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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE CIENCIAS Identificación de variantes de RNA mensajero del gen que codifica para la proteína E asociada al centrómero expresadas en líneas celulares tumorigénicas de origen epitelial T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: BIÓLOGA P R E S E N T A : CINDY EDITH JIMÉNEZ ÁVILA DIRECTOR DE TESIS: Dr. Sergio Juárez Méndez 2015 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Hoja de Datos del Jurado 1. Datos del alumno Jiménez Ávila Cindy Edith 15178918 Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Ciencias Biología 411023243 2. Datos del tutor M. en C. Sergio Juárez Méndez 3. Datos del sinodal 1 Dr. Raúl Rodríguez Peralta 4. Datos del sinodal 2 Dr. Fabián Jesús Arechavaleta Velasco 5. Datos del sinodal 3 M. en C. Alberto Rojas Ochoa 6. Datos del sinodal 4 M. en C. Vanessa Villegas Ruíz Agradecimientos Académicos Este trabajo estuvo bajo la dirección del Dr. Sergio Juárez Méndez, investigador del Laboratorio de Oncología Experimental del Instituto Nacional de Pediatría, al cual agradezco infinitamente por todo el apoyo brindado para la elaboración de este trabajo, por compartir conocimientos, por guiarme en todo momento y por sus críticas constructivas; sin su apoyo no hubiera sido posible la realización de este proyecto. Reitero mi agradecimiento por su amistad brindada. Agradezco a la M. en C. Vanessa Villegas Ruíz investigadora de la Unidad de Investigación del Instituto de Oftalmología FAP Conde de Valenciana IAP, por su apoyo brindado en el desarrollo de esta investigación, con la realización de lectura de Secuencias y por su participación como jurado para la revisión de este trabajo, sus comentarios fueron enriquecedores para este escrito. Al Dr. Fabián Jesús Arechavaleta Velasco, por haber aceptado participar como miembro del jurado para la evaluación de este trabajo, enriqueciendo el trabajo. Al Dr. Raúl Rodríguez Peralta y al M. en C. Alberto Rojas Ochoa, por su aceptación como miembros del jurado, por sus comentarios acertados en este trabajo. El jurado estuvo constituido por: Presidente: Dr. Raúl Rodríguez Peralta Vocal: Dr. Fabián Jesús Arechavaleta Velasco Secretario: Dr. Sergio Juárez Méndez Suplente: M en C. Alberto Rojas Ochoa Suplente: M en C. Vanessa Villegas Ruíz Agradecimientos Personales A mi familia A mi mamá, por todo su gran amor, cariño, cuidados, consejos, trabajo y sacrificios todos estos años y sobre todo por su apoyo incondicional. A mi papá, por sus sabios consejos, cariño, apoyo incondicional, por su trabajo y sacrificios todos estos años. A mis hermanas, por su cariño, compañía, paciencia y apoyo A mi hermano, por su cariño y apoyo. A mi familia en general, por su apoyo incondicional Agradezco a los integrantes del Laboratorio de Oncología Experimental, especialmente a Karina e Itzel, por su amistad, ayuda y comentarios en la realización de esta trabajo Gracias a los amigos y compañeros de este viaje, a los profesores de la Facultad de Ciencias Identificación de variantes de RNA mensajero del gen que codifica para la proteína E asociada al centrómero expresadas en líneas celulares tumorigénicas de origen epitelial ÍNDICE 1. RESUMEN .................................................................................................................................... 8 2. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................................... 9 2.1. Cáncer .................................................................................................................................. 9 2.2 Splicing Alternativo ........................................................................................................... 11 2.2.1 Primeros estudios procesamiento de RNA mensajero ............................................ 11 2.2.2 Generalidades del SA ................................................................................................. 12 2.2.3 Spliceosoma ............................................................................................................... 12 2.2.4 Mecanismo .................................................................................................................. 13 2.2.5 Regulación .................................................................................................................. 16 2.2.6 Tipos de SA ................................................................................................................. 18 2.2.7 Función........................................................................................................................ 19 2.3 Splicing alternativo en enfermedades .............................................................................. 20 2.4 Splicing alternativo en cáncer .......................................................................................... 21 2.5 CENP-E ............................................................................................................................... 25 2.5.1 Descubrimiento de CENP-E ....................................................................................... 26 2.5.2 Estructura de CENP-E ................................................................................................ 26 2.5.2.1 Dominio Cinesina-motor ......................................................................................... 27 2.5.2.2 Dominio central espiral bobina .............................................................................. 27 2.5.2.3 Dominio C-Terminal ................................................................................................ 28 2.5.3 Función CENP-E ......................................................................................................... 29 2.5.3.1 Congresión de los cromosomas ............................................................................ 30 2.5.3.2 Checkpoint mitótico ................................................................................................ 33 2.5.3.3 Otras funciones ....................................................................................................... 33 2.5.4 Patologías ................................................................................................................... 34 3. JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................................ 35 4. HIPÓTESIS................................................................................................................................. 36 5. OBJETIVOS ............................................................................................................................... 36 5.1 Objetivo General ................................................................................................................36 5.2 Objetivos particulares ....................................................................................................... 36 6. METODOLOGÍA ......................................................................................................................... 37 6.1 Cultivo celular .................................................................................................................... 37 6.2 Extracción de RNA total .................................................................................................... 37 6.3 Diseño de primers ............................................................................................................. 38 6.4 RT-PCR punto final ............................................................................................................ 39 6.5 Secuenciación .................................................................................................................... 41 6.6 Análisis de la secuencia .................................................................................................... 42 7. RESULTADOS ........................................................................................................................... 43 7.1 Evaluación de la expresión de variantes de RNAm de CENP-E ..................................... 43 7.2 Evaluación de la expresión de la región CENP-E ............................................................ 46 7.3 Expresión de la variante 4 de CENP-E ............................................................................. 50 7.4 Traducción in silico ........................................................................................................... 50 7.5 Patrón de splicing .............................................................................................................. 53 8. DISCUSIÓN ................................................................................................................................ 55 9. CONCLUSIONES ....................................................................................................................... 62 10. PERSPECTIVAS ..................................................................................................................... 63 11. REFERENCIAS....................................................................................................................... 