Identificacion-del-receptor-de-la-lectina-serica-CqL-y-su-participacion-en-la-regulacion-de-la-respuesta-inmune-celular-de-Cherax-quadricarinatus

Vista previa del material en texto

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
POSGRADO EN CIENCIAS DEL MAR Y LIMNOLOGÍA 
 
 
 
IDENTIFICACIÓN DEL RECEPTOR DE LA LECTINA SÉRICA CqL Y 
SU PARTICIPACIÓN EN LA REGULACIÓN DE LA RESPUESTA 
INMUNE CELULAR DE Cherax quadricarinatus 
 
 
TESIS 
: 
DOCTOR EN CIENCIAS 
 
 
 
PRESENTA: 
JOSÉ LUIS SÁNCHEZ SALGADO 
 
 
 
TUTOR PRINCIPAL: 
 
DR. EDGAR ZENTENO GALINDO 
FACULTAD DE MEDICINA, UNAM 
 
COMITÉ TUTOR: 
DRA. CRISTINA PASCUAL JIMENEZ 
UMDI-SISAL, UNAM 
DRA. MARÍA LETICIA ARENA ORTIZ 
UMDI-SISAL, UNAM 
DR. ROBERTO ARREGUÍN ESPINOSA DE LOS MONTEROS 
INSTITUTO DE QUÍMICA, UNAM 
DR. CUAUHTÉMOC JUAN HUMBERTO LANZ MENDOZA 
INSP
CIUDAD UNIVERSITARIA, CD. MX., ENERO 2018
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
	
 
 
 
 
 
 
IDENTIFICACIÓN DEL RECEPTOR DE LA LECTINA SÉRICA CqL Y 
SU PARTICIPACIÓN EN LA REGULACIÓN DE LA RESPUESTA 
INMUNE CELULAR DE Cherax quadricarinatus 
 
 
TESIS 
 
 
QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE: 
DOCTOR EN CIENCIAS 
 
 
 
PRESENTA: 
JOSÉ LUIS SÁNCHEZ SALGADO 
 
 
 
TUTOR PRINCIPAL: 
 
DR. EDGAR ZENTENO GALINDO 
FACULTAD DE MEDICINA, UNAM 
 
COMITÉ TUTOR: 
DRA. CRISTINA PASCUAL JIMENEZ 
UMDI-SISAL, UNAM 
DRA. MARÍA LETICIA ARENA ORTIZ 
UMDI-SISAL, UNAM 
DR. ROBERTO ARREGUÍN ESPINOSA DE LOS MONTEROS 
INSTITUTO DE QUÍMICA, UNAM 
DR. CUAUHTÉMOC JUAN HUMBERTO LANZ MENDOZA 
INSP 
 
MÉXICO, CD. MX., ENERO, 2018 
	
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El presente trabajo fue realizado en el 
Laboratorio 6 de Inmunología del 
Departamento de Bioquímica, Facultad de 
Medicina, Universidad Nacional Autónoma de 
México, bajo la asesoría del Dr. Edgar 
Zenteno Galindo, Dra. Concepción Agundis 
Mata y Dr. Mohamed Alí Pereyra Morales, con 
el financiamiento del programa UNAM-
PAPIIT (IN214315), beca CONACyT 
(376926); los cuales fueron fundamentales 
para el desarrollo de esta tesis. 
	
AGRADECIMIENTOS ACADEMICOS 
 
Al Dr. Edgar Zenteno Galindo por darme la oportunidad de incorporarme en su 
equipo de trabajo, por ser un guía a través de este proyecto y el enorme apoyo que 
me ha brindado para mi formación académica. 
 
A los miembros del comité académico: Dra. Cristina Pascual Jiménez, Dra. Leticia 
Arena Ortiz, Dr. Roberto Arreguin Espinoza de los Monteros y al Dr. Humberto Lanz 
Mendoza por enriquecer este proyecto con sus comentarios y sugerencias. 
 
A la Dra. Concepción Agundis Mata y al Dr. Mohamed Alí Pereyra Morales por el 
desarrollo de este proyecto, así como la dedicación y paciencia en mi formación 
académica. 
 
	
AGRADECIMIENTOS PERSONALES 
 
A mi linda familia: Mi madre, mi padre, Cris, MaFer por ser un soporte esencial en 
mi desarrollo personal, gracias por apoyarme en todos los momentos que los he 
necesitado y por ser un ejemplo a seguir, gracias a todos Uds. 
 
A mi nueva familia, Marlene: gracias por todo el apoyo que me has dado y sobre 
todo por alentarme a seguir cumpliendo mis metas… “Andábamos sin buscarnos 
pero sabiendo que andábamos para encontrarnos” 
 
A la familia del Laboratorio: La Jefa, Alí, Joserra, Mont y Tania por ser excelentes 
amigos y compañeros en el laboratorio, hacer de cada uno de mis días único, 
aprender tantas cosas y aguantarme otras tantas. 
 
A mis grandes amigos que me han acompañado a lo largo de mi vida, gracias por 
esas platicas interminables, por todas las palabras de ánimo y anhelo durante este 
proyecto. 
 
	
PREFACIOS 
 
La presente tesis está basada en los siguientes trabajos de investigación: 
• Sánchez-Salgado J. L., Pereyra M. A., Agundis C., Vivanco-Rojas O., Sierra-
Castillo C., Alpuche-Osorno J. J., Zenteno E (2017). Participation of lectins in 
crustacean immune system. Aqua Res. 48: 4001 – 4011. 
• Respuesta inmune en Cherax quadricarinatus: receptores en hemocitos. 
Pereyra Morales, Mohamed Alí; Sánchez Salgado, José Luis; Vivanco Rojas, 
Oscar; Agundis Mata, María Concepción (2017). Mens. Bioquim. 41: 49 – 53. 
ISSN: 0188 – 137X. 
• J.L. Sánchez-Salgado, M.A. Pereyra, O. Vivanco-Rojas, C. Sierra-Castillo, J.J. 
Alpuche-Osorno, E. Zenteno, C. Agundis (2014). Characterization of a lectin 
from the crayfish Cherax quadricarinatus hemolymph and its effect on 
hemocytes. Fish Shellfish Immunol. 39(2): 450–457. ISSN: 1050-4648. 
• IV Congreso Latinoamericano de Glicobiología (2017). “The serum lectin of 
Cherax quadricarinatus binds to a granular hemocytes and participates in the 
ROS production through NADPH system and specific signaling molecules” 
• XXXI Congreso Nacional de Bioquímica. (2016) “Participation of the humoral 
and cellular activity in hemolymph of crayfish Cherax quadricarinatus challenge 
with B-1,3 Glucans”. 
• III Congreso Iberoamericano de Histología. (2016) “Regulación de CqL y su 
receptor mediante la estimulación con Zymosan A y LPS en el langostino 
Cherax quadricarinatus”. 
• Tercer Congreso Latinoamericano de Glicobiología. (2015) “Regulation of CqLr 
expression on hemocytes of crayfish Cherax quadricarinatus” 
• EMBO Workshop on Cell Biology of Animal Lectins. (2015) “Regulation of 
oxidative burst in hemocytes by a serum lectin of crayfish C. quadricarinatus. 
• XXI Congreso Nacional de Inmunología. (2014). “Identificación del 
homoreceptor de la lectina sérica en los hemocitos de Cherax quadricarinatus”. 
 
	
INDICE 
ABREVIATURAS 10 
LISTA DE FIGURAS 11 
LISTA DE TABLAS 13 
RESUMEN 15 
INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES 17 
JUSTIFICACIÓN 24 
HIPÓTESIS 25 
OBJETIVOS 26 
MATERIALES Y MÉTODOS 
Organismos 27 
Identificación y caracterización bioquímica del receptor de CqL en los 
hemocitos de C. quadricarinatus. 
Poblaciones de hemocitos presentes en C. quadricarinatus. 27 
Electroforesis SDS-PAGE Tricina. 28 
Electroforesis Azul Nativa 28 
Electroforesis en dos dimensiones. 29 
Inmunoelectrotransferencia 30 
Inmunofluorescencia. 30 
Activación in vitro de los hemocitos de C. quadricarinatus con diferentes 
estimulantes 
Inmunofluorescencia en hemocitos estimulados. 31 
Determinación de la generación de ROS en hemocitos. 32 
Activación in vivo de langosta de agua dulce C. quadricarinatus con diferentes 
estimulantes. 
	
Reto antigénico de la langosta de agua dulce C. quadricarinatus. 33 
Conteo total y diferencial de hemocitos. 33 
Inmunofluorescencia 34 
Actividad aglutinante de la lectina en el suero de C. quadricarinatus 34 
Análisis estadístico. 34 
RESULTADOS 
Identificación de poblaciones celulares en Cherax quadricarinatus. 35 
Identificación y caracterización del receptor de CqL en los hemocitos 35 
Producción de ROS en los hemocitos de C. quadriarinatus. 38 
Identificación de proteínas fosforiladas en hemocitos activados con 
diferentes estimulantes. 39 
Inhibición de la producción de ROS en hemocitos de C. quadricarinatus. 43 
Identificación de CqLr en hemocitos activados con diferentes 
estimulantes. 44 
Conteo total de hemocitos 46 
Conteo diferencial de hemocitos 47 
Identificación de CqLr en hemocitos obtenidos de organismos 
retados con diferentes estimulantes. 49 
Actividad específica de la lectinaen el suero de C. quadricarinatus 50 
DISCUSIÓN 51 
CONCLUSIONES 58 
PERSPECTIVAS 58 
LITERATURA CITADA 59 
 
 
	 10	
ABREVIATURAS 
AAS Ácido Acetilsalicílico 
CqL Lectina de C. quadricarinatus 
CqLr Receptor de CqL 
DPI Diphenyleneiodonium 
FITC Isotiocianato de Fluoresceína 
Gal Galactosa 
GalNAc N-acetil Galactosamina 
Glc Glucosa 
GlcNAc N-acetil Glucosamina 
IAA Iodoacetamida 
JAK/STAT Janus Cinasa / Transductores de Señal y 
Activadores de la Transcripción 
Man Manosa 
MEK Proteínas Cinasas Activadas por 
Mitogénico 
NBT Azul de Nitro-Tetrazolio 
NeuAc Ácido N-Acetilneuramínico 
P38MAPK p38 proteína Cinasa Activada por 
Mitogénico 
PI3K Fosfoinositol 3-cinasa 
PKC Proteína cinasa C 
PMA Forbol Miristato Acetato 
PMSF Fluoruro de Fenil metil sulfonilo 
ROS Especies Reactivas del Oxígeno 
Ser Serina 
SYK Tirosin Cinasa de Bazo 
(Spleen tyrosine kinase) 
Thr Treonina 
TLR Receptor de Tipo Toll 
Tyr Tirosina 
WSSV White Spot Syndrome Virus 
 
