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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MÉXICO FACULTAD DE MEDICINA SECRETARIA DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE REHABILITACIÓN Luis Guillermo Ibarra Ibarra ESPECIALIDAD EN: Genética Médica Análisis de expresión diferencial de RNA circulares (RNAcirc) en un modelo celular murino de Enfermedad de Huntington T E S I S PARA OBTENER EL DIPLOMA DE MÉDICO ESPECIALISTA EN: PROFESOR TITULAR GENETICA MEDICA P R E S E N T A: LUIS ERNESTO MARFIL MARIN Margarita Valdes Flores ASESOR Alberto Hidalgo Bravo Ciudad de México Febrero 2020 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. AGRADECIMIENTOS Agradecer es el acto por el cual, reconocemos a todas esas personas que han estado para ayudarnos y, sobre todo, para guiarnos en el sendero que lleva al conocimiento. El reconocer que no lo sabemos todo, nos acerca necesariamente al camino del agradecimiento. Gracias, porque en esta etapa de formación académica, aprendí lo basto que es la ciencia, pero sobre todo el valor de ser humano y utilizar el conocimiento en pro del mismo. Reconozco a mis grandes maestros, el Dr. Miranda, el Dr. Hidalgo, la Dra. Arenas, así como a la Dra. Valdes y al Dr. Leyva; gracias a todos por guiarme en este sendero y no me queda más que decirles que siempre les guardare mucho cariño y respeto. Agradezco a todos los que hicieron posible este trabajo, a la maestra Mónica por acompañarme y ayudarme en los procesos durante el laboratorio, su amplia disponibilidad y resolución a los problemas. Agradezco al Dr. Jhonatan Rosas por guiarme desde mi primer año de residencia, ser compañero y amigo en este camino y sus palabras de aliento en todo momento. DEDICATORIA A MIS PADRES La segunda tesis que les dedico, por lo cual, estoy agradecido que sigan en mi vida. Sin su ayuda incondicional, este camino que ahora sigo no lo hubiera logrado. Gracias por creer en mí y siempre apoyarme. A MIS COMPAÑEROS RESIDENTES ¿Qué significa el conocimiento si no se puede compartir con personas que tienen un verdadero interés por lo mismo que te apasiona? Gracias a ustedes por permitirme ser parte de este proceso en sus vidas, y en el que espero haber impactado de alguna u otra manera. A MIS PROFESORES A todos los profesores de sedes externas por guiarme en este mundo, tan increíble y a la vez tan desconocido por el ámbito médico. Sus enseñanzas en la genética, sin lugar a duda, complementan este amplio campo de estudio. A LA UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO No hay mayor orgullo que seguir perteneciendo a la máxima casa de estudio, y no hay más orgullo que seguir representándola en todos los ámbitos posibles. AL INSTITTUTO NACIONAL DE REHABILITACION Por ser sede de la especialidad, por las facilidades para ver a los pacientes, sin los cuales, el conocimiento nunca se hubiera fortalecido. 1 INDICE I. RESUMEN............................................................................................................................... 3 II. INTRODUCCION ................................................................................................................... 4 1. Enfermedad de Huntington ................................................................................................... 4 1.1 Aspectos históricos .......................................................................................................... 4 1.2 Aspectos epidemiológicos ............................................................................................... 5 1.3 Cuadro clínico ................................................................................................................... 6 1.3.1 Manifestaciones motoras ........................................................................................ 8 1.3.2 Manifestaciones cognitivas ................................................................................... 10 1.3.3 Manifestaciones psiquiátricas ............................................................................... 11 1.4 Aspectos moleculares .................................................................................................... 12 1.4.1 El gen HTT ............................................................................................................... 12 1.4.2 Huntingtina ............................................................................................................... 13 1.5 Aspectos fisiopatológicos y de daño neuronal. .......................................................... 15 1.6 Relación genotipo - fenotipo ......................................................................................... 18 1.7 Marcadores pronósticos en Enfermedad de Huntington .......................................... 19 2. RNAs Circulares (cRNAs) ................................................................................................... 20 2.1 Características generales de los RNAs no codificantes ........................................... 20 2.2 RNA circulares ................................................................................................................ 21 2.3 Biogénesis de los circRNA ............................................................................................ 23 2.4 Regulación de la expresión de circRNA ..................................................................... 24 2.5 Función de lo RNA circulares ....................................................................................... 24 2.6 Relación de RNA circulares con expandidos microsatélites ................................... 25 III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................................... 27 IV. JUSTIFICACION .................................................................................................................. 28 V. PREGUNTA DE INVESTIGACION ................................................................................... 29 VI. HIPOTESIS ........................................................................................................................... 29 VII. OBJETIVO GENERAL ......................................................................................................... 30 VIII. MATERIAL Y MÉTODOS ................................................................................................... 31 1. Diseño de estudio................................................................................................................. 31 2. Cultivo celular ....................................................................................................................... 31 2.1 Primer cultivo celular de células PC12 Q23 y Q74 ................................................... 32 2 2.2 Subcultivos de líneas celulares PC12 Q23 y Q74 ..................................................... 32 2.3 Preparación de placa de 6 pozos para detección de expresión PVF asociada al tracto de poliQ mediante microscopio de florescencia. ........................................................ 33 2.4 Preparación de tubos para realizar extracción de RNA circulares......................... 34 3. Extracción de RNA para validación de datos obtenidos en microarreglo ................... 34 4. Microarreglo ArrayStar CircRNA V2.0 .............................................................................. 35 4.1 Extracción de ARN y control de calidad ...................................................................... 35 4.2 Marcaje e hibridación de RNA ...................................................................................... 36 4.3 Preparación de Chip de microarreglo .......................................................................... 36 5. Obtención y análisis de datos .................................................................................................. 37 IX. RESULTADOS ..................................................................................................................... 39 1. Concentración y calidad de RNA ....................................................................................... 39 2. Agregación de huntingtina en el cultivo de células PC12Q23 y Q74 ........................... 41 3. Expresión de cicRNA ........................................................................................................... 43 3.1 Expresión diferencial de circRNA ................................................................................ 43 3.2 Interacción de circRNA con miRNA ............................................................................. 48 X. DISCUSION .......................................................................................................................... 50 XI. CONCLUSIONES................................................................................................................. 55 XII. PERSPECTIVAS .................................................................................................................. 56 XIII. BIBLIOGRAFIA ..................................................................................................................... 