Caracterizacion-de-la-frecuencia-y-expresion-de-CD86-en-celulas-dendrticas-slan-provenientes-de-pacientes-con-sndrome-coronario-agudo

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO
FACULTAD DE MEDICINA
DIVISION DE ESTUDIOS DE POSGRADO
INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL
UNIDAD MEDICA DE ALTA ESPECIALIDAD
HOSPITAL DE CARDIOLOGIA DEL CENTRO MEDICO NACIONAL “SIGLO XXI”
CARACTERIZACIÓN DE LA FRECUENCIA Y EXPRESIÓN DE CD86 EN
CÉLULAS DENDRÍTICAS SLAN PROVENIENTES DE PACIENTES CON
SÍNDROME CORONARIO AGUDO.
TESIS PARA OBTENER EL TITULO DE:
ESPECIALISTA CARDIOLOGIA
PRESENTA:
DR. UZIEL ENRIQUE MANZANO LÓPEZ
ASESOR:
M en C. DRA. MARIA ALEJANDRA GUADALUPE MADRID MILLER
CIUDAD DE MEXICO
AGOSTO 2016
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
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Caracterización de la frecuencia y expresión de CD86 en células dendríticas slan
provenientes de pacientes con síndrome coronario agudo.
Autores:
Dr. Uziel Enrique Manzano López
Residente de Cardiología
Hospital de Cardiología, C.M.N. Siglo XXI.
druzielmanzano@gmail.com
Responsable:
M en C. Dra. Alejandra Madrid Miller.
Jefe de Investigación en Salud,
Hospital de Cardiología, C.M.N. Siglo XXI.
Teléfono: 56276900. Extensión: 22152.
akmadrid@prodigy.net.mx
Colaboradores:
Dr. Francisco Blanco Favela.
Jefe de la Unidad de Investigación Médica en Inmunología,
Hospital de Pediatría, C.M.N. Siglo XXI.
Teléfono: 56276900. Extensión: 22447.
fblanco1@terra.com.mx
D en C. Luis Chávez Sánchez.
Investigador Asociado A
Unidad de Investigación Médica en Inmunología,
Hospital de Pediatría, C.M.N. Siglo XXI.
Teléfono: 56276900. Extensión: 22447.
luis_chz@hotmail.com
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CONTENIDO
1. MARCO TEÓRICO 7
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 12
3. JUSTIFICACIÓN 13
4. OBJETIVO GENERAL 14
5. HIPOTESIS 15
6. MATERIAL Y MÉTODOS 16
7. CRITERIOS DE SELECCIÓN 17
8. OPERACIONALIZACION DE LAS VARIABLES 19
9. ANALISIS ESTADISTICO 23
10. ASPECTOS ÉTICOS 24
11. BIBLIOGRAFÍA 30
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Resumen
Caracterización de la frecuencia y expresión de CD86 en células dendríticas slan
provenientes de pacientes con síndrome coronario agudo.
*Manzano López, U. ** Madrid Miller, A. ***Blanco Favela, F. ****Chávez Sánchez, L.
Departamento de Investigación en Salud, UMAE, Hospital de Cardiología, C.M.N. Siglo
XXI. ** Unidad de Investigación Médica en Inmunología, Hospital de Pediatría, C.M.N.
Siglo XXI.
Las enfermedades cardiovasculares y en particular los síndromes isquémicos coronarios
agudos (SICA), representan un grave problema de salud en el mundo. En países
desarrollados y en algunos en vías de desarrollo estas patologías ocupan la principal causa
de muerte. La cardiopatía isquémica incluye la arteriopatía coronaria crónica (angina
estable) y SICA (angina inestable, infarto agudo de miocardio y muerte súbita). En México,
los síndromes isquémicos agudos fueron la segunda causa de muerte en población general
en el 2001, actualmente ocupan el primer lugar, originando 81,242 muertes por año, de las
cuales 60,610 se presentaron en individuos mayores de 65 años y alrededor de 20,631 en
individuos en edad productiva. En personas mayores de 75 años causa el 70% de todas las
muertes. En el proceso aterogénico diversas estirpes celulares participan en la respuesta
inmune especialmente las células dendriticas (DCs). Las DCs son células presentadoras de
antígeno profesionales cruciales en la respuesta inmune innata y inducción de una respuesta
inmune adaptativa a infecciones, así como, en el mantenimiento de la tolerancia
inmunológica de los tejidos propios. Las DCs existen en dos estados funcionales el primero
es un estado inmaduro en el cual se caracteriza por una alta expresión de moléculas del
complejo principal de histocompatibilidad (MHC) clase I y clase II, expresan receptores
para Fc, receptores para células muertas y receptores tipo lectina como el DEC-205, entre
otros. Estas moléculas le dan la capacidad a la DCs inmaduras de internalizar antígenos
exógenos y endógenos, los cuales son procesarlos para ser presentados en el contexto de las
moléculas del MHC, además incrementan los niveles de CD40, CD80, CD83 y CD86;
adicionalmente migran y presentan el antígeno a linfocitos T. Las DCs se acumulan en las
lesiones ateroscleróticas y se sugiere que pueden estar jugando un papel importante en el
proceso de la enfermedad. Las DCs arriban a la lesión por los receptores de quimiocinas
CCR2 y CCR5, cuyos ligandos se expresan en la placa. Las DCs pueden ser activadas a
través de los receptores tipo toll (TLR) que expresan en la superficie celular; además
estudios in vitro han establecido que las DCs de pacientes con SICA expresan niveles alto
de TLR4 y además pueden ser activadas a través de este receptor usando LPS.
Recientemente, la subpoblación de DCs denominada DCs slan (slanDCs) en sangre
periférica de humanos a cobrado interés, por su alta capacidad en secretar mediadores
inflamatorios, la cual se identifica a través del anticuerpo M-DC8. Las células slanDCs,
expresan CXCR1, CCR1, CCR5 y CCR7. Además, expresan CD83, CD86, así como, las
moléculas del MHC clase I y clase II, lo que sugiere que son capaces de inducir respuestas
inmunes. También, se ha demostrado que el estímulo de LPS en las slanDCs induce la
secreción de TNF-α e IL-12p70. Estas evidencias sugieren un posible papel de las slanDCs
en las enfermedades inflamatorias a través de la inducción y perpetuación de la
inflamación, en particular en la enfermedad cardiovascular. La identificación de la
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frecuencia, inmunofenotipica y funcional de las slan DCs en la enfermedad cardiovascular,
nos permitirá encontrar una biomarcador molecular de la enfermedad que se pueda
sugerirse en la clínica.
Objetivos.
1) Comparar la frecuencia de las slanDCs de sangre periférica de pacientes con síndrome
isquémico coronario y sujetos sanos. 2) Determinar el patrón de expresión de la molécula
CD86 en las slanDCs en fresco de pacientes con síndrome isquémico coronario. 3)
Demostrar que la activación de las slanDCs vía TLR2 y TLR4 induzcan un incremento en
la expresión de CD86. Así como un incremento en la producción de TNF-α e IL-12, en
pacientes síndrome isquémico coronario en comparación con sujetos sanos.
Diseño del estudio.
