Identificacion-de-protenas-blanco-del-complejo-enzimatico-snrk1-de-arabidopsis-thaliana

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
 
 
 
 
 
IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS BLANCO DEL COMPLEJO 
ENZIMÁTICO SNRK1 DE ARABIDOPSIS THALIANA 
 
 
 
 
 
 
 
TESIS 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
 
QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO 
PRESENTA 
JOSÉ RICARDO TREJO FREGOSO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 MÉXICO, D.F. 2015 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE Profesor: Dr. J. Eleazar Martínez Barajas 
VOCAL Profesor: Dra. Martha Patricia Coello Coutiño 
SECRETARIO Profesor: Dra. Nuria Victoria Sánchez Puig 
1° SUPLENTE Profesor: Dra. Nancy Monroy Jaramillo 
2° SUPLENTE Profesor: Dra. Perla Deyanira Maldonado Jimenez 
 
 
 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA, CONJUNTO E DE LA FACULTAD DE QUÍMICA, U.N.A.M. 
 
 
 
 
 
 
 
 
ASESOR DEL TEMA: 
 
DRA. MARTHA PATRICIA COELLO COUTIÑO 
 
 
 
SUPERVISOR TÉCNICO: 
 
M. EN C. BEATRIZ ALEJANDRA ÁVILA CASTAÑEDA 
 
 
 
SUSTENTANTE: 
 
JOSÉ RICARDO TREJO FREGOSO 
 
 
 
 
 
 
	
  
ÍNDICE GENERAL 
 
1. RESUMEN 1 
2. INTRODUCCIÓN 2 
 2.1. Estrés y energía 2 
2.2. La familia SNF1/AMPK/SnRK1: integración de las señales de energía y 
estrés 4 
 2.2.1. Generalidades 4 
 2.2.2. Familia génica de la SnRK 6 
 2.2.3. Estructura de los complejos cinasas SNF1/AMPK/SnRK1 8 
 2.2.3.1. Las subunidades clásicas 10 
 2.2.3.2. Las subunidades atípicas de plantas 13 
 2.2.4. Fosforilación de sustratos blanco 14 
3. ANTECEDENTES 17 
 3.1. Respuestas de la planta a la deficiencia de fosfato 17 
 3.2. SnRK1 en las respuestas de la planta a la deficiencia de fosfato 18 
4. HIPÓTESIS 21 
5. OBJETIVOS 21 
6. MATERIALES Y MÉTODOS 22 
6.1. Digestión de las construcciones pGEM-T Easy-np-G3PDHasa y pGEM-T 
Easy-PHR1 22 
 6.2. Electroforesis en geles de agarosa 22 
6.3. Purificación de los cDNAs np-G3PDHasa y PHR1, y el vector de 
expresión pGEX-4T-2 de un gel de agarosa. 23 
6.4. Ligación de los cDNAs np-G3PDHasa y PHR1 al vector de expresión 
pGEX-4T-2. 23 
 6.5. Transformación de bacterias competentes de Escherichia coli DH5α por 
choque térmico 23 
6.6. Purificación de los plásmidos pGEX-4T-2-np-G3PDHasa y pGEX-4T-2-
PHR1 23 
 6.7. Transformación de bacterias competentes de Escherichia coli BL21 RIL 25 
	
  
 6.8. Sobreexpresión de las proteínas recombinantes 25 
6.8.1. Optimización de las condiciones de sobreexpresión de las proteínas 
recombinantes 25 
 6.8.2. Sobreexpresión de las proteínas recombinantes 26 
 6.9. Purificación de las proteínas recombinantes por columna de afinidad 27 
 6.10. Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida en condiciones 
desnaturalizantes, SDS-PAGE 28 
6.11. Determinación de la concentración de proteínas por el método de 
Bradford 28 
 6.12. Remoción de la GST de las proteínas recombinantes 29 
 6.13. Obtención de la PEPC de Amaranthus hypochndriacus 30 
 6.14. Obtención de las plantas de Arabidopsis thaliana 30 
 6.15. Purificación de la actividad de SnRK1 31 
 6.16. Ensayos de actividad de SnRK1 33 
 6.17. Ensayos de fosforilación in-vitro 33 
7. RESULTADOS 35 
7.1. Obtención de los cDNAs np-G3PDHasa y PHR1 ligados al vector de 
expresión pGEX-4T-2 35 
7.2. Sobreexpresión y obtención de las proteínas recombinantes np-
G3PDHasa y PHR1 fusionadas a GST 36 
 7.3. Remoción de la GST de las proteínas recombinantes 40 
 7.4. Purificación de la actividad de SnRK1 42 
 7.5. Ensayos de fosforilación in-vitro 47 
8. DISCUSIÓN 51 
9. CONCLUSIONES 60 
10. PERSPECTIVAS 61 
11. REFERENCIAS 62 
 
 
	
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1. RESUMEN 
 
 La familia AMPK/SNF1/SnRK1 son una famila de proteínas cinasas 
heterotriméricas conservadas en todos los eucariontes, desde las levaduras (SNF1) 
hasta organimos multicelulares complejos como los mamíferos (AMPK) y las plantas 
superiores (SnRK1). Han sido denominadas como reguladores de los niveles 
energéticos de las células eucariontes, debido a que detectan los niveles energéticos 
de la célula o de todo el organismo y de acuerdo a estos niveles ejecutan acciones con 
el fin de mantener la homeostasis energética. Se ha postulado que en condiciones de 
estrés se ven comprometidos los niveles energéticos de la célula, por lo cual esta 
familia de cinasas inhibien los procesos biosintéticos que consumen ATP. Entonces, la 
familia de proteínas cinasas AMPK/SNF1/SnRK1 serían un punto de convergencia de la 
respuesta a diversos tipos de estrés. Esta familia ejecutan su acción mediante la 
modulación por fosforilación de enzimas del metabolismo o mediante la fosforilación de 
factores transcripcionales con la consecuente regulación de la expresión de diferentes 
genes. Además de las SnRK1, en plantas existen las SnRK2 y SnRK3, involucradas en 
el estrés por desecasión, salinidad o deficiencia nutrimental; condiciones 
representativas de la vida sésil de estos organismos. Un tipo de estrés común en las 
plantas es la deficiencia de fosfato, especialmente debido a que se compromete el 
metabolismo del carbono y la producción de ATP. Al ser las SnRKs moduladoras de la 
homeostasis energética antes varias condiciones de estrés, se propuso en este trabajo 
probar si existía actividad de cinasa sobre posibles blancos, involucrados en las 
respuestas a la deficiencia de fosfato, que contenían la secuencia reconocida por la 
SnRK1. Los blancos fueron la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (np-G3PDHasa), 
la fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC) y el factor transcripcional PHOSPHATE 
RESPONSE 1 (PHR1). Los blancos se obtuvieron como proteínas recombinantes de 
células de Escherichia coli, y se probaron con un actividad de SnRK1 parcialmente 
purificada de un extracto de hoja o raíz de Arabidopsis thaliana crecidas en condiciones 
de suficiencia o deficiencia de fosfato. 
 
 
	
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2. INTRODUCCIÓN 
 
2.1. Estrés y energía 
 
Todos los organismos enfrentan el desafío de mantener la homeostasis 
energética y metabólica, en especial cuando se presentan situaciones que perturban 
éste equilibrio. Es lógico pensar en la existencia de una relación entre la disponibilidad 
de energía y los mecanismos de tolerancia al estrés, supervivencia, crecimiento celular 
y longevidad ya que frecuentemente el estrés está asociado a una reducción en la 
fotosíntesis y/o en la respiración celular, ocasionando una deficiencia energética, y en 
última instancia la detención del crecimiento y la muerte celular (Baena-González et al., 
2007; Smith A & Stitt M, 2007). Además, la deficiencia energética probablemente es 
una consecuencia de muchos tipos de estrés, sin importar su sitio y modo de 
percepción. Con base en lo anterior, se ha sugerido que el estrés es en parte 
decodificado como una señal de deficiencia energética, la cual dispara respuestas 
independientes en su origen, pero que convergen (Baena-González et al., 2007). 
Estudios comparativos de microarreglos han revelado que las distintas respuestas 
adaptativas se logran, en parte, a través de cambios en la expresión génica, siendo 
varios tipos de genes estimulados o reprimidos ante varios tipos de estrés. (Baena-
González et al., 2007; Walley et al., 2007; Kilian et al., 2007; Ma S & Bohnert H, 2007; 
Fujita M et al., 2006).En resumen, aunque tradicionalmente se asocian las respuestas 
al déficit energético con la deficiencia de carbohidratos y la oscuridad, es probable que 
sean disparadas, en diferente grado, por todas aquellas condiciones adversas que 
alteran los niveles de energía y de metabolitos. 
 
Al igual que otros organismos vivos, las plantas se enfrentan a frecuentes 
variaciones, a menudo prolongadas, de las condiciones ambientales y de la 
disponibilidad de nutrientes. Sin embargo, al ser organismos sésiles no pueden escapar 
de estos múltiples desafíos ambientales. Por esta razón, las fluctuaciones en el estado 
de energía o la privación energética es una parte inherente del estilo de vida de las 
plantas y puede ser causado por alteraciones en el ciclo normal día-noche, al 
� 2�
ensombrecimiento o a una extensión de las horas nocturnas (Smith A & Stitt M, 2007; 
Thimm et al., 2004). También puede ocurrir un desbalance energético en los tejidos de 
demanda secundarios cuando compiten con tejidos de demanda primarios por los 
fotoasimilados, como en el caso de semillas y frutos (Smith A & Stitt M, 2007) o en 
plántulas etioladas (plántulas cuyo crecimiento se da en condiciones de oscuridad y que 
no han alcanzado su capacidad fotosintética debido a la falta de clorofila en los tejidos) 
y tejidos que no han adquirido una competencia fotosintética plena (Rolland et al., 
2006). Un déficit energético también puede ser desencadenado por el secuestro de 
carbono por parte de patógenos o por muchas otras condiciones ambientales adversas 
como desecación, temperaturas extremas, contaminantes o inundaciones; todas ellas 
interfiriendo en la asimilación de carbono y/o en la respiración (Baena-González et al., 
2007). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Por esta razón, las plantas han desarrollado la capacidad, dentro de los límites 
dependientes de las especies, para aclimatarse a periodos prolongados de estrés, 
ejecutando un conjunto de adaptaciones morfológicas, fisiológicas y metabólicas para 
sobrevivir bajo estas condiciones, entre lo que se incluye la detención del crecimiento, 
la activación de vías catabólicas (con el objetivo de proveer a la planta de fuentes 
alternativas de nutrientes, metabolitos y energía) y una reducción en la actividad de 
Figura 1. Conexiones de las redes de señalización en 
plantas. Han emergido interacciones de las vías de 
señalización de azúcar, nutrientes, energía, hormonas, 
estrés y defensa. Luz, CO2, agua, O2, temperatura y 
sincronización son moduladores globales de la red de 
señalización, los cuales son esenciales para las 
respuestas de salida del sistema de la planta en el 
crecimiento, sobrevivencia, senescencia o muerte. Las 
funciones de una larga familia de componentes 
reguladores claves, incluyendo más de 3,000 reguladores 
transcripcionales (TRs), 1,400 E3 ligasas, más de 1,000 
proteínas cinasas (PKs) y proteínas fosfatasas (PPs) y 
numerosos RNAs regulatorios, estarán integrados en 
varias vías de señalización. Calcio y especies reactivas 
de oxígeno (ROS) son reguladores celulares universales 
y versátiles que actúan a través de diferentes sensores y 
compañeros de retransmisión para controlar diversas 
respuestas a señales. Muchas más vías de señalización y 
mediadores de esta, como hormonas, péptidos, 
metabolitos, lípidos, receptores, canales, transportadores, 
GTPasas, ATPasas, chaperonas, proteínas de 
andamiajes y diversas enzimas, no se presentan en el 
diagrama. Imagen modificada de Sheen (2010). 
	