57 3 I. RESUMEN La enfermedad de Huntington es una de las principales enfermedades neurodegenarativas con repercusión a nivel psiquiátrico, cognitivo y motor. A nivel molecular se sabe que se debe a una expansión de más de 36 repeticiones del trinulcléotido CAG en el exón 1 del gen HTT, que codifica para la huntigtina. A pesar de los avances realizados para entender la enfermedad, la fisiopatología de la enfermedad no se ha dilucidado por completo. La evidencia actual sugiere que la expresión de la huntingtina mutada lleva a cambios en la expresión de diferentes especies de RNA, uno de los cuales son circRNA. Estos circRNA se han propuesto como moduladores de la regulación génica a través de diversos mecanismos uno de los cuales es actuar como esponjas de miRNA. Es posible que existan cambios en los niveles de expresión de circRNAs asociados a enfermedad de Huntington. Los niveles de expresión de circRNAs, estudiados en modelos celulares validados, pueden servir como marcadores de procesos biológicos que contribuyan a explicar el proceso fisiopatológico y que ayuden a determinar de una manera más oportuna y accesible, la presencia y progresión de la enfermedad de Huntington. Se realizo cultivo de líneas celulares de un modelo murino para EH. Estas células fueron PC12Q23 y PC12Q74, las cuales expresan repetidos en rangos normal y patológico respectivamente. Se realizó un análisis de expresión diferencial mediante un microarreglo Rat Circular RNA Microarray V2.0 de Arraystar. Tambien se realizó un análisis in silico, para determinar la interacción de circRNA con sus posibles miRNA blancos. En el modelo celular empelado, se observó, mediante proteína verde fluorescente incluida en el constructo celular, que las células PC12Q74, formaban focos de agregación patológicos. Encontramos que, para las células PC12Q74, existen circRNA que se expresan de manera diferencial, siendo 19 sub expresadas y 4 sobre expresadas. Encontramos, además, que de los circRNA sub expresados, la mayoría proviene del gen Rere. Además, la mayoría de los genes que dieron origen a las moléculas circulares, tienen que ver con funciones a nivel de sistema nervioso central y han tenido relación con EH. Se encontraron sitios de interacción con diferentes miRNA, algunos de los cuales interactúan con mas de un circRNA expresados diferencialmente. Con este estudio se logró demostrar que el modelo celular empelado es capaz de formar focos de agregación en las células con expandidos patológicos, además de que expresan diferencialmente moléculas de circRNA. Se encontró que la sub expresión de circRNA fue mucho mayor que la sobre expresión, lo que podría indicar una preferencia por su contraparte lineal y por lo tanto contribuir al proceso fisiopatológico de la enfermedad cuando están expresadas de esta manera. Se demostró por medio de análisis in silico, que estos circRNA tienen regiones que son reconocidas por diferentes miRNA, y que podrían contribuir a la regulación de estos, afectando su interacción con sus genes blanco y contribuir también al proceso fisiopatológico en EH. 4 II. INTRODUCCION 1. Enfermedad de Huntington 1.1 Aspectos históricos La enfermedad de Huntington (EH) fue descrita detalladamente como entidad hereditaria hace más de un siglo. Fue un médico americano, el Doctor George Huntington (9 abril de 1850 – 3 de marzo de 1916), al cual se le debe el nombre de la enfermedad, que hizo la descripción de la enfermedad en el año de 1872. Él público un artículo titulado On Chorea, en la revista Medical and Surgical Reporter of Philadelphia (Huntington 2003). En esta reportaba el caso de una familia originaria Long Island, Estados Unidos, con un padecimiento que en ese momento se conocía como danza de San Vitus, para describir el movimiento característico, denominado actualmente corea. Esta familia había sido estudiada por los mismos familiares de George Huntington, los cuales también eran médicos de la comunidad. Estos pacientes y sus familiares presentaban el mismo movimiento anormal y llamo la atención de Huntington, ya que antes no se había descrito casos heredados de corea. Además de esta característica, describió la tendencia al suicidio y de su gravedad en la edad adulta (Huntington 2003). Describió que con las generaciones más recientes, las manifestaciones eran mucho más graves, que morían prematuramente, y los que sobrevivían trasmitían la enfermedad a su descendencia. Una vez publicado su artículo, se comenzaron a conocer más casos parecidos a los descritos por el citado médico americano, ya para ese entonces, se englobaba como Corea de Huntington. Posteriormente, en 1960 el nombre cambio a Enfermedad de Huntington, ya que en realidad, además del movimiento anormal característico, se englobaban otras manifestaciones clínicas reconocidas, dentro de las cuales, se encuentran las alteraciones psiquiátricas y psicológicas (Wexler, Wild, and Tabrizi 2016). Con el reconocimiento posterior de las Leyes de Mendel y el carácter hereditario de las enfermedades, se despertó rápidamente el interés por reconocer el carácter eugenésico de esta enfermedad, lo cual a su vez contribuyó a la estigmatización de la misma. (Wexler, Wild, and Tabrizi 2016). Fue hasta 1993, cuando el Huntington’s Disease Collaborative Research Group, bajo la dirección de la Doctora Nancy Wexler y la Hereditary Disease Foundation, identificaron la causa de la enfermedad de Huntington: un repetido de trinucléotidos expandido e inestable 5 localizado en el cromosoma 4, que segregaba con los casos de pacientes que tenían la enfermedad. Posteriormente al gen donde se encontraba el repetido, se le denomino HTT, codificante para la proteína huntingtina, en alusión a la descripción epónima de la enfermedad. Esto llevo a la publicación del artículo donde seevidencian estos hallazgos, en la importante revista Cell del año 1993 (MacDonald et al. 1993). 1.2 Aspectos epidemiológicos La incidencia de la enfermedad de Huntington varía alrededor del mundo. Se habla que hay diferencias de más de 10 veces entre diferentes regiones geográficas. Incluso, antes de la era molecular, estimar la incidencia se basaba en reportes médicos y en última instancia, de los reportes patológicos. Aunado a eso, los reportes, como aún se puede percibir en la actualidad, están orientados a países con un alto desarrollo económico. Todo esto provocaba subestimación de la misma, siendo esta de 7.6 a 8.9 por 100, 000 habitantes. Algunos estudios se han centrado en estudiar la prevalencia de la EH. El grupo de Rawlins, del Department of Non-Communicable Disease Epidemiology, en Londres (Rawlins et al. 2016), realizo una revisión sistemática de prevalencias reportadas en el mundo. En este estudio se incluyeron 81 reportes, los cuales al menos incluyeran una población de 150 000 personas, en un periodo que abarca desde el año 1930 hasta enero de 2017. Dentro de sus resultados encontraron gran heterogeneidad (I2 = 99.0%, CI 95% 98.9-99.1), con relación a las regiones valoradas. Interesantemente describe la prevalencia por continente y según su grupo etario. Según este estudio, la prevalencia por 100, 000 habitantes fue de 0.40, 2.17, 7.33, 5.53, 6.68 y 3.60 para Asia, Europa norte y centro, América del Norte, Oceanía, Reino Unido y Europa oeste respectivamente. Siendo este estudio uno de los más recientes, las frecuencias estimadas reportadas no varían tanto respecto a otros estudios realizados(Kay, Hayden, and Leavitt 2017). Del estudio de Rawlins, se encontró, además, que por ejemplo, para la comunidad de población negra la prevalencia fue la más baja siendo de 0.02 por 100, 000 habitantes en África, aunque esta sube a 6.37 por 100, 000 habitantes en América. También encontramos que para la población asiática la prevalencia es de las más baja en todos los estudios que se incluyeron siendo esta en un rango de 0.11 a 0.33 por 100, 000 habitantes. En este estudio, fue la población caucásica la que presento la mayor prevalencia de la enfermedad, en parte por el tipo de población estudiada, siendo por ejemplo, en América hasta de 17.27 casos por 100, 000 habitantes (Rawlins et al. 2016). 6 En América, llama la atención la descripción hecha por el Doctor Américo Negrete en una comunidad al oeste de las costas de Lago Maracaibo, Ciudad de Zulia, en Venezuela, en la que se describió una alta prevalencia (1 en 143 - 230,000 habitantes) y agregación familiar de EH (Okun and Thommi 2004)(Moscovich et al. 2011). Estudios posteriores realizados por el grupo de Paradisi en población general en Venezuela, han estimado la prevalencia en 1 en 200, 000 habitantes (Paradisi, Hernández, and Arias 2008). Si se compara este último dato, con estudios realizados en el continente, la prevalencia es baja. El grupo de Fisher encontró una incidencia de 13.69 por 100,000, (población caucásica en Canadá) siendo esta la más alta reportado hasta el 2017 para la población del continente americano. (Fisher and Hayden 2014)(Rawlins et al. 2016). En México, no hay estudios de prevalencia de EH. En 2012 el grupo de la Dra. Alonso (Alonso et al. 2009), como parte de un estudio realizado en el Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía Manuel Velasco, se incluyeron a 691 pacientes, de 401 familias con EH, en un periodo comprendido de 1973 a 2008. En su mayoría estos pacientes provenían de la capital del país, así como de la zona conurbada, pero también se logró representación de la mayor parte de los estados que conforman a la República Mexicana. En este estudio además se incluyó información de edad de inicio, manifestaciones clínicas, así como algunos aspectos moleculares. Fuera de este estudio, a la fecha no hay otro realizado con el mismo impacto o número de pacientes. 