Desde el punto de vista clínico se trata de un diseño transversal. Sin embargo ya que se va a
aplicar una maniobra se podría considerar un estudio clínico-básico concurrente.
Grupos de estudio.
Se incluirán 78 casos concurrentes de pacientes que ingresen a la UMAE, Hospital de
Cardiología de Centro Médico Nacional SXXI, que cumplan con los criterios de selección.
El grupo de sujetos sanos será de 26 de entre 45 a 75 años de edad, se reclutaran de banco
de sangre. Ambos grupos serán sometidos a una valoración médica integral por un médico
cardiólogo. Obtención de células mononucleares. Las células se obtendrán a partir de 20
ml de sangre heparinizada por lymphoprep. La viabilidad celular se realizara por exclusión
con azul tripan. Determinación de la frecuencia y marcadores de superficie celulares en
las células dendríticas slan. Las células mononucleares se resuspenderán en PBS-BSA
(0.5%)- Na3N 0.2% pH=7.4 y se incubaran con los anticuerpos monoclonales anti-
humanos: anti-CD3-PE, anti-CD14-PE, anti-CD19-PE y anti-CD56-PE (eBioscience), para
excluir células del linaje de linfocitos T, linfocitos B, células NK y macrófagos. La
identificación de las slanDc se realizará con anticuerpos anti-CD123-Violeta brillante 421,
anti-HLA-DR-APC-Cy7, (BD Pharmingen), anti-CD11c-APC, anti-M-DC8-APC-FITC(Miltenyi Biotec MACS, Bergish Gladbach, Germany), así como con, anti-CD80-PECy5 ,
anti-CD86-PECy7, anti-CD40-PECy5, anti-TLR2-PECy7, anti-TLR4-PECy7 de
eBioscience, San Diego, CA., anti-CCR2-PECy5 (R&D Systems, Inc., Minneapolis).
Determinación de citocinas intracelualres. Las células mononucleares se estimularan con
100 ng/ml de LPS de Escherichia coli serotype O111:B4 (100 ng/ml) (Sigma) o con 20
ng/ml de Pam3CSK4 (Alexis Biochemicals, Plymouth Meeting, PA, USA), concluida la
incubación se realizará la tinción para identificar a las slanDC, así como las citocinas TNF
e IL-12.
Análisis estadístico.
Análisis univariado de las variables continuas se describirán de acuerdo a su distribución
(promedio ± desviación estándar, mediana y percentiles). Las características demográficas
de la población se expresarán en porcentaje de frecuencia. Para el análisis bivariado de
variables continuas y comparación de grupos de pacientes se emplearan t de Student o U de
Mann Whitney. Para la comparación de variables cualitativas se empleará Chi 2 o prueba
exacta de Fisher de acuerdo con valores esperados. Para la comparación de variables
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cuantitativas entre grupos se empleará ANOVA o Kruskal Wallis de acuerdo con la
distribución de los datos y homogeneidad de varianzas. Se considerara un valor de p ≤ 0.05.
Aspectos éticos.
Este protocolo corresponde aún estudio con riesgo mínimo de acuerdo al reglamento de la
Ley General de Salud en materia de Investigación, ya que solo se tomará una muestra de
sangre en una ocasión. Dado estas características se solicitará consentimiento verbal.
Recursos, financiamiento y factibilidad.
Pacientes: La UMAE Hospital de Cardiología, tiene un ingreso mensual promedio de 80
pacientes, de los cuales el 95 % aproximadamente es debido a síndrome coronario agudo.
Recursos físicos y materiales: La Unidad de Investigación Médica en Inmunología,
Hospital de Pediatría, CMN SXXI y la Unidad de Investigación Médica en Autoinmunidad,
Hospital de Especialidades, CMN SXXI cuenta con los recursos, equipo y reactivos
necesarios para llevar al cabo los experimentos así como el personal capacitado. Recursos
financieros: Se someterá a evaluación del apoyo Financiero para el Desarrollo de
Protocolos de Investigación y Desarrollo Tecnológico sobre Temas Prioritarios de Salud
IMSS. Tiempo a desarrollarse: El protocolo se desarrollara en 3 años y medio.
Experiencia del grupo. El Dr. Francisco Blanco Favela, cuenta con 62 artículos
publicados en revistas internacionales, ha participado en 6 publicaciones de capítulo de
libro en inglés, ha graduado a alumnos de posgrado de maestría y doctorado en ciencias, ha
obtenido apoyos financieros en el IMSS y CONACYT. El Dr. Luis Chávez Sánchez, ha
publicado 7 artículos en revistas internacionales, ha participado en la publicación de dos
capítulos de libro en inglés, ha graduado a dos alumnos de licenciatura, ha obtenido un
apoyo financiero en el IMSS y otro de CONACYT. La Dra. Alejandra Madrid Miller, ha
publicado 6 artículos tanto en revistas nacionales e internacionales, colabora en la
publicación de uh libro en español, ha graduado a diversos alumnos de especialidad, ha
obtenido financiamientos en el IMSS.
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Marco teórico
Las enfermedades cardiovasculares y en particular los síndromes isquémicos coronarios
agudos (SICA), representan un grave problema de salud en el mundo. En países
desarrollados y en algunos en vías de desarrollo estas patologías ocupan la principal causa
de muerte [1]. La cardiopatía isquémica incluye la arteriopatía coronaria crónica (angina
estable) y SICA (angina inestable, infarto agudo de miocardio y muerte súbita) [2].
La angina es el síntoma más característico de la cardiopatía isquémica, manifestándose por
dolor, opresión o malestar generalmente torácico; atribuible a isquemia miocárdica
transitoria. La angina estable es aquella angina de esfuerzo en la que no ha habido cambios
en su forma de presentación en las últimas 4 semanas e implica la no previsible aparición
de complicaciones de forma inminente o evolución desfavorable en un futuro inmediato
[2]. Los SICA incluyen la angina inestable, la cual representa la transición entre la
enfermedad arterial coronaria estable y el estado en el que el paciente se encuentra en alto
riesgo de presentar un infarto. De hecho, la angina inestable es la primera forma de
presentación clínica en algunos pacientes, la cual se caracteriza clínicamente por dolor
precordial de origen isquémico, o dolor en extremidades superiores, mandíbula y epigastrio,
desencadenado con el esfuerzo o aún en reposo, con duración menor a 30 minutos cuyo
inicio de los síntomas es menor a 8 semanas, en pacientes previamente asintomáticos. Sin
embargo, en pacientes con antecedente de angina estable, se presenta con cambios en la
frecuencia de los eventos de angina, o bien, en su duración, severidad y factores
desencadenantes del evento, acompañado o no de síntomas neurovegetativos y/o
alteraciones electrocardiográficas [3].
En el infarto agudo del miocardio, las manifestaciones clínicas habitualmente tienen una
duración superior a los 30 minutos y existe elevación de marcadores séricos de necrosis
miocárdica [4], como consecuencia de una isquemia severa ocasionada por una oclusión
coronaria aguda de origen trombótico que se produce tras la ruptura de una placa
aterosclerosa vulnerable [2].
