Analisis-comparativo-de-los-metodos-para-la-deteccion-de-clenbuterol-ensayo-inmunoenzimatico-ELISA-y-cromatografa-de-lquidos-de-alta-resolucion-HPLC-con-detector-de-fluorescencia

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
DE MÉXICO 
 
 
MAESTRIA EN CIENCIAS DE LA PRODUCCIÓN 
Y DE LA SALUD ANIMAL 
 
 
 
 
 
ANÁLISIS COMPARATIVO DE LOS MÉTODOS 
PARA LA DETECCIÓN DE CLENBUTEROL, ENSAYO 
INMUNOENZIMÁTICO (ELISA) Y CROMATOGRAFÍA 
DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) CON 
DETECTOR DE FLUORESCENCIA 
 
 
T E S I S 
PARA OBTENER EL GRADO DE 
MAESTRO EN CIENCIAS 
P R E S E N T A: 
ADRIANA AYALA FLORES 
 
TUTOR: 
DR. RENÉ ROSILES MARTINEZ 
 
COMITÉ TUTORAL: 
DRA. MARÍA DE LA SALUD RUBIO LOZANO 
M. EN C. FRANCISCA AIDA ITURBE CHIÑAS 
 
 
 
MÉXICO D. F. 2010 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
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fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
Dedicatoria. 
 
A mi mamá y mi hermana que siempre han estado a mi lado apoyándome en 
todo lo que hago. 
 
A mi mejor y más querida amiga Larissa que siempre ha estado a mi lado en las 
buenas y en las malas. 
 
A mí querida amiga Getza por su inigualable amistad y apoyo incondicional. 
 
Al Lic. Héctor Rodríguez Licea que en paz descanse, por haberme bridando la 
oportunidad y la confianza permitiéndome escalar un peldaño más en mi vida 
profesional para llegara a ser la mejor. 
 
A mis ex compañeros de la ANETIF el Dr. Jaramillo, Enrique, Coco y Oscar que 
siempre estuvieron pendientes de mi con gran cariño. 
 
A ti mi Amor, que has sabido alentarme en los momentos más difíciles, con 
paciencia, con el gran amor que siempre me das y por la infinita confianza que 
has depositado en mí. 
 
A todas las personas que en su momento me poyaron y ayudaron a salir 
adelante en los momentos críticos. 
 
A Dios por haberme permitido culminar esta etapa profesional de mi vida. 
 
Gracias. 
 
 
Agradecimientos. 
 
Al Dr. Juan Gay Gutiérrez director general del Centro Nacional de Servicios de 
Constatación en Salud Animal (CENAPA). 
 
Al personal del laboratorio de residuos tóxicos a Cesar Linares y al químico 
Francisco Javier Ontiveros por su enseñanza y colaboración en el desarrollo de 
la técnica de ELISA para la detección de clenbuterol en músculo e hígado de 
bovino. 
 
Al personal del laboratorio de Toxicología por su apoyo, comprensión y ayuda en 
la evaluación y desarrollo de la técnica de HPLC/F y en la validación de la 
técnica de HPLC/UV para la detección y confirmación de clenbuterol en músculo 
e hígado de bovino. 
 
Al municipio de Tulancingo, Hidalgo, por su apoyo financiero para la realización 
de este trabajo. 
 
Al Dr. René Rosiles Martínez, quién aportó gran parte del conocimiento para la 
elaboración de este trabajo. 
 
 
 
Índice. 
Pag. 
 
1. Introducción.…………………………………………………………………………..1 
2. Antecedentes………………………………………………………………………….3 
2.1 Uso de aditivos en alimentación animal…………………………………………..4 
2.2 Promotores de crecimiento………………………………………………………....6 
2.3 ¿Qué es el clenbuterol?....................................................................................8 
2.4 Mecanismo de acción de los agonistas -AR…………………..……………….11 
2.5 Propiedades físicas…………………………………………………………..……13 
2.6 Inocuidad y calidad. ……………………………………………………………….13 
2.7 Dosis. ………………………………………………………………………………..15 
2.8 Uso en animales…………………………………………………………………....17 
2.9 Marco legal nacional…………………………………………………………..…...18 
2.10 Marco legal internacional…………………………………………………………24 
2.11 Métodos de detección. …………………………………………………………..25 
3. Hipótesis………………………………………………………………………………34 
4. Objetivos.……………………………………………………………………………..35 
5. Material y métodos………………………………………………………..…………36 
5.1 Identificación de clenbuterol por medio de la prueba de ELISA……………….37 
5.2 Análisis del clenbuterol por cromatografía de líquidos con fluorescencia 
(HPLC/F ………………………………………………………………...……….……….41 
5.3 Detección de clenbuterol por HPLC/UV……………………………………..…..43 
5.4 Validación del método HPLC/UV……………………………..…………………..45 
6. Resultados……………………………………………………….………………….…48 
6.1 Resultados para ELISA……………………………………………………………..48 
6.2 Resultados de los ensayos para el análisis de clenbuterol por HPLC 
y detector de Fluorescencia……………………………………………………………51 
 
6.3 Resultados de la validación del método cromatografía de líquidos y 
detector de luz ultravioleta HPLC/UV…………………………………………………53 
6.4 Resultados para técnica de HPLC/UV…………………………………….…….57 
7. Discusión…………………………………………………………………………..…60 
8. Conclusión……………………………………………………………………………66 
9. Referencias. ………………………………………………………………………….67 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Lista de figuras. 
 
Figura 1. Principales estados productores de carne de bovino (2008)…….....2 
Figura 2. Serie histórica de la producción de carne de bovino 1998-2008…...2 
Figura 3. Estructura general de las fenetanolaminas…………………………10 
Figura 4. Estructura del clenbuterol……………………………………………..10 
Figura 5. Molécula de clenbuterol……………………………………………….10 
Figura 6. Mecanismo de acción de los beta-agonistas………………………..12 
Figura 7. Excrecion del clenbuterol en bovino…………………………………18 
Figura 8. Principales estados que han presentado casos de intoxicación 
por consumo de carne contaminada con clenbuterol 2002-2006…………...19 
Figura 9. Fórmula estructural del Ortoftaldialdehido…………………………..31 
Figura 10. Detector de florescencia……………………………………………..32 
Figura 11. Kit Ridascreen Clenbuterol Fast ® (Bio-pharm)…………………...40 
Figura 12. Sistema de Cromatografía Liquida de Alta Resolución………….42 
Figura 13. Procedimiento de extracción para la determinación de 
Clenbuterol por HPLC/Uv………………………………………………………...45 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Lista de cuadros. 
Pag. 
Cuadro 1. Concentración de clenbuterol en muestras de hígado (H) 
Distrito Federal, Toluca, Querétaro, Tulancingo. Analizadas por la 
técnica de ELISA………………………………………………………………………48 
 
Cuadro 2. Concentración de clenbuterol en muestras de músculo (b) 
de bovino. Distrito Federal y Tulancingo. Analizadas por la técnica de ELISA…50 
 
Cuadro 3. Índices de la regresión lineal en la linealidad del método analítico 
para la identificación del clenbuterol por HPLC/UV/HCl…………………………..55 
 
Cuadro 4. Índices de la regresión lineal en la linealidad del método analítico 
para la identificación del clenbuterol por HPLC/UV/Fase móvil…………………..56 
 
Cuadro 5. Índices de regresión lineal para realizar el estimado de la 
concentración de clenbuterol en las muestras de campo…………………………58 
 
 
Resumen 
 
El clenbuterol es un β - agonista administrado actualmente como promotor de 
crecimiento en forma ilegal al ganado. El objetivo de este trabajo fue analizar 
muestras de hígado y músculo de bovino por las técnicas de ELISA y 
cromatografía de líquidos de alta resolución para la identificación de 
clenbuterol. Se evaluó la técnica de cromatografía de líquidos de alta 
resolución con detector de fluorescencia y se validó la técnica de cromatografía 
de líquidos alta resolución con detector luz ultravioleta. La recolección de las 
muestras se realizó al azar, 80 de hígado y 80 de músculo de bovino. Las 
muestras fueron analizadas por la técnica de ELISA; se evaluó la técnica de 
HPLC/F y se llevó a cabo la validación e implementación del método HPLC/UV, 
tomando en cuenta los parámetros de desempeño: linealidad, especificidad, 
repetibilidad, límitemínimo de detección y límite mínimo de cuantificación. Se 
calculó el riesgo de exposición por tamaño de ración consumida. Los 
resultados obtenidos fueron 66 muestras positivas (41.25%) con un promedio 
de 7,480ppt en hígado y de 3,412ppt en músculo. Para la técnica HPLC/F, no 
se observaron señales asociadas con la concentración de clenbuterol. Los 
resultados para HPLC/UV fueron 8.4 µg/kg de clenbuterol, usando 
concentraciones de 27.2 a 6.8ng en 30µl, con un CV de 0.66% y un TR de 2.3 
min. La concentración mínima detectable se fue de 6.8 ng. Los resultados de 
este estudio se encuentran por encima del límite establecido como máximo. Se 
llevó a cabo la confirmación y documentación de los resultados, estableciendo 
que los análisis aplicados son confiables, adecuados para la finalidad que han 
sido empleados. La técnica ELISA, es un método rápido, sensible y fiable para 
detectar clenbuterol, efectiva para su utilización como método de screening. El 
método de HPLC/UV validado es un método confirmativo. 
 
 
 
 
 
 
Abstract. 
  
