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Estudiando Biologia

28/7/2022

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Biología

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE QUÍMICA
Identificación y purificación de las proteínas involucradas en la
mineralización del erizo de mar Echinometra lucunter de la región
del Golfo de México

TESIS

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO

PRESENTA
ERICK FLORES HERNÁNDEZ

MÉXICO, D.F. AÑO 2013

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL

Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal
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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
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respectivo titular de los Derechos de Autor.

JURADO ASIGNADO:

PRESIDENTE: Profesor: María Amanda Gálvez Mariscal
VOCAL: Profesor: Amelia María de Guadalupe Farrés González Saravia
SECRETARIO: Profesor: Roberto Alejandro Arreguín Espinosa de los Monteros
1er. SUPLENTE: Profesor: Rosalinda Velázquez Salgado
2° SUPLENTE: Profesor: Adrián de Santiago Zarate

SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: INSTITUTO DE QUÍMICA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA DE BIOMACROMOLÉCULAS

ASESOR DEL TEMA: DR. ROBERTO ALEJANDRO ARREGUÍN ESPINOSA DE LOS MONTEROS
Firma:
SUPERVISOR TÉCNICO: M. EN C. FERNANDO LÓPEZ SÁNCHEZ
Firma:
SUSTENTANTE: ERICK FLORES HERNÁNDEZ
Firma:

Índice
Páginas
I. RESUMEN 4
II. ABREVIATURAS 5
III. ANTECEDENTES 6
IV. ÁREA DE ESTUDIO 9
V. ESPECIE DE ESTUDIO 11
VI. INTRODUCCIÓN
-Biomineralización
-Matriz Orgánica
-Proteínas de la matriz
orgánica
-Nucleación
-Carbonato de calcio y
polimorfos
-Sobresaturación en fluidos
13
13
14
16

20
22
VII. OBJETIVOS 23
VIII. METODOLOGÍA 23
IX. RESULTADOS 27
X. DISCUSIÓN GENERAL 36
XI. CONCLUSIONES 41
XII. PERSPECTIVAS 42
XIII. ANEXOS 43
XIV. REFERENCIAS 49

I. RESUMEN
La biomineralización se puede definir como el estudio de la formación, estructura y
propiedades de sólidos inorgánicos (óxidos, sulfuros, sílice, carbonatos, fosfatos,
etc.) depositados en sistemas biológicos. Este proceso está perfectamente
regulado y da como resultado la generación de estructuras como los huesos, los
dientes, las espinas, las corazas, las conchas, estructuras del exoesqueleto de
esponjas vítreas y calcáreas, etc. Este proceso es asistido por biomoléculas de la
matriz orgánica como proteínas, carbohidratos y lípidos. La matriz orgánica se
organiza en una red tridimensional y genera un sitio de nucleación y
posteriormente la formación de cristales. Además contiene las moléculas que
determinan la forma, polimorfismo y moléculas que regulan el crecimiento de los
cristales.
En nuestro laboratorio se trabajó con el erizo de mar Echinometra lucunter. Los
especímenes se colectaron en la zona arrecifal de Veracruz. Las espinas, la testa
y la linterna de Aristóteles del erizo de mar fueron descalcificadas y a partir de
estas estructuras se obtuvo una fracción soluble. Los componentes proteicos de la
fracción soluble se separaron por medio de sus propiedades fisicoquímicas y los
resultados muestran que hay una fracción en la cual se observaron dos proteínas
más abundantes de aproximadamente 60 kDa en los extractos totales de las
diferentes estructuras. Esta muestra se sometió a cromatografía de líquidos de
alta eficiencia (HPLC) en una columna de exclusión molecular y posteriormente en
una columna de intercambio iónico para separar cada componente. Los resultados
obtenidos por geles de acrilamida y el análisis de Espectrometría de Masas
(MALDI-TOF) muestran la presencia de dos proteínas con pesos moleculares de
66.7 y de 33.3 kDa. Los ensayos biológicos han demostrado que 1 µg de los
extractos totales crecidos en placa generan cristales de calcita por el análisis de
Espectrometría de Infrarrojo. Las pruebas biológicas con las proteínas purificadas
sugieren un papel de estas proteínas en la generación de cristales de carbonato
de calcio en forma de calcita.

II. ABREVIATURAS

AC: Anhidrasa carbónica

ASB: Albumina sérica bovina

CCA: Carbonato de calcio amorfo

CaCO3: Carbonato de calcio

EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético

E. lucunter:

ET:
Echinometra lucunter

Extracto total

IFE: Isoelectroenfoque

IR: Infrarrojo

Kps: Constante de solubilidad

L. variegatus: Lytechinus variegatus

MALDI-TOF: Matrix-assisted laser desorption
ionization
time-of-flight mass

MP: Metaloproteasas

pI: Punto isoeléctrico

PMCs: Células del mesénquima primario

SDS: Dodecil sulfato de sodio

SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida
con dodecil sulfato de sodio

S. purpuratus: Strongylocentotus purpuratus

III. ANTECEDENTES
Existen en el mundo cerca de 7,000 especies vivientes de equinodermos y 13,000
especies más que forman el registro fósil de este grupo que data desde el
Cámbrico Temprano. Los equinodermos fueron reconocidos por el hombre desde
tiempos ancestrales, según aparecen sus formas en algunos frescos de las
cavernas de Creta, en Grecia con una antigüedad aproximada de 4,000 años (20).
El término Echinodermata fue utilizado en 1734 por Jacob Klein, quien lo aplicó
únicamente a los erizos de mar.

Los estudios sobre equinodermos de México se iniciaron en 1838, cuando se
hicieron breves referencias sobre especímenes colectados en localidades
próximas a las costas mexicanas (20). México alberga una gran diversidad de
equinodermos. Hasta el momento se han reportado casi 600 especies que habitan
nuestro mar territorial, aproximadamente 10% de las de equinodermos existentes
en el planeta. El inventario faunístico de los equinodermos de México dista mucho
de ser completo; casi no existen estudios en aguas profundas del Pacífico, Golfo
de California y Golfo de México debido a que los medios de los que se ha
dispuesto sólo han permitido efectuar exploraciones litorales.

Se sabe que los equinodermos son especies dominantes de las comunidades
bentónicas. Los erizos de mar generalmente prefieren puntos expuestos donde
hay rompimiento de olas, ya que en esta zona hay muchas macroalgas y reside la
mayor oferta de plancton, debido al recambio y movimiento continuo del agua en
especial, sobre litorales rocoso carbonatados (1). Como tal desempeñan un papel
clave en el ecosistema arrecifal, son importantes para el reciclaje de los elementos
minerales y su incorporación al ciclo de los nutrientes, degradando la materia
orgánica hasta un nivel que pueda ser nuevamente aprovechado por los
productores primarios (2).

La especie Echinometra lucunter (Linnaeus, 1758) llega a ser muy común y
alcanza densidades elevadas en el sublitoral rocoso por lo que su influencia sobre
la comunidad arrecifal debe ser notable (3). Además de ser considerada
removedor primario de sedimentos y detritus en el mar, desempeñando un papel
muy importante en el ciclo de los metales pesados por lo se utiliza como indicador
de contaminación por petróleo y metales (4).

Algunos de los biominerales más importantes y mejor estudiados provienen del
erizo de mar, por sus elementos esqueléticos los cuales son materiales que han
desafiado a los científicos durante décadas. A pesar de exhibir morfologías tipo
esponja y superficies curvas,que son características asociadas normalmente con
materiales amorfos, cada elemento se comporta como un único cristal de calcita,
cristales que se creé que delimitan al mundo biológico (23, 24).

Desde tiempos remotos los cristales han maravillado a un gran número de
científicos, muchos de ellos por presentar caras bien definidas, llamaron la
atención de las más prestigiadas personalidades de la Ciencia de la época. Sin
7

embargo, la cristalización de compuestos de naturaleza biológica data de la
década de 1847-1857. En aquellos primeros días, la cristalización era concebida
como una herramienta de purificación, para la caracterización de proteínas y
cristalografía por medio de rayos-X, tenía un corto alcance de importancia (22).

Cuando los métodos de rayos-X se fueron desarrollando, el problema de la
cristalización no fue crucial ni fue el cuello de botella en ese momento. La
situación cambió cuando los métodos de resolución estructural se establecieron
correctamente y cuando la biología molecular dio acceso a moléculas más
sofisticadas. Con ello ha crecido el número de cuestiones básicas de biología y
como consecuencia una gran necesidad de cristales de específicas
macromoléculas biológicas. Desde este tiempo, la obtención de monocristales de
proteínas de un tamaño suficiente, para estudios cristalográficos, ha sido el cuello
de botella, no solo para estudios estructurales, sino también para el diseño de
fármacos y el desarrollo de la cristalografía de rayos-X (22).

Grandes cantidades de carbonato de calcio biogénico se forman en los océanos.
En general los procesos de mineralización son controlados por organismos que
tienden a tener macromoléculas asociadas. Estas últimas son responsables de
importantes funciones como es la formación de tejidos y su contribución a las
propiedades biomecánicas del producto generado. La información en los libros de
bioquímica referida a formación de tejidos mineralizados se restringe a carbonato
y fosfato. Sin embargo, en detalle se conocen solo algunas estructuras, entre ellas
los esqueletos de equinodermos y las conchas de algunos moluscos.

A este proceso se le conoce como biomineralización por el cual los organismos se
valen de biomoléculas para generar estructuras funcionales como son de soporte,
alimentación, movilidad, protección o defensa (5), las cuales provienen de formas
cristalizadas del carbonato de calcio. El proceso está perfectamente regulado y da
como resultado biominerales de estructuras tan finamente construidas como los
huesos, dientes, espinas, caparazones, conchas, cáscaras, perlas, corales y otros
muchos materiales a temperatura ambiente. Estas condiciones se han tratado de
reproducir en el laboratorio para obtener numerosos productos industriales con
ciertas características mecánicas muy superiores a las conocidas en la actualidad.
Pero los ensayos realizados no han logrado los resultados esperados debido a la
gran complejidad del mecanismo de formación de estos biominerales. Un ejemplo
típico es la cáscara del huevo de aves, reptiles y otros organismos, que tiene una
estructura formada por cuatro capas de enorme complejidad y en la que cada una
se adapta perfectamente a la función que va a desarrollar en el crecimiento del
nuevo individuo.