1.3 Cuadro clínico Las manifestaciones clásicas de la Enfermedad de Huntington corresponden a alteraciones en el movimiento, siendo el más característico la corea; agregándose además otros síntomas extrapiramidales, presencia de deterioro cognitivo progresivo, y manifestaciones psiquiátricas. Se sabe que la EH tiene relación con edad de inicio y severidad de sintomatología, relacionada con el tamaño de repetidos de CAG en el gen HTT, lo cual se mencionara más adelante. El curso de las manifestaciones clínicas ya mencionadas, son divididas siguiendo un modelo de historia natural de la enfermedad descrito por Shouldon y Fahn,(Beglinger et al. 2010) la cual describe dos periodos de presentación, una fase presintomática, seguida de una fase sintomática. Estos periodos se representan en una gráfica, donde se relacionan los diferentes periodos y el grado de disfunción motor y cognitivo. El grado de disfunción fue valorado según la escala de capacidad funcional total (TFC por sus siglas en inglés), 7 que es un componente de la Escala de calificación de la Enfermedad de Huntington Unificada (HSG, 1996) El periodo presintomático a su vez se divide en una fase presintomática propiamente dicha y en una fase prodrómica. La primera se presenta de 10 a 15 años antes del inicio de los síntomas. Comúnmente no hay sintomatología, sin embargo, algunos pueden presentar cambios en imagen de resonancia magnética, evaluación motora cuantitativa alterada u alteración en otros biomarcadores. La fase prodrómica se caracteriza por cambios motores, cognitivos y conductuales sutiles. El periodo sintomático se divide a su vez en 3 o 5 fases (Beglinger et al. 2010; Ross et al. 2014), dependiendo del autor que se consulte (figura 1.1) . Se apunta que la edad promedio de inicio de esta etapa sintomática es alrededor de los 45 años. La forma más útil de dividirlo es en tres fases. La primera de ellas es la fase temprana, en la cual, los pacientes son funcionales en sus actividades de la vida diaria. Le sigue una fase moderada, donde los pacientes son incapaces de realizar funciones complejas tales como trabajar, conducir o comprar de manera independiente, pero pueden realizar actividades de la vida diaria y actividades del hogar que sean sencillas. En las etapas tardías, ya no son independientes para ninguna de las actividades, incluso aquellas que son comunes a la vida diaria (Ross et al. 2014). Aproximadamente dos terceras partes de los pacientes se presentan con manifestaciones a nivel psiquiátrico. En estadios temprano de la enfermedad se puede acompañar de alteración en los movimientos oculares, coordinación de movimientos, dificultad en la planeación de tareas y se puede presentar depresión o irritabilidad. Estadios posteriores de la enfermedad, la corea se vuelve el principal componente, con progreso de disfagia y disartria. La sobrevida después del inicio es 15 a 18 años, con muerte entre los 54 a 55 años. (Bates et al. 2015; Ross et al. 2014) 8 FIGURA 1.1: Fases clínicas e historia natural de la Enfermedad de Huntington. Nota. Modificada de Ross C., et.al. Nature Reviews. 2014. 1.3.1 Manifestaciones motoras Se distinguen dos componentes (Bates et al. 2015). El primero de ellos consiste en movimientos involuntarios, del cual, la corea es el principal componente. La corea se presenta en el 90% de los casos y su severidad aumenta dentro de los primeros diez años después de su inicio de la sintomatología. Dentro de los movimientos anormales, la corea se clasifica dentro las hipercinesias, con movimientos espasmódicos. La palabra corea tiene un origen griego que significa danza, y es precisamente esta descripción lo que distingue a este movimiento anormal. La corea es entonces, un movimiento involuntario, abrupto, no predecible y no rítmico, resultado de un flujo aleatorio y continuo de contracciones musculares que van de una partedel cuerpo a otra (Abdo et al. 2010). Estos movimientos ocurren frecuentemente y de manera inicial de manera distal, como lo es en dedos de las manos o los pies, y en ocasiones en músculos faciales. Con el tiempo, la marcha se vuelve inestable y los movimientos anormales se vuelven más proximales y axiales, siendo prominente los movimientos de extensión de los músculos de la espalda. Los movimientos coreicos se presentan todo el tiempo que el paciente este despierto. A nivel facial se 9 describe la corea facial, que produce movimientos continuos y asimétricos de la cara. También se agregan problemas para deglutir o disartria (McColgan and Tabrizi 2018; Ross et al. 2014). Otro dato que se agrega en etapas avanzadas, es la fuerza fluctuante de la mano y reflejos que se describen como colgados, con contracciones sostenidas y movimientos alternantes de la pierna después de inducir el reflejo patelar. Además se puede agregar contracciones de menos de 100 mili segundos, descritos como mioclónicas, o contracciones sostenidas de más de 50 mili segundos, descritos como distonías, que provocan posiciones anormales como torticolis o rotaciones del tronco (Abdo et al. 2010) y en algunos casos se ha comentado que es el primer signo motor en aparecer en pacientes con EH. El segundo componente es el poco control de movimientos involuntarios, que generalmente se tienden a ser más pronunciados en las etapas avanzadas de la enfermedad (Ross et al. 2014). Estos incluyen la incoordinación y la rigidez. Todos los pacientes desarrollaran bradicinesia; el cual provoca lentitud para realizar todos los movimientos, así como acinesia; que es la dificultad para comenzar los movimientos voluntarios (McColgan and Tabrizi 2018). También se han descrito tics similares a los vistos en el Síndrome de Tourette, y signos cerebelosos como hipo o hipermetría. Alteración en movimientos oculares como sacadas son vistas en 75% de los casos. También se pueden presentar alteraciones cerebelares, con una marcha parecida a la atáxica (Bates et al. 2015). Las características motoras de EH pueden ser evaluadas utilizando diferentes escalas (Reilmann and Schubert 2017). Una de ellas considerada como estándar de oro, es la UHDRS TMS (Kieburtz et al. 2001) . Esta escala fue desarrollada por la Huntington Study Group. Se trata de una escala categórica, la cual incluye movimientos oculares (movimientos horizontales o verticales, así como movimientos sacádicos), presencia de disartria, protrusión lingual, movimientos finos controlados de los dedos o las manos, test de Luria (dificultad para alterar una respuestas a una tarea motora programada cuando se cambió el orden de las acciones de esa tarea), rigidez de extremidades superiores, afectación coreica por regiones, territorios afectados por distonía, así como presencia de bradicinesia y alteraciones en la marcha. Cada categoría es evaluada de 0 como menor afección, hasta 4 con mayor severidad, con un puntaje que va desde 0 a 124 puntos totales. Posteriormente se han desarrollado otras escalas, que han utilizado algunos de los parámetros originalmente evaluados, con el propósito de calificar mejor ciertos detalles, de acuerdo con la escala utilizada. Dentro de estas encontramos la TMS-4 o la mMS (Reilmann and Schubert 2017). Algunas escalas también fueron diseñadas para evaluar la efectividad 10 de tratamientos, por ejemplo, el uso de la tetrabenazina en el contexto del TETRA-HD. Esta se basaba en territorios afectados por la corea en una escala denominada (TCS). El uso de estas escalas, aunque útil, está limitado a pacientes con manifestaciones de EH y es poco útil para etapas prodrómicas de la enfermedad. Así mismo la contribución de diferentes parámetros no es la misma y no es ponderable para las manifestaciones que se presentan de manera diferente entre los pacientes. Otra de las limitaciones que se tienen al utilizar estas escalas es que son subjetivas y dependen de la pericia de quien los examina. Se han desarrollado escalas que tratan de ser más objetivas al volver las observaciones más cuantitativas. Este es el caso de Q-motor, el cual utiliza un traductor de fuerza cuantitativo (digitomotografía, disdiadocomotografia, manomotografía, coreomotografia, piemotografia y glosomotografia) los resultados. En conjunción con el TRACK-HD, suele ser más objetiva y en algunos casos ser útil en la investigación de fármacos, así como su potencial uso en estadios prodrómicos de la enfermedad (Reilmann and Schubert 2017). 1.3.2 Manifestaciones cognitivas El deterioro cognitivo es una de las manifestaciones principales de EH y puede incluso aparecer antes que la afectación motora se haga evidente, incluso presentándose 15 años antes del inicio de la enfermedad (J. S. Paulsen et al. 2008). Al igual que las manifestaciones motoras, las cognitivas deterioran con el paso del tiempo. La atención y concentración suelen ser las primeras en afectarse (Bourne et al. 2013). Se ha encontrado incluso, que la memoria y funciones de ejecución, son sensibles para detectar pacientes presintomáticos, más aun en aquellos que están próximos a manifestar sintomatología (Hart et al. 2013). La principal área afectada es a nivel de funciones ejecutivas, denominándolo síndrome disejecutivo. En pacientes con HD se ha descrito que tienen dificultad para discriminar actividades según su importancia o relevancia, por lo tanto los pacientes afectados tienen dificultad para planificar aspectos cotidianos de la vida o volver a planificar con facilidad eventos que ya fueron experimentados (Hart et al. 2013; Jane S. Paulsen 2011). Las alteraciones en la memoria son observadas en los pacientes con HD, al tener dificultad para aprender nueva información o recuperar información aprendida previamente. También se ha observado alteración al realizar actividades que requieren retroalimentación, como lo es la prueba del círculo. Estas manifestaciones se relacionan con desordenes que afectan la vía estriado – subcortical, descritas en la demencia vascular, o enfermedad de Parkinson. 