Clonacion-expresion-purificacion-y-caracterizacion-de-dos-piruvato-cinasas-presentes-en-vibrio-cholerae

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS
FACULTAD DE MEDICINA
CLONACIÓN, EXPRESIÓN, PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN
DE DOS PIRUVATO CINASAS PRESENTES EN VIBRIO CHOLERAE
TESIS 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE 
DOCTOR EN CIENCIAS
PRESENTA:
CARLOS ALBERTO GUERRERO MENDIOLA
DIRECTOR DE TESIS
Dra. LETICIA H. RAMÍREZ SILVA
FACULTAD DE MEDICINA
COMITÉ TUTOR
Dr. JUAN PABLO PARDO VÁZQUEZ Dra. ADELA RODRÍGUEZ ROMERO
 FACULTAD DE MEDICINA INSTITUTO DE QUÍMICA
 
 Ciudad Universitaria ,2017 
 
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El presente trabajo se realizó bajo la
dirección de la Dra. Leticia Haydeé
Ramírez Silva en el Departamento de
Bioquímica de la Facultad de Medicina de
la Universidad Nacional Autónoma de
México. Durante el desarrollo del trabajo
conté con beca del Consejo Nacional de
Ciencia y Tecnología.
 
 
Dedico esta tesis a mi Mamá y a mi Hermano, gracias por todo.
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad Nacional Autónoma de México por la formación recibida.
A los miembros del comité tutorial y del jurado: Dra. Leticia Haydeé Ramírez Silva, Dr.
Armando Gómez Puyou, Dr. Juan Pablo Pardo Vázquez, Dra. Adela Rodríguez Romero,
Dra Marietta Tuena de Gómez Puyou, Dr. Salvador Uribe Carvajal, Dr. Juan Luis Rendón
Gómez y Dra. Alicia González Manjarrez
Agradezco principalmente a la Dra. Leticia por aceptarme como su alumno, como su amigo
y por sus enseñanzas en la ciencia y en la vida.
A los Doctores Armando Gómez Puyou y Marietta Tuena de Gómez Puyou por los
seminarios, su apoyo, sus enseñanzas, consejos y su gran paciencia.
A todas las personas que con su trabajo, colaboración y recomendaciones ayudaron a la
realización de este proyecto: Dr. Juan Pablo Pardo, Dra. Gloria Hernández, Nallely
Cabrera, Dra Emma Saavedra, Dra. Rusely Encalada, Dr. José de Jesús García.
A todos los amigos del departamento de bioquímica, del INP y compañeros de laboratorio
por su amistad, consejos, momentos y apoyo durante todos estos años.
Especialmente gracias a mi mama por todo su amor y apoyo incondicional durante toda mi
vida, a nano por ser el mejor hermano y a Cyn por todo su cariño, paciencia y amor.
A Toooda mi familia y a tooodos mis amigos, gracias por todo. 
 
INDICE
ABREVIATURAS..................................................................................................................1
RESUMEN............................................................................................................................2
ABSTRACT...........................................................................................................................4
INTRODUCCION..................................................................................................................6
Vibrio cholerae...............................................................................................................................6
Piruvato cinasa..............................................................................................................................9
Regulación de la piruvato cinasa..............................................................................................10
Estructura de la piruvato cinasa................................................................................................12
Actividad dependiente e independiente de catión monovalente...........................................17
Mecanismo cinético....................................................................................................................25
OBJETIVOS........................................................................................................................27
Objetivo general..........................................................................................................................27
Objetivos particulares.................................................................................................................27
MATERIALES Y MÉTODOS...............................................................................................28
Reactivos......................................................................................................................................28
Clonación, sobreexpresión y purificación de VcIPK y VcIIPK...............................................28
Ensayos de la actividad de VcIPK y VcIIPK............................................................................32