Los biominerales son minerales que se forman en el interior de un organismo,
animal o vegetal. Se trata de compuestos cristalinos y su número se ha
incrementado notablemente en los últimos años a medida que han avanzado las
investigaciones. Son algo más de 60, en su mayor parte sales de calcio, hierro o
magnesio y se caracterizan por formar agregados cristalinos separados por un
material orgánico como colágeno o quitina. Los tres grupos más numerosos (16
8

especies), carbonatos (10) y sulfuros (10), pero también hay sulfatos, óxidos de
hierro y manganeso, cloruros, fluoruros, silicatos, oxalatos, uratos e incluso azufre
elemental.

Otros estudios de gran interés se han desarrollado sobre los tejidos óseos y
caparazones, por su compleja estructura, rigidez y en algunos casos regeneración
de dichas estructuras (las espinas en el caso de erizos de mar). De especial
interés es la formación de fosfatos, carbonatos y ópalo biogénico en conchas de
bivalvos y caparazones de gasterópodos, constituidos por carbonato de calcio
(calcita, aragonita o vaterita), huesos (principalmente hidroxiapatita) y otros
órganos animales y vegetales.

Se ha investigado con gran detalle la formación del nácar en los moluscos, de las
perlas naturales y de los dientes poniendo de manifiesto una secuencia de
procesos de una belleza excepcional a escala microscópica. También existen
biominerales perjudiciales en las litiasis biliares y urinarias conocidas como
cálculos y que requieren tratamiento médico a fin de eliminarlas. Menos frecuentes
son otros cálculos en amígdalas, bronquios, cabellos, intestino, saliva y páncreas
con trastornos siempre importantes. Para seguir avanzando en la ciencia, las
investigaciones deben centrarse en los mecanismos naturales más sencillos en la
formación de biominerales.

Por lo cual hasta el momento no se han podido imitar los procesos de
biomineralización de los organismos de manera artificial en el laboratorio. Ya que
para lograr un biomineral de manera artificial se requieren de altas temperaturas,
pH extremos y presiones altas. Además se propone el erizo de mar ya que de toda
la diversidad biológica presente en nuestro planeta, la mayor cantidad de
organismos se encuentra en el mar, que cubre el 70% de su superficie.

El papel de las proteínas que participan en la formación de tejidos mineralizados
es poco entendido, por lo que su aislamiento y caracterización son de importancia
para comprender y explicar su función. Cabe mencionar que la purificación y
caracterización de proteínas asociadas a la biomineralización en Echinometra
lucunter (E. lucunter) no se ha reportado hasta el momento, por lo cual podría
contribuir con una o nuevas proteínas involucradas en dicho proceso.

Las perspectivas en el estudio de la biomineralización en erizos de mar aún deja
mucho por descubrir acerca de la formación y función de los cristales de carbonato
de calcio. Obstantemente no se tiene el conocimiento exacto de cuantas proteínas
están involucradas en la formación de los mismos, ni la función específica de cada
una de ellas, no se conoce la interacción proteína-cristal a nivel molecular, ni los
mecanismos de regulación de la formación de los cristales. Por lo anterior, éste es
un campo muy fértil para investigaciones multidisciplinarias.

IV. ÁREA DE ESTUDIO

-Golfo de México
El Golfo de México se encuentra localizado al este de la República Mexicana
(entre los 30o y 18o N; 98o y 80o O) es un mar semi-cerrado que forma parte de la
región del Gran Caribe. Se le considera la cuenca de aguas protegidas más
grande del océano Atlántico y es compartido por México, Estados Unidos y Cuba.
Limita con el Mar Caribe por un umbral de profundidad aproximado de 2 500 m y
los límites sur y norte están formados por la plataforma de Campeche/Yucatán y la
de Florida. Mantiene interacción con las aguas y biota del Océano Atlántico
mediante el estrecho de Florida y con el Mar Caribe a través del canal de Yucatán.
Es relativamente poco profundo (3 600 m máximo) y comprende un área total de 1
768 000 km2 (19).

El Sistema Arrecifal Veracruzano está formado por un grupo de islotes y 17
arrecifes, de los cuales 11 se localizan frente a Antón Lizardo y el resto frente al
Puerto de Veracruz. Se enlaza al noroeste con el Sistema Arrecifal Veracruzano
Norte, situado frente a la Laguna de Tamiahua y al oeste con el Sistema Arrecifal
de Campeche y Yucatán. Abarca los municipios de Veracruz, Boca del Río y
Alvarado, con una superficie de 52,238 hectáreas.

Figura 1. Localización del Golfo de México
Tomado de http://www.semarnat.gob.mx/temas/ordenamientoecologico/Paginas/B_A_GolfoMex_Caribe.aspxEn investigaciones realizadas por Lara et al. (1995) y de acuerdo al análisis de la
comunidad de equinodermos en el sistema arrecifal Veracruzano llega a la
conclusión que E. lucunter es la especie más abundante en zonas de sustrato
duro (subzonas de la cresta arrecifal) con densidades de hasta 20 ind/m2 (19).

Por esta razón se tomó la decisión de trabajar con este erizo ya que no existe un
peligro para la especie. La recolección de los ejemplares de E. lucunter se realizó
10

en dos áreas del estado de Veracruz, la primera se realizó en la zona de la
Gallega y en la región de Montepío en la estación de biología tropical “Los
Tuxtlas”.

Figura 2. Zonas de colecta de Echinometra lucunter.

Primera colecta
Costa de la Gallega

Segunda colecta
Acantilado Montepío
11

V. ESPECIE DE ESTUDIO

Echinometra lucunter

Reino: Animalia
Phylum: Echinodermata
Clase: Echinoidea
Orden: Camarodonta
Familia: Echinometridae

Los equinodermos (Phylum Echinodermata, del griego echinus, "espinoso";
dermatos "piel") constituyen un grupo altamente diversificado y bien caracterizado
entre los invertebrados marinos de las costas de México. Son organismos
deuterostomados que presentan una gran diversidad de formas: esferoidal,
discoidal y cordiforme en los equinoideos (erizos de mar); estelar en los
asteroideos (estrellas) y los furoideos (estrellas serpiente) cilíndrica en los
holoturoideos (pepinos de mar) y pentacrinal en crinoideos y concentricicloideos
(lirios y azucenas de mar) con representantes fósiles y actuales.

Se conocen alrededor de 7,000 especies pertenecientes a este Phylum, que es el
único gran grupo de invertebrados deuterostomados. Los equinodermos son
exclusivamente marinos y generalmente son animales bentónicos de aguas poco
profundas. Su tamaño es de aproximadamente 15 cm. Se caracteriza por tener
una coraza larga oval, espinas angulosas negras o rojizas, con anillos obscuros en
la base. La característica más llamativa del grupo es su simetría pentarradial. Otra
característica de los equinodermos es la presencia de un esqueleto interno.
Normalmente, el esqueleto está dotado de una serie de espinas o tubérculos que
sobresalen de la superficie del cuerpo dándole un aspecto rugoso o espinoso (25).

Los equinodermos móviles, los cuales le dan los nombres comunes de erizos de
mar, erizos acorazados, bizcochos del mar y dólares de arena. Se han descrito
alrededor de unas 950 especies. México alberga una gran diversidad de
equinodermos. Hasta el momento se han reportado casi 600 especies que habitan
nuestro mar territorial, aproximadamente 10% de las de equinodermos existentes
en el planeta (20).

La mayoría de los erizos de mar presentan espinas largas (primarias) y cortas
(secundarias) Figura 4, distribuidas de forma más o menos homogénea por toda la
superficie del cuerpo. Sus espinas se pueden regenerar. Están adaptados para
vivir tanto en fondos duros como blandos, y utilizan las espinas como órganos
locomotores.

Figura 3. Erizo de mar E. lucunter
Tomada de
http://www.decapodos.infored.mx/670488_
ERIZOS.html

Poseen un caparazón formado de CaCO3 al cual se le llama testa (Figura 5). Se
alimentan gracias a un aparato masticador muy desarrollado denominado linterna
de Aristóteles (Figura 6).

La estructura general de los erizos de mar se muestra en la Figura 7, en donde se
puede apreciar las estructuras del estudio (espinas, testa y linterna).

Figura 5. Testa de E.lucunter
Tomado de http://www.decapodos.infored.mx/670488_ERIZOS.html

Figura 4. Espinas de E.lucunter
Figura 6. Linterna de Aristóteles
Tomado:http://mariadoloresbioygeoiesarroyo.blogspot.mx/2011/05/aparato-digestivo.html

Figura 7. Estructura general de erizos de mar.
Tomado: http://www.pixmule.com/aparato-digestivo-higado/33/

VI. INTRODUCCIÓN

Biomineralización

Muchos organismos construyen sus biomateriales a partir de carbonato de calcio
para generar diferentes estructuras. La biomineralización se refiere al proceso de
cómo los organismos forman minerales, si bien la mayoría de los organismos no
forma depósitos minerales, se han encontrado que algunas proteínas podrían ser
responsables del proceso de nucleación y crecimiento de cristales. Por lo anterior
se define que la biomineralización es el proceso en el cual los organismos se
valen de biomoléculas para generar estructuras funcionales. Este proceso que es
asistido por biomoléculas genera la formación de minerales, estructura y
propiedades de sólidos inorgánicos que se depositan en sistemas biológicos (5, 6).