64 8 1. RESUMEN El cáncer constituye un problema de salud pública, a nivel mundial es la segunda causa de muerte. Las células cancerígenas se caracterizan por la acumulación de múltiples alteraciones genéticas, cambios epigenéticos, inestabilidad genómica, activación de oncogenes, inactivación de genes supresores de tumores. El splicing alternativo provee un importante mecanismo de regulación involucrado en diversos procesos biológicos; tiene un impacto en el fenotipo celular, esto se debe a que puede generar diferentes RNA mensajeros maduros que pueden traducirse a proteínas con funciones distintas. Se ha evidenciado al splicing alternativo como un importante papel en cáncer. La expresión de variantes aberrantes afecta significativamente muchos eventos celulares críticos en el desarrollo de la enfermedad. En este estudio se evaluó la expresión de transcritos de la proteína E asociada al centrómero (CENP-E), con el fin de identificar nuevas variantes del gen. La identificación de las variantes de CENP-E fue confirmado mediante RT-PCR y Secuenciación Sanger, se evidenciaron dos transcritos del gen no reportados hasta el momento. Estas nuevas variantes podrían jugar un papel importante en el desarrollo del cáncer. 9 2. INTRODUCCIÓN 2.1. Cáncer El cáncer es una enfermedad multifactorial que se caracteriza por un proceso de crecimiento y diseminación no controlado de células que conduce a la formación de una masa de tejidos, la cual, se le denomina tumor. Existen múltiples tipos de tumores y pueden aparecer prácticamente en cualquier tejido. Para el desarrollo de la enfermedad se han descrito diversas etapas las cuales son: Iniciación, promoción, formación del tumor y metástasis (Frank et al. 2010; Oliveira et al. 2007). El cáncer se clasifica de acuerdo al órgano en el que se origina la enfermedad. Se le denomina carcinoma, a un crecimiento excesivo de células epiteliales; sarcoma, al crecimiento de tejido conectivo; leucemias, mielomas y linfomas a células de la sangre; neuroblastomas y gliomas a células del sistema nervioso (Burke 2004). El origen del cáncer es controvertido y hasta cierto punto desconocido, se le asocia a diversos factores como: ambientales, moleculares y celulares. En éste último encontramos características como: la acumulación de múltiples alteraciones genéticas, cambios epigenéticos, inestabilidad genómica, activación de oncogenes, inactivación de genes supresores de tumores, entre otros. Se ha demostrado que los cambios moleculares juegan un papel importante en la célula, ya que promueve procesos celulares asociados a cáncer como: insensibilidad a señales inhibitorias de crecimiento, evasión de la muerte celular programada, potencial replicativo ilimitado, angiogénesis sostenida, evasión de la respuesta inmune, promoción de la inflamación y desregulación energética celular (Hanahan & Weinberg 2011). Como se mencionó anteriormente, el cáncer es una enfermedad que se genera por la acumulación diversas alteraciones (Sarkar et al. 2013; Sandoval & Esteller 2012). Se han reportado una gran cantidad de alteraciones genómicas, incluidas: mutaciones puntuales, translocaciones, amplificaciones, deleciones y variaciones 10 del número de copias. Se ha determinado que estas alteraciones pueden promover cambios en la expresión génica, incluyendo: expresión génica aberrante en oncogenes, abatimiento de la expresión de supresores de tumores, expresión de genes mutados con función anormal (Vogelstein et al. 2013). Por otra parte, las alteraciones genómicas son frecuentemente acompañadas por alteraciones epigenéticas en el desarrollo del cáncer (Choi & Lee 2013; Suvà et al. 2013). Estas modificaciones afectan la función de las proteínas resultantes, como: supresor de tumor y oncogenes, y una diversidad de genes relacionados con el cáncer que afecta varios proceso celulares (proliferación celular, apoptosis, sistema inmune, entre otros) (Choi & Lee 2013). Por otra parte, en estudios recientes se ha evidenciado que los procesos transcripcionales incluido el Splicing Alternativo (SA); juegan un papel primordial en el desarrollo y progresión del cáncer. Dada la importancia de este proceso, algunos autores han propuesto la inclusión del SA como otro Hallmark del cáncer (Ladomery 2013). El cáncer constituye un problema de salud pública. Según las estimaciones de la Agencia Internacional para la Investigación sobre Cáncer (IARC) a nivel mundial es la segunda causa de muerte, sólo después de las enfermedades cardiovasculares. En el 2012 había 14,1 millones de casos nuevos en todo el mundo, las estimaciones de muertes por esta enfermedad fue de 8,2 millones (alrededor de 22,000 muertes al día) (Globocan, 2012). A nivel mundial en el 2012 los tres tipos de cáncer más comúnmente diagnosticado fue en hombres: próstata, pulmón y colorrectal; en mujeres: mama, colorrectal y de pulmón. La tasa de incidencia es ~25 % mayor en los hombres que en mujeres (Globocan, 2012). En México, según la Unión Internacional Contra el Cáncer (UICC), esta enfermedad es la tercera causa de muerte, después de las enfermedades cardiovasculares y la diabetes, se estima que cada año se detectan 128,000 casos nuevos. Los tipos de cáncer que causan mayor número de muertes por año son: pulmón, estómago, hígado, colon y mama (SSA, SPPS, 2013). 11 2.2 Splicing Alternativo El proyecto de secuenciación del genoma humano, ha planteado preguntas importantesacerca de la naturaleza de la complejidad genómica. Se informó que el genoma humano tiene aproximadamente entre 25,000 y 30,000 genes, pero se calculan más de 300,000 transcritos distintos, un número mucho mayor que el número de genes. Esta diferencia considerable entre el número de genes y transcritos, se puede deber a que a partir de un RNA mensajero no maduro (pre- RNAm), pueden generar varios transcritos (variantes) mediante el SA (Modrek & Lee 2002; Kalsotra & Cooper 2011). 2.2.1 Primeros estudios procesamiento de RNA mensajero Aunque el concepto de SA se introdujo por primera vez en la década de 1970, sólo unos pocos cientos de genes han sido reconocidos hasta la fecha con SA. En 1977, fue por primera vez cuando se observaron isoformas de RNA mensajero, a estos genes se les denomino Split genes o genes segmentados debido a la diferencia que marcaban con respecto a lo que hasta ese momento se conocía (Modrek & Lee 2002). Los intrones y exones fueron descubiertos por Walter Gilbert en el gen hexon de adenovirus. Se predijo, que diferentes rearreglos de corte alternativo de exones generan diversas moléculas de mRNA (Modrek & Lee 2002). Estudios posteriores realizados en la mosca D. melanogaster; fueron fundamentales para demostrar que el proceso de diferenciación sexual en la mosca dependía de SA. Además, se evidenció al gen Dscam, que presenta múltiples sitios de SA y puede generar potencialmente 38,016 isoformas de proteínas diferentes. Estos estudios sentaron las bases para empalme alternativo, proceso importante en la regulación postrancripcional, ya que contribuye en diversos procesos celulares como: diferenciación, proliferación, entre otros. Estos procesos celulares son consecuencia de la expresión de muchas isoformas de proteínas, con función biológica diferente. 12 2.2.2 Generalidades del SA Los genes en organismos eucariotas, se encuentran frecuentemente interrumpidos por secuencias no codificantes (intrones), que deben ser eliminadas. El splicing es el proceso donde los intrones son removidos del RNA inmaduro, para producir moléculas de RNA mensajero (RNAm) codificantes. Por otro lado, el splicing alternativo ocurre cuando algunos exones, intrones o porciones de los mismos, son incluidos de manera diferencial en el transcrito, de manera que se producen diversas moléculas de RNAm a partir de un mismo precursor inmaduro. Se estima que >90% de los genes humanos tiene SA, este proceso es importante ya que constituye la principal fuente para generar la diversidad proteica en eucariotas. Aunque, se estima que entre el 15 y el 50% de las enfermedades genéticas humanas son originadas por algún defecto en el SA, apenas empieza a dilucidarse la extraordinaria contribución del SA en diferentes procesos biológicos y patológicos (Chen et al. 2012). Cada episodio de SA permite generar diferentes moléculas de RNAm, que puede a su vez generar diferentes productos proteicos a partir de un mismo molde, incrementando la capacidad codificante de los genes. Este es un sistema finamente regulado (encendido/apagado) en la expresión de variantes proteícas que en algunos casos son tejido específicas. Por ejemplo, la expresión de variantes proteícas en el desarrollo embrionario, la regulación es fina (espacio- temporal) (Chen et al. 2012; Blencowe 2006). 2.2.3 Spliceosoma El spliceosoma es un complejo dinámico de RNA-proteína, es una de las máquinas celulares más complejas que se encuentra en los eucariotas, con un ciclo funcional altamente regulado. Esta sofisticada enzima tiene una notable plasticidad en el reconocimiento del sustrato y puede reconocer diferentes regiones del pre-RNAm (Ast 2004; Hoskins & Moore 2012). 13 El spliceosoma está constituido por cinco RNAs pequeños nucleares (snRNA), estos se asocian con proteínas y forman complejos conocidos como partículas ribonucleoproteicas pequeñas nucleares (snRNPs), además de esto, un gran número de proteínas (más de 150 proteínas) auxiliares cooperan para reconocer con precisión los sitios de empalme y catalizar las dos etapas de la reacción de empalme (Chen & Manley 2009; Matlin et al. 2005). El spliceosoma, reconoce secuencias dentro del pre-mRNA, la mayoría de las cuales están localizadas en intrones. A pesar que, se han identificado secuencias consenso y sitios adyacentes de reconocimiento de las snRNPs, no es posible definir una secuencia única para el splicing. El reconocimiento de las snRNPs, está dada por la complementariedad de bases entre el pre-RNAm, así como la interacción entre las mismas snRNPs. Las diferentes snRNPs se van ensamblando en el spliceosoma de acuerdo como se va requiriendo a lo largo del procesamiento (Figura 1B) (Ast 2004; Hoskins & Moore 2012; Matlin et al. 2005). 