Analisis-de-la-carga-mutacional-en-el-genoma-mitocondrial-en-fibroblastos-de-pulpa-dental-humana

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MEXICO
MAESTRÍA EN CIENCIAS (NEUROBIOLOGÍA)
Análisis de la Carga Mutacional en el Genoma Mitocondrial en
Fibroblastos de Pulpa Dental Humana 
TESIS
Que para optar por el grado de:
Maestro en Ciencias 
PRESENTA:
Q.F.B. Bertha Guadalupe Rueda Zarazúa
Tutor: 
Dr. Alfredo Varela Echavarría, INB. UNAM 
Comité Tutor:
Dra. Teresa Edith Garay Rojas, INB. UNAM
Dra. Aurea Orozco Rivas, INB. UNAM
Querétaro, Qro, México. 
Julio 2017 
1
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
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Índice de contenido
I. Dedicatorias............................................................................................................................................3
II. Agradecimientos....................................................................................................................................4
III. Abreviaturas.........................................................................................................................................5
IV. Resumen...............................................................................................................................................6
V. Summary................................................................................................................................................7
1. Antecedentes..........................................................................................................................................8
 1.1 Generales........................................................................................................................................8
 1.1.1 La mitocondria........................................................................................................................8
 1.1.2 Fosforilación oxidativa...........................................................................................................9
 1.1.3 El genoma mitocondrial........................................................................................................10
 1.1.4 Herencia................................................................................................................................12
 1.1.5 Dinámica mitocondrial.........................................................................................................14
 1.1.6 Mutaciones............................................................................................................................15
 1.1.7 Enfermedades mitocondriales y su diagnóstico....................................................................17
 1.2 Antecedentes directos...................................................................................................................19
 1.2.1 Dinámica de deleciones en cerebro de ratón........................................................................19
2. Planteamiento del proyecto..................................................................................................................24
 2.1 Justificación..................................................................................................................................24
 2.2 Hipótesis.......................................................................................................................................26
2.3 Objetivos.......................................................................................................................................26
 2.3.1 Generales..............................................................................................................................26
 2.3.2 Específicos............................................................................................................................26
3. Materiales y métodos...........................................................................................................................27
 3.1 Diseño experimental.....................................................................................................................27
3.2 Muestras biológicas.......................................................................................................................29
3.3 Secuenciación masiva....................................................................................................................31
3.4 Análisis bioinformático.................................................................................................................31
4. Resultados............................................................................................................................................35
 4.1 Procesamiento de las muestras.....................................................................................................35
 4.2 Análisis bioinformático de deleciones..........................................................................................37
 4.2.1 Deleciones recurrentes..........................................................................................................41
 4.2.3 Distribución de las deleciones..............................................................................................45
 4.2.4 Secuencias repetidas directas................................................................................................47
 4.2.5 Deleciones comunes.............................................................................................................49
5. Discusión..............................................................................................................................................51
6. Conclusiones........................................................................................................................................60
7. Perspectivas..........................................................................................................................................61
8. Referencias...........................................................................................................................................62
VI. ANEXO..............................................................................................................................................69
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I. Dedicatorias
A mis padres Bertha y Paulino, y mi hermano César por su amor infinito, apoyo incondicional
e incitarme siempre a alcanzar mis sueños. 
Al Dr. Alfredo Varela por aceptarme como parte de este proyecto y por su compromiso
inquebrantable conmigo y el proyecto, su claridad de mente y sus valores.
Al Dr. Jorge Tonatiuh por ser el guía más paciente y comprensivo, por aumentar mi tolerancia
a la frustración, por sus palabras y sus regaños, por las lecciones en el laboratorio y la vida y
su sincera amistad.
Al Dr. Carlitos por siempre creer en mí y apoyarme incondicionalmente en todo momento, por
todo su tiempo invertido en mí y este proyecto, por las horas de pláticas, risas y las aventuras
dentro y fuera del laboratorio. 
A Manuel, Ricardo, Fer, Paco, Caro y Mariana por hacer mis días más divertidos, por todas
las risas, las noches sin dormir en el laboratorio, las charlas, los bailes y todos los momentos
que quedaron en mí de esta bonita amistad. 
A todas las personas en SLP y QRO que me quieren y apoyan incondicionalmente. Ellos que
están siempre dispuestos a oír mis frustracionesy explicaciones acerca de lo que hago y
siempre sonríen aunque entiendan la mitad de lo que digo. 
3
II. Agradecimientos 
Fuentes de financiamiento: PAPIIT203713, FOMIX249744, CONACYT 232722, 238566,
271787, 282779, Beca Nacional Maestría CONACYT 420123
Universidad Nacional Autónoma de México e Instituto de Neurobiología 
Cirujano Dentista
 Mauricio Armando Noria Linares
FES-Cuautitlán, UNAM
 Laura González Dávalos
Laboratorio Nacional de Visualización Científica Avanzada, UNAM
 Luis Alberto Aguilar Bautista
Instituto de Neurobiología, UNAM
Laboratorio de Diferenciación Neural y Axogénesis
 Jorge Tonatiuh Ayala Sumuano
 Carlos Javier López Victorio
 Carlos Lozano Flores 
 Rosa Martha Pérez Serrano 
.
Laboratorio de Mapeo de Función Cerebral 
 Leopoldo González Santos
Unidad de Proteogenómica
 Adriana González Gallardo 
 Anaid Antaramian Salas 
 Michael Conrad Jeziorski 
Unidad de Cómputo
 Alberto Lara Ruvalcaba
 Omar González Hernández
 Ramón Martínez Olvera
Unidad de Enseñanza 
 Leonor Casanova Rico 
 Guadalupe Amador Uribe
 Ma. Carmen Mendoza López
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III. Abreviaturas
ATP Trifosfato de Adenosina 
ADP Difosfato de Adenosina 
Ca2+ Calcio
CINVESTAV Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico 
Nacional 
DMEM Modificación de Dulbecco del Medio Eagle 
DRP1 Proteína Relacionada con Dinamina
ERO Especies Reactivas de Oxígeno
FADH2 Dinucleótido de Falvina y Adenina 
gMT Genoma mitocondrial
GNU GNU no es Unix, Sistema Operativo de Software libre
GRCh38 Consorcio de Genoma de Referencia Humano número 38
Kb Kilobases (Mil pares de bases)
LANGEBIO Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad
MFN Mitofusina
MLPA Amplificación Dependiente de Ligación Múltiple
NADH Dinucleótido de Nicotinamida y Adenina
NGS Secuenciación de Nueva Generación 
OPA1 Atrofia Óptica 1
PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa
pb Pares de bases
REDOX Reducción-Oxidación 
SNP Polimorfismo de Nucleótido Único
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IV. Resumen 
La mitocondria es un organelo celular cuya principal función es la producción de energía por
medio de la fosforilación oxidativa. Las mitocondrias tienen un genoma de ADN circular que
contiene los genes que codifican para péptidos que son componentes fundamentales de la
fosforilación oxidativa y parte de la maquinaria de traducción para la síntesis de esos
componentes. En este genoma ocurren mutaciones de distintos tipos de las cuales las
deleciones son los eventos más comunes y son causales de una amplia gama de
enfermedades debilitantes y neurológicas de difícil diagnóstico debido a la naturaleza
heterogénea de estas patologías y a las limitaciones en los métodos moleculares actuales. 
En este proyecto desarrollamos un método de aislamiento de ADN circular a partir de pulpa
de dientes deciduos de individuos sanos para la identificación de la carga de deleciones en el
genoma mitocondrial a través de secuenciación masiva. Los datos de NGS (Secuenciación
de Nueva Generación) se mapearon con BLAT y para el análisis usamos comandos de Linux
y otras herramientas bioinformáticas como SAMtools. 
Como parte de este trabajo identificamos deleciones de diversos tamaños distribuidas a lo
largo de todo el genoma de las cuales las más abundantes son las deleciones de un solo
nucleótido las cuales se encuentran distribuidas a lo largo de todo el genoma. Sin embargo,
hay regiones de mayor prevalencia y otras, como en la región no codificante del d-loop, en la
cual se detectaron un mínimo de deleciones. Sólo el 1.94% de las deleciones involucra en
sus extremos repetidos directos de al menos 4 nucleótidos y el mayor identificado fue de 8
nucleótidos. Sólo 25 deleciones fueron comunes en las tres muestras analizadas y la
mayoría son específicas de cada individuo. La deleción más abundante corresponde a la
secuencia comprendida entre las posiciones 521-524 la cual se encuentra en dos de las tres
muestras con 1.13% y 2.58% de heteroplasmia y corresponde a la región del d-loop. 
Estos hallazgos revelan la existencia de una gran diversidad de deleciones de baja
frecuencia en el genoma mitocondrial de individuos sanos. Este trabajo es un primer estudio
con este método en humanos para conocer la dinámica de las deleciones en condiciones
normales y así sentar las bases para un nuevo método diagnóstico con una capacidad
amplia de identificación de deleciones en cualquier región del genoma mitocondrial. 
6
V. Summary
The mitochondrion is a cellular organelle whose main function in the cell is energy production
through oxidative phosphorylation. Mitochondria contain a genome of circular DNA that
contains genes that encode peptides which are fundamental for oxidative phosphorylation
and part of the mitochondrial translation machinery. Different types of recombination events
occur in this genome, deletions being the most common among them and they could cause a
wide spectrum of neurological and debilitating diseases whose diagnosis is difficult due to the
heterogeneous nature of the pathologies and to limitations in current molecular methods. 