Para que se lleve a cabo este proceso de transformación, los seres vivos deben
de seleccionar los diferentes materiales desde el medio ambiente e incorporarlos a
las estructuras antes mencionadas. Hay que tomar en cuenta que el material que
se va a incorporar depende de la abundancia y la disponibilidad en el medio
ambiente (5).

La formación de estos biominerales es con un mayor impacto en los océanos,
donde la química revela importantes componentes en sedimentos y rocas marinas.
Ejemplos de biominerales son los huesos, dientes, huevos de aves, conchas de
diferentes moluscos y otros muchos materiales. Los biominerales se componen
principalmente de carbonato de calcio, fosfato de calcio (como apatita) o sílica.
Los bloques básicos de construcción disponible para la construcción de
estructuras están dados por las siguientes ecuaciones:

1. CO2 + H2O ↔ HCO
-3 + H+
2. Ca+2 + HCO3 ↔ CaCO3
3. Ca+2 + HPO4
-2 ↔ CaHPO4 (como hidroxiapatita, Ca10(PO4)(OH)2

El estudio de esta disciplina se remota a los años 30 con la aparición de la
difracción de rayos X como herramienta aunque a partir de 1895 existen
antecedentes. El primer uso de las proteínas cristalinas para estudios de rayos-X,
fue hecho por Dorothy Hodking en 1934, ella obtuvo el primer patrón de difracción
de un cristal de pepsina. El estudio de este campo en el área de materiales se
remota sin embrago a principios de los años 80. En cuanto a la estructura se sabe
que alrededor de un 80% de los biominerales son cristalinos y un 20% son
amorfos. Por otra parte el calcio constituye cerca del 50% de todo el biomineral
conocido. Un 25% se atribuye a fosfatos. Además el grupo hidroxilo está presente
en un 60%. Los biominerales son producto de una compleja serie de eventos,
donde la acción concertada de ciertas células genera sólidos inorgánicos que
cristalizan y crecen de un modo definido y ordenado para formar huesos, dientes,
caparazones, cáscaras, perlas, corales, etc. En general se pueden encontrar 36
tipos de biominerales como carbonatos, fosfatos, sulfatos, sulfuros, haluros,
silicatos, óxidos, citratos, oxalatos, ópalo (biogénico en conchas de bivalvos) y los
14

óxidos de hierro (21). La distribución de biominerales entre los 5 reinos muestra
que 36 son formados por animales, 10 por protistas, 24 por móneras (bacterias y
algas verdeazuladas), 11 por plantas vasculares y 10 por hongos.

En muchos invertebrados, estos sólidos llegan a ser unidades de esqueletos y
muestran una morfología específica. Algunos de esos minerales tal como la sílica
son amorfos, o sea, no presentan un orden repetido y regular de una unidad de
modo de caracterizar el cristal. La información de estos materiales es más
complicada de entender y por lo tanto los esfuerzos se centran en cuantificar y
estudiar las propiedades de aquellos que presentan configuraciones cristalinas.

Los eucariontes invertebrados han usado sílica o carbonato para la generación de
estas estructuras. Los vertebrados han usado el fosfato en la generación de sus
esqueletos en forma de hidroxiapatita (7). De igual manera han desarrollado
estructuras donde está presente la biomineralización como son los huesos, los
dientes y la otoconia (8). La biomineralización en humanos es un proceso
fisiológicollevado a cabo por biomoléculas y minerales. Se sabe que el esqueleto
y los dientes están compuestos principalmente de fosfato de calcio en forma de
hidroxiapatita [Ca10(PO4)(OH)2], y la otoconia al igual que las estructuras de los
invertebrados están hechas de carbonato de calcio (CaCO3) principalmente (7, 9).
En conclusión los vertebrados utilizan el fosfato de calcio y los invertebrados el
carbonato de calcio.

Uno de los aspectos más importantes en los procesos de biomineralización es la
participación de proteínas, carbohidratos y lípidos (matriz orgánica). La
biomineralización se controla desde varios aspectos que involucran la regulación
química, control espacial, estructura y morfología.

Para que la biomineralización se lleve a cabo, es importante considerar algunos
aspectos. El primero de ellos es la disponibilidad y abundancia de los materiales
en el medio ambiente, ya que dependiendo de la abundancia y disponibilidad, los
organismos incorporan estos materiales a sus diferentes estructuras. El segundo
aspecto a considerar es la entrada y el transporte de estos materiales al sitio
donde serán depositados, todo esto bajo un estricto control biológico, para
generar huesos y dientes en el caso de los vertebrados y corazas, espinas, en el
caso de los invertebrados. Tercero, todos estos procesos involucrados en la
biomineralización son controlados y asistidos por la expresión de ciertas proteínas
y enzimas, polisacáridos y lípidos. Las características y el papel que desempeñan
es todavía un enigma en el terreno de la biomineralización (5).

Cada uno de estos requerimientos es dirigido por un determinado número de
genes que se expresan dependiendo de las condiciones energéticas y de las
influencias del medio ambiente (25) Figura 8.

N u c l e a c i ó n.
Crecimiento
Químico.
Saturación.Solubilidad.
Genes. Medio ambiente.
Condiciones energéticas y bioquímicas.
Delimitación espacial.
Flujo
de
iones.

Por lo anterior todo este proceso se controla por medio de una de una red de
regulación. Esta puede ser a nivel de control químico, espacial, estructural,
morfológico y de construcción (25).

Matriz Orgánica

La matriz orgánica es usualmente considerada como el material íntimamente
asociado y presente dentro de las estructuras mineralizadas. Una definición
apropiada sugiere que la matriz es una superficie organizada que actúa como
mediador de la mineralización. Es importante mencionar que el material orgánico
en forma de proteína, glicoproteína, carbohidrato o lípido se ha observado en una
gran variedad de matrices mineralizadas. En exoesqueletos de invertebrados los
dos mayores contribuyentes orgánicos son componentes solubles e insolubles en
agua. La fracción soluble de varias especies de moluscos muestra grupos ligados
a calcio. El erizo de mar Strongylocentotus purpuratus (S. purpuratus) se ha
tomado como modelo para el estudio de este proceso, este organismo tiene un
exoesqueleto formado de calcita que es rico en magnesio.

La matriz orgánica está estructurada en una red tridimensional muy compleja de
macromoléculas que consiste de proteínas y polisacáridos (5). Esta matriz
orgánica permita generar un microambiente donde se lleva a cabo la nucleación
del cristal o sea la organización de iones y de especies hidratadas, por medio de
biomoléculas compuestas de aminoácidos cargados y de moléculas de azúcares
aniónicas. También está involucrada en el crecimiento del cristal, deposición a un
estado polimórfico determinado y regulación del crecimiento de los cristales,
además de la forma que éstos pueden tomar (10). Todo esto ha conducido a los
científicos a investigar cómo los organismos diseñan los biominerales tales como
huesos o conchas, los cuales están compuestos de material inorgánico y
macromoléculas orgánicas (5).
Figura 8. Niveles de regulación en la biomineralización.
16

En estudios realizados en embriones, se ha observado que la esqueletogénesis
se lleva a cabo por las células del mesénquima primario (PMCs). Estas células
son las responsables de propiciar el lugar donde se lleva a cabo la
biomineralización (10).

Un estudio de las macromoléculas de un tejido mineralizado comienza por
remover éstas de la fase mineral. El procedimiento usual para carbonatos y
fosfatos consiste en usar ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a pH neutro. Se
utiliza EDTA porque algunas proteínas están asociadas a metales, además por su
efecto quelante sobre iones de calcio y magnesio. Se trabaja a un pH neutro ya
que el CaCO3 precipita a un pH cercano a 8. Se logra identificar en la mayoría de
los casos macromoléculas en solución con carácter altamente ácido. No todos los
materiales biogénicos son solubles en EDTA. Además otras sustancias tales como
los óxidos pueden ser disueltas en ácido. Por lo que obtener macromoléculas
puras aisladas es una tarea complicada.

Uno de los principales componentes de la matriz orgánica son las proteínas de
tipo ácido, llamadas así por su composición de aminoácidos como el ácido
glutámico y ácido aspártico, además de contener residuos de serina y treonina
que pueden sufrir modificación con la unión de grupos fosfato. También se ha
visto que muchas de estas biomoléculas ácidas son glicoproteínas; que tienen
unidas covalentemente cadenas de polisacáridos que contienen residuos de
sulfato y ácidos carboxílicos. De igual manera muchas veces van enlazadas a
polisacáridos también de carácter ácido, ricas en grupos carboxilato y en algunas
ocasiones asociadas a grupos sulfato.

Los estudios han derivado en una serie de discusiones que han llevado a sugerir
algunas características que confiere la matriz a la biomineralización. Estas se
presentan a continuación.

1. Grupos aniónicos en la matriz orgánica pueden concentrar iones de calcio en
varios sitios y producir la supersaturación necesaria para la nucleación de
minerales.

2. Proteínas solubles en la matriz inhiben la deposición de minerales. Por tanto
podría ser utilizado como mecanismo control.

3. La matriz de proteína puede favorecer un crecimiento isomorfo particular o
inhibir el crecimiento de ciertas fases cristalinas. Así se puede favorecer el
crecimiento de un cristal en particular.

4. La matriz soluble de proteínas puede ser cubierta por minerales y quedar
atrapada en el cristal. Esto podría determinar o influir en la resistencia del cristal y
el desarrollo de microestructuras alrededor de la inclusión. Así se puede dirigir la
estructura mineral de los esqueletos biológicos.

5. La matriz insoluble puede formar una estructura de caparazón (esqueleto) que
es después cubierta por una capa de la matriz soluble más reactiva. Los depósitos
en la matriz posteriormente forman el cristal y no son responsables de su
crecimiento.