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enzimas biosínteticas (Contento et al., 2004; Thimm et al., 2004; Baena-González et al., 
2007; Wang et al., 2007). En otras palabras, las plantas adaptan y modulan su 
metabolismo, así como el flujo de moléculas, nutrientes e información entre órganos 
para aclimatarse (Figura 1) (Walch-Liu et al., 2005; Liu et al., 2009). 
 
2.2. La familia SNF1/AMPK/SnRK1: integración de las señales de energía y estrés 
 
2.2.1. Generalidades 
 
Los organismos deben constantemente sentir e integrar muchos estímulos 
internos para optimizar el crecimiento y el desarrollo. Las diferentes señales son 
percibidas por receptores específicos y mediadas por cascadas de señalización para 
finalmente llevar a cabo respuestas celulares adecuadas, como la adaptación 
metabólica (Polge & Thomas, 2007). La fosforilación/defosforilación de proteínas ha 
sido reconocida como el mayor mecanismo de regulación postraduccional de la 
actividad de proteínas y en la transducción de señales intracelulares en organismos 
eucarioticos. Las enzimas encargadas de catalizar la fosforilación de otras proteínas se 
denominan proteínas cinasas. Se ha identificado un gran número de proteínas cinasas 
en diferentes organismos. La levadura Saccharomyces cerevisiae posee 113 genes que 
codifican proteínas cinasas (Hunter & Plowman, 1997), mientras que los humanos 
tienen 518 (Manning et al., 2002). Por otra parte, el genoma de Arabidopsis codifica 
1,085 proteínas cinasas (Hrabak et al., 2003), lo cual es cerca del 4% de los 25,500 
genes predichos para esta planta (Arabidopsis Genome Initiative, 2000). 
 
En plantas se han identificado unos complejos de proteínas cinasas involucradas 
en la señalización celular en respuesta a estrés por baja energía y al estatus de 
carbono (Baena-González et al., 2007; Fragoso et al., 2009; Coello et al., 2011; Nunes 
et al., 2013a; Nunes et al., 2013b), así como en respuestas relacionadas a hormonas y 
estrés durante el crecimiento y desarrollo de la planta (Radchuk et al., 2006; Baena-
González & Sheen, 2008; Martínez-Barajas et al., 2011; Cho et al., 2012; Nunes et al., 
2013a). A esta familia de proteínas cinasas de plantas se le denominó proteínas 
� 4�
relacionadas a SNF1-1 (SnRK1, SNF1-related kinase 1), y es miembro de una familia 
conservada de proteínas cinasas serina-treonina independientes de calcio que incluye a 
la proteína cinasa sacarosa no fermentadora 1 (SNF1, sucrose non-fermenting 1) de 
levaduras y a la proteína cinasa activada por AMP (AMPK, AMP-activated protein 
kinase) de mamíferos (Hardie, 2007; Baena-González et al., 2007), cuyos miembros se 
presentan como complejos heterotriméricos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Esta familia de cinasas heterotriméricas conservadas ejecutan un papel 
fundamental en la respuesta fisiológica de las células al regular el metabolismo y la 
homeostasis energética (Figura 2) (Hardie, 2007; Hardie & Sakamoto, 2006; Hedbacker 
& Carlson 2008; Bright et al., 2009), salvaguardando los niveles de energía celular al 
Figura 2. El convergencia de las señales de déficit energético al complejo SnRK1. Diferentes señales de entrada 
desencadenados por condiciones que generen déficit energético convergerán en el complejo cinasa SnRK1. Estas 
señales modularán la actividad de cinasa del complejo SnRK1 por regulación del estado de fosforilación del complejo, 
regulación alostérica por metabolitos indicadores de deficiencia energética o por regulación transcripcional de las 
diferentes subunidades del complejo. Esta modulación de la actividad de cinasa del complejo SnRK1 traerá como 
consecuencia general la inhibición de procesos biosintéticos y la promoción del catabolismo, mediante la fosforilación 
directa de enzimas y de factores transcripcionales (TFs), ocasionando esto último una reprogramación transcripcional. 
Como última consecuencia, se logra la aclimatación de la planta a las distintas condiciones ambientales y etapas del 
crecimiento. Imagen modificada de Baena-González E, Sheen J (2008). 
 
	
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regular la producción y consumo de ATP. Por esta razón no es de sorprender que se 
encuentren complejos heterotriméricos ortólogos en todos los eucariontes; desde 
levaduras (SNF1) a plantas (SnRK1) y mamíferos (AMPK) pasando por gusanos (AAK, 
AMP-activated kinase) e insectos (AMPK) (Ghillebert R et al. 2011). 
 
2.2.2. Familia génica de la SnRK 
 
Las plantas contienenun grupo de cinasas muy grande relacionadas a las 
cinasas tipo SNF1, aunque la mayoría de estas enzimas en Arabidopsis tienen una 
estructura primaria diferente en comparación con sus homólogos de levadura. Para la 
gran superfamilia de SnRKs, Halford y Hardie (1998) propusieron clasificarlas, con base 
en la similitud de la secuencia y la estructura del dominio catalítico en SnRK1, SnRK2 y 
SnRK3. Arabidopsis contiene 38 proteínas cinasas que están relacionadas a la familia 
de cinasas SNF1/AMPK/SnRK1 (Figura 3). Los genes de la SnRK1 han sido 
identificados y caracterizados en muchas especies de plantas. Están presentes en una 
familia de genes de pequeño y mediano tamaño, comprendiendo, por ejemplo, tres 
miembros en Arabidopsis y 10 a 20 miembros en cebada. Los genes de la familia de 
SnRK1 en los cereales se puede subdividir en dos grupos: SnRK1a y SnRK1b, con 
base en la secuencia de aminoácidos. La SnRK1a se expresa en toda la planta y esta 
más relacionada a la SnRK1 de plantas dicotiledóneas. La SnRK1b se expresa a 
niveles altos en la semillas, aunque es posible detectar bajos niveles de expresión en 
otras partes de la planta, y sólo esta presente en plantas monocotiledóneas (Halford et 
al., 2003). 
 
SnRK2s y SnRK3s tienen 42-45% de identidad en la secuencia de aminoácidos 
de la región catalítica con la SnRK1, SNF1 y AMPK, siendo de esta manera menos 
similares a la SNF1 y a la AMPK que a la SnRK (Halford & Hardie, 1998; Halford et al., 
2000). La subfamilia de genes SnRK2 y SnRK3 aparentemente son únicos de plantas y 
son relativamente grandes y diversos comparados con la de la SnRK1, existiendo en A. 
thaliana 10 proteínas cinasas SnRK2 y 25 proteínas cinasas SnRK3 (Halford & Hey, 
2009). Las SnRK2s y SnRK3s han divergido más de la SNF1 y la AMPK que la SnRK1, 
� 6�
lo cual se pone en evidencia no sólo por la identidad en la secuencia de aminoácidos 
del dominio catalítico, también en el hecho de que no complementan a la levadura 
mutante snf1Δ (Hrabak et al., 2003). Se ha sugerido que estas dos subfamilias de 
SnRKs emergieron durante la evolución de la planta como resultado de duplicación y a 
partir de ahí evolucionaron rápidamente, tomando nuevos papeles que permitieron 
conectar las señales metabólicas y las de estrés (Halford & Hey, 2009). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Las SnRK2s son cerca de 140 a 160 aminoácidos más pequeñas que las 
SnRK1s, promediando un tamaño cercano a los 40 kDa, y tiene un fragmento de 
aminoácidos ácidos característico en sus dominios C-terminales (Halford et al., 2000). 
Se han involucrado en las respuestas a estrés salino; por ejemplo, nueve de los diez 
miembros de SnRK2 presentes en Arabidopsis son activadas por estrés salino 
Figura 3. Árbol de secuencias para los 
miembros de la familia SnRK de A. 
thaliana, AMPK de humanos (Homo 
sapiens) y SNF1 de levaduras (S. 
cerevisiae) con base en el alineamiento 
de los dominios catalíticos de cinasa. 
Imagen tomada de Halford & Hey (2009). 
	
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(Boudsocq et al., 2004) y la sobreexpresión de SnRK2.8 ha mostrado que incrementa la 
tolerancia a la desecación y estimula genes inducidos por estrés (Umezawa et al., 
2004). La expresión de los tres miembros de la familia de SnRK2 en trigo PKABA1, 
W55a y TaSnRK2.4 es estimulado por el tratamiento de altas concentraciones de sal y 
la expresión de W55a y TaSnRK2.4 en Arabidopsis ha mostrado que incrementa la 
tolerancia a la sal (Holappa & Walker-Simmons, 1995; Xu et al., 2009; Mao et al., 2010). 
También se ha involucrado a las SnRK2s en las respuestas a ABA, pues mutantes de 
SnRK2.6 se ven afectadas en el cierre estomatal en respuesta a ABA (Mustilli et al., 
2002; Yoshida et al., 2002); además de que la actividad de SnRK2.6 es estimulada por 
esta hormona (Mustilli et al., 2002; Yoshida et al., 2002). 
 
El grupo SnRK3s es representado por cinasas previamente descritas como la 
proteína cinasa interactuante con CBL (CIPKs) (Kudla et al., 1999; Shi et al.,1999; Kim 
et al., 2000; Albrecht et al., 2001), salt overly sensitive (SOS2) (Zhu et al., 1998; Halfter 
et al., 2000; Liu et al., 2000) y la proteína cinasa S (PKS) (Guo et al., 2001). Estas 
proteínas cinasas interactúan con proteínas de unión a calcio como SOS3, SCaBPs y 
CBL, las cuales están relacionadas con los sensores neuronales de calcio de animales 
y a la subunidad B de la proteína fosfatasa calcineurina (Kudla et al., 1999; Kim et al., 
2000; Albrecht et al., 2001; Guo et al., 2001), por lo que se ha sugerido que son 
dependientes de Ca2+ y que intervienen en la señalización de éste ion. 
 
