aproximado de 50 µL en el concentrador de 
ADN/DNA PLUS. 
 
 Análisis de los amplicones 
Con el fin de verificar la presencia, peso y pureza de los amplicones obtenidos se 
corrieron geles de agarosa al 1.5% teñidos con bromuro de etidio (1 µL/10 mL de 
agarosa) (Invitrogen), la electroforesis se llevó a cabo a 80 V por 45 min, utilizando como 
marcador el 100 bp DNA Ladder TrackIt™ de Invitrogen, se visualizó en el 
transiluminador de UV ColePalmer. La concentración se obtuvo midiendo la absorbancia 
a 260 y 280 nm en el espectro Biomate 3 (Thermo Scientific). 
 
 
 
 
 
No. de ciclos Temperatura (°C) Tiempo 
1 94 3 min 
35 
94 30 s 
60 45 s 
72 2 min 
1 72 10 min 
METODOLOGÍA 
 
 
- 32 - 
 
 DGGE (Muyzer et al., 1993) 
Los amplicones obtenidos representan a los individuos presentes en la muestra de queso 
o en la sal. Los fragmentos amplificados tenían un tamaño muy similar (aprox. 700 pb), 
pero diferente secuencia, por lo que para separarlos se utilizó un gel con un gradiente 
desnaturalizante. Se empleó el equipo DCode™ Universal Mutation de BIORAD, con las 
condiciones descritas por Rojas et al. en 2008 (gradiente desnaturalizante entre 10 y 
35% en gel de poliacrilamida al 8% (donde el 100% de la solución desnaturalizante está 
compuesta por 8 M de urea y 40% de formamida), 60 °C, 80 V durante 16 h en buffer 
TAE 1X (40 mM Tris-HCl, 20 mM ácido acético, 1 mM EDTA, pH 8); así como las 
empleadas por Zúñiga en 2009 (gradiente desnaturalizante entre 30 y 70% en gel de 
poliacrilamida al 8% (donde el 100% de la solución desnaturalizante está compuesta por 
7 M de urea y 40% de formamida) a 60 °C, 85 V durante 17 h en buffer TAE 1X , con el 
fin de determinar con qué gradiente (urea-formamida) se obtenía una mejor separación 
de los amplicones. En ambos casos se cargaron 3 µg de muestra por carril. Los geles se 
tiñeron con el kit DNA Silver Staining, (GE, Healthcare) y digitalizados con el equipo 
Fluor-S a través del programa Quantity One versión 4 (BIORAD). La preparación de las 
soluciones se describe en el Anexo II. 
 
 Selección y tratamiento de las bandas 
Del patrón de bandeo obtenido se seleccionaron todas las bandas de la muestra de sal 
de grano artesanal, así como algunas de las bandas de las muestras de queso que 
coincidían con el patrón de la sal artesanal, y algunas otras de las muestras de sal 
comercial que presentaron un patrón diferente. 
 
Con el fin de recuperar el ADN contenido en cada una de las bandas, se siguió el 
protocolo descrito por Zúñiga en 2009, el cual consistió en cortar con bisturí estéril cada 
una y transferirla a un microtubo estéril de 2 mL, adicionarles 50 µL de agua desionizada 
filtrada estéril, pH 8; posteriormente se incubaron los tubos a 37 °C durante 1 h 
(Thermomixer, eppendorf) y fueron almacenados por un tiempo mínimo de 24 h a 4 °C. 
 
METODOLOGÍA 
 
 
- 33 - 
 
 Re-amplificación de ADN 
El ADN recuperado se concentró hasta obtener aproximadamente 10 ng/ µL. Se corrieron 
reacciones de 50 µL para la re-amplificación, la cual se realizó con la mezcla de reacción 
descrita en la Tabla 3, las condiciones de la reacción de PCR se mantuvieron a 
excepción de la Tm que fue de 53º C por el uso del cebador Pedio2:644 sin grapa. 
 
Cada reacción se concentró hasta aproximadamente 30 µL, éstas se cargaron en un gel 
de agarosa al 1.5% teñido con bromuro de etidio (1 µL/10 mL de agarosa) (Invitrogen), 
para verificar que sólo hubiera una banda, la electroforesis se llevó a cabo a 80 V por 45 
min, empleando como marcador el 100 bp DNA Ladder TrackIt™ de Invitrogen, las 
bandas se visualizaron en el transiluminador de UV ColePalmer y se cortaron las bandas 
que se encontraban en el peso deseado (Aprox. 700 pb), éstas se colocaron en 
microtubos de 1.5 mL para ser tratadas con el kit de purificación de Applied Science 
(Roche) y extraer el ADN (Anexo III). 
 