In this project, we established a method for isolation of circular DNA from pulp of deciduous
teeth for the identification and quantification of deletion load in the mitochondrial genome from
healthy individuals using massive sequencing. The NGS (New Generation Sequencing) data
were mapping with BLAT and for the analysis we used Linux commands and other
bioinformatic tools as SAMtools. 
As part of this work, we identified deletions of different sizes distributed throughout the
genome, the majority of which involve the loss of a single nucleotide. There are regions,
however, with a higher prevalence of deletions and others such as the non coding d-loop
region, in which a minimum of deletion events were detected. Only 1.94% of the deletions
involve in their extremes at least a 4 nucleotide direct repeat and the largest identified was 8
nucleotides long. Only 25 deletions were present in all three samples analyzed and most of
them were specific to a single individual. The most abundant deletion corresponds to the
sequence between the positions 521-524 which was in two of the three samples with 1.13%
and 2.58% heteroplasmy and is part of the d-loop region. 
These findings reveal the existance of a high diversity of deletions present at low frequencies
in the mitochondrial genome of healthy individuals. This work is the first study with this
method in humans to understand the dynamics of deletions in the mitochondrial genome. It
constitutes the groundwork for the development of a new diagnostics tool with a broad
capacity to detect deletions throughout the mitochondrial genome.
7
1. Antecedentes 
1.1 Generales 
1.1.1 La mitocondria
La mitocondria es un organelo citoplasmático cuya morfología puede variar dependiendo de
los requerimientos de la célula. Las mitocondrias se pueden encontrar en forma individual o
formando una retícula en las células eucarióticas (Pernas & Scorrano 2015). 
La teoría endosimbiótica postulada por Lynn Margulis en el año de 1967, establece que estos
organelos tienen su origen evolutivo en alfaproteobacterias, que se incorporaron a células
eucariotas hace millones de años. La teoría se basa en que existen múltiples características
compartidas entre estos microorganismos y las mitocondrias incluyendo su mecanismo
quimiosmótico para la obtención de energía (Pernas & Scorrano 2015, Margulis 1970).
La mitocondria tiene una doble membrana que delimita compartimentos funcionalmente
especializados. La membrana externa permite la importación y exportación de biomoléculas
y simultáneamente protege al citosol de productos mitocondriales que podrían ser tóxicos
como las especies reactivas de oxígeno (ERO) (Pernas & Scorrano 2015).La membrana
interna separa el espacio intermembranal de la matriz mitocondrial y es menos permeable
que la externa. La membrana interna forma crestas cuya base mantiene el contacto con la
membrana externa y permite la importación de moléculas a la matriz mitocondrial. Las
crestas son áreas funcionales ya que ahí se realizan la síntesis y traslocación de proteínas,
favorecen el mantenimiento de los nucleoides, la biogénesis de proteínas con centros de
Fe/S y ahí se anclan los complejos de la cadena respiratoria que realizan la fosforilación
oxidativa (Pernas & Scorrano 2015). 
En células animales, la función primordial de las mitocondrias es la producción de energía en
forma de adenosina trifosfato (ATP) (Wallace et al., 2014); sin embargo, hay otras funciones
que se llevan a cabo en la mitocondria como son la regulación de Ca2+, la termogénesis, el
control de la apoptosis y el metabolismo de azúcares mediante el ciclo de Krebs
(Kowaltowski, 2000).
8
1.1.2 Fosforilación oxidativa
La obtención de energía en las células eucariotas se da principalmente por medio de la
fosforilación oxidativa que acopla el transporte de electrones a la síntesis de ATP. 
El metabolismo de carbohidratos, lípidos y proteínas convergen en el ciclo de Krebs que
alimenta la cadena de transferencia de electrones para la generación de energía. La glucosa
es el principal sustrato para este proceso; por cada molécula de la misma se sintetizan de 32
a 34 moléculas de ATP mientras que la glicólisis por sí misma produce únicamente 4
moléculas de ATP (Cooper, 2000). 
En las crestas mitocondriales hay cuatro complejos proteicos acoplados a una ATP sintetasa.
Las moléculas NADH y FADH2 que se producen en el ciclo de Krebs son oxidadas por el
complejo I (NADH deshidrogenasa) y el complejo II (succinato deshidrogenasa),
respectivamente, liberando en ambos casos pares de electrones de alta energía. Los
electrones son transportados por la coenzima Q al complejo III (citocromo C reductasa) y
luego a través del citocromo C al complejo IV (citocromo C oxidasa). Una vez que esto ocurre
vuelven a la matriz mitocondrial y se combinan con oxígeno para formar agua. La
transferencia de electrones por los complejos permite el paso de protones (H+) de la matriz
al espacio intermembranal. El transporte de iones genera un gradiente de protones que al
volver a la matriz brinda la energía necesaria a la fracción F0 intermembranal de la ATP
sintasa. Esta corriente hace rotar, por acción mecánica, las subunidades γε de la porción F1
lo cual induce un cambios conformacionales de las subunidades β que forman hexámeros
intecalados con α. Las subunidades β pueden tener tres estados conformacionales que
permiten la unión de nucleótidos: O, L y T. El T permite la fosforilación de las moléculas de
ADP para formar ATP (de Paula et al. 2013, Cooper 2000).
El espacio intermembranal es electroquímicamente positivo con un pH=7.0 y la matriz es
negativa con un pH=8.0; esta diferencia proporciona el componente químico mientras que se
establece un potencial eléctrico a través de la membrana debido al incremento de cargas
positivas en el lado citosólico. Por ello se considera que la fosforilación oxidativa es un
fenómeno electroquímico (Mitchell 1961)
9
1.1.3 El genoma mitocondrial 
Las mitocondrias tienen su propio genoma (gMT) que consiste en una doble hélice circular
que en el humano contiene 16,569 pares de bases con 37 genes que codifican para 2 ARN
ribosomales, 22 ARN de transferencia y 13 polipéptidos que forman parte de 4 de los 5
complejos involucrados en la Fosforilación oxidativa (Copeland & Longley, 2014, Ameur et al.,
2011, Damas et al., 2014, Solano et al., 2001). Además se han identificado 2 orígenes de
replicación OH y OL en los nucleótidos 407 y 5747 respectivamente y una región de control
con conformación de triple cadena que facilita la síntesis de la cadena H o cadena pesada en
el extremo 5' denominada “d-loop” (Figura 1) (Damas et al., 2014) . 
Cada célula tiene de cientos a miles de genomas dependiendo del tejido los cuales se
encuentran agrupados formando nucleoides que contienen entre 2 y 10 moléculas circulares
(Carelli et al. 2015). 
 
10
Figura 1. Estructura genómica del genoma mitocondrial. El genoma mitocondrial
consta de 37 genes que codifican para 2 ARN ribosomales, 22 ARN de
transferencia para la síntesis de proteínas propias de la mitocondria y 13 ARN
mensajeros que codifican para proteínas que participan en la fosforilación
oxidativa. Adaptado de St John, J.C. et al. 2010.
11
1.1.4 Herencia
La herencia mitocondrial no sigue patrones mendelianos sino que las mitocondrias son
heredadas por línea germinal materna (Carelli et al., 2015). 
El estudio de las diferencias en el genoma mitocondrial han sido de gran importancia en el
estudio filogenético de nuestra especie siguiendo la ascendencia por línea materna hasta el
origen de nuestra especie que se ha definido como la Eva mitocondrial, la cual tiene una
antigüedad aproximada de 200 000 años y su origen en África. Con base a las diferencias
sistemáticas entre los genomas mitocondriales se ha desarrollado una clasificación en
haplogrupos con una filogenia bien definida que ha permitido trazar el movimiento de las
poblaciones y es la base de muchos estudios filogenéticos (Hart et al., 2014). 
En 1990 se define la nomenclatura de los haplogrupos con letras de la A a la Z, de acuerdo
a su descubrimiento. Los haplogrupos A-G fueron asignados al linaje asiático y americano,
mientras que H-K a las poblaciones europeas y L corresponde al grupo de mayor variación
de las poblaciones africanas (Figura 2). Actualmente esta línea de investigación continua
definiéndose con las nuevas tecnologías de secuenciación y nuevos estudios poblacionales
(Kivisild, 2015). 
12
 
Figura 2. Árbol filogenético de los haplogrupos mitocondriales de acuerdo a la
herencia materna a partir de las secuencias del ADN mitocondrial (Adaptado de
Phylotreemt. MtDNA tree Build 17 (18 Feb 2014))
13
A pesar de la herencia mitocondrial materna, la mayoría de las proteínas mitocondriales
están codificadas en el núcleo, el cual sí sigue una herencia mendeliana. Algunos estudios
sugieren que en los ovocitos existe una subpoblación mitocondrial, que corresponde a las
mitocondrias que se heredan, la cuál tiene cierto grado de quiescencia y no es
funcionalmente activa por lo que al no estar en constante interacción con especies reactivas
de oxígeno, su carga mutacional es menor a la del resto de las mitocondrias funcionales que
participan activamente en la producción de energía (de Paula et al., 2013). Otros estudios
han determinado que al momento de la fecundación pocas mitocondrias paternas se
internalizan al ovocito y las que lo logran son eliminadas por medio de un mecanismo de
marcaje que las dirige a degradación previo al reclutamiento de autofagosomas del ovocito.