2.2.4 Mecanismo El splicing alternativo del pre-RNAm requiere de cuatro elementos que actúan en cis: los sitios 5' y 3' de corte y empalme alternativo, la secuencia de punto de bifurcación (PBS) y el tracto de polipirimidinas. Además, factores que actuan en trans (proteínas reguladoras) y la estructura secundaria del pre-RNAm; en conjunto forman el “código de splicing” (Figura 1A) (Keren et al. 2010; Ast 2004; Matlin et al. 2005; McManus & Graveley 2011). 14 Figura 1: Maquinaria de Splicing. a) Los cuatro elementos conservados que permiten el reconocimiento del pre-RNAm por el spliceosoma: los sitios 5' y 3' de corte y empalme alternativo, la secuencia de punto de bifurcación, y el tracto de polipirimidinas. b) Se muestran los pasos clave en el proceso de splicing, así como, distintos complejos que dan lugar al spliceosoma. c) Factores de regulación que actúan en cis y en trans (tomado y modificado de Chen & Manley, 2009; Keren et al., 2010; Kornblihtt et al., 2013). De manera general, el SA ocurre cuando el ensamble del spliceosoma es iniciado con el reconocimiento del sitio de splicing 5´ (5´ss) por snRNA U1 y la unión del factor de splicing (SF1) al punto de bifurcación; la unión de estas dos ribonucleoproteínas conforman el complejo E´, el cual, es independiente de ATP. Posteriormente, el complejo E´ recluta al factor auxiliar U2 (U2AF) y se une al tracto de polipirimidina en la región 3´ terminal, otro complejo heterodimero U2F65/U2AF35 se une al sitio de splicing 3´ (3´ss); a este arreglo de proteínas y RNA se le denomina complejo temprano (E) (Chen & Manley 2009). Posteriormente, se remplaza SF1 por U2, mediante la complementariedad de su componente de RNA con la cadena, al punto de bifurcación con ayuda de U2ASF, mediante una reacción dependiente de ATP. Este nuevo arreglo produce la complementariedad de bases entre U2 y la hebra de RNA, sea tal, que la adenina 15 del punto de bifurcación salga un poco de la cadena y quede expuesta para producirse la reacción de transesterificación, a este arreglo se le denomina complejo A, también conocido como complejo pre-spliceosoma (Figura 1B) (Chen & Manley 2009; McManus & Graveley 2011; Matlin et al. 2005). En el siguiente paso se recluta complejo tri-snRNP formada por U4, U5 y U6, ocurren nuevos cambios conformacionales, promoviendo la formación del complejo B. Finalmente, la forma catalítica del spliceosoma resulta de la formación del complejo C por la pérdida de snRNP (U1 y U4) (Figura 1B). Consecuencia de esto, hay un acercamiento del 5´ss y el sitio de bifurcación, lo que facilita la primera reacción de transesterificación, donde el 2´OH de la adenina produce un ataque nucleofílico sobre el fosforilo de la guanina del sitio 5´ss. En la siguiente reacción, U5 ayuda a traer a proximidad los exones de los sitios 5´ss y 3´ss, que completan la segunda reacción de transesterificación entre el 3´OH, formado por la primera reacción y el fosforilo de la guanina del 3´ss. Finalmente, se libera el RNAm y las snRNPs las cuales, siguen unidasla estructura en forma de lazo resultante (lariat), formada por la unión entre el punto de bifurcación y el 5´ss recién formado. Al degradarse el RNA que forma el lariat, las snRNPs son liberadas y recicladas para su nuevo uso (Ast 2004; Matlin et al. 2005; Chen & Manley 2009). Para explicar, el reconocimiento de las secuencias que serán removidas o reconocidas como intrones, y aquellas que serán reconocidas como exones; las regiones a escindirse están delimitadas por secuencias específicas, y esenciales conocidas como: definición de intrones (ID) y definiciones exones (ED). ID tiene lugar cuando la maquinaria de splicing reconoce una región intrónica y coloca la maquinaria de empalme sobre la región, por su parte ED, tiene lugar cuando la maquinaria basal se coloca a través de los exones (Keren et al. 2010; Ast 2004; Matlin et al. 2005). Los sitios de splicing 3´ y 5´, consisten en una secuencia consenso, que son reconocidos por componentes del spliceosoma. Los sitios de splicing pueden ser fuertes o débiles dependiendo de su proximidad y diferencias con la secuencia 16 consenso. Esto determina efectivamente sus afinidades por los factores de splicing. En general, los sitios de splicing fuertes conducen a splicing constitutivo y utilizan todas las funciones del sitio. El porcentaje de los sitios de splicing débiles, varía dependiendo del contexto celular, incluso a niveles de saturación de los componentes normales de spliceosomal. La cercanía de los sitios splicing fuertes y débiles a lo largo de un pre-RNAm, conducen a la competencia del SA. El grado en que se utilizan los sitios débiles está regulada por factores de SA (Kornblihtt et al. 2013; McManus & Graveley 2011). Se ha demostrado que los exones alternativos, poseen sitios de empalme más débiles que los exones empalmados constitutivamente, permite el reconocimiento subóptimo de los exones por la maquinaria de empalme y conduce al corte y empalme alternativo (E. Kim et al. 2008; McManus & Graveley 2011). 2.2.5 Regulación El SA es un mecanismo sumamente regulado, éste, se da de manera diferencial en los distintos tejidos y procesos celulares, para mantener un estado fisiológico saludable y garantizar el correcto desarrollo de los linajes celulares (Matlin et al. 2005; Cáceres & Kornblihtt 2002; Chen & Manley 2009). El SA está regulado en distintos niveles, el nivel básico; incluye el reconocimiento del sitio de splicing por el spliceosoma, la activación o represión del mismo, que está mediada por varias proteínas (Ast 2004; Matlin et al. 2005). El splicing es regulado por numerosos elementos que actúan en cis (secuencia del pre-RNAm), así como por factores que actúan en trans (proteínas nucleares), estos regulan los sitios débiles del SA (Figura 1C) (Matlin et al. 2005). Dentro de la secuencia del pre-RNAm se encuentran secuencias reguladoras que se les denomina en cis, juegan un papel importante en la regulación del SA, ya que promueven activación o represión del splicing, tal como: potenciadores y silenciadores respectivamente, afectando el uso de un sitio de splicing. Estas secuencias se encuentran tanto en regiones exonicas e intronicas. Las regiones 17 potenciadoras se clasifican de la siguiente forma: secuencias exonicas potenciadoras de splicing (ESE), secuencias intronicas potenciadores de splicing (ISE). Las secuencias silenciadores del splicing son: secuencias exonicas silenciadoras de splicing (ESS) y secuencias intronicas silenciadoras de splicing (ISS) (Figura 1C) (Matlin et al. 2005; Ast 2004). Por otro lado, los factores que actúan en trans funcionan a través de la unión a potenciadores y/o silenciadores, entre ellas, las proteínas ricas Ser / Arg (SR), estas proteínas pueden tener una función dual en el SA, ya que se pueden reprimir o promover el SA, pero comúnmente están vinculados con ESE. En cambio la ribonucleoproteina heterogénea nuclear (hnRNP), se le ha asociado con una actividad de reprimir y que generalmente se unen a ESS e ISS. Sin embargo algunas hnRNP tales como hnRNP F y hnRNP H, así como factores específicos de tejido como nPTB y PTB, NOVA y FOX, se ha demostrado su unión a ISE y promover el splicing (Kornblihtt et al. 2013; Keren et al. 2010) (Figura 1C). Actualmente, se sabe que cambios en la concentración de dichos factores, pueden ser responsables de modificar el splicing en diversos tipos celulares y el nivel de diferenciación. Además, la expresión de algunos factores de splicing pueden estar regulados a su vez, por eventos de SA. Mientras que la funcionalidad, la localización y la actividad de varios factores pueden regularse también por su estado de fosforilación (Pohl et al. 2013). Otros niveles de regulación del SA, es mediado por la estructura de la cromatina, así como también la maquinaria de transcripción (RNA polimerasa II), promotores, factores de transcripción, co-activadores potenciadores de la transcripción, remodeladores de la cromatina; promueven el SA, por lo que se ha demostrado que el splicing es un evento co-transcripcional (Keren et al. 2010; Chen & Manley 2009; McManus & Graveley 2011). Por otro lado, cambios y mutaciones dentro de la secuencia del RNAm, da lugar a alteración en los sitios de reconocimiento del splicesosoma (ID y ED) generando la omisión o retención de intrones y exones. Además, pueden afectar las secuencias 18 ESE, ISE, ESS, ISS que promueven la omisión o retención de exones/intrones (Kornblihtt et al. 2013). Como se había mencionado anteriormente, cada vez hay más evidencias donde se observa que la cromatina tiene un papel clave en el SA a través de modificaciones de histonas y el posicionamiento de nucleosomas (Keren et al. 2010; Kornblihtt et al. 2013). Patrones de SA cambian constantemente bajo condiciones fisiológicas, lo que permite responder a los cambios medio- ambientales. 