2.2.3. Estructura de los complejos cinasas SNF1/AMPK/SnRK1 
 
La familia de proteínas cinasas SNF1/AMPK/SnRK1 se presentan como 
complejos heterotriméricos, constituídos por una subunidad catalítica α y dos 
subunidades regulatorias β y γ (Figura 4). La formación de este heterotrímero es 
necesario para la estabilidad y actividad de cinasa del complejo. En plantas, la primera 
secuencia relacionada a la subunidad catalítica de los complejos SNF1/AMPK 
reportada fue RKIN1, aislado en una librería de cDNA de endospermo de centeno con 
base en la complementación de la mutante de levadura snf1 (Alderson et al., 1991). El 
gen codifica para una proteína de 58 kDa de 502 aminoácidos, y mostró una identidad 
� 8�
en la secuencia de 48% con AMPK y SNF1. En otras especies de plantas, como 
cebada, avena, papa, nabo y tabaco; se han clonado genes SnRK1 (Halford & Hardie, 
1998). En A. thaliana se han identificado tres genes SnRK1: AKIN10, AKIN11 y AKIN12. 
Los primeros dos genes codifican proteínas cinasas de una masa molecular de 
aproximadamente 58 kDa (Hrabak et al., 2003), mientras el último se ha identificado 
como un pseudogen. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Genes relacionados a la subunidad β fueron clonados posteriormente en A. 
thaliana (AKINβ1 y AKINβ2) y en papa (Solanum tuberosum, StubGal83). Las proteínas 
AKINβ1 y AKINβ2 interactúan con las otras dos subunidades del complejo SnRK1 en 
ensayos de doble híbrido. Dos familias de proteínas únicas de plantas muestran 
Figura 4. Características estructurales en las subunidades de los complejos cinasas SNF1/AMPK/SnRK1. Se 
muestran los diferentes dominios de cada unas de las subunidades, “clásicas” y “atípicas”, que componen los complejos 
cinasas presentes en levaduras (SNF1), mamíferos (AMPK) y plantas (SnRK1). En la subunidad catalítica α se muestra la 
fosfotreonina conservada en el bucle de activación, en el dominio de cinasa, a un lado del cual está la secuencia de 
autoinhibición (AIS). En el extremo C-terminal de la subunidad catalítica α (α-CTD) se ubica el dominio de interacción con 
la subunidad β (β-SID). En la subunidad β clásica se observa el dominio de unión a glucógeno (GBD) o dominio de unión 
al almidón (SBD) para el caso de plantas, seguido en el extremo C-terminal (β-CTD) del dominio de asociación de la 
cinasa, en donde ocurre la interacción son las subunidades α y γ para formar el complejo activo. En la representación de 
la subunidad γ se observa primero el dominio N-terminal divergente seguido de las repeticiones de cistatión-β-sintasa 
(CBS), que constituyen los dominios Bateman. Las unidades atípicas, específicas de plantas, son AKINβ3, que no posee 
SBD, a diferencias de las subunidades β clásicas, y AKINβγ, la cual contiene un SBD en el extremo N-terminal. Imagen 
modificada de Ghillebert R et al. (2011) 
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similitud con subunidades γ de levadura, las cuales son la familia PV42, la cual incluye 
PV42 de frijol (Phaseolus vulgaris) y AKINγ de Arabidopsis (Abe et al., 1995; Bouly et 
al., 1999) y la familia SnIP1 (Slocombe et al., 2002). A pesar de que se ha encontrado 
que interactúan con SnRK1 en ensayos de doble híbrido, no son capaces de 
complementar a la mutante snf4 de levadura. 
 
2.2.3.1. Subunidades clásicas 
 
La subunidad catalíticatipo α. La subunidad catalítica posee el mayor grado de 
conservación a través de las especies, y la identidad en la secuencia entre SNF1, 
AMPK y SnRK1 de centeno (RKIN1) se incrementa a 62-64% si se consideran sólo los 
dominios catalíticos (Halford et al., 2003). Esta subunidad posee las siguientes 
características estructurales: 
• Dominio de cinasa. Esta región esta localizada en la mitad de la porción N-
terminal de la proteína (Carling et al., 1994). En el dominio de cinasa, se 
encuentra una estructura secundaria denominada asa-T (T-loop), que a su vez 
contiene un residuo de treonina (Thr), el cual está conservado en las cinasas de 
todas las especies (Thr210 en Snf1, Thr172 en AMPK y Thr175 en AKIN10) 
(Figura 5). Es necesario que éste residuo de Thr sea fosforilado por cinasas 
corriente arriba para conferirle actividad de cinasa al complejo (Hedbacker & 
Carlson, 2008; Steinberg & Kemp, 2009; Polge & Thomas, 2007; Halford & Hey, 
2009; Shen et al., 2009). 
 
 
 
 
 
 
• Secuencia reguladora de autoinhibición (AIS, autoinhibition sequence). Se 
encuentra justo a un lado del dominio de cinasa, hacia la porción C-terminal. 
Bajo condiciones activantes puede ocurrir la interacción entre la subunidad γ y el 
Figura 5. Alineamiento de secuencias de 
aminoácidos dentro del asa-T para varios 
miembros de la familia SNF1/AMPK/SnRK1. El 
residuo de Thr que se fosforila para conferir la actividad 
al complejo cinasa se muestra subrayado y en negritas. 
Las secuencias son de bases de datos Gen Bank, 
EMBL o Swiss Prot, y pertenecen a: AMPK, rata; 
RKIN1, centeno; BKIN12, cebada; AKIN10, 
Arabidopsis; NPK5, tabaco; SNF1, levadura. Imagen 
tomada de Halford N, Hardie D (1998) 
	
   11	
  
dominio AIS, desreprimiendo la actividad de cinasa (Jiang & Carlson, 1996; Jiang 
& Carlson, 1997). 
• Dominio de interacción con la subunidad β (β-SID, β subunit interaction 
domain). Se encuentra cerca del extremo C-terminal. 
 
La subunidad reguladora tipo β. Este tipo de subunidad ha sido considerada como 
el andamiaje para la formación del complejo heterotrimérico, sobre el cual ocurre la 
interacción con las subunidades α y γ (Yang et al., 1992; Yang et al., 1994; Jiang & 
Carlson, 1996; Jiang & Carlson, 1997). Además, se ha implicado a las subunidades de 
tipo β en el control de la localización subcelular de los complejos cinasas y en la 
especificidad hacia determinados blancos (Bouly et al., 1999; Vincent & Carlson, 1999; 
Vincent et al., 2001; Gissot et al., 2004). En Arabidopsis las dos proteínas de tipo β, 
AKINβ1 y AKINβ2, presentan una identidad de secuencia de aminoácidos de 49% y 
55%, con respecto a las subunidades de tipo β de levaduras y mamíferos, dentro de las 
regiones que las caracterizan (Bouly et al., 1999). Estas regiones son: 
• Dominio de unión al glucógeno/almidón (GBD/SBD, glycogen binding 
domain/ starch binding domain). Este dominio fue inicialmente identificado 
como secuencia de interacción con la cinasa, (KIS, kinase interaction sequence) 
(Jiang & Carlson, 1997) y más tarde se identificó una región, superpuesta al 
dominio KIS, con características de dominio de N-isoamilasa (Hudson et al., 
2003). Este dominio fue denominado como GBD, debido a que en algunos casos 
tiene la capacidad de unir glucógeno en animales y levaduras (Ghillebert et al., 
2011; Sanz et al., 2013). Debido a que las subunidades de tipo β de Arabidopsis 
son capaces de unir almidón, el carbohidrato de reserva de las plantas, se ha 
sugerido que en plantas se denomine a este dominio como SBD (Ávila-
Castañeda et al., 2014). El dominio se localiza en medio de la proteína y es 
requerido para la interacción con la subunidad de tipo α en la SNF1 y la SnRK1, 
pero no es requerido para la formación de complejos de AMPK estables en 
mamíferos. Se ha sugerido que el GBD es un dominio regulatorio que inhibe la 
actividad de AMPK cuando se une a los puntos de ramificación dentro del 
glucógeno, actuando como un detector de glucógeno en células de mamífero 
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(McBride et al., 2009) y en plantas se ha encontrado que la adición de almidón 
inhibe la actividad de cinasa del complejo SnRK1 (Ávila-Castañeda et al., 2014). 
Un análisis estructural del GBD de AMPKβ1 unido a β-ciclodextrina reveló que 
los residuos críticos para la interacción proteína-carbohidrato son W100, K126, 
W133 y N150 (Polekhina et al., 2005). En AKINβ1 sólo se encuentran 
conservados el primer triptófano y la lisina, mientras que en AKINβ2 se hallan los 
dos triptófanos pero no el residuo de lisina. (Ávila-Castañeda et al., 2014) (Figura 
6). También se ha involucrado a las subunidades tipo β en la localización del 
complejo cerca de sus blancos putativos que participan en el metabolismo del 
glucógeno, como la glucógeno sintasa y la glucógeno fosforilasa (Hudson et al., 
2003; Polekhina et al., 2003). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
• Dominio de asociación con el complejo SNF1 (ASC, association with the 
complex SNF1). El dominio se encuentra en el extremo C-terminal de la 
proteína, y esta encargada de la interacción con la subunidad γ en SNF1 y 
SnRK1 (Jiang & Carlson, 1997), y con las subunidades α y γ de la AMPK (Iseli et 
al., 2005).� 
• Dominio N-terminal de la subunidad β (β-NTD, β-subunit N-terminal 
domain). Las subunidades β poseen un extremo N-terminal más variable, en 
comparación con los dominios GBD/SBD y ASC conservados. Se ha propuesto 
que este extremo variable es el encargado de controlar la localización subcelular 
de los complejos, mediante secuencias para la translocación núcleo-citoplasma 
(Hedbacker & Carlson, 2006) o secuencias de N-miristoilación para el transporte 
a membrana (Hedbacker & Carlson, 2006; Steinberg & Kemp, 2009). 
Figura 6. Alineamiento de secuencias de aminoácidos dentro del SBD/GBD para las subunidades AKINβ1, AKINβ2 
y AKINβγ, comparadas con AMPKβ1 de rata (Rattus norvergicus). Para el alineamiento se consideraron los 
aminoácidos 92-178 de AKINβ1, 93-180 de AKINβ2, 70-154 de AKINβγ y 7-154 de AMPKβ1. En la secuencia de 
AMPKβ1 se observan los aminoácidos críticos para la interacción carbohidrato-proteína en negritas y con asterisco. Se 
observa que las subunidades tipo β clásicas no conservan todos los aminoácidos críticos, mientras AKINβγ sí. Imagen 
tomada de Ávila-Castañeda A et al. (2014). 
	