Cada una de estas características es capaz de tener una influencia en los
mecanismos de crecimiento. En el caso de deposición de minerales en animales y
plantas las moléculas orgánicas que forman la matriz están contenidas en
pequeñas vesículas en el citoplasma y son pasadas a vacuolas minerales por la
fusión en sus membranas. Se asocian cuatro funciones a la matriz orgánica:
nucleación, orientación, morfología incluyendo tamaño y control de tipo polimorfo.

Proteínas de la matriz orgánica

En el campo de la biomineralización se han reportado que en el erizo de mar S.
purpuratus existen cuando menos tres proteínas que forman parte de la matriz
orgánica de la espícula de la larva. Estas proteínas son SM50, PM27 y al menos
una forma de SM30. Estas tres proteínas estuvieron también presentes en
dientes, las espinas y coraza de individuos adultos (10).

Además, se reporta que las proteínas de la matriz de la espina del erizo de mar
adulto, pueden ser divididas en dos grupos de acuerdo a sus similitudes. La
subfamilia SM50, que incluye SM50, SM37, SM32, SM29, PM27 y tres proteínas
relacionadas con SM29 (proteína primariadel mesénquima) (5,10).

La proteína SM50 no está glicosilada y es de aproximadamente 48.5 kDa con un
punto isoeléctrico alcalino (pH~12.9). Esta proteína tiene composición rica en
prolinas. También se han encontrado genes homólogos a SM50 que se han
aislado y caracterizado en Lytechinus pictus y Lytechinus variegatus (LSM34),
Hemicentrotus pulcherrimus (HSM41). Evidencias experimentales demuestran que
LSM34 y SM50 son esenciales para la formación de la espícula (15, 16, 17).

La proteína SM30 tiene un peso molecular de 30.6 kDa con un punto isoeléctrico
ácido. Se sabe que es el producto de las células del mesénquima primario de ahí
las iniciales SM. Es una glicoproteína ácida que tiene un simple dominio de lectina
(CTL) y una secuencia repetida rica en prolinas (15, 18).

Recientemente se identificaron dos nuevas proteínas a las cuales llamaron P58-A
y P58-B que son esenciales para la esqueletogénesis. Estos genes son
expresados especialmente en las PMCs de embriones del erizo de mar L.
variegatus y S. purpuratus (16).

Otro tipo especial de proteína llamada anhidrasa carbónica (AC) que cataliza la
hidratación reversible del CO2 y provee el carbonato para la formación de la
calcita, además es una enzima que se cree que juega un papel central en la
formación de endoesqueleto de los erizos de mar. En el genoma de S. purpuratus
se han identificado 19 genes que codifican para esta enzima. La AC es una
18

enzima que se cree juega un papel central en la formación del endoesqueleto del
erizo de mar S. purpuratus, y contiene zinc (Zn) para su funcionamiento. La
hidratación reversible del CO2 se da de la siguiente manera:
CO2 + H2O → HCO3 + H
+1 y provee el carbonato para la formación de la calcita
(16, 18).
Se ha reportado que la inhibición de la actividad de la AC bloquea la formación de
la espícula y su elongación.

Las proteínas MSP130 constituyen otra familia de proteínas específicas de
equinodermos implicadas en la biomineralización (6). Este grupo de proteínas
comprende a unas glicoproteínas asociadas a membrana de células específicas
del mesénquima primario de ahí sus iniciales (10, 18).

Existen proteínas relacionadas en la biomineralización como son las proteasas,
que para su actividad dependen de zinc por lo cual se han llamado
metaloproteasas (MP) y juegan un papel importante en el metabolismo, migración
celular, apoptosis, fusión de membrana y salida y activación de factores de
crecimiento. Estas proteínas se encuentran presentes en diferentes cantidades en
la testa, espina, linterna de Aristóteles y la espícula del erizo de mar (18). Cuatro
MP se han identificado en la matriz de la espina que son las más abundantes y
pertenecen a un grupo de cuatro proteínas que son: Sp-Mmp18, Sp-Mn19 like, Sp-
Mn3 y Sp-Mn6 y de la coraza las más abundantes son: Sp-Mt1-4/Mnpl6 y Sp-
Mt5/pL2 (10,18).

Nucleación

La visión clásica de la cristalización considera que existen diferentes etapas en
este proceso a través de la adhesión de estructuras básicas que pueden ser
átomos, iones o moléculas. Los precursores o estructuras básicas tienen
estructuras amorfas y estos se han identificado en sistemas sintéticos y sistemas
biológicos. Está claro que la parte más importante en el proceso de la
cristalización es la nucleación o sea la formación del núcleo en un sistema sobre
saturado, por lo tanto el control de la cristalización en principio, requiere control en
la nucleación (26).

La nucleación puede ser facilitada por la formación de enlaces entre los iones
minerales y las moléculas de la matriz orgánica. Esta matriz orgánica permite
generar un microambiente donde se lleva a cabo la nucleación del cristal, es decir
la organización de iones y de especies hidratadas, con la formación de enlaces la
capa hidratada de iones puede en parte ser removida (5). Una consecuencia de la
interacción entre iones minerales y la matriz es el descenso en la energía de
activación de la nucleación, que es la energía libre necesaria para lograr que se
lleve a cabo la nucleación, Figura 9.

Crear una superficie cuesta energía debido a que los enlaces tienen que
romperse. Así, al ir de un pedazo de materia a dos pedazos más pequeños, la
energía total del sistema aumenta: la energía libre de la superficie es siempre
positiva.

Es importante mencionar el papel que desempeñan los fosfolípidos en el control
de la biomineralización ya que junto con los polipétidos y los polisacáridos
controlan la nucleación, porque abaten la energía de activación por medio de la
reducción de la energía interfacial; de igual manera modifican la velocidad de
nucleación, organizan el sitio específico de la nucleación sobre la superficie
orgánica, seleccionan los polimorfos y llevan a cabo el alineamiento cristalográfico
del núcleo sobre la fase orgánica.

En el caso de la mineralización generada por organismos se argumenta la
existencia de especies precursoras metaestables y su importancia en cuanto a la
eficiencia y control de la mineralización controlada biológicamente la cual se
puede mantener por varias vías (27).

- La primera es cuando las condiciones termodinámicas del microambiente
favorecen la precipitación no biológica, favoreciendo así la eficiencia de la
mineralización. En este proceso se utiliza entre el 70 a 90 % de la entalpía del
sistema, la energía restante puede ser utilizada entonces por las interacciones
entre el material orgánico y el material inorgánico y de esta manera controlar el
crecimiento del cristal (27).

-La segunda está relacionada a la concentración del material, que depende de la
entrada a través de las membranas por medio de bombas de iones y proteínas
acarreadoras además a la cantidad de precursores del cristal existentes en el
sistema (27).

-La tercera vía involucra el crecimiento de la estructura de los cristales sobre la
superficie de moléculas que ofrecen control en diferentes niveles. Estas moléculas
pueden regular la estructura del cristal (polimorfismo), morfología, además de
incrementar o decrecer la velocidad de unión de los precursores y de esta manera
controlar la forma y el crecimiento (27).

Figura 9. Curvas de energía libre para la nucleación en la
ausencia (1) y presencia (2) de una superficie orgánica.
Tomado de: “Mann et al. (2001)”.
20

La carga de los iones Calcio atrae iones CO3
-2 y por tener una concentración
suficiente de esos iones se induce la formación de nucleación. Así el sustrato de
proteína podría enlazar y orientar la nucleación. Se ha observado que un ácido
puro, rico en proteínas de la matriz de conchas de moluscos puede nuclear
cristales en la superficie expuesta con la cara de un cristal específico enlazado a
la proteína. La nucleación de carbonato de calcio se genera a partir de
interacciones sobre la superficie (enlaces iónicos) entre iones Ca+2 y CO3
-2
(Greenfield, 1984).

Hay evidencias en varias estructuras de que proteínas insolubles cubiertas por
proteínas solubles son capaces de nuclear minerales inorgánicos. En la Aragonita,
un polimorfo del carbonato de calcio, se sugiere una interacción entre la matriz
orgánica, la superficie y la nucleación (Simkiss, 1986). Diferentes formas del
carbonato de calcio se pueden originar en la matriz lo cual sugiere que existe un
mecanismo de control que privilegia ciertas situaciones.

El control químico toma en cuenta para la formación de biominerales cuatro
factores físicos y químicos que son: la solubilidad del material inorgánico, la
sobresaturación, la nucleación y el crecimiento del cristal.

a) La solubilidad del material inorgánico es importante porque determina las
condiciones termodinámicas de precipitación, que influye en las velocidades de
nucleación y crecimiento del cristal.
b) El control espacial se refiere a la regulación del tamaño y forma de los
biominerales. El control espacial está relacionado con las dimensiones físicas del
sitio donde se lleva a caboy con los mecanismos de control químico.
c) El control estructural se basa en la facilidad con que los sistemas producen
estructuras en las cuales los cristales se asocian con la matriz orgánica y también
se organizan respecto a la superficie macromolecular. Esto quiere decir que la
matriz orgánica actúa como un templado para la nucleación (5).

Carbonato de calcio y polimorfos

Muchos organismos construyen sus biomateriales a partir de carbonato de calcio
para generar diferentes estructuras. El carbonato de calcio (CaCO3) es uno de los
minerales más abundantes en la naturaleza y por lo tanto más estudiados debido
a que es una de las mayores sustancias inorgánicas producidas por organismos
vivos mediante el proceso conocido como la biomineralización. No es solo el
material estructural más importante en los tejidos naturales rígidos tales como
conchas, perlas, huesos y dientes, sino que también tiene importantes
aplicaciones en la industria de la pintura, caucho, plástico y papel.