2.2.6 Tipos de SA Las posiciones relativas de los sitios débiles y fuertes dan lugar a los diferentes patrones de SA que incluye: escisión de exones; exones mutuamente excluyentes; uso alternativo de sitios 5 ', uso alternativo de sitios 3' y retención de intrones. Por último, hay otros eventos complejos, menos frecuentes, que dan lugar a sitios de inicio de transcripción alternativa y múltiples sitios de poliadenilación (Figura 2) (Keren et al. 2010; Ast 2004; Matlin et al. 2005). El tipo de SA varía entre las especies. La retención del intrón es más común en organismos inferiores, hongos y protozoos (E. Kim et al. 2008). Por otra parte, la escisión de exón (40 % de frecuencia) aumenta gradualmente en eucariontes superiores, sugiriendo que la escisión de exones contribuye a la complejidad fenotípica. Los sitios 3´ y 5´ de SA se cree que son subfamilias de escisión de exón y podría representar una etapa evolutiva intermedia. El sitio alternativo 3´ también conocido como sitio aceptor está presente en el 18,4% y el sitio alternativo 5´ también conocido como sitio donante en un 7,9% (Koren et al. 2007). Por su parte, las plantas muestran bajos niveles de genes con SA, sin embrago presentan un alto nivel de retención intrón (~ 30%) y un bajo nivel en escisión de exón (<5%) (E. Kim et al. 2008). El patrón de exones mutuamente excluyentes, está presente en mamíferos y en algunos invertebrados, ocurre en un porcentaje menor (Pohl et al. 2013). 19 Figura 2: Patrones de SA. En la figura se muestra los distintos patrones de SA, los exones constitutivos se muestran en las regiones azul y los alternativos en morado; los intrones están representados por líneas continuas y las discontinuas indican opciones de splicing. A). Escisión de exones. B) uso alternativo de sitios 3’. C) uso alternativo de sitios 5'. D) Retención de intrones. E) Exones mutualmente excluyentes. F) Promotores alternativos. G) Poliadenilación alternativa. (Tomada ymodificada de Keren et al. 2010). 2.2.7 Función El SA es un mecanismo importante para la modulación de la expresión de genes, permite a un solo gen aumentar su capacidad de codificación, lo que cada lugar, la síntesis de distintas isoformas de proteínas, y estas pueden variar en estructura y función biológica, ya que se puede modificar la secuencia de proteínas / dominios y las interacciones proteína-proteína (Chen et al. 2012; Kalsotra & Cooper 2011; Kelemen et al. 2013) Este mecanismo puede ser impulsado mediante cambios fisiológicos los cuales son determinantes para proporcionar una variabilidad de RNAm y que estos a su vez son utilizados por otros mecanismos de regulación, como lo puede ser: 20 regulación mediada por decadencia (NMD) que sucede con la introducción de codones de terminación prematuros (PTCs); la variabilidad de UTRs en RNAm, que afecta a los elementos que actúan en cis, que median la regulación de la eficiencia de la traducción de RNAm, estabilidad y localización (Skotheim & Nees 2007). Aunque la mayoría de las veces los cambios son bastante pequeños, es difícil de discernir si hay consecuencias funcionales. En algunos casos las isoformas provenientes del SA no cambian completamente su función, pero si la relación (1:1, 1:2, 1:3, etc) de las isoformas expresadas, puede promover diversos procesos celulares (Blencowe 2006; Kelemen et al. 2013). Se cree que el SA pudo haber proporcionado ventajas evolutivas, en particular durante evolución de organismos metazoarios. Dado que el SA es más abundante en eucariotas superiores, el porcentaje de genes y exones que se someten al SA es mayor en los vertebrados que en invertebrados. Estas ventajas pueden haber incluido la protección de mutaciones, transposones y amplificaciones, atribuyéndole capacidad de codificación genómica flexibles, diversidad de proteínas y la regulación (Necsulea & Kaessmann 2014; Xing & Lee 2006; Ast 2004). 2.3 Splicing alternativo en enfermedades La extrema flexibilidad de regulación del SA está basada en los múltiples factores, y está sujeto a errores que da lugar al SA aberrante en genes clave, que ocasionan la aparición de muchas enfermedades genéticas (Cáceres & Kornblihtt 2002). Las mutaciones en las secuencias reguladoras que afectan al SA, son una causa generalizada de enfermedades humanas y cáncer. Estas mutaciones pueden alterar potenciadores o silenciadores existentes o crear nuevos sitios de SA, alterando así los exones alternativos que se incluyen y la conversión de los exones constitutivos a exones alternativos. Cuando se producen estos cambios en 21 las secuencias codificantes, sus efectos están reflejados en la proteína codificada. Los cambios de bases dan lugar a codones de paro prematuros o cambios de aminoácidos, que actúan a nivel de proteína codificada. Las patologías más caracterizadas causadas por mutaciones que actúan en cis, son tauopatías tales como la demencia frontotemporal con parkinsonismo, distrofia miotónica y atrofia muscular espinal (Tazi et al. 2009; Spitali & Aartsma-Rus 2012). Las mutaciones en genes que codifican factores que actúan en trans, también, pueden causar enfermedades, a diferencia de las mutaciones que actúan en cis, sólo afectan el gen comprometido, las primeras afectan a diversos genes. Los trastornos más estudiados que surgen de este tipo de mutación son la distrofia muscular facioescapulohumeral y varios tipos de cáncer (Biamonti et al. 2014; Cáceres & Kornblihtt 2002). 2.4 Splicing alternativo en cáncer En la actualidad numerosos informes han demostrado que los patrones de SA cambian en el cáncer. La expresión de variantes alternativas afecta significativamente eventos celulares críticos en la biología del cáncer, los ejemplos mejor documentados en procesos cancerosos, se relacionan con alteración de la expresión en supresores tumorales y oncogenes. Los protooncogenes (estimulantes del crecimiento y la división celular) así como, los genes supresores tumorales (inhibidores de la proliferación celular excesiva) codifican proteínas involucradas en proliferación, diferenciación, muerte, control del ciclo celular, angiogénesis, invasión , metástasis, respuesta a fármacos, entre otros (Skotheim & Nees 2007; Venables 2006). Sin embargo, aún no está claro en qué medida el SA funcionalmente ha contribuido a la iniciación y progresión del cáncer. La mayoría de los patrones de empalme alterados podrían ser en gran medida sintomáticos y atribuidos a una falta generalizada en la fidelidad del SA, en las células cancerosas. La existencia 22 de variantes de SA específicas en cáncer, simplemente podría ser una consecuencia del fenotipo maligno (Tazi et al. 2009). Se han identificado perfiles de expresión asociados a tipos particulares de cáncer, pero han sido pocos los hallazgos de variantes de mensajero, esto se debe principalmente a la existencia de una diversidad de estirpes tumorales (Venables 2006). Genes asociados a cáncer pueden expresar isoformas de empalme que, favorecen el crecimiento de células cancerosas. Un ejemplo frecuentemente citado es Bcl-x; miembro de la familia Bcl-2, regula la permeabilidad de la membrana externa de la mitocondria. La isoforma constitutiva Bcl-xS es proapoptótico, cambios en el patrón de splicing dan lugar a la isoforma Bcl-XL con actividad antiapoptótico, ya que impide la liberación de componentes mitocondriales que promueven la apoptosis (Figura 3A) (Ladomery 2013; Venables 2006; David & Manley 2010; Takehara et al. 2001). Otro ejemplo es VEGF-A, éste expresa isoformas de empalme alternativo que son anti-angiogénica y pro-angiogénica. Una alteración en el equilibrio de las isoformas de VEGF-A por SA promueve y/o inhibe la angiogénesis. La sobreexpresión de la isoforma pro-angiogénica de VEGF-A, se observan consistentemente en los tumores sólidos (Figura 3K) (Harper & Bates 2008; Amin et al. 2011; Sette et al. 2013). Además se ha encontrado numerosos genes que presentan cambios en el perfil de SA, dando lugar a funciones distintas que favorecen procesos cancerígenos (David & Manley 2010; Ladomery 2013). Como se mencionó, los cambios en la concentración, localización, composición, la actividad de factores trans, tales como: hnRNP y proteínas SR, pueden alterar la selección del sitio de splicing, dando lugar SA aberrante (Biamonti et al. 2014). Varios estudios han demostrado alteraciones específicas en la expresión de factores de empalme en cáncer, que dan lugar a cambios en la concentración, localización, composición proteíca, y puede alterar la selección del sitio de splicing; un ejemplo de ello es el factor de splicing SRSF1 (anteriormente conocida como ASF / SF2) un miembro de la familia de proteínas SR; descrito como un 23 proto-oncogén. SRSF1 tiene varios blancos de pre-RNAm, la sobreexpresión de SRSF1 puede llevar a cambios en SA en diversos RNAms, dan como resultado un fenotipo cancerígeno (Amin et al. 2011; Karni et al. 2007). Uno de los blancos de SRSF1 es CD44, glicoproteína transmembranal de tipo 1 que participa en interacciones célula-célula y célula-matriz, es de los ejemplos mejor caracterizados de splicing y cáncer. Este gen posee SA en 10 de sus 20 exones, estos pueden ser incluidos individualmente o en combinación, a la fecha se han reportado seis isoformas distintas; se encuentran asociadas a varios procesos biológicos, tales como el reclutamiento de linfocitos, la adhesión célula- matriz epitelial, y la metástasis tumoral (Figura 3C) (Kelemen et al. 2013; David & Manley 2010; Gnthert et al. 1991). Otro gen bien caracterizado, blanco de SRSF1; es el proto-oncogén RON. La sobreexpresión SRSF1, el exón 11 de RON se excluye, dando lugar a la variante ΔRON en el cáncer de mama y aumenta la capacidad de metástasis en diferentes células tumorales (Figura 3J) (De Craene & Berx2013; Ladomery 2013). Otros ejemplos son, hnRNP A1, A2 y hnRNP promueven la expresión de dos isoformas de piruvato cinasa, PKM1 y PKM2 (Christofk et al. 2008; Biamonti et al. 2014). Mientras PKM1 es característico de células diferenciadas, PKM2 esta sobreexpresado en células embrionarias y cáncer, además, es clave para los altos niveles de la glucólisis, típica en las células neoplásica (conocido como el efecto Warburg) que les permite sobrevivir en condiciones anaeróbicas (Figura 3 D) (Christofk et al. 2008). Otros ejemplos de genes que presentan SA son: Ciclina D1, H-Ras, FGFRs, Rac1 y Fas (Figura 3). Ciclina D1, que presenta un sitio de poliadenilación alternativa, generando una proteína oncogénica, la isoforma ciclina D1b, que está poliadenilada en un sitio en el intrón 4 (Figura 3E), H-Ras presenta una mutación intrónica de tal manera que se escinde el exón IDX, generando una proteína que induce proliferación (Figura 3F) (David & Manley 2010). 