 Secuenciación 
Las muestras fueron secuenciadas por MACROGEN-Korea. 
 
 Análisis de secuencias 
Los alineamientos entre las secuencias directa y reversa se efectuaron con ayuda del 
programa DAMBE (Data Analysis in Molecular Biology and Evolution) (Xia y Xie, 2001) 
utilizando el algoritmo Clustal W y se realizó la comparación de las secuencias con el 
banco de datos de NCBI (National Center of Biotechnology Information), mediante el 
programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Ma et al., 2002) para nucleótidos. 
 
 
 
 
 
 
METODOLOGÍA 
 
 
- 34 - 
 
 Árbol filogenético 
Se construyó la relación filogenética existente entre los microorganismos identificados y 
otras secuencias similares obtenidas del programa BLAST, la cual fue inferida mediante 
el método Neighbor-Joining (Saitou and Nei, 1987). La distancia de la relación 
filogenética fue calculada usando el método Tamura-Nei, mediante el programa Mega 4 
(Tamura et al., 2007) a través de 1000 remuestreos.RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
 
- 35 - 
 
IX. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
 Análisis de cebadores utilizados 
El presente estudio fue planteado con el fin de identificar BAL halófilas en muestras de 
queso Cotija y sal, se utilizaron los cebadores descritos por Rojas et al. (2008), 
Pedio2:644-FirR:1244, ya que con ellos lograron identificar bacterias de este tipo 
provenientes de sedimentos marinos de la costa de Yucatán. Con el fin de determinar la 
región del gen 16S del ADNr en la cual se alineaban los cebadores así como corroborar 
su especificidad, se realizó un alineamiento de estos mediante el programa BLAST (Ma 
et al., 2002). Los datos obtenidos de esta búsqueda (realizada el 03 Marzo de 2010) se 
muestran en la Tabla 5, para fines prácticos sólo se presentan 3 microorganismos con los 
cuales se tuvo un porcentaje de 100% de identidad para cada uno de los cebadores con 
un valor de expectancia de 0, sin embargo, cabe destacar que todos los demás 
microorganismos con los que alinearon los cebadores también pertenecían a la familia 
Firmicutes (de los géneros Enterococos, Bacilos y Lactobacilos), se trataban de BAL y la 
mayoría con porcentajes elevados de tolerancia a concentraciones de NaCl con lo que 
aseguramos que las bacterias que se llegaran a identificar del queso Cotija serían BAL 
halófilas. 
 
Posteriormente mediante el programa MultAlin (Corpet, 1988) se alinearon 10 de los 
microorganismos del resultado del BLAST con ambos cebadores; se obtuvo que el 
cebador Pedio2:644 se unía entre región de pares de bases 576-596 y el cebador 
FirR:1244 entre 1219-1241. En la Figura 7, se muestra esquemáticamente con una flecha 
púrpura la ubicación de la región del ARNr 16S que puede ser amplificada con estos 
cebadores (final de la región V3 hasta la V8). El número aproximado de pares de bases 
del amplicón obtenido es de 665, amplificando de esta forma la tercera parte del gen 16S 
ARNr. Adicionalmente se muestran otros cebadores universales que se han empleado en 
otros estudios dentro del grupo de trabajo (Zúñiga, 2009; García, 2010). 
 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
 
- 36 - 
 
Tabla 5. Microorganismos cuya secuencia 16s ARNr tiene un 100% de identidad con los 
cebadores utilizados. 
Cebador Microorganismo Fuente de aislamiento 
Tolerancia a 
NaCl 
Pedio2:644 
Weissella koreensis 
Productos vegetales 
fermentados (Kimchi) de 
Corea 
8 a 10 % 
Lactobacillus sakei 
subsp. Carnosus 
 
Comida fermentada ≥6.5% 
Enterococcus 
faecalis 
Soya fermentada 6.5% 
FirR:1244 
Marinilactobacillus 
piezotolerans 
Sedimentos del subsuelo 
marino 
0-12% 
Halolactibacillus 
halophilus 
 