Este proceso de eliminación de las mitocondrias paternas parece ser crítico para la viabilidad
de los embriones (Zhou et al. 2016, Wang et al. 2016).
Durante la maduración del ovocito ocurre un fenómeno denominado “cuello de botella” en el
cual se disminuye aleatoriamente el número de copias del gMT por célula seguida de la
replicación de los mismos (Cao et al. 2009). A partir de este paso crítico en la herencia
mitocondrial puede haber una expansión clonal de variantes genómicas específicas que se
replican y prevalecen en el nuevo individuo, los cuales pueden ser canónicos y altamente
funcionales pero también genomas mutados con distintos grados de deficiencia (Carelli et al.
2015).
 
1.1.5 Dinámica mitocondrial
En condiciones normales existe un equilibrio entre la fusión y fisión mitocondrial. La fusión es
un proceso mediante el cual las mitocondrias cambian su morfología y seunen permitiendo
la transferencia de moléculas del gMT, proteínas, lípidos y metabolitos. De manera inversa la
fisión mitocondrial es otro proceso en respuesta a señales citosólicas a partir del cual se
producen una o más mitocondrias hijas. Esto se relaciona directamente con el recambio
mitocondrial por biogénesis o con la degradación por mitofagia. Estos ajustes ocurren en
función a las necesidades de los tejidos o células y la pérdida de este equilibrio está
directamente relacionada con la muerte celular (Carelli et al. 2015, Jornayvaz & Shulman
2010).
14
La biogénesis mitocondrial requiere de entre 1000 y 1500 proteínas codificadas en el
genoma nuclear y su coordinación con la síntesis de proteínas codificadas en el genoma
mitocondrial. Algunos factores como el estrés oxidativo del medio, la restricción energética,
bajas temperaturas, el mismo proceso de división o diferenciación celular afectan la
biogénesis variando el número, talla y masa de las nuevas mitocondrias (Jornayvaz &
Shulman 2010). 
La fusión mitocondrial permite que las mitocondrias con deficiencias leves a nivel de genoma
o de proteínas, puedan complementarse con otras lo que mantiene la funcionalidad
mitocondrial. Este proceso involucra moléculas de unión que juegan un papel fundamental;
OPA-1 en la membrana interna y las mitofusinas MFN-1 y MNF-2 en la membrana externa
(Pernas & Scorrano 2015). La fisión mitocondrial, permite a las mitocondrias con daños
severos separarse de la retícula y se favorece su degradación por medio de la mitofagia
(Carelli et al., 2015). Los cambios en el potencial de membrana de la mitocondria son señal
de disfuncionalidad y pueden sensarse por el eje Pink1/Parkin activando una cascada de
señalización intracelular que lleva a la remoción de las mitocondrias defectuosas. La fisión es
coordinada por DRP1 que es una molécula que hidroliza GTP y divide la membrana interna y
externa de la mitocondria para generar mitocondrias hijas. La GTPasa Rheb regula este
proceso interactuando con Nix y LC3-II del autofagosoma luego de ser reclutada a la
membrana externa. La mitofagia aumenta como consecuencia de una alta actividad
energética en las células promoviendo a la vez el recambio mitocondrial y manteniendo la
producción de energía (Lavie et al. 2013), Carelli et al. 2015).
1.1.6 Mutaciones
A diferencia del genoma nuclear, en cada célula existen múltiples genomas mitocondriales
que varían en número de un tejido a otro en función de su requerimiento energético. El
mtADN solía considerarse como un conjunto de copias idénticas; sin embargo, en la
actualidad se sabe que existe heteroplasmia que es la coexistencia en la misma célula de
variantes genómicas producto de distintos eventos mutacionales (Damas et al., 2014, Carelli
et al., 2015). Es también sabido que la tasa de mutación del genoma mitocondrial en
vertebrados es de 10 a 17 veces mayor que la del genoma nuclear (Wallace et al., 2014), y
15
que estas mutaciones pueden ser de naturaleza somática y producirse de novo a lo largo del
ciclo de vida del individuo (Carelli et al., 2015, Kang et al., 2016) o bien ser heredadas
directamente por línea germinal de la madre. En el equilibrio dinámico de la mitocondria se
producen mutaciones constantemente y existen algunas teorías sobre el origen de las
mismas. i) La constante exposición a factores mutagénicos como las especies reactivas de
oxígeno (ERO) (Khrapko & Turnbull, 2014), ii) Defectos en la funcionalidad de las enzimas
POLG (polimerasa) y Twinkle (helicasa) (Damas et al., 2014), iii) Mutaciones en genes
nucleares involucrados en replicación y mantenimiento mitocondrial (Carelli et al. 2015), iv)
El proceso natural de envejecimiento y su correspondiente acumulación de mutaciones
(Ameur et al., 2011, Williams et al., 2013, Kang et al., 2016).
La diversidad de mutaciones que se han descrito en el genoma mitocondrial abarca
mutaciones puntuales, sinónimas y no sinónimas, así como deleciones e inserciones de
diversos tamaños que se han observado en humanos y otros mamíferos (Damas et al., 2014,
Williams et al., 2013). Las mutaciones son muy diversas, ocurren en distintas regiones del
genoma y afectan distintos genes, presentan grados variables de heteroplasmia, se han
identificado en diversos tejidos y se sabe que dependiendo de estos factores la eficiencia en
la función mitocondrial puede verse afectada (Kang et al., 2016). Si bien son aún
desconocidos los mecanismo de formación y estabilización de las deleciones en el genoma
mitocondrial, se han observado asociaciones entre éstas con repetidos directos, que son
secuencias idénticas en posiciones contiguas de nucleótidos en distintas regiones del
genoma que facilitan eventos de recombinación, así como con estructuras secundarias en el
ADN del tipo “tallo-bucle” (Lakshmanan et al., 2012). Tanto repetidos directos como
estructuras de tallo-bucle correlacionan con sitios de deleción en genomas de mamíferos de
vida larga como monos y humanos pero no en especies como rata y ratón, lo cual podría ser
una adaptación evolutiva ante mutaciones estables (Lakshmanan et al. 2012). 
La acumulación de mutaciones en el ADN mitocondrial causa disfunción mitocondrial en
distintos grados. Deficiencias de la función mitocondrial afectan el metabolismo de las células
y en consecuencia pueden llegar a tener efectos a nivel de tejidos o incluso sistémicos. Un
mayor número de mutaciones se han relacionado con enfermedades como la enfermedad de
16
Parkinson, Alzheimer, infertilidad masculina y se ha sugerido que favorecen el desarrollo de
algunas formas de cáncer de próstata, estómago, colon, mama y pulmón (Damas et al.
2014; Lakshmanan et al. 2012; Hoekstra et al. 2016, Hosseinzadeh et al., 2014; Wallace et
al. 2014; Schwartz et al. 2006; Burgart et al. 1995). 
1.1.7 Enfermedades mitocondriales y su diagnóstico
Cargas mutacionales altas generalizadas afectan la eficiencia de la función mitocondrial pero
también existen mutaciones particulares que se han asociado a fenotipos patológicos en
humanos. En el año de 1988 se identificó la primera mutación patológica mitocondrial en
humanos y desde entonces se han caracterizado más de 200 (Wallace et al., 2014, Solano et
al., 2001, Chinnery et al., 2012) . 
Las enfermedades mitocondriales son un grupo de síndromes y patologías heterogéneas en
las cuales la funcionalidad de las mitocondrias se ve afectada en uno o varios tejidos y en su
mayoría tienen un origen genético ocasionado por mutaciones patológicas.
Los tejidos más afectados por patologías mitocondriales son los que tienen mayor
requerimiento energético, especialmente músculo y cerebro. Por ello la mayoría de las
afecciones mitocondriales en el humano son neuromusculares y progresivas (Damas et al.,
2014, Williams et al., 2013). Existe una gran variabilidad de enfermedades o síndromes que
se han relacionado con mutaciones mitocondriales entre las cuales destacan la neuropatía
óptica hereditaria de Leber, oftalmología progresiva externa crónica, síndrome de Kearns-
Sayre, síndrome de Leigh y diabetes con sordera (Solano et al., 2001, Carelli et al., 2015,
Lakshmanan et al., 2012).
Un estudio epidemiológico en Inglaterra, entre 1990 y 2014, estimó que la incidencia mínima
de mutaciones patológicas relacionadas con enfermedades mitocondriales es de 23 por cada
100 000 adultos, o sea 1 de cada 4300 personas, de los cuales 2.9 son debidas a
mutaciones en genes mitocondriales codificados en el ADN nuclear y el resto a mutaciones
del ADN mitocondrial. Así mismo se estimó que 12.5 por cada 100 000 adultos se encuentran
afectados clínicamente y 10.7 por cada 100 000 se encuentran en riesgo de padecer alguna
17
enfermedadmitocondrial (Gorman et al., 2015). 