24 Figura 3: Representación de los eventos de SA en cáncer. Las isoformas que están presentes y reguladas en el cáncer que tienen efectos positivos sobre el crecimiento, la supervivencia o comportamiento invasivo se muestran en la parte superior de cada diagrama; los cuadrantes en amarillo representan los exones constitutivos y en blanco las regiones que se escinden alternativamente. A) Gen Bcl-x, puede generar dos isoformas Bcl-xL y Bcl-xS. B) El Gen Caspasa puede generar a dos isoformas: Caspasa 2s y Capasa 2L. C) Fas presenta dos isoformas: FasΔ6 y Fas. D) PKM genera dos isoformas PKM2 y 1. E) Ciclina D1 da lugar a la isoformas Ciclina D1b y a. F) H-Ras, genera a H-Ras(p21) y H-Ras(p19). G) CD44, genera seis diferentes isoformas. H) FGFR, da lugar a FGFR2IIIc y FGFR2IIIb. I) Rac, genera a Rac 1b y Rac1. J) Ron genera dos isoformas: ΔRon y Ron. K) VEGF expresa a VEGF 165 y VEGF 165b (Tomada y modificada de David & Manley 2010). Resultados de nuestro grupo de investigación, reveló el perfil de expresión en tumores de ovario de origen epitelial, líneas celulares y tejido sano de ovario. Se identificaron una gran cantidad de genes desregulados que presentan potencialmente escisión alternativa, en diferentes exones del transcrito constitutivo. Entre los genes con mayor significado estadístico se encontró el gen que codifica para la proteína E asociada al centrómero (CENP-E), mostrando un potencial sitio nuevo de splicing alternativo (Figura 4) (Juárez-Méndez et al. 2013). 25 Figura 4: Expresión de los exones del gen CENP-E. A) Variantes de CENP-E (Variante 1 y 2). B) Expresión exónica cada línea representa el promedio de expresión por grupo: línea roja (Líneas celulares), en verde (tumores de ovario) y en azul (tejido sano de ovario). C) Mapa de calor, en color azul indica una baja expresión y en rojo una alta expresión. Los cuadros en color rojo indican las regiones a evaluar en este estudio. 2.5 CENP-E El gen CENP-E que codifica para una proteína cinesina dimérica que pertenece a la familia 7 de las cinesinas, se encuentra conservada en todo el reino animal. Juega un papel crítico en la mitosis (alineación correcta de los cromosomas en metafase) (Y. Kim et al. 2008). Se encuentra en el brazo largo del cromosoma 4, en la posición 4q24-q25, esta codificada en la cadena antisentido y está conformado por 49 exones (Figura 5). Según National Center for Biotechnology Information (NCBI) se conocen dos variantes del gen: Variante 1 (NM_001813.2) que contiene 49 exones y la Variante 2 (NM_001286734.1) conformada por 47 exones; ambos transcritos son codificantes. A B C http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&id=71061467 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&id=557878611 26 Figura 5: Localización del gen CENP-E. Se localiza en el brazo largo del cromosoma 4 y la transcripción es en la cadena antisentido (GenCards, 2015). 2.5.1 Descubrimiento de CENP-E CENP-E fue descubierto hace más de dos décadas, se demostró que tiene un papel esencial en la progresión de la metafase-anafase. Se ha identificado que la proteína es asociada a las regiones del centrómero. Se analizó la presencia de esta proteína en las fases del ciclo celular, pero no se identificó en la interfase, sino hasta la prometafase y al final de la mitosis (Tim et al. 1992). Se asocia a la actividad motora de microtúbulos y es probable responsable de los movimientos hacia los polos del cinetocoro en prometafase y anafase. 2.5.2 Estructura de CENP-E La proteína tiene una estructura espiral bobina, pesa 312 kDa, se compone de tres dominios: el dominio cinesina-motor (N-terminal), dominio central espiral bobina y el dominio globular (C-terminal) (Figura 6) (Garcia-Saez et al. 2004; Musinipally et al. 2013). Esta proteína motora es homodimérica, las cabezas de la proteína están dimerizadas a través de un tallo en espiral-α helicoidal prolongado, seguido de dominios globulares, cada cabeza contiene un sitio de unión al ATP y otro sitio de unión a los microtúbulos (Y. Kim et al. 2008). 27 Figura 6: Estructura de la proteína CENP-E. CENP-E está conformada por tres dominios: dominio motor, dominio espiral bobina y el dominio C-terminal (representado en verde) (Musinipally et al. 2013) 2.5.2.1 Dominio Cinesina-motor Este dominio se encuentra en la región N-terminal, implicado en los movimientos de los cromosomas, abarca los residuos Met1-Lys327, posee sitios de unión a microtúbulos y dependiente de ATP, la energía liberada es necesaria para alimentar la congresión de los cromosomas (Y. Kim et al. 2008; Garcia-Saez et al. 2004). Promueve un movimiento lento con alta procesividad dirigido al extremo “mas” de los microtúbulos. El sitio de unión a microtúbulos en este dominio, es altamente regulado para la correcta función de esta proteína, esto es, mediante una fosforilación en el residuo treonina 422 (T422) (Kim et al. 2010) y por la interacción con el dominio C-terminal tiene como función inhibir el sitio de unión (Espeut et al. 2008). 2.5.2.2 Dominio central espiral bobina Es una α-hélice larga discontinua, abarca los residuos Asn336-Ala2471 (Garcia- Saez et al. 2004). El análisis de la secuencia mostro que dominio contiene múltiples distorsiones y bisagras que forman curvas cerradas, debido que tiene segmentos repetidos discontinuos de prolina o glicina (aproximadamente 20 veces) la discontinuidad en los segmentos, es probablemente lo que confiere la alta flexibilidad, y esto promueve la interacción con múltiples moléculas a lo largo de las fibras del cinetocoro (Y. Kim et al. 2008). 28 Este dominio actúa como correa de sujeción móvil, manteniendo contacto con cinetocoro y el extremo “mas" de los microtúbulos, por lo que este dominio es muy importante en la correcta estabilización de los microtúbulos en el cinetocoro. Tiene longitud de aproximadamente 230 nm (Y. Kim et al. 2008), debido a su longitud, de este dominio se ha propuesto que es capaz de producir la congresión de un cromosoma mono-orientado al centro de la célula (Kapoor et al., 2006). El dominio presenta dos regiones con homología a secuencias PEST (residuos Arg459-Lys489 y His2480-Lys2488) que podría ser responsable de la rápida degradación intracelular de CENP-E al final de mitosis (Garcia-Saez et al. 2004). 2.5.2.3 Dominio C-Terminal El dominio C-terminal, es un dominio globular abarca los residuos Ile2126- Val2476, es la región que se requiere para la localización y unión al cinetocoro, posee actividad de unión a microtúbulos pero independiente de ATP (Garcia-Saez et al. 2004; Schaar & Yen 1998). La región de unión al cinetocoro abarca los residuos Ile2126-Val2476 y el sitio de unión a microtúbulos, abarca los residuos Glu2565-Gln2663 (Garcia-Saez et al. 2004). Se hapropuesto que ocurre una interacción entre el dominio cinesina y este dominio, en donde el dominio C-terminal inhibe la actividad motora del dominio cinesina, esta interacción se rompe al ser fosforilado el dominio C-terminal por MPS1 o CDK1-ciclina B temprano en la mitosis (Espeut et al. 2008) Hasta el momento hay pocos estudios y no es claro el papel de este dominio en la interacción directa de los microtúbulos. Se sugiere que esta proteína puede pertenecer a una clase de MAPs (Proteínas asociadas a microtúbulos) que han evolucionado para realizar conexiones flexibles pero resistentes a los microtúbulos, sin competir con los sitios tradicionales de MAPs, este sitio de unión puede estar involucrado en el anclaje de microtúbulos al cinetocoro de lado temprano en la mitosis, lo que facilita la congresión de cromosomas, en el dominio motor del que ya se habló anteriormente (Musinipally et al. 2013). 29 Además, se han descrito otras modificaciones como la sumoilación, a través de SUMO-2/3 se detectó en este dominio, esencial para las interacción con el cinetocoro (Zhang et al. 2008). 