Organismos marinos de 
la costa de Japón 
7% 
Thalassobacillus 
devorans 
Hábitats hipersalinos del 
sur de España 
7.5-10% 
 Programa utilizado para el alineamiento: BLAST 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7. Esquema del gen 16S del ARNr, se muestran las regiones que pueden ser amplificadas con 
algunos cebadores universales: pA-gamma (V1) y 338f-518r (V3). También se muestra la región que puede 
amplificarse con los empleados en este estudio, Pedio2:644-FirR:1244 (final de la V3 hasta la V8). 
 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=165096�
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=214325�
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=214325�
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=306540�
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=306540�
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=279813�
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=279813�
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
 
- 37 - 
 
 Extracción de ADN 
En la Figura 8 se presenta un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio, en él se 
observó que el ADN extraído fue de calidad ya que sólo hay una banda definida en la 
mayoría de las muestras, no se presentó degradación del ADN (barrido por debajo de la 
banda). También se corroboró la pureza de las muestras con el índice de pureza al sacar 
el coeficiente de relación de A260/280nm (Tabla 6), el cual nos indica la proporción de ADN-
proteína, si es ≥1.8 indica que hay una concentración mínima de proteína en 
comparación a la de ADN. En este caso, los valores de la mayoría de las muestras se 
encuentran alrededor del valor esperado para este parámetro. 
 
La concentración obtenida para cada muestra se observa también en la Tabla 6, en el 
caso de las muestras de queso Cotija las concentraciones son más bajas en contraste 
con las obtenidas en las muestras de sal, esto se debe a que por un lado el ADN extraído 
de estas últimas fue de cultivos enriquecidos por lo que hay una mayor cantidad de 
microorganismos, mientras que las muestras de queso son matrices complejas en las 
que durante la extracción influyen varios factores como la homogenización, los 
macrocomponentes del alimento (caseína y grasa principalmente). Estos pueden 
absorber detergentes, agentes caotrópicos o quelantes que son necesarios para la 
extracción de los ácidos nucléicos, así como también es determinante una adecuada lisis 
celular de los microorganismos que puedan estar presentes (Jany y Baribier, 2008). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
 
- 38 - 
 
Tabla 6. Concentración de ADN de las muestras analizadas. 
Muestra A260nm A280nm Concentración (ng/µL) Relación A260/280 
1 0.854 0.580 31.55 1.768 
2 0.972 0.663 34.70 1.803 
3 0.389 0.260 12.75 2.04 
4 0.675 0.360 337.5 1.875 
5 2.057 1.520 83.2 1.499 
6 0.755 0.555 21.2 1.893 
7 2.246 1.557 99.9 1.526 
8 0.347 0.185 173.5 1.876 
9 0.557 0.328 278.5 1.698 
Muestras 1-3 y 5-7 corresponden a las muestras de queso Cotija, muestra 4 a la sal artesanal de Colima, 
muestras 8 y 9 a sal comercial, Cisne y Cortés, respectivamente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8. Muestras de ADN observadas en gel de agarosa al 1% (en Buffer TAE 1X) teñido con bromuro 
de etidio (1 µL/ 10 mL de agarosa) de las muestras de ADN, 85 V por 45 min. Los números representan 
cada una de las muestras evaluadas descritas en la Tabla 6. Brevemente, carril M: marcador de peso 
molecular (100 bp DNA Ladder TrackIt™, Invitrogen), carriles 1-3, 5-7 corresponden a muestras de queso 
Cotija, carril 4 a la sal artesanal de Colima y carriles 8 y 9 muestras de sal comercial, Cisne y Cortés, 
respectivamente. 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
 
- 39 - 
. 
 PCR 
Posteriormente ya determinada la concentración y calidad del ADN obtenido de cada 
muestra, se llevó a cabo la reacción de PCR partiendo en todos los casos de 100 ng de 
ADN para cada reacción. Los datos de las concentraciones de los amplicones, así como 
de los índices de pureza se presentan en la Tabla 7, en la cual se observa que se logró 
aumentar considerablemente la cantidad de ADN de todas las muestras, aunque a pesar 
de que se partió de la misma concentración no se tiene la misma cantidad para todas, lo 
que se podría justificar por la presencia de algunos inhibidores en la reacción. 
 