11 A pesar de que los pacientes tienen problemas para el aprendizaje, en la memoria de corto plazo o en el uso de información de reciente adquisición, a diferencia de los pacientes con enfermedad de Alzheimer, el deterioro suele ser más lento (Jane S. Paulsen 2011). También se ha observado que tienen incapacidad para tener un adecuado juicio en el proceso del razonamiento. El lenguaje esta generalmente respetado. Con el tiempo los procesos psicomotores son retardados. Otras manifestaciones observadas son alteración en la atención, flexibilidad para procesamiento de información, funciones visoespaciales alteradas, planeación y control de emociones (Jane S. Paulsen 2011; Ross et al. 2014) Tomando en cuenta estudios realizados en el TRACK-HD (Tabrizi et al. 2013), 10 de los 12 aspectos cognitivos evaluados, fueron evidentes en etapas tempranas de la enfermedad . Las pruebas que fueron afectadas son las que tienen que ver con la velocidad psicomotora y de atención visual, la integración y transformación visomotora y espacial, así como la velocidad psicomotora en un contexto hablado. Cuando la enfermedad se manifiesta tempranamente, el deterioro cognitivo puede ser evidente en un periodo de 12 a 24 meses, mientras que en los pacientes presintomáticos el deterioro se hace evidente a lo largo de 36 meses. También es importante mencionar que el grado de deterioro cognitivo varía de un paciente a otro (Tabrizi et al. 2013). 1.3.3 Manifestaciones psiquiátricas Pacientes con esta enfermedad desarrollan cambios en la personalidad, tienen psicosis afectiva o incluso, desarrollar esquizofrenia (Rosenblatt 2007). Este tipo de manifestaciones suele ser más variable que las manifestaciones cognitivas o motoras, sin embargo, al igual que estas, los síntomas aumentancon la progresión de la enfermedad. (Epping et al. n.d.). Los comportamientos hostiles, obsesivos compulsivos y de ansiedad, suelen ser las primeras manifestaciones en EH, incluso antes de las manifestaciones motoras, tal como lo establece el estudios Predict-HD.(Duff et al. 2007). La depresión mayor es una de las principales manifestaciones y se ha reportado en el 26 al 50% de los pacientes. (Marshall et al. 2015; Jane S. Paulsen 2011). Generalmente preceden a las manifestaciones clínicas y tienen su mayor pico en etapas tempranas de la enfermedad. En comparación con la población general no tiene predilección por algún sexo en específico y de una presentación mucho más temprana (Eddy, Parkinson, and Rickards 2016). 12 Las ideas suicidas son una de las manifestaciones tempranas de la enfermedad y también se ha observado en pacientes portadores preclínicos. Se calcula que esta ocurre en 2.3% a 5.7% de las personas con EH. Se sabe que el periodo crítico para el desarrollo de ideas suicidas se da justo cuando se diagnostica la enfermedad o cuando experimentan pérdida de su independencia (J S Paulsen et al. 2001). La ansiedad es frecuente y se presenta en 34 o 61% de los pacientes, siendo lo más frecuentes que presenten trastorno de ansiedad generalizado y ataques de pánico (Eddy, Parkinson, and Rickards 2016; Julien et al. 2007) Otras manifestaciones son desinhibición en 34%, irritabilidad 38-73%, apatía en 34 -76% y menos común, manifestaciones como psicosis parecida a esquizofrenia.(J S Paulsen et al. 2001). La enfermedad de Huntington de presentación infantil se caracteriza por inicio antes de los 20 años y acontece en el 5 al 10% de los individuos afectados. Las manifestaciones clásicas asociadas a la enfermedad también se presentan en estos pacientes, con deterior mental más severo, síntomas motores y cerebelares prominentes, retraso en el lenguaje y en el habla, convulsiones que se presentan en el 30-50% de los pacientes sobre todo cuando el inicio es antes de los 10 años 1.4 Aspectos moleculares La enfermedad de Huntington pertenece a las entidades genéticas conocidas como enfermedades por expansión de micro-satélites. El caso específico de EH, se debe a mutaciones dinámicas que provocan expansión del trinucléotido CAG, en el exón 1 del gen HTT, en una región codificante que produce tracto de poliglutamina (poliQ) que, al formar agregados patológicos, se vuelven perjudiciales para las células neuronales. 1.4.1 El gen HTT El gen HTT, se encuentra localizado en el cromosoma 4p16.3 y codifica para la proteína huntingtina (Humbert 2016). Este gen de 180 kilobases, contiene 67 exones y genera 2 transcritos de 10,366 y de 13,711 pares de bases. El segundo difiere del primero por una secuencia adicional en la región 3’ no traducida de 3,360 pares de bases. Esta segunda isoforma se expresa de manera importante en tejido cerebral. La expresión de este gen 13 está ampliamente distribuida en el organismo y es importante durante el desarrollo (Ruzo et al. 2015). Variantes en corte y empalme se han descrito, con variantes que saltan el exón 10, 12, 29 y 46, o pueden retener 57 pares de bases del intrón 28 y tener un exón 41 extra (41b).(Hughes et al. 2014) Dentro del primer exón del gen, se encuentran repetidos del trinucleótido CAG, cuyo tamaño en la población es altamente polimórfico pero un rango normal se considera entre 9 y 35, siendo lo más común de 15 a 20 e intermedios entre 27 y 35 de estos CAG (Humbert 2016). 1.4.2 Huntingtina El gen HTT codifica para la proteína huntingtina que normalmente tiene un tracto de 23 glutaminas, y en promedio 3144 aminoácidos con un peso molecular de 348 kD, además de ser una proteína soluble (Humbert 2016). De acuerdo a la base de datos ontología de PUBMED, es altamente conservada en, chimpancés, perros, ratas y ratones. A pesar de esto, hay que hacer notar, que el exón 1 ha sido poco conservado durante la evolución, en contraste con el resto de los exones. Fuera del dominio codificado por el exón 1, el resto de los 66 exones que codifican del aminoácido 69 al 3144, forman el 97.8% de la proteína. Los aminoácidos en N-terminal son conservados en vertebrados. El tamaño del tracto de poliglutamina es altamente polimórfico en humanos y varía de una especia a otra (Tartari et al. 2008). Esta proteína se puede encontrar en localización nuclear o citoplasma, lo que orienta hacia múltiples funciones en diferentes compartimentos celulares (Cattaneo, Zuccato, and Tartari 2005). El Human Protein Atlas, se observa que tiene expresión en la mayoría de los tejidos corporales, sin embargo, es a nivel de sistema nervioso donde se encuentra su mayor expresión, notablemente alta en la corteza cerebral, seguida de una expresión media en cerebelo. Cabe destacar que se expresa en tejido adrenal en la misma cantidad que el cerebelo, de importancia para investigación con líneas celulares. La proteína está organizada en dominios separados entre sí y se predice que formará un solenoide superhelical alargado y que este puede tener una estructura flexible que puede alterar su actividad (W. Li et al. 2006). El tracto de poliQ empieza en el aminoácido número 18, y se ha descrito que estos tractos forman una estructura en forma de cremallera polar, cuya función pudiera estar relacionada con interacción con otros factores igual polares y con esto, permitir su solubilidad en un medio acuoso. Seguido de este dominio se encuentra un tracto de poliprolina (polyP), que también contribuye a la polaridad de la molécula. 14 Después de estas estructuras, se encuentran dominios ordenados que comprenden agrupamientos de repetidos alfa hélices HEAT (factor de elongación 3, fosfatasa 2A y TOR1), cada uno con un tamaño de aproximadamente 40 aminoácidos. (Andrade and Bork 1995; Humbert 2016). Por último en el dominio C-terminal se encuentra una secuencia de exportación nuclear (NES), la cual podría estar implicado en el transporte del núcleo al citoplasma (Cattaneo, Zuccato, and Tartari 2005). Otro de los sitios altamente conservados en la proteína, son los sitios de proteólisis. Estas pueden generar pequeños fragmentos tanto de proteína normal como de la forma mutada, siendo esta última la que más fragmentos por proteólisis genera y que contribuye en el proceso patológico de la enfermedad. Se cree que los dominios HEAT son importantes para la interacción con otras macromoléculas que le permitirán interactuar principalmente con proteínas del citoesqueleto neuronal. Las secuencias de aminoácidos que están entre los dominios HEAT, sirven como sitios de proteólisis principalmente por caspasas, calpaínas, catepsinas y metaloproteinasas. Todos los dominios son susceptibles a modificaciones postraduccionales como fosforilaciones, acetilaciones o glucosilaciones. El extremo C terminal, tiene una señal de exportación nuclear, importante para la localización normal de la proteína. Finalmente, la interacción intramolecular con todas estos dominios, le permitirá a la proteína adquirir diferentes configuraciones tridimensionales, la cual podría varíar de acuerdo a la molécula que interactúe con ella (Cattaneo, Zuccato, and Tartari 2005; Schulte and Littleton 2011). Las funciones de la huntigtina, aún no se conocen completamente. Se sabe que por lo menos interactúa con otras 200 proteínas. Entre sus funciones están la regulación del tráfico vesicular, coordinación de la división celular, regulación de la cilio génesis, actúa como mediador de la endocitosis, en el reciclado de vesículas y en el tráfico de endosomas. Además, también participa en la regulación de la transcripción, al servir de unión con algunos de estos factores (Bates et al. 2015; Humbert 2016; Ross and Tabrizi 2011) La fragmentación proteolítica del extremo N-terminal es importante por su probable rol enla toxicidad generada por este fragmento. Se trata de un fragmento de 100 aminoácidos que se denomina HTT 1, codificado por el exón 1 de HTT. Fragmentos relacionados con este constan de tres dominios uno N-terminal de 17 aminoácidos (HTTNT