Estudios cinéticos.......................................................................................................................33
Síntesis y purificación del Cromo-ADP....................................................................................33
Experimentos de Fluorescencia................................................................................................34
Anticuerpos policlonales anti-VcIPK y anti-VcIIPK.................................................................34
Inmunodetección de VcIPK y VcIIPK con Western Blots......................................................35
Determinación de metabolitos en extractos de V.cholerae...................................................36
RESULTADOS Y DISCUSIÓN...........................................................................................38
Purificación de VcIPK y VcIIPK y determinación de la masa molecular.............................38
Activación por cationes monovalentes en VcIPK y VcIIPK...................................................39
Activación por efectores alostéricos en VcIPK y VcIIPK.......................................................42
Ensayos de actividad de VcIPK y VcIIPK en presencia de Mg2+ y Mn2+.............................44
Parámetros cinéticos de VcIPK y VcIIPK en presencia de Mg2+..........................................44
Parámetros cinéticos para VcIPK y VcIIPK en presencia de Mn2+.......................................47
Estudios de velocidad inicial en VcIPK y VcIIPK....................................................................50
Estudios de inhibición sin salida en VcIPK y VcIIPK..............................................................52
Estudios de fluorescencia en VcIPK y VcIIPK........................................................................55
Expresión de VcIPK y VcIIPK en Vibrio cholerae...................................................................57
Determinación de metabolitos en extractos de Vibrio cholerae............................................60
CONCLUSIONES...............................................................................................................62
REFERENCIAS..................................................................................................................63
ABREVIATURAS
BCA Ácido bicinconínico
BN-PAGE Electroforesis nativa
 Dodecil sulfato de sodio
EDTA Ácido etileno diamino tetracético
Fru 1,6-BP Fructosa 1,6-bisfosfato
Fru 2,6-BPFructosa 2,6-bisfosfato
Glc 6-P Glucosa 6-fosfato
IPTG Isopropil-1-tio-β-D-galactopiranosido
LDH Lactato deshidrogenasa
M+ Catión monovalente
M2+ Catión divalente
MLA Marcos de lectura abierta
PEP Fosfoenolpiruvato
PK Piruvato cinasa
Rib 5-P Ribosa 5-fosfato
RMPK Piruvato cinasa de músculo de conejo
RMPK-E117K Mutante E117K de piruvato cinasa de músculo de conejo
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de 
TK Transcetolasa 
TMACl Cloruro de tetrametilamonio 
TpPK Piruvato cinasa de Termofilum pendens
VcIIIPK Piruvato cinasa III de Vibrio cholerae 
VcIIPK Piruvato cinasa II de Vibrio cholerae 
VcIPK Piruvato cinasa I de Vibrio cholerae
1
RESUMEN 
En un estudio filogenético previo de la familia de la piruvato cinasa, se observó un
árbol con topología dicotómica. Una rama tiene secuencias que presentan glutámico en la
posición 117 (numeración de acuerdo a la secuencia de la piruvato cinasa de músculo de
conejo) y la otra presenta una lisina en la misma posición. Las enzimas con el Glu117,
son K+-dependientes y aquellas con la Lys117 son K+-independientes. Adicionalmente, se
encontró que todos los organismos presentan un solo tipo de piruvato cinasa con
excepción de las -proteobacterias, que pueden poseer enzimas de ambas ramas del
árbol filogenético. El objetivo de este trabajo fue explorar si estas enzimas
filogenéticamente distintas, se expresan de forma endógena en la bacteria y si ambas
contribuyen en la actividad de piruvato cinasa. Se estudió a la enzima con el Glu117 y a
una de las dos enzimas con la Lys117 presentes en Vibrio cholerae. Este trabajo es la
primera caracterización de las piruvato cinasas en esta -proteobacteria. 
Las dos isoenzimas se clonaron, sobreexpresaron, purificaron y se caracterizaron
cinéticamente. Los resultados mostraron enzimas con características cinéticas muy
diferentes entre sí. La isoforma con el Glu117 (VcIPK) tiene una actividad de 380 y 0.032
μmol min-1 mg-1 con y sin K+, respectivamente por lo tanto, es dependiente de catión
monovalente y la activación mayor se obtiene con K+ seguida de Rb+, NH4+, Cs+, Na+ y Li+.