Tabla 7. Concentración de ADN de los productos de PCR de cada una de las muestras. 
Muestra A260nm A280nm 
Concentración 
(ng/µL) 
Relación 
A260/280 
1 1.598 1.057 761 1.551 
2 2.536 1.663 1200 1.571 
3 1.515 0.993 748 1.536 
4 2.174 1.425 1063 1.544 
5 1.879 1.255 935 1.501 
6 1.714 1.163 857.5 1.473 
7 1.666 1.178 811.5 1.430 
8 1.796 1.152 898 1.559 
9 1.591 1.030 795.5 1.545 
 
El tamaño esperado del amplicón era alrededor de 657 pb pero al utilizar la grapa, que 
era de 40 pb, el tamaño aproximado era de 700 pb, en la Figura 9 se muestran los 
amplicones obtenidos del peso esperado al observase una banda intensa cerca del 
marcador de 700 pb. 
 
 
 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
 
- 40 - 
Figura 9. Gel de agarosa al 1.5% (en Buffer TAE 1X) teñido con bromuro de etidio (1 µL/ 10 mL de 
agarosa) de los productos de PCR, 80 V por 45 min. Carril M: marcador de peso molecular(100 bp DNA 
Ladder TrackIt™, Invitrogen), carriles 1-3, 5-7 corresponden a muestras de queso Cotija, carril 4 a la sal 
artesanal de Colima y carriles 8 y 9 muestras de sal comercial, Cisne y Cortés, respectivamente. 
 
 
 DGGE 
Ya que en cada muestra amplificada se tiene ADN del mismo peso de diferentes 
microorganismos, se utilizó la técnica de DGGE para separar los amplicones obtenidos. 
Esta técnica permite, mediante el uso de agentes desnaturalizantes y la electroforesis, 
separar los fragmentos que tengan el mismo tamaño pero que difieren en su secuencia. 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
 
- 41 - 
 
Con el fin de elegir con qué gradiente se separaban mejor los amplicones, se probaron 
las condiciones descritas por Rojas et al. (2008), quien utilizó los mismos cebadores para 
aislar microorganismos halófilos (gel de poliacrilamida al 8% con gradiente 
desnaturalizante 10-35% a 60 °C, 80 V durante 16 h en buffer TAE 1X). Sin embargo, 
para estas muestras no se obtuvo ningún patrón de bandeo y sólo se logró observar una 
banda deforme al final de cada carril (Figura 10), lo cual indica que las muestras 
necesitan un gradiente más elevado porque el contenido de G-C de las muestras es 
diferente y más alto. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 10. Amplicones observados en gel DGGE de poliacrilamida al 8% con gradiente desnaturalizante 
10-35%, 60 °C, 80 V durante 16 h en buffer TAE 1X teñido con plata de los productos de PCR. Los carriles 
1-3, 5-7 corresponden a muestras de queso Cotija, carril 4 a la sal artesanal de Colima. 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
 
- 42 - 
 
Por otro lado también se probaron las condiciones utilizadas por Zúñiga en el 2009, la 
cual trabajó con muestras de queso Cotija. En comparación con las empleadas por Rojas 
et al. en el 2008, el gradiente desnaturalizante descrito era más alto (30-70%). La 
electroforesis duró 12 h a 85 V. Se lograron observar dos grupos de bandas intensas en 
todos lo carriles; sin embargo, no hubo una buena separación ni definición de las bandas 
cercanas (Figura 11). 
 
Se decidió por tanto emplear un gradiente entre 40-60% que es en donde se observó en 
la Figura 11 que se encuentran la mayoría de las bandas, con el fin de lograr una mejor 
separación de éstas para cortarlas y extraer el ADN e identificar a los microorganismos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 11. Huella génica observa en gel de poliacrilamida al 8% con gradiente desnaturalizante 30-70%, 
60 °C, 85 V por 12 h teñido con plata. Los carriles 1-3, 5-7 corresponden a muestras de queso Cotija, carril 
4 a la sal artesanal de Colima. 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
 