o N17), un dominio con repetidos CAG de longitud variable y una proteína rica en prolina (PRD) de 51 aminoácidos. Las revisiones mencionan, en especial el fragmento de HTT de 17 aminoácidos, ya que tiene importantes funciones en blancos de membrana, uniéndose a 15 chaperonas, en la exportación nuclear y están involucrados en regulación del tráfico vesicular (Bates et al. 2015). Esta estructura, cuando no está unida a membrana, adquiere una conformación desorganizada. Un aumento de más de 23 repetidos CAG promueven a que esta conformación sea la preferente y que por lo tanto favorezca la formación de agregados proteicos patológicos. (Humbert 2016). FIGURA 1.2: Aspectos moleculares de la proteína huntingtina. a) estructura propuesta de la proteína huntingtina. En la caja se muestra la región correspondiente al tracto de poliglutamina. b) los dominios HEAT forman dominios globulares, cuando interaccionan entre sí forma una estructura en forma de cerradura que le permite interactuar con otras proteínas. c) representación de los dominios de la proteína huntingtina. Después de los primeros 17 aa, en la caja roja se observan los tractos de poliglutamina. Las cajas amarrillas representan zonas de escisión de la proteína. En naranja fuerte las regiones denominadas HEAT, con una alta organización y en naranja claro, las regiones entre HEAT de menor organización. La caja verde representa zonas de señalización de exportación nuclear. Los círculos de colores representan las diferentes modificaciones postraduccionales d) Representación del fragmento N terminal, la caja verde representa una zona de señalización de exportación nuclear, la caja azul representa el tracto de poliglicinas. Abajo se representa la conformación desorganizada con un tracto no patológico, lo cual le permite al fragmento ser flexible. Del lado derecho se representa la conformación cuando el tracto tiene un expandido patológico, lo cual provocaría que el fragmento N terminal se vuelva más rígido, permitiendo así su polimerización. Nota. Modificada de Ross C., et.al. Lancet. 2011 y Saudou F. et. al. Cell 2016. 1.5 Aspectos fisiopatológicos y de daño neuronal. La fisiopatología de EH se puede explicar con dos mecanismos a nivel genético, pérdida de función de la proteína normal de huntingtina y ganancia de función tóxica de los tractos de poliglutamina. Esta última explica la fisiopatología de la enfermedad. 16 En el caso de pérdida de función se ha encontrado, en modelos animales de ratón, que afecta el desarrollo normal cerebral (Dragatsis, Levine, and Zeitlin 2000), el mantenimiento de la homeostasis y vuelve más vulnerable a las células neuronales al estrés oxidativo. Además, se ha relacionado con el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF por sus siglas en inglés) y su transporte vesicular. Este factor es importante para la sobrevivencia de células del estriado y actividad cortico - estriatal (Gauthier et al. 2004). Otros datos que apuntan a esta pérdida de función son anormalidades en la función del transporte de proteínas como PCM1, proteína importante en la ciliogenesis (Keryer et al. 2011) o incluso coadyuva en la falta de reconocimiento de la proteína mutante por el fagosoma. (Martinez- Vicente et al. 2010). Otras funciones están relacionadas como regulador de expresión de factor de transcripción, así como en la regulación de la comunicación sináptica (Cattaneo, Zuccato, and Tartari 2005). Todas estas funciones importantes dentro de la proteína indican que mutaciones homocigotas en el gen HTT para una expansión patológica, lleva a un fenotipo severo, comparable incluso, para un heterocigoto con la misma expansión. Las revisiones también apuntan que huntingtina normal es necesario para reducir la toxicidad de la huntingtina mutada, así como reducir el daño celular ocasionada por esta, así como mejora en el transporte de BDNF (Cattaneo, Zuccato, and Tartari 2005) La huntingtina mutante adquiere configuraciones anormales, siendo la más común la beta plegada. Estas proviene de fragmentos N terminales con potencial de agregación al propiciar cambios conformacionales en la proteína normal, permitiendo una configuración anómala (Hatters 2008). (Nucifora et al. 2001). A nivel nuclear se pueden formar agregados que pueden llegar a ser más de 100,000 moléculas de huntingtina. Dentro de los mecanismos importantes para la generación de estos fragmentos, es una producción mayor del exon1 del HTT, generada por corte y empalme alternativo (Sathasivam et al. 2013), o por la producción de fragmentos N terminales por las diferentes caspasas (Bates et al. 2015). Se ha observado que este agregado proteico se transloca hacia el núcleo y ahí tiene efectos en la transcripción. Se ven afectados algunos factores de transcripción, uno de los cuales son los elementos de unión de respuesta a AMP cíclico (CREB por sus siglas en inglés). Este último factor disminuye la transcripción de muchas proteínas importantes dentro de la célula. Finalmente, la agregación de esto fragmentos ocasionan un des regulación en la síntesis proteica, sobre todo para aquellas que tienen que ver con la producción y transporte de vesículas, así como las que están involucradas en la eliminación de desechos a lo largo de toda la neurona. Las revisiones sobre los mecanismos de lesión celular muestran que se 17 inhibe la actividad del proteosoma, la actividad de las chaperonas y se inhibie la autofagia, lo cual, en conjunto, permite que la proteína mutante continúe lesionando el tejido neuronal. También se sabe que huntingtina anormal afecta la actividad mitocondrial normal, provocado aumento de especies reactivas de oxígeno y con esto mayor daño celular (Ross and Tabrizi 2011). Figura 1.3: Fisio patogenia en Enfermedad de Huntington en la célula neuronal. a) En la proteína con tractos expandidos en rango patológicos, hay corte del fragmento N-terminal, b) estos fragmentos adquieren una conformación anómala, que junto con otros fragmentos se oligomerizan para formar agregados que se pueden en citoplasma o en el núcleo, c) estos fragmentos pueden afectar el sistema del proteasoma, con acumulación de otras proteínas a degradar. Además, hay daño directo en la mitocondria, con lo que aumenta el estrés oxidativo en la neurona. d y e) podría interactuar con huntingtina normal, como consecuencia modificando su función, un efecto que se observa con una función alterada de BDNF. Este daño estaría causando alteración del citoesqueleto, sobre todo en los procesos que están involucrados en el transporte de vesículas sinápticas. f) los agregados se pueden encontrar en núcleo, afectando factores de transcripición o moduladores del corte y el empalme alternativo. Esto tiene como consecuencia alteración en genes codificantes para proteínas, así como en RNA no codificantes como miRNA o lncRNA. Nota. Modificada de Ross C., et.al. Lancet. 2011 y Saudou F. et. al. Cell 2016 Dentro de los mecanismos fisiopatológicos están la degeneración a nivel del sistema nervioso central. Existe pérdida temprana de hasta el 95% de las células estriatales, con afectación de conexiones neuronales espinosas de estriado que utilizan las vías 18 GABAergicas, con la posterior pérdida de comunicación con el globo pálido y sustancia negra. Se produce un aumento de la estimulación de los receptores de glutamato extra sinápticos y disminución de la re captación de glutamato, lo que produce exotoxicidad y daño neuronal (Albin et al. 1992). Además, hay atrofia de la corteza cerebral, de la sustancia blanca, así como afectación a nivel de tálamo y núcleos hipotalámicos (Ross and Tabrizi2011). Histológicamente se caracteriza por presencia de inclusiones intranucleares, los cuales son agregados de huntingtina anormal dentro del núcleo, pero también se pueden encontrar a nivel de dendritas y terminales axonales. Estas son inclusiones pato gnómicas en EH. (Ross et al. 2014). 1.6 Relación genotipo - fenotipo Existe relación entre el tamaño del repetido CAG y edad de inicio de EH (Douglas R. Langbehn et al. 2010). - Alelos en rango normal: de 26 o menos CAG - Alelos intermedios: 27 – 35 repetidos CAG. No tiene riesgo de desarrollar EH, sin embargo, por el mecanismo de inestabilidad de micro satélites, puede tener riesgo de transmitir a la descendencia un alelo expandido causante de EH - Alelos causantes de EH: 36 o más repetidos CAG, con riesgo de desarrollar sintomatología de EH. La edad de inicio es en la vida adulta. A su vez de clasifican en - Alelos de penetrancia reducida: 36 a 49 repetidos CAG, riesgo para desarrollar EH, pero no desarrollan sintomatología - Alelos de penetrancia completa: más de 50 repetidos CAG desarrollan EH. Con alelos más de 60 CAG desarrollaran la forma juvenil. La transmisión del alelo mutado es de origen paterno. Esta trasmisión es provocada por un mecanismo de inestabilidad, provocando expansión del trinucléotido CAG. Esta puede ocurrir antes de la meiosis en espermatogonias o después de meiosis en células germinales diferenciadas (Yoon et al. 2003). Se cree que este mecanismo de expansión es debida a errores durante reparación en la replicación o incluso en el mecanismo de reparación por escisión de bases (McMurray 2010). El fenómeno de anticipación es consecuencia de este 19 fenómeno de expansión. En la anticipación se observa un inicio de la enfermedad a edades más tempranas, en las generaciones sucesivas, respecto a la edad de inicio del caso índice. Los repetidos expandidos predicen también grado de deterioro motor, cognitivo y funcional, pero no manifestaciones psiquiátricas y duración de la enfermedad. Existe una amplia variabilidad en el rango de inicio de los síntomas cuando los alelos están en un rango de 36 a 49 repetidos. Cuando la expansión es de más de estos repetidos, se ha observado que el rango de inicio de la enfermedad es en promedio a los 30 años con una variación de +/- 10 años. Sin embargo, por ejemplo, con un tamaño de repetido de 40 CAG, esta variación, para una edad de inicio en promedio de 60 años es de +/- 25 años (D. R. Langbehn et al. 2004). En estos casos se ha determinado que los repetidos CAG intervienen en el 70% para explicar la edad de inicio de la enfermedad, mientras que el otro 30% es debido a diferentes genes modificadores. Dentro de los genes modificadores de han descrito ADORA2A, ATG7, CNR1, GRIK2, GRIN2A, GRIN2B, HAP1, PPARGC1A, MAP2K6, MAP3K5, NPY, NPY2R, OGG1, PEX7, TP53 y UCHL1 (Gusella and MacDonald 2009). 