El CaCO3 tiene tres polimorfos cristalinos anhidros, los cuales ordenados por
estabilidad termodinámica son calcita, aragonita y vaterita (Figura 10). La calcita
tiene forma hexagonal, además de ser uno de los minerales más abundantes en la
naturaleza, su nombre viene del latín Calx, que significa cal viva. La aragonita es
un polimorfo ortorrómbico en forma de agujas. La calcita y la aragonita se
21

encuentran en biominerales (cáscaras de huevos, conchas de moluscos y
crustáceos) y la vaterita es formada y estabilizada solo por algunos organismos y
es imposible identificarla en muestras de origen geológico (11).

Figura 10. Microscopía Electrónica de Barrido (MEB) de polimorfos de carbonato de calcio.

Además de tener estos tres polimorfismos también el CaCO3 se encuentra como
carbonato de calcio amorfo (CCA) y dos formas hidratadas (CaCO3•H2O,
CaCO3•6H2O) (28). La formación de CCA, vaterita y aragonita resultan por los
altos niveles de sobresaturación en la nucleación y en la fase inicial del
crecimiento. De igual manera está bien referenciado que la presencia de
pequeñas proporciones de Mg2+ o Sr2+ favorece la precipitación de aragonita en
vez de calcita a temperatura ambiente, mientras que la presencia de Mg2+ en altas
proporciones favorece la estabilización del CCA en carbonatos biogénicos (13).

La nucleación y el crecimiento de los polimorfos del CaCO3 comúnmente se
relacionan con el predominio de los factores cinéticos más que de las propiedades
termodinámicas. Muchos organismos como los equinodermos y moluscos
emplean el CCA en el proceso del desarrollo del biomineral. Este CCA se puede
depositar en forma hidratada para después ser deshidratado en el proceso de
generación de los cristales (7).

Los factores que regulan la nucleación y el crecimiento de carbonatos de seres
vivos son regulados por la disponibilidad de sitios de nucleación, cambios de pH o
niveles de carbonatos y niveles de CO2. Puede darse que en sitios de la
nucleación donde se observan calcitas (Figura 11), por un crecimiento excesivo
puede transformarse en aragonitas (14).
22

Sobresaturación en fluidos

Para formar cristales a partir de una solución la concentración de los iones a
precipitar debe exceder los valores de concentración que dependen de la
constante de producto de solubilidad. La constante de producto de solubilidad
(Kps) es definida a partir de la termodinámica como el producto de las actividades
de los iones en solución que están en equilibrio con el sólido puro. Se aplican las
leyes del equilibrio químico a sistemas heterogéneos constituidos por una solución
saturada de iones de un electrolito poco soluble (aquél que se disuelve en una
cantidad superior a 0.020 M); esto es lo que se conoce como principio del
producto de solubilidad. Si para dos sustancias se tienen distintos valores de Kps,
entonces aquélla que presenta el mayor valor será la más soluble.

En presencia de otras sustancias estos comportamientos pueden variar de modo
de ser inhibidos o bien catalizados. Por lo tanto los valores de Kps tabulados en
libros son referidos a las sustancias puras. De las tres estructuras mencionadas
anteriormente la calcita es la estructura de más baja energía y por lo tanto la más
estable y su producto de solubilidad (Kps) es igual a Kps= 3.36 X 10-9, el de la
aragonita Kps= 6.0 X 10-9 y para la vaterita el valor de Kps= 1.221 X 10-8 (16).

Figura 11. Modelos de la estructura de Calcita ampliado 108 veces. (Wood, 1964)
23

VII. OBJETIVO

Aislar, purificar y caracterizar la o las proteínas que están involucradas en la
mineralización de CaCO3 del erizo de mar Echinometra lucunter.

OJETIVOS PARTICULARES

 Obtener la matriz orgánica del erizo de mar Echinometra lucunter.
 Aislar y purificar la o las proteínas más abundantes presentes en la matriz
orgánica de E. lucunter que puedan estar relacionadas en el proceso de
mineralización de CaCO3.
 Caracterizar bioquímicamente la o las proteínas más abundantes.
 Realizar ensayos de generación de cristales de CaCO3 con las diferentes
fracciones de proteínas obtenidas.

VIII. METODOLOGÍA

Obtención de la Matriz orgánica

Se sabe que la matriz orgánica de los equinodermos se encuentra intracelular, por
lo cual es necesario retirar toda presencia orgánica externa y de igual manera
retirar el calcio presente en las estructuras. Se recolectaron ejemplares del erizo
E. lucunter de la costa la Gallega y de Montepío (Veracruz). La recolección se
llevó a cabo por medio de buceo libre en la primera zona de colecta (zona somera
y arenosa cerca de la playa), en la segunda zona se colectaron utilizando guantes
de carnaza en las zonas rocosas. Los erizos fueron muertos por congelación y
posteriormente diseccionados para la obtención de las diferentes estructuras
(espinas, testa y linterna de Aristóteles).

Procedimiento para la obtención de la matriz:
1. Se lavó la muestra en NaClO (6-14%), cuatro veces en 200 ml cada uno por 60
min a una temperatura de 4-60C.
2. Posteriormente se sonicó pasados 15 min del tiempo total por un intervalo de 2
min (4 sonicadas de 2 min por cada hora).
3. La muestra se lavó con agua desionizada varias veces y posteriormente se llevó
a sequedad.
4. Se pulverizó en un mortero y se tomó su peso seco.
5. A continuación se desmineralizó en ácido acético al 40% (6ml/g) por toda la
noche a 4-60C.
6. Se dializó la muestra en una membrana de 3500 kDa (Spectra/Por® Biotech)
por 24h a 4-60C contra agua desionizada.

Precipitación con Sulfato de Amonio (NH4)2SO4

Al obtener el extracto crudo se continuó con la precipitación con (NH4)2SO4
partiendo de una primera concentración de 0-50% y posteriormente de 50-100%,
centrifugando cada pellet a 30000 rpm por 30 min en un rotor Ti45 y
24

resuspendiendolo en 18 ml de H2O desionizada. Posteriormente se dializó en una
membrana de 3500 kDa (Spectra/Por® Biotech) por 24h a 4-60C contra agua
desionizada.

Electroforesis (SDS-PAGE)

Para conocer el intervalo de peso molecular de las proteínas que componen las
estructuras del erizo se realizó una electroforesis en gel de acrilamida tanto con el
extracto crudo como con las fracciones purificadas. Se prepararon geles al 12%,
14% y 8-14%.

Se tomaron 15 µl de muestra y se calentó a 900 C en baño de agua durante 3
minutos, posteriormente se centrifugó a 2500 rpm durante 30 minutos. Se utilizó
básicamente el sistema de BioRad, con geles de poliacrilamida en sistema
discontinuo. El gel de separación se preparó con acrilamida en solución al 30 %,
1.5 M Tris-HCl con 10 % de SDS (pH: 8.8), persulfato de amonio al 10 % y
TEMED. El gel de concentración al 5 %, se preparó con acrilamida en solución al
30%, 1.0 M Tris-HCl con 10 % de SDS (pH: 6,8), persulfato de amonio al 10 % y
TEMED. Se utilizó como buffer de corrida una solución 0.025 M Tris; 0.192 M
glicina (ácido aminoacético) y 0.1 %SDS.

La electroforesis se realizó con equipo Mini Protean® Tetra cell de BioRad a 80 V
durante 3h. La tinción se realizó con tinción de plata (Invitrogen SilverQuestTM
Silver Staining Kit). Un gel al 12% se reveló con azul de alciano para observar si
las proteínas se encontraban glicosiladas.

También se corrió un gel de punto isoeléctrico utilizando el Phast System y
revelándolo con tinción de plata (Invitrogen SilverQuestTM Silver Staining Kit).

Cuantificación de Proteínas totales

La cuantificación de proteínas totales se realizó por el método del ácido
bicinconínico con un reactivo comercial (Pierce ® BCA Protein Assay Kit, Termo
Cientific). Las reacciones se realizaron en placas de poliestireno de 96 pozos con
fondo plano (Costar). Para las determinaciones, se construyó una curva patrón
con albúmina sérica bovina con rango entre 173 y 2600 µg/ml. Se colocaron 25 µl
por pozo de los estándares y muestras por duplicado, posteriormente se
agregaron 200 µl de la solución de trabajo (mezcla de la solución A y B en
proporción 50:1), se dejó reposar 2h a 350C en una incubadora (Thermo Scientific)
y se determinó la densidad óptica (DO) en un espectrofotómetro para microplacas
con filtro de 562 nm (ELx 808 BioTech). Se graficaron los resultados (DO) de la
curva patrón, se obtuvo la regresión lineal y se calculó la concentración de la
muestra con la ecuación de la ordenada al origen (y=mx+b).

Isoelectroenfoque (IFE)
Se empleó un Rotofor (BioRad) para separar las proteínas y conocer su punto
isoeléctrico. Empleando una cámara de electroenfoque de 18 ml, las soluciones
25

empleadas para las membranas fueron; para la aniónica 0.1 M NaOH y para la
catiónica 0.1 M H3PO4. Las anfolinas empleadas son de un rango de pH 6-8 (LKB
Ampholine®). Las muestras se corrieron a 12 W por 4h a 1rpm y 40C.
Posteriormente se realizó la colecta en 20 tubos.

Ensayos de Anhidrasa Carbónica (AC)

Se realizó la prueba de AC de acuerdo al método electrométrico de Wilbur y
Anderson (1948). La metodología utilizada fue la reportada en la prueba de
anhidrasa carbónica del Worthington (28), realizando modificaciones en la
cantidad de muestra manteniendo la relación estequiometría de los reactivos. Los
reactivos empleados fueron una solución Tris-HCl 0.012M pH 8.3, saturada de
CO2 a una temperatura de 0
oC y como control positivo la enzima de anhidrasa
carbónica (Sigma C-2273). Tomando el tiempo que tarda en bajar el pH 8.3 a 6.3
en el tubo de reacción. La actividad es calculada de la siguiente manera:

Cromatografía Líquida de Alta Resolución

Después de comprobar cuales tubos procedentes del Rotofor presentaban más
actividad se procedió a separar las proteínas por métodos cromatográficos. En un
primer paso se empleó una columna de exclusión molecular TSK gel G2000SW
(7.5 x 600 mm), tamaño de partícula de 10 µm (esférica), tamaño del poro 125 Å,
TOSOH Bioscience (Sweden). Utilizando como regulador agua desionizada a un
flujo de 0.5 ml/min, con una detección de 220-280 nm y un gradiente isocrático.