El diagnóstico de estas patologías resulta complejo debido a sus características: a) tienen
cuadros clínicos diversos que van desde desórdenes motores o neurológicos, convulsiones,
demencia, sordera y cardiomiopatía hasta disfunciones hepáticas y pancreáticas; b) el
fenotipo patológico y la severidad de la enfermedad dependen de los grados variables de
heteroplasmia; c) presentan heterogeneidad genética ya que una mutación específica puede
dar lugar a fenotipos patológicos diferentes dependiendo del tejido en que se encuentren y
un solo fenotipo puede ser producto de distintas mutaciones o de la combinación de más de
una variante genómica y d) presentan mosaicismo genético, es decir que puede haber
distintos genotipos desde un nivel celular hasta tisular, por lo que una mutación puede no ser
detectable en un tejido pero sí en otro del mismo individuo. Por todo lo anterior, el diagnóstico
de estas enfermedades es sumamente complejo, es fácil confundirlas con otros síndromes y
para su confirmación requiere de una amplia gama de estudios clínicos, metabólicos,
morfológicos, histoquímicos, bioquímicos y genéticos (Solano et al., 2001). 
Actualmente, la metodología para diagnóstico molecular de enfermedades mitocondriales
más usada es la Amplificación Dependiente de Ligación Múltiple (MLPA) que es una prueba
que usa sondas para variantes genómicas específicas que están relacionadas con las
mutaciones causales más conocidas (Mayorga et al. 2015). Sin embargo, existe un gran
sesgo en el uso de este método ya que está diseñado sólo para la identificación de
mutaciones conocidas. 
18
1.2 Antecedentes directos
1.2.1 Dinámica de deleciones en cerebro de ratón
El genoma mitocondrial de ratón tiene 16 299 pares de bases, sólo 270 pb menos que el
humano, y se encuentran codificados los mismos genes con una distribución similar. Existe
una gran homología entre ambos genomas y las similitudes no son sólo genómicas sino
también fisiológicas(Figura 3) (Kazachkova et al. 2013). 
De acuerdo a estudios previos de otros laboratorios con secuenciación sanger, se
observaron deleciones en el genoma mitocondrial de ratones viejos pero no en jóvenes y las
deleciones se encontraron en menos del 0.01% de los genomas considerando distintos
tejidos, incluido cerebro. Además asocian algunas de las deleciones con secuencias
repetidas directas, ya que en el genoma mitocondrial existen gran cantidad de sitios con
secuencias repetidas directas, perfectas o imperfectas. Se observó que estas regiones de
secuencias repetidas directas tienen un mayor contenido relativo de G/C, no abarcan los
orígenes de replicación y se encuentran lo suficientemente separados entre sí para poder
observar las moléculas deletadas revelando el producto de PCR en geles de agarosa. Una
de las limitaciones de esta metodología es que sólo es posible detectar deleciones grandes
(Tanhauser & Laipis, 1995). Otros estudios con PCR revelaron que al comparar la proporción
de deleciones en la sustancia nigra, en ratón viejo se encuentra en menores niveles de
heteroplasmia (menos de 0.5%) que en humano de edad avanzada (5%) (Guo et al., 2010). 
19
Figura 3. Distribución de los genes codificados en el genoma mitocondrial. a) De
humano (Homo sapiens, NC_012920) b) De ratón (Mus musculus, NC_005089)
(Adaptado de Kazachkova et al., 2013).
Estudios de nuestro laboratorio nos han permitido caracterizar la carga de deleciones en el
20
genoma mitocondrial de ratón desde ovocitos hasta tejido cerebral embrionario, adulto y
anciano, observándose una alta diversidad de eventos de deleción en su mayoría con bajas
frecuencias. En este estudio corroboró que la amplificación por desaplazamiento múltiple no
introduce errores significativos de secuencia. Así mismo se usó como control de
secuenciación para la plataforma Illumina un genoma clonado en fragmentos con E. coli, lo
que permitió descartar las posibles deleciones introducidas por el método de secuenciación
masiva. 
La mayoría de las deleciones detectadas fueron de un solo nucleótido. Sin embargo,
deleciones de mayor tamaño, incluso de varias kilobases de longitud, fueron identificadas en
todos los estadios (Ayala Sumuano et al. Resultados preliminares) (Figura 4). Estos estudios
revelaron además que existen subpoblaciones de deleciones cuya frecuencia varía en las
distintas etapas analizadas. Considerando algunos estudios de otros laboratorios se
esperaría que las deleciones aumentaran su frecuencia conforme avanza la edad de los
individuos (Kang et al. 2016). Sin embargo, en nuestro laboratorio se observó que sólo una
fracción de las deleciones tiende a la acumulación conforme avanza la vida del individuo.
Otros subgrupos de deleciones tienen distintas tendencias a través del tiempo ya que
también se identificaron subpoblaciones de deleciones muy abundantes en ovocitos o
embriones que mantienen su frecuencia a lo largo del tiempo y otras que incluso parecen
disminuir y ser menos frecuentes en adultos mayores (Ayala Sumuano et al. Resultados
preliminares).
Las deleciones observadas se distribuyen a lo largo de todo el genoma mitocondrial,
afectando regiones codificantes y regulatorias con una distribución no homogénea y con
regiones discretas del genoma que muestran una mayor recurrencia de eventos. Estos
hallazgos revelan que variantes del genoma mitocondrial que contienen deleciones son más
abundantes que lo previamente observado y que son parte del repertorio normal de genomas
mitocondriales presente desde células germinales y que se mantienen en tejidos somáticos
(Ayala Sumuano et al. Resultados preliminares) (Figura 5). 
21
Figura 4. Frecuencia relativa de las deleciones mitocondriales identificadas en
tres estadios del cerebro de ratón clasificadas de acuerdo a su tamaño. Cada
barra corresponde a un individuo (Ayala Sumuano et al. Resultados no
publicados). 
22
Figura 5. Distribución de las deleciones en el genoma mitocondrial de ratón
clasificadas de acuerdo a su tamaño. Cada círculo representa las 16.3 Kb del
genoma mitocondrial y la punta de flecha el origen de la numeración. Inicia de la
circunferencia al centro a manera de espiral, y va trazando cada deleción como
arcos que van del punto de ruptura inicial al final. Los radios (en el caso de las
deleciones de menor tamaño) y los arreglos radiales que asemejan rebanadas de
pastel (en deleciones de mayor tamaño) representan regiones con recurrencia de
eventos, por el contrario las regiones blancas representan la ausencia de eventos
en nuestras muestras en esa región.
23
2. Planteamiento del proyecto
2.1 Justificación
Estudios de nuestro laboratorio con un método por el cual se analizan todas las regiones del
genoma mitocondrial revelaron que en ratones existe una alta diversidad de deleciones de
baja frecuencia en ovocitos y tejidos somáticos adultos. En el humano, sin embargo, no se
han llevado a cabo estudios que analicen de manera integral la carga mutacional con este
método. Esto es de gran relevancia pues se sabe que altos grados de heteroplasmia de
mutaciones específicas se pueden correlacionar con enfermedades que cursan con
disfunción mitocondrial. 
El diagnóstico de enfermedades mitocondriales resulta complicado debido a la variabilidad de
los cuadros clínicos, su heterogeneidad genética, los grados de heteroplasmia, el
mosaicismo que las caracteriza y a que los métodos de diagnóstico molecular actualmente
usados tienen un gran sesgo técnico hacia deleciones conocidas. 
La mayoría de los métodos de diagnóstico molecular de enfermedades mitocondriales
presentan sesgos ya que están dirigidas a mutaciones específicas relacionadas con las
enfermedades mitocondriales más conocidasy muchos de ellos requieren del uso de PCR, lo
cual genera mutaciones artefactuales en las muestras. Debido a esto el desarrollo de una
técnica para el análisis que no tenga ese sesgo y permita identificar toda la gama de
deleciones sin la carga mutacional introducida por la reacción de PCR, así como la
identificación de un nivel basal de deleciones permitirá el desarrollo de un método
diagnóstico que facilite la identificación enfermedades de origen mitocondrial con alta
confiabilidad.
Este trabajo representa una primera aproximación del método utilizado en ADN mitocondrial
de ratón en muestras de origen humano, por lo que se ha considerado dar un enfoque global
para la identificación de deleciones, considerando todos los tamaños, grados de
heteroplasmia y ubicación en el genoma mitocondrial. 
24
Debido a la naturaleza de este estudio se ha dejado de lado, por el momento, las
características particulares de las muestras como el tejido, haplogrupos y otras
características de origen. Estas consideraciones se hicieron con la intención de probar la
metodología para la obtención de la información relevante para el desarrollo de un método de
diagnóstico basado en NGS (Secuenciación de Nueva Generación). 
25
2.2 Hipótesis
El genoma mitocondrial de células humanas de individuos sanos contiene una alta diversidad
de deleciones de baja frecuencia.
2.3 Objetivos
2.3.1 Generales
Analizar la carga mutacional de deleciones en el genoma mitocondrial de células humanas 
de individuos sanos. 
2.3.2 Específicos 
 Desarrollar una técnica de aislamiento de ADN circular a partir de muestras de pulpa
de dientes deciduos humanos.
 Secuenciar masivamente el ADN circular.
 Analizar la diversidad y frecuencia de deleciones presentes en el ADN mitocondrial. 