2.5.3 Función CENP-E La adecuada segregación de cromosomas durante la mitosis requiere la unión bipolar de cromosomas duplicados al huso mitótico, que emanan de los polos opuestos. Cada vez que una célula se divide, una estructura proteica especializada llamada cinetocoro se ensambla en la superficie de cada centrómero, y es el cinetocoro el sitio de unión de los microtúbulos del huso ubicados en la región centromérica de cada cromátida hermana, además, promueve la interacción de los cromosomas y microtúbulos del huso, es responsable de la alineación de los cromosomas a lo largo de la placa de metafase y la segregación de las cromátidas hermanas en células hijas durante la anafase (Cleveland et al. 2003; Walczak et al. 2010) La región que constituye la interacción cromosoma-microtúbulos en los vertebrados, se compone de una red de proteína fibrosa con múltiples interacciones al huso mitotico (Dong et al., 2007). CENP-E forma parte de la red fibrosa para la fijación cinetocoro que se demostró mediante microscopía electrónica (Cooke et al., 1997; Yao et al., 1997). La expresión de CENP-E está altamente regulada y es dependiente del ciclo celular, la expresión es baja en la fase G1 temprana pero aumenta a medida que las células progresan a través del ciclo celular, los niveles aumentan a su pico máximo durante la fase G2 tardía, en esta fase se asocia con los cinetocoros durante la fase M del ciclo celular, y se degrada poco después (Tim et al. 1992). CENP-E se encuentra asociada a la parte exterior del cinetocoro en el inicio de la prometafase, durante la metafase y permanece allí hasta la anafase (Brown et al., 1994). Esta proteína ha sido ampliamente estudiada por su papel en la congresión de los cromosomas. CENP-E tiene como función primordial el mantenimiento de la 30 estabilidad cromosómica a través del movimiento de los cromosomas bi- orientados y cromosomas mono-orientados al ecuador, el correcto alineamiento de los cromosomas en la placa metafásica, la correcta captura y estabilización de los microtúbulos en los cinetocoros. También, se requiere para la progresión de metafase a anafase, ya que funciona como un sensor de tensión “checkpoint mitótico” para señalar el inicio de la anafase (Walczak et al., 2010). Aunque el motor CENP-E fue una de las primeras proteínas que se identificaron en el cinetocoro, su regulación es poco conocida, en parte debido a la dificultad técnica de purificación (Yen et al., 1991). 2.5.3.1 Congresión de los cromosomas Durante prometafase, los cinetocoros mediante un complejo de cinesinas incluidas CENP-E capturan y estabilizan los microtúbulos dinámicamente inestables que crecen en los polos. Una vez unidos a los cinetocoros, los cromosomas exhiben movimientos oscilatorios, la conmutación entre los polos, movimientos antipolares y culminando la alineación en la placa de la metafase. Estos movimientos se denominan colectivamente como congresión, y se cree que son al menos en parte, una consecuencia de las fuerzas generadas por los motores de CENP-E localizados en el cinetocoro. Además, se encuentra en los polos de la célula, es en este momento CENP-E establece uniones con microtúbulos que son inestables y laterales, esto es debido a la alta densidad de microtúbulos cerca de los polos del huso, es probable que ocurra un anclaje aberrante de microtúbulos-cinetocoro, sino se corrigen estas uniones incorrectas pueden llevar a una mala segregación de cromosomas y aneuploidía (Holanda & Cleveland, 2009). CENP-E es fosforilado en T422 que reduce la afinidad a los microtúbulos lo que permite selectividad hacia los haces de microtubulos del cinetocoro, y la corrección de anclajes aberrantes al cinetocoro (Kim et al. 2010; Sardar & Gilbert 2012). Esta fosforilación es más frecuente en los cinetocoros cercanas a los polos del huso (Kim et al. 2010). 31 La proteína Aurora A se concentra en los polos, probablemente es responsable de la fosforilación, que es esencial para promover la congresión de cromosomas polares. El sitio donde CENP-E es fosforilado, es en el dominio espiral bobina adyacente al dominio motor, está junto a varios aminoácidos cargados positivamente conservados, esta carga básica de aminoácidos se propone como una correa de sujeción electrostática directamente involucrado en unión a los microtúbulos, por lo tanto la fosforilación en T422 disminuye la carga básica, reduciendo la afinidad de CENP-E por los microtúbulos y permite que el motor se disocie más fácilmente durante el arrastre (Figura 7B) (Kim et al. 2010). Por otra lado, la proteína Aurora B, se localiza al interior del centrómero durante la profase a metafase (Ruchaud et al., 2007) la fosforilación por Aurora B desestabiliza las uniones incorrectas de los microtúbulos que llegan al espacio inter-cinetocoro realizadas por la longitud del dominio espiral enrollado CENP-E, a través de las fibras del cinetocoro vecinas (Y. Kim et al. 2008). Los cromosomas se mueven hacia el ecuador a lo largo de un haz de microtúbulos del cinetocoro impulsados por CENP-E, con dirección al ecuador ya sea a través de un mecanismo de biorientación o por el mecanismo de cromosomas mono- orientado, mediado por deslizamiento a lo largo de fibras de cinetocoro vecinas (Figura 7C) (Y. Kim et al. 2008). Una vez que los cromosomas llegan al centro de la célula, en la parte exterior del cinetocoro hay una alta concentración de la proteína fosfatasa 1 (PP1, también conocida como PP1G) se une a CENP-E y es desfosforilada (Figura 7D), esto es esencial para promover la captura de microtúbulos estables a los cinetocoros en los cromosomas y para la biorientación estable del cinetocoro (Figura 7E) (Kim et al. 2010). Una vez que se logra una posición ecuatorial de los cromosomas; continúan oscilando de la misma manera que, durante el movimiento inicial a la zona media del huso, estos movimientos producen poco desplazamiento neto de la placa a la metafase. El motor CENP-E sigue desempeñando un papel activo en los cinetocoros, mejorando sus vínculos con los extremos de los microtúbulos dinámicos, para asegurar la estabilización de al cinetocoro (Figura 7F) (Y. Kim et al. 2008). 32 Por lo tanto, la actividad de CENP-E está controlada por un interruptor de fosforilación-defosforilación que está mediada por las cinasas Aurora A/B y por PP1 respectivamente, esta modulación es crucial para la congresión cromosomal. Además, esto también proporciona información espacial dentro del huso mitótico para regular la actividad de CENP-E según la posición del cromosoma (Kim et al. 2010) Figura 7: Mecanismo de acción de CENP-E. Se muestran los diferentes pasos que se requieren para la congresión de cromosomas.A) Se muestra que los cromosomas son trasladadas hacia los polos a lo largo de microtúbulos astrales. Aurora B fosforila a CENP-E. B) Aurora A fosforila CENP- E en T422 cerca de los polos del huso, liberando PP1 de CENP-E. C) Se inicia el movimiento CENP-E hasta el ecuador a lo largo de la fibra del cinetocoro. D) Una vez que cromosomas han congresado, los cinetocoros se alejan del gradiente de la proteína Aurora CENP-E es desfosforilado por PP1. E) Una vez que CENP-E es desfosforilado, aumenta la concentración de PP1. F) Los cromosomas han sido bi-orientados. CENP-E estabiliza las interacciones microtúbulos- cinetocoro (tomado y modificado de Kim et al. 2010). 33 2.5.3.2 Checkpoint mitótico Además, CENP-E tiene un papel bifuncional en el puesto de control mitótico. En primer lugar, estimula la señalización de control mitótico al servir como un activador, como una ciclina de la actividad cinasa BubR1, por otro lado, cuando todos los cinetocoros no han hecho interacciones estables con los microtúbulos, mediante la unión y silenciando BubR1, provoca la detención del ciclo celular (Yao et al. 2000; Kops et al. 2005) 2.5.3.3 Otras funciones Datos previos han sugerido que el papel de CENP-E en la mitosis no se limita al transporte de los cromosomas durante la congresión. En primer lugar, CENP-E se detecta en el cinetocoro de los cromosomas que se han congregado. En segundo lugar, el agotamiento de CENP-E induce una reducción de hasta el 50% en el número de los microtúbulos en los cromosomas congregados. En tercer lugar, la supresión del gen CENP-E conduce a una menor proporción de los cromosomas en anafase. En cuarto lugar, después de la congresión todavía se requiere la localización de CENP-E dependiente de PP1, para la captura de microtúbulos estables a los cinetocoros (Gudimchuk et al. 2013). Sin embargo, mencionado lo anterior es inusual encontrar a CENP-E después que el cinetocoro se une a microtúbulos, que no separa sino que permanece estable asociada con la punta de los microtúbulos. En un estudio reciente se demostró que CENP-E tiene la propiedad de ser, tanto un motor dirigido al extremo más de microtúbulos, y por otra lado, un rastreador punta del extremo más (+) para la polimerización y despolimerización de microtúbulos, que se unen a la punta de los microtúbulos en crecimiento, desempeñan un papel importante en la regulación de la dinámica de microtúbulos. Esto es debido a la combinación del dominio motor, dirigido al extremo más con el dominio de C-terminal que difunde rápidamente proporcionando, el motor 34 molecular CENP-E con características ideales para participar en el mantenimiento de uniones correctas en los cinetocoros (Gardner 2013; Gudimchuk et al. 2013). 2.5.4 Patologías Estudios han demostrado que las células con niveles reducidos de CENP-E desarrollan aneuploidía e inestabilidad cromosómica (Weaver et al. 2007). En diversos tipos de células y organismos, la eliminación o inhibición de CENP-E conduce a un fallo en la alineación completa de los cromosomas en metafase, además hay una disminución de la proporción de cromosomas en anafase. (Putkey et al., 2002; Wood et al., 1997; Yao et al., 2000 & Yucel et al., 2000). Por otra parte, los cinetocoros que han biorientado y se encuentran totalmente alineados, en ausencia de CENP-E de forma estable, se unen sólo la mitad de los microtúbulos (Putkey et al., 2002). Sin embargo, la aneuploidía y la inestabilidad cromosómica que es debido a la reducción específica de CENP-E, se ha demostrado que cumple una doble función, por un lado promueve tumorigénesis y por otro inhibe la tumorigénesis en la presencia de daño genético adicional. Se demostró que la reducción de la expresión CENP-E promueve inestabilidad genómica, iniciación y progresión tumoral. Por el contrario, altos niveles de aneuploidía puede resultar en una mayor sensibilidad al daño genético adicional, que finalmente conduce a la muerte celular, por lo que CENP-E podría actuar tanto como un oncogén y como un supresor de tumor (Weaver et al. 2007; Rath & Kozielski 2012). En cáncer de mama, endometrio, próstata y en melanomas; se ha observado un incremento en la expresión de CENP-E, sin embargo, se ha detectado la disminución en carcinoma hepatocelular, lo que proporcionan una evidencia directa que la reducción de CENP-E puede iniciar hepatocarcinogenesis (Rath & Kozielski 2012). 