Posteriormente se utilizó una columna de intercambio iónico TSK gel SP-5PW (7.5
x 75 mm), con una matriz de vinilo, tamaño de partícula de 10 µm (esférica),
tamaño de poro 1000 Å TOSOH Bioscience (Sweden). Utilizando como regulador
A una solución buffer de citratos 0.1 M pH 4.0 y posteriormente el regulador B
(solución buffer de citratos 0.1 M pH 4.0 + NaCl 1M) a un flujo de 0.5 ml/min, con
una detección de 220-280 nm y un gradiente lineal 0% al 100% del solvente B por
100 min; se mantiene 20 min al 100% de B.

Caracterización por MALDI-TOF

La mezcla obtenida de la cromatografía de Exclusión molecular fue secada por
evaporación utilizando un SpeedVac (Svant ISS110). Se tomó 1 µl de la muestra y
se mezcló con 5 µl de matriz (solución saturada de H2O al 70%, acetonitrilo al 30%
y TFA al 0.1%), se empleó un equipo Microflex (Brucker) a 337 nm con láser de
nitrógeno. Para el análisis de los resultados se utilizó el programa Flexcontrol 3.0.

Bioensayos

Las reacciones se realizaron en placas de poliestireno de 96 pozos con fondo
plano (Costar). Se utilizaron las soluciones de (NH4)2CO3 40 mM, CaCl2 20 mM,
agua desionizada saturada de CO2 (ver Anexo) a temperatura ambiente y se le
agregó 1 gota de aceite mineral. Se utilizó como control negativo agua
desionizada y como control positivo la enzima de anhidrasa carbónica (Sigma C-
2273).

Difracción de rayos X de monocristales

Los cristales obtenidos de los bioensayos fueron secados en una incubadora
(Thermo Scientific) a 35oC, posteriormente se seleccionó el mejor cristal y
empleando un pin de vidrio templado a temperatura ambiente, fue llevado a un
Difractómetro de Rayos X (Brucker Axs); utilizando radiación de Molibdeno.

Análisis por Espectroscopia en Infrarrojo (IR)

Parte de los cristales fueron secados en incubadora Thermo Scientific a 350C,
posteriormente se realizó una pastilla de KBr y se llevó al equipo FT-IR (Brucker
Tensor 27).

Recolección de erizos
E.lucunter mediante buceo libre
y colecta manual
Obtención de la matriz orgánica
Precipitación con sulfato de
amonio [(NH4)2SO4]
Diálisis empleando membrana
de 3500 kDa
Separación por Rotofor
(fracción activa)
Geles SDS-PAGE a diferentes
porcentajes revelados con
tinción de plata
Aislamiento por HPLC en
columna de exclusión
molecular
Aislamiento por HPLC en
columna de intercambio iónico
Bioensayos (Generación de
cristales)
Análisis por
espectrometría en IR
Difracción de Rayos X
de monocristales
Espectrometría de
masas (MALDI-TOF)
Phast system, punto
isoeléctrico y determinación de
glicoproteínas
Bioensayos (Generación de
cristales)
Microscopía
electrónica de barrido
27

IX. RESULTADOS

La estacionalidad y abundancia de E. lucunter en el Golfo de México
específicamente del sistema arrecifal Veracruzano permitió una captura de
aproximadamente 50 erizos, los cuales fueron identificados como E. lucunter y
fueron colectados en bolsas Ziploc con 10 ejemplares cada una y congelados para
su transporte.

1. Aislamiento de proteínas de la matriz orgánica del erizo de mar

Se obtuvo la matriz orgánica a partir de las espinas, testa y linterna de Aristóteles
del erizo de mar. El extracto total se dializó y posteriormente se liofilizó una parte
para el gel y cuantificación de proteínas; el análisis de las proteínas de la matriz
orgánica de las estructuras se llevó a cabo por medio del corrimiento en un gel de
acrilamida al 12%. Como se puede observar en la figura 12, se tiene diferentes
proteínas de pesos moleculares de entre 20 y 250 kDa.

Figura 12. Gel de acrilamida 12% SDS-PAGE, teñido con plata. Carril 1 marcador de peso molecular,
carril 2 Extracto total (ET) de espina, carril 3 ET de testa y carril 4 ET de linterna.

Posteriormente se llevó a cabo una precipitación con sulfato de amonio
[(NH4)2SO4], de la cual se obtuvieron dos fracciones de acuerdo al porcentaje de
saturación: fracción 0-50% y fracción 50-100%. El pellet de ambas
concentraciones fue resuspendido en 18 ml determinándole actividad y
concentración de proteínas.

2. Determinación de proteínas

Una vez obtenida la curva patrón de BCA (Gráfica 1) se realizó por duplicado la
medición de los extractos totales del erizo de mar E. lucunter (tabla 1).
28

Gráfica 1. Curva patrón de albumina sérica bovina

Extracto Crudo Concentración de proteína (µg/ml)
Espina 1600.1
Testa 2886.957
Linterna de Aristóteles 1404.348

De las dos fracciones obtenidas por la precipitación se prosiguió con la fracción
50-100%, la cual se llevó al Rotofor, un equipo que separa las proteínas de
acuerdo a su punto isoeléctrico. Se recuperaron 20 fracciones (gráfica 2) a las
que se les determinó su pH, concentración de proteína y actividad de anhidrasa
carbónica(AC).

Gráfica 2. Curva de concentración de proteína y actividad de AC (primera circulación del Rotofor).

y = 0.0023x + 0.0482
R² = 0.9947
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 200 400 600 800 1000 1200
A
b
so
rb
an
ci
a
5
9
5
(
n
m
)
Concentración (µg/mL)
Curva BCA
Tabla 1. Concentración
de proteína (µg/ml) de
los extractos crudos.
29

Las fracciones 11, 12 y 13 fueron las que presentaron mayor actividad de AC, por
lo cual se escogieron para una segunda circulación por el Rotofor; nuevamente se
obtuvieron 20 fracciones a las cuales se les midió pH, concentración de proteínas
y actividad de AC. De igual manera se escogieron los tubos que presentaron
mayor actividad los cuales fueron los tubos 13 y 16 (Gráfica 3).

Gráfica 3. Curva de concentración de proteína y actividad de AC (segunda circulación del Rotofor).

Las fracciones 13 y 16 que presentaron mayor actividad de AC, se juntaron para
correrlas por medio de una columna de exclusión molecular. Como se puede
observar en la gráfica 4, se obtuvieron 8 fracciones de una cromatografía de
exclusión molecular. Cada fracción que se recuperó se corrió en un gel de
acrilamida en gradiente del 8% al 14 %, esto con el objetivo de separar mejor las
proteínas de bajo y alto peso molecular. La actividad apareció en la fracción 2, la
cual presenta dos bandas una de 30 kDa y otra de 66 kDa (figura 13).

Gráfica 4. Cromatograma de Exclusión molecular del extracto total de espina.
30

Figura 13. Gel de acrilamida SDS-PAGE, en gradiente del 8 al 14 %, teñido con plata. Carril 1
marcador de peso molecular, carril 2 fracción 2 de la cromatografía exclusión molecular.

Con base en este resultado, la muestra se analizó por el método de
espectrometría de masas (MALDI-TOF) y los resultados que se obtuvieron se
muestran en la figura 14. Donde se pueden observar al menos dos tipos de
proteínas una de 33, 308.734 Da y otra de 66, 726.604 Da.

Figura 14. Espectro de masas MALDI-TOF de la fracción 2 de exclusión molecular.

Posteriormente la muestra se corrió en un cromatógrafo de líquidos de alta
resolución con una columna de intercambio iónico, de la cual se obtuvieron dos
fracciones (a y b) figura 15. De igual manera se corrió un gel de punto isoeléctrico
(Phast-system) para caracterizar el pH de ambas proteínas.

Carril 1 Carril 2
30 kDa
66 kDa
31

Punto isoeléctrico (pI)
Se realizó un gel de punto isoeléctrico de la fracción dos que se obtuvo de la
cromatografía de exclusión molecular en un equipo de Phast System. Como se
puede observar existen dos proteínas, una proteína en mayor proporción de
carácter ácido, con un pI de aproximadamente 3.50 y otra proteína en menor
proporción de carácter básico con un valor de pI 7.35 (figura 16).

Figura 16. Gel de PI (Phast-System) carril estándar de calibración de pI, carril 2 fracción de
intercambio iónico.

Determinación de glicosilación

Las fracciones a y b se corrieron en un gel de acrilamida al 12 % y se tiñó con el
colorante de azul de Alciano, para detectar si las proteínas presentaban
glicosilación (figura 17). Para comprobar que no hubo proteínas glicosiladas se
destiñó el gel para posteriormente teñirlo con tinción de plata y demostrar así la
presencia de las proteínas. Los resultados muestran que no existen proteínas
glicosiladas como se demuestra en la figura 18.

Ensayos de Anhidrasa Carbónica (AC) y generación de cristales

La enzima anhidrasa carbónica desempeña un papel importante en la formación
del endoesqueleto de muchos organismos marinos porque provee el carbonato
para la formación de calcita. Por lo anterior se realizó una prueba de generación
de cristales de carbonato de calcio (CaCO3), a partir de matriz orgánica de la
espina, testa y linterna de Aristóteles. Los cristales generados fueron crecidos
sobre una caja de poliestireno y se observaron al microscopio óptico a las 24 h
(figuras 19, 20).