La enzima con la Lys117 (VcIIPK) es independiente de catión monovalente. Por otro lado,
VcIPK se activa alostericamente por fructosa 1,6-bisfosfato y VcIIPK se activa por glucosa
6-fosfato y ribosa 5-fosfato, siendo este último el mejor activador. La fructosa 1,6-
bisfosfato es un activador “tipo K” de VcIPK (modifica la K0.5 del PEP); mientras que en
VcIIPK, la ribosa 5-fosfato es un modulador alostérico “tipo mixto” y tiene efecto sobre la
K0.5 y la Vmax de todos los sustratos (PEP, ADP-Mg y Mg2+libre). En ausencia de su efector
alostérico y la misma concentración de sustratos, VcIPK exhibe una Vmax del 80% de
aquella encontrada en presencia del efector. Este resultado coincide con la activación no
esencial de los moduladores alostéricos descrita para la mayoría de las piruvato cinasas.
En contraste, la actividad de VcIIPK sin efector alostérico, es del 0.5% de la actividad total
que muestra en presencia de la ribosa 5-P. Esto sugiere que el azúcar monofosforilado es
un potente activador de VcIIPK y esta dependencia catalítica del efector alostérico es una
característica novedosa de esta piruvato cinasa. Sin embargo, la activación esencial de
VcIIPK por ribosa 5-P desaparece cuando los estudios se realizan en presencia de Mn2+
2
(en sustitución de Mg2+). A pesar de presentar una regulación alostérica diferente, ambas
enzimas exhiben un mecanismo cinético secuencial al azar en equilibrio rápido. Estudios
de fluorescencia intrínseca mostraron que la fructosa 1,6 bisfosfato le confiere una mayor
flexibilidad a VcIPK, mientras que ribosa 5-fosfato no muestra efecto sobre VcIIPK. En
cambio, se observa que el Mn2+ la lleva a una conformación más compacta. Por otra
parte, se midieron las concentraciones intracelulares de la fructosa 1,6-bisfosfato y de la
ribosa 5-fosfato en la cepa CVD 103 de V. cholerae y se verificó que las concentraciones
determinadas son suficientes para inducir la máxima activación en sus respectivas
enzimas. Adicionalmente, el análisis de inmunodetección por Western-blot, indica que
ambas enzimas se expresan en V. cholerae cultivada en LB y aerobiosis. En conjunto los
resultados indican que tanto VcIPK como VcIIPK contribuyen a la actividad de piruvato
cinasa en Vibrio cholerae.
3
ABSTRACT
A previous phylogenetic study of the family of pyruvate kinase exhibited a tree with
dichotomic topology. One cluster has sequences that contain glutamic at position 117
(numbering according to the sequence of rabbit muscle pyruvate kinase) and the other has
lysine at the same position. The characterized enzymes that have Glu117 are K+-
dependent (type I) and those with Lys117 exhibited monovalent cation independent activity
(type II). Interesting, in this analysis it was found that all the organisms have only one type
of pyruvate kinase, except for -proteobacteria, which may possess enzymes in both
branches of the phylogenetic tree. In this context, the aim of this work was to explore if
these phylogenetically distinct enzymes, are endogenously expressed in the bacteria and
both contribute to the activity of pyruvate kinase. Therefore, the enzyme with Glu117 and
one of the two enzymes with Lys117 present in Vibrio cholerae were studied. This work is
the first report of the characterization of the pyruvate kinases of this -proteobacterium. 
 The two isozymes were cloned, overexpressed, isolated and kinetically characterized.
The results showed enzymes with very different kinetic features. The isozyme with Glu117
(VcIPK) exhibits an activity of 380 and 0.032 µmol min-1 mg-1 with and without K+,
respectively. Therefore, VcIPK was monovalent cation dependent and the greatest
activation was obtained with K+ followed by Rb+, NH4+, Cs+, Na+ and Li+. The isozyme with
Lys117 (VcIIPK) is monovalent cation independent. On the other hand, VcIPK is
allosterically activated by fructose 1, 6-bisphosphate and VcIIPK is activated by glucose 6-
phosphate and ribose 5-phosphate, the latter being the best activator. Fructose 1,6-
bisphosphate is a K type activator of VcIPK (it modifies K0.5 of PEP); whereas ribose 5-
phosphate is a mixed type activator of VcIIPK (it modifies either K0.5 and Vmax of all the
substrates (PEP, ADP-Mg and Mg2+free)) . In the absence of its allosteric effector and at the
same substrate concentration, VcIPK exhibited a Vmax 80% of that found with the effector.