35 3. JUSTIFICACIÓN El SA juega un papel muy importante en la generación de la diversidad de las proteínas expresadas. La mayoría de las variantes de RNAm generadas por SA se desconocen, y el conocimiento sobre los mecanismos que regulan el proceso de splicing, es somero. En cáncer se han identificado una gran cantidad de genes desregulados, y la expresión de variantes de RNAm. En nuestro grupo de investigación realizando análisis del transcriptoma, se observó la expresión diferencial de exones en CENP-E, sugiriendo la expresión de nuevas variantes. Se ha determinado que la expresión de variantes alternativas tiene un papel importante en el desarrollo y progresión del cáncer, sin embargo, se conoce poco sobre la diversidad de RNAm expresadas en cáncer. Por lo anterior, es importante realizar investigaciones dirigidas al estudio del splicing alternativo para la búsqueda de nuevas variantes de RNAm y proteínas que son expresadas por células tumorigénicas y determinar si tienen alguna implicación en el desarrollo y progresión de la enfermedad. Además, el perfil de splicing de cada gen puede fungir como marcador pronóstico, diagnóstico y de tratamiento para el cáncer. 36 4. HIPÓTESIS En líneas celulares tumorigénicas del tipo epitelial se expresarán nuevas variantes de RNA mensajero del gen CENP-E. 5. OBJETIVOS 5.1 Objetivo General Identificar las variantes expresadas de RNA mensajero del gen CENP-E en líneas celulares tumorigénicas. 5.2 Objetivos particulares Analizar la expresión del gen CENP-E a nivel transcripcional en las líneas celulares tumorigénicas Identificar los sitios de splicing alternativo en los transcritos expresados del gen CENP-E. 37 6. METODOLOGÍA 6.1 Cultivo celular Para el estudio se utilizaron líneas celulares humanas tumorigénicas de tipo epitelial: cáncer de cérvix, de ovario, de mama, entre otras (Tabla 1); además líneas celulares de leucemia (no epiteliales); de la ATCC (American Type Culture Collection). Se cultivó las líneas celulares en medio DMEM, se suplementó con suero fetal bovino inactivado (SFB, GIBCO) al 10% y con antibiótico (penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 ug/ml) se mantuvo a 37°C, 5% de CO2 y humedad relativa al 85%. Tabla 1: Líneas celulares a evaluar Cáncer de Ovario Cáncer cervicouterino Cáncer de glándula mamaria Otras líneas celulares de tipo epitelial Leucemia (No epiteliales) NIH- OVCAR3 SK-OV-3 TVO-21G TVO11D HeLa SiHa CaLo Rova Vibo C-33A Vippa INBL Caski MS-751 MCF-7 MDA- MB231 Hacat Hep-2 Hek-293T REH Jurkat K-562 6.2 Extracción de RNA total Para la extracción del RNA total, se utilizaron los cultivos celulares con una confluencia del 70-80 %, los cultivos se lavaron 3 veces con PBS pH 7.4. Basado en el protocolo Qiagen RNeasy mini Kit se extrajo el RNA total, para ello se le adiciono 700 µl de Buffer RTL, se incubó durante 5 minutos, se homogeneizó mediante una perla en el equipo de Tissue lyser (Quiagen, Valencia, CA, USA) durante 30 segundos, posteriormente se agregaron 700 µl de etanol al 70%, se 38 mezcló, el contenido se transfirió a la columna, se centrifugó a 10,000 rpm durante 15 segundos, posteriormente se le adicionó 700 µl de buffer RW1, se retiró el sobrenadante, se agregaron 600 µl de RPE, se centrifugo, se repitió el paso anterior. Se dejó secar la columna a temperaturaambiente durante 1 minuto, posteriormente se le agrego 30 µl de H2O libre de RNasas. Una vez que se resuspendió el RNA se cuantificó por espectrofotometría mediante el equipo NanoDrop ND-1000, para obtener la concentración y así mismo se verificó que no existiera contaminación, para su posterior manipulación. 6.3 Diseño de primers De acuerdo a los resultados arrojados del microarreglo de expresión (Figura 4), se encontró que varios marcadores exónicos mostraron una supresión de casi ~4 veces respecto a los marcadores cercanos, estos resultados sugerían la presencia de un corte y empalme alternativo en esas regiones, donde se suprimía la expresión. A partir de esto se eligió las regiones donde se observó una mayor supresión de los marcadores. Posteriormente, se realizó el diseño de primers específicos para cada una de las regiones a evaluar, mediante el IDT (Integrated DNA Technologies) a través de la herramienta PrimerQuestTool (https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/), flanqueando la región donde potencialmente hay un sitio de splicing alternativo. Los criterios para elegir los primers fueron: específicidad para la región del gen a evaluar, Tm de los pares de primers fueran similares, contenido GC fuese igual o lo más cercano al 50%. La región 1 del gen a evaluar, se le denominó CENP-E, amplifica una región consenso para ambas variantes del gen, para la Variante 1 (NM_001813.2) abarcan del exón 18 al 21 y para la Variante 2 (NM_001286734.1) abarcan los exones 17-20 (Figura 8A y Tabla 2). La región 2, se le denominó CENP-Ea, abarca los exones 36 al 40 y 35 al 38 para la Variante 1 y 2, respectivamente (Figura 8B y Tabla 2). Todos los primers utilizados en el estudio, se evaluó su especificidad, realizando el Basic Local Alignment Search Tool (Blast) en el NCBI. Se utilizaron iniciadores específicos para evaluar el gen constitutivo RPL4 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&id=71061467 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&id=557878611 39 referencia. Por último, para evidenciar la nueva variante, se diseñó un primer donde está el sitio de splicing alternativo. Figura 8: Regiones a evaluar. Localización de las regiones a evaluar en CENP-E, reconoce dos V1 (variante 1, NM_001813.2) y V2 (Variante 2, NM_001286734.1). Los cuadros en azul muestran los exones constitutivos y en rojo los exones alternativos, las flechas rojas representan los iniciadores. A) Se muestra la región a evaluar, denominada CENP-E, que amplifica una secuencia consenso (SC) para ambas variantes abarca cuatro exones. B) La región 2 denominada CENP-Ea, abarca 5 exones para la variante 1 y 4 exones para la variante 2. 6.4 RT-PCR punto final Para la amplificación por PCR, se realizó la RT-PCR en dos pasos, primero se preparó el DNA complementario (cDNA), se sintetizó a partir de 5 µg de RNA total. Para ello, se utilizó el Kit M-MLV Reverse Transcriptasa de acuerdo al protocolo establecido por la casa comercial (Invitrogen). A 5 µg de RNA total se le adiciono 1 µL de DNAsa (1 U), 1 µL de Buffer de DNAasa (1X), se llevó a un volumen final de 10 µL con H2O libre de RNasa. Las reacciones fueron incubadas en el termociclador (Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler) a 37 °C por 30 minutos, posteriormente se agregó 1 µL de EDTA (5mM) y se incubo a 65 °C por 10 minutos. Posteriormente, se le adicionó 1 µL de Random Hexamer Primers (10X), 4 µL Buffer M-MLV (5X), 1 µL de dNTPs (10mM), 2 µL DTT (0.1M), 1 µL de RNAsa out (40 U), 1 µL M-MLV RT. La reacción se incubó bajo el siguiente programa: 5 Ex 18 Ex 19 Ex 20 Ex 21 5´ 3´ SC Ex 17 Ex 18 Ex 19 Ex 20 5´ 3´ Ex36 Ex37 Ex38 Ex39 5´ Ex40 SC Ex35 Ex36 Ex37 Ex38 3´ Ex39 V1 V2 SC CENP-E CENP-Ea A B http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&id=71061467 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&id=557878611 40 minutos a 37°C, 10 minutos a 25 °C, 60 minutos a 37 °C durante y 10 minutos a 70 °C. Una vez obtenido el cDNA, se realizó diluciones a una concentración final de 25 ng/µL y se almacenó a -25°. Posteriormente se procedió a evaluar la integridad del cDNA mediante la amplificación del gen RPL4 (gen constitutivo), para ello se utilizó Dream Taq Green DNA Polymerase (Thermo Scientific, USA), de acuerdo al protocolo de la casa comercial; las reacciones se ajustaron en un volumen final de 25 µL, se utilizaron 50 ng de RNA Total, 2.5 µL de Buffer Dream Taq (10X), 1 µL de dNTPs (10 mM), 0.5 µL de cada uno de los oligonucleótidos reverse y forward a 10 pmol/ul y 0.125 µL de Dream Taq Green DNA Polymerase a una concentración de 5U/µL. Las reacciones fueron incubadas en el termociclador bajo las siguientes condiciones de amplificación: inicialmente se incubó a 95 °C por 3 min, posteriormente por 40 ciclos se realizó las siguientes condiciones 95 °C por 30 s, 60 °C por 30 s y 72 °C por 30 s y para finalizar se incubaron a 72 °C durante 15 min. Tabla 2: Primers de los genes a evaluar RPL4 Forward 5´CGAATGAGAGCTGGCAAAGGCAAA 3´ Reverse 5´ACGCCAAGTGCCGTACAATTCATC 3´ 21 pb 21 pb Tm: 60 Tamaño del amplicón: 243 pb CENP-E Forward 5´AGCTGCTTAGAGAAAAGGAAGACC 3´ Reverse 5´ GCAAAATGACTTCTTCCCGCA 3 24 pb 21 pb Tm: 56.7 Tm: 56.3 Tamaño del amplicón: 492 pb CENP-Ea Forward 5´CCAACTCAAGGAAAGCCTGCAAGA 3´ Reverse 5´ TTCCATGGAGCATCTCTGGTTTGC 3´ 24 pb 24 pb Tm: 59.7 Tm: 59.6 Tamaño del amplicón: 490 pb y 778 CENP-E variante 4 Forward 5´GAAGGAGAAAATGATTTGCTCTG 3´ Reverse 5´GCAAAATGACTTCTTCCCGCA 3´ 23 pb 21 pb Tm: 51.7 Tm: 56.3 Tamaño del amplicón: 115 pb 41 Una vez realizado este paso se procedió a la amplificación del gen de interés CENP-E. Se amplificaron las dos regiones del gen, para ello se utilizó Dream Taq Green DNA Polymerase, de acuerdo al protocolo ya descrito. Para la región CENP-Ea, el programa utilizado fue 95 °C por 3 min, posteriormente por 40 ciclos se realizó las siguientes condiciones 95 °C por 30 s, 59.5 °C