Clenbuterol is a β - agonist currently administered illegally as a growth promoter 
in cattle. The aim of this study was to analyze liver and muscle samples from 
bovine for the identification of clenbuterol by ELISA techniques and high 
resolution liquid chromatography. The high-performance liquid chromatography 
technique with a fluorescence detector (HPLC/F) was evaluated and the liquid 
chromatography technique with an ultraviolet light detector (HPLC/UV) was 
validated. The collection of samples was randomly; 80 of liver and 80 of muscle, 
all from cattle. The samples were analyzed by ELISA, the HPLC/F technique 
was evaluated and the implementation and validation of the HPLC/UV method 
was carried out, taking into account the performance parameters: linearity, 
specificity, repeatability, minimum limit of detection and minimum limit of 
quantification. It was calculated the risk of exposure by the size of the serving 
consumed portion. The results were 66 samples positive (41.25%) with an 
average of 7,480 ppt in liver and 3,412 ppt in muscle. In the HPLC/F technique, 
there were no associated signals with the clenbuterol concentration. The results 
for HPLC/UV were 8.4 μg/kg of clenbuterol, using concentrations from 27.2 to 
6.8ng in 30μl, with a VC of 0.66% and a RT of 2.3 min. The minimum detectable 
concentration was 6.8 ng. The results of this study are above the allowed 
maximum limit. The confirmation and documentation of the results has been 
done, proving that the applied tests are reliable and adequate for the purpose 
that they have been used in the past. The ELISA technique is a rapid, sensitive 
and reliable method for detecting clenbuterol; effective as a screening method. 
The validated HPLC/UV method is a confirmatory method. 
 
  
Keywords: clenbuterol, validation, ELISA, HPLC/F, HPCL/UV.   
 
 
 
1 
 
1. Introducción 
 
Los alimentos de origen animal son un ingrediente indispensable en la 
alimentación del ser humano, ya que aportan y proveen grandes cantidades de 
nutrientes necesarios para que un individuo pueda desarrollarse y mantenerse en 
homeostasis1. 
 
Los diferentes tipos de carne son básicas para la alimentación del humano; en 
México se consumen principalmente la carne de res o bovino, carne de porcino y 
carne de ave, así como la carne de ovino, caprino, caballo y conejo en menor 
cantidad. 
 
La carne de res (bovino) es uno de los principales y más complejos alimentos de 
origen animal que se consumen en México, debido a sus altas propiedades 
nutricionales, su alto contenido en hierro, vitaminas y proteínas. Actualmente 
gracias al desarrollo tecnológico se puede encontrar en el mercado carne de res 
mexicana de buena calidad, inocua, libre de patógenos y sustancias que puedan 
perjudicar al hombre; además de una gran variedad de productos con valor 
agregado. 
 
El inventario de ganado bovino para 1998 era de 28,313,158 cabezas de ganado 
incrementándose en los últimos diez años a 29,420,059 cabezas en el año 2008, 
lo que representa un incremento del 3.91% en el número de animales en 
producción, según cifras reportadas por el Servicio de Información Agroalimentaria 
y Pesquera (SIAP) con respecto a esto, se observa que la producción de carne en 
canal bovina en México se ha visto favorecida en los últimos años, al pasar de una 
producción de 1, 379,768 toneladas en el año 1998 a 1, 667, 136 toneladas en el 
año 2008. Lo que representa un incremento del 20.83% en los últimos diez años2. 
Para el 2008 los principales estados productores de carne de bovino fueron 
Veracruz, Jalisco, Chiapas, Baja California, Sonora y Sinaloa (fig. 1). 
2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El incremento en la producción nacional de carne de bovino se debe 
principalmente a la implementación de medidas de manejo, inclusión de 
ingredientes de mejor calidad en la ración y uso de sustancias tendientes a 
incrementar la eficiencia en la conversión alimenticia, que por ende, repercuten en 
la ganancia diaria de peso; así como la utilización de otras herramientas como la 
manipulación genética, con la cual se ha logrado la intensificación de la 
producción animal y ha difundido el empleo de líneas genéticas de alto 
rendimiento; como razas especializadas en producción de carne como son Belgain 
74,443 78,042 78,447
84,793
101,466
180,292
242,543
1,667,136
SONORA
SINALOA
BAJA CALIFORNIA
CHIHUAHUA
CHIAPAS
JALISCO
VERACRUZ
RESTO DE LOS 
ESTADOS
Fig. 1 Principales estados productores de carne de bovino (2008).
3 
 
blue, Simmental, Charolais, Limousin, Hereford, Santa Gertrudis, entre otras, que 
son destinadas para la producción de carne principalmente, además de las 
recientes mejoras en cuanto a la tecnificación y manejo de hato. 
 
3 
 
 
 
 
2. Antecedentes 
 
En el transcurso de las décadas y de acuerdo con los patrones culturales de 
consumo de productos cárnicos, la carne de ganado bovino es uno de los 
ingredientes principales utilizados por el ama de casa para la elaboración de 
platillos tradicionales que se consumen en todo el país2. Aumentando así factores 
antes no considerados como son salud pública, inocuidad alimentaria y la 
economía, que han repercutido y transformado los hábitos en el consumidor, 
prefiriendo ahora la carne libre de grasa. 
 
Para los ganaderos producir carne a gran escala con el menor costo y tiempo 
posible es una necesidad; y por consecuencia con el paso del tiempo se han 
adoptado técnicas que permiten producir carne en canal en mayor cantidad por 
unidad de superficie y alimento utilizado. 
 
Es así, como la adición de ingredientes altamente energéticos en las dietas de los 
animales en la etapa de finalización ha significado un factor esencial para lograr 
mayores ganancias diarias de peso. 
 
La industria manufacturera de alimentos concentrados ha logrado la producción de 
alimentos eficientes que repercuten directamente y de manera positiva en la 
relación costo - beneficio de cada ciclo de producción. Que además de los 
beneficios antes mencionados, también brindan calidad e inocuidad al producto 
terminado necesaria para su venta, tomando en cuenta las preferencias del 
consumidor. 
 
 
4 
 
 
2.1 Uso de aditivos en alimentación animal. 
 
Otra forma de incrementar la eficiencia productiva es por medio de la 
administración en la dieta de sustancias denominadas “aditivos”, los cuales tienen 
diversas procedencias (probióticos, antibióticos, hormonales, enzimas y beta-
agonistas) mismos que producen un efecto positivo en la ganancia diaria de peso 
en los animales (Ganancia Diaria de Peso “GDP”)1,3. Estas características 
representan para el ganadero, más ingresos en cada ciclo de producción, siendo 
redituable su utilización. 
 
Se entiende por aditivo alimentario cualquier sustancia, que no se utilizao 
consume normalmente como alimento, ni tampoco se usa como ingrediente básico 
en alimentos, tenga o no valor nutritivo, y cuya adición intencionada al alimento es 
con fines tecnológicos (incluidos los organolépticos) en sus fases de fabricación, 
elaboración, preparación, tratamiento, envasado, empaquetado, transporte o 
almacenamiento, que resulte (directa o indirectamente) por sí o sus subproductos, 
en un componente del alimento o elemento que afecte a sus características 4, 5, 6. 
 
El uso de los aditivos en los alimentos debe basarse en el conocimiento de sus 
efectos y mecanismos de acción y en el empleo de las dosis adecuadas3. 
 
Para su utilización y la obtención de excelentes resultados, se requieren tres 
factores básicos, que deben prevalecer en un hato de producción pecuaria: 
1) Condiciones higiénicas sean adecuadas, para disminuir al máximo las 
afecciones por hongos y microorganismos patógenos. 
2) Edad y procedencia de los animales sean similares, para disminuir el estrés 
por jerarquía en el manejo de lotes, y la aparición de patologías sea nula o 
mínima de acuerdo a la zona climática. 
5 
 
3) Utilización de un alimento de buena calidad que cubra las necesidades 
nutricionales del ganado1,7. 
 
Actualmente los aditivos son utilizados de forma rutinaria en la alimentación 
animal, fundamentalmente para: mejorar el sabor, la presentación y conservación 
de las materias primas utilizadas en la dieta, así como prevenir ciertas 
enfermedades y aumentar la eficiencia productiva de los animales3. 
 
Se debe tener en cuenta que en la crianza de animales para la producción son 
factores importantes: el ritmo de crecimiento, la conversión alimenticia, la 
producción cárnica, la producción lechera, que pueden modificarse mediante el 
uso de alguna de estas sustancias en las diferentes etapas del ciclo de 
producción. El efecto de los aditivos en el animal se observa de forma individual, 
considerándose lo anterior como una ventaja, ya que el engordador tiene la 
libertad de elegir entre la amplia gama existente de aditivos en el mercado, ya sea 
el de su preferencia o el que dará resultados deseables para su producto 
terminado, considerando su costo y sus características8. 
 
La lista de aditivos es muy amplia y se incluyen varios componentes que son de 
diferente naturaleza química, catalogados en base a sus características, 
mecanismo de acción, así como potencial de uso en los animales, clasificándose 
en: conservadores (antioxidantes, inhibidores de hongos, preservadores); 
estimulantes del consumo (emulsionantes, saborizantes), modificadores de la 
fermentación ruminal utilizados en bovinos, ovinos y caprinos, como agentes para 
reducir la presencia de microorganismos perjudiciales para el animal (antibióticos 
selectivos, ionóforos) y los promotores del crecimiento (hormonas, probióticos, 
prebióticos, β agonistas-adrenérgicos de naturaleza sintética y enzimas)3, 9,10. 
 
 
 
6 
 
2.2 Promotores de crecimiento. 
 
Los promotores del crecimiento son aditivos que requieren mayor control en su 
utilización, ya que deben administrarse según indicaciones del fabricante y de 
acuerdo al tipo de sustancia utilizada, respetando los periodos de retiro antes del 
sacrificio 11,12. 
 
Lamentablemente se han registrado evidencias de prácticas inadecuadas, 
utilizados en forma indiscriminada sin respetar las dosis estipuladas y los tiempos 
de retiro antes del sacrificio, esto refleja un riesgo de salud pública, provoca ETA’s 
(enfermedades transmitidas por alimentos), que son enfermedades originadas por 
la ingestión de alimentos contaminados con microorganismos o sustancias tóxicas, 
y que representan actualmente uno de los riesgos sanitarios más frecuentes que 
enfrenta la población, se pueden presentar con padecimientos agudos o crónicos y 
de corta o larga duración. La exposición crónica se asocia principalmente a 
sustancias químicas como los aditivos que pueden dañar a mediano o largo plazo 
la salud del consumidor11. 
 
El grado de exposición de una población a los efectos adversos por el consumo 
de alimentos depende de la frecuencia con la que éstos se encuentren 
contaminados, y la magnitud del daño dependerá del grado de 
patogenicidad/toxicidad de las sustancias involucradas y de la susceptibilidad de 
las personas. 
 