Figura 17. Gel SDS-PAGE al 12% teñido con
azul de Alciano. Carril 1 marcador de peso
molecular, carril 2 fracción a y b.
Figura 18. Gel SDS-PAGE al 12% teñido con
tinción de plata. Carril 1 marcador de peso
molecular, carril 2 fracción a y b.
Figura 19. Cristalización
de CaCO3 sobre placa.
Control negativo (1)
agua desionizada,
control positivo (2)
anhidrasa carbónica.
Escala = 200 µm.
Fracción a
Fracción b
33

Figura 20. Cristalización de CaCO3 sobre placa. Extracto total (ET) de espina (1), ET de linterna de
Aristóteles (2), ET de testa (3). Escala = 100 µm.

Espectroscopia de Infrarrojo (IR)
Posteriormente se secaron los cristales para analizarlos por el método de Espectroscopia
de infrarrojo (figuras 21, 22 y 23). Como se puede observar, en el espectro se obtuvieron
las señales características de 873.64 cm-1 y 712.91cm-1 que concuerdan con las señales
reportadas para CaCO3 en forma de calcita.

Figura 21. Espectroscopia de IR de los cristales del extracto total de Espina.

Figura 22. Espectroscopia de IR de los cristales del extracto total de Testa.
34

Figura 23. Espectroscopia de IR de los cristales del extracto total de la Linterna de Aristóteles.

Difracción de rayos X de monocristales
De igual manera se realizó un ensayo de AC pura como control positivo a diferentes
concentraciones de la enzima. El cristal obtenido se analizó por difracción de Rayos X y los
valores de celda que se obtuvieron (4.9888, 4.9927, 17.0816, 89.9703, 90.0139, 120.0173,
368.394) fueron los mismo reportados para calcita, figura 24.

Figura 24. Cristal de CaCO3 crecido en placa a temperatura ambiente por acción de la Anhidrasa
carbónica.

Espectroscopía electrónica de barrido
Otra fracción de los cristales obtenidos del ensayo con AC fue analizada por un
microscopio electrónico de barrido para obtener una mejor imagen de la estructura de los
cristales de calcita (figura 25).

1 2
Figura 25. (1) Cristales de CaCO3 generados por la anhidrasa carbónica crecidos
en placa, (2) cristal de CaCO3.

Bioensayos con las fracciones puras
Posteriormente de las dos fracciones que se obtuvieron de la cromatografía de
intercambio iónico se realizaron pruebas de generación de cristales. A los cuales se les
tomaron fotos de igual manera, además que se probaron las fracciones a y b juntas para
observar si se mejoraban los cristales (figura 26).

Figura 26. Cristales de CaCO3 generados con las fracciones puras. (1) Control positivo AC, (2)
fracción a, (3) fracción b y (4) fracción a+b. Escala = 100 µm.

CUADRO DE RENDIMIENTO DE ESPINA 50-100%

Paso de
purificación
Volumen
(ml)
Proteína
Total
(mg)
Actividad
Específica
(unidades/mg)
Factor de
purificación
Extracto
Total
1000 1329 40.282 1
Precipitación
(NH4)2SO4
18 1.5651 96 2.38
Rotofor 1 0.464 215.17 5.34
TSKgel
2000W
0.650 N/D N/D N/D
TSKgel
SP-5PW
0.450 0.023 240 5.95
Tabla 2. Cuadro de rendimiento de la fracción 50-100% de la espina
36

X. DISCUSIÓN

Generalidades

Se forman grandes cantidades de carbonato de calcio por biogénesis en los
océanos. En general los procesos de mineralización son controlados por
organismos que tienden a tener macromoléculas asociadas. Algunos de los
biominerales más importantes y mejor estudiados son de erizo de mar, por sus
elementos esqueléticos, los cuales son materiales que han desafiado a los
científicos durante décadas. A pesar de exhibir morfologías tipo esponja y
superficies curvas, que son características asociadas normalmente con materiales
amorfos.

Estas condiciones se han tratado de reproducir en el laboratorio para imitar el
proceso mediante el cual un organismo genera un biomineral a condiciones
normales para el organismo. Por lo cual hasta el momento no se han podido imitarlos procesos de biomineralización. Esta caracterización es una tarea difícil, dado
que generalmente la matriz orgánica es una mezcla de moléculas biológicamente
activas, además de que está constituye el 0.1% de proteínas presentes en el
material intramineral del erizo.

Este trabajo se enfocó en la obtención de la matriz orgánica presente en las
espinas del erizo de mar, testa y linterna de Aristóteles. Se llevó a cabo una
purificación de la matriz orgánica de acuerdo a la técnica reportada por Mann,
2008 realizando algunas modificaciones a la misma.
Recolección de Echinometra lucunter (E. lucunter)

La zona de recolección fue la adecuada ya que se colecto la especie de interés en
gran abundancia lo cual confirmaba los reportes encontrados por Solís M. 1998. El
problema con el erizo fue el tamaño, porque se colectaron erizos adultos y erizos
jóvenes, y la longitud de las espinas y la testa variaban de un individuo a otro
teniendo erizos de mayor dimensión y de menor dimensión. La selección de la
especie fue buena porque no hubo un impacto ecológico negativo sobre la especie
E. lucunter en la zona.

Obtención de la matriz orgánica

Para favorecer a las proteínas que se encuentran intramineralmente sean
expuestas se agregó el ácido acético al 40% para que reaccione con el Ca2+
asociado a las proteínas formando el acetato de calcio y liberando CO2.
Favoreciendo así que las proteínas se encuentren disueltas en la fase líquida.

Existen otros métodos para la obtención de la matriz orgánica, en algunos casos
emplean el ácido clorhídrico y en otros el ácido acético al 50%. La metodología
que se utilizó fue la reportada por Mann 2008, con la diferencia de usar el acético
37

al 40% en lugar del 50% y se cambió la cantidad de dicho compuesto ya que
especifican usar 20ml por cada gramo de muestra seca, en este caso se utilizaron
6 ml por cada gramo de muestra. Este nuevo método resultó en la obtención de la
matriz orgánica, confirmándose mediante la medición de proteína total (BCA).
Obteniendo una concentración de aproximadamente 1.5 mg/ml que variaba
dependiendo de la estructura que provenía. La testa por ser el componente de
mayor tamaño se obtuvo 2.8 mg/ml de matriz orgánica.

Cuando se conocen las propiedades físicas y químicas de las proteínas de interés
resulta más sencillo elegir un método de purificación, así como las operaciones de
remoción de solutos y concentración de fracciones. El peso molecular determina el
límite de exclusión de las membranas empleadas en las diálisis, así como el
tamaño de los poros en el medio cromatográfico.

En el caso de E. lucunter no se han reportado proteínas que intervengan en la
biomineralización las bases de datos consultadas fueron el Scopus y NCBI. En
base a esto es poco lo que se conoce acerca de las proteínas de la matriz
orgánica en esta especie de erizo de mar. El método de purificación que se
desarrolló en este trabajo se basó en los pesos moleculares de las proteínas
aisladas en otro erizo de mar S. purpuratus reportado por Livingston B.T. et al
2006 y en las diferentes propiedades de separación de los geles cromatográficos
empleados. En total, la purificación de las proteínas se realizó en seis pasos.

En el gel de los extractos totales (figura 11) se tienen proteínas de pesos
moleculares de entre 20 y 250 kDa. Sin embrago, se puede ver que unas bandas
son más abundantes, por ejemplo en la espina se observan con mayor intensidad
aquellas de peso molecular de 50 y 60 kDa. De igual manera se pueden observar
bandas similares presentes en las tres estructuras.

Estos resultados están de acuerdo a lo reportado por otros grupos de
investigación, como se muestra en la figura 11. Por otra parte la abundancia de
proteínas de alrededor de 20 y 50 kDa estaría indicando la existencia de proteínas
de la subfamilia SM50, que incluye la misma SM50, SM37, SM32, SM29, PM27
(10, 18).

Para asegurarnos que las modificaciones hechas a la técnica no hubieran
resultado en pérdida de matriz orgánica se cuantificó el extracto total dando como
resultado para espina 1.6 mg, testa 2.8 mg y para la linterna 1.4 mg. Con esto se
hace constatar que sí se obtuvo la matriz orgánica.

Purificación de proteínas asociadas a la biomineralización

De las dos fracciones obtenidas por la precipitación con sulfato de amonio se
decidió continuar trabajando solo con la fracción 50-100% de precipitación de la
espina, por el motivo de la cantidad de muestras que se obtuvieron del Rotofor. Se
decidió continuar con la fracción de la espina porque estudios como los de Mann y
38

colaboradores indican la presencia de proteínas involucradas en la
biomineralización en las espinas de los erizos.

Las otras fracciones de la testa y la linterna de Aristóteles se guardaron a -700 C
para su posterior tratamiento.

Cromatografía Líquida de Alta Resolución

Con base al resultado obtenido del gel de gradiente 8-14% se tomaron 5 µl de la
fracción dos y se analizó por el método de espectrometría de masas (MALDI-
TOF). Se obtuvo la gráfica de la figura 14, en donde se pueden observar al menos
dos tipos de proteínas presentes en este pico lo cual concuerda con lo obtenido en
el gel de acrilamida. Se obtienen dos tipos de proteínas una de 33308.734 Da a la
cual asignaremos como proteína A y otra de 66726.604 Da que será proteína B.

Se realizó un gel de pI de la fracción dos de exclusión molecular donde se pueden
observar dos tipos de proteínas, una proteína en mayor proporción de carácter
ácido con un punto isoeléctrico de aproximadamente 3.50 y otra proteína en
menor proporción de carácter básico de un valor de pI 7.35 (figura 16). Por lo cual
se concluye que la proteína de mayor abundancia podría ser rica en aminoácidos
ácidos o contener grupos fosfato. De confirmar esto con base a su secuencia se
podría sugerir su papel en el proceso de la biomineralización como en el control de
la nucleación, control del crecimiento del mineral entre otras actividades asociadas
a la biomineralización, que necesitan de aminoácidos ácidos (Branka et al. 2011,
Mann 2001).