- 43 - 
 
El perfil de bandas obtenido en el gel de poliacrilamida con gradiente desnaturalizante 
40-60% se muestra en la Figura 12, se observa que se logró una mejor separación de los 
amplicones de las muestras. La huella génica obtenida de la muestra de sal artesanal 
utilizada para la elaboración del queso Cotija (carril 4) es similar a la encontrada en las 
muestras de queso Cotija (carriles 1, 2, 3, 5, 6 y 7), mientras que otras muestras 
comerciales de sal (carriles 8 y 9) presentan un patrón distinto por lo que podría 
responderse parcialmente a la hipótesis planteada, ya que al conocer el fundamento de 
la técnica de DGGE se espera que los amplicones que migran a la misma altura 
correspondan a un mismo microorganismo. Dado lo anterior, podemos decir que el tipo 
de sal empleado influye dentro de la microbiota del queso Cotija. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 12. Perfil de DGGE de los productos de PCR teñido con plata. Gel de poliacrilamida al 8%, 60 °C 
por 12 h. Los carriles corresponden a las muestras descritas en la Tabla 6. Los carriles 1-3, 5-7 
corresponden a muestras de queso Cotija, carril 4 a la sal artesanal de Colima y carriles 8 y 9 muestras de 
sal comercial, Cisne y Cortés, respectivamente. 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
 
- 44 - 
 
 Selección de las bandas e Identificación Molecular 
Una vez obtenido el patrón de bandeo de todas las muestras, se decidió seleccionar 5 
bandas pertenecientes a la muestra de sal artesanal (carril 4, Figura 12) ya que al poseer 
las muestras de queso Cotija el mismo patrón de bandeo, se esperaba que los 
microorganismos identificados provinieran de ésta. Para confirmar lo anterior se decidió 
seleccionar solamente aquellas bandas de las muestras de queso que se veían más 
definidas y concentradas y que migraban igual que las seleccionadas en la sal, dado que 
es costosa la secuenciación de todas las bandas. 
 
 En el caso de las muestras de sal comercial sólo se seleccionaron las de la muestra 8 
porque la muestra 9 presentó un perfil de bandeo similar. De la muestra 8 se 
seleccionaron 3 bandas, dos de ellas no se encontraron en ninguna de las muestras de 
queso ni sal artesanal y, se seleccionó una banda que tenía una migración igual a otra 
encontrada en quesos y sal artesanal. En la Figura 12 se muestran marcadas () las 
bandas que fueron seleccionadas del gel con gradiente desnaturalizante 40-60%. 
 
En la Tabla 8, se muestran los microorganismos con los que presentaron mayor identidad 
las bandas seleccionadas. Por las características de éstos se corrobora la especificidad 
de los cebadores empleados, ya que todos se tratan de bacterias de la familia Firmicutes 
y la mayoría son BAL halófilas. 
 
Por su parte, en la Figura 13 se marcan con el mismo color las bandas identificadas 
como el mismo microorganismo. Para la muestra de sal artesanal sólo se lograron 
secuenciar 3 de las 5 bandas (carril 4, bandas F, G, H), las cuales fueron identificadas 
todas como Enterococcus asini (color amarillo), al igual que las bandas A, D, E e I 
provenientes de queso, así como K y M de sal comercial. Por otra parte se identificó la 
banda B de la muestra de queso 1 como Vagococcus carniphilus (color rosa) y la C como 
Lactobacillus sakei o L. curvatus (color azul). 
 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
 
- 45 - 
 
Las bandas J (carril 7, muestra de queso) y L (carril 8, muestra de sal comercial) 
corresponden a Enterococcus termitis o E. haemoperoxidus (color verde). La banda F 
seleccionada de la muestra de sal artesanal presenta la misma identidad (E. asini) que 
las bandas A, D e I de los carriles 1, 5 y 7, respectivamente, correspondientes a muestras 
de queso, lo cual concuerda con lo esperado, es decir que las bandas que migraran a la 
misma altura se supondría que se tratasen del mismo microorganismo. Por su parte, 
también en el caso de las bandas E de queso y K de sal comercial, se observó que 
presentaban la misma distancia de migración y se identificaron también como E. asini, 
aunque la distancia no corresponde a la que presentó la banda F. 
 