 
	 11	
LISTA DE FIGURAS 
Figura 1. Figura 1. Identificación a nivel transcripcional de vías de señalización en 
hemocitos de crustáceos relacionadas con la respuesta inmune. Spz, Spatzle; 
MyD88, respuesta primaria de diferenciación mieloide 88; TRAF6, Factor asociado 
a receptor 6; NFkB, Factor Nuclear kappa B; IMD, Deficiencia inmunitaria; STAT, 
señalizador transductor y activad de la transcripción, JAK; Janus cinasa (Modificado 
de Li y Xiang, 2013). 
Figura 2. Poblaciones celulares de Cherax quadricarinatus. A) Hemocitos 
granulares B) Semi-granulares C) Hialinas. Barra = 10 μm. 
Figura 3. Identificación de CqLr en el lisado de hemocitos. A) Lisado de hemocitos 
de C. quadricarinatus en condiciones desnaturalizantes (20 μg). B) Lisado celular 
revelado con CqL-B y estreptavidina-peroxidasa. Peso molecular = 120kDa. 
Marcadores de peso molecular: Precision plus proteins dual color standards 
(BioRad, USA). 
Figura 4. Identificación de isoformas de CqLr mediante una electroforesis 2D. A) 
Lisado de hemocitos revelado con Azul de Comassie (80 μg). B) Lisado de 
hemocitos revelado con CqL acoplada a biotina y revelado con Estreptavidina-
Peroxidasa. Marcadores de peso molecular: Precision plus proteins dual color 
standards (Bio-Rad, USA). 
Figura 5. Identificación de CqL en condiciones nativas. A) Lisado total de hemocitos 
de C. quadricarinatus en condiciones nativas (50 μg). B) Lisado celular revelado con 
CqL-biotina y streptavidina-peroxidasa (490 KDa). 
Figura 6. Identificación de CqLr en hemocitos granulares. A) Tipos de hemocitos de 
C. quadricarinatus en microscopía de luz; G = Hemocitos granulares, SG= 
	 12	
Hemocitos semigranualres y H= Hemocitos hialinos. B) Microscopía de luz de 
monocapa de hemocitos. C) Hemocitos granulares marcados con CqL-B. Barra = 
20 μm. 
Figura 7. Identificación de la fosforilación en residuos tirosina en hemocitos 
activados con Zymosan A (1 μg/mL), CqL (7.5 μg/mL) y BSM (2.5mM) a diferentes 
tiempos. Las células se revelaron con anticuerpo anti-tirosina fosforilada y se 
observaron en un microscopio con Epi- fluorescencia. 100x. La intensidad media fue 
estimada de la fluorescencia de Alexa594. Los datos son el promedio ± SEM de tres 
experimentos. Prueba ANOVA de dos vías. *** P <0.001, las condiciones fueron 
comparadas con el grupo CqL+BSM. 
Figura 8. Identificación de la fosforilación en residuos treonina en hemocitos 
activados con Zymosan A (1 μg/mL), CqL (7.5 μg/mL) y BSM (2.5mM) a diferentes 
tiempos. Las células se revelaron con anticuerpo anti-treonina fosforilada y se 
observaron en un microscopio con Epi- fluorescencia. 100x. La intensidad media fue 
estimada de la fluorescencia de Alexa594. Los datos son el promedio ± SEM de tres 
experimentos. Prueba de ANOVA de dos vías. * P <0.05, *** P <0.001, las 
condiciones fueron comparadas con el grupo CqL+BSM. 
Figura 9. Identificación de la fosforilación en residuos serina en hemocitos activados 
con Zymosan A (1 μg/mL), CqL (7.5 μg/mL) y BSM (2.5mM) a diferentes tiempos. 
Las células se revelaron con anticuerpo anti-serina fosforilada y se observaron en 
un microscopio con Epi- fluorescencia. 100x. La intensidad media fue estimada de 
la fluorescencia de Alexa594. Los datos son el promedio ± SEM de tres 
experimentos. Prueba de ANOVA de dos vías. * P <0.05, ** P <0.025, *** P <0.001; 
las condiciones fueron comparadas con el grupo CqL+BSM. 
	 13	
Figura 10. Detección de CqLr por inmunofluoresencia. A) Monocapa de hemocitos 
1x105 incubados con Zymosan A (1 μg/mL), LPS (1 μg/mL), CqL (7.5 μg/mL) y 
Control (Sin estímulo) por 60 minutos a 28ºC. 63x. B) Hemocitos granulares bajo el 
estímulo de Zymosan A (1 μg/mL). Barra = 20 μm. 100x. 
Figura 11. Hemocitos totales en organismos retados con Zymosan A, LPS, solución 
salina (SS) y No estimulado (Control). Prueba ANOVA de dos vías. * P <0.05, ** P 
<0.025, *** P <0.001. Los valores se compararon con el grupo SS en cada tiempo. 
Figura 12. Células granulares en organismos retados con Zymosan A, LPS, 
solución salina (SS) y No estimulado (Control). Prueba ANOVA de dos vías. * P 
<0,05, *** P <0,001. Los valores se compararon con el grupo SS en cada tiempo. 
Figura 13. Células hialinas en langostas retadas con Zymosan A, LPS, solución 
salina (SS) y No estimulado (Control). Prueba ANOVA de dos vías. ** P <0.025, *** 
P <0.001. Los valores se compararon con el grupo SS en cada tiempo. 
Figura 14. Conteo de células semigranulares en organismos retados con Zymosan 
A (200 μg/kg), LPS (20 μg/kg), Solución Salina (SS) y No estimulado (Control). 
Prueba ANOVA de una vía. No se observó variación en los valores comparados con 
el grupo control (SS) en cada tiempo. 
Figura 15. Identificación de CqLr por inmunofluorescencia en una monocapa de 
hemocitos 1x105 extraídos de organismos retados con Zymosan A (200 μg/kg), LPS 
(20 μg/kg), Solución Salina (SS) y No estimulado (Control) a diferentes tiempos e 
incubados a 28ºC. A) Las células se revelaron con CqL- Biotina y estreptavidina-
FITC y observaron en un microscopio con Epi-fluorescencia. 100x. 
Figura 16. Actividad específica de la hemolinfa de organismos retados con 
diferentes estímulos: Zymosan A, LPS, solución salina (SS) y No estimulado 
	 14	
(Control). UHA = Inverso de la última dilución que mostró actividad de aglutinación. 
Actividad específica = UHA/ mg de proteína. Prueba ANOVA de dos vías. * P <0.05; 
*** P <0.001. Los valores se compararon con el grupo SS en cada tiempo. 
 
LISTA DE TABLAS 
Tabla 1. Producción de ROS por hemocitos de C. quadricarinatus 
Tabla 2. Efecto de diferentes inhibidores de señalización en la producción de ROS 
por hemocitos estimulados con CqL. 
 