En México, los síndromes isquémicos agudos fueron la segunda causa de muerte en
población general en el 2001, actualmente ocupan el primer lugar, originando 81,242
muertes por año, de las cuales 60,610 se presentaron en individuos mayores de 65 años y
alrededor de 20,631 en individuos en edad productiva. En personas mayores de 75 años
causa el 70% de todas las muertes [5]. El SICA es más frecuente en el género masculino
que en el femenino, con relación aproximada de 1:10, Sin embargo, en mujeres después de
los 65 años de edad, se pierde ésta relación y se vuelven tan vulnerables como los hombres.
La forma más frecuente de presentación clínica de la enfermedad coronaria en las mujeres
es la angina de pecho, mientras que en los hombres se presenta más a menudo en forma de
infarto del miocardio [2].
Los factores de riesgo asociados con enfermedades cardiovasculares incluyen: dislipidemia,
diabetes mellitus, hipertensión arterial sistémica, tabaquismo, niveles elevados en plasma
de homocisteína, concentraciones elevadas de lipoproteína a, alteración del balance entre
radicales oxidantes y antioxidantes, la expresión del antígeno leucocitario humano,
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infecciones por microorganismos como citomegalovirus, Chlamydia pneumoniae y
Helicobacter pylori [6,7].
El proceso aterogénico se inicia con la disfunción endotelial que consiste en una pérdida de
las funciones homeostáticas del endotelio (anti-adhesiva, anti-agregante, anti-proliferativa,
anti-oxidante, anti-trombótica y reguladora del tono vasomotor) e incluyen un aumento de
la permeabilidad endotelial a lipoproteínas de baja densidad las cuales son modificadas por
lipoperoxidación en el espacio subendotelial iniciando la formación de la placa
aterosclerosa [6,7]. Como consecuencia se observa la expresión de selectina-E, selectina-P,
molécula de adhesión de plaquetas a células endoteliales-1, molécula de adhesión
intercelular-1 y molécula de adhesión de células vasculares (VCAM) -1, las cuales
producen la interacción entre las células T y los monocitos circulantes con las células
endoteliales [8,9]. Además, moléculas quimiotractantes como la proteína quimiotractante
de monocitos (MCP)-1 estimulan la migración y acumulación de leucocitos en el sitio de la
lesión, también se ha descrito la participación de receptor (CCR2) en el desarrollo de la
lesión aterosclerosa [10,11], resultados similares se han demostrado con la fraktalkina;
otras quimiocinas que están involucradas en la formación de la lesión son MIP-1α, MIP-1β,
así como, sus receptores (CCR1 y CCR5) [12]. En esta etapa de la lesión, las células
musculares lisas migran a la placa estimuladas por el factor de crecimientoderivado de
plaquetas y el factor de crecimiento de fibroblastos [6,7]. Los monocitos y macrófagos
participan en la respuesta inmune innata y son células efectoras esenciales en la enfermedad
aterosclerosa. Expresan en la superficie celular receptores “scavenger”, los cuales
identifican e internalizan las partículas de lipoproteína de baja densidad oxidada (LDLox),
induciendo su activación y transformación en células espumosas [13]. Además, en la lesión
se genera la placa fibrosa caracterizada por un crecimiento extracelular de lípidos,
particularmente colesterol, ésteres de colesterol y matriz derivada de células musculares
lisas [6]. Los macrófagos activados presentes en la placa, secretan citocinas pro-
inflamatorias, entre las que se encuentran interleucina (IL)-1β, IL-8, TNF-α, factor
estimulador de colonias de macrófagos y MCP-1. En etapas avanzadas de la placa se inicia
la muerte celular de macrófagos por interferón (IFN)-γ. Por otro lado, la apoptosis o
necrosis puede ser generada por la acumulación de lípidos promoviendo el avance del
núcleo necrótico en la placa. Además, los macrófagos producen TNF-α, IL-1β y
metaloproteinasas que pueden ser críticos en el daño a la lesión [6,7,13,14]. En la última
etapa de la aterosclerosis ocurre ruptura o ulceración de la placa fibrosa lo que conduce a
síndromes de angina inestable o al infarto de miocardio. La vulnerabilidad de la placa se
origina por un adelgazamiento de la lesión y ocurre por inhibición de la secreción de matriz
proveniente de células musculares lisas a través de IFN-γ secretado por linfocitos T. Los
macrófagos degradan la matriz de la capa fibrosa por medio de colagensa intersticial,
gelatinasa y estromilisina. La degradación de la capa fibrosa frecuentemente se origina en
los hombros de la lesión y puede conducir a una hemorragia, las plaquetas activadas se
adhieren a la arteria lesionada ocasionando la formación de un trombo y la oclusión de la
arteria [6].
Con base en lo anterior, que da de manifiesto que diversas estirpes celulares participan en la
respuesta inmune en la aterosclerosis especialmente los macrófagos [7]. Sin embargo, los
macrófagos no son las únicas células presentadoras de antígeno presentes en la lesión
aterosclerosa. Adicionalmente, se ha descrito la presencia de células dendriticas (DCs) en la
placa aterosclerosa [15]. Las DCs son células profesionales presentadoras de antígeno
9
cruciales en la respuesta inmune innata y adaptativa a infecciones, así como, en el
mantenimiento de la tolerancia inmunológica de los tejidos propios [16]. Las DCs existen
en dos estados funcionales el primero es un estado inmaduro en el cual se caracteriza por
una alta expresión de moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC)
clase I y clase II contenidas en vesículas, en su superficie expresan receptores para Fc,
receptores para células muertas y receptores tipo lectina como el DEC-205, entre otros [16-
19]. Estas moléculas le dan la capacidad a la DCs inmadura de internalizar antígenos
exógenos y procesarlos para ser presentados en las moléculas del MHC, adicionalmente
migran y presentan el antígeno a linfocitos T, en esta etapa las DCs carecen de la capacidad
de inducir el “prime” en la respuesta inmune. En el segundo estado la DCs inmadura pasa a
una DCs madura la cual sufre una desregulación en la adquisición de antígenos y en la
capacidad de procesamiento de antígenos. Por otro lado, aumenta su inmunogenicidad a
través de la expresión de altos niveles de moléculas de MHC, CD40, CD80, CD83 y CD86,
permitiéndole inducir un “prime” en la respuesta inmune [20].
Las DCs representan una pequeña población células derivadas de medula ósea, sin embargo
existen diferentes subtipos de DCs con distintas funciones inmunológicas [21]. Los
subtipos encontrados en un estado de equilibrio (“steady-state”) en el ratón y en el humano
incluyen a las DCs plasmacitoides (pDCs) y a las DCs convencionales (cDCs) en tejidos no
linfoides, en circulación y en el tejido linfoide. Las cDCs residentes en el tejido linfoide
incluyen subtipos de cDCs fenotipicamente diferentes y se localizan en el timo, bazo y
nódulos linfoides. También, se pueden encontrar las cDCs en piel como las células de
Langerhans localizadas en epidermis y a las DCs dermales situadas en las áreas dermales; a
las DCs asociadas al tejido mucoso; a las DCs asociadas al tejido linfoide e incluye DCs de
zona marginal, células interdigitantes asociadas a la zona de T, DCs de centro germinal y
DCs timicas. Por otro lado, las DCs de tejido intersicial incluyen a las DCs de hígado y
pulmón [22]. En condiciones inflamatorias, las DCs pueden derivar de monocitos [23].