Otro factor de importancia son los patrones de consumo de la población, los 
cuales están relacionados con las preferencias del consumidor, aspectos 
socioeconómicos, regionales y culturales, características étnicas, estacionalidad, 
diferencias de edad y de comportamiento. 
 
7 
 
En animales productores de carne se utilizan como aditivos las hormonas 
anabólicas (esteroides, andrógenos y estrógenos) que al ser administradas en los 
animales destinados para abasto, causan retención de nitrógeno corporal, debido 
a la interacción de estas sustancias con los receptores androgénicos, que 
provocan una reducción en la degradación de proteínas musculares y aumento de 
la síntesis proteica obteniendo como resultado una mejora en la conversión 
alimenticia; lo que se traduce en un aumento de peso diario 13. 
 
El estrógeno natural más activo es el estradiol, que modifica los patrones de 
crecimiento. A partir de 1930 se han producido otros estrógenos de naturaleza 
sintética en laboratorio; siendo uno de estos el dietilestilbestrol que adquirió gran 
relevancia por las consecuencias prácticas que se obtenían al utilizar esta 
hormona. Posteriormente se demostró que esta sustancia producía efectos 
carcinogénicos en animales de laboratorio; por tal motivo su uso se prohibió en 
México en el año de 1980 9,13. 
 
Otras sustancias utilizadas como promotores del crecimiento son los antibióticos, 
cuyo propósito es modificar la microflora del rumen. Los principales antibióticos 
aceptados para uso en animales de abasto son; avopracina, bambermicina, 
virgiamicina, monensina y lasalocida 3,9,13. Al igual que las hormonas se prohibió 
el uso de algunas sustancias como la tetraciclina, clortetraciclina, oxitetraciclina, 
lincomicina, penicilina, estreptomicina y tilosina, el primero de julio de 1976 y que 
fueron incluidas en una lista publicada de aditivos no autorizados en Francia 9,13. 
 
La familia de los aditivos utilizados en la alimentación animal para aumentar la 
ganancia diaria de peso individual del animal así como mejorar la presentación del 
producto final (canal), son los adrenérgicos β–agonistas14. 
Los β-agonistas son compuestos químicos del grupo de los beta-adrenérgicos, 
que confiere a cualquier producto, dilución o mezcla el carácter farmacéutico 
8 
 
específico de los mismos, con efectos de promoción de la masa muscular, 
reductor de la cantidad de grasa corporal y broncodilatador15. 
 
Los β-agonistas se han utilizado en medicina veterinaria para el tratamiento de 
afecciones respiratorias por su acción broncodilatadora en equinos y como 
tocolíticos en bovinos y ovinos en el proceso del parto tardío o en corrección de 
distocias; al mismo tiempo son considerados desde 1983 como “mejoradores de la 
calidad de la canal” por disminuir la cantidad de grasa en la misma. Las sustancias 
que componen esta familia son: Zilpaterol, Ractopamina, Cimalterol, Isoproterenol 
y Clenbuterol, este último se sitúa en el centro de diversas controversias, por su 
uso inadecuado, que ha ocasionado su prohibición en México, ya que el aumento 
en la demanda de carne magra se ha incrementado en los últimos años16,17. 
 
Debido al efecto anabolizante que ejerce el clenbuterol, se comenzó a utilizar en la 
alimentación del ganado bovino para obtener un aumento en la masa muscular en 
los animales 7, 16, 18. 
 
El uso de estas sustancias en la engorda de animales de abasto tuvo su inicio en 
el año 1970. En esta misma década el mal empleo de estos aditivos, produjeron 
las primeras intoxicaciones tanto en Estados Unidos comoen Europa. 
 
Al día de hoy estas sustancias anabólicas se siguen empleando como aditivos en 
la alimentación animal, para mejorar el rendimiento en canal de varias especies 
domésticas entre los que destacan el clenbuterol, zilpaterol y ractopamina. 
 
2.3 ¿Qué es el clenbuterol? 
 
Es una sustancia anabólica, ß-agonista, considerado como un potente 
broncodilatador, y agente lipolítico, glicolítico y glucogénico en muchas 
9 
 
especies7,19,20,21. Produce una distribución de los nutrientes hacia las vías 
metabólicas, aumentando la síntesis y deposito de proteínas (retención de 
nitrógeno) del animal y por consecuencia disminuyen la acumulación de materia 
grasa en los tejidos22, 23. 
Los efectos metabólicos de este compuesto, alteran la composición corporal de 
ganado destinado a la producción de carne durante su crecimiento, debido a que 
la energía ingerida altera metabólicamente diversas funciones, y por lo tanto a 
esto se le conoce como redistribución de la energía, ya que esta, se muestra 
disponible para la nueva formación de tejido (especialmente visible en los cuartos 
traseros de los animales) y en una disminución de la deposición de grasa corporal. 
Al mismo tiempo, provocan una relajación de los músculos lisos de los bronquios, 
vasos sanguíneos, vías genitourinarias y tracto gastrointestinal 7,24,25. 
 
La administración de clenbuterol a dosis diez veces mayor a la indicada como 
terapéutica, presenta una acción anabolizante y actúa como modulador del 
crecimiento en bovinos, ovinos y porcinos ya que ejerce su acción selectivamente 
sobre los receptores del subtipo β, localizados principalmente en el tejido adiposo 
y muscular, promoviendo el incremento del músculo esquelético y la disminución 
de la grasa corporal, observándose mayores rendimientos en la canal, lo cual 
favorece la síntesis de proteína y disminuye la grasa16,25,26. Administrado por 
periodos largos produce un crecimiento compensatorio27. 
 
Sin embargo el mejoramiento de la misma no es lineal a la dosis administrada, en 
cantidades mayores se afecta el bienestar animal causando aumento en la presión 
sanguínea, aumento arterial de oxigeno y glucosa además de taquicardia durante 
24 horas después de su administración 16,17,25. 
 
El Clenbuterol es un -adrenoceptor que tiene un potente efecto bronquiolítico, 
por acción preferencial en los  adrenoceptores en el músculo, que resulta en la 
10 
 
relajación del músculo liso bronquial y en un descenso en la resistencia del paso 
del aire. Así mismo, a través de uniones selectivas con los  adrenoreceptores de 
la membrana celular del músculo liso uterino, ocurre relajación del útero 
(tocólisis)7. 
 
El clorhidrato de clenbuterol es una arilámina de acción prolongada cuyo nombre 
químico es 4-amino-3,5 dicloro-α-terbutil-aminometil-bencil alcohol16. Es un 
simpaticomímetico sintético del grupo de las fenetanolaminas, la dosis terapéutica 
óptima para producir una notoria broncodilatación es de 0.8mcg/kg/dos veces al 
día/cinco días, en bovinos y equinos; estas sustancias que como grupo requieren 
la presencia de un anillo aromático, con un grupo hidroxilo en la posición  del 
grupo alifático para mostrar actividad16,17. Con excepción de la dobutamina, las 
catecolaminas naturales del organismo (epinefrina y norepinefrina) son muy 
similares a los agonistas (-AR). Sin embargo el clenbuterol como todos los 
agonistas -AR muestran importantes diferencias en las actividades intrínsecas, lo 
cual se debe a las características de los grupos sustituyentes7. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 3 Estructura general de las 
fenetanolaminas. 
Fig. 4 Estructura del clenbuterol. 
Fig. 5 Molécula de clenbuterol: 
Peso molecular: 277.19 g/mol 
Formula moleular:C12H18C12 N2O 
Nombre químico:4-amino 3,5 
dicloro-α-terbutil-aminometil-bencil 
alcohol. 
 
11 
 
2.4 Mecanismo de acción de los agonistas -AR. 
 
 
Este compuesto ejerce su efecto al activar a los receptores β-adrenérgicos 
específicamente del subtipo β de los tejidos adiposos17. 
 
En general su mecanismo de acción se lleva a cabo cuando se pone en contacto 
con el receptor específico formando un compuesto agonista-receptor, este llega 
hasta las células del músculo. Ya que es una molécula de tamaño muy grande 
esta no puede pasar por la membrana plasmática celular, así que necesita un 
receptor que responde a las señales externas y actúan mediante proteínas G y 
GTP (por medio de un transporte activo). Estas proteínas G están formadas por 
tres sub unidades (α,β,γ). En ausencia de hormonas la Gs se encuentra en forma 
de GDP inactiva. La unión del compuesto al receptor induce el intercambio de 
GTP (debido a que el clenbuterol funciona como una hormona anabólica dentro 
del cuerpo) y este complejo se une a la proteína Gs α, produciendo así la 
liberación de GDP y permitiendo la unión del GTP. Así la Gs α – GTP activa a la 
adenil-ciclasa, lo que altera la concentración de AMPc, el cual se sintetiza a partir 
de ATP por la enzima adenil-ciclasa y es continuamente degradado mediante la 
fosfodiesterasa de AMPc. 
 
El AMPc promueve la activación de lipasas en el adiposito para posteriormente 
liberar ácidos grasos a la sangre. A medida que se produce el AMPc, este se une 
a una subunidad reguladora inhibidora cinasa proteíca-A, que provoca la 
separación de la subunidad, dejando libre la subunidad catalítica de la proteína 
Cinasa-A, para fosforilar las proteínas efectoras, que utilizan el ATP como fuente 
de grupo fosfatos de energía. La fosforilación de estas proteínas efectoras, puede 
incrementar o inhibir su actividad y por lo tanto inician una respuesta celular. 
 
12 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Los ß-agonistas poseen efectos muy marcados sobre el metabolismo de proteínas 
y lípidos, que se traducen en una hipertrofia muscular. El mecanismo de la síntesis 
proteica, se inicia por activación de los aminoácidos con ATP y una enzima 
específica para cada aminoácido, separándose dos moléculas de ácido fosfórico. 
 
La segunda etapa del proceso incluye la transferencia del aminoácido, activado a 
una molécula de RNAt. Estas son pequeñas moléculas de ácido nucléico. La 
tercera etapa, incluye la transferencia de aminoácidos unidos a t-RNA de los 
ribosomas (lugar donde se lleva la síntesis de proteína dentro de la célula) del 
citoplasma celular, tanto las moléculas de RNAt como las de RNAm se unen a los 
ribosomas para lograr la síntesis de un polipéptido a partir de los aminoácidos 
transportados por el RNAt28,29. 
 