Tabla 8. Identidad de las bandas seleccionadas del DGGE por secuenciación y 
alineamiento con el GenBank™ a través del programa BLAST. 
Banda* Identidad %ID E 
A Enterococcus asini 98% 0 
B Vagococcus carniphilus 97% 0 
C Lactobacillus sakei/L. curvatus 97% 0 
D Enterococcus asini/E. termitis 98% 0 
E Enterococcus asini/E. termitis 97% 0 
F Enterococcus asini/E. termitis 97% 0 
G Enterococcus asini 98% 0 
H Enterococcus asini 98% 0 
I Enterococcus asini 98% 0 
J Enterococcus termitis/E. haemoperoxidus 98% 0 
K Enterococcus asini/E.termitis 97% 0 
L Enterococcus termitis/E. haemoperoxidus 97% 0 
M Enterococcus asini/E. termitis 97% 0 
 *Las letras corresponden a las bandas marcadas en la Figura 13. %ID = Porcentaje 
 de identidad. E = Valor de expectancia. 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
 
- 46 - 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 13. Identificación de bandas obtenidas en DGGE. Los carriles 1-3, 5-7 corresponden a muestras de 
queso Cotija, carril 4 a la sal artesanalde Colima y carriles 8 y 9 muestras de sal comercial, Cisne y Cortés, 
respectivamente. Las letras y recuadros muestran a las bandas que fueron identificadas por secuenciación. 
Los microorganismos identificados por BLAST se diferencian por colores. Amarillo: Enterococcus asini, 
Verde: Enterococcus termitis, Rosa: Vagococcus carniphilus, Azul: Lactobacillus sakei. 
 
Sin embargo, contrario a lo anterior, no se presentó este comportamiento para la banda 
G (E. asini) de la sal artesanal, ya que para las bandas B y J de quesos que migraron a la 
misma distancia se obtuvieron identidades diferentes (V. carniphilus y E. termitis, 
respectivamente). 
 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
 
- 47 - 
 
La banda C de la muestra 1 de queso la cual se identificó como L. sakei o L. curvatus, no 
se logró corroborar que proviniera de la muestra de sal artesanal, debido a que la banda 
que migró a la misma distancia (Figura 12) de esta última, se perdió durante el proceso y 
no se pudo mandar a secuenciar. 
 
Finalmente, las bandas L y M del carril 8 (Figura 13) de sal comercial (Cisne) se 
identificaron inesperadamente como E. termitis y E. asini respectivamente. Dado que 
estas bandas tenían una distancia de migración no encontrada en las muestras de queso 
y sal artesanal se esperaba identificar otros microorganismos halófilos. 
 
Los resultados obtenidos nos llevan a plantear los problemas asociados a la metodología 
de DGGE. Uno de ellos es la comigración de las bandas, lo cual no siempre indica que 
se trate del mismo genotipo (Burr, et al., 2006), caso que observamos para las bandas B, 
G y K (Figura 13). Otro inconveniente que se presentó fue el haber identificado E. asini 
en diferentes bandas que migraron a distintas alturas, lo que se puede explicar por la 
presencia de diferentes copias del gen 16S ARNr que generalmente se dan en respuesta 
a la disponibilidad de recursos nutricionales y las condiciones de estrés del ambiente 
(Klappenbach et al., 2000), en este caso serían las elevadas concentraciones de sal 
(~6.2% en el queso). 
 
En la Tabla 9, se muestran los lugares de los cuales han sido aislados los 
microorganismos identificados en el queso, así como el porcentaje óptimo de NaCl al 
cual pueden crecer. Son casi nulos los reportes que existen de los tres primeros 
microorganismos reportados en la tabla (E. asini, E. termitis y E. haemoperoxidus) ya que 
son microorganismos relativamente nuevos; no hay reportes de su presencia en 
productos lácteos, de hecho los lugares donde fueron aislados poseen características 
muy distintas a las del queso Cotija, lo que hace novedosa su existencia en este producto 
que además posee una elevada concentración de sal (queso Cotija) y, por ejemplo, 
según Vaux et al. (1998) E. asini no crece a concentraciones ≥6.5% de NaCl y en el 
presente estudio se identificó su crecimiento a una concentración de 7%. 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
 
- 48 - 
 
La presencia de la especie L sakei ha sido reportada antes en alimentos fermentados con 
un alto contenido de NaCl (Hüfner et al., 2007) por lo que no es extraño encontrarla en el 
queso Cotija. 
 
Tabla 9. Características de los microorganismos identificados. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Vagococcus carniphilus se ha reportado en carne molida de res y también en un estudio 
previo realizado en el grupo de trabajo en queso Cotija por Zúñiga en el 2009, donde se 
señala al microorganismo como una población constante dado que se encontró en todas 
las fases de maduración y como una población no dominante. La identificación de este 
microorganismo en queso durante este estudio corrobora lo encontrado por Zúñiga. 
Adicionalmente no existen otros reportes de alimentos fermentados semejantes al queso 
Cotija donde se haya encontrado este género. 
 