This result is in agreement with the non-essential activation of the allosteric modulators
described for most of the pyruvate kinases. In contrast, at the same substrate
concentration and without the allosteric effector, the activity of VcIIPK was 0.5% of that
observed with ribose 5-phosphate. These data showed that the monophosphorylated
sugar was a strong activator of VcIIPK and this catalytic dependence on the allosteric
effector is a novel feature of this pyruvate kinase. However, the essential activation of
ribose 5-phosphate in VcIIPK disappeared when the assays were performed in the
presence of Mn2+ (in substitution of Mg2+).Despite of the different allosteric regulation, both
4
enzymes exhibit a rapid equilibrium random order kinetic mechanism. Intrinsic
fluorescence assays showed that fructose 1,6-bisphosphate confers VcIPK high flexibility
while no effect was observed by ribose 5-P in VcIIPK. Instead it was observed that Mn2+
leads to a more compact conformation of VcIIPK. On the other hand, intracellular
concentrations of fructose 1,6-bisphosphate and ribose 5-phospate were measured in the
V. cholerae 103 CVD strain and it was verified that these metabolite concentrations are
enough to induce maximal activation of their respective enzymes. In addition, Western-blot
immunodetection analysis showed that both enzymes are expressed in aerobic LB
cultures of V. cholera. These data indicate that VcIPK and VcIIPK contribute to the activity
of pyruvate kinase in Vibrio cholerae. 
5
INTRODUCCION
Vibrio cholerae
En 1965, Véron propuso formalmente el nombre de la familia Vibrionaceae. Se
consideró agrupar aquellas bacterias fermentativas que tuvieran un flagelo polar y fueran
oxidasa positiva (es decir que presentan citocromo c oxidasa). La familia está constituida
por los géneros Vibrio, Photobacterium, Aeromonas y Plesiomonas [Farmer y cols. 1985]. 
Las especies del género Vibrio pertenecen a las -proteobacteria. Son bacilos
curvos gram negativos que se mueven de forma errática gracias a un único flagelo.
Pueden ser aerobios, anaerobios facultativos y fermentadores de glucosa. Toleran pH
alcalinos y algunas especies necesitan medios de alta salinidad para crecer (halófilos).
Son ubicuos en ambientes acuáticos, es decir se encuentran tanto en agua dulce como
salobre. En estos medios acuosos pueden mantener su capacidad virulenta sin
multiplicarse durante largos periodos de tiempo. Más frecuentemente se encuentran en
aguas templadas y pueden aislarse de mariscos y pescados, donde pueden alcanzar
concentraciones elevadas [Seas y Gotuzzo 2005]. Se han identificado más de 35
especies del género Vibrio de las que 12 son “vibriones marinos”, gérmenes ambientales
que no se han asociado a una patología humana [Garrity y cols. 2004]. El resto de las
especies (V. cholerae, V. parahemolyticus, V. fluvialis, V. vulnificus, V. damsela, V.
hollisae, V. mimicus, entre otros), producen gastroenteritis, infección de heridas y tejidos
blandos y sepsis/bacteriemia.
 Vibrio cholerae es la especie de mayor importancia clínica y epidemiológica,
cuyas cepas O1 (denominadas así porque se aglutinan con el antisuero O1) son
causantes de los casos clásicos de cólera pandémico. Con excepción del serogrupo 0139
o “ Bengal” , causante de una gran epidemia en 1992 en India y Bangladesh [Ramamurthy
y cols.1993], las cepas no-O1 de V. cholerae y el resto de las especies se considera que
no causan síndromes diarreicos tan graves y que producen más frecuentemente
infecciones extraintestinales [World Health Organization 2000].
El genoma de Vibrio cholerae contiene un gran repertorio de genes que codifican
para proteínas de transporte y enzimas para catabolizar un amplio rango de nutrientes.