 
Fig. 6 Mecanismo de acción de los beta-agonistas 17. 
13 
 
 
2.5 Propiedades físicas 
 
El clenbuterol se puede encontrar en estado sólido y líquido. En sólido es un polvo 
incoloro, muy soluble en agua, metanol y etanol, ligeramente soluble en cloroformo 
o como sustancia líquida de color blanco amarillento, con un punto de fusión de 
174 ºC, soluble en agua, metanol y etanol y muy soluble en cloroformo. Es estable 
en agua caliente (100 ºC) y en aceite caliente (260 ºC), por lo que no se 
descompone con los procesos de ebullición, rostizado, freído ni en 
microondas30,31. 
 
2.6 Inocuidad y calidad. 
 
La calidad e inocuidad de los alimentos siempre ha sido un factor de preocupación 
permanente a nivel internacional; se pueden considerar varios aspectos como son: 
nutricional, residuos químicos, residuos físicos, microbiológicos (virus, bacterias 
hongos, parásitos)32. 
 
La utilización de clenbuterol durante la engorda del animal, ocasiona una 
disminución del 20 al 30 % de grasa en el ganado, así como un aumento de 
proteína del 13 % en la región del costillar, prevaleciendo dicho efecto si se 
administra por periodos largos (más de 30 días) y hasta el sacrificio. También se 
ha reportado que disminuye la calidad de la carne (terneza) 32,33. 
 
La calidad de la carne en canal, se ve afectada cuando a estase le ha 
administrado clenbuterol previo al sacrificio, ya que la proteína en músculo 
aumenta y la grasa disminuye, así aumenta el % de masa muscular entre el 6 y 
18% al mismo tiempo que promueve la disminución de grasa. 
 
14 
 
Antes del sacrificio la concentración de glucógeno disminuye esto a su vez limita la 
acidificación (pH de 0.3 a 0.4) de la carne postmortem, como resultado de las 
concentraciones de ácido láctico en el músculo y la baja concentración del 
pigmento hemo que produce el oscurecimiento de la carne, a lo que se le 
denomina carne DFD (oscura, firme y ceca)34,35. Debido a que aumenta la 
cantidad de agua en la canal de los animales tratados con clenbuterol asociada al 
aumento de proteínas, durante el almacenamiento de la canal se da una excesiva 
perdida de agua por goteo32, así la carne se deteriora más rápido debido a que el 
pH es mayor favoreciendo así a la contaminación microbiana afectando así la 
inocuidad del alimento. 
 
Durante el proceso de almacenamiento la carne que contiene residuos de beta 
agonistas, presenta un acortamiento de las fibras musculares por el frío, esto 
debido a la reducción de grasa en la canal, provocando que esta se enfríe más 
rápido durante el proceso de maduración y por consiguiente la carne se vuelve 
más dura32. 
 
Este endurecimiento de la carne se relaciona con el aumento en la cantidad de 
colágeno insoluble36 que aumenta la producción de tejido conectivo32. Se ha 
demostrado que los beta agonistas interfieren reduciendo las acciones del sistema 
enzimático de las calpaínas; estas son responsables de la proteólisis post mortem 
que resulta en el ablandamiento de la carne y el calcio, causa debilitamiento o 
degradación de los discos Z al activar las calpaínas37,38, así la proteólisis se ve 
disminuida debido a los bajos niveles de calcio existentes en el músculo post 
mortem14, 37,38. 
 
También se dan cambios en las miofibrillas musculares durante los procesos de 
maduración debido a las enzimas proteolíticas: los lisosomas contienen enzimas 
con gran actividad proteolítica como las catepsinas, que participan en el 
15 
 
ablandamiento de la carne; estas enzimas son activadas en el músculo 
postmortem al disminuir el pH14,32,37. 
 
Las catepsinas lisosomales tienen un efecto conjunto con las calpaínas del 
músculo, lo que se llama sistema calpaína/calpastatina, donde la calpastatina es 
un inhibidor de la capacidad proteolítica32. Durante la cocción la carne puede 
tardar más en cocerse, ya que requiere mayor temperatura debido a su elevado 
pH además de presentar una perdida excesiva de agua. 
 
La reducción de la grasa en la carne, conlleva a una disminución en el sabor. 
Ramos et al., (2002) menciona que probablemente también disminuya su 
digestibilidad y el valor nutricional. 
 
2.7 Dosis. 
 
En los humanos, la dosis terapéutica del clenbuterol necesaria para producir un 
efecto broncodilatador es de 10, 20 y hasta 40mg/adulto, con una vida media de 
34 horas, el efecto puede tener una duración de 8 a 12 horas tanto a nivel de vías 
aéreas centrales, así como periféricas de pequeño calibre. Su absorción por vía 
oral es rápida entre 15 y 45 minutos, alcanza niveles máximos en plasma 1 a 4 
horas después de ser administrado39, su eliminación se realiza en forma bifásica. 
La fase de eliminación corta (curva alfa) con vida media de una hora y la fase 
prolongada (curva beta) rebasa la fase corta con una vida media de 3 a 6 horas. 
La eliminación se realiza predominantemente por vía renal40. 
 
La Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) ha establecido límites máximos 
permisibles (LMP) en cuanto a la dosis terapéutica administrada al ganado bovino 
y al consumo por el humano de carne o hígado de bovino; estableciendo como 
dosis terapéutica de 0.8µg/kg de peso corporal del animal y un límite máximo de 
16 
 
residuos en músculo recomendado de 0.2µg/kg y 0.6µg/kg en hígado; no señala 
una cifra de ingesta diaria admisible41. Para calcular el límite máximo permisible, 
es necesario conocer la ingesta diaria admisible (Admisible Daily Intake ADI)7, 
utilizando como factor de ADI un total de 300 g de carne o hígado; el valor de la 
ADI seria de 0.04µg/kg/día42 equivalente a 2.4mg/día para una persona de 60kg. 
Por seguridad el valor de la ADI se reduce (10 veces) según lo determinado por 
Boenisch et al. (1993), quedando en 4.1 ng/kg/día, considerando a un humano con 
un peso de 60 kg43. 
 
En base a los LMR que han establecido diversas organizaciones a nivel mundial 
se puede decir que la ADI seria aproximadamente de 0.235µg, sobre una base de 
consumo diaria de 300g de carne y 100g de hígado7. 
 
La exposición de los humanos por consumo de carne o hígado contaminados con 
clenbuterol, cuando el período de retiro ante-mortem de este fármaco no ha sido 
suficiente para que los residuos desaparezcan totalmente los productos cárnicos 
en cuestión, ha dado lugar a diversos casos de intoxicaciones en diferentes 
países. 
 
Para evitar efectos colaterales en el consumidor se deben aplicar y respetar los 
tiempos de retiro ante-mortem, algunos autores recomiendan 4 semanas de retiro 
previo al sacrificio7,42 siempre y cuando las dosis administradas hayan sido las 
convencionales para mejorar el rendimiento de la canal, ya que en algunas 
ocasiones al tratar de obtener un rendimiento aún más elevado en la canal, los 
productores o engordadores administran de 5 y hasta 10 veces más la dosis 
promotora de crecimiento (0.8µg/kg) que se podría considerar como optima7. 
 
Algunos de los síntomas que se han reportado por intoxicación debido al consumo 
de productos cárnicos contaminados con clenbuterol son: dilatación de pupilas, 
17 
 
dolor de cabeza, palpitaciones, diarrea, tremores distales, disnea, nauseas y 
vomitos27,44,45,46,47,48. 
 
2.8 Uso en animales. 
 
Una vez administrado, dentro del organismo se deposita en varios órganos en 
diferente proporción, siendo la mayor concentración en riñón, ojo, hígado, pulmón, 
estos tejidos pueden ser un riesgo a la salud al ser consumidos, pues se 
encuentran dentro de la dieta del mexicano1. 
 
A pesar de su prohibición, su utilización ha ido incrementando en los últimos años, 
algunos ganaderos ocultan su uso cuidando los plazos de retiro antes de enviar a 
sus animales al sacrificio, ya que se almacena en retina, plasma, hígado, músculo, 
se excreta en orina; como caso particular cabe mencionar que en la retina no 
desaparece, permaneciendo durante toda la vida del animal y aún después de 
muerto, debido a que el compuesto se fija en la melanina presente en el humor 
acuoso y vítreo, así mismo los animales con piel oscura retienen mayores 
cantidades de residuos por la presencia de melanina en estos tejidos a diferencia 
de otros órganos7,24,32. 
 
Se piensa que su adhesión a la melanina contenida en ojo (retina y uvea) es 
debido a que los β-agonistas se unen a la rodopsina (fotopigmento llamado 
púrpura visual), que es el principal componente de los bastones y se encuentra 
presente en el cabello, en ambos sitios este fotopigmento es parecido a los β-
receptores33,35. 
 
Se estima que el tiempo de eliminación en el del Clenbuterol es de la siguiente 
manera27,49,50,51. 
 
 
18 
 
o Hígado – 56 días 
o Retina – no se elimina 
o Riñón – 17 a 21 días 
o Músculo – 6 a 7 días 
o Pelo – hasta que el animal mude el pelo 
o Orina – 17 a 21 días 
o Suero – 3 días 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El clenbuterol se utiliza generalmente en bovinos, con resultados satisfactorios al 
aumentar el volumen de masa corporal del animal, también se ha probado en 
cerdos, ovejas y aves de corral, pero se han obtenido resultados poco 
satisfactorios18,19. Sin embargo es un tanto peligroso para la salud pública y 
representa un acto ilegal 7. 
 
2.9 Marco legal nacional. 
 
A principios del año 2000 se presentaron casos de intoxicación en humanospor 
consumo de hígado y músculo de res contaminados con Clenbuterol en varios 
estados de la República Mexicana: Jalisco, 15 brotes con 65 casos; Distrito 
Federal, 4 brotes con 21 casos; Estado de México, 3 brotes con 17 casos; Hidalgo, 
Fig. 7 Excreción del clenbuterol en bovino 
 (4 a 15 días después de su aplicación). 
19 
 
1 brote con 6 casos; Guanajuato, 2 brotes con 9 brotes; Querétaro, 1 brote con 11 
casos; Michoacán, 1 brote con un caso1,52. 
 