	 15	
RESUMEN 
Los hemocitos en la hemolinfa de invertebrados realizan funciones de defensa 
contra patógenos, aún no se conocen con claridad los mecanismos celulares y 
humorales que participan en la regulación del sistema inmune en crustáceos. En la 
membrana de los hemocitos granulares de Cherax quadricarinatus, se identifica un 
receptor de la lectina sérica (CqLr) en el 34% de las células granulares, es una 
glicoproteína de 490kDa en su estructura nativa y está compuesta por subunidades 
de 120kDa que no presentan isoformas. Los hemocitos granulares estimulados con 
CqL (7.5 µg/mL) incrementan 360% la producción de especies reactivas del oxígeno 
(ROS) comparado con hemocitos no tratados, este efecto se inhibe con 200 mM Gal 
y de 100 mM NeuAc. En los hemocitos granulares se incrementa la fosforilación de 
proteínas intracelulares: 242% en residuos de tirosina, 192% en residuos de 
treonina y 152% en residuos de serina. Los inhibidores de SYK, PI3K, PKC, 
NADPH-Oxidasa, así como AAS y IAA, disminuyen significativamente la producción 
de ROS. Por otro lado, en hemocitos estimulados con β-glucanos (1 µg/mL) se 
observa un aumento en la presencia de CqLr en comparación con hemocitos 
estimados con LPS (0.1µg/mL). En un modelo in vivo, se retaron organismos 
machos de 47.3 g ± 5.21 con β-glucanos (10 µg/mL) y LPS (1 µg/mL), se tomaron 
muestras a las 0, 2, 12, 24 h post-reto. En presencia de β-glucanos se observa un 
incremento en la presencia de CqLr en hemocitos granulares 2 horas después del 
reto. La capacidad aglutinante del suero muestra un incremento a 2 horas después 
del estímulo. Estos resultados sugieren que CqL podría participar en la activación 
de los hemocitos granulares y así participar en la respuesta inmune contra agente 
patógenos de la langosta C. quadricarinatus. 
	 16	
ABSTRACT 
Hemocytes are in the invertebrate hemolymph, these cells perform defense 
functions against pathogens, however, it is not clear how cellular and humoral 
mechanisms participate in the regulation of immune system of crustaceans. It was 
identified a serum lectin receptor (CqLr) in the cellular membrane of the 34% 
granular hemocytes of Cherax quadricarinatus, it is a 490kDa glycoprotein and it is 
composed by 120kDa subunits without isoforms. Granular hemocytes stimulates 
with CqL (7.5 µg/mL) increase 360% production of reactive oxygen species (ROS) 
compared with unstimulated hemocytes, in the presence of CqL incubated with 200 
mM Gal or 100 mM NeuAc, there was no significant difference in the ROS 
production. Granular hemocytes stimulated with CqL increase intracellular 
phosphorylation proteins: 242% tyrosine residues, 192% threonine residues, and 
152% serine residues. SYK, PI3K, PKC, and NADPH-Oxidase inhibitors significantly 
decreases ROS production. On the other hand, Hemocytes stimulate with β-glucans 
(1 µg/mL) increase the CqLr presence compared with hemocytes stimulated with 
LPS (0.1 µg/mL). In in vivo model, male organisms (47.3 g ± 5.21) were treated with 
β-glucans (200 µg/kg) and LPS (20 µg/kg), samples were taken at 0, 2, 12, 24 h 
post-challenge. In presence of β-glucans, it was observed an increase of CqLr in 
granular hemocytes and the serum agglutination title 2 h post-challenge, in presence 
of LPS, it was not observed a significantly increase. These results suggest that CqL 
could participate in the activation of granular hemocytes and regulate the immune 
response against pathogens in the fresh water crayfish C. quadricarinatus. 
	 17	
INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES 
Enfermedades en la langosta de agua dulce Cherax quadricarinatus 
En los últimos años, la langosta Cherax quadricarinatus se ha utilizado en la 
acuicultura a nivel global; sin embargo, se han reportado enfermedades en esta 
especie causadas por diferentes patógenos como: virus, bacterias y hongos que 
pueden afectar su desarrollo (Saoud et al., 2013). Algunos de los virus que afectan 
a estos organismos pertenecen al tipo baciliformes intracelulares como el virus 
baciliforme Cherax quadricarinatus o parvovirus de Cherax quadricarinatus de 
Bowater de la familia Parvoviridae (Anderson y Prior, 1992; Bowater et al., 2002). 
Las bacterias patógenas se encuentran frecuentemente en el medio de la langosta; 
los principales géneros que infectan a C. quadricarinatus son Vibrio y Coxiella 
(Edgerton et al., 2002; Saoud et al., 2013). Se han descrito algunas especies de 
hongos que pueden causar enfermedades como el género Thelohania, que afecta 
a esta especie en su hábitat natural (Herbet, 1987). Se ha reportado que el hongo 
del género Vavraia es patógeno para esta langosta, la infección causada por este 
patógeno ocasiona pérdida de movilidad del organismo (Langdon, 1991). A causa 
de las enfermedades causadas por estos agentes infecciosos, se han realizado 
avances para dilucidar los mecanismos inmunológicos celulares y humorales que 
participan en la eliminación de patógenos en los crustáceos (Longshaw, 2011). 
La respuesta inmune en crustáceos 
El sistema inmunológico de crustáceos está compuesto por una línea de defensa 
física conformada por el exoesqueleto (Tasumi y Vasta, 2007). Cuando los 
microorganismos logran introducirse en el organismo, el sistema inmune posee la 
capacidad de identificarlos mediante receptores solubles y/o por receptores 
	 18	
asociados a membranas celulares de reconocimiento a patrones (PRR) que 
identifican moléculas asociadas a patógenos (PAMP´s) (Akira et al., 2006). Este 
reconocimiento activa diferentes mecanismos humorales que colaboran en la 
eliminación de los patógenos como: el sistema de la profenoloxidasa (proFO), la 
coagulación, péptidos con actividad antimicrobiana y las lectinas (Tassanakajon et 
al., 2013). 
Existen mecanismos celulares que participan en el sistema inmunológico de los 
crustáceos; se han descrito tres poblaciones de células (hemocitos) con 
participación en la respuesta inmune: granulares, semi-granulares y hialinas; cada 
población posee características morfológicas particulares (Sun et al., 2010). Estas 
células participan en diferentes procesos inmunológicos, entre los cuales destaca el 
proceso de encapsulación, mecanismo mediado por moléculas de adhesión que 
generan una unión entre hemocitos formando capas celulares alrededor de la 
partícula extraña para posteriormente eliminarlo (Smith, 2010). La fagocitosis es un 
mecanismo mediante el cual se internaliza el agente extraño y se elimina por 
mecanismos dependientes e independientes de oxígeno (Vázquez, et al., 2009). 
Las especies reactivas de oxígeno (ROS) y nitrógeno (NOS) que participan en la 
fagocitosis son producidas principalmente por la NADPH oxidasa (NOX) (Buchon et 
al., 2014). 
Las lectinas como receptores séricos específicos en la respuesta inmune 
Se han reportado moléculas que participan en el reconocimiento hacia agentes 
patógenos en crustáceos, se han identificado 11 PRR´s (Receptores de 
reconocimiento de patrones) entre los cuales destacan los receptores de tipo 
Scavenger, TLR´s, lectinas tipo C y galectinas (Wang y Wang, 2013a). Estas 
	 19	
moléculas de reconocimiento identifican una amplia variedad de moléculas 
presentes en los patógenos como: lipopolisacáridos (LSP), peptidoglicanos (PGN), 
β-glucanos (Zymosan A) y ácidos nucleicos de origen viral (ARN/ADN), entre otros 
(Wang y Wang, 2013a). Dentro de los PRR´s se encuentran las lectinas, estas 
moléculas son proteínas o glicoproteínas que reconocen carbohidratos con alta 
especificidad (Sharon, 2007). Se ha propuesto que las lectinas participan en la 
activación de los mecanismos de inmunidad presentes en los crustáceos (Sánchez-
Salgado et al., 2017). 
Dentro de estos mecanismos, las lectinas participan en el proceso de la fagocitosis, 
la lectina MjGal del cangrejo M. japonicus y la lectina LvGal del camarón L. 
vannamei funciona como opsoninas que incrementan la capacidad fagocítica de los 
hemocitos (Shi et al., 2014). Por otro lado, se han identificado que las lectinas 
participan en la activación de la explosión oxidativa de los hemocitos, estas 
moléculas colaboran en la eliminación del agente patógeno (Smith, 2010). 
En el camarón L. setiferus, se identificó una lectina (LsL) con especificad por 
azúcares N-acetilados, el receptor de esta lectina (LsLr) se localizó en el 85% de 
las células granulares, esta molécula está compuesta por dos subunidades de 61 y 
52 KDa. Los hemocitos activados con LsL tienen un aumento del 60% en la 
producción de radicales libres de oxígeno en comparación con hemocitos no 
estimulados; se sugiere que el sistema de la NADPH oxidasa y otros mecanismos 
oxidativos participan en este mecanismo, cuando LsL se incubó con sus 
carbohidratos específicos, NeuAc, GalNAc y GlcNAc, se inhibió la producción de 
ROS, lo que indica que LsLr es una glicoproteína (Alpuche et al. 2009). 
	 20	
Los hemocitos del langostino M. rosenbergii producen 4.7 veces mayor cantidad de 
radicales libres del oxígeno en presencia de su lectina sérica (MrL) en comparación 
con hemocitos no estimulados, efecto que se inhibió con los azucares específicos 
para esta lectina como GalNAc, GlcNAcy Neu5Ac (Sierra et al., 2005). Los 
resultados sugieren que hay participación de un receptor glicosilado en la 
membrana de los hemocitos y que participa en la explosión oxidativa (Sierra et al., 
2005). En el camarón M. japonicus, la lectina (MjGal) aumenta significativamente la 
eliminación de agentes bacterianos. Se reportó la presencia del receptor en la 
membrana de los hemocitos, lo que podría indicar que la regulación de la respuesta 
inmune estaría relacionada con el reconocimiento de la lectina a través de su 
ligando glicosilado (Shi et al., 2014). 
La langosta de agua dulce C. quadricarinatus posee una lectina sérica (CqL) 
formada por un heterotrímero de 290 KDa, CqL es dependiente de Ca2+, presenta 
una amplia especificidad por carbohidratos, principalmente reconoce Gal y NeuAc 
(Sánchez-Salgado et al., 2014). Esta lectina incrementa la producción de ROS en 
los hemocitos estimulados. Estos resultados sugieren que CqL participa 
activamente en la regulación de la producción de radicales libres (Sánchez-Salgado 
et al., 2014). 
La investigación sobre la caracterización de las lectinas, así como la identificación 
de su función en los mecanismos de defensa de los crustáceos ha aumentado 
considerablemente, sin embargo, aún no se conocen con claridad la señalización 
intracelular que se desencadena dentro de los hemocitos para activar los 
mecanismos inmunológicos (Wang y Wang., 2013b). 
 
	 21	
Vías de señalización de la respuesta inmune 
Se han descrito 3 principales vías de señalización en el sistema inmune en 
invertebrados: Toll, Imd y JAK/STAT (Lemaitre y Hoffman, 2007). La activación de 
la vía de señalización Toll se induce principalmente por el reconocimiento de 
bacterias Gram positivas y hongos (Buchon et al., 2014; Valanne et al., 2011). La 
señalización Imd se desencadena en presencia de bacterias Gram negativas 
(Buchon et al., 2014; Kleino y Silverman, 2014). Por último, la vía JAK/STAT se 
induce por el reconocimiento de citocinas, en recientes fechas, se ha observado que 
está asociada a una respuesta antiviral (Buchon et al., 2014). 
En los crustáceos se han descrito las mismas vías de señalización (Toll, Imd y 
JAK/STAT), sin embargo, la identificación se ha hecho a un nivel genómico. En el 
camarón Penaeus monodon se observa un aumento en la expresión a nivel 
transcripcional de una proteína homóloga a STAT posterior a la infección con el 
virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV) (Chen et al., 2008). En el camarón 
F. chinensis, se identificó y clonó una proteína homologa a MyD88 (FcMyD88) que 
participa en la vía de activación de TLR en respuesta a infecciones bacterianas 
(Wen et al., 2013). En L. vannamei se observaron proteínas relacionadas a Pelle, 
TRAF6 y Dorsal (Wang et al., 2011). 
Se ha sugerido que las lectinas séricas podrían activar estas vías de señalización. 
En L. vannamei se identificó una proteína similar a NFB que podría participar en la 
señalización mediante la activación de una lectina sérica (LvCTL4) (Li et al., 2015). 
En M. japonicus se ha asociado el reconocimiento de bacterias por la lectina MjCC-
CL y la activación de la vía de señalización JAK/STAT (Sun et al., 2017) 
	 22	
 
Figura 1. Identificación a nivel transcripcional de vías de señalización en hemocitos de crustáceos 
relacionadas con la respuesta inmune. Spz, Spatzle; MyD88, respuesta primaria de diferenciación 
mieloide 88; TRAF6, Factor asociado a receptor 6; NFkB, Factor Nuclear kappa B; IMD, Deficiencia 
inmunitaria; STAT, señalizador transductor y activad de la transcripción, JAK; Janus cinasa 
(Modificado de Li y Xiang, 2013). 
 
En otras especies de invertebrados, se determinó la participación de moléculas en 
las vías de activación de los mecanismos celulares responsables de la producción 
de ROS. En el mejillón Mytilus galloprovincialis, se encontró que PKC y PI3K están 
involucrados en la producción de NOS en hemocitos (García-García et al., 2008). 
En el caracol Lymnaea stagnalis, las PKC son proteínas relevantes en la 
señalización intracelular de hemocitos que producen ROS (Wright et al., 2006). 
Los receptores que reconocen PAMP´s y las moléculas que participan en las vías 
de señalización se han identificado a nivel transcripcional, es prioritario realizar 
análisis a nivel proteómico para tener un mejor conocimiento de las moléculas que 
participan en los mecanismos de defensa en crustáceos (Li y Xiang, 2013). Hasta 
el momento, se cuenta con poca información sobre los receptores específicos de 
	 23	
las lectinas y las vías de señalización en hemocitos, eventos de gran trascendencia 
en los mecanismos celulares que colaboran en la eliminación de agentes 
infecciosos. 
	 24	
JUSTIFICACIÓN 
Existen reportes sobre enfermedades en crustáceos causadas por diferentes 
agentes infecciosos, se han descrito virus de la familia Parvoviridae; bacterias del 
genero Vibrio o Coxiella y hongos como responsables de múltiples enfermedades 
en C. quadricarinatus. En los últimos años, estos acontecimientos han causado 
importantes pérdidas económicas a nivel mundial. 
Resultados previos sugieren la participación de una lectina sérica de Cherax 
quadricarinatus (CqL) en la activación de hemocitos para inducir la producción de 
radicales libres de oxígeno, mecanismo relacionado directamente con la fagocitosis 
que participa en la destrucción de agentes infecciosos. Hasta el momento, se cuenta 
con pocos estudios acerca de la presencia de receptores para estas lectinas en la 
membrana de los hemocitos y no se ha logrado determinar con claridad la presencia 
de vías de señalización en los hemocitos que generen la activación de la respuesta 
inmune celular mediada por la interacción de lectina y su ligando. 
Por lo tanto, es importante realizar estudios acerca del reconocimiento de las 
lectinas séricas por sus receptores en la membrana de hemocitos y la activación 
intracelular que modula la respuesta inmune celular en crustáceos con el objetivo 
de aportar información sobre los mecanismos de inmunidad innata en respuesta a 
agentes patógenos. 
	 25	
 
 
 
 
 
 
 
 
 
HIPÓTESIS 
La lectina sérica de C. quadricarinatus reconoce un receptor en los hemocitos que 
desencadena vías de señalización y activa el mecanismo de la explosión oxidativa. 
 