 
 
 
Microorganismo Aislado de… % NaCl Referencia 
Enterococcus asini 
Intestino de 
burros 
 6.5% NaCl Vaux et al., 1998 
Enterococcus 
termitis 
Intestino de 
termita 
 6.5% NaCl Svec et al., 2006 
Enterococcus 
haemoperoxidus 
Agua para 
beber/alberca 
 6.5% NaCl Svec et al., 2001 
Lactobacillus sakei 
Alimentos 
fermentados 
 9% NaCl Hüfner et al., 2007 
Vagococcus 
carniphilus 
Carne molida de 
res 
 6.5% NaCl 
Shewmaker et al., 
2004 
Zúñiga, 2008 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
 
- 49 - 
 
La presencia de este microorganismo, se podría justificar a causa de la sal de mar 
artesanal empleada durante el proceso de elaboración del queso, ya que Moore et al. en 
2006 halló a Vagococcus lutrae en sedimentos marinos, especie con la que V. carniphilus 
tiene una semejanza del 96.7% (Zúñiga, 2009). En este estudio no se logró identificar en 
la sal artesanal, lo cual puede explicarse por el hecho de que faltaron otras bandas por 
secuenciar o a que la presencia de este microorganismo en queso no se deba a la sal. 
 
Marinilactobacillus psychrotolerans no se logró identificar en la sal artesanal ni en queso, 
a pesar de que este microorganismo ya ha sido reportado por Zúñiga en el 2009 en 
muestras de queso Cotija como una población constante y dominante y por García en el 
2010 en la sal artesanal amplificando la región V1 y V3. Esto también podría explicarse 
por que faltaron bandas por secuenciar. 
 
De acuerdo a la huella génica observada en muestras de queso y sal artesanal, podemos 
decir que todos los productores emplean una sal del mismo origen (Colima). Lo cual es 
respaldado por el hecho de que las muestras de sal comercial generan una huella génica 
diferente. 
 
Finalmente se construyó el árbol consenso (Figura 14) para determinar la relación 
filogenética existente entre las BAL halófilas encontradas y otras secuencias de BAL 
obtenidas del GenBank™, se utilizó como grupo externo a E. coli. La relación fue inferida 
mediante el método Neighbor-Joining. De manera general, se lograron agrupar 7 de los 9 
microorganismos identificados como E. asini. Sin embargo, los microorganismos de las 
bandas F y H se agruparon dentro del género Enterococos pero es difícil establecer la 
especie, lo cual puede explicarse porque la región amplificada no muestra mucha 
variabilidad entre las especies de Enterococos. Lo mismo sucede para los 
microorganismos de las bandas J y L que se habían identificado por el alineamiento 
como Enterococcus termitis/E. haemoperoxidus, sin embargo en el árbol se agruparon 
dentro del género esperado pero no se pudo diferenciar la especie. 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
 
- 50 - 
 
El microorganismo de la banda B identificado por alineamiento como V. carniphilus quedó 
bien ubicado dentro del género esperado. Llama la atención que en el árbol generado, 
este género se encuentre cercano al género Enterococos e incluso no se haya 
diferenciado como un género diferente. Sin embargo, algunos autores han reportado que 
el género Vagococos es filogenétiamente y fenotípicamente similar a los Enterococos, lo 
que dificulta su diferenciación dado que comparten aproximadamente un 96-97% de 
identidad (Collins et al., 1989). 
 
Por último, se esperaba que el microorganismo de la banda C se agrupara dentro del 
género Lactobacilos, lo cual no se observó. 
 
De acuerdo a lo observado en el árbol filogenético, podemos decir que la mayor parte de 
los microorganismos fueron agrupados dentro del género Enterococos y 7 se lograron 
diferenciar a nivel de especie como E. asini. También se logró ubicar V. carniphilus 
dentro del género correspondiente. Algunos microorganismos no se ubicaron en la 
posición esperada de acuerdo a los resultados del alineamiento. Sin embargo, es muy 
importante tomar en cuenta que los porcentajes junto a los nodos que indican la 
asociación de las secuencias en el mismo clado, no fueron muy altos. Lo que indica que 
el agrupamiento es incierto, probablemente por la alta similitud entre las secuencias del 
género Enterococos en la región secuenciada, lo que no permite la diferenciación