1.7 Marcadores pronósticos en Enfermedad de Huntington Se han investigado, algunos marcadores que ayuden a predecir o determinar la severidad de la Enfermedad de Huntington. La mayor parte están relacionados con el proceso fisiopatológico de la enfermedad, posterior a la acumulación de huntingtina y han tenido su principal aplicación y desarrollo en los métodos de diagnóstico por imagen (Ross et al. 2014). Medición de algunos biomarcadores como 8 hidroxi 2 deoxiguanosina (8OHdG190, producto de la oxidación de ADN)o incluso medición de BDNF, pero hasta el momento ninguno de estos ha demostrado una asociación clara entre sus niveles y su poder predictivo en la evolución de la enfermedad (Borowsky et al. 2013). Estudios de imagen permiten conocer los cambios neuropatológicos macroscópicos que se desarrollan durante la EH y utilizarlos como medidas de seguimiento en pacientes en fase prodrómica de la enfermedad (Aylward et al. 2011). Estas imágenes se han asociado con atrofia de la materia blanca, sobre todo a nivel frontal, así como cambios en el volumen del núcleo estriado. Estos cambios se pueden observar en pacientes preclínicos y con manifestaciones con por lo menos 15 años de diferencia entre ellos. También se ha demostrado que estos cambios prosiguen con el desarrollo de la enfermedad (Ruocco et 20 al. 2008). Imágenes con tensor de difusión (DTI por sus siglas en inglés) han demostrado cambios en la orientación de las fibras de la sustancia gris y blanca en pacientes preclínicos y con manifestaciones, con una diferencia de detección de 30 años entre los dos grupos (Rosas et al. 2006). La resonancia magnética funcional (RMf) puede detectar cambios en pacientes preclínicos, aunque su interpretación en ocasiones no es clara, y no hay relación con la respuesta farmacológica (Jane S. Paulsen et al. 2004; Ross et al. 2014). También se ha estudiado resonancia por espectrometría de masas para identificar alteraciones metabólicas relacionadas con N acetil aspartato, glutamato y mioinositol (un marcador de astrocitosis) en pacientes preclínicos (Sturrock et al. 2010). Por último, el uso de tomografía por emisión de positrones (PET por sus siglas en inglés), ha demostrado detectar aumento en la captación de glucosa en áreas corticales, con una posterior disminución de la misma a lo largo del desarrollo de la enfermedad. Esta disminución fue más notoria en aquellos pacientes preclínicos, que desarrollaron una progresión rápida de la enfermedad.(Shin et al. 2013). Otros estudios más recientes han buscado la medición de proteínas o factores estudiados en líquido céfalo raquídeo (Fang et al. 2009). Aunque hay artículos de revisión que se refieren a estos marcadores bioquímicos, se concluye que aún falta validarlos en grupo grandes de pacientes como lo es el PREDICT-HD (Ross et al. 2014; Scahill, Wild, and Tabrizi 2012). 2. RNAs Circulares (cRNAs) 2.1 Características generales de los RNAs no codificantes El ácido ribonucleico (RNA por sus siglas en inglés), es una biomolécula vital para el funcionamiento de los seres vivos. El RNA es un polímero de ribonucleótidos de purina y pirimidinas, unidos entre sí por enlaces 3´,5´-fosfodiéster. El carbohidrato es ribosa, con un grupo hidroxilo en posición del carbono 2´. A pesar de que se han descrito estructuras de cadena sencilla para esta molécula, se sabe que, dada la complementariedad que existe en la cadena de RNA, esta puede adquirir distintas estructuras secundarias(Neidle 2008). Una de las funciones sobresalientes de los RNA no codificantes, se descubrió gracias a los microRNA (miRNAs). Después de su transcripción en regiones específicas del genoma y de su posterior procesamiento, estos se dirigen a distintos RNA mensajeros (mRNAs) u otras moléculas de RNA. La importancia de estas moléculas fue conocer su intervención en la regulación de la expresión génica y su implicación en enfermedades, como por ejemplo, 21 en el cáncer. Además, pueden ser utilizados como posibles blancos terapéuticos (He and Hannon 2004) Otro cambio importante en el conocimiento acerca de los RNAs fue el descubrimiento de los RNA largos no codificantes (lncRNAs), ya que se pensaba que solo moléculas pequeñas eran capaces de regular a otras RNAs. Estos lncRNAs son unidades de más de 200 nucleótidos, y están distribuidos en regiones intrónicas, antisentido e intergénicas. Aún queda poco claro cuál es su papel en la regulación, ya que algunos tienen bajo nivel de conservación evolutiva, o niveles bajos de expresión (Sharp 2009). A la fecha hay otras clases de RNAs de reciente descubrimiento, con importantes funciones regulatorias, en la que su biogénesis, así como sus posibles funciones regulatorias, han sido de gran interés científico. Este es el caso de los RNAs circulares. (circRNAs) 2.2 RNA circulares Los RNA circulares (circRNA), consisten en una configuración circular, con un enlace fosfodiester 3´- 5´, que cierra la estructura,al no tener extremos libres, son moléculas más estables. Los circRNA son trascritos de cadena sencilla covalentemente cerradas, que son derivados de un precursor de RNA mensajero (premRNA) (Hsiao, Sun, and Tsai 2017). Estas estructuras de RNA, fueron descritas hace 40 años y en un principio se propusieron como formaciones secundarias debidas a un proceso de corte y empalme defectuoso. Uno de los primeros estudios acerca de circARN fueron realizados por Nigro y colaboradores, analizando el gen DDC, para el cual se detectaron isoformas mediante RT-PCR, amplificación y secuenciación(Nigro et al. 1991).Estudio posteriores se realizaron y se encontraron hallazgos similares, por ejemplo, en el gen Sry del ratón(Capel et al. 1993), y en los genes ETS-1 (Cocquerelle et al. 1992) y en el gen DMD (Surono et al. 1999) en humanos (Barrett and Salzman 2016). Con el avance la secuenciación de siguiente generación de RNA (RNAsec) se ha demostrado que su expresión es amplia a lo largo de todo el genoma. Uno de los primeros análisis utilizando esta tecnología, ocurrió analizando leucemia aguda linfoblástica en humanos, en las cuales se encontró expresión global de estas moléculas. También se observó en leucocitos de personas sanas y en otras líneas celulares (Salzman et al. 2012). Estos mismos resultados fueron comprobados con otros análisis bioinformáticas independientes (Barrett and Salzman 2016). 22 De acuerdo a análisis y descubrimientos posteriores, se han descrito las siguientes características que distinguen a los circRNA (Barrett and Salzman 2016): • Se encuentran altamente expresados. En fibroblastos se han identificado, mediante secuenciación de RNA, por los menos 25,000 de estas moléculas, derivados de por lo menos de 15% de genes que se transcriben activamente. Se determinó que estas moléculas exceden en por lo menos 10 veces a sus contrapartes lineales, principalmente dentro del sistema nervioso central (Jeck et al. 2013). • Expresión especifica según un tipo celular concreto. El análisis de los datos del consorcio ENCODE reveló que el repertorio de genes que expresan circARN, la tasa de transcripciones de moléculas circulares contra lineales para cada gen, e incluso el patrón de isoformas de empalme de los ARN circulares de cada gen fueron específicos de tipo celular (Salzman et al. 2013). También se ha observado que su expresión es amplia en todos los tejidos corporales, encontrándose una expresión alta en plaquetas, células endoteliales, plasma y suero (Maass et al. 2017). Además se ha comprobado la presencia de circRNA, ampliamente expresadas en el tejido cerebral, con una tasa de expresión alta respecto a su cognado lineal, Estas moléculas mostraron conservación en las especies estudiadas (Rybak-wolf et al. 2015; Sekar and Liang 2019) • Conservación, más alta de lo esperado entre humanos, ratas y ratones. Estudios han estimado que la fracción de ortología de circRNA ratones y humanos va de al menos el 5% hasta el 30% (Barrett and Salzman 2016). Por otra parte, para el caso de ratones se ha estimado que puede ser incluso del 66% de moléculas con ortólogos en humanos (Guo et al. 2014). Existe una alta conservación de los circRNA, particularmente en la secuencia de nucleótidos que se encuentra adyacente en donde se cerrara y formara la molécula, si se compara incluso, con los exones donde se llevara a cabo el empalme reverso (You et al. 2015). • Son moléculas demasiado estables, con vida media que supera las 48 horas. Se ha corroborado su presencia en exosomas lo que contribuye a una amplia distribución (Y. Li et al. 2015). Por otro lado se ha encontrado que resisten la degradación por RNAasas (Suzuki et al. 2006). 