A partir de este año se han registrado 192 brotes de intoxicaciones por el consumo 
de carne o hígado contaminado con clenbuterol 1,300 casos53, llegando a un total 
de 2,037 casos para el año 2007, según el Senado de la Republica marzo 200954. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ante esta problemática, la Secretaria de Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y 
Alimentación (SAGARPA) ha generado estrategias que pretenden evitar su 
distribución y utilización en la finalización de ganado destinado al abasto, para 
evitar estos riesgos. En marzo 1º de 2002 en el Diario Oficial de la Federación, se 
púbico la Norma Mexicana de Emergencia NOM-EM-015-ZOO-2002, misma que 
tiene el propósito de establecer las especificaciones técnicas para el control del 
uso de beta-agonistas en los animales. 
Fig. 8 Principales estados que han presentado casos 
de intoxicación por consumo de carne contaminada 
con clenbuterol 2002-2006. 
20 
 
 
El 25 de Marzo del 2002 se activó el Dispositivo Nacional de Emergencia de 
Sanidad Animal, el cual declara el interés zoosanitario y de inocuidad alimentaria 
por el uso indebido del producto denominado Clorhidrato de Clenbuterol, ambas 
regulaciones ejercidas a nivel nacional. 
 
Por su parte la Secretaría de Salud del Gobierno del Distrito Federal (SSA) en 
conjunto con la SAGARPA y la Comisión Federal para la Prevención de Riesgos 
Sanitarios (COFEPRIS), y la Procuraduría General de Justicia (PGJ) han 
implementado en corrales de engorda, rastros y lugares donde se expenden 
alimentos, programas a nivel nacional de control con muestreos de rutina. 
 
El Proyecto de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-065-ZOO-2003 define como 
β-agonista no autorizado al compuesto químico del grupo de los β-adrenérgicos 
que confiere a cualquier formulación, dilución o mezcla el carácter farmacéutico 
específico de los mismos, con efectos de promoción de la masa muscular, 
reductor de la cantidad de grasa corporal y broncodilatador, que se comercializa o 
administra a los animales sin contar con la autorización de la SAGARPA55. 
 
Cabe mencionar que dicha norma aún se encuentra en revisión por la Comisión 
Federal de Mejora Regulatoria (COFEMER) y por lo tanto aún no se está 
aplicando, ya que para que esto suceda cualquier norma debe ser publicada en el 
Diario Oficial de la Federación, aunque al parecer debido a los acontecimientos 
que presentan intoxicaciones en varias partes del país, registradas en los últimos 
meses, se le está dando prioridad a este asunto, además de los recientes trabajos 
realizados en la cámara de diputados sobre la prohibición de este fármaco. Como 
parte de las acciones conjuntas del gobierno mexicano para eliminar el uso de 
clenbuterol en nuestro país, a partir del año 2006 el Servicio Nacional de Sanidad, 
Inocuidad y Calidad Agroalimentaria (SENASICA) ha implementado un programa 
en varios estados de la República llamado “proveedor confiable”, dicho programa 
21 
 
consiste en un esquema de muestreo con cierta periodicidad en la unidad de 
producción mediante una técnica simple, para la detección de clenbuterol, 
otorgando al ganadero una certificación de ganado libre de clenbuterol y que 
además da un valor agregado al producto final. Dicho programa ha sido 
implementado de forma gradual en algunos estados de nuestro país. 
 
 
Es así como el uso ilegal del clenbuterol se ha convertido en un problema muy 
grave que presenta consecuencias nocivas en la salud humana, que año con año 
el Senado de la Republica trabaja con el objetivo de conseguir su prohibición, pero 
no solo del que lo usa también de quien lo fabrica. 
 
De acuerdo a lo estipulado en la Norma Emergente Oficial Mexicana NOM-EM-
015-ZOO-2002, “Especificaciones técnicas para el control del uso de beta 
agonistas en los animales”, se establecen los tipos de muestra y especificaciones 
para cada una de ellas, además de los métodos de identificación que son 
clasificados en métodos de detección y de cuantificación, y de los confirmativos, 
siendo las pruebas oficiales el ensayo inmunoenzimático y como prueba 
confirmativa la técnica cromatografía de líquidos de alta resolución y 
cromatografía de gases56. 
 
La Técnica Enzimática de inmunoensayo manejando el Kit Ridascreen Clenbuterol 
Fast ® (Bio-pharm), es establecida por la NOM-EM-015-ZOO-2002 para 
proporcionar una metodología rápida y específica para detección de Clenbuterol y 
otros β-agonistas en muestras de: orina, músculo, hígado, retina, pelo, alimento, 
leche56. 
 
En el punto (4.11.5) de la NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-061-ZOO-1999, 
Especificaciones zoosanitarias de los productos alimenticios para consumo 
animal, se menciona que el Clenbuterol es una sustancia de uso prohibido y suele 
utilizarse en forma clandestina para incrementar el volumen de la masa muscular 
en el ganado57. 
22 
 
 
En la NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-194-SSA1-2004, Productos y Servicios. 
“Especificaciones sanitarias en los establecimientos dedicados al sacrificio y 
faenado de animales para abasto, almacenamiento, transporte y expendio”. 
Especificaciones sanitarias de productos58. Que fue publicada en el Diario Oficial 
el 18 de septiembre de 2004 y entro en vigor en el año 2005. Describe que los 
productos de bovino deben estar libres de Clenbuterol, en el apartado de 
Contaminantes (6.10.5), así mismo en el punto 8.6 específica que el método de 
prueba empleado será el ensayo inmunoenzimático. 
 
La nueva Ley Federal de Sanidad Animal publicada en el Diario Oficial de la 
Federación el 23 de julio del 2007 en el Titulo Sexto “Del control de productos para 
uso o consumo animal, establecimientos y actividades y servicios”, capítulo 1 Del 
control de productos para uso o Consumo Animal, Articulo 19.- dice “que la 
Secretaria estará facultada para determinar, evaluar, dictaminar, registrar, 
autorizar o certificar”. Inciso IV. Los límites máximos de residuos permitidos de 
antibióticos, compuestos hormonales, químicos, tóxicos y otros equivalentes, en 
bienes de origen animal destinados para consumo humano, así como el tiempo de 
retiro de estas sustancias en animales vivos. Y en el artículo 92 menciona que “la 
Secretaría determinará aquellos productos para uso o consumo animal que por 
sus condiciones de inocuidad, eficacia y riesgo requieran de registro o 
autorización. Los requisitos y procedimientos para el otorgamiento y uso de los 
registros o autorizaciones a que se refiere este artículo, se establecerán en el 
Reglamento de esta Ley”59. 
 
En el Artículo 93 se establece que la Secretaría publicará en el Diario Oficial de la 
Federación el listado de las sustancias y productos cuyo uso o consumo en 
animales estén prohibidas. 
 
Por otra parte en el artículo 95 menciona que la Secretaría expedirá disposiciones 
de sanidad animal en las que determinará las características y especificaciones 
23 
 
zoosanitarias que deberán reunir: en el tiempo de retiro de antibióticos, 
antimicrobianos, compuestos hormonales, químicos, plaguicidas y otros en 
animales vivos, los límites máximos de residuos permitidos de los mismos en 
bienes de origen animal, así como el Programa de Monitoreo de Residuos 
Tóxicos59. 
 
Por último en el Artículo 174 establece que “Al que ordene el suministro o 
suministre a animales destinados al abasto alguna sustancia o alimento prohibidos 
a los que se hace alusión esta Ley y demás disposiciones de salud animal, será 
sancionado con tresa siete años de prisión y de diez mil a cincuenta mil días de 
salario mínimo de multa”59. 
 
En el proyecto revisado por las diferentes dependencias de gobierno y 
organizaciones privadas involucradas, para la elaboración del Reglamento de la 
Ley Federal de Sanidad Animal se hace solo mención a lo siguiente respecto al 
uso de sustancias prohibidas: 
 
Artículo 286. De conformidad con lo dispuesto en el Artículo 6º fracción LXVIII, de 
la Ley, el SENASICA expedirá criterios técnicos, que sirvan de base para la 
aplicación, registro, control, inspección y verificación de buenas prácticas 
pecuarias primaria, así como buenas prácticas de manufactura, Procedimientos 
Operacionales Estándar de Saneamiento o Análisis de Riesgos y Control de 
Puntos Críticos y otros que determine la Secretaría en los establecimientos TIF, 
además de: inciso VIII. Programas de muestro aleatorio de clenbuterol60. 
 
Y en el Artículo 230. Con fundamento en el artículo 93 de la Ley, el SENASICA 
publicará el listado de las sustancias o productos cuyo uso o consumo en 
animales esté prohibido o restringido60. 
Se clasificará un principio activo prohibido o restringido considerando lo siguiente: 
24 
 
I. Cuando posterior a su revisión, y de ser necesaria su constatación, se 
determine que representa un riesgo zoosanitario. 
II. Cuando no cuenten con el soporte técnico científico para establecer su 
tiempo de retiro bienes de origen animal. 
III. Aquellos ingredientes activos de nuevo desarrollo que no cuenten con el 
soporte técnico-científico que respalde su eficacia y seguridad para su 
empleo en animales. 
IV. Aquellos que por recomendación de Organismos Internacionales 
reconocidos hayan sido restringidos o prohibidos por razones 
zoosanitarias. 
V. Aquellos que por sus características de uso representen un riesgo 
importante a la salud animal y humana por el uso indebido, los desvíos 
de uso y el abuso de los mismos. 
 
2.10 Marco legal internacional. 
 
 
En 2008 la FAO llevó a cabo la revisión del Reglamento Internacional de Salud 
Animal del 2005, algunos de los temas revisados fueron el clenbuterol en carne de 
cerdo61. 
 
En el Código Federal de Regulación (CFR) del USDA, titulo 21 Food and Drugs. 
Capítulo 1: Food and Drugs Administration Departament of Health and human 
Services. Sección 530.41 Subchapeter E, Animal Drugs, Feeds and Related 
Products se establece que “queda prohibido el uso de fármacos y sustancias en 
alimentos para animales y animales destinados a la alimentación humana; el uso 
de clenbuterol, entre otros”62. 
 