Adicionalmente, las DCs pueden encontrarse en arterias normales y se localizan
típicamente en el espacio sub-endotelial así como en la unión entre la media y la adventicia
[24,25]. Hasta hora se ha propuesto que las DCs embebidas en la pared juegan un
importante papel en la sobrevivencia de la pared arterial y en la tolerización contra
autoantígenos a través del silenciamiento de las respuestas de los linfocitos T [26]. En 1995
se demostró por primera vez que las DCs se acumulan en las lesiones ateroscleróticas y se
sugirió que las DC estarían jugando un papel importante en el proceso de la enfermedad
[15]. La presencia de las DCs, en la placa aterosclerosa se ha confirmado mediante el uso
de anticuerpos que reconocen marcadores presentes en las DCs en humanos y ratones
(CD11c, CD1a, S-100, CD83, y DC-SIGN) [27].
La adhesión de las DCs al endotelio en el ateroma se origina a través de las moléculas de
adhesión como: selectina E y P, así como, de VCAM-1 [28,29]. Otro mecanismo de
adhesión de las DCs a la lesión se da a través de interacción con plaquetas [30]. El
endotelio también es capaz de producir quimiocinas que permiten el reclutamiento de DCs
a la lesión. Se ha demostrado la presencia de las quimiocinas CCL12, CCL5 y se sugieren
como quimiotacticos para las DCs debido a que expresan en su superficie celular los
receptores CCR2 y CCR5 [31,32]. Por otro lado, la deficiencia del receptor de CX3CR1
resulta en la disminución de la aterosclerosis y en el número de DCs presentes en la placa
aterosclerosa [33], resultados similares se han encontrado en la deficiencia de CCR7 [34].
10
Las DCs pueden ser activadas por del reconocimiento de patrones moleculares asociados a
daño como también por patrones moleculares asociados a patógenos [35] a través de los
receptores tipo toll (TLR) que expresan en la superficie celular [36]. Entre estos, se ha
demostrado claramente que TLR2 y TLR4 juegan un papel clave en el desarrollo de la
placa aterosclerosa [37]. In vitro se ha establecido que las DCs de pacientes con SICA
sobre-regulan TLR4 y además pueden ser activadas a través de este receptor usando LPS
[38]. En lo que respecta a TLR2 se sugiere una posible activación de las DCs por
Chlamydia pneumoniae [39]. Por otro lado, publicaciones recientes indican que antígenos
endógenos como LDL modificada oxidativamente activan a TLR2 y TLR4 [40,41] e
incluso la LDLox induce la maduración de DCs sobre-regulando HLA-DR y CD86, las
cuales participan en la inducción de la respuesta inmune adaptativa [42]. Además, las DCs
secretan las quimiocinas CCL19 y CCL21 implicadas en orquestar la atracción de linfocitos
T, así como citocinas entre las que se encuentra la IL-12, esta citosina sobre-regula
positivamente el receptor CCR5 en linfocitos T, el cual participa en la acumulación de
linfocitos T en la placa aterosclerótica [31] y se localizan cerca de las DCs [43].
La presentación de antígenos y las señales co-estimuladoras de las DCs hacia los linfocitos
T son cruciales para su activación, induciendo una expansión clonal de linfocitos T en la
lesión [44] y producción de IFN-γ [45]. También se ha descrito que linfocitos T CD8 y
células NK se encuentran cerca de las DCs y estas son capaces de activar ambos tipos
celulares aumentando su actividad citotóxica induciendo muerte celular de células
endoteliales y células vascularesde músculo [46,47]. Las DCs posiblemente participen en
la desestabilización de la placa ateroslcerosa a través de la activación de linfocitos T CD8,
células NK y linfocitos T cooperadores. La secreción de IFN-γ derivado de los linfocitos T
cooperadores activados ocasiona la activación de macrófagos presentes en la lesión a través
de la secreción de metaloproteinasas que degradan la matrix extracelular lo que lleva a la
desestabilización de la placa aterosclerosa [6].
Por otro lado, el análisis de las DCs en sangre periférica a cobrado interés en las
enfermedades cardiovasculares. En sangre periférica se encuentran las DCs mieloides
(mDCs) las cuales expresan CD1c, CD11c, CD33 y secretan IL-12. En contraste las DCs
plasmacitoides (pDCs) expresan constitutivamente CD123 y son productoras de IFN-α
[18]. Otras diferencias se encuentran en el perfil de expresión de TLR, las pDCs expresan
abundantemente TLR7, TLR8, y TLR9. En contraste las mDCs expresan TLR2 y TLR4.
Las mDCs representan el 0.2% y las pDCs el 0.1% de los leucocitos en sangre periférica
[48]. Se ha reportado una disminución en la frecuencia de mDCs en sangre periférica de
pacientes con SCIA comparado con los testigos. En contraste el número de pDCs no se
altera y se sugiere que la disminución en la periferia de las mDCs se debe a un posible
reclutamiento de las mDCs a la placa aterosclerosa [49]. En contrate, otros autores
demuestran un incremento en el número de mDCs en pacientes con enfermedad
cardiovascular con respecto a los testigos y reportan un número similar de las pDCs en
ambos grupos [50]. Otros reportes indican una disminución tanto de mDCs, así como de las
pDCs conforme avanza la enfermedad [51,52]. Por otro lado, otro reporte indica una
disminución significativa de las pDCs en pacientes con enfermedad cardiovascular y las
mDCs únicamente presentaron una tendencia baja a disminuir [53].
11
Recientemente una tercera subpoblación de DCs denominada DCs slan (slanDCs) en sangre
periférica de humanos acobrado interés la cual se identifica a través del anticuerpo M-DC8
[54]. Las células slanDCs representan del 0.6% al 2% de las células mononucleares de la
sangre periférica siendo la mayoría de las DCs presentes en la sangre de los humanos y
fenotípicamente expresan M-DC8+, CD1c-, CD11c+, CD16+, CD14-, C5aR+ y CD45RA+
los cuales difieren de los descritos previamente para las DCs [54,55]. Sin embargo,
comparten otros marcadores similares a las DCs como: CD11c+ y CD123 dim.
Adicionalmente, expresan los receptores CXCR1, CCR1, CCR5 y CCR7. Además,
expresan CD83, CD86, así como, las moléculas del MHC clase I y clase II, lo que sugiere
que son capaces de inducir respuestas inmunes [56]. Esto ha que dado de manifiesto en
estudios in vitro donde se han demostrado que las slanDCs son potentes inductoras de
respuestas primarias de linfocitos T antígeno específica a través de la inducción de la
actividad citotóxica de linfocitos T [56,57], también son capaces de promover la
proliferación, secreción de IFN-γ y citotoxicidad de células NK [57]. Las slanDCs
inmaduras al ser estimuladas con LPS producen y secretan TNF-α [55,58]. Por otro lado,
las slanDC maduras al ser estimuladas con LPS secretan IL-12p70 [59]. Estas evidencias
sugieren un posible papel de las slanDCs en las enfermedades inflamatorias a través de la
inducción y perpetuación de la inflamación. Interesantemente se ha demostrado la presencia
de las slanDCs en la mucosa ileal de pacientes con enfermedad de Crohn’s [58], así como,
en lesiones de psoriasis vulgaris en la epidermis y en el tejido pannus de la artritis
reumatoide [59].