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La subunidad reguladora tipo γ. Se ha involucrado a las subunidad de tipo γ de 
levaduras en la regulación de la actividad del complejo cinasa, pues Snf4 se une al 
dominio AIS de Snf1 y estabiliza la cinasa en una conformación abierta activa (Jiang & 
Carlson, 2006). Las subunidades tipo γ de Arabidopsis muestran una identidad en la 
secuencia de aminoácidos de 20-25% con Snf4 (Halford et al., 2003). Es a través de 
esta subunidad que la AMPK detecta la relación AMP/ATP intracelular. 
• Dominios Bateman (CBS, cystathionine β synthase). La subunidad γ se 
caracteriza por poseer dos pares de repeticiones de cistatión-β-sintasa (CBS), 
los cuales se llaman dominios Bateman. Se ha observado que éstos unen AMP 
para el caso de las subunidades de tipo γ de la AMPK (Hedbacker & Carlson, 
2006; Steinberg & Kemp, 2009); y que el nivel de conservación más alto entre 
Snf4, AMPKγ y SnRKγ se encuentra en los motivos CBS. 
• Dominio N-terminal de la subunidad γ (γ-NTD, γ-subunit N-terminal 
domain). Región divergente en el extremo N-terminal de la subunidad, en donde 
ocurre la interacción con la subunidad β (Crozet et al., 2014). 
 
2.2.3.2. Las subunidades atípicas de plantas 
 
 Además de las subunidades clásicas, en plantas han emergído subunidades del 
complejo heterotrimérico que no han sido descritas en otro reino (al menos no en 
cualquiera con los genomas completamente secuenciados) (Polge & Thomas, 2007). 
En Arabidopsis estas subunidades son AKINβ3 y AKINβγ. 
 
Subunidad AKINβ3. Las proteínas AKINβ3 aparecen como formas truncadas de 
las subunidades β, careciendo completamente de SBD, así como de laregión N-
terminal. Sin embargo, AKINβ3 de A. thaliana ha mostrado complementariedad con la 
triple mutante sip1Δ sip2Δ gal83Δ de levadura, sugiriendo que algunas funciones 
básicas se han conservado (Gissot et al., 2004; Polge et al., 2008). 
 
	
   14	
  
Subunidad AKINβγ. Un homólogo de la subunidad tipo SNF4/AMPKγ, AtSNF4, 
fue clonado por la complementación parcial de la mutante snf4 de levadura (Kleinow et 
al., 1999). Este gen codifica para la proteína proteína AKINβγ, la cual posee un SBD 
característico de las subunidades β y los dominios CBS característicos de AKINγ 
(Lumbreras et al., 2001). Esta subunidad es codificada por un solo gen. El SBD de esta 
subunidad es capaz de unir almidón; de hecho, a diferencia de las subunidades tipo β 
clásicas, AKINβγ posee los cuatro residuos críticos para la interacción proteína-
carbohidrato en el SBD (Ávila-Castañeda et al., 2014) encontrados en AMPKβ1 de rata 
(Polekhina et al., 2005). El alineamiento de la secuencias AKINβ1, AKINβ2 y AKINβγ 
reveló la presencia de una inserción de tres aminoácidos en AKINβγ (VPM), lo cual crea 
un rizo extra en el modelo estructural adyacente a uno de los triptófanos críticos para la 
unión a carbohidratos (Ávila-Castañeda A et al. 2014), la cual se ha propuesto que crea 
una superficie que favorece la asociación con el almidón sobre el glucógeno (Polekhina 
et al., 2005). Esta misma inserción se ha reportado también en la subunidad tipo 
AKINβγ de maíz (López-Paz et al., 2009). Se ha propuesto que estas subunidades 
forman complejos de dos componentes (Lumbreras et al., 2001; Ávila-Castañeda et al., 
2014); sin embargo, se ha observado que AKINβγ de Arabidopsis puede interactuar con 
las subunidades AKINβ in vitro e in vivo, indicando que es posible también la formación 
de complejos de tres componentes (Gissot et al., 2006). El mismo estudio también 
identificó el potencial de mecanismos de splicing alternativo en la regulación de la 
expresión de AKINβγ. 
 
1.2.4. Fosforilación de sustratos blanco 
 
Los complejos cinasas SNF1/AMPK/SnRK1 activos son capaces de ejecutar sus 
acciones regulatorias a través de la modulación de la actividad enzimática, vía 
fosforilación directa de enzimas o regulación de su expresión génica (Halford & Hey, 
2009). Para conservar el ATP, estos complejos cinasas inactivan varias enzimas 
involucradas en vías anabólicas. AMPK de mamíferos y SNF1 de levaduras fosforilan e 
inactivan in vitro a la acetil-CoA carboxilasa (Davies et al., 1990; Woods et al., 1994; 
Steinberg & Kemp, 2009), lo cual inhibe la formación de malonil-CoA a partir de acetil-
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CoA y, por lo tanto, la síntesis de ácidos grasos. Por otra parte, AMPK y SnRK1 inhiben 
la actividad de la 3-hydroxi-3-metil-glutaril-CoA (HMG-CoA) reductasa in vitro, la enzima 
que cataliza la reacción limitante de la síntesis de esteroles/isoprenoides (Clarke & 
Hardie, 1990; Beg et al., 1993; Ball et al., 1994; Ball et al., 1995). Para el caso de 
SnRK1 se ha encontrado que in vitro también fosforila e inactiva a la sacarosa fosfato 
sintasa (SPS), la cual cataliza la biosíntesis de sacarosa; la nitrato reductasa (NR), que 
cataliza la primer reacción involucrada en la asimilación de nitrógeno, la trehalosa 
fosfato sintasa 5 (TPS5) y la 6-fosfofructo-2-cinasa/fructosa-2,6-bisfosfatasa (F2PK), 
involucrada en procesos señalización y en el reparto de fostosintato, respectivamente. 
Para el caso de las enzimas NR, TPS5 y F2PK, la inactivación también requiere de la 
unión de la proteína 14-3-3. También se ha encontrado que la SnRK1 modula el estado 
rédox de la AGPasa, enzima clave en regulación de la biosíntesis de almidón en 
respuesta a altos niveles de sacarosa (Coello et al., 2010). Otros sustratos de la SnRK1 
son factores de transcripción. Se ha relacionado a la familia de factores 
transcripcionales bZIP en la reprogramación transcripcional mediada por SnRK1 en 
condiciones de estrés energético (Baena-González et al., 2007). También se ha visto 
que fosforila a la proteína de unión al elemento de respuesta a ABA (AREBP, ABA 
response elment protein) relacionando a la SnRK1 con las vías de señalización de ABA 
y de estrés (Zhang et al., 2008). 
 
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Figura 7. Secuencia consenso para la fosforilación por SnRK1 y comparación con las secuencias de los 
péptidos SAMS y AMARA. Los residuos requeridos se remarcan en gris. Los aminoácidos entre paréntesis no son 
requeridos pero incrementan la fosforilación por SnRK1. Se ha observado que el sitio consenso puede tener el 
aminoácido hidrofóbico en la posición +3, en vez de la posición +4. Bas, aminoácidos de naturaleza básica; Hyd, 
aminoácidos de naturaleza hidrofóbica; Xxx, cualquier otro aminoácido. Modificado de Halford et al. (2003). 
	
   16	
  
Con base en la secuencia alrededor del sitio de fosforilación por AMPK de la 
acetil-CoA carboxilasa de rata se desarrolló el péptido SAMS (HMRSAMSGLHLVLRR). 
A pesar de ser un sustrato relativamente específico para AMPK en extractos de hígado 
de rata (Davies et al., 1989), ha sido usado para detectar actividad de cinasa en 
extractos de planta (McKintosh et al., 1992). Después fue establecido un motivo de 
reconocimiento para el complejo cinasa SnRK1, usando variantes de péptidos como 
sustratos (Weekes et al., 1993). Comprende a la serina (Ser) fosforilada (SnRK1 
también fosforilaría residuos de Thr, pero fosforila Ser mucho más eficientemente), 
residuos hidrofóbicos en las posiciones -5 y +4 en relación a la Ser, y al menos un 
residuo básico, el cual puede estar a -3 o -4 (Figura 7). El péptido AMARA 
(AMARAASAAALARRR) retiene el motivo de reconocimiento mínimo para la 
fosforilación por parte de SnRK1, mientras los demás residuos son de alanina, aparte 
del extremo C-terminal básico usado para unir al péptido a la matriz durante los 
ensayos de cinasa. Se ha mostrado que residuos básicos en las posiciones -6 y +5 
incrementan la actividad (Huang & Huber, 2001). El péptido AMARA ha mostrado que 
es mejor sustrato que el péptido SAMS (Dale et al., 1995b). La identificación de 
péptidos sustratos para SnRK1 ha permitido la medición adecuada de la actividad de 
SnRK1 usando ensayos apropiados. 	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
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3. ANTECEDENTES 
 
3.1. Respuestas de la planta a la deficiencia de fosfato 
 
El fósforo es uno de los seis macronutrientes requeridos para las plantas, junto 
con nitrógeno, potasio, calcio, magnesio y azúfre. Las raíces de las plantas absorben al 
fósforo del suelo, en la forma química ortofosfato (Pi), mediante transportadores 
(Marschner, 1995). El Pi es un componente estructural de las membranas celulares, y 
a pH fisiológico, los grupos Pi poseen una carga negativa que previene la difusión. 
Igualmente se encuentran en los ácido nucleicos, confiriéndoles resistencia contra la 
hidrólisis. Además de su papel estructural, el Pi también está involucrado en varios 
procesos bioquímicos y de desarrollo, pues participa de manera dinámica en las 
cascadas de señalización mediante los procesos defosforilación/defosforilación. En el 
ATP funciona para transferir energía de los procesos productores de ésta, como la 
fotofosforilación, la fosforilación oxidativa y la fosforilación a nivel de sustrato, a los 
procesos biosintéticos dependientes de la energía celular, el bombeo de iones, y el 
trabajo mecánico. Por esta razón, el fósforo participa en las relaciones entre la 
fotosíntesis, la conservación de energía y el metabolismo del carbono. A pesar de que 
el P es un elemento abundante en la corteza terrestre, éste se encuentra poco 
disponible para las plantas debido a su baja rapidez de difusión y a la fijación como Pi 
orgánico o como sales inorgánicas insolubles con calcio, hierro o aluminio (Yuan & 
Dong, 2008). Esto hace que las concentraciones de Pi en el suelo sean a menudo muy 
bajas (2 a 10 µM) (Bieleski, 1973; Raghothama, 1999). Lo anterior lo hace uno de los 
macronutrientes más escasos e inaccesibles en el suelo y una de los principales causas 
de la limitación en el crecimiento de la planta (Schachtman et al., 1998; Abel et al., 
2002; Vance et al., 2003; Ticconi & Abel, 2004). 
 