25 
 
En la Unión Europea, el Reglamento (CEE) n° 2377/90 del Consejo de 26 de junio 
de 1990 establece un procedimiento comunitario de fijación de los límites máximos 
de residuos de medicamentos veterinarios en los alimentos de origen animal. Se 
establecen los límites máximos permisibles solo en el uso de clorhidrato de 
clenbuterol empleado de forma terapéutica, donde dice que para músculo el límite 
no debe sobrepasar 0.1 µg/Kg, para hígado y riñón 0.5 µg/Kg63. 
 
Por otro lado la Organización Mundial de la Salud indica un límite máximo 
permisible de no más de 220ppt en músculo de bovino64. 
 
La Comisión del Codex Alimentarius, Límites Máximos de Residuos para 
Medicamentos Veterinarios en los Alimentos, actualizado en la 29a Sesión de la 
Comisión del Codex Alimentarius Commission (Julio 2006) estableció los 
siguientes parámetros: Ingesta diaria admisible: 0-0.004 μg/kg de peso corporal, 
en músculo 0.2 LMR (μg/kg), en hígado 0.6 LMR (μg/kg) debido a la posibilidad 
del uso indebido de este medicamento, sólo se recomiendan los LMR cuando 
estén relacionados con un uso terapéutico aprobado en el ámbito nacional, tal 
como la tocólisis o como una terapia complementaria en las enfermedades 
respiratorias65. 
 
 
2.11 Métodos de detección. 
 
Para la identificación de residuos del Clenbuterol se han desarrollado métodos 
analíticos de cuantificación en base al estudio de muestras de tejidos: hígado, 
riñón, músculo, grasa, suero sanguíneo, orina, bilis, pelo, retina y alimentos para 
animales. Siendo hígado y ojo las muestras más significativas para la detección de 
concentraciones residuales de este fármaco. 
 
Los métodos analíticos resultan de gran importancia para monitorear abusos en el 
uso de clenbuterol27. 
26 
 
 
La Norma Emergente Oficial Mexicana NOM-EM-015-ZOO-2002, 
“Especificaciones técnicas para el control del uso de beta agonistas en los 
animales”, establece los tipos de muestra y especificaciones para cada una de 
ellas. 
 
En el Proyecto de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-065-ZOO-2003, 
“Especificaciones técnicas para la erradicación del uso de beta-agonistas no 
autorizados en los animales” los métodos de prueba son clasificados en métodos 
de detección y de cuantificación, además de los confirmativos, siendo las pruebas 
oficiales el ensayo inmunoenzimático, cromatografía de gases y cromatografía de 
líquidos de alta resolución como confirmatorias. 
 
La Técnica Enzimática de Inmunoensayo (ELISA) manejando el Kit Ridascreen 
Clenbuterol Fast ® (Bio-pharm), establecida en la NOM-EM-015-ZOO-2002. 
Proporciona una metodología rápida para detección de Clenbuterol y otros β-
agonistas en muestras de: orina, músculo, hígado, retina, pelo, alimento y leche. 
 
Es una técnica espectrofotométrica, basada en el principio de la reacción 
antígeno-anticuerpo47,70. Una vez realizada la extracción y purificación de la 
muestra, el conjugado clenbuterol-enzima compite por los sitios de unión de los 
anticuerpos adheridos en los pozos con el clenbuterol contenido en las muestras o 
estándares, haciendo evidente la reacción inmunológica por medio de la adición 
de un sustrato y una sustancia cromógena. La reacción enzima-sustrato-
cromógeno genera un producto de color azul. Esta reacción se detiene con el 
reactivo de paro de la reacción, el cual produce un cambio de la coloración azul a 
amarillo. La densidad óptica (DO) es inversamente proporcional a la concentración 
de clenbuterol47,70. 
 
27 
 
Esta técnica es una herramienta para el tamizado simultáneo de los β- agonistas 
con una molécula de terbutil o isopropil ligada al grupo amino. El grupo metílico 
más pequeño no presenta afinidad por la epinefrina, esto quiere decir que la 
prueba de ELISA no resultará positiva frente a los β-agonistas corporales como es 
la epinefrina1. Por otra parte el anticuerpo es suficientemente no específico para la 
detección de un gran número de compuestos sustituidos solo en el anillo 
aromático. Sin embargo el puente heterológico interno del antígeno y el marcador 
son necesarios para obtener una mayor sensibilidad25. 
 
La técnica de ELISA es una de las más rápidas y sensibles que permite el análisis 
de varias muestras en poco tiempo, una de sus ventajas es el bajo costo de los 
reactivos; es considerada como prueba tamiz. Sin embargo, una de sus 
principales limitantes es que la prueba forma reacciones-cruzadas con fármacos 
cuya estructura química es similar al Clenbuterol (como Bromuterol, Terbutalin, 
Salbutamol, Cimalterol, Adrenalina, entre otros). Por lo que se considera como un 
método muy sensible pero poco especifico. 
 
El método confirmatorio considerado como el más confiable actualmente para la 
detección de clenbuterol es la cromatografía liquida de alta resolución con detector 
de masas (HPLC/MS), este método se practica en los laboratorios de referencia 
autorizados en México para el análisis de clenbuterol, el procedimiento consiste en 
llevar a cabo una fragmentación de la partícula de clenbuterol induciendo la 
perdida de una molécula de agua en el grupo hidroxil bencílo y el cambio de un 
átomo de hidrógeno del grupo metílico de la amina secundaria protonada, seguido 
por la pérdida de la mitad alquena n-sustituida. Ocurriendo un golpe en la célula 
que provoca que esta sea reducida a pequeñísimas partículasen las distintas 
fases 27. 
 
 
 
28 
 
El detector de masas es capaz de mostrar partículas de tamaño mínimo por 
debajo de los 2 micrones, detectando y escaneando picos muy angostos de la 
molécula; así como de las fracciones de la molécula una vez que se ha hecho el 
bombardeo con los iones27. 
 
Esta técnica posee una alta resolución sensibilidad y especificidad ya que nos da 
el peso molecular de los compuestos. 
 
Sin embargo este método requiere de una extrema precisión del analista durante 
su procedimiento y más tiempo de dedicación. Debido a esto actualmente se han 
desarrollado técnicas alternativas donde se utiliza la HPLC y que además 
funcionan con detectores específicos, para el caso de este estudio se utilizaron el 
detector ultravioleta y de fluorescencia. 
 
La técnica de cromatografía de líquidos de alta resolución con detector ultravioleta 
(HPLC/UV), es un simple y rápido método de detección de clenbuterol, ya que no 
necesita la derivación y se puede llevar a cabo con una fase inversa rápida 69. La 
detección de β-agonistas por HPLC/UV habilita a los mediadores de los 
cromógenos en algunos compuestos que absorben altamente los rayos UV. En el 
caso del clenbuterol la cantidad mínima detectable por HPLC/UV es de hasta 
1ppm (mg/kg o µg/g) 69. 
 
Los detectores de absorbancia son dispositivos de doble haz, uno de los haces 
pasa por la cubeta de flujo y el otro a través de un filtro que reduce su intensidad; 
es un método que ya se ha empleado en la detección de clenbuterol y que posee 
una alta especificidad69. La mayoría de los compuestos orgánicos pueden ser 
analizados por los detectores de UV. 
 
Las bases fisicoquímicas para la prueba de identificación de clenbuterol con 
detector de luz ultravioleta (HPLC/UV) se establecen en los sistemas de extracción 
29 
 
con un buffer de fosfato de potasio al 0.02M y un disolvente orgánico polar. La 
limpieza de la muestra se lleva a cabo mediante un cartucho sep pak-C18 y es 
realizada con un pH controlado que oscila entre 2.8 a 9.3, la eliminación de la 
grasa se realiza con un disolvente orgánico (hexano) en pH alcalino, de igual 
forma que la limpieza final del extracto orgánico en pH controlado con éter 
terbutílico, finalmente la identificación de clenbuterol a una longitud de onda 
específica obtenida durante el escaneo de luz ultravioleta y la máxima absorción 
en 211 nm en longitud de onda. A estas condiciones fisicoquímicas se les conoce 
como sistemas de extracción, purificación y caracterización de máxima absorción 
en cierta longitud de onda especifica (211nm)73. El sistema de identificación del 
clenbuterol con luz ultravioleta tiene la característica de la selectividad en la 
separación en un sistema cromatografico de un líquido de mayor densidad (fase 
estacionaria) con un líquido de menor densidad fase móvil y la identificación en 
una longitud de onda específica obtenida durante el escaneo. Las condiciones 
facilidades de acoplamiento del tiempo de retención en los sistemas de integración 
de resultados, son un sistema de corroboración entre el estándar y la presencia 
del clenbuterol en el extracto de la muestra73. 
 
 
La cromatografía de líquidos de alta resolución con detector de fluorescencia 
(HPLC/F) es una técnica cromatografíca que consta de un sistema isocrático, este 
sistema permite que la composición de la fácil móvil permanezca constante a lo 
largo del proceso de elusión.74. La separación cromatografíca se lleva a cabo en 
una columna C18 (250 x 4.6 mm I. D.) y la derivación del compuesto fluorescente 
se realiza a nivel postcolumna donde se une el clenbuterol con el cromógeno 
(ortoftaldialdehido). Las condiciones fisicoquímicas se realizan mediante una 
bomba isocrática conectada con un conector en forma de T a la salida de la 
columna y antes del detector con un serpentín de 45cm. En este caso la detección 
se desarrolla con el detector de fluorescencia, explorando en el rango de 336-455 
30 
 
mm (excitación/emisión); conectado a una estación de integración, usando un 
sofware Total Chrom v. 5.1 y una impresora. 
 
Las condiciones cromatográficas de la fase móvil consisten en una mezcla de 
acetonitrilo en buffer de fosfato de potasio al 0.02 M (25:75, v/v) ajustado en un 
rango de pH de 4.8 a 8.0. Este será desgasificado con un sistema de helio en 
línea, utilizando un filtro de membrana de 0.044 µm. 
 