12
Planteamiento del problema
La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria crónica, en la cual participan diversas
estirpes celulares del sistema inmune que incluye a las células dendríticas. Recientemente
se ha demostrado una reducción en su frecuencia en sangre periférica en humanos bajo un
proceso inflamatorio y se ha determinado su presencia en tejido de enfermedades
inflamatorias e incluso al ser activadas con LPS son capaces de secretar citocinas
inflamatorias como TNF-α e IL-12p70 involucradas en los procesos inflamatorios en el
síndrome coronario agudo. Además, inducen la activación de linfocitos T a través de la
secreción de IFN-γ y posiblemente direccionen la respuesta hacia una respuesta tipo TH1.
Sugiriendo un papel relevante de la slanDCs en pacientes con síndrome coronario agudo,
por lo que nos parece adecuado plantear:
¿Cual es la frecuencia y activación de las slanDC en la respuesta inflamatoria de pacientes
con síndrome isquémico coronario, en comparación con la respuesta de slanDCs de sujetos
sanos?
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Justificación
La enfermedad arterial coronaria aterosclerosa en sus diferentes presentaciones clínicas
como síndromes isquémicos agudos son la segunda causa de muerte general en nuestra
población. En la actualidad la enfermedad aterosclerosa se considera un proceso
inflamatorio y durante su desarrollo participan diversas estirpes celulares del sistema
inmune que incluye a las células dendríticas que son consideradas como las más potentes
células presentadoras de antígeno; poseen una alta capacidad de estimular a linfocitos T, B,
células NK y pueden direccionar la diferenciación del linfocito T cooperador hacia un
linfocito cooperador 1.
Recientemente se ha descubierto una población de células dendríticas denominadas slan y
se ha demostrado su presencia en lesiones de enfermedades inflamatorias crónicas, más
aún, posee la capacidad de inducir respuestas inflamatorias. Sin embargo, no existe
información acerca del posible papel que juega la slanDCs en el síndrome isquémico
coronario a través de la inducción y perpetuación de la inflamación, por lo que nos parece
interesante explorar la frecuencia y activación de las slanDCs en pacientes con síndrome
isquémico agudo. Será conveniente aclara que este protocolo corresponde al tema
prioritario de enfermedades cardiovasculares de la convocatoria de la Coordinación de
Investigación en Salud: Concurso de Apoyo Financiero para el Desarrollo de Protocolos de
Investigación y Desarrollo Tecnológico sobre Temas Prioritarios de Salud IMSS.
14
Objetivo general
Demostrar la frecuencia de las slanDCs, así como su estado de activación en la sangre
periférica de síndrome isquémico coronario.
Objetivos específicos
1. Comparar la frecuencia de las slanDCs de sangre periférica de pacientes con
síndrome isquémico coronario y sujetos sanos.
2. Determinar el patrón de expresión de la molécula CD86 en las slanDCs en fresco de
pacientes con síndrome isquémico coronario.
3. Demostrar que la activación de las slanDCs vía TLR2 y TLR4 induzcan un
incremento en la expresión de CD86. Así como un incremento en la producción de
TNF-α e IL-12, en pacientes síndrome isquémico coronario en comparación con
sujetos sanos.
15
Hipótesis
1. Los pacientes con síndrome isquémico coronario presentaran una disminución en la
frecuencia de las slanDCs en periferia con respecto a los sujetos sanos.
2. Las slanDCs provenientes pacientes con síndrome isquémico coronario presentaran
niveles más elevados de las moléculas HLA-DR, CD80, CD86, CD40, TLR2, TLR4
y CCR2 con respecto a las slanDCs de los sujetos sanos.
3. Las slanDCs provenientes pacientes con síndrome isquémico coronario presentaran
niveles más elevados de TLR2, TLR4, CD80, CD86, CD40, HLA-DR, CCR2,
TNF-α e IL-12, al ser activadas con LPS y/o Pam3CSK4 con respecto a las slanDCs
de los sujetos sanos.
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Material y métodos
Diseño del estudio
Desde el punto de vista clínico se trata de una cohorte mientras que por la maniobra
experimental se trata de un estudio experimental.
Grupos de estudio
Se incluirá casos concurrentes, de pacientes que ingresen al Hospital de Cardiología de
Centro Médico Nacional SXXI, que cumplan con los criterios de selección. Los pacientes
con síndrome coronario agudo se incluirán dentro de las 48 horas de iniciados los síntomas
en la Unidad de Cuidados Intensivos Cardiovasculares para la toma de muestras y los
pacientescon angor estable se considerará la toma de muestra después del cateterismo
cardiaco diagnóstico una vez que se demuestre la presencia de lesiones significativas. El
grupo de sujetos sanos pareados por edad, se reclutaran de banco de sangre.
17
Criterios de Inclusión
1. Pacientes de cualquier género, menor de 75 años.
2. Pacientes con diagnóstico de infarto agudo del miocardio o angina inestable, dentro
de las 72 hrs de iniciados los síntomas.
3. El diagnostico de infarto se considerará con 2 de los siguientes criterios:
A. Dolor precordial de tipo isquémico ≥ 30 min. de duración, acompañado o no
de disnea, diaforesis, nausea y/o vómito.
B. Elevación de CPK total mayor al 150% de su valor basal normal.
C. Desnivel positivo o negativo del segmento ST igual o mayor de 1 mm en 2
o más derivaciones que vean la misma cara o presencia de BRIHH de
reciente aparición.
4. Se considerará como angina inestable con 2 de los siguientes criterios:
i. Dolor precordial de tipo isquémico con duración menor de 30 min.
cuyo inicio de presentación desde el primer evento sea menor de 8
semanas, o que en este tiempo exista cambios en el patrón de
presentación de los eventos de angina en pacientes con angina
estable previa, o angina 48 hrs a 4 semanas después de un infarto
del miocardio. Acompañado o no de síntomas neurovegetativos.
ii. Cambios electrocardiográficos en el segmento ST y/o en la onda T.
iii. Ausencia de elevación de marcadores de necrosis miocárdica (CPK
total o MB).
5. Se consideraran pacientes con angor estable:
A. considerarán pacientes en clase funcional II o III por angina de acuerdo con
la clasificación de la Sociedad Cardiovascular Canadiense (CCS)
B. Ausencia de datos que sugieran cambios en el patrón de presentación de los
eventos de angina al menos en los últimos 2 meses o la presencia de eventos
de angor en reposo o presencia de cambios electrocardiográficos en el
segmento ST en reposo.
C. Pacientes que ingresen a nuestro hospital programados para la realización de
estudio angiográfico donde se demuestre la presencia de al menos 50% de
estenosis de una o más arterias coronarias epicárdicas.
6. Consentimiento verbal informado al familiar del paciente para su aceptación de
ingreso al presente estudio.