 
 
	 26	
 
OBJETIVO PRINCIPAL 
 
Determinar la participación de la lectina como factor humoral en la activación de la 
respuesta inmune de los hemocitos en la langosta de agua dulce Cherax 
quadricarinatus. 
 
OBJETIVOS PARTICULARES 
• Identificar y caracterizar el receptor de la lectina sérica (CqLr) en los 
hemocitos de la langosta de agua dulce C. quadricarinatus en las diferentes 
poblaciones de hemocitos. 
• Determinar la participación de CqL y su especificidad en la producción de 
ROS en los hemocitos de C. quadricarinatus. 
• Identificar moléculas que participan en las vías de señalización de los 
hemocitos en presencia de CqL 
• Analizar la presencia de CqLr en hemocitos y la capacidad aglutinante de la 
lectina en el suero de organismos estimulados con diferentes patrones 
moleculares asociados a patógenos. 
 
	 27	
MATERIALES Y MÉTODOS 
Organismos. 
Se utilizaron langostas de agua dulce adultos machos obtenidos del estanque “El 
Higuerón” ubicado en el municipio de Jojutla, Morelos. Los organismos se 
capturaron manualmente para evitar ser lesionarlos. El transporte de las langostas 
se llevó a cabo en hieleras conteniendo agua fría (10ºC) y aireación constante. Se 
mantuvieron tres semanas antes de su manejo dentro del laboratorio, en peceras 
con aireación y temperatura constante de 28ºC, fue suministrado alimento comercial 
(Purina, Suiza) tres veces por semana. La densidad de la población se mantuvo en 
6 organismos por m2. El estado de intermuda se determinó siguiendo la metodología 
descrita por Peebles, J. (1977). Se obtuvo el peso total de los organismos mediante 
eluso de una balanza Scott Pro (Ohaus, USA). 
Identificación y caracterización del receptor de CqL en los hemocitos de C. 
quadricarinatus 
Poblaciones de hemocitos presentes en C. quadricarinatus. 
Se tomó una muestra de hemolinfa del seno pericardial, esterilizada previamente 
con alcohol etílico al 70%, con jeringa y aguja de 21g x 32mm, la muestra se diluyó 
1:2 en anticoagulante para crustáceos (450 mM NaCl, 100mM glucosa, 30 mM 
Citrato de sodio, 26 mM Ácido cítrico, 20mM EDTA, pH=4.5). De cada organismo 
se extrajo 1 mL de hemolinfa; la muestra se colocó en tubos de plástico estériles a 
4ºC. Los hemocitos fueron lavados 3 veces en Solución modificada de Van-
Harreveld (SS) (270 mM NaCl, 25.7 mM CaCl2, 4.6 mM KCl, 2.6 mM MgCl2, pH=8) 
(Lanz et al., 1993) por centrifugación a 300 x g por 10 min a 4ºC. El conteo diferencial 
	 28	
se realizó una cuenta de 100 células en 3 campos seleccionados aleatoriamente. 
Se determinó la viabilidad celular utilizando la tinción de azul tripán. 
Electroforesis SDS-PAGE Tricina. 
Los hemocitos previamente lavados, se incubaron por 30 min a 4ºC con 
amortiguador de lisis (2 mM de Inhibidores de proteasas, Roche; 4mM PMSF; Tritón 
X-100 al 1% en amortiguador salino de fosfatos, PBS: NaCl 137mM, KCl 2.7mM, 
Na2HPO4�H20 10mM, KH2PO4 2mM; pH 7.3) en agitación constante. La suspensión 
resultante se centrifugó a 13,000 x g por 30 min a 4ºC. El sobrenadante del lisado 
celular se corrió en geles de poliacrilamida al 10% (SDS-PAGE) en el sistema de 
SDS-PAGE-Tricina de Schägger (2006). Se emplearon estándares de peso 
molecular con rango de 10 a 250 KDa (Precision Plus Protein Dual Color, BioRad, 
USA). La electroforesis se corrió a 50V durante 30 min y posteriormente a 120V 
hasta finalizar el corrimiento. 
Electroforesis Azul Nativa 
Para determinar el peso molecular nativo de CqLr, se corrió la muestra en una 
electroforesis azul nativa (BN-PAGE) (Witting et al., 2006). Después de lisar las 
células como se describió previamente, se incubó la muestra (150 μg) en 7 μL de 
amortiguador (50 mM Bis-Tris, 500 mM Ácido 6-aminocaproico, pH=7.0) y 3 μL of 
digitonina (50 mg/mL) a 4ºC por 45 min. Después de la incubación, la muestra fue 
centrifugada 100,000 x g por 35 min. El sobrenadante fue colocado en un gel en 
gradiente linear de poliacrilamida (4%-14%) of BN-PAGE, el gel corrió durante 18 h 
a 30V. El peso molecular de CqLr fue estimado utilizando como referencia 
complejos mitocondriales de bovino con un rango de 130kDa a 1500kDa (De los 
Rios-Castillo et al., 2011). 
	 29	
Electroforesis en dos dimensiones. 
Se prepararon las muestras (80 μg) utilizando solución de rehidratación (Urea 7M, 
Tiourea 2M, CHAPS 4%, DTT 50mM, 0.5 % de IPG buffer pH 3-10; GE Healthcare, 
azul de bromofenol 0.002%) hasta obtener un volumen total de 125 μL. Las 
muestras se vertieron en los carriles de la bandeja de rehidratación (Amersham 
Biosciences, Suecia), a cada una muestra se le colocó una tira de poliacrilamida de 
7 cm de longitud con rango de pH lineal de 3 a 10 (GE Healthcare, U.K.); las tiras, 
fueron cubiertas con 1mL de aceite mineral y se permitió la hidratación por 16h a 
temperatura ambiente. La separación por punto isoeléctrico (isoelectroenfoque) se 
llevó a cabo en la cámara Multiphor II (Amersham Biosciences, Suecia) con las 
siguientes condiciones: paso 1, 200 V por 20 min, con incremento de voltaje lineal; 
paso 2, 3,500 V por 2 h con voltaje lineal; paso 3, 3,500 V, 5,000 Vh, con un 
incremento de voltaje rápido, manteniendo como límite 50 μA por tira. Para la 
segunda dimensión, las tiras se equilibraron en 10 mL de amortiguador de equilibrio 
(Tris-base 50 mM pH 8.8; 6 M urea, Glicerol 30%, SDS 2%, Azul de bromofenol 
0.002 %) adicionado con DTT (64.8 mM) en agitación constante por 15 min a 
temperatura ambiente; posteriormente las tiras fueron nuevamente incubadas en 
solución de equilibrio, esta vez adicionada con iodoacetamida (135 mM). La tira fue 
depositada en el carril correspondiente del gel separador, embebido en un gel de 
agarosa al 0.5 %; se preparó con acrilamida al 10 % en el sistema de SDS-PAGE-
Tricina, en cámara de electroforesis vertical, en la parte superior, a un lado de la 
tira, se colocó el marcador de peso molecular (Precision Plus Protein Dual Color, 
Bio-Rad), La migración electroforética se llevó a cabo a 4ºC con un voltaje constante 
de 120V por 90 minutos en la cámara SE260 Mighty Small II (Hoefer, USA) 
	 30	
Inmunoelectrotransferecia. 
Posterior a las electroforesis, se incubó el gel en amortiguador de transferencia (Tris 
base 25mM, Glicina 192mM, Metanol 70%, pH=8.3) durante 90 min. La 
transferencia a membranas de Nitrocelulosa (Immobilon-P Membrane, Millipore), se 
realizó en un aparato Trans-Blot SD semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad, USA) a 
temperatura ambiente con voltaje constante (25V) 60 min, las muestras transferidas 
a la membrana se visualizaron con tinción rojo de Ponceau (Sigma Chem., USA) 
(Towbin et al., 1979). Los sitios reactivos libres se bloquearon con albumina sérica 
bovina libre de IgG al 0.25% (Sigma Chem., USA) en PBS y Tween 20 (PBS-T) al 
0.1% durante 1 h. En seguida, las membranas se lavaron con PBS-T 3 veces, en 
agitación, 7 min cada lavado. Para detectar el receptor se adicionó CqL acoplada a 
biotina en dilución previamente establecida e incubó 16 h a 4ºC. Se lavó la 
membrana con PBS-T 3 veces, 15 min cada lavado. Posteriormente, se adicionó 
estreptavidina-peroxidasa e incubó a durante 1 h a 37ºC; al termino del tiempo, se 
lavó con PBS-T 4 veces y se procedió a la detección con Opti-4CN (BioRad, USA). 
Inmunofluorescencia. 
Los hemocitos se lavaron por centrifugación con SS a 300 x g a 4ºC durante 10 min, 
después se colocaron en portaobjetos previamente tratados con Poli-L-lisina y 
marcados con un lápiz hidrofóbico (Vector Labs, U.K.); se colocaron 1x105 células 
por pozo y se incubaron durante 15 min a 4ºC en cámara húmeda, para 
posteriormente fijarse con paraformaldehido al 1% en PBS por 10 min, se 
bloquearon los pozos con albúmina sérica bovina libre de IgG (Sigma, USA) al 5% 
en PBS-T durante 30 min y las células se lavaron con SS. Para detectar el receptor, 
se adicionó CqL acoplada a biotina en dilución previamente establecida e incubó 2 
	 31	
h a 37°C, enseguida se lavó la muestra con PBS-T 4 veces. Se adicionó 
estreptavidina-FITC e incubó a 37ºC durante 1 h. Al término, se lavó la muestra con 
PBS-T 4 veces y se montaron en anti-fotoblanqueador Vectashield (Vector Labs, 
U.K.). Se utilizó BSM como control. Los hemocitos marcados se observaron en un 
microscopio Leica DM/SL (Cambridge, U.K.) equipado con sistema de epi-
iluminación. 
Activación in vitro de los hemocitos de C. quadricarinatus con diferentes 
estimulantes 
Inmunofluorescencia en hemocitos estimulados 
Los hemocitos fueron obtenidos, lavados y montados en los portaobjetos como se 
describió previamente. Para detectar el receptor, se realizó una cinética de 60 
minutos, al tiempo establecido en cada experimento, se fijaron los hemocitos con 
paraformaldehido al 1% en PBS durante 10 min, posteriormente, se lavaron las 
células con PBS-T 4 veces. Se adicionó CqL acoplada a biotina en dilución 
previamente establecida e incubó 2 h a 37°C, enseguida se lavó la muestra con 
PBS-T 4 veces. Se adicionó estreptavidina-FITC e incubó a 37ºC durante 1 h. Para 
la detección de proteínas con tirosinas, treoninas y serinas fosforiladas, se utilizó el 
anticuerpo de ratón anti-treonina fosforilada, ratón anti-tirosina fosforilada o ratón 
anti-serina fosforilada en dilución de 1:100 e incubó 2 h a 37°C. A continuación, se 
colocó el anticuerpo anti-ratón acoplado a Alexa594 e incubó a 37ºC durante 1 h. Al 
termino de los dos procedimientos (CqL y anticuerpos), se lavó la muestra con PBS-
T 4 veces y se montaron en anti-fotoblanqueador Vectashield (Vector Labs, U.K.). 
Se utilizó Gal como control de la activación medianteCqL, este carbohidrato es 
específico para la lectina. Los hemocitos marcados se observaron en un 
	 32	
microscopio Leica DM/SL (Cambridge, U.K.) equipado con sistema de epi-
iluminación. La fluorescencia total de las células fue cuantificada por el conteo 
aleatorio de la fluorescencia media de 30 células granulares utilizando el programa 
ImageJ (Maryland, USA) por tiempo y estimulo evaluados. 
Determinación de la generación de ROS en hemocitos. 
Para la cuantificación del estallido respiratorio, se utilizaron monocapas de 
hemocitos en SS (1 x 105 células/pozo), las células se dejaron adherir en placas de 
96 pozos con fondo plano (NUNC, Dinamarca) durante 15 minutos a 4ºC. En el 
primer experimento, se colocaron CqL (7.5 µg/mL) solo o en presencia de las 
moléculas: Man, Glc, Gal y NeuAc, Mucina Submaxilar Bovina, (BSM), Fetuina, DPI 
(20 µM) y Superoxido dismutasa (SOD) (1 mU); los carbohidratos fueron utilizados 
a 200mM y las glicoproteínas a 1 mg/mL y fueron incubadas con CqL 20 min antes 
de añadirlos a los hemocitos. 
En el segundo experimento se utilizó CqL (7.5 µg/mL) solo o en presencia de los 
inhibidores: inhibidor de MEK (PD98059, Cell Signal), inhibidor de NADPH-oxidasa 
(DPI, Sigma, USA), inhibidor de SYK (Piceatannol, Sigma, USA), inhibidor de PKC 
(Gö6983, Millipore), inhibidor de PI3K (LY294002, Millipore), inhibidor de P38MAPK 
(SB203580, Millipore), ácido acetilsalicílico (Sigma, USA), iodoacetamida (GE, 
U.K.), dexametasona (Sigma, USA), fluoruro de sodio (Sigma, USA) y azida de 
sodio (J.T. Baker, USA). Todos los inhibidores fueron añadidos 20 min antes de 
realizar el estímulo y posteriormente, se agregó CqL durante 30 min a 28ºC. 
A continuación, se incubaron con 100 µL de NBT al 0.2% (Sigma, USA) en Solución 
Salina al 0.85%, 30 min a 28°C. Al termino del tiempo, las placas se lavaron con 
PBS y se fijaron con metanol al 70%; se añadió a cada pozo 120 µL de KOH 2 M y 
	 33	
se agitó durante una hora, en seguida se agregó 140 µL de dimetil sulfoxido 
(DMSO). La muestra se leyó a 630 nm en un lector de ELISA (Labsystems, 
Finlandia), con una solución de NBT como blanco. La reducción del NBT se reportó 
como nano moles de NBT reducido (nmol NBTr). Se realizaron 3 experimentos con 
3 replicadas cada uno para llevar acabo el análisis estadístico. 
 