El desarrollo del método está basado en la reacción que se lleva a cabo con la 
derivación del grupo amino primario con el (OPA) en la presencia de 2-
mercaptoetanol (ME); obteniendo un producto fluorescente como se señaló antes. 
 
El 2-Mercaptoetanol es un líquido transparente, incoloro, con olor desagradable, 
su fórmula general HOCH2CH2SH. Es miscible en agua y casi todos los solventes 
orgánicos comunes. Se produce por la reacción del gas de sulfuro de hidrógeno y 
óxido de etileno. Desnaturaliza las proteínas debido a sus propiedades de 
reducción fuerte mediante la reducción de puentes di-sulfuro y las divisiones o 
estructura de la proteína cuaternaria. 
 
El ortoftaldialdehido (OPA) es un aldehído, su fórmula general es: R-CH=O donde 
el grupo R puede tener diversas características estructurales (saturado, 
insaturado, alifático cíclico, aromático) de estructura muy simple hasta muy 
compleja; su fórmula molecular es C8H6O2 con un peso molecular de 134.13. La 
Figura 11 muestra la fórmula estructural del Ortoftaldialdehido. 
 
El OPA tiene un grupo carbonilo C=O y son catalogados dentro de un grupo muy 
extenso denominado “Compuestos Carbonílicos”. Este grupo carbonilo presente 
en los aldehídos determina considerablemente sus propiedades físicas y químicas, 
el grupo carbonilo es también el responsable de la gran facilidad con que 
31 
 
intervienen en reacciones de adición nucleofilica ya que, debido a la gran atracción 
electrónica que ejerce el átomo de oxígeno, ocasiona una deficiencia electrónica 
en el átomo. 
 
El OPA fue originalmente introducido como un reactivo alternativo a la ninhidrina 
en la postcolumna de derivación y suministró un significante incremento en la 
sensibilidad. Los aminoácidos reaccionan con el OPA en presencia de un reductor 
fuerte, en condiciones alcalinas (pH 9 a 11), dando un compuesto fluorescente. 
La derivación de los grupos aminos es una de las áreas de aplicación analítica de 
reacciones. Estos derivados son utilizados en distintos métodos analíticos, 
aplicados a compuestos aminos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
El límite de detección para HPLC/flourescencia (HPLC/F) se establece de acuerdo 
a la cantidad mínima detectable mediante el método de adición47. 
Los métodos de derivación son empleados para reducir la polaridad del grupo 
amino y mejorar el comportamiento de los compuestos. 
Esta derivación del grupo amino es usada para activar la separación de estos 
compuestos, que de otra manera serian inseparables y confiere la detectabilidad 
por medio del análisis de HPLC 76. 
 
Fórmula 
molecular: C8H6O2 
Figura 9. Fórmula estructural del Ortoftaldialdehido. 
32 
 
La reacción de las aminas primarias no fluorescentes con los rendimientos 
derivados del reactivo intensamente fluorescente, son útiles en el análisis de 
HPLC. Así mismo ortoftaldialdehido (OPA), forma un derivado fluorescente con 
grupos amino primarios; se ha utilizado principalmente con derivación post 
columna en el análisis de los aminoácidos. El uso del ortoftaldialdehido tiene dos 
ventajas: una que es soluble en agua y que el resultado de la derivada 
potencialmente tiene mayor utilidad76. 
 
La identificación del clenbuterol se logra una vez que este, se convierte en un 
compuesto fluorescente debido a la unión con un fluorocromo. En el momento en 
que el clenbuterol sea identificado por el detector de fluorescencia, se incrementa 
la sensitividad hasta mil veces con un derivado específicomuy alto (hasta ppb 
ng/g o µg/kg). 
 
El desarrollo de este método en la identificación del clenbuterol, ha logrado 
incrementar la sensitividad hasta mil veces, así como su especificidad con la 
formación de un derivado fluorescente (ortoftadialdehido); esto hace que se 
convierta en una técnica competitiva, de carácter específico al compararse con 
algunas características no deseadas en la técnica de ELISA. Este último método 
goza de una alta sensitividad pero no de una alta especificidad por que se 
detectan al mismo tiempo varios beta agonistas (clenbuterol con sus 
congéneres)47. 
 
Este método se ha empleado para la identificación de varios compuestos, sin 
embargo en el caso de la detección de clenbuterol solo se tienen estudios 
preliminares. 
 
En el estudio realizado por Gallegos (2005) la implementación y validación de la 
técnica de HPLC/F se hizo por ensayos del desarrollo del complejo clenbuterol – 
fluorocromo, molécula química que absorbe la luz a una determinada longitud de 
33 
 
onda (ENERGIA) de excitación y emite a una longitud superior (MENOR 
ENERGIA) interacciona con la luz de excitación procedente del láser47.La cantidad 
de fluorescencia con la cual una célula se tiñe es proporcional a la cantidad de 
sitios de unión. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Algunas otras técnicas que se pueden utilizar como confirmatorias son el 
radioinmunoanálisis (RIA), cromatografía en capa fina (CCF), electroforesis 
capilar, cromatografía de líquidos de alta resolución (CLAR), cromatografía de 
gases (CG) y estas dos últimas con sus modalidades con acoplamiento a 
espectrometría de masas (MS)71,72. 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 10 Detector de florescencia. 
34 
 
 
3. Hipótesis: 
 
Los resultados del análisis para clenbuterol en muestras de hígado y músculo por 
la técnica de ELISA son similares a los obtenidos por cromatografía de líquidos. 
 
 
 
 
35 
 
4. Objetivos 
Objetivo general: 
El objetivo general de este trabajo fue analizar muestras de hígado y músculo de 
bovino por las técnicas de ELISA y cromatografía de líquidos de alta resolución 
para la identificación de clenbuterol. 
 
 
4.1 Objetivos particulares: 
 
 Evaluar la técnica de cromatografía de líquidos con detector de 
fluorescencia (CLAR/F) para la identificación de clenbuterol. 
 Validar la técnica de cromatografía de líquidos con detector de luz 
ultravioleta (CLAR/UV) para el análisis de clenbuterol. 
 Analizar comparativamente las concentraciones de clenbuterol obtenidas 
por la técnica de ELISA con las de HPLC/F/UV en muestras de hígado y 
músculo de bovino en expendios del centro de la Republica Mexicana. 
 Identificar el riesgo de exposición de las personas de acuerdo a la cantidad 
de muestras positivas y la concentración de clenbuterol en estas al 
considerar el consumo diario y la vida media del clenbuterol en el 
organismo. 
 
 
 
 
 
 
 
36 
 
 
5. Material y métodos 
 
Para el desarrollo del presente trabajo, el tamaño de muestra fue seleccionada al 
azar, es decir de acuerdo a la capacidad de análisis, la recolección de las 
muestras se realizó conforme a un programa de muestreo establecido para los 
expendios de carne de res existentes en cada una de las zonas, recolectando 80 
muestras de hígado y 80 de músculo de bovino. 
 
Los sitios de recolección se eligieron considerando los siguientes factores 
 
o Estados del centro del país 
o Mercados y expendios no formales 
o Antecedentes 
 
Procedimiento de recolección. 
 
o Se ubicaron los principales expendios (mercados o carnicerías) de cada 
ciudad o municipio. 
o Se identificaron a las carnicerías que expenden carne de res. 
o En cada expendio se compró una porción aproximada de 100g de carne de 
res (bisteck de bola) y/o hígado de bovino. 
o Al finalizar cada jornada de recolección las muestras fueron empacadas 
bolsas con cierre hermético y fueron identificadas con un número 
consecutivo distintivo entre las muestras de hígado y las muestras de 
carne. 
37 
 
o El manejo de las muestras se realizó de acuerdo a la NOM-110-SSA1-1994. 
Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis 
Microbiológico. 
o El transporte se realizó siempre conservando la cadena de frio, hasta llegar 
al laboratorio. 
o En el laboratorio todas las muestras fueron pesadas y registradas en una 
hoja de cálculo capturando los siguientes datos (Fecha de recolección, # de 
muestra, peso, costo y lugar de recolección). 
o Posteriormente fueron depositadas en el congelador y almacenadas a -
20ºC hasta el momento en que se realizó el análisis. 
 
Estas muestras fueron analizadas por la prueba de ELISA (método oficial) para 
clenbuterol, conforme al procedimiento que se emplea en el centro nacional de 
servicios en constatación en salud animal (CENAPA) en el laboratorio de residuos 
tóxicos; descrito en la referencia (ridascreen) a continuación: 
Esta técnica se basa en el principio de la reacción antígeno-anticuerpo47,70. 
 
 
5.1 Identificación de clenbuterol por medio de la prueba de ELISA 
 
Extracción de la muestra 
 
1.- En un tubo para 50ml se pesaron 5g de la muestra previamente molida y se 
homogenizó a 9500rpm con 25ml de ácido clorhídrico 50mM. 
2.- Se agitó por hora y media a temperatura ambiente a 200rpm. 
3.- De los 6g de homogenizado se transfirió (1 g de muestra) a un tubo para 
centrifuga. 
4.- Se centrifugó por 15 min a 3400rpm de 10 a 15 °C. 
5.- El sobrenadante se transfirió a otro tubo, añadiendo 300µl de NaOH 1M y se 
mezcló por 15 min. 
38 
 
6.- Se añadieron 4 ml de Fosfato de potasio monobásico 0.5M (500mM) pH 3.0, y 
se homogenizó brevemente y almacenándolo de 2 a 8˚C por hora y media. 
7.- Se volvió a centrifugar durante 15 min. a 3400rpm a 10-15˚C, para transferir el 
sobrenadante. 
8.- Por último se purificó la muestra por medio de una columna C18. 
 
 
Purificación por Columna C18. 
 
Consiste en la limpieza de la muestra a través de una columna C18 para quitar las 
impurezas de la muestra. 
1. Se enjuagó la columna con 2ml de solución de enjuague (buffer de KH2PO4) 
50mM pH 3. 
2. Se aplica el sobrenadante de la muestra. 
3. Se enjuaga la columna con 2ml de solución de enjuague. 
4. Se remueven los residuos del fluido mediante presión positiva y se secó la 
columna 2 min. con flujo de aire o nitrógeno. 
5. La muestra fue eluida lentamente con 1 ml de metanol (100%) a una 
velocidad de 15 gotas por minuto. 
6. Se evaporó completamente el solvente a 50 -60 C a una corriente débil de 
nitrógeno. 
7. El residuo seco se reconstruyó con 400µL de agua destilada y se 
emplearon 20µl por pozo para el análisis. 
 