por 30 s y 72 °C por 45 s y para finalizar se incubaron a 72 °C durante 15 min. Para la región 1 del gen de interés denominada CENP-E, las reacciones se incubaron en el termociclador bajo el siguiente programa: 95 °C por 3 min posteriormente durante 40 ciclos bajo el siguiente programa: 95 °C por 30 s, 56.5 °C por 30 s y 72 °C por 40 s; y por ultimo 72 °C por 15 min. Para la región nueva variante el programa que se utilizó fue el siguiente: 95 °C por 3 min, posteriormente por 40 ciclos se realizó las siguientes condiciones 95 °C por 30 s, 53.5 °C por 30 s y 72 °C por 30 s y para finalizar se incubaron a 72 °C durante 15 min. La visualización de los productos de PCR se realizó en geles de agarosa al 1.5% para el gen constitutivo y al 2% para las regiones del gen CENP-E. 6.5 Secuenciación Una vez que se visualizaron los amplicones generados por PCR, se procedió a purificar dichos productos de PCR mediante el kit QlAquick Gel Extraction de acuerdo al protocolo establecido por la casa comercial (Qiagen, Valencia, CA, USA), para ello se cortaron las bandas de interés, a estas se le agregaron 500 µL de Buffer QG, posteriormente se incubó a 55 °C durante 10 min, se le adicionó 100 µL de isopropanol, la solución se homogeneizó y esta se pasó a la columna, una vez esto se centrifugó a 14,000 rpm por 2 min, posteriormente se le adicionó nuevamente 500 µL de Buffer QG, se centrifugó a 14,000 rpm por 2 min, después se le agregó 500 µL de Buffer PE y se centrifugó bajo las mismas condiciones, este procedimiento se realizó dos veces, por último se agregaron 30 µL H2O libre 42 de DNasas y se centrifugó a la misma velocidad durante 3 min; finalmente se cuantificó mediante el equipo NanoDrop ND-1000. Una vez que se obtuvieron los productos purificados, se procedió al marcaje para la Secuenciación Sanger,utilizando el Kit Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems), para ello se utilizaron 15 ng de DNA purificado, 0.5 µL de primer forward o reverse (10 pmol/ul), 3.5 µL de Buffer Big Dye Terminator 5X (BDT), 0.5 µL de enzima BDT, la reacción se ajustó a 10 µL. Se incubó en el termociclador bajo el siguiente programa 95 °C durante 30 s, 50 °C por 15 s y 60 °C durante 4 min, todo esto durante 25 ciclos. Los productos del marcaje fueron purificados con el Kit CENTRI-SEP Spin Columns (Princeton Separations, USA), de acuerdo con el protocolo de la casa comercial, posteriormente las muestras fueron introducidas en el secuenciador Applied Biosystems Abi Prism 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). 6.6 Análisis de la secuencia Una vez que se obtuvieron las secuencias, fueron analizadas en el software BioEdit v7.2.5, posteriormente se procedió al alineamiento con respecto a las secuencias reportadas en el NCBI, para ello, se utilizó Clustal Omega de European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute (EMBL- EBI) (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ 43 7. RESULTADOS 7.1 Evaluación de la expresión de variantes de RNAm de CENP-E Se evaluaron 22 líneas celulares tumorigénicas, de las cuales 19 fueron líneas celulares de tipo epitelial incluidas: 4 líneas celulares de cáncer de ovario, 10 de cáncer de cervicouterino, 2 de cáncer de mama, una línea celular de laringe, otras dos líneas inmortalizadas de queratinocitos y riñón. Además, también se evaluaron 3 líneas celulares de leucemia (no epiteliales). Se evaluó la expresión del gen constitutivo RPL4, para evidenciar que las muestras son amplificables, como se observa en la Figura 9a, la expresión está presente en las 22 líneas celulares. Como se esperaba, se observa un amplicon de ~250 pb. Ya que se había corroborado la expresión del gen constitutivo, se prosiguió a evaluar la expresión CENP-E. Para determinar la expresión de variante 1 y 2, evaluamos la región CENP-Ea que amplifica dos amplicones uno para cada variante. Sin embargo, la expresión de esta región reveló la presencia de tres amplicones con expresión diferencial. Se observo un amplicón con un tamaño aproximadamente 500 pb, esperado para la variante 2. El amplicón se observó en todas las lineas celulares, además se observa mayor expresión respecto a los otros amplicones. El amplicon de mayor tamaño (~800 pb) perteneciente a la variante 1, presenta menor expresión respecto a la variante 2. Es importante destacar que no se observó el amplicon en dos líneas celulares (C-33A y en HaCat) (Figura 9b) Además, de los dos amplicones esperados (variante 1 y 2) se observó la presencia de otro amplicon (~600 pb), presente una línea celular de cancer cervicouterino (ViBo) (Figura 9b). Ya que habíamos identificado los amplicones esperados, corroboramos la expresión de las variantes 1 y 2, mediante secuenciación Sanger. Se procedió a 44 purificar los tres amplicones con el kit QlAquick Gel Extraction (Quiagen). Una vez obtenidas las secuencias, se realizó un alineamiento con respecto a las secuencias reportadas en el NCBI (Figura 10B). Como se esperaba, observamos la expresión de la variante 1 y 2. En cuanto al amplicon de ~600 pb, se encontró que tenía una escisión de 159 nt en el extremo 3´del exon 38; esta nueva variante se le denominó variante 4. Esto es interesante, ya que el exon 38 está presente solo en la variante 1, lo que esta sugiriendo la presencia de nuevas variantes de RNAm del gen CENP-E (Figura 10 A y B). 45 Figura 9: Expresión de los genes RPL4 y CENP-E. A) Gel de agarosa al 1.5 % en el que se observa la expresión del gen RPL4 (constitutivo). B) Gel de agarosa al 2% donde se observa la expresión de las variantes de CENP-E, se observa la expresión de tres amplicones ~800 (señalado flecha morada), ~600 (señalada en flecha roja) y 500 pb, el amplicón de ~600, presente en una línea celular (ViBo). En la parte superior se observa la expresión en líneas celulares de tipo epitelial, en el primer carril se observa el marcador de peso molecular seguido de cuatro líneas celulares de cáncer de ovario (1-4), diez de cáncer de cervicouterino (5-14), dos de cáncer de mama (15,16), una línea celular de laringe (17) y dos líneas inmortalizadas (18,19). En la parte inferior se observa la expresión en líneas celulares de leucemia (20-22). 1.- NIH-OVCAR-3, 2.-SK- OV-3, 3.- TVO-21G, 4.- TVO-112D, 5.- HeLa, 6.- SiHa, 7.- CaLo, 8.- Rova, 9.- ViBo, 10.- C-33A, 11.- Vippa, 12.- INBL, 13.- Caski, 14.-MS-751, 15.-MDA-MB231, 16.- MCF-7, 17.- Hep-2, 18.- HaCat, 19.- Hek-293T, 20.- REH, 21.- Jurkat, 22.-K-562, control negativo (-). 46 Figura 10: Alineamiento y secuencia de los productos de la región CENP-Ea. A) A la derecha se observa la secuencia del amplicón de ~800 pb; a la izquierda la secuencia del amplicón de ~600 pb, el recuadro en color morado encierra la secuencia constitutiva, el de color rojo encierra los sitios de unión exónicos, la flecha negra indica el sitio de corte alternativo. B) Alineamiento de las secuencias de las variantes 1 y 2 (ya reportadas) con las secuencias de las bandas 800, 600 y 500 pb. La banda 800 pb corresponde a la variante 1, la de 500 pb corresponde a la variante 2, la banda 600 pb presenta una escisión en el extremo 3´ del exón 38, en rojo se observan los nt escindidos. 7.2 Evaluación de la expresión de la región CENP-E Ya que habíamos observado que hay co-expresión de las variantes 1 y 2. Se evaluó otra región de interés en el gen CENP-E, donde potencialmente existe un 47 sitio de SA, los iniciadores amplifican una región consenso para las variantes 1 y 2. Como se esperaba, la expresión de esta región mostró la presencia de un amplicón en ~500 pb. La expresión se observó en todas las líneas celulares evaluadas, además, pudimos observar otros amplicones, en 600 pb, 400 pb y 300 pb. No obstante, las bandas de 600 y 400 no estaban bien definidas, mientras que el de 300 pb, su expresión fue muy baja, respecto al amplicon de 500 bp. La banda en 300 pb solo se pudo visualizar en algunas líneas celulares como lo son: NIH-OVCAR-3, SK-OV-3, TVO-112D, HeLa, Hep-2, MS-751 y en las líneas celulares de leucemia: K-562 (Figura 11). La presencia de los diferentes amplicones, nos sugirió que puede tratarse de nuevos sitios de splicing alternativo presente en esa región. Figura 11: Expresión del gen CENPE. Gel de agarosa al 2%, se observa la expresión de tres amplicones 600 pb, 500 pb, 400 pb y otro amplicon de 300 pb con baja expresión indicado con flechas rojas. En la parte superior se observa la expresión en líneas celulares de tipo epitelial, en el primer carril se observa el marcador de peso molecular seguido de cuatro líneas celulares de cáncer de ovario (1-4), diez de cáncer de cervicouterino (5-14), dos de cáncer de mama (15-16), una línea celular de laringe (17) y dos líneas inmortalizadas (18,19). En la parte inferior se observa la expresión en líneas celulares de leucemia (20-22). 1.- NIH-OVCAR-3, 2.-SK-OV-3, 3.- TVO-21G, 4.- TVO-112D, 5.- HeLa, 6.- SiHa, 7.- CaLo, 8.- Rova, 9.- ViBo, 10.- C-33A, 11.- Vippa, 12.- INBL, 13.- Caski, 14.-MS-751, 15.-MDA-MB231, 16.- MCF-7, 17.- Hep-2, 18.- HaCat, 19.- Hek-293T, 20.- REH, 21.- Jurkat, 22.-K-562, control negativo (-). 48 A continuación, para corroborar si los amplicones correspondían a nuevas variantes, se purificaron y secuenciaron. La secuenciación corroboró que la banda de ~500 pb corresponde a una región consenso para la variante 1 y 2. Mientras que los amplicones de 600 y 400 pb no se pudo observar la secuencia, lo que sugiere que son productos inespecíficos. Mientras que el amplicón en 300 pb, la secuencia resultante se alineó con las secuencias
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