Activación in vivo de langosta de agua dulce C. quadricarinatus con diferentes 
estimulantes. 
Reto antigénico de la langosta de agua dulce C. quadricarinatus. 
Para llevar acabo los retos antigénicos en un modelo in vivo, se utilizaron 6 
organismos por cada condición: Lipopolisacáridos (LPS) (20 µg/kg), β1,3-glucanos 
(Zymosan A) (200 µg/kg), SS (Solución Salina) y Control (Sólo toma de muestra); 
en cada organismo se administraron 100 µL con la cantidad indicada del 
estimulador. Posteriormente, se tomó una muestra de hemolinfa por una punción en 
el área del seno pericardial, esterilizada previamente con alcohol etílico al 70%, los 
tiempos de toma de muestra fueron 0 h, 2 h, 12 h y 24 h posteriores al reto 
antigénico. Cabe destacar que para cada condición se utilizó un organismo sin toma 
de muestra previa, esto con la finalidad de evitar pseudo-replicas. 
Conteo total y diferencial de hemocitos. 
Los hemocitos se lavaron por centrifugación con SS a 300 x g a 4ºC durante 10 min, 
se resuspendieron en 1mL de la misma solución; se contaron las células en una 
cámara de Neubauer por triplicado. Para el conteo diferencial se colocaron 1x105 
células por pozo y se incubaron durante 15 min a 4ºC en cámara húmeda para 
posteriormente fijarse con paraformaldehido al 1% en PBS por 10 min. A 
	 34	
continuación, se contaron 100 células en 3 campos aleatoriamente en un 
microscopio Leica DM/SL de campo claro (Cambridge, U.K.). 
Inmunofluorescencia. 
Se utilizó la técnica descrita previamente. Brevemente, se colocaron 1x105 células 
por cada tiempo y reto antigénico que se evaluó, para detectar el receptor CqLr, se 
adicionó CqL acoplada a biotina y posteriormente se adicionó estreptavidina-FITC. 
Los hemocitos marcados se observaron en un microscopio Leica DM/SL 
(Cambridge, U.K.) equipado con sistema de epi-iluminación. 
Actividad aglutinante de la lectina en el suero de C. quadricarinatus. 
Se obtuvieron eritrocitos de conejos provenientes del Bioterio de la Facultad de 
Medicina, UNAM, México. Se tomó la sangre en una solución estéril de Alsever 
(glucosa 100 mM, NaCl 20 mM y citrato sódico 30 mM, pH=7.3), los eritrocitos se 
lavaron 3 veces con PBS por centrifugación (300 x g durante 10 min). La actividad 
hemaglutinante (UHA) del suero se realizó en placas U de microtitulación (NUNC, 
Dinamarca) por dilución seriada por triplicado. La cuantificación de la concentración 
de proteínas del suero se determinó por el método de Bradford (Bradford, 1976). La 
actividad específica se reportó como UHA/mg de proteínas de cada suero de los 
organismos por tiempo y estimulo evaluados. 
Análisis estadístico. 
Para la identificación de diferencias significativas en los muestreos realizados se 
utilizó el programa Stats 20 (IBM, USA), se realizó prueba de ANOVA de una vía o 
dos vías. La significancia estadística fue de p < 0.05. 
	 35	
RESULTADOS 
En este estudio se utilizaron organismos adultos machos en estado de intermuda. 
El peso promedio fue de 47.3 g ± 5.21. Los organismos se mantuvieron en 
estanques con temperatura de 28 ºC y concentración de oxígeno disuelto >5 mg/L. 
Identificación de poblaciones celulares en Cherax quadricarinatus. 
El conteo diferencial de estas poblaciones fue: 62% células hialinas, 13% células 
semi-granulares y 25% células granulares (Fig. 2). El conteo total de hemocitos fue 
de 1.6x106 células por mL ± 0.14 x106. 
 
 
Figura 2. Poblaciones celulares de Cherax quadricarinatus. A) Hemocitos granulares B) Semi-
granulares C) Hialinas. Barra = 10 μm. 
 
Identificación y caracterización del receptor de CqL en los hemocitos. 
En el lisado celular de hemocitos de la langosta, se observó que el receptor está 
compuesto por una subunidad de 120 kDa en condiciones desnaturalizantes (Fig. 
3). Se observó que la subunidad que conforma al CqLr de 120 kDa, tiene un punto 
isoeléctrico (IP) fue de 7 y no presentó isoformas (Fig. 4). 
 
	 36	
 
Figura 3. Identificación de CqLr en el lisado de hemocitos. A) Lisado de hemocitos de C. 
quadricarinatus en condiciones desnaturalizantes (20 μg). B) Lisado celular revelado con CqL-B y 
estreptavidina-peroxidasa. Peso molecular = 120kDa. Marcadores de peso molecular: Precision plus 
proteins dual color standards (BioRad, USA). 
 
Figura 4. Identificación de isoformas de CqLr mediante una electroforesis 2D. A) Lisado de hemocitos 
revelado con Azul de Comassie (80 μg). B) Lisado de hemocitos revelado con CqL acoplada a biotina 
y revelado con Estreptavidina-Peroxidasa. Marcadores de peso molecular: Precision plus proteins 
dual color standards (Bio-Rad, USA). 
	 37	
La conformación nativa de CqLr presentó un peso molecular de 490 kDa (Fig. 5). 
Mediante una inmunofluoresencia, el receptor de la lectina CqL se observó en el 
34% de los hemocitos granulares, es decir, esta molécula se localizó en el 8% de 
los hemocitos totales en circulación (Fig. 6). 
 
Figura 5. Identificación de CqL en condiciones nativas. A) Lisado total de hemocitos de C. 
quadricarinatus en condiciones nativas (50 μg). B) Lisado celular revelado con CqL-biotina y 
streptavidina-peroxidasa (490 kDa). 
 
 
Figura 6. Identificación de CqLr en hemocitos granulares. A) Tipos de hemocitos de C. 
quadricarinatus en microscopía de luz; G = Hemocitos granulares, SG= Hemocitos semigranualres 
y H= Hemocitos hialinos. B) Microscopía de luz de monocapa de hemocitos. C) Hemocitos granulares 
marcados con CqL-B. Barra = 20 μm. 
	 38	
Activación in vitro de los hemocitos de C. quadricarinatus con diferentes 
estimulantes. 
Producción de ROS en los hemocitos de C. quadriarinatus. 
Sedeterminó la participación de CqL en la activación de la explosión oxidativa 
usando la prueba de reducción de NBT (NBTr) (Tabla 1). La concentración óptima 
de CqL para producir NBTr fue de 7.5 μg/mL. CqL y PMA aumentaron la generación 
de ROS en un 300% y 327% respectivamente en comparación con los hemocitos 
no tratados. La especificidad de CqL sobre los hemocitos se evaluó incubando la 
lectina durante 30 min con diferentes carbohidratos antes de estimular a los 
hemocitos. 
Tabla 1. Producción de ROS por hemocitos de C. quadricarinatus 
 
 
 
 
 
 
 
Hemocitos incubados por 60 min con: Forbol 12-miristato-13 acetato (PMA), Superoxido dismutasa 
(SOD), difenileniodonio (DPI), Fetuina (Fet). Prueba de t-student, * P<0.05, **P<0.025 los grupos 
fueron comparados con el grupo control. 
 
 
Estimulador Concentración nMNBTr (nmol) 
Sin Estímulo - 1.1 
PMA 7.5 ηg 4.7** 
CqL 7.5 μg/mL 4.5** 
CqL/Man 200 mM 4.4** 
CqL/Fet 0.05 mM 3.2* 
CqL/Glc 200 mM 2.9* 
CqL/Gal 200 mM 2.8* 
CqL/NeuAc 100 mM 2.6* 
CqL/SOD 1 mU 1.9 
CqL/DPI 20 μM 1.5 
	 39	
Los principales carbohidratos que inhibieron la actividad de CqL fueron: Gal y 
NeuAc, 51% y 55% respectivamente; la Man no mostró ningún efecto. El superóxido 
dismutasa (SOD) inhibió 72% y el Difenileniodonio (DPI) 89% de la reducción de 
NBT en hemocitos activados con CqL (Tabla 1). 
 