Una vez realizada la extracción y purificación de la muestra, el conjugado 
clenbuterol-enzima compite por los sitios de unión de los anticuerpos adheridos en 
39 
 
los pozos con el clenbuterol contenido en las muestras o estándares, haciendo 
evidente la reacción inmunológica por medio de la adición de un sustrato y una 
sustancia cromógena70. 
 
Preparación de la microplaca. 
 
1. Se utilizó la bolsa de aluminio que contiene la placa, con el objetivo de que a esta 
este expuesta lo menos posible a la luz. 
2. Los pozos requeridos fueron retirados junto con el marco. 
3. El resto de los pozos se mantuvieron con el agente de secado, bien cerrado dentro 
de la bolsa de aluminio a una temperatura de 2 a 8ºC. 
4. Se insertan los pozos en la placa integrada en el kit. 
5. Se prepara el anticuerpo que viene presentado en forma concentrada. Debido a 
que la enzima conjugado tiene estabilidad reducida, solo se reconstruye la 
cantidad requerida. 
6. Antes de pipetear la enzima conjugada, se agitó cuidadosamente. Y se preparó 
una solución 01:11 en solución buffer. 
7. Se agregaron 100µl de solución de anticuerpos diluidos a cada pozo e incubaron 
por 15 minutos a temperatura ambiente. 
8. Agregar 100µl de solución de anticuerpo diluidoen cada pozo seleccionado e 
incubar por 15 minutos a temperatura ambiente. 
9. Se vació el líquido de los pozos invirtiendo la micro placa boca abajo y después 
enjuagar con agua destilada y vaciarla nuevamente. 
10. Repetir dos veces más el mismo procedimiento. 
11. Posteriormente se agregan 20µl del estándar o de la muestra preparada. 
40 
 
12. Se agregaron 100µl de la enzima conjugada diluida, en el fondo de cada pozo, 
incubando por 30 minutos a temperatura ambiente. 
13. De nuevo se enjuagaron los pozos invirtiéndolos como se realizo anteriormente. 
14. A cada pozo se le agregan 100µl de sustrato-cromógeno. Mezclar e incubar en la 
oscuridad por 15 minutos a temperatura ambiente. 
15. Después se agregan 100µl de la solución de paro a cada pozo. Se mezcla para 
después medir la absorbancia a 450nm contra un blanco de aire. Se debe leer 
dentro de un lapso no mayor a 60min. 
La reacción enzima-sustrato-cromógeno genera un producto de color azul. Esta 
reacción se detiene con el reactivo de paro de la reacción, el cual produce un 
cambio de la coloración azul a amarillo. La densidad óptica (DO) es inversamente 
proporcional a la concentración de clenbuterol47,70. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 11 Kit Ridascreen Clenbuterol Fast ® (Bio-pharm) 
41 
 
Una vez obtenidos los resultados por la técnica de ELISA se identificaron las 
muestras conforme al valor obtenido de positividad, a la ubicación geográfica que 
de recolección y tomando como referencia la incidencia en brotes y eventos 
relacionados con la intoxicación o administración de clenbuterol tanto en humanos 
como en animales. 
 
Posteriormente las muestras que resultaron positivas se identificaron en el 
laboratorio de toxicología de la facultad de medicina veterinaria y zootecnia de la 
UNAM, fueron separadas del resto y se prepararon para ser analizadas por la 
técnica de CLAR/F y la técnica de CLAR/UV. 
 
 
5.2 Análisis del clenbuterol por cromatografía de líquidos con fluorescencia 
(HPLC/F) 
 
Análisis de clenbuterol derivado con ortoptaldialdehido y mercapto-etanol 
(OPA/ME) pre-columna e identificación por HPLC y detector de fluorescencia 
 
El sistema cromatográfico (fig. 15) utilizado en este estudio consta de un reodhyne 
(sistema de válvulas para conectar el asa de la muestra con la columna de 
separación), una columna de separación con un liquido C18 adsorbido en 
partículas de 4 micras de diámetro, una bomba binaria modelo serie 200 equipado 
con un automuestreador, un detector de luz ultravioleta serie 200, conectado a 
una estación de integración de señales interface serie 900 PNelson y un software 
Total Chrom v. 5.1 e impresora. 
 
 
 
42 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Para la búsqueda de las condiciones óptimas76 de reacción entre el clenbuterol y 
el fluorocromo los ensayos realizados se basaron en la reacción entre el radical 
amino del clenbuterol y el OPA/ME (fluorocromo), en condiciones diferenciales tres 
pH: 6, 7 y 8. Estos ensayos se implementaron antes de la inyección en el 
cromatográfo (pre-columna). Por medio de esta reacción se buscó el desarrollo de 
un compuesto fluorescente que pudiera ser identificado con el detector de 
fluorescencia en el HPLC. Las longitudes de onda de emisión y excitación fueron 
de 336/455 nm consideradas en el desarrollo de la identificación de los 
aminoácidos derivados con el OPA/ME. 
 
Esta derivación de los aminoácidos (radicales amino) a compuestos fluorescentes 
es el principio básico para la identificación de la mayoría de los aminoácidos; dicha 
reacción se utilizó como base para la posible formación de un compuesto 
fluorescente a partir del OPA/ME que se adhiere al grupo amino del clenbuterol. 
Los posibles compuestos derivados de esta reacción se midieron en una columna 
amino que soportó los cambios de pH relativamente extremos de 4 a 8. 
 
Fig. 12 Sistema de Cromatografía Liquida de Alta 
Resolución. 
43 
 
Los ensayos con este método se realizaron considerando temperatura ambiente 
del laboratorio, los recipientes de cristal y material utilizados y aplicación de 
volúmenes de los reactivos con pipetas graduadas; antes de la inyección en la 
columna con el estándar de clenbuterol en tres pH distintos 6 dentro del rango 
acido, 7 en el rango neutro y 8 en el rango alcalino; usando tres concentraciones 
para la curva del estándar partiendo de la concentración mínima detectable 
esperada con una progresión geométrica que fue de 15, 30 y 60 ng/30µl, estas 
concentraciones fueron elegidas para obtener una respuesta lineal cercana a 
0.999. Los pH de incubación se ajustaron a los señalados con acidificación o 
alcalinización del incubado. 
 
Se inyectó en el rheodyne 30 µl de la mezcla suspendida y 1ml/minuto de la fase 
móvil a una presión de 2,000 libras. 
 
 
5.3 Detección de clenbuterol por HPLC/UV 
 
1. Extracción de la muestra. 
La extracción y desengrasado de las muestras de hígado y músculo para el 
análisis del clenbuterol por cromatografía de líquidos y detector de luz ultravioleta 
se realizó conforme al método explicado en un experimento realizado por 
González et al., (1996). 
 
A un gramo de muestra se le adicionaron 10 ml de buffer de fosfato llevándola a 
un pH de 2.8, esta se sonicó durante 10 minutos y posteriormente se centrifugó a 
15,000 g a una temperatura de 8 ºC durante 10 minutos. 
A continuación se separó el sobrenadante; y se ajusto a un pH de 9 con solución 
NaOH 2 mol. 
 
44 
 
La limpieza de la muestra (fig.13) se llevó a cabo en un sistema de separación 
líquido/sólido (cartucho), por medio de una columna sep PAK C-18 de 300mg, 
previamente activada con 5 ml de agua y 5 ml de metanol. En un sistema de 
vacío la muestra se hizo pasar por este cartucho para que ahí se atrapara el 
clenbuterol. 
 
El clenbuterol se eluyó con 3 ml de metanol. Este eluato fue evaporado a 35ºC 
con un flujo de nitrógeno, hasta llegar al estado de sequedad, el residuo se 
disolvió en 2ml de 0.01mol de acido clorhídrico. 
 
El desengrasado se practicó por la adición de 2 ml de n-hexano, el mezclado se 
realizó en un vortex y el centrifugado a 1000 g/3 minutos; una vez realizada esta 
parte del método, se desechó la fase orgánica y se agregaron de nuevo 2ml de n-
hexano. Se alcalinizó la fase acuosa con 100 µl de NaOH 2 mol. Después de esto 
se añadieron 2ml de éter terbutil-metil y se centrífugo por tres minutos. La fase 
orgánica se transfirió a otro tubo y la extracción con el éter metil-terbutilo se 
repitió. En residuo después de la evaporación en el flujo de nitrógeno a 35ºC se 
redisolvió en 100 µl de ClH 0.01 molar, una vez separada la fase orgánica, la 
muestra fue evaporada mediante un flujo de nitrógeno a una temperatura de 35 
ºC. 
 
Finalmente el residuo fue resuspendido en HCl 0.01 mol con 100 µl, o en fase 
móvil (ACN /fosfato de potasio, 25/75%). 
 
Se tomaron 30 µl para inyectarse en el rheodyne, para llevar a cabo la lectura en 
el cromatógrafo de líquidos con la columna alfa-amino 100/4.5 mm y partículas de 
5µm; fase móvil de ACN y buffer de fosfato de potasio 25/75% y detector de luz 
ultravioleta a una longitud de onda de 211nm (ultravioleta). La separación del 
clenbuterol se llevó a cabo entre la columna y la fase móvil a una presión de 2770 
lbs y 1ml/minuto de flujo. 
45 
 
Las señales se integraron en un equipo computarizado con la interfase NELSON 
y la tarjeta de transformación de la señal analógica a digital. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Por último estos residuos fueron resuspendidos en 100µl de HCl 0.01 M. Y 
también en 100µl de la fase móvil. 
 
 
5.4 Validación del método HPLC/UV 
 
Para este trabajo se llevó a cabo, previamente la validación del método analítico 
que es la adaptación específica de una técnica analítica para un propósito de 
medición seleccionado77, 78, 79, en este caso para identificar clenbuterol