23 2.3 Biogénesis de los circRNA Los circRNA, son derivados de premRNA, los cuales son transcritos por la RNA polimerasa II (RNApolII). La forma más conocida en la biogénesis de los circRNA son las que dependen de la maquinaria que permiten el corte y empalme (spliceosoma). En el proceso de corte y empalme, se remueven intrones y se unen exones llevando a la formación de un ARN lineal en sentido 5´-3´. Su síntesis depende tanto de elementos reguladores en cis como coactivadores en trans. Particularmente, en los circARN, se pierden parte de las estructuras normalmente agregadas como parte del proceso de corte y empalme, como la adición de 7-metilguanilaro o la poliadenilación terminal (tallo de poly(a)) (Chen 2016). En el proceso de corte y empalme canónico, el exón ubicado en dirección 5´, libera un grupo hidroxilo de una guanina ubicada al final del exón (sitio donador), se forma un asa secundaria y posteriormente, este grupo hidroxilo realiza un ataque nucleofílico al fosfato ubicado en la primera guanina del exón ubicado en dirección 3´ (sitio aceptador). El evento permite que el “primer “exón en la secuencia se una con el exón que le continua. En los ARN circulares, es la disposición espacial lo que permite el corte y empalme reverso y la circularización de la molécula. En este proceso intervienen una clase de ARN especializados. Canónicamente es mediante la interacción de U2 snRNP y U1snRNP los que permiten un ARN lineal. En el corte y empalme reverso, se conserva U2snRNP, pero interactúa otro complejo denominado tri-snRNP (U4, U5, U6) (Starke et al. 2015). El proceso consiste, en que el exón ubicado hacia 3´, sea el que contribuya con el sitio donador, al liberar el grupo hidroxilo, y que el exón ubicado hacia 5´, sea al cual será dirigido el ataque nucleofílico. De esta manera se contribuye con un sitio aceptador, de manera inversa a la convencional. Esto crea que la molécula se plegue y forme un gran bucle, el cual puede contener intrones o incluso exones con intrones (Y. Wang and Wang 2015). Parte de la estabilización del bucle, es permitido gracias a que se forman por arriba del bucle, secuencias de ARN que se parean, de aproximadamente 20 – 40 nucleótidos (Liang and Wilusz 2014). El último paso dentro de la generación de circRNA, es la eliminación del intrón o intrones incluidos en el bucle, mediante mecanismos de corte y empalmen canónicos, o se pueden incluir y formar parte de la molécula de ARN circular. Por último, como parte del proceso de formación de estas moléculas covalentemente cerradas, se pierde parte de las secuencias necesarias para la adición, en el extremo 5´de la modificación de 7 metil guanina y del extremo 3´para la adición de colas de poli adeninas. A pesar de la pérdida de estas 24 moléculas de señalamiento, ganan resistencia a la degradación por las ARN asas H (Chen 2016). 2.4 Regulación de la expresión de circRNA Debido a que la formación de circRNA este acoplado al procesamiento directo de ARN lineales, hay ciertos factores que favorecen la síntesis de uno u otra molécula. Dentro de estos factores podemos mencionar la maquinaria que tiene que ver con el corte y empalme para generar el ARN maduro. En los ARN de estructura lineal, la polimerasa, que junto con los factores de corte y empalme ya comentados, tiene una mayor tasa de procesividad y de elongación, en comparación con los ARN de estructura circular (Ashwal-Fluss et al. 2014). Dentro de los elementos regulados en cis, se han encontrado que dentro de los exones donde se llevara a cabo la formación de estas moléculas, existen secuencias intrónicas que flanquean estas regiones, dentro de las cuales existen secuencias Alu. Estas secuencias son importantes, ya que permiten la formación de la molécula y para la estabilidad del bucle durante el procesamiento(Jeck et al. 2013; Zhang et al. 2014). Otro de los factores de suma importancia en la regulación de estos factores son proteínas de unión al RNA. El factor relacionado es el factor de corte y empalme unido al musculo (Mbl) por sus siglas en inglés. Este factor es importante para la regulación del corte y empalmealternativo. Se han encontrado que estos factores tienen múltiples sitios de unión en regiones flanqueantes de los exones que formaran el RNA circular. Se ha encontrado que estas permiten la formación de circRNA (Ashwal-Fluss et al. 2014). Otras proteína de unión al ARN de importancia para permitir la circularización del ARN son la proteína de unión al pre ARN mensajero “tambaleante” (QKI) y ADAR1 (Chen 2016). 2.5 Función de lo RNA circulares La principal función de los RNA circulares es la regulación de la expresión génica. Esta función dependerá de la estructura, localización y blanco de estas moléculas (Chen 2016; Huang et al. 2017). Además, se ha demostrado su importancia en células derivadas del tejido cerebral. Una de las primeras funciones descritas para los RNA circulares, es que actúan como “esponjas” de micro RNA (miRNA), es decir actúan como secuestradores de estas moléculas (Thomson and Dinger 2016). Esta regulación se realiza por los RNAcirc que se 25 originan por corte y empalme reverso que se encuentran en el citoplasma (Salzman et al. 2012). Se ha propuesto, que una de los primeras moléculas reportadas con esta función es la proteína 1 relacionada con degeneración cerebelar (CDR1as, por sus siglas en inglés)(Hansen et al. 2013). CDR1as tiene alrededor de 70 sitios de unión para el miR-7 y para proteínas tipo Argonauta. Tanto CDR1as como mir-7 son moléculas altamente expresadas en tejido cerebral, sobre todo en etapas que tienen que ver con su desarrollo embriológico. CDR1as regula negativamente a miR-7, y permite el adecuado desarrollo cerebral (Hansen et al. 2013; Memczak et al. 2013). También se ha encontrado que hay altos niveles de miR-7 en células B pancreáticas y se ha relacionado con secreción inadecuada de insulina y su implicación en el desarrollo de diabetes, y que la regulación a la baja de este micro ARN por CDR1as, aminora los efectos de la falla pancreática (Xu et al. 2015). Otro ARN circular con función de esponja es el que está relacionado con el gen murino Sry, este circular tiene 16 sitios blancos para unión de micro ARN 138. Sin embargo, la función específica de este circular no está del todo clarificada. Los circRNA, actúan entonces, en la regulación transcripcional de miRNA, que en comparación con otros reguladores, tienen más sitios de unión para su blanco, son altamente abundantes y estables (Chen 2016). Por otra parte, se reconocen que estas moléculas son capaces de regular la transcripción e incluso el proceso de corte y empalme. Se encontró que estas moléculas son capaces de unirse a los promotores de los genes lineales a los que les dieron origen, y que potencian la transcripción de este gen (Z. Li et al. 2015). Otra de sus funciones es servir como adaptador en interacciones proteína – proteína. El circFOXO3 acopla y permiten la función del complejo CDK2 y p21, al igual que la interacción de MDM2 y p53, todas muy importantes para la regulación del ciclo celular (Du et al. 2017). 2.6 Relación de RNA circulares con expandidos microsatélites Diversos estudios han analizado la presencia de RNA circulares en diversos tejidos. Se ha encontrado que estas moléculas tienen una alta tasa de expresión en el tejido cerebral. Además se demostró que tiene implicaciones importantes en el desarrollo neuronal, formaciones dendríticas, así como en la neuroplasticidad (You et al. 2015). Por otro lado también se han identificado que estos RNA tienden a expresarse en todo el cerebro, aunque hay regiones específicas, como lo son la corteza frontal, el lóbulo occipital y el diencefalo donde se expresa más (Sekar and Liang 2019). Además de corroborar su alta 26 expresión en tejido cerebral, se ha comprobado que la expresión de varios ARN circulares se conservan entre ratones y drosophila. (Rybak-wolf et al. 2015). El circRNA más ampliamente relacionado con enfermedades degenerativas del sistema nervioso central es CDR1as, el cual se ha visto implicado en enfermedad de Alzheimer, Enfermedad de Parkinson así con en enfermedades por priones (Lu et al. 2019). Hay pocos estudios dirigidos en relación con expandidos microsatélites y moléculas circARN. De los trabajos recientes se encuentran los de Witkos y cols. Ellos realizaron un análisis in silico, donde describen la relación de expandidos microsatélites, su asociación con diversos micro ARN, así como su asociación con ARN largos no codificantes. Debido a su representación en el genoma, así como por su tamaño, se encontró que ARN circulares se asociaban a diversos expandidos como son GAA, CGG, CUG y CAG, siendo este último uno en los que se obtuvo mayor representación. Se observó además que estos se asocian más de una vez con elementos de respuesta a micro ARN, los cuales son importantes ya que permiten la degradación de su ARN blanco. Concluyen que estos ARN circulares sirven como una vía de enlace importante entre todos estos ARN (Witkos et al. 2018) 27 III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA La Enfermedad de Huntington es la enfermedad neurológica de origen genético más frecuente en el mundo y se sabe que es una importante causa de consulta en Institutos con Especialidad en Neurología. Es una enfermedad crónica degenerativa y causa paulatinamente un deterioro en la calidad de vida y finalmente conlleva a la muerte. Actualmente se conocen los mecanismos moleculares centrados en el daño patológico, principalmente orientados en el expandido de CAG anormal que dará origen a tractos de poliglutaminas. Así mismo se ha usado esta base molecular de la enfermedad para demostrar si el paciente es portador de la mutación y si desarrollara o transmitirá la enfermedad. Sin embargo, no predice en la totalidad, como se comportará la enfermedad, su evolución o incluso la respuesta al tratamiento. Hay mecanismos moleculares que pudieran impactar como genes modificadores, que aún no han sido descritos y explorados en Enfermedad de Huntington. Algunos grupos de investigación han realizado estudios para determinar los mejores predictores que detecten a los pacientes en etapas preclínicas de la enfermedad y pronosticar su evolución. La mayoría de estos estudios, y de los que se conocen mejores resultados, se enfocan en métodos de imagen, como lo es resonancia magnética, PET o estudios funcionales, sin embargo, su aplicación y alcance pudieran llegar a ser limitados. 