Esto es congruente con el estilo de vida tan versátil que presenta esta bacteria. Es un
organismo que puede encontrarse en forma de vida libre, asociado a organismos
acuáticos del plancton y zooplancton (copépodos, pequeños crustáceos, gusanos y
6
moluscos) [Colwell, 1996] , o bien en otro tipo de fauna y flora acuática como plantas,
algas, lirio etc.[Tamplin y cols.1990], también puede encontrarse en algunos protozoos
(Abd y cols. 2005; 2007), o como patógeno de algunos organismos hospederos no
acuáticos como aves y humanos [Ogg y cols. 1989], igualmente puede encontrarse en
estado latente no cultivable, condición en la que las bacterias son metabólicamente
activas ante un estrés, pero incapaces de llevar a cabo división celular [Rozak y Colwell
1987].
Un grupo de investigadores encontró que el genoma de V. cholerae y otros
integrantes del mismo género (Vibrio parahaemolyticus, V. anguillarum, V. fluvialis y V.
vulnificus), presenta 4,033,460 pares de bases (pb), distribuidos en dos cromosomas
circulares, de 2,961,146 pb (cromosoma 1) y 1,072,314 pb (cromosoma 2) (Figura 1)
[Trucksis y cols.1998, Heidelberg y cols. 2000]. En conjunto, ambos codifican para 3,885
marcos de lectura abierta. La mayoría de los genes requeridos para el crecimiento y la
viabilidad de la bacteria están ubicados en el cromosoma 1, aunque también existen
genes exclusivos del cromosoma 2 que pueden ser esenciales para el funcionamiento
normal de la célula (dsdA, thrS, genes que codifican para las proteínas ribosomales L20 y
L35 y otros que codifican para diferentes intermediarios de rutas metabólicas) [Heidelberg,
2000]. Los genes que son esenciales para las funciones básicas de la bacteria
(replicación, transcripción y traducción del ADN y biosíntesis de la pared celular), así
como de patogenicidad (toxinas y adhesinas), se localizan principalmente en el
cromosoma mayor. En este último, se desconoce la función del 42% de los genes totales,
mientras que el cromosoma menor contiene 58% de genes hipotéticos. 
 
FIGURA 1. Características generales del genoma de Vibrio cholerae. [Heidelberg y cols.
2000].
7
El análisis de la secuencia del genoma de Vibrio cholerae mostró que la mayoría
de los genes presentaban gran similitud con los de Escherichia coli (1,454 marcos de
lectura abierta (MLA)). También se observó que 499 MLA que corresponden al 12.8% del
total, mostraron una alta similitud con respecto a otros genes, lo que sugiere la existencia
de duplicaciones recientes [Heidelberg y cols. 2000]. La mayoría de los MLA duplicados
codifican para productos relacionados con funciones de regulación, quimiotaxis [Bateman
y cols. 1999], transporte y adherencia [Jonson y cols. 1991], transposición [Fraser 1997],
patogenicidad [Colwell 1996] y funciones desconocidas codificadas por proteínas
hipotéticas conservadas. De un total de aproximadamente 105 duplicaciones, por lo
menos un MLA se encuentra en cada cromosoma, indicando entrecruzamientos recientes
entre ambos cromosomas. La extensa duplicación de genes involucrados en conservar la
homeostasis (quimiotaxis y transporte de solutos), apoya la importancia de los productos
de estos genes en la biología de V. cholerae, principalmente en relación a su capacidad
para habitar diversos ambientes. Es probable que estos ambientes, condujeran la
duplicación y divergencia de los genes utilizados para funciones específicas. La
existencia de varios MLA con funciones aparentemente idénticas en ambos cromosomas,
sugiere la participación de transferencia lateral de genes y/o eventos de transposición
[Mekalanos 1983]. Cabe mencionar que esta característica de poseer dos cromosomas,
se encuentra en otras especies del genero Vibrio, y que el hecho de que el cromosoma
menor sea considerado un megaplásmido (capturado por una especie ancestral de
Vibrio), sugiere que les confiere una ventaja evolutiva, principalmente dentro del
ecosistema acuático, donde diferentes especies de Vibrio son los microorganismos
dominantes [Colwell 1994]. Como ya se mencionó, V. cholerae presenta MLA que
codifican para proteínas con un alto grado de similitud entre ellas. Es interesante para
nuestra línea de investigación el caso particular de la enzima piruvato cinasa. En el
genoma de V. cholerae se encuentran tres genes que codifican para tres isoenzimas de la
piruvato cinasa. Dos de ellas se encuentran en el cromosoma 1 y la otra en el
cromosoma 2. El significado de la existencia de dos o más isoformas de la piruvato
cinasa y su papel metabólico en V. choleraese desconocen. No existe información en la
literatura acerca de las piruvato cinasas de V. cholerae.