26
3. Materiales y métodos 
3.1 Diseño experimental 
La estrategia experimental para la realización de este proyecto se resume en la Figura 6 e
incluye el procesamiento de muestras de células de pulpa dental obtenidas de dientes
deciduos de individuos sanos en edad escolar, la secuenciación masiva de los genomas
mitocondriales y el análisis bioinformático de las deleciones presentes.
27
Figura 6. Metodología para la determinación de la carga mutacional en células de
pulpa dental humana. Se llevó a cabo una extracción de mtADN para realizar
secuenciación masiva en la plataforma Illumina y determinar las mutaciones
prevalentes mediante un análisis bioinformático.
3.2 Muestras biológicas
28
Selección de los candidatos
Debido a que es el primer acercamiento experimental con este método en humanos, se
utilizó un tejido de fácil obtención. Se seleccionó la pulpa de dientes deciduos ya que su
obtención fue secundaria a procedimientos odontológicos previamente programados por el
cirujano dentista responsable y no implicó procedimientos adicionales a los necesarios para
el tratamiento planeado. 
Para la elección de los niños participantes en este protocolo de investigación se consideró
que sus condiciones de salud generales fueran aparentemente buenas, sin ningún
antecedente o diagnóstico conocido de enfermedad mitocondrial y que fueran pacientes
programados para extracción de dientes deciduos por el cirujano. Con estas consideraciones
se obtuvieron 3 muestras de pulpa dental provenientes de niños de edades entre 6 y 11
años, de nacionalidad mexicana y pertenecientes a una población urbana.
Consentimiento informado 
Debido a que las muestras de material biológico provienen de menores de edad, se solicitó a
los padres o tutores legales la lectura y firma del consentimiento informado donde se
especifican las intenciones y alcances del proyecto así como la descripción de los
procedimientos experimentales y el manejo de los datos personales con base a las leyes
aplicables. Este proyecto fue previamente sometido a evaluación por el Comité de Ética en
Investigación del Instituto de Neurobiología de la Universidad Nacional Autónoma de México
(Protocolo 44.H).
Obtención de la muestra
Las pulpas dentales se obtuvieron al momento de la extracción odontológica realizada bajo
condiciones de asepsia. Se recibió la pieza dental en PBS(AB) [Antibióticos [PBS 1X +
Penicilina/Estreptomicina 5% + Anfotericina 3% + Enrofloxacino 1X] y se pasó a medio de
aislamiento basal [DMEM F12 + Penicilina/Estreptomicina 5% + Anfotericina 3% +
Enrofloxacino 1X] en frío para su traslado. Se extrajo y se disoció la pulpa por succión
repetida con micropipeta seguida de ciclos de lavado con medio enriquecido de antibióticos
29
[Penicilina/Estreptomicina 2% + Anfotericina 0.2% + Enrofloxacino 1X] y centrifugado a 880
xg por 5 minutos].
Cultivo de células 
Las células de pulpa dental disociadas se sembraron en un pozo de una caja de cultivo de 96
pozos con Medio de crecimiento [DMEM F12 + SFB 20% + Ác. Ascórbico 0.1 mM +
Glutamina 2 mM + Penicilina/Estreptomicina 1% + Anfotericina 0.1% + Factor de crecimiento
fibroblástico 2.5 ng/mL] incubando a 37°C y 5% de CO2. Este cultivo que favorece el
crecimiento de fibroblastos se mantuvo por tres semanas con lo que las bacterias presentes
en la muestra se eliminaron. Los cultivos se extendieron hasta confluencia en 16 cajas de
100 mm por muestra. En esta etapa se generó un banco congelando 1 millón de células por
vial de congelación. Para el procesamiento de las muestras se realizó cultivo de 24 horas
partiendo de un vial de congelación, se resuspendieron las células por tratamiento con
trispsina y se obtuvo por centrifugación una pastilla de células de cada muestra.
Extracción y purificación del ADN Mitocondrial 
Para la obtención de ADN enriquecido en moléculas circulares a partir de células de pulpa
dental cultivadas se utilizó una adaptación del protocolo de lisis alcalina basado en el
“QIAprep Spin Miniprep Kit” de Qiagen (Cat. No. 27104, Hilden, Alemania). Se añadió SDS a
la solución P1, para iniciar la lisis desde el primer paso y facilitar la extracción del ADN, así
como dos lavados de 0.7 ml de buffer PE, centrifugando 10 segundos y 1 minuto,
respectivamente, para hacer un lavado más eficiente y no mermar el material con la primera
centrifugación. Los volúmenes y el resto de los pasos fueron los indicados por las
instrucciones proporcionadas por el fabricante.
Para eliminar remanentes de ADN lineal provenientes del genoma nuclear, se digirió la
solución de ADN con una exonucleasa dependiente de ATP (PlasmidSafe, Epicentre.
Madison, WI). Se llevó a cabo la digestión de todo el eluído de la columna de extracción en
su volumen total de 60 µL con 20 unidades de DNasa y una incubación a 37°C por 16 hrs.
Transcurrido ese tiempo de incubación se adicionó una segunda mezcla de reacción de 40
µL con 20 unidades de enzima y se incubó nuevamente a 37°C por 6 horas y finalmente se
30
inactivó la reacción incubando a 70°C por 30 minutos.
Posteriormente se precipitó el ADN con 0.1 volúmenes de acetato de sodio 3 M y 2.5
volúmenes de etanol absoluto para proseguir con el protocolo de amplificación.
Amplificación 
Para amplificar el ADN mitocondrial de las muestras y obtener cantidades suficientes para su
secuenciación, se utilizó el método de amplificación por desplazamiento múltiple usando una
polimerasa de alta fidelidad y oligonucleótidos aleatorios (Repli-G single cell, Cat. No.
150343, Qiagen, Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante, ya que es un
método que permite más uniformidad y menor frecuencia de errores que la amplificación por
otros métodos. 
3.3 Secuenciación masiva 
Secuenciación masiva 
Se secuenciaron tres muestras de mtADN con la plataforma Illumina NextSeq en modo de
lecturas pareadas de 150 nucleótidos porla Unidad de Servicios Genómicos del LANGEBIO
de CINVESTAV, Campus Irapuato. 
3.4 Análisis bioinformático 
Control de calidad de lecturas
La evaluación de la calidad de las lecturas se realizó con el paquete FastQC (High
Throughput Sequence QC Report, Version 0.11.3, Andrews, Lindenbaum, Howard, Ewels
2011-15) y posteriormente fueron filtradas para eliminar contaminación por adaptadores y
lecturas con bajo nivel de calidad en una escala PHRED33 con valor menor a 30 usando
Trimmomatic (GNU, Version 0.36, Bolger, Lohse & Usadel, 2014, -phred33
ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE-2.fa:2:30:10 CROP:150 HEADCROP:15 MINLEN:50 ). Luego
del control de calidad se removieron 15 nucleótidos de uno de los extremos de las lecturas
quedando lecturas de 135 nucleótidos para el análisis.
31
Mapeo de Secuencias 
Las lecturas se mapearon a la secuencia del mtADN contenida en la versión GRCh38 /hg38
(GCA_000001405.15. Dic 2013, NCBI genome / 51 Homo sapiens, Reference 38. Revised
Cambridge Sequence (rCRS). GenBank J01415.2 y RefSeq accession number
NC_012920.1., Haplogroup H2a2a), del genoma humano por medio del programa BLAT
(Standalone BLAT v. 36X2, UCSC, Genome Bioinformatics de Kent Informatics, Inc., 2002,
opciones de default), el cual nos permite identificar deleciones de distintos tamaños de forma
directa en los archivos PSL de salida.
Un archivo PSL contiene 21 campos con la siguiente información:
1. Mapeos
2. No mapeos
3. Mapeos repetidos
4. Número de Ns
5. Número de inserciones en lectura
6. Número de bases insertadas en lectura
7. Número de inserciones en referencia
8. Número de bases insertadas en referencia 
9. Cadena (+ ó -)
10. Nombre de lectura
11. Tamaño de lectura
12. Posición de inicio en lectura
13. Posición de fin en lectura
14. Nombre de referencia
15. Tamaño de referencia
16. Posición de inicio en referencia
17. Posición de fin en referencia
18. Número de bloques
19. Tamaño de bloques (separador: “,”)
20. Posición de inicio en lectura (separador: “,”)
21. Posición de inicio en referencia (separador: “,”)
Dada la naturaleza circular del genoma mitocondrial, el archivo fasta del genoma de
referencia fue duplicado en el mismo archivo para así permitir la detección de las deleciones
que incluyen el origen de la numeración de la secuencia del genoma. 
32
 
Minería y cribado de datos de mapeo (Ver sección VI. Anexo)
Para determinar la frecuencia y diversidad de las deleciones en el ADN mitocondrial de las
muestras de pulpa dental utilizamos comandos del sistema operativo Linux para el
procesamiento de archivos PSL resultado del mapeo. En primer lugar se concatenaron los
archivos conteniendo las lecturas pareadas (R1 y R2) de cada muestra con el comando cat
para luego filtrar las deleciones, usando awk, seleccionando aquéllas que cumplieran con los
siguientes criterios:
 Tener dos bloques, lo que equivale a una deleción por lectura.
 Con inicio antes de la coordenada 16 569 para evitar duplicaciones.
 Sin inserciones en la misma lectura.
 Que los bloques tuvieran al menos 15 nucleótidos de longitud para reducir la
ambigüedad en el mapeo.