Para mantener las concentraciones intracelulares de Pi, las plantas han 
desarrollado una serie de respuestas a la deficiencia de Pi (PSR, Pi-starvation 
response), ejecutadas mediante la integración de las señales por factores internos. Las 
PSR provienen, en parte, de la inducción coordinada de cientos de genes inducibles por 
	
   18	
  
la deficiencia de Pi (PSI, Pi-starvation inducible), y están involucrados en la adquisición 
y movilización del Pi, en vías metabólicas, transducción de señales, regulación 
transcripcional y en varios procesos relacionados con el crecimiento y desarrollo de la 
planta (Vance et al., 2003; Ticconi & Abel, 2004; Fang et al., 2009; Lin et al., 2009; 
Nilsson et al., 2010). 
	
  
2.2. SnRK1 en las respuestas a la deficiencia de Pi de la planta 
 
Se ha documentado que la actividad de SnRK1 cambia durante la deficiencia de 
Pi (Fragoso et al., 2009), lo cual abre la posibilidad de la participación de ésta cinasa en 
la regulación de las PSR. Una de las PSR observadas es la acumulación de almidón en 
las hojas, característica que se acentúa en mutantes akin10 de Arabidopsis, en 
comparación a plantas silvestres bajo deficiencia de Pi (Fragoso et al., 2009). La 
acumulación de almidón durante la deficiencia de Pi ha sido asociado directamente con 
una menor degradación de éste en la noche (Bernal et al., 2005; Fragoso et al., 2009) y 
la participación de la SnRK1 en el metabolismo del almidón se refuerza con los 
hallazgos de que el AKINβγ y AKINβ2 se unen al almidón y que éste inhibe la actividad 
de SnRK1 (Ávila-Castañeda et al., 2014). Otra relación que existe entre la señalización 
de la deficiencia de Pi y de SnRK1, es que por una parte las PSR son incrementadas 
por la presencia de sacarosa (Hammond & White, 2008), y por otro lado la actividad de 
SnRK1 es modulada por este carbohidrato (Baena-González et al., 2007). También se 
ha observado que existen cambios en los perfiles transcriptómicos durante la 
deficiencia de Pi, dependientes de la actividad de SnRK1. La mutante akin10 de 
Arabidopsis mostró, bajo condiciones de deficiencia de Pi, la inducción de genes 
involucrados en la síntesis de sacarosa (SPS4 y SPS2), en el metabolismo del azúcar 
(GAL1 y HEX) y en la formación de tilacoides (THF1); así como la inhibición de genes 
involucrados en el transporte de monosacáridos al tonoplasto (TMT2), en la 
degradación de proteínas (FBP y SKP), en la señalización de GTP (RAB) y en la 
transducción de señales (NPH), en comparación con plantas silvestres (Fragoso et al., 
2009). Todo esto podría reflejar la detección del estrés por deficiencia de Pi como 
estrés energético por la SnRK1, y ubicarla como punto de convergencia de diferentes 
cascadas de señalización. 
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La sobreexpresión de las subunidades catalíticas como proteínas de fusión a 
GFP en plantas de A. thaliana bajo diferentes regímenes de Pi, indicó que los 
complejos AKIN11-GFP disminuyeron su actividad durante la deficiencia de Pi, mientras 
AKIN10-GFP incrementó su actividad (Fragoso et al., 2009). Se determinó también que 
en plantas transgénicas sobreexpresando AKIN11-GFP, esta es degradada en 
condiciones de deficiencia de Pi. Además, se encontró que el incremento en la actividad 
de AKIN10 no se debe a alguna modificación el estado de fosforilación de la Thr175 
(Fragoso et al., 2009). Una posibilidad que explica todo lo anterior es que se estén 
formando distintos complejos SnRK1 bajo las diferentes codiciones de abasto de Pi, los 
cuales tendrían una actividad y especificidad por sustratos diferente. Resultados de 
nuestro grupo de trabajo revelaron la presencia diferencial de subunidades del 
complejo SnRK1 en suficiencia y deficiencia de Pi (Guerrero, 2012). 
 
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Con todo lo anterior en mente, fue posible pensar en encontrar sustratos blanco 
de la SnRK1 que estuvieran relacionados a las PSR (Figura 8). Una búsqueda in silico 
de potenciales proteínas blancos de la SnRK1, usando el programa ScanProsite 
(http://prosite.expasy.org/scanprosite/), encontró sitios potenciales de fosforilación por 
SnRK1 en el factor transcripcional PHR1 (PHOSPHATE STARVATION RESPONSE 1), 
Figura 8. Secuencia consenso para la fosforilación por SnRK1 y comparación con las secuencias de los 
péptidos SAMS y AMARA. Los residuos requeridos se remarcan en gris. Los aminoácidos entre paréntesis no son 
requeridos pero incrementan la fosforilación. Bas, residuos básicos; Hyd, residuos hidrofóbicos; Xxx, cualquier otro 
residuo. Para el caso de la np-G3PDHasa, el aminoácido hidrofóbico en la posición +3 o +4 no se encuentra, pero se ha 
demostrado la fosforilación de la np-G3PDHasa de T. aestivum en un residuo de Ser con una secuencia consenso que 
carece de este residuo hidrofóbico (Piattoni et al., 2011) 
	
   20	
  
en la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa no fosforilante (np-G3PDHasa) y en la 
fosfoenol piruvato carboxilasa (PEPC). Estas proteínas están involucradas en diferentes 
PSR por lo que nuestra hipótesis de trabajo es la siguiente: 
	
  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
	
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4. HIPOTESIS 
 
Si el complejo cinasa SnRK1 fosforila a las proteínas PHR1, np-G3PDHasa y PEPC, 
entonces el grado de fosforilación de éstas depende del régimen de Pi y del tejido de 
donde se obtengan las cinasas. 
 
5. OBJETIVOS 
 
• General. Comparar el efecto de la actividad SnRK1 proveniente de plantas 
crecidas en deficiencia y suficiencia de fósforo, a sobre sus proteínas blanco 
(PHR1, np-G3PDHasa y PEPC). 
 
• Particulares. 
o Obtener los cDNAs de np-G3PDHasa y PHR1. 
o Ligar los cDNAs a un vector de expresión. 
o Sobreeexpresar y purificar las proteínas recombinantes en bacterias de 
Escherichia coli. 
o Extraer la SnRK1 de plantas de A. thaliana, crecidas en deficiencia o 
suficiencia de fósforo. 
o Realizar los ensayos de fosforilación sobre las proteínas recombinantes 
con la SnRK1.� 11�
6. MATERIALES Y MÉTODOS 
 
6.1. Digestión de las construcciones pGEM-T Easy-np-G3PDHasa y pGEM-T 
Easy-PHR1. Los cDNAs np-G3PDHasa y PHR1 se encontraban ligados al vector 
pGEM-T Easy (Promega), por lo cual se tuvieron que digerir con las enzimas de 
restricción EcoRI y BamHI (Figura 9). Los sitios de restricción para estas enzimas se 
encontraban flanqueando cada uno de los cDNAs. Primero se digirieron los plásmidos 
con BamHI realizando la mezcla de digestión que consistía en 4 µL de solución 
amortiguadora REact® 3 10x (Invitrogen) (500 mM de Tris-HCl pH 8, 100 mM de MgCl2 
y 1 M de NaCl), 1 µg de DNA, 1 µL de la enzima BamHI (1U/µL) y agua estéril hasta 
obtener un volumen final de 40 µL. La reacción de digestión se incubó por 2 h a 37 ºC, 
después de lo cual se añadió a la mezcla la enzima EcoRI y se incubó la reacción a 37 
ºC por toda la noche. Por otra parte, también se digirió el vector de expresión pGEX-4T-
2 empleando las mismas enzimas de restricción. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6.2. Electroforesis en geles de agarosa. Para separar los ácidos nucleicos se 
realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1% (m/v), preparado en solución 
Figura 9. Mapas físicos de los plásmidos pGEM-T Easy-np-G3PDHasa y pGEM-T Easy-PHR1 . Los cDNAs 
de interés se encuentran flanqueados por los sitios de restricción BamHI y EcoRI, cuyas enzimas permitieron la 
liberación del cDNA y su posterior ligación en el vector de expresión en el sentido correcto. 
 
 
	
   23	
  
amortiguadora TAE (40 mM de Tris-HCl, 20 mM de ácido acético, 1 mM de ácido 
etilendiaminotetraacético (EDTA)) con bromuro de etidio. Las muestras se prepararon 
agregando amortiguador de carga 6x (25% (m/v) ficoll 400, 0.25% (m/v) de azul de 
bromofenol y 0.25% (m/v) de xilen cianol,) en una relación 1:6, y la electroforesis se 
realizó en presencia de solución amortiguadora TAE a 100 V. 
 
6.3. Purificación de los cDNAs np-G3PDHasa y PHR1, y el vector de 
expresión pGEX-4T-2 de un gel de agarosa. Los cDNAs y el vector de expresión 
fueron purificados de un gel de agarosa al 1%, empleando el kit comercial PureLinkTM 
Quick Gel Extraction (invitrogenTM), siguiendo las indicaciones de la casa comercial. 
 
 6.4. Ligación de los cDNAs np-G3PDHasa y PHR1 al vector de expresión 
pGEX-4T-2. La reacción de ligación de los cDNAs al vector de expresión pGEX-4T-2, 
consistió en 100 ng del vector, 17 ng del cDNA (np-G3PDHasa o PHR1), 2 µL de 
solución amortiguadora 10x (100 mM Tris-HCl pH 7.8, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 10 
mM ATP), 1 µL de ligasa (1U/µL) y un volumen de agua suficiente para llevar la 
reacción a 20µL. La mezcla de reacción se dejó en incubación a 4 °C toda la noche. 
 
6.5. Transformación de bacterias competentes de Escherichia coli DH5α por 
choque térmico. Una suspensión de bacterias de E. coli DH5α (100 µL), conservadas 
en refrigeración a -70 ºC, se descongelaron en hielo por 15 min. Se agregó 10 µL de la 
reacción de ligación (pGEX-4T-np-G3PDHasa o pGEX-4T-PHR1) y después se incubó 
la suspensión celular en hielo por 30 min. Transcurrido este tiempo, se aplicó un 
choque térmico de 42 ºC por 30 seg e inmediatamente se colocó la suspensión celular 
en hielo por 2 min. Se añadió 400 µL de medio LB estéril y se incubó la suspensión 
celular a 37 ºC con agitación (250 rpm) por 2 h. Terminado el tiempo de incubación, se 
vertieron las células en una placa de agar al 1% con medio LB y ampicilina (100 µg/mL) 
y se incubaron a 37 ºC toda la noche. 
 