Identificación de proteínas fosforiladas en hemocitos activados con diferentes 
estimulantes. 
Por inmunofluorescencia, se identificó en los hemocitos la presencia de proteínas 
fosforiladas (Tyr, Thr y Ser) posteriores a los estímulos. En la identificación de Tyr-
P (Fig. 7), el grupo estimulado con Zymosan A mostró a los 5 min un aumento del 
380% en comparación al grupo sin estímulo; a los 15 min y 30 min, no hubo 
diferencias significativas. El estímulo de CqL tuvo un incremento del marcaje a los 
5 min de 242%; los tiempos posteriores al estímulo no presentaron cambios 
significativos. El grupo CqL+BSM y sin estímulo no se presentó variaciones a ningún 
tiempo de activación evaluado. 
	 40	
 
Figura 7. Identificación de la fosforilación en residuos tirosina en hemocitos activados con Zymosan 
A (1 μg/mL), CqL (7.5 μg/mL) y BSM (2.5mM) a diferentes tiempos. Las células se revelaron con 
anticuerpo anti-tirosina fosforilada y se observaron en un microscopio con Epi- fluorescencia. 100x. 
La intensidad media fue estimada de la fluorescencia de Alexa594. Los datos son el promedio ± SEM 
de tres experimentos. Prueba ANOVA de dos vías. *** P <0.001, las condiciones fueron comparadas 
con el grupo CqL+BSM. 
 
En presencia de Zymosan A, se observó un incremento en la fosforilación de Thr a 
partir de los 2 min; a los 5 min se identificó un aumento del 184% con respecto al 
grupo sin estímulo (Fig. 8). Tras 15 y 30 min, no se observaron valores diferentes 
en la presencia de proteínas fosforiladas en Thr. Con el estímulo de CqL, a los 5 
	 41	
min se observó un incremento de 192% superior con respecto a los valores 
mostrado por el grupo sin estímulo. Al transcurrir 15 y 30 min, los valores son 
similares a los reportados en el grupo sin estímulo al mismo tiempo, es importante 
mencionar que con la activación de CqL se observó marcaje solo en células 
granulares. Las células que se incubaron con CqL+BSM y el grupo sin estímulo, no 
mostraron un aumento significativo en el marcaje a ningún tiempo bajo las mismas 
condiciones a las que se mantuvieron los todos grupos. 
 
Figura 8. Identificación de la fosforilación en residuos treonina en hemocitos activados con Zymosan 
A (1 μg/mL), CqL (7.5 μg/mL) y BSM (2.5mM) a diferentes tiempos. Las células se revelaron con 
anticuerpo anti-treonina fosforilada y se observaron en un microscopio con Epi- fluorescencia. 100x. 
La intensidad media fue estimada de la fluorescencia de Alexa594. Los datos son el promedio ± SEM 
de tres experimentos. Prueba de ANOVA de dos vías. * P <0.05, *** P <0.001, las condiciones fueron 
comparadas con el grupo CqL+BSM. 
	 42	
 
 
Figura 9. Identificación de la fosforilación en residuos serina en hemocitos activados con Zymosan 
A (1 μg/mL), CqL (7.5 μg/mL) y BSM (2.5mM) a diferentes tiempos. Las células se revelaron con 
anticuerpo anti-serina fosforilada y se observaron en un microscopio con Epi- fluorescencia. 100x. 
La intensidad media fue estimada de la fluorescencia de Alexa594. Los datos son el promedio ± SEM 
de tres experimentos. Prueba de ANOVA de dos vías. * P <0.05, ** P <0.025, *** P <0.001; las 
condiciones fueron comparadas con el grupo CqL+BSM. 
 
Por último, se identificó la fosforilación de proteínas en el residuo de serina (Fig. 9). 
En las células estimuladas con Zymosan A hubo un aumento en el marcaje del 
131% y 100% al trascurrir 2 y 5 min respectivamente. El estímulo de CqL a los 2 
min, provocó aumento del marcaje de 142% en comparación con el grupo sin 
	 43	
estímulo; a los 5 min, se identificó el valor más alto 152% de la fosforilación de Ser; 
a los 15 min y a los 30 min no se observó diferencia con el grupo sin estímulo. En 
la inhibición de la actividad de CqL+BSM, no se identificó aumento en la presencia 
de serinas fosforiladas. 
 
Inhibición del a producción de ROS en hemocitos de C. quadriarinatus. 
Para determinar la participación de algunas moléculas en las vías de activación al 
interior de los hemocitos se utilizaron inhibidores específicos. Las dos moléculas 
que presentaron una mayor disminución en la producción de ROS fueron el ácido 
acetilsalicílico (AAS) y el inhibidor de PKC (Gö6983), el decremento fue del 63% y 
61% respectivamente (Tabla 2). Otras moléculas con una disminución significativa 
con respecto al grupo estimulado con CqL fueron: el inhibidor de PI3K (LY294002) 
que inhibió 50%; el inhibidor de SYK (Piceatannol) redujo la formación de ROS 51%; 
por último, la iodoacetamida (IAA) generó una disminución del 48% con respecto a 
la activación con CqL. En cambio, en presencia de los inhibidores de proteínas MEK 
(PD98059), P38MAPK (SB203580), Dexametosona, Fluoruro de Sodio y Azida de 
sodio, no se observó una disminución significativa en la producción de ROS (Tabla 
2). 
 
 
 
 
 
	 44	
Tabla 2. Efecto de diferentes inhibidores de señalización en la producción de ROS 
por hemocitos estimulados con CqL. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Hemocitos incubados por 60 min con: Mucina submaxilar bovina (MSB), Ácido acetilsalicílico (AAS), 
inhibidor de PKC (Gö6983), inhibidor de SYK (Piceatannol), inhibidor de PI3K (LY294002), 
yodoacetamida (IAA). Prueba de ANOVA de una vía. **P<0.025, ***P<0.001. los grupos fueron 
comparados con el grupo CqL. 
 
Identificación de CqLr en hemocitos activados con diferentes estimulantes. 
Los hemocitos se estimularon con diferentes estimulantes a diferentes tiempos, se 
identificó la presencia de CqLr (Fig.10A). A 60 min, se observó un aumento del en 
la presencia del receptor de CqL en los hemocitos granulares estimulados con 
Zymosan A con respecto al grupo sin estímulo (Fig. 10B); al estimular hemocitos 
con LPS, no se observaron modificaciones en la presencia de CqLr en los hemocitos 
en ningún tiempo evaluado. 
 
 
Estimulador Concentración nMNBTr (nmol) 
Sin Estímulo - 1.1*** 
Zymosan A 1 μg/mL 8.7*** 
CqL 7.5 μg/mL 4.8 
CqL/MSB 2.5 mM 1.7*** 
CqL/AAS 2.5 mM 2.5*** 
CqL/ Gö6983 1 μM 2.6*** 
CqL/ Piceatannol 50 μM 3.0** 
CqL/ LY294002 50 μM 3.0** 
CqL/IAA 50 mM 3.1** 
	 45	
A 
 
 
 
 
 
 
 
 
B 
 
 
 
 
 
 
Figura 10. Detección de CqLr por inmunofluoresencia. A) Monocapa de hemocitos 1x105 incubados 
con Zymosan A (1 μg/mL), LPS (1 μg/mL), CqL (7.5 μg/mL) y Control (Sin estímulo) por 60 minutos 
a 28ºC. 63x. B) Hemocitos granulares bajo el estímulo de Zymosan A (1 μg/mL). Barra = 20 μm. 
100x. 
 
	 46	
Activaciónin vivo de los hemocitos de C. quadricarinatus con diferentes 
estimulantes 
Conteo total de hemocitos 
El conteo total de células por mL de hemolinfa se realizó a las 0, 2, 12, 24 h después 
de llevar a cabo el reto con LPS y Zymosan A. El número de hemocitos circulantes 
a las 0 h (Conteo total de hemocitos) en la langosta fue de 1.6 x 106 células/mL ± 
0.14 x106 (n = 16). La estimulación con LPS presentó un incremento del 91% con 
respecto al control; a las 12 h, el conteo disminuyó 75% en comparación con el 
grupo control (Fig. 11). En la estimulación con Zymosan A, los hemocitos totales se 
incrementaron 116% a las 2 h con respecto al control y a las 12 h tuvieron un 
decremento del 50% menor al control. 24 h posteriores a la estimulación, los valores 
de LPS y Zymosan A, no presentaron diferencias significativas en relación al grupo 
control (Fig. 11). 
 
 
Figura 11. Hemocitos totales en organismos retados con Zymosan A, LPS, solución salina (SS) y No 
estimulado (Control). Prueba ANOVA de dos vías. * P <0.05, ** P <0.025, *** P <0.001. Los valores 
se compararon con el grupo SS en cada tiempo. 
	 47	
Conteo diferencial de hemocitos 
Las células granulares variaron con el estímulo de Zymosan A disminuyendo 50% 
a las 2 h con respecto al grupo SS; después de 12 h, los valores fueron similares al 
grupo SS (Fig. 12). Tras el estímulo de LPS a las 2 h disminuyó 41% las células 
granulares en comparación con el grupo SS al mismo tiempo; después de 12 h, la 
cantidad de células aumentó hasta alcanzar los valores del grupo control. 
 
Figura 12. Células granulares en organismos retados con Zymosan A, LPS, solución salina (SS) y 
No estimulado (Control). Prueba ANOVA de dos vías. * P <0,05, *** P <0,001. Los valores se 
compararon con el grupo SS en cada tiempo. 
 
En las células hialinas tras el estímulo de Zymosan A, se registró un aumento del 
20% con respecto al grupo SS a las 2 h, a las 12 h disminuyó la presencia de estas 
células hasta igualar los valores del grupo SS. El reto con LPS generó incremento 
del 17% comparado con el grupo SS; a las 12 y 24 h no se encontró incremento 
significativo (Fig 13). 
	 48	
 
Figura 13. Células hialinas en langostas retadas con Zymosan A, LPS, solución salina (SS) y No 
estimulado (Control). Prueba ANOVA de dos vías. ** P <0.025, *** P <0.001. Los valores se 
compararon con el grupo SS en cada tiempo. 
 
En las células semigranulares no se observaron cambios significativos en la 
cantidad de células cuantificadas en los diferentes grupos muestreados (Fig. 14). 
 
Figura 14. Conteo de células semigranulares en organismos retados con Zymosan A (200 μg/kg), 
LPS (20 μg/kg), Solución Salina (SS) y No estimulado (Control). Prueba ANOVA de una vía. No se 
observó variación en los valores comparados con el grupo control (SS) en cada tiempo. 
 
	 49	
Identificación de CqLr en hemocitos obtenidos de organismos retados con 
diferentes estimulantes. 
Se realizó una inmunofluorescencia con hemocitos de los organismos retados para 
determinar variaciones en la presencia de CqLr. Hay un incremento del 754% en las 
células granulares de los organismos retados con Zymosan A 2 h post-estímulo (Fig 
15). 
 
Figura 15. Identificación de CqLr por inmunofluorescencia en una monocapa de hemocitos 1x105 
extraídos de organismos retados con Zymosan A (200 μg/kg), LPS (20 μg/kg), Solución Salina (SS) 
y No estimulado (Control) a diferentes tiempos e incubados a 28ºC. A) Las células se revelaron con 
CqL- Biotina y estreptavidina-FITC y observaron en un microscopio con Epi-fluoresencia. 100x. 
 