Criterios de exclusión
1. Pacientes que cursen con síndrome anémico.
2. Antecedentes de enfermedad neoplásica, inflamatoria crónica o proceso infeccioso
activo.
3. Antecedentes de tratamiento previo con anti-inflamatorios o inmunosupresores.
4. Niveles de creatinina ≥ 1.6 mg/dl.
5. Trombocitopenia o discrasia sanguínea conocida.
6. Pacientes a los que no se logre obtener la cantidad de sangre necesaria para los
ensayos.
18
7. Pacientes en los que no se logre obtener el número de monocitos necesarios para los
experimentos.
Criterios de no Inclusión
1. Negativa a ingresar al protocolo.
2. Datos de sangrado mayor activo.
Tamaño de la muestra
Se cálculo para un valor de delta de 89 (diferencia de las medias de producción de TNF por
monocitos)60, con un poder de la prueba de 0.80 y valor de alfa del 95%, con los que nos da
un tamaño de muestra de 26 por grupo.
19
Variables (Definición de variables)
Variables Independiente
Células provenientes de los diferentes grupos:
I. pacientes con síndrome coronario agudo
II. pacientes con angor estable
III. sujetos sanos.
Definición conceptual: Los pacientes son síndrome coronario agudo son aquellos
que presentan manifestación clínica de isquemia aguda o necrosis miocárdica aguda
debida a reducción del flujo coronario, aporte de oxígeno miocárdico insuficiente,
desequilibrio entre el aporte y demanda de oxígeno, asociada a la enfermedad
arterial coronaria con erosión o ruptura de la placa aterosclerosa y la subsecuente
oclusión parcial o toral de la luz del vaso. Se considera paciente con angor estable
aquel que presenta dolor precordial de tipo isquémico que no ha modificado su
forma de presentación en los último 2 meses, habitualmente se presenta con el
esfuerzo y cede con el reposo. Se considera que un sujeto sano a la ausencia de
enfermedad o estado patológico alguno.
Definición operativa: se considera pacientes con síndrome coronario agudo a
aquellos que ingresen con diagnóstico de angina inestable, infarto agudo de
miocardio sin elevación del segundo ST o infarto con elevación del segmento ST.
Se considerara pacientes con angor estable aquel que presenta eventos de angina en
clase funcional II-III de la CCS, o bien, que cuente con prueba inductora de
isquemia positiva, que requiera de estudio de angiografía coronaria donde se
demuestre al menos la presencia de obstrucción de >50% de alguna arteria coronaria
epicárdica. Se considera a sujetos sanos a aquellos en quienes de descarte la
presencia de signos o síntomas de isquemia miocárdica, enfermedad inflamatoria
crónica, neoplásica o infecciosa.
Tipo de variable: nominal
Escala de medición: grupo I , grupo II y grupo III
Variables dependientes
Citocina pro-inflamatoria
Definición conceptual: Citocina pro-inflamatoria es un proteína producida por
diversos tipos celulares de la respuesta inmune, participando en la inducción,
expresión y regulación de otras moléculas de la respuesta inflamatoria o inmune.
Definición operacional: Se considera citocina pro-inflamatorias el TNF se realizaran
mediciones de proteína en el sobrenadante del cultivo celular mediante ELISA.
Escala de medición: Variable de razón.
Tipo de Variable: Cuantitativa continúa.
20
Moléculas coestimulatorias: CD80, CD86, CD40 y HLA-DR.
Definición conceptual: CD80 y CD86 moléculas de superficie celular presente en
células presentadoras de antígenos. Proporcionan un estímulo necesario para la
activación del linfocito T. CD40 molécula de superficie celular presente en células
presentadoras de antígenos y se requiere para su activación. HLA-DR es una molécula
de superficie celular presente en las células presentadoras de antígenos. Proporciona
un estímulo necesario para la activación de linfocitos T.
Definición operacional: Se realizaran las mediciones de las moléculas mediante
citometría de flujo.
Escala de medición: Variable de razón.
Tipo de variable: Cuantitativa continúa.
TLR: TLR2 y TLR4
Definición conceptual: Receptor tipo toll reconoce una variedad de patrones
moleculares asociados a patógenos.
Definición operacional: Se realizaran mediciones de la proteína de superficie celular
mediante citometría de flujo.
Escala de medición: Variable de razón.
Tipo de variable: Cuantitativa continúa.
Slan (6-Sulfo LacNAc)
Definición conceptual: Es una modidicación de un carbohidrato de la glucoproteína P-
selectina ligando-1 se expresa característicamente en una subpoblación de células
mononucleares.
Definición operacional: Se realizaran mediciones de la proteína de superficie celular
mediante citometría de flujo.
Escala de medición: Variable de razón.
Tipo de variable: Cuantitativa continúa.
21
Métodos
Toma de muestras de sangre
La muestra sanguínea se obtendrá de vía venosa a partir de catéter periférico, previa asepsia
y antisepsia, se obtendrá un volumen de 15 ml de sangre venosa en tubos que contienen
1000 U heparina por ml de sangre. En caso de no contar con catéter periférico se realizará
punción de vena periférica
Obtención de células mononucleares
A partir de 15 ml de sangre se diluirán en PBS 1X a pH= 7.4 en una relación 1:3
posteriormente 7 ml de sangre diluida se colocaran sobre 4 ml de lymphoprep (Axis-Shield,
Liverpool, UK) y se centrifugarán a 2000 rpm 30 minutos se recuperara el anillo entre el
lymphoprep (Axis-Shield) y plasma, se lavaran las células mononucleares 2 veces con PBS
1X, el paquete recuperado se resuspenderá en 2 ml de medio RPMI al 10% de surero fetal
bovino (Invitrogen Carlsbad, CA). La viabilidad celular se realizara por exclusión con azul
tripan.
Determinación de la frecuencia y marcadores de superficie celulares en las células
dendríticas slan
Las células mononucleares se resuspenderán en PBS-BSA (0.5%)- Na3N 0.2% pH=7.4 y se
incubaran con los anticuerpos monoclonalesanti-humanos: anti-CD3-PE, anti-CD14-PE,
anti-CD19-PE y anti-CD56-PE (eBioscience), para excluir células del linaje de linfocitos T,
linfocitos B, células NK y macrófagos. La identificación de las slanDc se realizará con
anticuerpos anti-CD123-Violeta brillante 421, anti-HLA-DR-APC-Cy7, (BD Pharmingen),
anti-CD11c-APC, anti-M-DC8-APC-FITC (Miltenyi Biotec MACS, Bergish Gladbach,
Germany), así como con, anti-CD80-PECy5 , anti-CD86-PECy7, anti-CD40-PECy5, anti-
TLR2-PECy7, anti-TLR4-PECy7 de eBioscience, San Diego, CA., anti-CCR2-PECy5
(R&D Systems, Inc., Minneapolis) durante 20 minutos en oscuridad a 4oC, posteriormente
se lavaran dos veces con PBS-BSA (0.5%)- Na3N 0.2% pH=7.4 y se fijaran con 35 μl de
PBS p-formaldehído 1%. Los niveles de las moléculas se superficie se medirán utilizando
el citometro de flujo FACS Canto (BD Biosciencies). Por otro lado, se realizaran cultivos
celulares, los cuales se estimularan con LPS y Pam3CSK4 y se determinaran los niveles de
TLR2, TLR4, CD80, CD86, CD40, HLA-DR y CCR2. Los niveles de expresión se
cuantificaran midiendo la intensidad media de fluorescencia (IMF) de cada muestra
utilizando el software FlowJo software (Tree Star, San Carlos, CA).