6.6. Purificación de los plásmidos pGEX-4T-2-np-G3PDHasa y pGEX-4T-2-
PHR1. Para la purificación de los plásmidos, primero se inocularon 5 mL de medio LB 
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con ampicilina (100 µg/mL) con una colonia bacteriana de E. coli DH5α transformada. 
Se incubó el medio inoculado a 37 ºC con agitación (250 rpm) toda la noche. Se 
transfirió el cultivo a un tubo de microfuga y se centrifugó a 14000xg por 1 min. Se 
descartó el sobrenadante y se resuspendió la pastilla en 200 µL de Solución de 
Resuspensión. Se adicionaron 200 µL de Solución de Lisis, la cual consistía de 0.2 M 
de NaOH y 0.1% de dodecil sulfato de sodio (SDS), y se mezcló por inversión. Después 
se añadió 350 µL de una solución de AcOONa 3M pH 5, se mezcló por inversión y se 
centrifugó la mezcla a 14000xg por 10 min. El sobrenadante se transfirió a otro tubo de 
microfuga, se añadió 1 volumen de isopropanol y se dejó la mezcla a -20 ºC por 1 h. 
Transcurrido éste tiempo, se centrifugó a 14000xg por 5 min a 4 ºC, y se resuspendió la 
pastilla en 300 µL de agua deionizada. Se agregaron 5 µL de RNasa (20 mg/mL), y se 
incubó la mezcla a 37 ºC por 30 min. Entonces, se añadió 1 volumen de 
fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (PCI) y se agitó la mezcla en un vórtex. Se 
centrifugó a 17000xg por 2 min, y se recuperó la fase acuosa. Se añadió 1/3 de 
volumen de solución de AcOONH4 10 M y 3 volúmenes de etanol absoluto frío. Se dejó 
la mezcla a -20 ºC por 1 h. Se centrifugó a 17000xg a 4 ºC por 15 min y se descartó el 
sobrenadante. Después se lavó las pastilla con etanol al 70% frío (1 mL) dos veces, se 
dejó secar y se disolvió la pastilla en 50 µL de agua deionizada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 10. Mapas físicos de los plásmidos pGEX-4T-2 Easy-np-G3PDHasa y pGEX-4T-2 Easy-PHR1. Estos 
plásmidos permiten que se codifique una proteína recombinante fusionada a GST, GST:np-G3PDHasa y 
GST:PHR1. Fueron introducidos en bacterias BL21 RIL para su sobreexpresión y la GST permitió su purificación 
por cromatografía de afinidad. 
 
	
   25	
  
Se purificó el plásmido proveniente de 4 colonias por cada uno de los cDNAs y 
de cada una de las purificaciones se tomaron 3 µL, a los cuales se les realizó un 
ensayo de restricción, empleándose las enzimas BamHI y EcoRI. De esta manera se 
liberaron los cDNAs, haciendo posible evidenciar la presencia de estos en las 
construcciones con pGEX-4T-2 (Figura 10). 
 
6.7. Transformación de bacterias competentes de E. coli BL21 pRIL. Con los 
plásmidos que contenían el cDNA de la proteína de interés, se realizó la transformación 
de bacterias de E. coli BL21 pRIL, empleando la misma metodología descrita para la 
transformación de las bacterias de E. coli DH5α. Para éste caso se empleó 1 µL de 
plásmido purificado y vertieron 150 µL de la suspensión celular ya transformada a las 
placas de agar, al 1% con medio LB y ampicilina (100 µg/mL), 
 
6.8. Sobreexpresión de las proteínas recombinantes. 
6.8.1. Optimización de las condiciones de sobreexpresión de 
las proteínas recombinantes. Para establecer la mejores condiciones de 
sobreexpresión de las proteínas recombinantes, se probaron diferentes 
temperaturas de crecimiento y diferentes concentraciones del inductor 
isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosido (IPTG). Se tomó una de las colonias 
de E. coli BL21 pRIL transformadas con el plásmido correspondiente 
(pGEX-4T-2-np-G3PDHasa o pGEX-4T-2-PHR1) y con ella se inocularon 
8 mL de medio LB con ampicilina (100 µg/mL). Se incubó el medio 
inoculado toda la noche, bajo agitación (250 rpm) a 37ºC. Con la 
suspensión celular obtenida se inocularon 50 mL de medio LB con 
ampicilina (100 µg/mL), adicionando un volumen suficiente del precultivo 
para alcanzar un valor de DO600 entre 0.05 y 0.1. Se dejaron crecer las 
bacterias con agitación (250 rpm), a temperaturas de incubación de 37 ºC, 
18 ºC ó temperatura ambiente. Cuando se alcanzó un valor de DO600 
entre 0.6 y 0.8, se tomó una alícuota de los cultivos (control no inducido) y 
posteriormente se adicionó al cultivo solución de IPTG 1 M, utilizándose 
un volumen de solución necesaria para obtener concentraciones del 
	
   26	
  
inductor en el cultivo de 0.1 mM ó 0.5 mM. Los cultivo inducidos, y los 
controles se incubaron bajo agitación (250 rpm) a la temperatura de 
incubación correspondiente. El tiempo de incubación después de la 
inducción a una temperatura de 37ºC fue de 3 h, a temperatura ambiente 
fue de 5 h ya 18 ºC fue de toda la noche. Una vez terminado el tiempo de 
incubación, se centrifugó la suspensión celular a 4000xg por 20min a 4ºC, 
se descartó el sobrenadante y se guardó la pastilla a -70 ºC hasta el 
momento de su uso. 
 
La pastilla se resuspendió en una solución de lisis que consistía en 
PBS 1x (13.7 mM de NaCl, 1 mM Na2HPO4, 0.27 mM KCl y 0.2 mM de 
KH2PO4 a pH 7.0) con 1 mM de benzamidina, 1 mM de fluoruro de 
fenilmetilsulfonio (PMSF), 1 mM de ditiotreitol (DTT), 1 mM de EDTA, 1% 
(v/v) de TritonX-100 y 1 mg/mL de lisozima), considerándose que por cada 
10 mL de cultivo se emplearía 1 mL de ésta solución. La suspensión se 
dejó en incubación a temperatura ambiente por 30 min, y posteriormente 
se sonicó a 21% de amplitud, empleando 1 pulso de 10 seg. Se centrifugó 
el lisado a 15000xg por 30 min, a 4ºC. El sobrenadante se transfirió a otro 
tubo mientras que la pastilla se resuspendió en PBS 1x, alcanzándose un 
volumen equivalente al del sobrenadante. Ambos se analizaron por 
electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% en condiciones 
desnaturalizantes, SDS-PAGE. 
 
6.8.2. Sobreexpresión de las proteínas recombinantes. Se 
determinó que las mejores condiciones para sobreexpresión de las 
proteínas recombinantes eran con una concentración de inductor IPTG de 
0.1 mM a una temperatura de incubación de 18 ºC. Se siguió un 
procedimiento similar al descrito con anterioridad. Para la sobreexpresión 
de la proteina np-G3PDHasa se tomó una de las colonias de E. coli BL21 
pRIL transformadas con el plásmido pGEX-4T-2-np-G3PDHasa y con ella 
se inocularon 50 mL de medio LB con ampicilina (100 µg/mL). Se incubó el 
	
   27	
  
medio inoculado toda la noche, bajo agitación (250 rpm) a 37ºC. Con la 
suspensión celular obtenida se inocularon 200 mL de medio LB con 
ampicilina (100 µg/mL), adicionando un volumen suficiente del precultivo 
para alcanzar un valor de DO600 entre 0.05 y 0.1. Se dejaron crecer las 
bacterias con agitación (250 rpm) a 18 ºC. Cuando se alcanzó un valor de 
DO600 entre 0.6 y 0.8, se tomó una alícuota del cultivo (control no inducido) 
y posteriormente se adicionó al cultivo solución de IPTG 1 M, utilizándose 
un volumen de solución necesaria para obtener concentraciones del 
inductor en el cultivo de 0.1mM. Los cultivos inducidos, y los controles se 
incubaron bajo agitación (250 rpm) a una temperatura de 18 ºC por toda la 
noche. Una vez terminado el tiempo de incubación, se centrifugó la 
suspensión celular a 4000xg por 20 min a 4 ºC, se descartó el 
sobrenadante y se guardó la pastilla a -70 ºC hasta el momento de su uso. 
 
La pastilla se resuspendió en una solución de lisis (solución PBS 1x 
con 1 mM de benzamidina, 1mM de fluoruro de fenilmetilsulfonio (PMSF), 
1mM de ditiotreitol (DTT), 1mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 
1% (v/v) de TritonX-100 y 1mg/mL de lisozima), considerándose que por 
cada 10 mL de cultivo se emplearía 1 mL de ésta solución. La suspensión 
se dejó en incubación a temperatura ambiente por 30 min, y 
posteriormente se sonicó a 21% de amplitud, empleándose 5 pulsos de 10 
seg, con intervalos de descanso de 1 min. Se centrifugó el lisado a 
15000xg por 30 min, a 4ºC. El sobrenadante se transfirió a otro tubo 
mientras que la pastilla se resuspendió en PBS 1x, alcanzándose un 
volumen equivalente al del sobrenadante. Ambos se analizaron por 
electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% en condiciones 
desnaturalizantes, SDS-PAGE. 
 
Para la obtención de la proteína PHR1, se realizó el mismo 
procedimiento, se utiilizaron bacterias de E. coli BL21 pRIL transformadas 
con el plásmido pGEX-4T-2-PHR1, empleandose un cultivo de 1 L. 
	
   28	
  
 
6.9. Purificación de las proteínas recombinantes por columna de afinidad. 
Las proteínas recombinantes fusionadas a GST (GST:np-G3PDHasa y GST:PHR1) se 
purificaron empleando una resina a la cual estaba unida glutatión reducido (GSH) 
(QIAGEN). En una columna de plástico se agregó 1 mL de la suspensión que contenía 
la resina al 50% (500 µL de volumen de cama), y posteriormente se equilibró la 
columna con 10 volúmenes de cama de la solución PBS-EW (PBS 1x con 1 mM de 
EDTA y 1 mM de DTT). Una vez equilibrada la resina, se pasó la fracción soluble del 
lisado celular, separándose una alícuota para el análisis posterior. Se lavó la columna 
con otros 10 volúmenes de cama de la solución PBS-EW y se realizó la elución de la 
proteína unida con la solución amortiguadora TNGT (50 mM de Tris-HCl pH 8.0 con 400 
mM de NaCl, 20 mM GSH reducido, 0.1 % (v/v) Tritón-x-100 y 1 mM de DTT). Se 
determinó el enriquecimiento de las fracciones con la proteína recombinante mediante 
una electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% en condiciones desnaturalizantes, 
SDS-PAGE. La concentración de proteína recombinante se determinó por el método 
colorimétrico de Bradford. 
 