 Con un mapeo de al menos 100 nucleótidos en la lectura.
A partir de los archivos con el total de las deleciones, se determinó el tamaño de cada
deleción y las frecuencias en cada muestra eliminando todas las deleciones con tamaño
superior a 8299 nucleótidos, con la finalidad de evitar ambigüedades. 
A modo de convención, consideramos las deleciones como eventos independientes y una
sola deleción por genoma. Para ello aplicamos una ecuación al cálculo de la frecuencia
acumulada de las deleciones: 
p n= p n-1+(q n-1)(f n)
donde p es la proporción acumulada de genomas mutados y q los genomas no mutados, así
que la suma es igual al total de genomas o la unidad, p+q=1; f es la frecuencia normalizada
de cada deleción individual. Por lo tanto, la frecuencia de cada evento de deleción se
considera sobre q que son el resto de los genomas que no contienen la deleción ni nunguna
33
de las deleciones anteriores. Entonces q va reduciéndose conforme se va incluyendo el
siguiente evento. Al contemplar el total de deleciones identificadas en la muestra, tenemos el
porcentaje total de genomas mutados (p) y no mutados (q) para cada una de las muestras
considerando eventos independientes y una sola deleción por genoma. 
Para calcular la profundidad de las lecturas en cada muestra se consideraron la longitud de
las lecturas (135 nucleótidos), el número de lecturas por muestra y la longitud del genoma
mitocondrial humano (16 569 nucleótidos). Con estos datos se normalizaron las frecuencias
de las deleciones por millón de genomas.
Para el análisis de repetidos directos en las deleciones de cada muestra se creó una
población aleatoria con el mismo número de deleciones que la muestra de pulpa con mayor
número de datos. Pares de números en el rango de 1 a 16569 se crearon al azar con el
software de R ( GNU Project for Statistical Computing, 3.2.5 (2016-04-14), R Development
Core Team, 2014) utilizando la función sample para crear los puntos de corte de deleciones
virtuales en los extremos 5' y 3'. Tanto los archivos de las deleciones de la población
aleatoria como los provenientes de pulpa dental se corrieron con el mismo script con el cual
se obtuvieron las secuencias de los 20 nucleótidos previos a los puntos de corte de cada
deleción con el comando getfasta de bedtools (GNU v2.17.0). Se consideran únicamente las
deleciones mayores a 15 nucleótidos.
Las deleciones comunes fueron identificadas con la herramienta de Venny 2.1.0 - BioinfoGP
– CSIC. Las 28 deleciones fueron separadas de acuerdo a su tamaño y se relacionaron los
puntos de corte de cada deleción con las coordenadas que delimitan los genes
mitocondriales usando la base de datos de UCSC Genome Browser y el genoma de
referencia GRCh38/hg38.
4. Resultados
4.1 Procesamiento de las muestras
Las tres muestras de pulpa dental se procesaron para la obtención de ADN circular total en el
cual se incluye al ADN mitocondrial. Obtuvimos concentraciones entre 580 y 824 ng/µL de
34
ADN cuantificados por fluorometría lo que significó una masa total de entre 40 y 58 µg por
muestra (Tabla 1) . 
Con la intención de corroborar el aislamiento y amplificación del ADN mitocondrial a partir de
nuestro protocolo, realizamos la amplificación por PCR de un fragmento que corresponde a
las posiciones 14,445 a 14,700 del genoma mitocondrial, generando un producto amplificado
de 255 pares de bases. En las tres muestras se logró la amplificación del fragmento
esperado confirmando la presencia de ADN mitocondrial. Adicionalmente se corrieron las
muestras de ADN circular amplificado en un gel de agarosa para descartar que el ADN
estuviera degradado y en el cual se puede observar que son fragmentos mayores a 12 Kb
confirmando así su integridad (Figura 7).
Tabla 1. Concentración y masa total de ADN circular en cada una de las muestras
de pulpa dental (P1-P3).
35
Figura 7. ADN mitocondrial en células de pulpa dental. A. Validación de la
presencia de mtADN. Resultado de la PCR que valida la presencia de ADN
mitocondrial en cada una de las muestras, amplificando un fragmento mitocondrial
de 255pb en cada una. B. Integridad del ADN amplificado de las muestras de
pulpa dental en agarosa al 1%.
4.2 Análisis bioinformático de deleciones
Las lecturas secuenciadas luego del control de calidad fueron mapeadas contra el genoma
de referencia. En un primer análisis de las deleciones destacan dos deleciones comunes y
frecuentes en las tres muestras que son 3105-3107 y 3107-3109. Sin embargo, en el genoma
de referencia mitocondrial usado en el mapeo de las secuencias la posición 3107
corresponde a una N [...CTAC(N)TTCAA...]. Luego de larevisión y re-análisis de la secuencia
36
de referencia de Cambridge del genoma mitocondrial humano en 1999, se determinó que
correspondía a un error de secuenciación. Por convención se decidió introducir una N la
posición 3107 para mantener la numeración histórica del genoma (Andrews et. al., 1999). 
El análisis de las lecturas de las muestras de este estudio que mapean a este sitio del
genoma reveló que carecen de un nucleótido en esa posición y que la secuencia más
abundante en las lecturas secuenciadas es [...CTACTTCAA..]. Por ello realizamos
nuevamente el mapeo eliminando del genoma de referencia la N en la posición citada con lo
cual las deleciones aparentes en esa región desaparecen en las tres muestras, lo cuál
significa que no eran reales y por lo tanto se descartaron. Para el resto del análisis se
mantuvo la numeración de acuerdo al genoma de referencia.
Como resultado de la secuenciación y posterior al análisis de calidad con FastQC y
Trimmomatic obtuvimos entre 42 y 61 millones de lecturas por muestra (53.4 millones ± 10
millones), luego del mapeo el número de lecturas correspondientes al genoma mitocondrial
humano fueron entre 184 000 y 670 000 (354 mil ± 272 mil). Las profundidades de lectura
equivalentes al número de genomas secuenciados fueron entre 1500 y 5500 (2885 ± 2219).
Los datos normalizados a mil genomas muestran que el número de deleciones por muestra
es similar entre las tres muestras ya que el número total de deleciones se encuentra entre
496 y 586 (533 ± 47) y las deleciones únicas entre 434 y 514 (474 ± 40) lo cual sugiere que
existe una gran diversidad de deleciones en los genomas mitocondriales ya que las
deleciones únicas sin considerar la frecuencia representan una buena proporción del total de
eventos (Tabla 2, Figura 8).
Tabla 2. Resultados numéricos de la secuenciación y mapeo de las muestras de
pulpa dental.
37
Figura 8. Dispersión entre las muestras de las lecturas secuenciadas por Illumina
Nextseq y lecturas mapeadas en el genoma mitocondrial de referencia para
humano. La barra horizontal representa la mediana de la distribución de los
valores de las tres muestras. 
Los puntos de corte de las deleciones se distribuyen a lo largo del genoma mitocondrial y es
posible identificar coordenadas recurrentes en 5' como las posiciones 521, 5750, 2461, 6696
y en 3' las coordenadas 524, 5752, 6698, 2463 las cuales flanquean algunas de las
deleciones más comunes en las muestras (Figura 9). 
38
39
Figura 9. Puntos de corte de las deleciones identificadas en el genoma
mitocondrial humano. En el eje X se representan las 16.5 Kb del genoma
mitocondrial y en el eje Y representa las frecuencias de deleciones por cada diez
mil genomas de los puntos de ruptura en escala logarítmica base 10. En azul se
identifican los puntos de ruptura en 5' y en naranja los de 3', los picos observados
representan sitios de ruptura comunes.
 4.2.1 Deleciones recurrentes
Las deleciones más abundantes en los tres individuos fueron de un solo nucleótido en las
posiciones 521-524, 5750-5752 y 2462-2464. La primera tiene 1.13%, 2.58% de
40
heteroplasmia en P1, P2 respectivamente y no se encontró en P3 mientras que la segunda
tiene 0.53%, 0.29% y 0.24% y la tercera 0.27%, 0.35% y 0.17% en las tres muestras de
pulpa dental. Estas deleciones afectan la región del d-loop, una región intergénica entre el
ARN de transferencia para Asparagina y el de Cisteína y el gen del ARN ribosomal 16S.
Dado que los grados de heteroplasmia son bajos, es de esperarse que su presencia no
afecte la funcionalidad mitocondrial (Figura 10).
 
41
Figura 10. Deleciones de mayor abundancia en el genoma mitocondrial humano.
En rojo se observan las deleciones más abundantes de nuestro análisis. Las
letras interiores representan los aminoácidos a los que corresponden los ARN de
transferencia y por fuera se encuentran las coordenadas de los genes codificados
en el genoma mitocondrial humano de acuerdo al genoma de referencia (NCBI
Reference Sequence: NC_012920.1). 
4.2.2 Tamaños de deleciones 
Las deleciones fueron clasificadas por tamaño y normalizadas para ser comparables entre sí.
42
Se identificaron deleciones de entre 1 y 8295 pares de bases con medianas de 1350, 1597 y
1252 pares de bases respectivamente en cada muestra. Observamos que la distribución de
las deleciones por tamaño se mantiene entre las muestras, siendo las más abundantes las
de un sólo nucleótido y en conjunto las de más de cinco mil pares de bases (Figura 11). 
