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UNIVERSlOAD NACIONAL AUTÓNOMA DE fIIÉJ<ICO FIICUUAD DE IIIEOICIIM. DMSION DE ESruDl08 DE PQ!lCRAOO HOSPIT ... L INF ... mIL DE MIOxICO FEDERICO GóIllEZ PARA OBTEIOER EL TITULO DE ESPECIALISTA EN: {]~ÉnCA MÉDICA PRESENTA., 1lR1I. DU\NA INGRlD 1'l11ll:RA MARTÍNl:Z UL1<ECI1.JI<.', j)E TL:>l:; ORA Y¡;R6~KlI fABIOL\ MOR.\_l" BAltiWSO ASESOR DE TESIS: DRA. COHSTAHZA GARCiA DRGADO M. en C. EDGAN RICARDO VAzQUEZI1IARl iNEZ FESRERO ~013 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 2 DIRECTORA DE TESIS: . /< /'"' 1 / /' )Lth/1 í:d4bL ~L/ /;k¿,~ / Dra . Verónica já/biola Morán Barroso Profesor Titu lar de la Especialidad de Genética Médica Hospita l Infantil de México Federico Gómez ASESORES DE TESIS: &~ ¿¿. ~ &I~- Dr~onstlnza García Delgado Profesor Adjunto de la Especialidad de Genética Médica Hospital Infantil de México Federico Gómez M . en C. Edgar Ricardo Vázquez Martínez Facultad de Química UNAM Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 3 Índice Pág. Agradecimientos 4 Resumen 5 Antecedentes 7 Historia 10 Características clínicas 11 Características moleculares 21 Métodos diagnósticos 25 Asesoramiento genético 26 Planteamiento del problema 27 Justificación 28 Objetivos 29 Material y métodos 30 Resultados 35 Discusión 53 Conclusión 56 Bibliografía 57 Anexos 64 Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 4 AGRADECIMIENTOS A la Vida y a Dios, por permitirme llegar. A mis padres, Juan José Rivera Grijalva y Rosa María Martínez Castillo, por su apoyo incondicional, su amor, sus apapachos, sus sabios consejos, por ayudarme a ser quien soy. A Claudia, mi hermana, y a la nena más linda, Andrea. Al amor de mi vida, Juan Luis, por todo lo que me has enseñado en el camino que hemos recorrido juntos y que sin duda sé que sin ti no lo habría logrado. A la Dra. Verónica Morán y a la Dra. Constanza García Delgado por todo lo que hacen y siguen haciendo por mí. A Adriana, Edgar y Benjamín, por su asesoría, enseñanzas, ayuda y gran apoyo durante la realización de la presente tesis. Especialmente a la Dra. Ortiz de Luna y al Dr. Flores por todas y cada una de las cosas que me enseñaron y sobre todo por enseñarme a amar a la Genética con pasión. A todos los pequeñitos que con un “piquete de abejita” nos dieron las herramientas para abrir las puertas hacia su diagnóstico. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 5 RESUMEN Antecedentes: El síndrome de Alagille (SAG) (OMIM #118450), es una enfermedad que afecta diferentes sistemas, las manifestaciones clínicas son: hipoplasia de conductos biliares intrahepáticos, (manifestada como colestasis), facies característica, cardiopatía congénita, alteraciones oftalmológicas y alteraciones esqueléticas. Mutaciones en el gen JAG1, son responsables de hasta el 94% de los casos de síndrome de Alagille. La proteína para la que codifica, participa como ligando para activar la vía NOTCH la cual es indispensable durante la embriogénesis de estructuras como ojo, riñón, corazón, hígado, vasos sanguíneos. Por lo anterior, se planteó la siguiente Pregunta de investigación: ¿Cuáles son las características clínicas y cuál es la correlación con las mutaciones identificadas en los pacientes con diagnóstico clínico de SAG atendidos en el HIMFG? Justificación: El diagnóstico de SAG está basado en las características clínicas, dichas características tienen expresividad variable y pueden no estar presentes desde el nacimiento, el estudio molecular del gen JAG1 es una herramienta que permite incluir el diagnóstico molecular en el asesoramiento genético, además de un tratamiento oportuno y enfocado a la patología de base. En México, no se ha descrito la identificación de mutaciones en el gen JAG1 ni su relación con el fenotipo. Objetivo General: Analizar las características clínicas presentes en pacientes mexicanos con diagnóstico clínico de SAG y en aquellos con diagnóstico molecular de certeza atendidos en el HIMFG. Material y métodos: Estudio descriptivo y transversal, se revisaron pacientes con diagnóstico de SAG, enviados de las consultas de Genética y Trasplantes, se investigaron antecedentes familiares, las manifestaciones clínicas compatibles con SAG. A los pacientes con diagnóstico compatible con SAG se les invitó a participar en el estudio. En 3 pacientes se tomó una muestra de 1 ml de sangre periférica, previa firma de consentimiento informado, se extrajo DNA genómico, se amplificó por PCR los 26 exones del gen JAG1, se realizó dHPLC y secuenciación de los fragmentos amplificados de interés, para identificar cambios en la secuencia del gen. Se revisaron las características clínicas de pacientes diagnosticados con SAG y en quienes se realizó estudio molecular previamente en nuestro laboratorio y se compararon las características clínicas y las mutaciones previamente reportadas. Resultados: Se revisaron 15 expedientes de pacientes que tenían diagnóstico clínico de SAG, de los expedientes se obtuvo la información acerca de los antecedentes familiares. Los 15 pacientes analizados presentaron colestasis crónica. Se analizaron 3 pacientes con dHPLC; de los 11 pacientes previamente analizados para secuenciación (Vázquez Martínez E. et al), 7 presentaron mutación en JAG1, 4 fueron negativos para la mutación. Los 3 pacientes analizados con dHPLC presentaron cambios en los patrones cromatográficos en diferentes fragmentos. En los pacientes con mutación en JAG1, las características clínicas más frecuentes fueron las alteraciones hepáticas y cardiacas y la facies característica y las menos frecuentes fueron las alteraciones oftalmológicas, vertebrales y renales. Discusión: El análisis clínico y Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 6 molecular de los 11 pacientes demostró que la frecuencia de las características clínicas de los pacientes en los que se demostró mutación corresponde a lo previamente reportado en la literatura, en la mayoría de los estudios realizados a la fecha, se ha encontrado que las alteraciones más frecuentes son las alteraciones hepáticas y cardiacas. De los 4 pacientes negativos, uno cumplía criterios diagnósticos para SAG, por lo que podemos pensar que se trata de una deleción completa del gen o mutaciones en el gen NOTCH2; en dos pacientes su diagnóstico final fue diferente al de SAG, Colestasis intrafamiliar de Byler y Atresia de vías biliares. Conclusión: En los pacientes mexicanos que presentaron mutaciones en el gen JAG1 las características más frecuentes corresponden a lo previamente reportado en la literatura. De los pacientes negativos deben descartarse alteraciones en el gen NOTC2. No se logró establecer relación fenotipo-genotipo. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 7 ANTECEDENTESEl síndrome de Alagille, (SAG; OMIM #118450), también conocido como displasia arteriohepática o hipoplasia de los conductos biliares sindrómica (Alagille et al, 1987). Fue reportada por primera vez, en 1969 por Daniel Alagille, quien hacía énfasis en las manifestaciones hepáticas. Posteriormente, en 1973, Watson y Miller se enfocaron en las manifestaciones cardíacas (Watson et al, 1973). En 1975, Alagille describe formalmente el síndrome y estableció los criterios diagnósticos (Alagille et al, 1987). El SAG es una enfermedad autosómica dominante, con una expresión fenotípica muy variable, que afecta primariamente a hígado, corazón, ojos, cara y sistema esquelético. Tiene una prevalencia reportada de 1 en 70,000 recién nacidos vivos (Turnpenny et al, 2012). El diagnóstico de SAG se basa en la presencia de disminución o hipoplasia de los conductos biliares intrahepáticos observado en la biopsia hepática en asociación con al menos tres de los criterios clínicos mayores (Kamath et al, 2003), los cuales son: Colestasis crónica. Cardiopatía congénita (estenosis pulmonar). Facies característica (Frente amplia, enoftalmos, nariz recta con punta bulbosa y mentón triangular). Anomalías esqueléticas (vértebras en mariposa). Anomalías oculares (embriotoxón posterior). También se pueden presentar con craneosinostosis, anomalías de los vasos intracranianos, anomalías renales y pancreáticas y la presencia de un pliegue digital de flexión supernumerario (Kamath et al, 2003). El SAG es causado por mutaciones o deleciones en el gen JAG1, que se encuentra en el locus 20p12, y por mutaciones en NOTCH2, localizado en 1p13-p11 (Turnpenny et al, 2012). Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 8 Las mutaciones en JAG1 representan alrededor del 94% de los pacientes con SAG (Turnpenny et al, 2012). Se considera que las mutaciones en NOTCH2 son <1% de los pacientes, en estudios recientes (Kamath et al, 2012) suponen que las mutaciones en NOTCH2, están presentes en pacientes con características clínicas de SAG que no presentan mutaciones en JAG1. Los productos proteicos de JAG1 y NOTCH2, son ligando y receptor respectivamente, de la vía NOTCH (Gridley, 2003). La vía de señalización de NOTCH es una vía altamente conservada durante la evolución, es necesaria durante la embriogénesis así como en la vida adulta. Participa en mecanismos de proliferación celular, apoptosis y destino celular (Rampal et al, 2007). El locus genético de Notch, fue descrito en una mutación letal ligada al sexo en Drosophila, donde las hembras presentaban muescas en las alas (Ferretti et al, 2005). Posteriormente, Notch fue caracterizada como un “locus neurogénico”, ya que las mutaciones en Notch resultaban en cambios profundos en la decisión de destinos celulares durante la neurogénesis. Notch ha sido caracterizado en una amplia variedad de metazoarios desde C.elegans a los humanos. Los mamíferos, tienen 4 receptores Notch (Notch 1-4). La importancia de Notch en mamíferos está marcada por la observación de que los ratones homocigotos para mutaciones en Notch1 o Notch2 fallecen antes del día 11.5 de la embriogénesis (Rampal et al, 2007). La importancia de la vía NOTCH en humanos está claramente demostrada por las numerosas patologías, en las cuales la vía ha sido implicada. Además del SAG se encuentran la disostosis espondilo-costal, CADASIL (arteriopatía cerebral autosómica dominante con infartos subcorticales y leucoencefalopatía), leucemia de células T, esclerosis múltiple y otras formas de cáncer (Rampal et al, 2007) Todos los receptores-ligandos de la vía NOTCH comparten estructuras comunes, que incluyen un dominio extracelular amino terminal conservado llamado DSL (Delta-Serrata-Lag2), un número variable de repetidos EGF-like (del inglés Epidermal Growth Factor ó factor de crecimiento epidermal), un sólo Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 9 dominio transmembrana y un dominio citoplasmático especifico para cada ligando (Niessen et al, 2010), (Fig. 1). Vía canónica de señalización NOTCH Fig. 1. La vía de Notch se inicia con la interacción del ligando de la célula señalizadora y el receptor de la célula receptora. La interacción ligando receptor resulta en 3 eventos de corte. Estos resultan en la liberación del dominio intracelular del receptor de Notch y su subsecuente translocación al núcleo, donde se une y cambia a CSL de actuar como un represor transcripcional a un activador transcripcional. Modificado de Niessen et al 2010. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 10 HISTORIA Daniel Alagille, en 1967, junto con sus colaboradores del Hospital Bicêtre, describió en la revista Journées Parisiennes de Pédiatrie, por primera vez un grupo de niños con hipoplasia de ductos intrahepáticos pero ductos extrahepáticos presentes (Claude et al, 2006). En 1973, Watson y Miller, describieron una serie de niños con colestasis crónica, e hicieron mención de la asociación con cardiopatía congénita, facies característica y anomalías esqueléticas menores. En descripciones posteriores, Greenwood et al, 1976, Henriksen et al, 1977, Riely et al, 1978, Levin et al 1980 y Mueller et al, 1984, se enfocaron en describir las anomalías oftalmológicas, renales y tratar de especificar tipos de cardiopatía y las alteraciones esqueléticas que observaron (Krantz et al, 1997). En 1997 Li et al estimó que menos del 7% de los pacientes con SAG tienen deleciones en 20p12. Oda et al y Li et al, en 1997, demostraron que la mutación causante del síndrome de Alagille se encontraba en el gen JAG1 (Oda et al, 2000). Gray et al, 1999, demostró por análisis de Northern blot que JAG1 se expresaba en corazón, placenta y riñón, así como una menor expresión en pulmones, músculo esquelético y páncreas respecto a los primeros. Loomes et al, 1999, demostró que JAG1, se expresa en el corazón en desarrollo y en múltiples estructuras vasculares. Loomes et al, 2002 encontró que JAG1 se expresaba en células adyacentes a aquellas que expresan NOTCH2, sugiriendo una posible interacción ligando-receptor. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 11 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS DEL SÍNDROME DE ALAGILLE Previo al establecimiento del locus del gen JAG1 se realizaron estudios clínicos donde se trató de establecer las características clínicas más comunes presentes en el SAG. En los diferentes estudios realizados, a lo largo del tiempo, las características clínicas más prevalentes son las alteraciones hepáticas, las alteraciones cardiacas y la facies característica (Tabla 1). Tabla 1. Hallazgos clínicos en pacientes con SAG. Modificado de Krantz et al, 1997. Estudio H/M Hígado Corazón Ojo Vertebral Facies Otros Henriksen et al 1977 4/2 6/6 6/6 ¿? 5/6 6/6 RM 1/6 Riely et al, 1979 4/1 5/5 4/5 5/5 5/5 5/5 Falange distal corta 4/5. Acortamiento cubital 3/5, Renal 2/5, Hipotiroidismo 1/5. Levin et al, 1980 2/3 5/5 5/5 ¿? 3/5 5/5 Alt. Pulgar 2/5 Berman et al, 1981 0/3 3/3 3/3 1/3 3/3 3/3 ARJ 1/3. Dahms et al, 1982 5/1 6/6 6/6 0/6 1/6 6/6 Clinodactilia 4/6 Mueller et al, 1984 3/4 7/7 7/7 2/3 4/5 3/7 RM 2/3 Depreltere et al, 1987 16/11 25/27 26/27 9/16 6/18 19/27 Alagille et al, 1987 ¿? 73/80 68/80 55/62 70/80 76/80 Renal 17/23 RM 16% Krantz et al, 1998 28/23 56/56 44/44 34/41 29/53 40/40 Renal 13/56 Emerick et al, 1999 ¿? 92/92 62/92 72/92 47/92 88/92 Lykavieris et al, 2001 ¿? 163/163 30/163 137/163 129/163 158/163 Kamath et al, 2003 22/31 34/34 28/34 21/28 18/28 31/32 Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndromede Alagille atendidos en el HIMFG 12 Facies característica: El fenotipo característico del SAG fue descrito en 1975 por Alagille et al, lo refirió como frente amplia y prominente, mandíbula puntiaguda y punta de la nariz bulbosa, dentro de la descripción inicial se incluyeron grados variables de acortamiento de los dedos (Alagille et al, 1987). De manera universal se describe como frente amplia y prominente, ojos profundos (enoftalmos), nariz recta con punta bulbosa, maxilar inferior prominente con mentón triangular, dando la apariencia de un triángulo invertido (Fig. 2.). Fig. 2. Facies característica del SAG. Tomado de Turpenny et al, 2012. Alteraciones oftalmológicas: En el SAG, la característica oftalmológica más reportada, es la presencia de embriotoxón posterior (Fig. 3.), que se observa como una línea blanca que corresponde a una prominencia y desplazamiento anterior de la línea de Schwalbe y que se puede observar con mayor claridad en el lado temporal de la córnea con lámpara de hendidura o gonioscopia. El 15% de los individuos aparentemente sanos pueden presentar el embriotoxón posterior de manera aislada. También se han reportado drusas del nervio óptico y se detecta con ultrasonido ocular, angiografía fluorescente y en estudios postmortem (Kim et al, 2007) Otras manifestaciones oculares menos frecuentes son xantelasma, estrabismo, tinte ictérico en escleras, queratocono, anomalía de Axenfeld (embriotoxón Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 13 posterior con bandas iridocorneales), nódulos estromales en el iris, cataratas posteriores polares, hipoplasia del nervio óptico, discos inclinados, copas ópticas pequeñas, vasculatura anormal del disco, alteraciones del pigmento de la retina, miopía leve a moderada e hipoplasia macular (El-Koofy et al, 2011). Fig. 3. La flecha muestra embriotoxón posterior. Tomado de Turnpenny et al, 2012. Bao et al en 1997, establecieron que Jagged se expresa en la retina neural, cuerpo ciliar y cristalino. Los ratones homocigotos para el alelo nulo presentan alteraciones del segmento anterior, tales como coloboma del iris u opacidad corneal, pero no se han encontrado fenotipos similares a SAG (Kim et al, 2007). La función de la vía de Notch durante la formación del cristalino, se ha observado durante la formación e inicio del crecimiento de la vesícula que contiene al cristalino a través de la activación sinérgica de Foxe3 (Kim et al, 2007). Alteraciones Cardíacas: La alteración cardíaca más prevalente en SAG es la estenosis periférica de la válvula pulmonar, aunque se ha reportado que un 13% de los pacientes puede presentar tetralogía de Fallot (Bauer et al, 2010). El análisis de mutaciones en Jagged1 ha permitido establecer que el fenotipo observado se debe en algunos casos a la pérdida completa de Jagged1 y en otros, a mutaciones que inactivan su función (mutaciones de sentido equivocado o mutaciones sin sentido) (Niessen et al, 2008). Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 14 La haploinsuficiencia de Notch2, en modelos murinos, resulta en alteraciones renales e hipoplasia miocárdica, pero el fenotipo no asemeja los hallazgos cardiovasculares y renales presentes en los pacientes con SAG (Rampal et al, 2007). Por otra parte, los ratones dobles heterocigotos para los alelos Jagged1-nulo y Notch2-hipomórfico desarrollan ictericia, alteración en el desarrollo de los conductos biliares con asociación con anomalías de ojo, corazón y riñón (Niessen et al, 2008). Además la deficiencia de Hey2, en ratones, resulta en alteraciones cardiovasculares incluyendo tetralogía de Fallot y estenosis de la válvula pulmonar, sugiriendo que el eje de señalización de Jagged1, Notch2 y Hey2 está involucrado en el desarrollo del SAG (Niessen et al, 2008). El mecanismo por el cual se origina la estenosis valvular pulmonar aún no ha sido completamente establecido, aunque se ha relacionado con el papel de Notch en la regulación de la transformación endotelio a mesénquima en los cojinetes cardíacos. (Niessen et al, 2008). Otra posibilidad es que la estenosis pulmonar periférica en pacientes con SAG es causada por defectos en la señalización entre las capas de tejido de músculo liso y endotelio mediado por la expresión endotelial de Jagged1 en la vasculatura pulmonar (McElhinney et al, 2002). Alteraciones Hepáticas: Las manifestaciones hepáticas, están dadas principalmente por la hipoplasia de los conductos biliares intrahepáticos, lo que ocasiona colestasis crónica, la cual se considera el criterio clínico más importante para considerar al SAG. La hipoplasia de los conductos biliares se puede observar únicamente con la realización de biopsia hepática. (Krantz et al, 1997). Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 15 Existen diversas vías de señalización reguladoras del desarrollo de la vía biliar (Tabla 2). Tabla 2. Vías de señalización y su función. Modificada de Zong et al 2011 Vía de señalización Función en el desarrollo de la vía biliar intrahepática Notch Promueve la diferenciación biliar y la tubulogénesis. TGFβ Promueve la diferenciación biliar. Wnt/β- catenina Estimula la proliferación de los hepatoblastos y la diferenciación biliar. El desarrollo de la vía biliar intrahepática de manera normal requiere diversos pasos de diferenciación y morfogénesis (Fig. 4.): 1. Los hepatoblastos periportales son inducidos para diferenciarse en precursores de colangiocitos, formando anillos llamadas “placas ductales” alrededor de las ramas de la vena porta. 2. Se forman unas estructuras tubulares, cerca de las placas ductales, que darán origen a los conductos biliares. 3. Los precursores que fallan en ser incorporados en los conductos biliares regresan dejando los ductos maduros en su lugar. Desarrollo de los conductos biliares intrahepáticos Fig. 4. A) Los hepatoblastos (rojo) periportales son inducidos para diferenciarse B) en precursores de colangiocitos (verde), C) estos forman estructuras anulares conocidas como placas ductales alrededor de las ramas de la vena porta, D) después se forman estructuras tubulares de las cuales se originarán los E) ductos biliares. Modificado de Zong et al, 2011. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 16 Cuando se induce in vitro la vía de señalización de Notch en células progenitoras de hígado, resulta en la sobrerregulación de los marcadores biliares como Sox9 y la vía de señalización TGFβ. Los marcadores indican diferenciación celular (Zong et al, 2011) En modelos murinos, la deleción condicionada de RBPJ, un componente esencial de la vía de Notch, ocasiona una reducción de las células biliares epiteliales en el día 16.5 de la embriogénesis (Zong et al, 2011). La expresión incorrecta de formas activas constitutivamente de Notch1 o Notch2, es suficiente para inducir la diferenciación celular biliar ectópica y formación de túbulos (Zong et al, 2011). Dado que la activación de la vía de Notch requiere contacto célula-célula, las fuentes de ligandos de Notch durante la inducción de la placa ductal son las células endoteliales cercanas a las venas portales asociadas al mesénquima portal. Jag1 es expresado primero en las células epiteliales portales y su expresión se expande hacia las células mesenquimales así como a las células biliares precursoras. Este patrón de expresión es un proceso de dos pasos por los que los ductos biliares se desarrollan (Zong et al, 2011). La expresión de Jag1 a nivel de proteína en endotelio/mesénquima, inicia con la señalización de Notch en los hepatoblastos colocándose uno al lado del otro. Estascélulas, que forman la primera capa de la placa ductal expresan Jag1 e inducen a los hepatoblastos adyacentes a “adoptar” la programación biliar. La tubulogénesis, acompaña la inducción de la segunda capa (Zong et al, 2011). La colestasis crónica resulta de la reducción en la síntesis de las sales biliares o de la obstrucción intra o extrahepática para la excreción de los componentes biliares. La incidencia de la colestasis es de 1 en 2500 nacidos vivos y es la manifestación principal de una enfermedad hepatobiliar (Carlton et al, 2004) En el SAG, las manifestaciones hepáticas inician en los primeros meses de vida, sin embargo, la presentación de éstas puede variar. La ictericia puede ser temporal, intermitente o persistente, acompañada de prurito que generalmente inicia a los 6 meses de edad y se puede acompañar de xantomas (depósitos de colesterol), hasta falla hepática (Sepúlveda et al, 1999). La Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 17 ictericia se acompaña de elevación de bilirrubina en sangre, además de elevación de enzimas como fosfatasa alcalina y gammaglutamil transferasa y elevación de colesterol. La colestasis crónica ocasiona falla en el crecimiento (Krantz et al, 1997). En el estudio histológico, el hígado se caracteriza por una disminución en el número de conductos biliares en relación con espacios porta, ésta será menor de 0.4 (Normal 0.9-1.8). También se puede encontrar fibrosis de grado variable (Sepúlveda et al, 1999). Cuando las alteraciones hepáticas progresan hasta la cirrosis o la falla hepática, es necesaria la realización trasplante hepático, esto ocurre en alrededor del 25% de los pacientes (Englert et al, 2006). Alteraciones Renales: Las alteraciones renales más frecuentemente asociadas al SAG son poliquistosis renal medular, falla renal, displasia renal bilateral, riñón en herradura, agenesia renal y la dilatación pielocaliceal (Harendza et al, 2005). Notch2 tiene un papel fundamental durante el desarrollo del túbulo proximal y el glomérulo durante la segmentación de la nefrona. La activación de Notch1 participa en menor proporción durante el desarrollo del riñón por lo que muy probablemente requiere de la activación de Notch2 (McCright et al, 2003). Un factor de transcripción que funciona como regulador de la morfogénesis de los ductos biliares es, HNF1β (factor nuclear del hepatocito β1), que se ha relacionado con la presencia de quistes renales. Por lo que los pacientes con mutaciones en NOTCH2, es más frecuente que presenten alteraciones renales (Turnpenny et al, 2012). Alteraciones Esqueléticas: Dentro de las manifestaciones esqueléticas del SAG, se pueden encontrar vértebras en mariposa, hemivértebras, agenesia de sacro, braquidactilia y craneosinostosis, aunque la más frecuentemente reportada son las vértebras en mariposa (Fig. 5). Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 18 Vértebras en mariposa Fig. 5. Las flechas indican las vértebras en mariposa a nivel de T10 a T12. Tomado de Sanderson et al, 2002. Durante el desarrollo, el esqueleto apendicular y partes del axial, se derivan de cartílago hialino, el cual se origina de la condensación del precursor mesenquimal de células que se diferencian a condrocitos. Notch1 se detecta en etapas tempranas de la proliferación de los condrocitos y activación de la vía Notch en las células condrocitícas ATCD5 que suprimen la diferenciación condrogénica, de acuerdo a modelos murinos (Turnpenny et al, 2007). Estudios in vitro e in vivo han establecido el papel que juega la vía de Notch, en la diferenciación de los precursores mesenquimales hacia el linaje osteoblástico y la diferenciación osteoblástica posterior. Sin embargo, en otros estudios in vitro se ha observado que la vía Notch suprime e induce la diferenciación de los osteoblastos. Por otra parte, estudios in vivo, han permitido esclarecer la función que tiene la vía Notch en la formación del Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 19 esqueleto, gracias el estudios de etapas especificas de la vía (Zanotti et al, 2010) (Fig. 6). Fig. 6. Papel de la vía de señalización de Notch en el esqueleto. Notch suprime la proliferación y diferenciación del condrocito durante la formación del cartílago hialino e inhibe la diferenciación hipertrófica. Notch inhibe la diferenciación de los osteoblastos por la interacción con β-catenina, con factor de transcripción relacionado a Runt 2 (Runx-2) y Osterix (Osx). Notch suprime directamente la osteoclastogénesis en los precursores mononucleares e indirectamente por inducción de la expresión de Osteoprotegerina (OPG) y, como consecuencia, suprime la remodelación ósea. CSL (latencia del virus de Epstein-Barr factor promotor de unión C 1, Supresor de Hairless y Lag1). Modificado de Zanotti et al 2010. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 20 Otras manifestaciones: Se han descrito otras alteraciones menos frecuentes en SAG. Dentro de éstas, se mencionan: Retraso del crecimiento. Craneosinostosis. Accidentes cerebro-vasculares. Hipodontia y oligodontia. Alteraciones pancreáticas. Grados variables de retraso en el desarrollo psicomotor. Pubertad retardada. En resumen, los criterios clásicos para el diagnóstico del SAG son (Tabla 3): Tabla 3. Criterios clásicos del SAG. Modificado de Turnpenny et al, 2012. Sistema/alteración Descripción Hígado/colestasis Caracterizada por ictericia con hiperbilirrubinemia conjugada en el período neonatal. Facies dismórfica Frente amplia, enoftalmos, en algunas ocasiones con fisuras palpebrales ascendentes, orejas prominentes, nariz recta con punta bulbosa y mentón terminado en punta dando a la cara la apariencia de un triángulo. Cardiopatía congénita La más frecuente estenosis de la arteria pulmonar periférica pero también atresia pulmonar con alteraciones del septo atrial, comunicación interventricular y tetralogía de Fallot. Esqueleto axial/alteraciones vertebrales Vértebras en mariposa y en ocasiones hemivértebras, fusión vertebral y espina bífida oculta. Ojo/embriotoxón posterior Alteraciones de la cámara anterior, de manera más frecuente embriotoxón posterior. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 21 CARACTERÍSTICAS MOLECULARES DEL SÍNDROME DE ALAGILLE Se han realizado diversos estudios buscando mutaciones en el gen JAG1 y NOTCH2 para tratar de establecer el porcentaje de mutaciones en cada uno de estos genes, también se han buscado deleciones completas del gen en 20p12, esto utilizando diversas técnicas de biología molecular (Tabla 4). Tabla 4. Alteraciones reportadas en los genes JAG1 y NOTCH2. Estudio Técnica Pacientes con alteración en JAG1, 20p12 o NOTCH2 McElhinney et al, 2002 FISH, SSCP y secuenciación directa. 154/200 (77%) con mutación en JAG1. Heritage et al, 2002 DHPLC, secuenciación directa Se realizó estudio a un total de 30 familias, 30/14 familias tenían mutación en JAG1. Kamath et al, 2003 FISH, SSCP 129/212 (61%), con mutación en JAG1, 1/34 FISH positivo para la deleción 20p12.2. McDaniell et al, 2006 Secuenciación 2 familias con mutaciones en NOTCH2 JAG1 El gen JAG1 se encuentra en el locus 20p12.2, está formado por 26 exones y 25 intrones. Codifica para la proteína JAGGED1.Tiene 3 transcritos diferentes, éstos se dan por corte y empalme alternativo. El transcrito JAG1-001 (Ensembl), se expande 5.901 Kb., y codifica para 1218 aminoácidos, que conforman 11 dominios de la proteína JAGGED1. JAGGED1 es una proteína de superficie celular, quefunciona como ligando del receptor transmembrana NOTCH (Fig. 7). Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 22 Fig. 7. Representación esquemática de la proteína JAG1 en humanos, SP péptido señal, DSL delta, serrate, lag, EGF factor de crecimiento epidermal, CR región rica en cisteína, TM dominio transmembrana. Modificado de Turnpenny et al, 2007. Los dominios que componen a la proteína JAGGED1 son: El péptido señal, necesario para la maduración de la proteína dentro del aparato de Golgi. El dominio DSL, el más conservado evolutivamente, es indispensable para la interacción con los receptores Notch, así como, para la activación de la vía. El dominio de repetidos de EGF, forman parte de la región funcional del dominio (interactúa con el receptor). El dominio transmembranal es necesario, para el anclaje del ligando a la membrana y transporte vesicular. La regulación de la expresión del gen JAG1, no ha sido esclarecida totalmente, ya que puede ser regulado por distintos factores de transcripción de manera tejido, etapa de desarrollo y estímulo específico. Se ha establecido que puede estar regulado por Twist1 y factores de transcripción como Hnf1α y β, estos participan en el desarrollo óseo e intestinal, respectivamente. (Yen et al, 2010). Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 23 Se han reportado más de 400 mutaciones, en el gen JAG1, que causan el fenotipo de SAG (Turnpenny et al, 2012): 70% Mutaciones sin sentido (deleciones, inserciones). 12% Mutaciones que alteran el corte y empalme alternativo. 11% Mutaciones de sentido equivocado. 7% Deleciones completas del gen, con una región crítica de 5.4 Mb. Debido a que la mayoría de las mutaciones que se han identificado originan proteínas truncas, se piensa que el mecanismo para la expresión del fenotipo es la haploinsuficiencia. (Krantz et al, 1998). Sin embargo, se han realizado estudios en Drosophila que muestran que las proteínas mutantes tienen un efecto dominante negativo sobre la vía de señalización de Notch (Krantz et al, 1998). No existe correlación fenotipo-genotipo en las mutaciones analizadas hasta el momento, ya que se ha encontrado que en aquellos pacientes en los cuales existen deleciones completas del gen el cuadro clínico no varía con respecto de los que tienen mutaciones más pequeñas (Turpenny et al, 2012). Aunque la mutación G274D se ha demostrado que se encuentra segregando únicamente alteraciones cardiacas estructurales en una familia (Turnpenny et al, 2012). No existen “sitios calientes” mutacionales (Onouchi et al, 1999). Aproximadamente el 60% de las mutaciones ocurren de novo y el mosaicismo germinal puede ocurrir en el 8% de los casos (Turnpenny et al, 2012). Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 24 NOTCH2 El gen NOTCH2, se encuentra en el locus1p12-p11 (OMIM #610205), cuyas mutaciones son causantes en menos del 1% del fenotipo clínico de SAG. (Kamath et al, 2012). McDaniell et al, en 2006, identificó 2 familias con mutaciones en NOTCH2, en quienes además de presentar el fenotipo característico de SAG, presentaban daño renal grave. Existe evidencia, de estudios realizados en ratones, que Notch2, es necesario para el desarrollo renal normal; por lo que ratones homocigotos para mutaciones en Notch2 hipomórfico, morían prenatalmente secundario a los defectos en el desarrollo glomerular (McCright et al, 2002). Fig. 8. Representación esquemática de la proteína NOTCH2, se muestra en la imagen los repetidos de crecimiento epidermal, repetidos de ankirina que se encuentra en el dominio intracelular. Modificado de McDaniell et al, 2006. El gen NOTCH2 tiene 34 exones, codifica para una proteína de 2471 aminoácidos y funciona como receptor de los ligandos JAGGED1 y 2 y DELTA1 para regular la decisión del destino celular (McDaniell et al, 2006). Se expresa principalmente en cerebro, riñón, corazón, músculo-esquelético e hígado (Zeunner et al, 2011). Aún no existe suficiente información para poder realizar una relación fenotipo- genotipo (Turnpenny et al, 2012). Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 25 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS El diagnóstico de SAG se puede realizar utilizando diversas técnicas de biología molecular y citogenética molecular, dentro de las cuales se encuentran las siguientes: Secuenciación del gen JAG1 de forma directa. Identifica aproximadamente entre un 94% de los pacientes (Turnpenny et al, 2012). Hibridación in situ fluorescente (FISH). Detecta deleciones mayores a 1.5 Mb, en la región 20p12.2. Identifica entre un 6% y 8% de los pacientes (Warthen et al, 2006). Cuando no se encuentran mutaciones o alteraciones con la utilización de estos dos métodos, y tengamos un fenotipo compatible con SAG, se puede realizar secuenciación directa del gen NOTCH2, en éste se encuentran mutaciones en alrededor del 1% de los pacientes (Kamath et al, 2012) (Fig. 9). Fig. 9. Diagrama de flujo para el diagnóstico de Síndrome de Alagille Modificado de Turnpenny et al, 2012. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 26 ASESORAMIENTO GENÉTICO Dado el tipo de herencia, autosómica dominante, la expresividad variable y la penetrancia incompleta del síndrome, se deberá realizar una evaluación integral de los padres, buscando datos de manera intencionada de la enfermedad; una vez detectada alguna mutación se deberá realizar el estudio molecular a los padres buscando el mismo tipo de mutación. Por lo anterior, si alguno de los padres está afectado el riesgo de recurrencia es de 50%, y para los hermanos del probando, su riesgo también será de 50%. Se ha encontrado que alrededor de un 30% a 50% de los padres de un paciente con SAG estará afectado. Por lo tanto, la mayoría de la mutaciones ocurrirá de novo. Para el caso de una mutación de novo, el riesgo de recurrencia será igual al de la población general. Aunque se debe tener en consideración la posibilidad de un mosaico germinal hasta en el 8% de los casos, según lo reportado por Giannakudis et al, 2001. Se podrá realizar diagnóstico prenatal, con FISH y secuenciación directa, una vez que se tiene identificada la mutación (Giannakudis et al, 2001). Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 27 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA El SAG es un padecimiento que tiene una alta morbi-mortalidad, debido a la afectación multisistémica y a la necesidad de trasplante hepático en algunas ocasiones, en el caso del HIMFG, corresponde a la cuarta causa de trasplante hepático. Es causado en el 94% de los casos por mutaciones en el gen JAG1. La identificación de mutaciones en el gen JAG1 en pacientes con SAG es variable, ya que se han reportado diferentes tipos mutaciones (sin sentido, de sentido equivocado, deleciones del gen, etc.), esto debido al tamaño del gen y la variabilidad de expresión. Por lo tanto el diagnóstico y correlación clínica- molecular es compleja. Por lo anterior se decidió plantear la siguiente pregunta de investigación: ¿Cuáles son las características clínicas y cuál es la correlación con las mutaciones identificadas en los pacientes con diagnóstico clínico de SAG atendidos en el Hospital Infantil de México Federico Gómez? Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 28 JUSTIFICACIÓN El diagnóstico de SAG se realiza de manera clínica basado en los criterios mayores, sin embargo existen variables en la expresión del fenotipo que pueden no estarpresentes al nacimiento y manifestarse posteriormente, situación que complica el diagnóstico de certeza. El diagnóstico molecular de esta enfermedad nos ayudaría a realizar un diagnóstico definitivo de manera más temprana, y con esta información, la atención, el tratamiento y el asesoramiento genético serían aún más específicos al tener esta base molecular tanto para el paciente como para su familia. En México, a la fecha no se ha descrito la identificación de mutaciones en el gen JAG1 en pacientes con SAG ni su relación con el fenotipo. Por lo que, esta investigación nos proporcionará conocimiento científico nuevo que podrá ser utilizado en beneficio de nuestros pacientes y sus familias. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 29 OBJETIVO GENERAL: Analizar las características clínicas presentes en pacientes mexicanos con SAG que cuentan con diagnóstico molecular de certeza para mutaciones en el gen JAG1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Analizar las manifestaciones fenotípicas del SAG en un grupo de pacientes mexicanos con análisis molecular. 2. Establecer la relación fenotipo-genotipo en pacientes con SAG, atendidos en el Hospital Infantil de México Federico Gómez. 3. Buscar posibles cambios en la secuencia codificadora y esencial para el corte y empalme adecuado del gen JAG1, en 3 pacientes con diagnóstico clínico de SAG por técnica de DHPLC. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 30 MATERIAL Y MÉTODOS Diseño del estudio: Se trata de un estudio descriptivo y transversal. Tamaño de la muestra: Se consideró realizar la revisión de 15 pacientes con diagnóstico de SAG. Se revisaron los casos de los pacientes enviados a las consultas de Genética y trasplantes, por colestasis crónica y diagnóstico histopatológico de disminución o hipoplasia de los conductos biliares intrahepáticos. Para la revisión de los expedientes se utilizó un formato de recolección de datos, modificado de Kamath et al. (Anexo 1). En aquellos pacientes que presentaron algunas de las características clínicas del SAG, se les invitó a participar en el protocolo autorizado por el Comité de Investigación, Ética y Bioseguridad del HIMFG, por medio de carta de consentimiento informado, (Anexo 9), titulado “Búsqueda y caracterización de mutaciones en el gen JAG1 por técnico de dHPLC en pacientes con síndrome de Alagille” con registro HIM/2007/13. En la Fig. 10, se encuentra el algoritmo que se siguió durante el presente estudio. Criterios de inclusión: 1. Pacientes con diagnóstico clínico y por estudio histopatológico de SAG, a los cuales se les invitó a participar explicándoles el propósito del estudio por medio de carta de consentimiento informado. 2. Pacientes que aceptaron participar firmando dicha carta. 3. Expedientes con información completa. 4. Pacientes sin contraindicación para la toma de una muestra sanguínea y que no hubieran sido transfundidos en los últimos 3 meses. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 31 Criterios de exclusión y eliminación: 1. Pacientes y/o tutores que no aceptaran participar en este estudio. 2. Muestras insuficientes o que el material para analizar no tuviera una adecuada calidad. 3. Expedientes no analizables (información incompleta). Posterior a la firma del consentimiento informado, se tomó una muestra de sangre periférica de 2 ml en tubo con EDTA. (Anexo 2). Se extrajo DNA genómico, en el laboratorio de Biología Molecular del Departamento de Genética, mediante la técnica de detergentes aniónicos utilizando un kit comercial (Quiagen®) (Anexo 3). Posteriormente, se cuantificó y se verificó la pureza del DNA, mediante espectrofotometría. (Anexo 4). Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 32 Fig. 10. Algoritmo de análisis clínico y molecular de pacientes con SAG. Para la realización de la tesis se siguieron pasos específicos, durante cada uno de ellos, fue necesario realizar revisión de los expedientes, para asegurarnos que cumplieran con los criterios clásicos de SAG. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 33 Para determinar la integridad del DNA genómico, se realizó electroforesis en gel de agarosa al 1%, a 90 volts durante 60 minutos (Anexo 5). Mediante técnica de PCR (Anexo 6), se amplificaron 30 amplicones que corresponden a los 26 exones y sitios de corte, de acuerdo a las condiciones previamente reportadas por Krantz et al 1998 (Tabla 5). Tabla 5. Oligonucleótidos utilizados para el análisis del gen JAG1. Modificado de Krantz et al, 1998 Exón Sentido (5’-3’) Antisentido (3’-5’) Long. (pb) 1 TCCAATCGGCGGAGTATATTAGAG AGAGGACGGCTGGGAGGA 251 2ª GCGCTGACCTACCTCCTTCCCT CACGATGCGGTTGCGGTC 313 2B GCTTCGGCTCAGGGTCCA CCAGGCGCGGGTGTGAG 132 3 GTACAATGTTCGTCTGTT GTCCACAGGAGCGATACT 100 4ª CATGATTCACCACTTTGT GCATAGTGTCCAAAGAAG 190 4B CTGTAATAAGTTCTGCCG TCCCACCCCACCTGAGATA 195 5 GGAATTTGCAGACTTTAATGCAA CCTGCAGTCCCTGGGAGT 160 6 AAGGCTAACCTGGAGGTGTGCTGC TCCCACCCTGGGTCTCATCC 198 7 GTCTCTTAGTGACTCCA GCTTATAGAATGGTTGGGA 270 8 CATCCCTCTCTGACTGCCATCC ACCTCTCCCCAACGTGGTATCTT 217 9 GGATCTAATTGTCAGATGGAT GTCACAGGGATGTTCTTA 190 10 TTCCAAGGTGGGGGAGAT TGGAAACAAAGTCACTCAC 195 11 CACCCAGCGTAATAACCTT CTAGTGTCGCACAAATCT 175 12 TGAAGCCCTGTGTTTGTGGAATAC GAAAAGTAAAGGGAAGCGGAGGAG 318 13 GTTTTACTCTGATCCCTC CAAGGGGCAGTGGTAGTAAGT 260 14 GAATGCCGCATCTGTGGGTG AGGCTGGGGAGCACTGGTC 166 15 AGGAGGGAGCCATGAAAACTGC CAACATGACCCATACATCCCAGAG 251 16 GCCTGTCGTGAATGGTCCTGGA CAAGGCCAACTACCACTT 190 17 GCTATCTCTGGGACCCTT CCACGTGGGGCATAAAGTT 200 18 CCTCCAGACTGTTTCTGGATA GCAAGTCCCCAAGGGTGTCA 250 19 GTTGAAGTCCTCACTATT GTGGATGAGTGCTGGCTT 105 20 GTGTGGTCTTTGCTTTCT CCAGACGGAGACAGTCCTT 130 21 CATCAGTCCCTAAACTTGAACTCCATT CGCTCACCCCAGAAGACCCAT 196 22 GCTCACCCGTCTCCACCTGT GAACTGCGGCAGCCATCATGT 160 23 ATGGCTGCCGCAGTTCA CAAGCAGACATCCACCAT 350 24 CTTACACGTGTGTGGGTTTCTC GCCATCGAATAATGAGGT 230 25ª GCAGACACAGATTGTCGA CGCCTCTGAACTCTTACT 190 25B AGTAAACGTGATGGAAAC CCCTCGACCTGATGGCTTTA 200 26ª TCTTGGAGAGTTAATTGGTTTTGTGC CCTTGATGGGGACCGTGTTG 250 26B GCTGAACCAGATCAAAAACCCCA TTGTCCAGTTTGGGTGTTTTGTCG 239 26C GCGTATACGCTGGTAGACAGAGAAGA GAGAGTTTAAAGAACTAGAAGCCCTCAGA 194 Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 34 Para este estudio, se utilizó una variante de la PCR, la cual se denomina “Touchdown”. (Anexo 7). Esta variante se caracteriza por el incremento en la especificidad, sensibilidad y rendimiento de la amplificación. (Korbie et al, 2008). Una vez que se obtuvieron los productos de PCR, se realizó electroforesis en gel de agarosa al 2%, para saber determinar la correspondencia de los fragmentos obtenidos con el tamaño esperado (Anexo 6) (Tabla 5). Ya que se confirmó que los fragmentos obtenidos correspondían a lo esperado, se realizaron mezclas para la formación de homodúplex y heterodúplex, para utilizar la realización de cromatografía líquida de alta precisión desnaturalizante (dHPLC) (Anexo 8). Se analizaron los cromatogramas obtenidos para discriminar aquellos amplicones que pudieran indicar algún cambio en la secuencia de DNA, de acuerdo a los cromatogramas obtenidos en un control cuya secuencia se conoce. Los análisis anteriores fueron realizados con la asesoría de la Biol. Adriana Sánchez Boiso y el M. en C. Edgar Ricardo Vázquez Martínez, quien realizó su tesis basado en el estudio molecular de los pacientes J1 a J12. En esta tesis se hace el análisis clínico y la correlación molecular de este grupo de pacientes yse incluye además el análisis por dHPLC de los pacientes J13, J14 y J15. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 35 RESULTADOS Los resultados del presente estudio, se pueden dividir en clínicos y moleculares. Resultados Clínicos: Se revisaron los expedientes de los 15 pacientes que fueron invitados a participar en el protocolo de estudio para SAG. Para el registro interno de los pacientes, se les asignó la letra “J”, y un número seguido, de forma progresiva se fueron asignando los números, con lo que los pacientes fueron identificados como J1 a J15. De acuerdo a la hoja de recolección de datos, se logro recabar la siguiente información: Género: se encontró que participaron 7 niñas y 8 niños. (Fig. 11). Fig.11 Porcentaje de niños y niñas que participaron en el protocolo para identificar mutaciones en el gen JAG1. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 36 Lugar de origen: al ser el HIMFG un centro de referencia, podemos encontrar que la distribución geográfica de los pacientes es amplia, sin embargo, las entidades federativas con un mayor número de pacientes fueron el D. F y el Estado de México (Fig. 12). Fig. 12 Entidades federativas de donde son originarios, los pacientes incluidos en el estudio Antecedentes heredo-familiares: se indagó también en la historia familiar y no se encontraron antecedentes de colestasis ni malformaciones cardiacas. Ninguno de los padres presentaba el fenotipo característico. El paciente J5, tenía antecedente de padres consanguíneos en 5to grado y un hermano finado a los 3 meses de edad, de causa desconocida, pero finalmente este paciente fue eliminado en la primera etapa de este estudio realizada por Vázquez, 2011, porque no cumplía con criterios diagnósticos para SAG. En la tabla 6, se muestran los pacientes en los cuales se ha realizado trasplante hepático. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 37 Tabla. 6. Pacientes que han sido trasplantados. Pac. Trasplantado J1 Sí J2 Sí J3 Sí J4 No J5 No J6 No J7 No J8 No J9 Si J10 Si J11 Si J12 Si J13 No J14 No J15 No Para poder ser incluidos dentro del estudio, la característica clínica principal, fue la presencia de colestasis crónica y el hallazgo histopatológico de disminución o hipoplasia de los conductos biliares intrahepáticos. Por lo que, de acuerdo a la biopsia hepática estos fueron los diagnósticos (Tabla 7): Tabla.7: Diagnóstico de acuerdo al estudio histopatológico. Muestra Reporte de biopsia J1 Colestasis intracelular, células gigantes multinucleadas, ductopenia compatible con SAG J2 Escasez de conductos biliares, compatibles con SAG J3 Colestasis leve, fibrosis leve, disminución de conductos biliares. J4 Disminución de conductos biliares intrahepáticos. J5 Colestasis, fibrosis portal irregular, escasez de conductos biliares. J6 Se observan hasta 7 espacios porta en su área de 1.7 mm2 (normal 4-8/mm2), estos son pequeños y no exhiben conductos biliares interlobulillares. Los hepatocitos muestran retención biliar ocasional y algunos sinusoides están dilatados, concordantes con SAG. J7 Cambios secundarios a obstrucción parcial del flujo biliar. Fibrosis leve. Atresia de vías biliares. J8 Cambios concordantes con alteración del metabolismo de los ácidos biliares. La microscopia electrónica muestra cambios concordantes con colestasis familiar recurrente. Descartar enfermedad de Byler. J9 Disminución de los conductos biliares interlobulillares, compatible con SAG. J10 Obstrucción parcial al flujo biliar con fibrosis moderada.* J11 Colestasis con disminución de los conductos biliares intrahepáticos. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 38 J12 Disminución de los conductos biliares intrahepáticos. J13 Disminución de conductos biliares interlobulillares. J14 Colangitis aguda y crónica con fibrosis y obliteración de la luz de conductos biliares extrahepáticos, fibrosis portal leve, segmento de intestino sin alteraciones. J15 Disminución de conductos interlobulillares con índice de 0.36. Colestasis moderada, artificios múltiples. Nota: * biopsia no realizada en el HIMFG El paciente J12 fue trasplantado, al realizar el estudio histopatológico del hígado extirpado se encontró, además de lo ya reportado, cirrosis biliar secundaria y un adenoma hepatocelular. En la mayoría de los casos, donde los pacientes eran foráneos, la biopsia hepática se realizó en su lugar de origen y posteriormente se realizó la referencia al HIMFG, aquí se revisaron las laminillas para corroborar el diagnóstico de envío. Como se puede observar en la tabla 7, los pacientes J7, J8 y J14, de acuerdo a la biopsia, su diagnóstico final fue diferente al de SAG, esto se discutirá más adelante. En la tabla 8, se resumen los hallazgos clínicos encontrados en todos los pacientes revisados clínica y molecularmente. A n álisis clín ico y m o lecu lar en p acien tes co n Sín d ro m e d e A lagille aten d id o s en el H IM FG 3 9 T a b la 8 . C a r a c te r ís tic a s c lín ic a s d e lo s p a c ie n te s in c lu id o s e n e l p r o to c o lo E P : E m b rio to x ó n p o s te rio r, R P : R e tin o p a tía p ig m e n ta ria , E s P : E s te n o s is p u lm o n a r, C IA : C o m u n ic a c ió n in te ra u ric u la r, P C A : P e rs is te n c ia d e c o n d u c to a rte rio s o , IN : Ic te ric ia n e o n a ta l, H C B I: H ip o p la s ia c o n d u c to s b ilia re s in tra h e p á tic o s , C o l: C o le s ta s is , H C : H ip e rb ilirru b in e m ia c o n ju g a d a T R : T ra s p la n ta d o , Q R M : Q u is te s re n a le s m e d u la re s , A T R : A c id o s is tu b u la r re n a l, V M V é rte b ra s e n m a rip o s a , D P : D e s a rro llo p s ic o m o to r N L : N o rm a l, R M R e tra s o m e n ta l, N E : N o e s p e c ific a d o . ~, Facies AlOllalmologi.as Al Caldiologi.as Al Hepáti.as Al Renales AlEsqueléi.as DP Mut JAGl EP Ollas EsP CIA PCA Ollas I !tll Col HC TR QRM Ollas VM Ollas II JI + + + + + + NE NE RM Si J1 + + Ins",. + + + illp~. + NE SI I Tri.úspidea Itul A'm J3 + NL + + + + HL NE NE Si J4 NE NE Soplo + + NE NE RM No sistólico J5 No J6 + + + + + rnu Escoliosis NL No 4trwn , ~ j ,~~ mrA~ wrnr J1 NE NE + + + ATR Itw.,. RM No ,tuJilJ m~n.ltl. J8 LPH Eshbism Corsano + NL NL RM No o J9 + NL + + + + + + NE NE RM Si JIO + NE + + + + + NL ~. r.;, NE Si I 1f1 4.'<U.~1 Jl l NE NL + + + + NL NE HL Si I 112 + + + + + + + HE NL NE Si J13 + + + + + + NE + NE En esrudio J14 NE NE + Foramen oual + ATR HE RM En esrudio J15 + Ammp" + + + + ~¡, NL HE En luftJ4t1. esrudio Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 40 De acuerdo a la tabla 8, podemos dividir en cuatro grupos diferentes a los pacientes incluidos en el estudio: 1. Positivos para la mutación. 2. Negativos para la mutación. 3. Eliminado. 4. Pendientes de secuenciación. Positivos para la mutación: En la tabla 9, se muestran las características clínicas de los pacientes positivos para la mutación. Tabla. 9. Características clínicas de los pacientes con mutación en JAG1. Paciente Características clínicas J1 Facies compatible, embriotoxón posterior, estenosis pulmonar, ictericia neonatal, HCBI, hiperbilirrubinemia conjugada, no se especifica problema renal y esquelético. J2 Facies compatible, estenosis pulmonar e insuficienciatricúspidea, ictericia neonatal prolongada, hipoplasia de conductos biliares intrahepáticos, quistes renales, displasia renal, ATR, vértebras en mariposa. J3 Facies compatible, estenosis pulmonar, ictericia prolongada, HCBI. J9 Facies compatible, estenosis pulmonar, ictericia neonatal, HCBI, colestasis, hiperbilirrubinemia conjugada. J10 Facies compatible, estenosis pulmonar, ictericia prolongada, colestasis, hiperbilirrubinemia conjugada, sinostosis radiocubital. J11 Estenosis pulmonar, ictericia prolongada, HCBI. J12 Facies compatible, embriotoxón posterior, estenosis pulmonar, ictericia prolongada, HCBI, colestasis. Nota: HCIB: Hipoplasia de conductos biliares intrahepáticos, ATR acidosis tubular renal. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 41 De acuerdo a la tabla 10, la frecuencia de las características clínicas, de los pacientes que presentaban mutación en JAG1, son: Tabla 10. Frecuencia de las alteraciones compatibles con SAG de pacientes con mutación en JAG1. Rel H/M Facies Ojo Corazón Hígado Riñón Esquelético Otros 4/3 6/7 86% 2/5 40% 7/7 100% 7/7 100% 1/4 25% 2/3 66% 2/3 RDPM En la figura 13 se observa de manera gráfica el porcentaje de pacientes que presentaban facies característica de SAG con mutación en JAG1. Fig. 13. Pacientes con mutación en JAG1, con facies característica. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 42 La facies característica de un paciente con SAG, con mutación en JAG1 (Fig. 14). Fig. 14. Fenotipo de paciente con mutación en JAG1, se observa la frente amplia, la nariz recta con punta bulbosa, mentón terminado en punta que da el aspecto de triángulo invertido. Foto tomada previa firma de los padres de consentimiento informado (Anexo 11). En las figuras 15, 16 y 17, se muestran los porcentajes de las alteraciones oftalmológicas, renales y esqueléticas respectivamente. Fig. 15. Alteraciones oftalmológicas de pacientes con mutación en JAG1. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 43 Fig. 16. Alteraciones renales en pacientes con mutación en JAG1. Fig. 17. Pacientes con alteraciones esqueléticas con mutación en JAG1. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 44 En los pacientes J2 y J10, no se especifica en el expediente clínico la presencia de alteraciones oftalmológicas. En J1, J9 y J12 no se especifican las alteraciones renales y en J1, J3, J9 y J11, no se encontró alguna especificación con respecto a la presencia o no de alteraciones esqueléticas. Las características más frecuentes fueron las facies características, las alteraciones hepáticas y las alteraciones cardíacas. Las menos frecuentes fueron las alteraciones oftalmológicas, esqueléticas y renales. El paciente J2, además de la estenosis pulmonar, presentaba insuficiencia tricúspidea. El paciente J10, no presentaba vértebras en mariposa, sin embargo presentaba sinostosis radiocubital, que ha sido reportada como una las características que se pueden encontrar en SAG. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 45 Pacientes negativos para la mutación: Los pacientes J4, J6, J7 y J8, fueron negativos para la mutación en JAG1, las características clínicas se encuentran en la Tabla 11. Tabla 11. Características clínicas de los pacientes negativos para mutaciones en JAG1. Pac Facies Ojos Corazón Hígado (Bx) Riñón Esqueleto J4 NE NE Soplo sistólico Disminución de conductos biliares intrahepáticos NE NE J6 Si Embriotoxón posterior Estenosis pulmonar Disminución de conductos biliares intrahepáticos Doble sistema colector riñón derecho Escoliosis J7 NE NE Hipoplasia del tronco pulmonar Cambios secundarios a obstrucción parcial del flujo biliar. Fibrosis leve. Atresia de vías biliares ATR Polidactilia preaxial mano derecha J8 No Estrabismo Cor sano Cambios concordantes con alteración del metabolismo de los ácidos biliares. Prob Colestasis intrahepática familiar tipo Byler NL NL Nota: NE No especificado, LPH Labio y paladar hendido, NL Normal, ATR acidosis tubular renal Como previamente se había mencionado, en 2 de los pacientes negativos para la mutación en JAG1 el diagnóstico histopatológico no se correlacionaba con el SAG, por lo que era de esperarse que fueran negativos. Los diagnósticos finales fueron: Paciente J7 con diagnóstico de Atresia de vías biliares. Paciente J8 con diagnóstico de Colestasis intrahepática familiar tipo Byler. Según la tabla 11 de las características clínicas de los pacientes negativos, el paciente J4 solamente tiene 2 de los 3 criterios necesarios para hacer el diagnóstico de SAG, por lo que será necesario buscar de manera intencionada el resto de las características clínicas y también buscar mutaciones en el gen NOTCH2. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 46 El paciente J6, cumple con los criterios diagnósticos de SAG, aunque no se encontraron mutaciones en JAG1. Eliminado: El paciente J5 fue eliminado desde el inicio del estudio. Pendientes de secuenciación: Este grupo está conformado por los pacientes J13, J14 y J15. Las características clínicas se muestran en la tabla 12: Tabla 12. Características clínicas de los pacientes pendientes de secuenciación. Px Facies Ojos Corazón Hígado (Bx) Riñón Esqueleto J13 Si EP Estenosis pulmonar Disminución de conductos biliares interlobulillares. NE Vértebras en mariposa J14 NE NE CIA Colangitis aguda y crónica con fibrosis y obliteración de la luz de los conductos biliares extrahepáticos. ATR NE J15 Si Ametropía Estenosis pulmonar Disminución de los conductos interlobulillares con índice de 0.36. Colestasis moderada, artificios múltiples. Atrofia renal derecha NL Nota: EP: Embriotoxón posterior, CIA comunicación interauricular, ATR acidosis tubular renal, NE No especificado, NL Normal. En el caso del paciente J14, no estaría indicada la secuenciación del gen JAG1, ya que el diagnóstico histopatológico, no concuerda con el del hipoplasia o ausencia de conductos biliares interlobulillares, además de que no cumple con los demás datos clínicos de sospecha para SAG, por lo que quedaría descartado y su diagnóstico final sería atresia de vías biliares. Los pacientes J13 y J15 cumplen criterios clínico e histopatológicos compatibles con SAG, por lo que se deberá seguir con su estudio. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 47 Resultados Moleculares: Las muestras de sangre periférica, fueron procesadas para obtener DNA genómico, por medio de la técnica de detergentes aniónicos. Posteriormente se cuantificó el DNA por espectrofotometría y después se realizó electroforesis en un gel de agarosa al 1% a 90 Volts por 60 minutos, para determinar la integridad. Se realizaron reacciones de PCR, para amplificar los fragmentos de interés. Los fragmentos se visualizaron en gel de agarosa al 2%, al que se le añadió 1 µL de bromuro de etidio y se realizó electroforesis a 100 volts, durante 40 minutos. (Fig. 18, 19 y 20.). Fig. 18. Electroforesis en gel de agarosa al 2%, de los productos de PCR de la muestra J15 del fragmento del exón 9 al 19. En el carril 1 se colocó un marcador de peso molecular de 100 pb. Los pesos moleculares de los fragmentos corresponden a lo esperado, el fragmento 13 no amplificó y posteriormente fue repetido.Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 48 Fig. 19. Repetición de la electroforesis en gel de agarosa al 2% de los productos de PCR de los fragmentos 1, 2, 12 y 13 de la muestra J15, que no habían amplificado en la primera ocasión que se realizaron. En el carril 6 se colocó un marcador de peso molecular de 100 pb. Los pesos moleculares de los fragmentos corresponden a lo esperado. Fig. 20. Electroforesis en gel de agarosa al 2%, de los productos de PCR de los fragmentos 20 al 26C de la muestra J15. En el carril uno se colocó un marcador de peso molecular de 100 pb. Los pesos moleculares de los fragmentos corresponden a lo esperado. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 49 Una vez obtenidos los productos de PCR, de todos los fragmentos, se hicieron las mezclas para el análisis por dHPLC. Se analizaron los patrones cromatográficos de cada uno de los amplicones utilizados y se consideraron como anormales aquellos en los que se observa una diferencia significativa en el patrón con respecto al control (Fig. 21 y 22). Fig. 21. Patrón cromatográfico del amplicón 26B del paciente J15, donde se puede observar el cambio en el cromatograma, con respecto al control C44, el patrón de color verde corresponde al paciente J15. Fig. 22. Patrón cromatográfico del amplicón 23 del paciente J14, donde se observa el cambio en el Cromatograma comparándolo con el control C44 color gris, el patrón de color amarillo corresponde al paciente J14. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 50 Los exones que se consideraron normales tenían un patrón cromatográfico muy parecido al del control, por lo que no se consideró que pudiesen presentar mutaciones (Fig. 23 y 24). Fig. 23. Patrón cromatográfico del amplicón 8 del paciente J15, el patrón del cromatograma es muy similar al del control C44, por lo tanto, se considera que no existen cambios en la secuencia del gen en este amplicón. Fig. 24. Patrón cromatográfico del Amplicón 4A del paciente J13, el patrón de cromatográfico del paciente J13 (verde) es similar al del control C44. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 51 El análisis de con dHPLC de los pacientes J13, J14 y J15, mostró alteración en los patrones cromatográficos de los siguientes amplicones (Tabla 13). Tabla 13. Amplicones que presentaron cambios en los patrones cromatográficos, de los pacientes en los que se utilizó dHPLC. Paciente Amplicones con cambio en patrón cromatográfico J13 X1, X2B, X3, X4B, X6, X12, X16, X23, X24 J14 X2B, X6, X9, J18, X19, X20, X23, X26B J15 X1, X2B, X6, X9, X22, X23, X24, X26B Los pacientes en los que se confirmaron mutaciones en JAG1, fueron J1, J2, J3, J9, J10, J11 y J12. En la tabla 14, se muestran las mutaciones encontradas. Tabla 14: Mutaciones en JAG1. Modificado de Vázquez, 2011 Paciente Mutación J1 Exón 13, Sin sentido [Gln539X] J2 Exón 21, Sin sentido [Cys855X] J3 Exón 2, Sin sentido [Trp128X] J9 Exón 13, Inserción [Cys522fs] J10 Exón 6 Sin sentido [Gln291X] J11 Intrón 4-5: c.694+1G>C J12 Intrón 1-2: c.82-6C>A Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 52 Según los dominios de la proteína, las mutaciones se encontraron principalmente en los repetidos parecidos al factor de crecimiento epidermal (EGF) (Fig. 25). Fig. 25. Dominios de la proteína JAGGED1, donde se encontraron las mutaciones, tipos de mutaciones y exón.PS péptido señal, DSL Delta Serrate Lag, EGF factor de crecimiento epidermal, CR dominio rico en cisteína, RT región transmembranal. Las mutaciones de los pacientes J12 y J11, caen en las regiones intrónicas, por eso no se muestran en la Fig. 17, de acuerdo a lo publicado por Krantz et al, en 1998, las mutaciones que caen en las regiones intrónicas afectan los sitios de corte y empalme de la proteína. J3, exón 2, mutación [Trp128X], ocasiona una proteína trunca. J10, exón 6, mutación [Gln291X], ocasiona una proteína trunca. J1, exón 13, mutación [Gln239X], ocasiona una proteína trunca. J9, exón 13, inserción [Cys572fs], ocasiona corrimiento del marco de lectura. J2, exón 21, mutación [Cys855X], ocasiona una proteína trunca. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 53 DISCUSIÓN En función al objetivo general de la presente tesis, los pacientes en los cuales se encontró mutación en el gen JAG1, todos ellos cumplían con criterios clínicos para hacer el diagnóstico de SAG, así como se encontró que 5 de las mutaciones no habían sido previamente reportadas en la literatura. La características más frecuentes en este estudio, fueron las alteraciones hepáticas y las alteraciones cardíacas, en un 100% de los pacientes que presentaban mutación en JAG1, en la literatura se ha reportado que las alteraciones hepáticas corresponden a un 96% de los casos y que las alteraciones cardiacas a un 97%, por lo que nuestro estudio correspondería a lo previamente reportado (Emerick et al, 1999). Las características menos frecuentes que se encontraron en este estudio fueron las alteraciones oftalmológicas, renales y esqueléticas, sin embargo no a todos los pacientes buscaron estas características de manera intencionada. Sin embargo, de acuerdo a la tabla 1, donde se muestran las características clínicas de los pacientes que han sido analizados podemos encontrar que las alteraciones vertebrales y oftalmológicas son las menos frecuentes (Krantz et al, 1997). La correlación fenotipo-genotipo, es compleja, ya que el SAG tiene una expresividad variable (Boyer et al, 2005). En la tabla 14, se presentan los pacientes con mutación y el fenotipo que presentaban. Tabla 15. Mutaciones y fenotipo de los pacientes. Paciente Mutación Fenotipo J1 Exón 13, Sin sentido [Gln539X] C, H, O. J2 Exón 21, Sin sentido [Cys855X] C, H, E, F, R. J3 Exón 2, Sin sentido [Trp128X] C, H, F. J9 Exón 13, Inserción [Cys522fs] C, H, F, R. J10 Exón 6 Sin sentido [Gln291X] C, H, O, E, F. J11 Intrón 4-5: c.694+1G>C C, H, O, F. J12 Intrón 1-2: c.82-6C>A C, H, O, F. Nota: C: Corazón, H: Hígado, O: Ojo, F: Facies, R: Renal, E: Esquelético. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 54 Las mutaciones encontradas en los pacientes analizados, se presentan a lo largo de la región codificante y dos de ellas en regiones intrónicas, sin embargo, en aquellos pacientes donde la mutación estaba presente en los primeros exones, el fenotipo no fue más grave, por lo que no se puede predecir en base al sitio mutado, cuál será el fenotipo. La mayoría de los pacientes analizados, tanto por dHPLC como por secuenciación directa, presentaban las características clínicas que nos hacían sospechar en SAG. En todos ellos la manifestación principal fue la colestasis crónica. De acuerdo al dominio donde se encontraba la mutación, no se logro relacionarlos con un fenotipo más grave de la enfermedad. El paciente J12, presentaba mutación en la región intrónica 1-2, presentaba el fenotipo, alteración cardiaca, la alteración hepática y la alteración oftalmológica, su mutación se presentaba al inicio del gen, lo que ocasiona un error en el sitio de corte y empalme de la proteína, lo que origina el corrimiento del marco de lectura y posteriormente una proteína trunca, sin embargo el fenotipo no era severo, en cambio el paciente J2, donde la mutación se encontró en el exón 21, presentó el fenotipo completo de SAG, facies característica, alteraciones cardiacas, hepáticas, oftalmológicas, esqueléticasy renales, hablando del gen, la mutación se presentó casi al final de éste, hablando de la proteína, se presentó en el dominio EGF, muy cerca del sitio de interacción entre ligando y receptor. Tres de los pacientes analizados (2 por secuenciación y 1 por dHPLC), su diagnóstico final no correspondía al SAG. En 2 de ellos el diagnóstico fue atresia de vías biliares y en otro colestasis familiar tipo Byler. La atresia de vías biliares (OMIM %210500), es una enfermedad en la cual los niños presentan una obliteración progresiva o discontinua del sistema biliar extrahepático, que resulta en una obstrucción al flujo biliar, esto resulta en colestasis, hiperbilirrubinemia conjugada, cirrosis, y falla hepática, la mayoría de los pacientes necesitarán trasplante hepático en el primer año de vida; la atresia de vías biliares comparte con el SAG la presencia de colestasis de Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 55 aparición neonatal, por lo que es una de los diagnósticos diferenciales. La atresia de vía biliares, se considera un padecimiento multifactorial (Carlton et al, 2004). La colestasis intrafamiliar tipo Byler, (OMIM 211600), se considera una colestasis benigna intrahepática recurrente, es un grupo heterogéneo de enfermedades hepáticas autosómicas recesivas, que se caracterizan por aparición temprana de colestasis que progresa a fibrosis hepática, mutaciones homocigotas y heterocigotas compuestas en el gen ATP8B1, (OMIM 602397), localizado en 18q21.31, son las causantes de la colestasis intrafamiliar tipo Byler. Los pacientes también presentan colestasis desde la infancia, y siendo la colestasis, el principal criterio para sospechar SAG, también debe considerarse dentro de los diagnósticos diferenciales (Hori et al, 2010). El paciente J6, cumplía criterios diagnósticos para SAG, sin embargo no se logró establecer alguna mutación en el gen JAG1, por lo que no se puede descartar la presencia de mutaciones en NOTCH2, que presentará deleción completa del gen, considerar alguna fenocopia, considerar algún diagnóstico diferencial además de que se deberá investigar a la familia. De acuerdo con la Fig. 9, presentada en el apartado de métodos diagnósticos, se puede justificar que en el análisis molecular se hayan incluido pacientes con diagnóstico histopatológico diferente a SAG, ya que el cuadro clínico era sugerente, no cumplían con criterios clásicos, sin embargo, tenían algunas características. El diagnóstico de certeza de SAG en un niño con colestasis, es de suma importancia, ya que entre más pronto se lleve a cabo el diagnóstico y el trasplante, en caso necesario, mejor pronóstico tienen los niños; en los casos reportados en la literatura en donde a aquellos infantes con colestasis, pensando que el diagnóstico fuera atresia de vías biliares y no SAG, la cirugía respectiva a realizar era la técnica de, Kassai, sin embargo los que tuvieran diagnóstico de SAG, con esta cirugía su pronóstico se vuelve más adverso. (Turnpenny et al, 2012). Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 56 CONCLUSIÓN Las características clínicas de los pacientes mexicanos atendidos en el HIMFG incluidos en este estudio en quienes se demostró una mutación en el gen JAG1, cumplían con los criterios diagnósticos para SAG, incluyendo principalmente las alteraciones hepáticas (hipoplasia de vías biliares intrahepáticas) y las alteraciones cardiacas (estenosis pulmonar). Es importante considerar el realizar estudio molecular a los padres de los niños con mutaciones en el gen JAG1, para incluir en el asesoramiento considerando la variabilidad de expresión. En este estudio 4 pacientes con diagnóstico inicial de SAG fueron negativos para mutación en JAG1, dos de ellos tuvieron diagnósticos diferentes a SAG; un tercer paciente negativo para mutación sí tuvo criterios diagnósticos para SAG por lo que se debe descartar mutaciones en NOTCH2, como parte del abordaje diagnóstico. Un cuarto paciente no cumplió con todos los criterios clínicos, sin embargo tiene algunas características, lo que demuestra la importancia de definir el diagnóstico clínico para establecer el realizar o no el estudio molecular. De los pacientes con análisis por DHPLC, hasta el momento dos cumplen con criterios diagnósticos para SAG. Se encontraron cambios en los patrones cromatográficos, de los pacientes J13 y J15, en ellos es importante realizar el análisis por secuenciación para confirmar o descartar si estos cambios en los patrones cromatográficos corresponden a mutaciones o a polimorfismos del gen JAG1. En esta tesis se realizó el análisis de los datos clínicos de 15 pacientes con SAG, de los cuales se identificó que cumplían con los criterios internacionales clínicos para diagnóstico, se analizó la relación fenotipo y genotipo la cual hizo evidente la variabilidad clínica de la enfermedad y se destaca la importancia del diagnóstico temprano para tratamiento, ya que por ejemplo todos los pacientes con mutación demostrada ya han sido trasplantados. Así mismo la trascendencia del manejo multidisciplinario incluyendo el asesoramiento genético. Análisis clínico y molecular en pacientes con Síndrome de Alagille atendidos en el HIMFG 57 BIBLIOGRAFÍA Alagille D, Estrada A, Hadchouel M, Gautier M, Odièvre M, Dommergues JP. Syndromic Paucity of interlobular bile ducts (Alagille Syndrome or arteriohepática dysplasia) Review of 80 cases. J Pediatr 1987; 110: 195- 9. Bales C, Kamath B, Munoz P, Nguyen A, Piccoli D, Spinner N, Horn D, Shults J, Leonard M, Grimberg A, Loomes K. 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