Determinación de citocinas intracelulares
2x106 células mononucleares se estimularan con 100 ng/ml de LPS de Escherichia coli
serotype O111:B4 (100 ng/ml) (Sigma) y con 20 ng/ml de Pam3CSK4 (Alexis
Biochemicals, Plymouth Meeting, PA, USA) a 37oC durante 2 horas, concluida la
incubación a todos los pozos se les adicionarán 0.2 μL de Golgi-Stop (BD Biosciences) y se
incubaran durante 18 horas. Después los slanDC se teñirán con los anticuerpos anti-CD123-
Violeta brillante 421, anti-HLA-DR-APC-Cy7, (BD Pharmingen), anti-CD11c-APC, anti-
M-DC8-APC-FITC (Miltenyi Biotec MACS, Bergish Gladbach, Germany), durante 20
minutos en oscuridad. Posteriormente, se lavarán dos veces con Perm/Wash (BD
Biosciences) y se fijarán con 35 μL de PBS paraformaldehído al 1%. Los slanDC se lavarán
dos veces con Perma/Wash y se adicionarán 100 μL de la solución Cytofix/Cytoperm (BD
22
Biosciences) por 20 minutos a 4° C en oscuridad. Las células se lavarán dos veces con
Perm/Wash y después se les adicionará por separado los anticuerpos monoclonales anti-
humanos anti-TNF-α-PE (eBioscience) y anti-IL-12-PE (eBioscience) y se incubarán 1
hora a 4° C en oscuridad, y terminada la incubación se lavarán dos veces con Perm/Wash y
se resuspenderá en 350 μL de regulador para su análisis en el citómetro de flujo FACS
Canto (BD Biosciences).
23
Análisis estadístico
Análisis univariado de las variables continuas se describirán de acuerdo a su distribución
(promedio ± desviación estándar , mediana y percentiles). Las características demográficas
de la población se expresarán en porcentaje de frecuencia. Para el análisis bivariado de
variables continuas y comparación de grupos de pacientes se emplearan t de Student o U de
Mann Whitney. Para la comparación de variables cualitativas se empleará Chi 2 o prueba
exacta de Fisher de acuerdo con valores esperados. Para la comparación de variables
cuantitativas entre grupos se empleará ANOVA o Kruskal Wallis de acuerdo con la
distribución de los datos y homogeneidad de varianzas. Se considerara un valor de p ≤ 0.05.
24
Aspectos éticos
Este protocolo corresponde aún estudio de riesgo mínimo de acuerdo al reglamento de la
Ley General de Salud en materia de Investigación, ya que solo se tomará una muestra de
sangre en una ocasión. Dado estas características se solicitará consentimiento verbal. La
información de los expedientes de los pacientes será confidencial y la cual será
exclusivamente utilizada con fines de la investigación de la enfermedad cardiovascular. La
identidad del paciente se protegerá a través de identificar a los pacientes con números
secuenciales, los cuales serán almacenados en una base de datos que contendrá la
información, en un disco duro exclusivo para el protocolo de investigación, el cual tendrá
solo acceso la Dra. Alejandra Madrid Miller a través de una clave, protegiéndose la
información a personas no autorizadas. Se anexa hoja de consentimiento verbal.
25
Recursos, financiamiento y factibilidad
Pacientes: La UMAE Hospital de Cardiología, tiene un ingreso mensual promedio de 80
pacientes, de los cuales el 95 % aproximadamente es debido a síndrome coronario agudo.
Recursos físicos y materiales: La Unidad de Investigación Médica en Inmunología,
Hospital de Pediatría, CMN SXXI y la Unidad de Investigación Médica en Autoinmunidad,
Hospital de Especialidades, CMN SXXI cuenta con los recursos, equipo y reactivos
necesarios para llevar al cabo los experimentos así como el personal capacitado.
Recursos financieros: Se someterá a evaluación del Concurso de Apoyo Financiero para el
Desarrollo de Protocolos de Investigación y Desarrollo Tecnológico sobre Temas
Prioritarios de Salud IMSS. Tiempo a desarrollarse: El protocolo se desarrollara en 3 años y
medio.
Caracterización de la frecuencia y activación de las células dendríticas slan
provenientes de pacientes con síndrome coronario agudo.
Cronograma de actividades
Etapa 1
Duración: 6 meses
 Descripción de la etapa: Estandarización de las técnicas en particular en cuanto a
la caracterización fenotípica de las células dendríticas slan, así como la expresión de
TLR2, TLR4, CD80, CD86, CD40, HLA-DR y CCR2. Además, se establecerán los
rangos de normalidad en sujetos sanos, posteriormente estos datos se compararan
con lo que se encuentren en los pacientes con síndrome coronario agudo.
 Productos entregables: Se podría poner a la disposición de quien lo necesite la
metodología para determinar fenotípicamente a las células dendríticas slan, así
como la expresión de TLR2, TLR4, CD80, CD86, CD40, HLA-DR y CCR2.
También, estaremos en condiciones para brindar apoyo técnico y científico en el uso
del citometro a cualquier Servicio o Unidad de Investigación que lo solicite.
Etapa 2
Duración: 6 meses
 Descripción de la etapa: Se determinará la frecuencia de las células dendríticas
slan en circulación en los pacientes y sujetos sanos.
 Productos entregables: Se podría poner a la disposición de quien lo necesite la
metodología para determinar la frecuencia de las células dendríticas slan en
circulación en pacientes.
Etapa 3
Duración: 6 meses
 Descripción de la etapa: Los procedimientos estandarizados en la etapa 1 se
aplicaran para determinar la expresión de TLR2, TLR4, CD80, CD86, CD40, HLA-
DR y CCR2, en las células dendríticas slan provenientes tanto de los pacientes
como de los sujetos sanos.
26
 Productos entregables: Se podría poner a la disposición de quien lo necesite la
metodología para determinar la expresión de TLR2, TLR4, CD80, CD86, CD40,
HLA-DR y CCR2 en las células dendríticas slan en pacientes.
Etapa 4
Duración: 6 meses
 Descripción de la etapa: Se realizaran los análisis estadísticos para determinar las
diferencias en la expresión de las moléculas estudiadas, así como la frecuencia de
las células dendríticas slan entre los pacientes y los sujetos sanos. También, se
realizaran las asociaciones entre la frecuencia de las células dendríticas slan con las
diferentes manifestaciones clínicas de pacientes con síndrome coronario agudo. Así
como el estado que guarda la expresión de TLR2, TLR4, CD80, CD86, CD40,
HLA-DR y CCR2, en las células dendríticas slan con respecto las manifestaciones
de enfermedad, así como con la evolución de las mismas.
 Productos entregables: Se podría tener enviado a publicar los primeros resultados
de este proyecto a una revista indexada y con circulación internacional.