43
Figura 11. Distribución de las deleciones por tamaños en cada una de las tres
muestras de pulpa dental. En el eje de las X, se representa el porcentaje de las
frecuencias relativas acumuladas de las deleciones clasificadas por tamaño,
considerando los eventos como independientes. 
La frecuencia total acumulada de las deleciones, con nuestras consideraciones no excede al
total de genomas secuenciados en las tres muestras, lo que nos sugiere que no todas las
44
moléculas de ADN mitocondrial tienen deleciones y no es posible saber si hay más de una
deleción por genoma. Si consideramos el cociente del total de deleciones entre el total de
genomas secuenciados. Por muestra tenemos una relación de 0.52, 0.59 y 0.5 deleciones
por genoma mitocondrial. 
Al asumir la independencia de cada evento de deleción, consideramos la frecuencia como
una proporción de los genomas que no presentan ninguna de las deleciones anteriores. En
cada caso la suma de los genomas con y sin deleciones es el 100%. Por lo que la frecuencia
acumulada representa los genomas con deleciones y corresponde a 40.44%, 44.35% y
39.11% respectivamente en los tres individuos.
4.2.3 Distribución de las deleciones 
Con el propósito de conocer la distribución de las deleciones a lo largo del genoma
mitocondrial, se graficaron las deleciones encontradas de acuerdo a los puntos de ruptura de
inicio y fin en el genoma mitocondrial para detectar si hay regiones con mayor recurrencia de
deleciones y observamos que existe una gran diversidad de eventos ya que las deleciones
ocurren en cualquier punto del genoma mitocondrial aunque existen zonas con mayor
recurrencia. (Figura 12). 
Se observa una región aproximadamente entre las posiciones 5 000 y 8 000 con abundantes
deleciones de tamaño superior a 2 Kb y en las deleciones mayores a 5 Kb parecen tener una
mayor recurrencia en el segundo tercio del genoma mitocondrial. Con respecto a la región
del d-loop, observamos la presencia de deleciones de un solo nucleótido, pero considerando
tamaños mayores se observa un mínimo de deleciones, lo cual sugiere una mínima
recurrencia de eventos. 
45
Figura 12. Distribución de las deleciones en el genoma mitocondrial humano por
tamaño. Cada círculo representa las 16.5 Kb del genoma mitocondrial humano.
Inicia de la circunferencia al centro a manera de espiral, y va trazando cada
deleción como arcos que van del punto de ruptura inicial al final. Los radios (en el
caso de las deleciones de menor tamaño) y los arreglos radiales que asemejan
rebanadas de pastel (en deleciones de mayor tamaño) representan regiones con
recurrencia de eventos, por el contrario las regiones blancas representan la
ausencia de eventos en nuestras muestras en esa región. Los números debajo de
cada círculo representan los eventos graficados en cada caso.
46
4.2.4 Secuencias repetidas directas 
Con el fin de determinar si las deleciones mayores a 15 nucleótidos se asociaban con
secuencias repetidas directas analizamos la identidad de las secuencias adyacentes a cada
deleción. Las secuencias repetidas directas son secuencias de nucleótidos idénticas en las
regiones previas a los puntos de ruptura 5' y 3' de la deleción y según la literatura pueden
favorecer eventosde recombinación.
Al comparar las secuencias repetidas directas en las deleciones provenientes de nuestras
muestras con los de una población de deleciones provenientes de una simulación aleatoria,
observamos hay una menor probabilidad de encontrar las secuencias repetidas directas
conforme aumenta el número de nucleótidos idénticos y por lo tanto longitudes mayores
presentan frecuencias menores. Esta tendencia se observa tanto en las muestras como en la
deleciones simuladas. Alrededor del 71.7% de las deleciones no tienen secuencias repetidas
directas, el 26.4% tienen microhomologías de entre 1 y 3 nucleótidos y sólo alrededor del
1.9% de las deleciones de tamaño mayor a 15 nucleótidos tiene un repetido directo de al
menos 4 nucleótidos y hasta 8 nucleótidos de longitud, que fue el mayor identificado. Sin
embargo las frecuencias de deleciones con secuencias repetidas en sus puntos de corte
mayores a tres nucleótidos son ligeramente mayores que las esperadas de manera aleatoria
(Figura 13-A).
Además no se observa alguna prevalencia por región del genoma de acuerdo a los repetidos
directos (Figura 13-B), lo cual correlaciona con lo descrito previamente en ratón. La mayoría
de los repetidos directos y los de mayor longitud fueron identificados en deleciones de mayor
tamaño (Figura 13-C). 
47
Figura 13. Repetidos directos de las deleciones en cada muestra de pulpa dental.
A. Frecuencia relativa de repetidos directos en las deleciones de las muestras de
pulpa dental comparada con la de una muestra de deleciones aleatorias. B.
Distribución de los repetidos directos de las deleciones en el genoma
mitocondrial. El círculo representa las 16.5 Kb del genoma mitocondrial humano.
Se graficó una muestra de 100 deleciones por muestra y cada una se gráfica
como una cuerda del punto de corte 3' al 5'. El color representa la longitud de los
repetidos directos en cada muestra y el grosor de la línea la frecuencia de esa
deleción. C. Repetidos directos identificados en los grupos de deleciones
clasificadas por tamaño. En deleciones de tamaños entre 15 y 100 nucleótidos de
longitud no encontramos deleciones con repetidos directos de 4 nucleótidos o
48
4.2.5 Deleciones comunes 
Luego del filtrado de las deleciones propias de cada muestra de acuerdo a sus puntos de
ruptura, se identificaron las deleciones únicas compartidas entre las muestras sin considerar
su frecuencia, sólo como eventos únicos. Del total de las deleciones identificadas, las
comunes en las tres muestras representan el 0.7% (25 deleciones) y tienen porcentajes de
heteroplasmia entre 0.02% y 0.53% en las muestras de pulpa dental (Figura 14-A). Sin
embargo, la profundidad varía entre las tres muestras y afecta la proporción de deleciones ya
que a mayor profundidad aumenta la probabilidad de identificar un mayor número de
deleciones por muestra, por lo que la proporción entre las muestras debe tomarse con
reservas. Por esta razón tomamos muestras aleatorias de P2 y P3 equivalentes al número de
eventos de P1. Así es posible observar la proporción de deleciones compartidas entre las
muestras sin el efecto de la profundidad. Con esta consideración, la mayor proporción de
deleciones compartidas se observa entre P1 y P2 (33 deleciones), luego entre P2 y P3 (24
deleciones) y finalmente entre P1 y P3 (20 deleciones) (Figura 14-B). 
De las 25 deleciones identificadas originalmente como comunes, el 84.0% (21 deleciones)
son de 1 solo nucleótido y de los genes afectados por estas deleciones, el gen que codifica
para un polipéptido de la NADH Deshidrogenasa, ND2, fue el más afectado seguido de el
gen para el polipéptido del citocromo C oxidasa, CO1 (Figura 14-B,C). De las cuatro
deleciones que no son de un solo nucleótido, sólo una está asociada a un repetido directo de
4 nucleótidos.
49
Figura 14. Deleciones comunes en las muestras de pulpa dental. A. Deleciones
compartidas entre los tres individuos de estudio y su variabilidad, cada círculo
representa el universo de genomas mitocondriales de cada muestra de pulpa
dental (P1, P2, P3); los números son las deleciones propias de cada muestra y en
las intersecciones las deleciones comunes con su porcentaje en relación al
universo de deleciones identificados en la muestra. B. Deleciones compartidas
entre los tres individuos comparando el mismo número de deleciones en cada
muestra: el total de 716 de P1 y las mismas cantidades de P2 y P3 seleccionadas
de manera aleatoria del total de cada una. C. Las 28 deleciones comunes se
observan en la tabla clasificadas con base a su tamaño D. La gráfica muestra los
genes afectados por las deleciones comunes y su frecuencia general.
50
5. Discusión
Este estudio es un trabajo inicial en el que se llevó a cabo el análisis de la carga de
deleciones partiendo de datos de secuenciación masiva con poca profundidad. La
información obtenida nos da una idea de carga mutacional de deleciones en el genoma
mitocondrial humano en individuos sanos. Además, los métodos desarrollados nos permitirán
un estudio más detallado que pueda confirmar nuestros resultados con una mayor certeza
estadística. 
El genoma mitocondrial de individuos sanos contiene una alta abundancia de
deleciones de baja frecuencias
Hay estudios en humano de distintos grupos de edad, condiciones de salud y diferentes
tejidos en los cuales se han identificado variantes en el genoma mitocondrial que sugieren
que existe una carga mutacional basal. De las mutaciones identificadas la mayoría se
encuentra en grados bajos de heteroplasmia ( 0.2% al 2%) y un mínimo número de variantes
tienen hasta un 20% de heteroplasmia (Payne et al. 2013; Greaves et al. 2014). 
 
En resultados previos de nuestro laboratorio se identificó una gran diversidad de deleciones
en distintos estadios de la vida del ratón, la mayoría de ellas con frecuencias bajas. Se
estima que las deleciones afectan alrededor del 10% de los genomas mitocondriales de
ratón, lo cual es menor al promedio estimado en nuestro estudio de 41.3% de genomas
portadores de una deleción, asumiendo independencia de los eventos y una sola deleción
por genoma. Sin embargo, existen limitaciones en nuestro método para saber si hay más de
una deleción por genoma debido a que el ADN mitocondrial se fragmenta como paso previo a
la secuenciación y se hacen genotecas de los fragmentos, en este caso de 135 nucleótidos.