6.10. Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida en condiciones 
desnaturalizantes, SDS-PAGE. Para la separación de proteínas se siguió el 
procedimiento descrito por Laemmli (1970). A las proteínas a separar se les añadió 
solución amortiguadora de carga 4x, que consistía de 125 mM Tris-HCl pH 6.0, 20% 
(v/v) de glicerol, 4% (v/v) de dodecil sulfato de sodio (SDS), 0.4% (m/v) de azul de 
bromofenol, en una relación 1:4. Las muestras se calentaron a 90 ºC por 5 min y las 
proteínas desnaturalizadas se colocaron en un gel de poliacrilamida, que consistía en 
un gel apilador con 3% (m/v) de acrilamida y un gel separador con 12% (m/v) de 
acrilamida. La electroforesis se realizó con solución amortiguadora de corrida (25 mM 
de Tris-HCl pH 8.3, 192 mM de glicina y 0.1% (m/v) de SDS) a 120 V. Después de la 
electroforesis se procedió a teñir el gel con una disolución de Coomassie R (0.25% 
(m/v) de azul brillante, 10% (v/v) de ácido acético y 50% (v/v) de metanol) por 30 min y 
agitación, seguido del uso de una solución de desteñido (7.5% (v/v) de ácido acético y 
30% (v/v) de metanol) por toda la noche y agitación. Para el ensayo de fosforilación de 
	
   29	
  
las proteínas blancos, después de la electroforesis se procedió a realizar la 
transferencia de las proteínas como se describe más adelante. 
 
6.11. Determinación de la concentración de proteína por le método de 
Bradford. Para la determinación de proteína total se empleó el método descrito por 
Braford (1976). El reactivo de Bradford (Bio-Rad) empleado se encontraba en una 
concentración 5x, empleándose, por tanto, un volumen de 200 µL para un volumen total 
de 1 mL. La curva de calibración se construyó con base en una disolución de albúmina 
sérica bovina (BSA) de 1 mg/mL, tomándose diferentes volúmenes (Tabla 1). Después 
de 5 min de incubación a temperatura ambiente de la mezcla de proteína con el reactivo 
de Bradford a 1 mL de volumen total, se determinó el valor de absorbancia a λ=595 nm 
en un espectrofotómetro Ultrospec 2000. Para las muestras se realizó un procedimiento 
similar, tomándose volúmenes de la proteína recombinante obtenida que dieran valores 
de absorbancia dentro de la curva de calibración. 
 
Tabla 1. Volumenes empleados de BSA para la construcción de la curva de calibración 
Volumen de reactivo 
de Bradford 5x (µL) 
Volumen de BSA 
1mg/mL (µL) 
Masa de BSA (µg) Volumen de agua (µL) 
200 0 0 800 
200 2 2 798 
200 4 4 796 
200 6 6 794 
200 8 8 792 
200 10 10 790 
 
6.12. Remoción de la GST de las proteínas recombinantes. Antes de realizar 
el corte, se dializó la proteína recombinante, obtenida de la cromatografía de afinidad. 
Se colocó la proteína recombinante dentro de una membrana semipermeable de 
celulosa (Sigma-Aldrich) y se colocó en 1 L de solución amortiguadora de corte 1x (50 
mM de Tris-HCl pH 8.0 y 10 mM CaCl2). La diálisis se llevó a cabo por 3 días, 
cambiando la solución amortiguadora cada 24 h. 
 
	
   30	
  
Ya con la muestra dializada, se procedió a realizar el corte con el kit comercial. Laremoción de la glutatión-S-transferasa (GST), de la proteína recombinante, se realizó 
empleando el kit comercial Thrombin CleanCleave™ (Sigma-Aldrich). Se siguieron las 
especificaciones seguidas por la casa comercial, con algunas modificaciones. Para la 
digestión de 1 mg de proteína recombinante se tomaron 100 µL de la suspensión de la 
resina con trombina, la cuál esta al 50% (50 µL de volumen de cama), y se colocaron en 
un tubo de microfuga. Se lavó la resina 2 veces con solución amortiguadora de corte 1x, 
recuperándose la resina por centrifugación a 500xg por 5 min. Después, se añadió 100 
µL de la solución amortiguadora de corte 10x (Tris-HCl pH 8.0 50mM y CaCl2 10 mM) y 
un volumen equivalente a 1 mg de la proteína recombinante. Se llevó el volumen de 
reacción a 1 mL y se dejó en agitación a temperatura ambiente por 24 h. Se tomaron 
muestras de la reacción de digestión a las 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 12 y 24 h, para determinar 
el tiempo óptimo de la reacción de digestión, separando la resina del sobrenadante por 
centrifugación a 500xg por 5 min, y se guardaron las muestras obtenidas a -70 ºC, 
hasta su uso. Una vez transcurridas las 24 h, se recuperó la reacción de digestión y se 
almacenó a -70 ºC,. Las muestras de la reacción de digestión se cargaron en un gel de 
poliacrilamida al 12% y se realizó una electroforesis en condiciones desnaturalizanres, 
SDS-PAGE, para su análisis. 
 
La resina se regeneró lavándola primero con 500 µL de solución amortiguadora de 50 
mM de Tris-HCl pH 8.0 con 500 mM de NaCl, y después se realizaron cuatro lavados 
con 500 µL de una solución amortiguadora con 50 mM de Tris-HCl pH 8.0. La resina se 
conservó como una suspensión al 50% (v/v), usando una solución amortiguadora de 20 
mM de Tris-HCl pH 8.0 con 50% de glicerol, a 4 ºC. La resina no se usó más de 15 
veces y sólo se empleó para el corte de una sola proteína recombinante fusionada a 
GST, para evitar contaminación cruzada. 
 
6.13. Obtención de la PEPC de Amaranthus hypochondriacus. La PEPC de 
Amaranthus hypochondriacus empleada en este estudio fue amablemente 
proporcionada por el grupo de trabajo de la Dra. Rosario Adelaida Muñoz Clares. 
 
	
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6.14. Obtención de las plantas de Arabidopsis thaliana. Primero se realizó un 
lavado de las semillas de A. thaliana ecotipo Columbia, empleándose una solución que 
consistía en 50% v/v de hipoclorito de sodio concentrado y 0.01% de Tween 20; y 
posteriormente se realizaron 10 lavados con agua deionizada estéril (1 mL). De manera 
aséptica, se colocaron entre 20 y 30 semillas en frascos con 10 mL de medio basal 
Gamborg B5 con mínimo de orgánicos (Sigma-Aldrich) y 1% de sacarosa, a pH entre 
5.2 y 5.5. Se incubaron las semillas 3 días a 4 ºC, después de lo cual se colocaron las 
semillas en una cámara de crecimiento, con agitación (150 rpm) a 22ºC y un fotoperiodo 
de 8 h con luz y 16 h de oscuridad. Después de 1 semana, se cambió el medio de 
crecimiento de manera asceptica por medio Hoagland con fosfatos (solución con 1mM 
NH4H2PO4, 6mM KNO3, 4 mM Ca(NO3)2�H2O, 2 mM MgSO4�7H2O, 9 µM MnCl2�4H2O, 
46 µM H3BO3, 8 µM ZnSO4�7H2O, 3 µM CuSO4�5H2O, 1 µM H2MoO4�H2O y 0.01 g/L 
Fe(II)-EDTA) con 1% de sacarosa, a un pH entre 5.2 y 5.5. Se volvieron a colocar las 
plantas en la cámara de crecimiento por 1 semana. Transcurrido éste tiempo, el medio 
de crecimiento se cambió por medio Hoagland con fosfatos o medio Hoagland sin 
fosfatos, lavándose previamente las plantas con agua deionizada estéril. Se crecieron 
las plantas por 1 semana más, después de lo cual se retiraron de la cámara. Se separó 
raíz de hojas, y los tejidos se congelaron en N2 líquido y se conservaron en refrigeración 
a -70 ºC hasta su uso. 
 
6.15. Purificación de la actividad de SnRK1. Hojas y raíces fueron trituradas 
en un mortero en presencia de N2 líquido y se homogeinizaron con una solución 
amortiguadora para SnRK1 (50 mM de tricina pH 8.0, 50 mM de NaF, 1 mM de EDTA, 1 
mM de ácido etilenglicoltetraacetico (EGTA), 1 mM de DTT, 50 mM NaCl, 1 mM de 
benzamidina, 0.1 mM de PMSF, 0.2 % (v/v) de Brij 35, 10% (v/v) de glicerol, 25 mM de 
β-glicerolfosfato, 10 mM de pirofosfato de sodio, 2 mM de ortovanadato de sodio y 1x 
de cóctel de inhibidor de proteasas (Sigma-Aldrich)) más 2 % (m/v) polivinipirrolidona 
(PVPP). El homogenizado se filtró con la ayuda de gasas y el filtrado se centrifugó a 
18000xg por 30 min a 4 ºC. Se realizó un fraccionamiento grueso de las proteínas, 
precipitandolas con la adición de (NH4)2SO4, hasta obtener una solución al 50 %, bajo 
	
   32	
  
agitación por 1 h a 4 ºC. La mezcla se centrifugó a 18000xg por 30 min, se descartó el 
sobrenadante y la pastilla se resuspendió en la solución amortiguadora de SnRK1. 
 
El extracto generado se pasó por una columna de Sephacryl S-300, previamente 
equilibrada con la solución amortiguadora para SnRK1 y calibrada con marcadores 
moleculares. Se determinó que el volumen vació de la columna era de 40 mL, y se 
colectaron fracciones de 1 mL a partir de la fracción 41. A cada una de las fracciones 
se le determino actividad de SnRK1. Aquellas fracciones con actividad de SnRK1, 
obtenidas de la columna de filtración molecular, se juntaron y se pasaron por una 
columna de intercambio aniónico (Source 15Q GE Healthcare) previamente equilbrada, 
utilizando la solución amortiguadora para SnRK1. Las proteínas no unidas se lavaron 
extensivamente con la misma solución amortiguadora. Las fracciones se eluyeron 
usando la solución amortiguadora con un gradiente lineal de NaCl, desde 50 a 500 mM. 
Se colectaron 20 fracciones de 1 mL, a las cuales se les midió actividad de SnRK1. 
 