A las 12 y 24 h no se observó un incremento en la presencia del receptor. Es 
importante mencionar que el marcaje no aumentó en el número de células 
granulares ni en otra población celular. En los otros grupos (LPS, SS y Control), no 
	 50	
se observó variación en la presencia de CqLr después del reto a ningún tiempo 
muestreado (Fig. 15). 
 
Actividad específica de la lectina en el suero de C. quadricarinatus 
Se determinó la actividad específica presente en el suero de C. quadricarinatus, se 
registró incremento de la actividad específica en el grupo de Zymosan A a 2 h y 12 
h del 250% y 178% respectivamente comparados con el grupo SS. 24 h posteriores 
al reto, se obtuvieron datos sin diferencia significativa entre los cuatro grupos 
muestreados (Fig. 16). 
 
Figura 16. Actividad específica de la hemolinfa de organismos retados con diferentes estímulos: 
Zymosan A, LPS, solución salina (SS) y No estimulado (Control). UHA = Inverso de la última dilución 
que mostró actividad de aglutinación. Actividad específica = UHA/ mg de proteína. Prueba ANOVA 
de dos vías. * P <0.05; *** P <0.001. Los valores se compararon con el grupo SS en cada tiempo. 
	 51	
DISCUSIÓN 
El sistema inmune está constituido por varias poblaciones de células y moléculas 
que, de forma coordinada, generan una respuesta inmune en presencia de agentes 
patógenos (Govind, 2008). El sistema inmune presenta receptores de 
reconocimiento de patrones (PRRs) codificados en la línea germinal que pueden 
identificar patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) (Vasta et al., 
2012). En los últimos años, se han incrementado los reportes acerca de la 
participación de las lectinas, como PRRs, en los mecanismos de inmunidad de 
crustáceos, se ha identificado su participación en todos los mecanismos 
inmunológicos en invertebrados (Sánchez-Salgado et al., 2017). En un trabajo 
previo, se purificó y caracterizó la lectina sérica de la langosta de agua dulce C. 
quadricarinatus (CqL); se describió la especificidad hacia diferentes carbohidratos 
(Gal y NeuAc principalmente) y su posible participación en los mecanismos 
inmunológicos celulares de C. quadricarinatus (Sánchez-Salgado et al., 2014). La 
clasificación general menciona 3 poblaciones celulares de hemocitos en los 
crustáceos: células hialinas, semi-granulares y granulares (Smith, 2010). Sin 
embargo, no existe un consenso general de cuáles es su participación en los 
mecanismos inmunológicos y como se relacionan con las lectinas. 
En el presente trabajo, se identificó en los hemocitos un receptor de CqL, es una 
glicoproteína conformada por una subunidad de 120 kDa que está compuesta por 
una sola isoforma, en su conformación nativa, presenta un peso de 490 kDa. Se 
determinó que CqLr se localiza únicamente en los hemocitos granulares de C. 
quadricarinatus (8% de los hemocitos circulantes); CqL activa la producción de ROS 
	 52	
en los hemocitos, en presencia de los carbohidratos específicos para la lectina, Gal 
y NeuAc, se observa una inhibición de su actividad. 
Existen pocos trabajos realizados sobre la identificación de los receptores para las 
lectinas séricas en crustáceos. En el camarón L. setiferus se reportó una lectina 
(LsL) que tiene su receptor en 85% de los hemocitos granulares; el receptor está 
constituido por dos subunidades de 61 y 52 kDa, es una glicoproteína que es 
reconocida por LsL, esta lectina participa en la producción de radicales libres de 
oxígeno y en presencia de carbohidratos N-acetilados, disminuye la generación de 
ROS (Alpuche et al., 2009). En el cangrejo M. japonicus existe una galectina 
denominada MjGal; que reconoce tanto la superficie de los hemocitos como a 
agentes patógenos y participa en la activación del sistema de la fagocitosis (Shi et 
al., 2014). En el camarón F. chinensis se reportó una lectina FcLec4, el receptor de 
esta lectina se identificó en los hemocitos, presenta una estructura de tipo b-
integrina que promueve la fagocitosis (Wang et al., 2014). Estos datos nos permiten 
concluir que CqL participa en la producción de ROS a través de una interacción con 
su receptor dependiente de carbohidratos específicos y podría activar estos 
mecanismos a través de vías de señalización intracelulares. 
En los últimos años, se han realizado avances en la identificación de genesrelacionados con proteínas que participan en las cascadas de señalización de los 
hemocitos de crustáceos (Li y Xiang, 2013). Se estableció la posible presencia de 3 
vías de señalización relacionadas con el sistema inmune: la vía de JAK/STAT, la 
vía Toll y la vía IMD (Lemaitre y Hoffmann, 2007; Li y Xiang, 2013). No obstante, no 
se ha identificado cuáles de estas proteínas, actúan en la activación del proceso de 
	 53	
producción de especies reactivas del oxígeno. En el presente trabajo, se determinó 
que en presencia de CqL, los hemocitos granulares presentaron un aumento de 
proteínas fosforiladas; estos resultados concuerdan con la identificación del CqLr 
solo en esta población celular. Se ha establecido firmemente que la fosforilación 
está relacionada en las vías de señalización y en la posterior activación de las 
funciones celulares (Graves y Krebs, 1999). La interacción de CqL y su receptor 
inducen la fosforilación de proteínas que posiblemente estén asociadas a la 
transducción de señales que activen la producción de ROS en los hemocitos. 
En el presente reporte se utilizaron inhibidores específicos para identificar 
moléculas que participen en las vías de activación de los hemocitos estimulados 
con CqL. En presencia de Piceatannol (inhibidor de tirosin cinasa SYK) (Seow et al., 
2002), Ly294002 (inhibidor PI3K) (Vlahos et al., 1994), Gö6983 (inhibidor de PKC´s 
convencionales) (Gschwendt et al., 1996) y DPI (inhibidor de NADPH-oxidasa) 
(O´Donnell et al., 1993) provocó una disminución en la generación de ROS. El ácido 
acetilsalicílico (AAS) es un inhibidor de la vía de las prostaglandinas mediante el 
bloqueo de la cicloxigenasa 2 (Chen et al., 2012; Serhan et al., 2008); la 
iodoacetamida (IAA) bloquea la glucolisis (Schmidt y Dringen, 2009). Estas dos 
moléculas también presentaron la capacidad de inhibir la producción de ROS. Por 
otro lado, la molécula SB203580, inhibidor específico de la quinasa p38MAPK 
(Kumar et al., 1999); PD98059, inhibidor de la MEK1 y MEK2 (Sim et al., 2005); 
Dexametasona, inhibidor de MAPK (Huo et al., 2011); Azida de sodio (NaN3), 
inhibidor de la cadena respiratoria mitocondrial (Maemura et al., 2005) no 
disminuyeron significativamente la producción de ROS en los hemocitos 
estimulados con CqL. 
	 54	
La molécula SYK se ha asociado a una gran cantidad de receptores en la membrana 
de células pertenecientes al sistema inmune (Mócsai et al., 2010). Se ha identificado 
que algunos receptores de tipo lectina inician la señalización intracelular con la 
participación de proteínas de tipo SYK (Kerrigan y Brown, 2011). Una de las 
moléculas, que se relaciona directamente a SYK es la quinasa PI3K; estas dos 
moléculas pueden generar complejos señalizadores (Mócsai et al., 2010). Uno de 
los objetivos de SYK-PI3K son las proteínas de la familia de las PKC, una de sus 
principales funciones de las PKC es la fosforilación de las subunidades del sistema 
de la NADPH oxidasa para activarlo y producir ROS (Bréchard et al., 2013). Los 
resultados de este estudio nos permiten sugerir que la unión de CqL y su receptor 
activa la señalización intracelular donde participan moléculas SYK, PI3K y PKC para 
el ensamblaje de la NADPH oxidasa que produce ROS en los hemocitos granulares 
de la langosta de agua dulce C. quadricarinatus. 
Por otro lado, el efecto de CqL sobre los hemocitos parece estar mediado por la 
inducción de cicloxigenasas y el metabolismo de la glucosa (Chen et al., 2012; 
Serhan et al., 2009; Schmidt y Dringen, 2009). Estos datos sugieren que la 
producción de radicales libres del oxígeno está relacionada con procesos 
metabólicos de la mitocondria y del ácido araquidónico. 
Hasta el momento, no se ha descrito las vías de activación de este mecanismo en 
crustáceos, sin embargo, en el mejillón Mytilus galloprovincialis, se ha observado 
que PKC y PI3K participan en la producción de NOS de los hemocitos (García-
García et al., 2008). En el caracol Lymnaea stagnalis, se observó que la molécula 
PKC forma parte importante de la señalización intracelular que regula la producción 
de especies reactivas de oxígeno (Wright et al., 2006). En L. setiferus y P. vannamei 
	 55	
se observó la participación de procesos metabólicos en la producción de radicales 
libres del oxígeno (Alpuche et al., 2009; Sun, 2010). 
Dentro del modelo in vivo, se identificaron incrementos en los CTH 2 h después del 
reto con ambos estimulantes, 12 h post inducción, no se hay diferencias 
significativas con respecto a los valores del grupo control. En otro trabajo, se 
realizaron retos inmunológicos en presencia de WSSV y una bacteria Gram (-) en 
la misma especie (Liu et al., 2013); no se observaron variaciones significativas a las 
6, 12 y 24 h post inducción, en cambio a las 48 h, bajo el estímulo viral, se observó 
una disminución (Liu et al., 2013). Estos datos nos sugieren que la respuesta es 
dependiente del patógeno que es recocido por el organismo. 
Con el estímulo de Zymosan A y LPS a las 2 h, hubo variaciones en los CDH en las 
poblaciones de hemocitos granulares y hialinos. Existen reportes sobre la variación 
de los conteos diferenciales tras retos inmunológicos en crustáceos; no obstante, 
los resultados no son comparables pues la mayoría de estos reportes se realizaron 
en intervalos de tiempo diferentes. Sin embargo, en el camarón L. vannamei se 
hicieron mediciones de estos valores en presencia de un estímulo con la bacteria 
Vibrio alginolyticus (Gram -) dentro de las primeras 24 h post-inducción; en las tres 
poblaciones de hemocitos, se observaron valores mínimos entre las 6 y 12 h post-
indicción (Liu et al., 2005). Estos datos difieren con respecto a los valores reportados 
en este trabajo ya que a las 12 h después del estímulo, no encontramos diferencias 
con el grupo control; este efecto puede ser debido a la implementación de un reto y 
dosis diferente. 
En el presente reporte, se evaluó la presencia de CqLr y la actividad específica de 
la lectina presente en el suero tras estímulos en el modelo in vivo. En los hemocitos 
	 56	
granulares de C. quadricarinatus; encontramos aumento de la presencia de CqLr en 
presencia del estímulo con Zymosan A; con el reto de LPS, no hubo aumento en la 
marca de CqL en la membrana de los hemocitos. Se observó un aumento en la 
actividad específica de las lectinas en el suero a las 2 h y 12 h post-estimulo con 
Zymosan A, en cambio, en el grupo retado con LPS no aumentó significativamente. 
Existen reportes acerca de la cuantificación de genes relacionados con lectinas en 
crustáceos decápodos en presencia de retos inmunológicos con una gran cantidad 
de patógenos (Wang y Wang, 2013b). La mayoría de estos reportes mencionan un 
aumento en la cuantificación de mRNA de lectinas sin asociarlo con una actividad, 
en la langosta P. clarkii se identificó aumento en los niveles de lectina después del 
reto con de la bacteria V. anguillarum en la (Zhang et al., 2016). Se ha sugerido la 
presencia de receptores que podrían reconocer a los b-glucanos en crustáceos 
(Wang y Wang et al., 2013a). Nuestros resultados sugieren que el reconocimiento 
de b-glucanos podría estar relacionado con el aumento de la actividad de CqL en el 
suero y la presencia del receptor CqLr en la membrana de los hemocitos con la 
finalidad de activar la producción de ROS y colabore en la eliminación de los 
agentes patógenos. Es importante realizar más experimentos con la finalidad de 
esclarecer cual es la relación entre la lectina CqL y la respuesta a b-glucanos en la 
langosta de agua dulce C. quadricarinatus. 
En conclusión, en este trabajo se identificó al receptor de CqL en las células 
granulares, la interacción de la lectina con su receptor es dependiente de 
carbohidratos específicos, esta interacción aumenta la fosforilación de proteínas en 
los hemocitos donde participan SYK, PI3K y PKC en las vías de activación que 
	 57	
aumentala producción de ROS. En presencia de b-glucanos se observó un aumento 
en la actividad específica del suero y de la presencia de CqLr en los hemocitos. Esta 
información ayudará a entender el funcionamiento de los mecanismos 
inmunológicos celulares y aportará datos relevantes sobre la participación de las 
lectinas en la respuesta inmune innata. 
	 58	
CONCLUSIONES 
 