Etapa 5
Duración: 6 meses
 Descripción de la etapa: Estandarización de cultivos de las células dendríticas slan
provenientes de sujetos sanos, así como de la activación de estos células vía TLR2 y
TLR4 y determinar la respuesta en base a la expresión de las moléculas: TLR2,
TLR4, CD80, CD86, CD40, HLA-DR y CCR2.
 Productos entregables: Se tendrán las condiciones óptimas para la activación de
TLR2 y TLR4, lo que permitirádeterminar las distintas moléculas en las células
dendríticas slan de pacientes. En esta etapa se podría trasferir la tecnología antes
mencionad a los laboratorios que así lo requieran.
Etapa 6
Duración: 6 meses
 Descripción de la etapa: Se realizaran los cultivos celulares de las células
dendríticas slan provenientes de pacientes y sujetos sanos. Se llevaran a cabo los
experimentos de activación vía TLR2 y TLR4 y determinar la respuesta de las
células dendríticas slan en cuanto a la expresión de las moléculas: TLR2, TLR4,
CD80, CD86, CD40, HLA-DR y CCR2. Con los resultados obtenidos se tratara de
asociar la respuesta de las células dendríticas slan provenientes de los pacientes con
las manifestaciones de enfermedad así como con la evolución de la misma.
 Productos entregables: Se realizará un escrito con los resultados generados, los
cuales se enviaran para su publicación. También, se podría trasferir la tecnología
con los parámetros de normalidad y sus posibles implicaciones clínicas de los
resultados obtenidos para una posible caracterización de los pacientes con síndrome
coronario agudo.
Etapa 7
Duración: 6 meses
 Descripción de la etapa: De los cultivos celulares se identificaran las células
dendríticas slan de sujetos sanos y de pacientes, y se cuantificaran los niveles de
27
TNF-α e IL-12. Posteriormente se asociaran los niveles de esta citocinas con la
expresión de las moléculas estudiadas y con las manifestaciones de enfermedad, así
como con la evolución de las mismas. También, se realizaran los análisis
estadísticos con las correlaciones de los resultados obtenidos y se estructurará un
manuscrito para su publicación.
 Productos entregables: Se podría trasferir la tecnología con los parámetros de
normalidad y sus posibles implicaciones clínicas de los resultados obtenidos y sus
posibles implicaciones en la caracterización de los pacientes con síndrome
coronario agudo. Se enviara a publicar los resultados de este proyecto a una revista
indexada y con circulación internacional. Además, este proyecto permitirá que se
gradúe un alumno de Licenciatura y uno de Maestría en Ciencias, de los alumnos
graduados en este protocolo seré el tutor. También, se podrá dar apoyo técnico y
científico en el uso del citometro a cualquier Servicio o Unidad de Investigación
que lo solicite.
Caracterización inmunofenotípica y funcional de las subpoblaciones de monocitos en
pacientes con síndrome coronario agudo
Desglose del presupuesto
Gasto de inversión
Equipo de laboratorio y médico. $250 000.00
Equipo de cómputo. $0.00
Herramientas y accesorios. $0.00
Subtotal $250 000.00
Gasto Corriente
Artículos materiales y útiles diversos. $2 685 000.00
Gastos de trabajo de campo. $0.00
Difusión de los resultados de Investigación. $25 000.00
Pago por servicios externos. $0.00
Honorarios por servicios profesionales. $0.00
Viáticos, pasajes y gastos de transportación. $40 000.00
Gastos de atención a profesores visitantes, técnicos o expertos
visitantes.
$0.00
Compra de libros y suscripción a revistas. $0.00
Material de oficina. $0.00
Publicación o producción de libros y revistas. $0.00
Documentos y servicios de información. $0.00
Registro de patentes y propiedad intelectual. $0.00
Validación de concepto tecnológico. $0.00
Animales para el desarrollo del protocolos de investigación. $0.00
Apoyo a estudiantes de maestría o doctorado que participen en el
desarrollo de protocolos de investigación
$0.00
Subtotal $2 750 000.00
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Total $3 000 000.00
Justificación de cada rubro de gasto
Gasto de inversión:
En este apartado lo único que solicitamos en una centrifuga refrigerada de la marca
Hettich modelo Universal 320 R, cuyo costo es de $250 000.00 pesos M/N, por las
siguientes razones: Desafortunadamente el laboratorio donde se procesaran las muestras no
cuenta con este equipo y consideramos que este aparato es necesario para la realización del
proyecto que estamos proponiendo, por que nos permitiría realizar los experimento de una
manera más eficaz. Actualmente, dependemos de que se nos faciliten la centrifuga otro
laboratorio.
Gasto Corriente:
Artículos materiales y útiles diversos.
Dada la amplitud del proyecto consideramos que $ 2 685 000.00 pesos M/N del
financiamiento debe ser invertido exclusivamente en reactivos a fin de garantizar que se
cumplan con los objetivos. Este rubro es muy importante para el desarrollo del proyecto,
los gastos consisten en material necesario para realizar los experimentos.
Durante la realización de este proyecto se compraran de manera continua anticuerpos
dirigidos contra las moléculas que estudiaremos como son: anti-TLR2, anti-TLR4, anti-
CD80, anti-CD86, anti-CD40, anti-HLA-DR, anti-CCR2, anti-CD123-Violeta brillante
421, anti-HLA-DR-APC-Cy7, (BD Pharmingen), anti-CD11c-APC, anti-M-DC8-APC-
FITC (Miltenyi Biotec MACS, Bergish Gladbach, Germany), los cuales utilizaremos para
la caracterización y separación de las células dendríticas slan provenientes de pacientes
como de sujetos sanos, así como anticuerpos anti-CD3-PE, anti-CD14-PE, anti-CD19-PE y
anti-CD56-PE, para descartar linaje. También, se adquirirá material para cultivo de células
como medios de cultivo, suero fetal bovino, antibióticos, entre otros; así como reactivos
para activación de las poblaciones celulares (LPS, Pam3CSK4). También, se adquirirán de
manera constante anticuerpos para la determinación de citocinas intracelulares, así como
kits para realizar estos procedimientos. En todas las etapas que abarca este proyecto se
comprara constantemente material de plástico en general (tubos de 15 ml, de 50 ml, placas
de cultivo, pipetas serológicas, entre otros materiales), reactivos para el citómetro de flujo y
reactivos diversos, de tal forma que proponemos que el gasto de reactivos se proporcione
de la siguiente manera:
Etapa Duración Gasto
1 6 meses $ 383,571.43
2 6 meses $ 383,571.43
3 6 meses $ 383,571.43
4 6 meses $ 383,571.43
5 6 meses $ 383,571.43
6 6 meses $ 383,571.43
7 6 meses $ 383,571.43
Subtotal $ 2 685 000.00
29
Difusión de los resultados de Investigación.
En este apartado solicitamos el apoyo económico de 25 000.00 pesos M/N para gastos de
publicación de los resultados.
Viáticos, pasajes y gastos de transportación. En esta sección se solicitan $40 000.00 para
participar en al menos en un congreso internacional de alto prestigio relacionado con
nuestra área de investigación, para discutir los resultados obtenidos con nuestros pares y se
utilizaran para el pago de pasajes y de hospedaje.
30
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