28 IV. JUSTIFICACION A pesar de conocer aspectos importantes genéticos y sus consecuencias finales para el desarrollo de la enfermedad, aún existen limitaciones significantes que involucran nuestro conocimiento total hacia mecanismos que expliquen la evolución e historia natural de la enfermedad. En la actualidad, diversos ARN no codificantes han sido blanco de observación por la comunidad científica, ya que además de presentar funciones regulatorias, han sido blancos de estudios como marcadores pronósticos de la enfermedad, así como potencial blanco terapéutico. En este campo han entrado los ARN circulares, las cuales presentan ciertas ventajas, ya que se encuentran en gran abundancia, su degradación es más lenta, se producen como mecanismo de corte y empalme alternativo de su ARN mensajero y tienen funciones regulatorias importantes. Muchas de estas moléculas han sido relacionadas con diversas enfermedades, como lo son las relacionadas con procesos oncológicos o en enfermedades de origen multifactorial. Sin embargo, han tenido un papel importante en enfermedades crónico-degenerativas de origen neurológico como lo son la enfermedad de Parkinson o la enfermedad de Alzheimer. Aunque poco estudiadas en enfermedades por amplificación de microsatélites, la implicación de algunas de estas RNA circulares se ha demostrado en distrofia miotónica. Sin embargo, este mecanismo no se ha corroborado en expansión demicrosatélites que codifican para tractos de poliglutamina, como lo es el caso de enfermedad de Huntigton. La relación de la expresión circRNA con tracto de CAG, pudiera ser un factor que pudiera explicar ciertos mecanismos moleculares que pudieran tener como consecuencia impacto en el pronóstico y evolución de la enfermedad. A la fecha no hay algún estudio en el que se relacione algún ARN circular con historia natural de la enfermedad y su relación con la expansión de CAG en el gen HTT. 29 V. PREGUNTA DE INVESTIGACION ¿Cuál es la relación que existe entre un patrón de expresión diferencial de ARN circulares y la expansión del trinucléotido CAG en Htt en un modelo celular murino para enfermedad de Huntigton? VI. HIPOTESIS Existe una relación en la presencia de cierto grupo de ARN circulares que se relacionan con la presencia de una expansión patológica de trinucléotido CAG en el gen Htt en un modelo celular murino para enfermedad de Huntington. 30 VII. OBJETIVO GENERAL 1. General: Determinar si existe un patrón de expresión diferencial de RNA circulares asociados a la presencia de Htt mutante un modelo celular murino de enfermedad de Huntington 2. Específicos: - Obtener y comparar los perfiles de expresión de RNA circulares mediante utilizando el Rat Circular RNA Microarray V2.0 de Arraystar, con un modelo celular de enfermedad de Huntington con repetidos de 23 y 74 para CAG - Analizar regiones de interacción entre circRNA diferencialmente expresados con sus posibles miRNA blancos - Explicar posibles vías de interacción entre el expandidos patológico de huntingtina, el gen de origen del circRNA y su relación con miRNA blancos 31 VIII. MATERIAL Y MÉTODOS El presente estudio se realizó en colaboración entre el servicio de genética del Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía, y el departamento de genética y medicina genómica del Instituto Nacional de Rehabilitación 1. Diseño de estudio Investigación básica, estudio observacional, transversal. 2. Cultivo celular En el presente estudio se utilizaron células modificadas PC12, donadas por la Universidad de Cambridge, Dr. David Rubinsztein. El constructo se muestra en la figura 7.1. Estas células provienen del organismo Rattus norvegicus, con origen en el tejido de feocromocitoma en glándulas adrenales. Existen dos poblaciones celulares. Estas células tienen en el exón 1, repetidos CAG que codificarán para un tracto de 23 glutaminas (población celular PC12Q23, las cuales serán nuestras células control) y tractos CAG que codifican para 74 tractos de glutaminas (población celular PC12Q74, células problema). Ambos tipos celulares, tienen además dentro de su constructo, secuencias que permitirán la traducción de la proteína verde fluorescente (PVF), que nos servirá con proteína marcadora de expresión cuando se analicen con microscopio de florescencia (Wyttenbach 2001). FIGURA 7.1: Constructo del modelo celular del gen Htt . TRE: elemento respondedor de tetraciclina, Q23 o Q74 tamaño de unidad de repetidos CAG, PVF proteína verde fluorescente, Htt huntingtina. 32 La expresión tanto de PC12Q23 y PC12Q74 fue inducida por un activador transcripcional en el promotor, tipo Tet-on, al estar expuesta al antibiótico doxiciclina, el cual solo bajo estas condiciones permite la expresión de la proteína huntingtina. El medio de cultivo necesario, según las recomendaciones del Dr. David Rubinsztein tuvo las siguientes características: medio de cultivo Dubelco¨s Modified Eagle Medium, (DMEM) alto en glucosa, suplementado con L-glutmanina 2mM, higromicina 75ug/ml, 100 U/ml de penicilina/estreptomicina, 10% de suero de caballo inactivado por calor, 5% de suero bovino fetal y 100ug/ml de G418. 2.1 Primer cultivo celular de células PC12 Q23 y Q74 El esquema general del cultivo celular se muestra en la figura 7.2. 1.- Se etiquetaron 2 cajas Petri de 10 mm de diámetro, una para las células Q23 y otra para las células Q74 2.- Se colocan 12 ml del medio de cultivo completo en cada caja de Petri. 3.- Se vació el contenido celular correspondiente en cada caja previamente etiquetada 4.- Se guardan a 37°C con 5% de C02 2.2 Subcultivos de líneas celulares PC12 Q23 y Q74 Después de 48 horas en cultivo, se observó crecimiento celular bajo el microscopio. Cuando las células alcanzaron aproximadamente el 80 – 90 % de confluencia celular, se realizaron los subcultivos. Se realizaron un total de 10 pases para ambos tipos celulares. Los siguientes pasos se realizaron por separado para cada línea celular. El conteo celular se realizó por cada subcultivo y por cada tipo celular, mediante un hemocitometro. Las células se contaron de la siguiente manera: el número de células observadas en 4 cuadrantes y se obtuvo un promedio, al cual posteriormente se le multiplico por el factor de dilución. Esta cantidad se utilizó para sembrar un número específico de células en cada uno de los subcultivos realizados. 1.- Se aspiró medio de cultivo 2.- Se lavó con 4 ml de PBS la caja, se agito ligeramente, se aspiró y se desechó. 3.- Se colocarón 2 ml de tripsina a concentración 1x, se agito ligeramente. Posteriormente se dejó durante 7 minutos a 37 °C 4.- Se golpeó ligeramente la caja, para ayudar a separar a las células de la caja de Petri. 33 5.- Se tomaron 2 ml de medio de cultivo completo y se vertió el contenido en las paredes de la caja, tratando de ayudar a separar el mayor número de células, procedimiento que se repitió 3 veces 6.- Se colocó el contenido en un tubo de 12 ml, al cual finalmente se le agregó 6 ml de medio de cultivo completo 7.- Se procedió a realizar el conteo del número de células. 5.- Del subcultivo 1 y 2 solo se buscó el crecimiento de ambos tipos celulares. Por lo que se realizaron 2 cajas para PC12Q23 y 2 cajas para PC12Q74. El número de divisiones celulares se calculó con la formula #PD= (log10 cosechadas-log10 iniciales) / 0.301, en la cual se obtuvo 2.6 divisiones en 5 días, por lo tanto, el tiempo en que mantuvimos vigilancia la confluencia celular fue de 24 a 48 horas. 6.- Del subcultivo 3 al 10, se indujo la expresión de la proteína huntingtina. Los grupos PC12Q74 y Q23 con dox, a las cuales se les agrego doxiciclina a una concentración de 1ug/ml, para cada caja en el subcultivo. Se realizaron 2 cajas Petri por cada tipo celular. Los grupos PC12Q74 y Q23 sin doxicilina, se subcultivaron en 1 caja Petri por cada tipo celular. 6.- Se guardaron a temperatura de 37°C a una concentración de C02 de 5%. Se vigiló el crecimiento celular. 2.3 Preparación de placa de 6 pozos para detección de expresión PVF asociada al tracto de poliQ mediante microscopio de florescencia. 1.- Se rotularon pozos, utilizando 3 para células PC12Q74, 2 de estos pozos con células inducidas con doxiciclina, y 1 pozo sin inducir. Se prepararon pozos de la misma manera para PC12Q23 2.- A cada pozo se le agregaron 3 ml de medio suplementado. En cada pozo se sembraron aproximadamente 100 ul con 100 mil células según el tipo celular rotulado. Adicionalmente se agregó una concentración de 1ug/ ml para los pozos ya indicados. Se guardó a 37°C a 3.9 CO2 en cámara de cultivo. Se vigiló hasta alcanzar una confluencia de aproximadamente 70 a 80%. 3.- Se visualizaron células en microscopio invertido de florescencia CARL Zeiss AX10 Observer 1. Se tomaron fotografías a cada pozo 34 2.4 Preparación de tubos para realizar extracción de RNA circulares. Para ambos tipos celulares se utilizaron 1,500,000 células con doxiciclina. Se utilizaron células del pase 6. 1.- Se colocaron en tubo de 1.5 ml, 1.3 ml de células de suspensión de cada tipo celular. Se
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