La lectina sérica CqL reconoce una población de hemocitos granulares mediante su 
receptor (CqLr), este reconocimiento desencadena la fosforilación de proteínas al 
interior de la célula lo que aumenta la producción de especies reactivas del oxígeno. 
CqL participa en la regulación de la respuesta inmune contra agente patógenos de 
la langosta C. quadricarinatus. 
 
 
PERSPECTIVAS 
 
1.- Aislar y clonar el receptor CqLr en los hemocitos de C. quadricarinatus. 
2.- Estructurar la vía de señalización desencadenada por la interacción de CqL 
y su receptor. 
3.- Identificar la participación de CqL en la respuesta inmunológica en presencia 
de moléculas b-glucanos. 
	 59	
LITERATURA CITADA 
§ Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. (2006) Pathogen recognition and innate 
immunity. Cell 124: 783 – 801. 
§ Alpuche, J., Rosas, C., Vázquez, L., Guevara, J., Pereyra, A., Agundis, C., 
Pascual, C., Zenteno, E., (2009) Activation of immunological responses in 
Litopenaeus setiferus hemocytes by a hemocyanin like-lectin. Aquaculture. 
292: 11 - 15. 
§ Anderson, I. G., Prior, H. C. (1992) Baculovirus infections in the mud crab 
Scylla serrata, and a freshwater crayfish, Cherax quadricarinatus, from 
Australia. J. Invertebr. Pathol. 60: 265 – 273- 
§ Bowater, R.O., Wingeld, M., Fisk, M., Kelly, M.L.C., Reid, A., Prior, H., Kulpa, 
E.C., 2002. A parvo-like virus in cultured redclaw crayfish Cherax 
quadricarinatus from Queensland, Australia. Dis. Aquat. Org. 50, 79–86. 
§ Bradford (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram 
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. 
Biochem. 72: 248 – 254. 
§ Bréchard, S., Plançon, S., Tschirhart, E.J. (2013). New insights into the 
regulation of Neutrophil NADPH oxidase activity in the phagosome: A focus on 
the role of lipid and Ca2+ signaling. Antioxidants Amp. Redox. Signal. 18: 661 
– 676. 
§ Buchon, N., Silverman, N., Cherry, S. (2014). Immunity in Drosophila 
melanogaster from microbial recognition to whole organism physiology. Nat. 
Rev. Immunol. 14: 796 – 810. 
	 60	
§ Chen, W., Ho, K., Leu, J., Liu, K., Wang, H., Kou, G., Lo, C. (2008) WSSV 
infection activates STAT in shrimp. Dev. Comp. Immunol. 32: 1142 – 1150. 
§ Chen, B., Zhao, J., Zhang, S., Wu, W., Qi, R. (2012). Aspirin inhibits the 
production of reactive oxygen species by Downregulating Nox4 and Inducible 
Nitric Oxide Synthase in Human Endothelial Cells Exposed to Oxidized Low-
density Lipoprotein. J. Cardiovasc Pharmacol. 59: 405 – 412. 
§ De los Rios, D., Zarco-Zavala, M., Olvera-Sanchez, S., Pardo, J. P., Juarez, 
O., Martinez, F., Mendoza-Hernandez, G., García-Trejo, J. J., Flores-Herrera, 
O., 2011. Atypical cristae morphology of human syncytiotrophoblast 
mitochondria: role for complex V. J. Biol. Chem. 27, 23911 – 23919. 
§ Edgerton, B.F., Evans, L.H., Stephens, F.J., Overstreet, R.M. (2002) Synopsis 
of freshwater crayfish diseases and commensal organisms. Aquaculture. 206: 
57 – 135. 
§ García-García, E., Prado-Álvarez, M., Novoa, B., Figueras, A., Rosales, C. 
(2008). Immune responses of mussel hemocyte subpopulations are 
differentially regulated by enzymes of the PI 3-K, PKC, and ERK kinase 
families. Dev. Comp. Immunol. 32: 637 – 653. 
§ Govind, S. (2008). Innate immunity in Drosophila: Pathogens and pathways. 
Insect Sci. 15: 29 – 43. 
§ Graves, J. D., Krebs, E. D. (1999) Protein phosphorylation and signal 
transduction. Pharmacol. Ther. 82: 111 -121. 
	 61	
§ Gschwendt, M., Dieterich, S., Rennecke, J., Kittstein, W., Mueller, H.J., 
Johannes F.J. (1996) Inhibition of protein kinase C mu by various inhibitors. 
Differentiation from protein kinase c isoenzymes. FEBS Letters 392: 77 – 80. 
§ Herbert, B. (1987) Notes on diseases and epibionts of Cherax quadricarinatus 
and C. tenuimanus (Decapoda: Parastacidae). Aquaculture. 64: 165 – 173. 
§ Huo, Y., Rangarajan, P., Ling, E. A., Dheen, T. (2011). Dexamethasone inhibits 
the Nox-dependent ROS production via suppression of MKP-1-dependent 
MAPK pathways in activated microglia. BMC Neuroscience. 12: 49. 
§ Kerrigan, A.M., Brown, G.D. (2011). Syk-coupled C-type lectins in immunity. 
Trends in immunology. 32: 151 – 156. 
§ Kleino, A., Silverman, N., 2014. The Drosophila IMD pathway in the activation 
of the humoral immune response. Dev. Comp. Immunol. 42, 25 – 35. 
§ Kumar, S., Jiang, M., Adams, J., Lee, J. (1999). Pyridinylimidazole compound 
SB 203580 inhibits the activity but not the activation of p38 mitogen-activated 
protein kinase. Biochem Bioph. Res. Co. 263: 825 – 831. 
§ Langdon, J., S. (1991) Description of Vavraia parastacida sp. nov. (Microspora: 
Pleistophoridae from marrow, Cherax tenuimanus (Smith), (Decapoda: 
Parastacidae). J. Fish Diseases. 14: 619 – 629. 
§ Lanz, H., Hernandez, S., Garrido-Guerrero, E., Tsutsumi, V., Aréchiga, H. 
(1993) Prophelonoxidase system activation in the crayfish Procambarus clarkii. 
Dev. Comp. Immunol. 17: 399 – 406. 
§ Lemaitre, B., Hoffmann, J. (2007). The host defense of Drosophila 
melanogaster. Annu. Rev. Immunol. 25: 697 – 743. 
	 62	
§ Li, F., Xiang, J., (2013) Signaling pathways regulating innate immune 
responses in shrimp. Fish Shellfish Immunol. 34: 973 – 980. 
§ Li, H., Chen, Y., Li, M., Wang, S., Zuo, H., Xu, X., Weng, S., He, J., Li, C. (2015) 
A C-type lectin (LvCTL4) from Litopenaeus vannamei is a downstream 
molecule of the NF-kB signaling pathway and participates in antibacterial 
immune response. Fish Shellfish Immunol. 43: 257 – 263. 
§ Liu, C., Winton C., Chen, J. (2005). The peroxinectin of white shrimp 
Litopenaeus vannamei is synthesized in the semi-granular and granular cells, 
and its transcription is up-regulated with Vibrio alginolyticus infection. Fish 
Shellfish Immunol. 18: 431 – 444. 
§ Liu, Y., Chang, C., Hseu, J., Liu, K., Tsai, J. (2013). Immune responses of 
prophenoloxidase and cytosolic manganese superoxide dismutase in the 
freshwater crayfish Cherax quadricarinatus against a virus and bacterium. Mol. 
Immunol. 56: 72 – 80. 
§ Longshaw, M. (2011) Diseases of: Crayfish. J. Invertebr. Pathol. 106: 54 – 70. 
§ Maemura, K., Zheng, Q., Wada, T., Ozaki, M., Takao, S., Aikou, T., Bulkley, G., 
Klein, A., Sun, Z. (2005). Reactive oxygen species are essential mediators in 
antigen presentation by Kupffer cells. Immunol Cell Biol. 83: 336 – 343. 
§ Mócsai, A., Ruland, J., Tybulewicz, V. (2010). The SYK tyrosine kinase: a 
crucial player in diverse biological functions. Nat. Rev. Immunol. 10: 387 – 402. 
§ O´Donnell, V., Tew, D., Jones, O., England, P. (1993). Studies on the inhibitory 
mechanism of iodonium compounds with special reference to neutrophil 
oxidase. Biochem. J. 290: 41 – 49. 
	 63	
§ Peebles, J. (1977) A rapid technique for molt staging in live Macrobrachium 
rosembergii. Aquaculture 12: 173 - 180. 
§ Saoud, I., Ghanawi, J., Thompson, K., Webster, C. (2013) A review of the 
culture and diseases of redclaw crayfish Cherax quadricarinatus (Von Martens 
1868). J. World Maric. Soc. 44: 1-29. 
§ Sánchez-Salgado, J.L., Pereyra, M., Vivanco-Rojas, O., Sierra-Castilo, C., 
Alpuche-Osorno, J., Zenteno, E., Agundis, C. (2014) Characterization of a 
lectin from the crayfish Cherax quadricariantus hemolymph and its effect on 
hemocytes. Fish Shellfish Immunol. 39: 450 – 457. 
§ Sánchez-Salgado J.L., Pereyra M. A., Agundis C., Vivanco-Rojas O., Sierra-
Castillo C., Alpuche-Osorno J. J., Zenteno E. (2017). Participation of lectins in 
crustaceans immune system. Aquaculture Research. 
§ Schägger, H. (2006). Tricine-SDS-PAGE.