Posteriormente la muestra se corrió por una columna de intercambio iónico en el
cual el resultado vuelve a concordar con la presencia de solo dos proteínas que
están presentes en MALDI-TOF, en el gel de acrilamida y en el gel de punto
isoeléctrico.

Según los reportes, las proteínas aisladas del exoesqueleto de erizos de mar,
como la espina, tienen una masa entre 15 y 130 KDa, además en general no
presentan modificaciones postraduccionales como la glicosilación. Se han
encontrado proteínas de mayor masa molecular cómo la proteína MPS130 que sí
presentan glicosilaciones (Livinstong et al. 2006, Mann et al. 2008, Mann et al.
2012). También existen proteínas fosforiladas (Mann et al. 2008, Veis et al. 2008).

La determinación de glicosilación muestra que no hay la presencia de
carbohidratos en la molécula de proteína por lo que se concluye que estas
moléculas no son glicoproteínas. Para lo cual se comprobó retiñendo el gel con
tinción de plata (figura 18) y evidenciando dos proteínas, una alrededor de los 30
kDa y otra a los 63 kDa. Lo cual concuerda con la purificación de la muestra al
solo presentar dos proteínas presentes.

Ensayos de Anhidrasa Carbónica (AC) y generación de cristales

En este trabajo se empleó como referencia la actividad de la anhidrasa carbónica,
ya que en estudios realizados por Müller WEG et al 2012, han demostrado que la
enzima anhidrasa carbónica juega un papel importante en la formación del
endoesqueleto de muchos organismos marinos porque provee el carbonato para
la formación de calcita. Se tomó como un punto para identificar las posibles
proteínas involucradas en la biomineralización. Se piensa que esta enzima está
también presente en E. lucunter como una proteína involucrada en la
biomineralización.

El resultado de la actividad enzimática del extracto total de cada unade las
diferentes estructuras y de las fracciones obtenidas demuestra la existencia de la
AC. Se espera que la proteína purificada sea una AC, sin embargo no se puede
concluir lo anterior hasta no tener la secuencia. Por lo anterior se realizó una
prueba de generación de cristales de carbonato de calcio (CaCO3), a partir del
extracto total de espina. A partir del extracto total de la espina, testa y linterna
(figuras 19, 20) se generaron cristales los cuales fueron observados a las 24 h. Se
utilizó como control negativo el agua desionizada dando como resultado lo
esperado, la ausencia de cristales. El control positivo (1µg) presentó una gran
cantidad de cristales de carbonato de calcio generados por la acción de la
anhidrasa carbónica, mientras que con 1 µg de muestra del extracto total se
presentaron cristales, pero de menor tamaño.

Los cristales generados se analizaron por el método de Espectroscopía de
infrarrojo, para cerciorarse que los cristales fueran de carbonato de calcio y no
alguna sal precipitada, así como para saber de qué tipo de isoforma es la que se
encuentra presente. Como se puede observar en el espectro, se obtuvieron las
señales características de 873.64 cm-1 y 712.91cm-1, que concuerdan con las
señales reportadas para CaCO3 en forma de calcita, lo cual era lo que se
esperaba.

También se realizó un ensayo con AC pura como control positivo, en el que se
emplearon diferentes concentraciones de la enzima. El cristal (figura 24) obtenido
se analizó por difracción de Rayos X ya que el espectro de infrarrojo no es una
técnica que nos asegure el tipo de polimorfo. Los valores de celda que se
obtuvieron son los mismos reportados para calcita.

Las fracciones puras obtenidas de la cromatografía de intercambio iónico se
emplearon para las pruebas de generación de cristales de CaCO3, lo cual se
comprobó que sí se producen cristales (figura 26). El control positivo volvió a
generar cristales de buen tamaño y morfología similar a los anteriores, también se
observaron las fracciones puras dando como resultado, que la fracción A genera
cristales de menor tamaño y en poca cantidad. La fracción B presenta cristales
similares al control positivo de buen tamaño y en buena cantidad, en un tercer
pozo se colocaron ambas proteínas para observar si se obtenían cristales de
mejor calidad y tamaño. Sí se mejoró el crecimiento y la cantidad de cristales lo
40

cual nos sugiere que ambas proteínas trabajan en conjunto para llevar a cabo la
biomineralización. Esto comprueba que son un grupo de proteínas las
involucradas en la biomineralización. Sin embargo no se ha podido determinar el
tipo de polimorfo, porque los cristales son muy pequeños para analizarse por
Difracción de rayos X aunque por la morfología presente pueden corresponder a
calcita.

XI. CONCLUSIONES

 El método para la obtención de la matriz orgánica en E. lucunter resultó
rápido y efectivo para la obtención del extracto crudo.
 Se consiguió aislar y purificar dos proteínas de 33 kDa y 68 kDa presentes
en la matriz orgánica de las espinas de E. lucunter que están relacionadas
en el proceso de mineralización de CaCO3.
 La matriz orgánica está formada de proteínas con pesos moleculares entre
20 y 240 kDa. Por lo anterior sabemos que está compuesta por una mezcla
compleja de proteínas. Estos resultados concuerdan con lo reportado por
Mann y col. (2010). El extracto total de la muestra obtenida de E. lucunter
está enriquecido de proteínas de alrededor de 20 y 60 kDa, lo que sugiere
la posible existencia de proteínas de la subfamilia SM50.
 La enzima anhidrasa carbónica juega un papel central en la formación del
endoesqueleto del erizo de mar y provee el carbonato para la formación de
la calcita (Mann et al.2004). La proteína de alto peso molecular presenta un
alto porcentaje de semejanza con las AC y especialmente con las de origen
marino.
 Los resultados de actividad enzimática de AC que se han obtenido a partir
de la matriz orgánica de las espinas del erizo de mar sostienen el hecho de
que la presencia de dicha proteína como un componente importante de esta
estructura.
 Se caracterizaron bioquímicamente ambas proteínas obteniéndose para la
fracción A una masa molecular 33.308 kDa y un punto isoeléctrico de 3.5, la
proteína de la fracción B tiene una masa molecular de 68.543 kDa y con un
punto isoeléctrico calculado en 7.37.
 De los ensayos de generación de cristales de CaCO3, se consiguieron
cristales de CaCO3 en forma de calcita de los extractos totales de las
estructuras del erizo de mar. Se comprobó el tipo de cristal generado con
las diferentes fracciones de proteínas obtenidas. Así, los experimentos de
generación de cristales de carbonato de calcio, con las proteínas A y B,
juntas y por separado generan cristales.

XII. Perspectivas

Con un conocimiento más profundo de este fenómeno, se podrán realizar diversas
aplicaciones para el beneficio del humano. Por ejemplo en el desarrollo de
materiales biocompatibles diseñados molecularmente, para múltiples aplicaciones
como la formación de implantes óseos o dentales, sin el riesgo de incompatibilidad
o corrosión de los materiales. Igualmente se podrán desarrollar nuevas curas para
enfermedades propias de la vida moderna, como la nefrolitiasis o la formación
imperfecta de huesos y dientes.

Las proteínas determinadas en el presente trabajo se caracterizaron
bioquímicamente, por lo que el paso a seguir es la obtención de la estructura
primaria mediante la secuencia de aminoácidos para ambas proteínas. Se
propone realizar estudios de alineamiento y de proteínas homólogas. Además
realizar estudios de dicroísmo circular para determinar el tipo de estructura
secundaria (hélice α o lámina β).

Se requiere obtener, de igual manera, cristales de carbonato de calcio de mayor
tamaño para poder dilucidar el tipo de polimorfo presente, por lo que se propone
realizar ensayos en presencia de metales (Zn) proponiendo que se tratara de una
metaloproteína. También se pretende proponer un mejor sistema de cristalización
para obtener cristales de mejor calidad y poder realizar la difracción de rayos X.

De igual manera se propone estandarizar otro método para la obtención de la
matriz orgánica, para mejorar rendimientos en la extracción.

Se pretende realizar oligoméros para obtener la proteína sintéticamente y mejorar
su rendimiento en la extracción natural. De igual manera para no hacer un impacto
ecológico a la especie y realizar estudios de estructura y función sobre las
proteínas obtenidas.

XIII. Anexo

Sobre los métodos y procesos empleados

Electroforesis

La electroforesis en gel se halla entre los métodos más resolutivos y convenientes
en la separación molecular. En esta técnica, los geles retrasan las moléculas
grandes con respecto a las menores al migrar a través del gel por efecto de un
campo eléctrico. El aislamiento molecular se basa en la filtración en gel, así como
en las movilidades electroforéticas delas moléculas que se están separando. Los
geles de uso común son la poliacrilamida y la agarosa, que poseen poros de
dimensiones moleculares cuyos tamaños pueden especificarse (Walker, 1996;
Hawcroft, 1997).

Preparación y reactivos

A. Acrilamida/Bis-acrilamida
87.g acrilamida (29.2g/100ml)
2.4g N’N’-bis-metil-acrilamida (0.8/100ml)
Aforar a 300 ml con agua desionizada. Guardar a 4oC en oscuridad
(30días máximo)

B. 1.5M Tris-HCl pH 8.8
27.23g Tris base (18.15/100ml)
80ml agua desionizada
Ajustar pH 8.8 con 6N HCl. Aforar a 150ml con agua desionizada.
Guardar a 4oC

C. 0.5M Tris-HCl pH 6.8
6g Tris base
60ml agua desionizada
Ajustar pH 6.8 con 6N HCl. Aforar a 100ml con agua desionizada.
Guardar a 4oC

D. SDS 10%
Disolver 10g SDS (dodecil