Debido a lo anterior no es posible saber qué lecturas corresponden a una misma molécula de
ADN mitocondrial. 
51
Nuestros resultados señalan que también existe una alta diversidad y baja frecuencia
individual de deleciones y si consideramos la suma de todos los eventos podemos decir que
la carga mutacional es alta, aún en condiciones de salud.
Las deleciones se distribuyen en todo el genoma mitocondrial.
Las deleciones específicas con mayor frecuencia fueron 521-524, 5750-5752 y 2462-2464;
cuyas coordenadas corresponden respectivamente al d-loop, una región entre el ARN de
transferencia para asparagina y el de cisteína y al gen de ARN ribosomal 16S. Estas
deleciones tienen valores de heteroplasmia de entre 0.13% y 1.17%, lo cual contrasta con
otros resultados donde describen mutaciones en el ADN mitocondrial de células provenientes
de individuos sanos con porcentajes de heteroplasmia de hasta 97% en distintos genes
mitocondriales tanto ARN ribosomal, ARN de transferencia, y polipéptidos, destacando
deleciones en el d-loop (Kang et al. 2016).
Cabe mencionar que ninguna de las deleciones más abundantes descritas en otros estudios
en humano, ya sean en condiciones de salud o como deleciones patológicas las cuales se
han asociado con alguna enfermedad fue identificada en las genotecas procedentes de
nuestras muestras (Solano et al. 2001; DiMauro & Schon 2001; Kang et al.2016).
En estudios previos de nuestro laboratorio en ratón identificamos deleciones distribuidas en
todo el genoma mitocondrial. Sin embargo existen regiones discretas donde ocurren con
mayor frecuencia lo cual fue similar con nuestros resultados (Ayala-Sumuano. Resultados
preliminares). 
En un estudio previo se analizan deleciones como una compilación de resultados de distintos
artículos con datos de secuenciación del ADN mitocondrial humano en condiciones
patológicas y de salud (Damas et al. 2014). Al analizar los puntos de ruptura en 5' y 3', en
otros estudios encontraron que se encuentran distribuidos en el genoma. Sin embargo hay
una prevalencia en 5' en la región entre las coordenadas 6,000 y 10,000, iniciando en las
secuencias del ARN de serina 1 y los genes CO2 y ATP8, mientras que para 3' la mayor
52
proporción se encuentra entre los nucleótidos 13,000 y 16,000 aproximadamente, en los
genes ND5, CYTB y más marcadamente en el d-loop (Damas et al. 2014). Al realizar el
análisis de la posición de los puntos de ruptura de nuestras deleciones parecen tener una
distribución más uniforme a lo largo del genoma mitocondrial. 
 Otros resultados de este mismo estudio en humanos revelan que el 98.8% de los genomas
mitocondriales conservan la región del d-loop (Damas et al. 2014), o sea que no es común
encontrar deleciones en esta región. En nuestro estudio observamos que la región
circundante al origen, posiblemente en el d-loop, parece tener un mínimo de deleciones,
sobre todo de gran tamaño. Sin embargo, se identificaron deleciones pequeñas e incluso el
evento con mayor grado de heteroplasmia se encuentra en esta región (521-524). La baja
incidencia de deleciones mayores en esta región no necesariamente significa que no
ocurran. Es posible que las deleciones en el d-loop afecten severamente el genoma
mitocondrial ya que en esta región se encuentra el origen de replicación OH de la cadena
pesada y promotores de la transcripción. Las deleciones que afectan el origen de replicación
OL de la cadena ligera también se consideran como mutaciones de alta severidad. Si un
genoma deja de ser funcional ya no se replica y la célula lo elimina por lo que sería difícil
identificar genomas con esta región deletada al momento del muestreo. En el caso de las
regiones con alta incidencia de deleciones, éstas pueden seguir siendo funcionales gracias a
que se pueden complementar con otros genomas. 
 
El genoma mitocondrial contiene deleciones de distinto tamaño y las más abundantes
son las de un nucleótido
Las deleciones identificadas en el ADN mitocondrial de células provenientes de sujetos sanos
varían en tamaño. Sin embargo las de mayor abundancia son las de un nucleótido. Estos
resultados concuerdan con los descritos en el ADN mitocondrial de ratón en distintos
estadios en estudios previos de nuestro laboratorio (Ayala et al. Resultados preliminares).
Las deleciones identificadas en nuestras muestras van de 1 a 8295 pares de bases con una
mediana de 1350 pares de bases. La diversidad en el tamaño de las deleciones en el
53
genoma mitocondrial fueron descritas previamente en humano al identificarse en tejidos
sanos deleciones de tamaño entre 3 y 15,628 pares de bases de longitud con una media de
tamaño de 7,471 pares de bases (Damas et al. 2014). En otros estudios mencionan
deleciones de distintos tamaños bajo otras condiciones y en otras células como
espermatozoides (Colagar & Karimi 2014). 
Las deleciones van desde cambios en un sólo nucleótido hasta deleciones de 16 Kb, lo cual
sugiere la posibilidad de circularización de los fragmentos que son producto de una deleción.
Por ello en este estudio se consideraron sólo las deleciones menores a 8299 pares de bases,
la mitad del genoma. Con esto evitamos la duplicación de eventos, ya que no es posible
saber si estamos considerando tanto el fragmento genómico deletado y circularizado como el
genoma del cuál se desprendió el fragmento como dos eventos independientes cuando en
realidad podrían ser producto del mismo. 
La mayoría de las deleciones no están asociadas a secuencias repetidas directas.
Se ha descrito que las secuencias repetidas directas están asociados a deleciones en el
genoma mitocondrial ya que favorecen eventos de recombinación. Algunos estudios en
humano, tanto en condiciones patológicas como en individuos sanos el 3.97% de las
deleciones está asociada a secuencias idénticas de más de 10 nucleótidos y 16.5% tienen
secuencias repetidas directas de más de 4 nucleótidos (Damas et al. 2014). Esto difiere de
nuestros resultados en los que observamos que sólo el 1.9% de las deleciones mayores a 15
nucleótidos tienen secuencias idénticas de más de 4 nucleótidos. Las diferencias entre
nuestros resultados y los obtenidos en otros estudios se relaciona directamente con nuestro
método de muestreo. Este método nos permite observar un panorama más amplio e
identificar deleciones de distinto tamaño en cualquier región del genoma mitocondrial con
gran precisión. La metodología usada en otros estudios se limita a deleciones específicas
cuya incidencia está relacionada patologías mitocondriales. 
54
A pesar de que hay una baja proporción de deleciones asociadas a secuencias repetidas
directas, éstas ocurren con una frecuencia un poco mayor a la esperada de manera aleatoria
en nuestros datos, así como en otros estudios en humano (Damas et al. 2014; Lakshmanan
et al. 2012). Esto sugiere que las secuencias repetidas directas no se encuentran únicamente
por probabilidad en las deleciones sino que su presencia tiene un origen biológico. Nuestros
datos sugieren que la mayoría de las deleciones no se asocian a eventos de recombinación
favorecidos por secuencias homólogas y su origen podría ser a través de otros mecanismos. 
Lakshmanan, Damas y Colagar describen repetidos directos de 13 nucleótidos de longitud en
humano. Nosotros detectamos secuencias de hasta 8 nucleótidos en nuestras muestras pero
no puede descartarse que existan secuencias idénticas de mayor tamaño debido a la baja
profundidad de nuestro estudio (Lakshmanan et al. 2012; Damas et al. 2014; Colagar &
Karimi 2014). 
Los resultados previos de nuestro laboratorio en ratón son similares a lo observado en
humano ya que la mayoría de las deleciones no están asociadas a repetidos directos y éstos
se observan preferentemente en deleciones de varias kilobases. La ocurrencia de los
eventos de deleción en ratón no está asociada a la longitud de los repetidos directos en las
deleciones. No obstante, en ambas especies, el empleo del mismo método reveló que la
diferencia entre la presencia de repetidos directos en las muestras comparadas con los datos
aleatorios es mayor en ratón que en humano, sobre todo en longitudes mayores a 10
nucleótidos. En ratón se detectaron repetidos directos de 15 nucleótidos mientras que el más
largo en humano fue de 8 nucleótidos de longitud. Sin embargo, estas diferencias pueden
deberse a que el tamaño de las muestras de ratón es mayor al de las de humano. Entre
mayor es la muestra mayor es el número de eventos analizados y aumenta la probabilidad de
detectar eventos que ocurren más esporádicamente (Ayala, J. Resultados preliminares).
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Al analizar las deleciones en el ADN mitocondrial de individuos sanos encontramos que hay
una alta carga mutacional. Esto constituye un hallazgo relevante que sugiere que todo
individuo tiene una carga de deleciones en el ADN mitocondrial que no causa
disfuncionalidad mitocondrial. 
Las deleciones identificadas se encuentran en bajas frecuencias y es probable que sean
transmitidas por línea materna dada la recurrencia de algunas deleciones en diferentes
individuos. Esto es relevante ya que esta alta diversidad de deleciones presentes