El extracto generado se pasó por una columna de Sephacryl S-300 (GE 
Healthcare), previamente equilibrada con la solución amortiguadora de SnRK1 y 
calibrada con marcadores moleculares. Se determinó que el volumen vacio de la 
columna era de 40 mL, por lo que se colectaron fracciones de 1 mL a partir de la 
fracción 41. A cada una de las fracciones generadas se les determinó la actividad de 
SnRK1. Las fracciones con actividad de SnRK1 se juntaron y se pasaron por una 
columna de intercambio aniónico Source 15Q (GE Healthcare) previamente equilibrada 
con la solución amortiguadora de SnRK1. Las fracciones no unidas se lavaron 
extensivamente con esta solución amortiguadora. Las fracciones se eluyeron usando la 
solución amortiguadora con un gradiente de NaCl que partía desde 50 mM hasta 500 
mM. Se colectaron 20 fracciones de 1 mL, a las cuales se les midió la actividad de 
SnRK1. La fracción con mayor actividad de SnRK1 se pasó por una columna de 
exclusión molecular Superdex 200 (GE Healthcare) previamente equilibrada con 
solución amortiguadora de SnRK1 y calibrada con marcadores moleculares. Se 
colectáron fracciónes de 0.5 mL y a cada una se le determinó la actividad de SnRK1. 
 
	
   33	
  
6.16. Ensayos de actividad de SnRK1. Para los ensayos de actividad de cinasa 
se siguió el procedimiento descrito por Davies et al. (1999), con las modificaciones de 
Sugden et al. (1999). En placas de microtitulación se colocó la mezcla de reacción, que 
consistía de 40 mM de HEPES pH 7.5, 5 mM de MgCl2, 200 mM de ATP mezclado con 
12.5 kBq [γ-33P]ATP (GE Healthcare), 200 mM de péptido AMARA 
(AMARAASAAALARRR), 4 mM de DTT, 0.5 mM de inhibidor de fosfatasas y 1x de 
coctel de inhibidor de proteasas (Sigma-Aldrich), en un volumen final de 25 µL. El 
ensayo se inició con la adición de la actividad de SnRK1 purificada (5 µL) y se llevó a 
cabo a una temperatura de 30 ºC. Después de 6 min de iniciada la reacción, se tomó 
una alícuota de 15 µL y se colocó sobre un papel de fosfocelulosa Whatman P81 de 2 
cm x 2 cm. Inmediatamente se realizaron 3 lavados del papel con una solución de ácido 
fosfórico al 1% (v/v), seguido de un lavado con acetona. Una vez secos, los papeles se 
colocaron en un coctel de centelleo y se realizó la medición de lascuentas por minuto 
en un contador Beckman Coulter LS 6500. La actividad específica se expresó en nmol 
Pi/min/mg de proteína. 
 
6.17. Ensayos de fosforilación in vitro. En un tubo de microfuga, se agregó 
una mezcla de reacción con 40 mM de HEPES pH 7.5, 5 mM de MgCl2, 200 mM de 
ATP con 2 mCi de [γ-33P]ATP (3000 mCi), 4 mM de DTT, 1x de inhibidor de proteasas 
(Sigma-Aldrich), 1x de inhibidor de fosfatasas, 2 µg de cada una de las proteínas y 2.5 
µL de la SnRK1 purificada; en un volumen final de 20 µL. Para los ensayos de 
fosforilación se emplearon las proteínas recombinantes y BSA como control negativo. 
Además se realizó un ensayo de fosforilación con agua en vez de usar alguna proteína, 
para determinar si existía alguna proteína copurificada con la cinasa, que pueda ser 
fosforilada por ésta. La reacción se inició cuando se añadió la cinasa y la mezcla se 
incubo por 30 min a 30 ºC. Transcurrido este tiempo, se adicionó solución 
amortiguadora de carga para detener la reacción. Las muestras se cargaron en un gel 
de poliacrilamida al 12% y se realizó una electroforesis en condiciones 
desnaturalizantes, SDS-PAGE. Después, se transfirieron las proteínas a una membrana 
de fluoruro de polivinilideno (PVDF), usando un sistema húmedo (Bio-Rad) con 
solución amortiguadora de transferencia que consistía en 124 mM de Tris-HCl, 96 mM 
	
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de glicina y 20% (v/v) de metanol a 100 V por 1 h en frío. Una vez transferidas las 
proteínas, se secaron y se colocaron sobre una pantalla Imaging Screen HD (Bio-Rad) 
durante 24 horas para luego analizar la imagen en un fotodocumentador Personal 
Molecular Imager FX (Bio-Rad). 
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
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7. RESULTADOS 
 
7.1. Obtención de los cDNAs de np-G3PDHasa y PHR1 ligados al vector de 
expresión pGEX-4T-2 
 
Los vectores de clonación pGEM-T Easy con los cDNAs np-G3PDHasa y PHR1, 
así como el vector de expresión pGEX-4T-2 se sometieron a una digestión con las 
enzimas de restricción BamHI y EcoRI. La digestión de los vectores de clonación con 
los cDNAs dio como resultado la presencia de dos fragmentos, como se muestra en el 
gel de la electroforesis de la digestión (Figura 11). Se observa para estos casos la 
obtención de dos bandas, una de un tamaño aproximado de 3000 pb y otra de tamaño 
menor a 1500 pb. Se puede presumir que la primer banda pertenece al vector de 
clonación, mientras que las otras bandas corresponderían a los cDNAs np-G3PDHasa 
y PHR1, los cuales poseen un tamaño de 1230 pb y 1491 pb, respectivamente. Por otra 
parte, la digestión del vector de expresión pGEX-4T-2 con las enzimas de restricción 
mencionadas produce la eliminación de 9 pb, fragmento que no es detectado en la 
electroforesis bajo las condiciones descritas y se manifiesta con la presencia de una 
sola banda en el gel de la electroforesis (Figura 11). Esta banda se ubica entre los 
marcadores de 6557 pb y 4361 pb, lo cual corresponde con el tamaño del vector de 
expresión de aproximadamente 4900 pb. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El vector de expresión y los cDNAs se purificaron de este gel para realizar la 
ligación de cada cDNA al vector de expresión. La ligación se vio facilitada gracias a que 
se emplearon las mismas enzimas de restricción en las digestiones, lo cual dejó 
Figura 11. Digestión de pGEX-4T-2, pGEM T-Easy 
np-G3PDHasa , y pGEM T-Easy-PHR1. En el 
primer carril del gel de agarosa al 1% se observa el 
marcador de tamaño molecular ( HindIII), mientras 
que en los otros tres carriles se muestran los 
plásmidos digeridos con las enzimas de restricción 
BamHI y EcoRI. 
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extremos cohesivos con nucleótidos complementarios entre los extremos del cDNA y 
del vector. Además, el uso de dos enzimas de restricción distintas posibilita, en 
principio, la adecuada direccionalidad del cDNA al momento de la ligación, asegurando 
que el cDNA este en el marco de lectura adecuado. Con el producto de ligación (pGEX-
4T-2-npG3PDHasa y pGEX-4T-2-PHR1), se transformaron bacterias de E. coli DH5α y 
se crecieron en medio sólido LB, con ampicilina como compuesto de selección. Se 
tomaron 4 colonias de cada una de las transformaciones realizadas, se crecieron en 
medio líquido LB con ampicilina y se purificaron los plásmidos. Para determinar si los 
plásmidos purificados contienen el cDNA, se realizó un ensayo de restricción con las 
enzimas EcoRI y BamHI y a estas digestiones se les realizaron una electroforesis en 
un gel de agarosa (Figura 12). En todas las purificaciones se observó una banda 
ubicada entre los marcadores de 6657 pb y 4361 pb, lo que correspondería al vector de 
expresión (4900 pb) y una banda que se encuentra por debajo del marcador de 2027 
pb, que sería el cDNA, ya sea npG3PDHasa o PHR1. Con éstos resultados se puede 
presumir que todos los plásmidos purificados pertenecían al vector de expresión con el 
cDNA ligado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
7.2. Sobreexpresión y obtención de las proteínas recombinantes GST:np-
G3PDHasa y GST:PHR1 
 
Se usó uno de los plásmidos purificados para transformar bacterias de E. coli 
BL21 pRIL, las cuales se sembraron en medio sólido LB, con ampicilina como factor de 
Figura 12. Digestión de los plásmidos pGEX-4T-2-np-G3PDHasa pGEX-4T-2-PHR1. En 
el primer carril del gel de agarosa al 1% se observa el marcador de tamaño molecular 
(λHindIII), mientras que en los otros carriles se muestra los plásmidos purificados de las 
distintas colonias tomadas (C1-4), digeridos con las enzimas de restricción BamHI y EcoRI. 
	
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selección. Una vez que se contó con las colonias de las bacterias transformadas, fue 
posible realizar la sobreexpresión de la proteína recombinante, realizándose en un 
principio con temperaturas de incubación de 37 ºC y temperatura ambiente, y 
concentraciones del inductor IPTG de 0.0 mM, 0.5 mM y 1.0 mM. Después de la 
inducción se recuperaron las bacterias, se lisaron y se separó la fracción soluble e 
insoluble. A las diferentes fracciones obtenidas se les realizón una electroforesis en gel 
de poliacrilamida (Figura 13), con el objetivo de evidenciar en cual de estas fracciones 
se encontraba la proteína recombinante. Las proteínas np-G3PDHasa y PHR1 tienen 
un peso molecular de 54 kDa y 46 kDa respectivamente, las cuales en este caso 
poseen la proteína GST de 26 kDa fusionada en el extremo N-terminal, esperándose de 
esta manera proteínas recombinantes de un peso molecular de alrededor de 75 kDa. 
En los geles de la electroforesis se observa la sobreexpresión de la proteína 
recombinante GST:np-G3PDHasa bajo todas las condiciones de inducción empleadas 
(Figura 13a). Sin embargo, se observa que la fracción insoluble contiene casi la 
totalidad de la proteína recombinante en estas condiciones de sobreexpresión y el 
aumento en la cantidad de inductor IPTG aparentemente no incrementa la cantidad de 
la proteína recombinante (Figura 13a). Para el caso de la GST:PHR1, se revela un 
patrón semejante al descrito para la sobreexpresión de GST:np-G3PDHasa, estando 
las fracciones insolubles enriquecidas con la proteína recombinante (Figura 13b); pero 
en este caso se observa una mayor sobreexpresión de la proteína recombinante a una 
temperatura de 37 ºC y a altas concentraciones de IPTG. 
 
Las proteínas recombinantes no se observaron en la fracción soluble debido a 
que se encuentran acumuladas en agregados insolubles llamados cuerpos de inclusión. 
Estas partículas de agregados pueden observarse por microscopía de campo claro, 
debido a su propiedad refractaria, en el citoplasma como ovoides o cilindros porosos 
con una una longitud y volumen característicos de 1 µm y 0.6 µm3, respectivamente 
(Carrió et al., 1998; Bowden et al., 1999; Taylor et al., 1986). Bajo condiciones 
adecuadas, los