8
Piruvato cinasa
La piruvato cinasa (PK) (ATP-piruvato 2-O-fosfotransferasa, E.C. 2.7.1.40), realiza
la segunda fosforilación a nivel de sustrato de la glucólisis. Cataliza la transferencia
directa del grupo fosfato del fosfoenolpiruvato (PEP) al ADP para formar ATP y piruvato
en presencia de dos equivalentes de un catión divalente (Mg2+) [Gupta y Oesterling 1976,
Baek y Nowak 1982] y uno de un catión monovalente (K+) [Boyer y cols. 1942, Kayne
1973, Nowak y Suelter 1981]. Esta reacción constituye el último paso de la vía glucolítica
y se lleva a cabo en dos etapas (Figura 2): en la primera etapa el fosfato terminal del ADP
ataca nucleofílicamente al PEP y se realiza la transferencia directa reversible del grupo
fosfato del PEP al complejo ADP-Mg, formando ATP-Mg y enolpiruvato inestable
[Seeholzer y cols. 1991]; durante la segunda etapa, un ión hidronio cede un protón al
enolpiruvato y se lleva a cabo la tautomerización ceto-enol produciendo piruvato en su
conformación ceto estable [Kuo y Rose 1978]. La cetonización altamente favorable hace
que la reacción global sea exergónica, al grado que la reacción es metabólicamente
irreversible (Larsen y cols. 1994). La energía derivada de la hidrólisis del PEP es mayor
que la que se requiere para fosforilar el ADP; por lo tanto, la formación de los productos
(ATP y piruvato) se encuentra muy favorecida en la reacción (Keq = 6.45 X 103 a pH 7.4)
[Muirhead 1987]. El piruvato producto de esta reacción, es un intermediario importante en
el metabolismo de los hidratos de carbono, al servir como molécula precursora en
distintas rutas bioquímicas, por lo que la enzima piruvato cinasa constituye uno de los
puntos de regulación de la vía y se considera un punto de intersección metabólica. El
hecho de que las vías del metabolismo de los hidratos de carbono lleven a cabo tanto
procesos de anabolismo como de catabolismo, requiere la existencia de mecanismos de
control que regulen el flujo de metabolitos dentro de los procesos de degradación y de
biosíntesis de las biomoléculas [Sanwal 1970]. La regulación de estas rutas metabólicas
puede estar dada por un aumento o disminución en la expresión de genes dentro de la
célula, o por la modificación de la actividad de las enzimas presentes en estos procesos
biológicos. Los organismos en general, han desarrollado una amplia variedad de
mecanismos para el control de la actividad de las enzimas que son puntos de regulación
importantes en las vías metabólicas. La regulación de la piruvato cinasa es importante
para el control de las concentraciones de nucleótidos (carga energética ATP, ADP, AMP),
las concentraciones de intermediarios glucolíticos en la célula [Jurica y cols. 1998] y para
tejidos que llevan a cabo la gluconeogénesis, en donde la inhibición de la PK es
necesaria para evitar ciclos fútiles [Rognstad 1976]. En los organismos y en ciertos tejidos
9
donde la glucólisis y la gluconeogénesis ocurren simultáneamente, la enzima está sujeta
a múltiples mecanismos de control (fosforilaciones, modificaciones covalentes y efectores
alostéricos) y posee propiedades regulatorias especialmente diseñadas para un fino
control del balance entre estas dos vías metabólicas [Seubert y Schoener 1971, Kayne
1973]. 
 
FIGURA 2. Reacción catalizada por la piruvato cinasa.
Regulación de la piruvato cinasa
Las enzimas como la piruvato cinasa, que ocupan posiciones claves dentro de las
rutas metabólicas en puntos de intersección, son ideales para controlar el flujo de
metabolitos a través de sus vías. Frecuentemente estas enzimas presentan cinética tipo
no Michaeliana y son susceptibles a presentar regulación alostérica por sus sustratos,
productos y otros efectores cuya naturaleza química dependerá del metabolismo
particular del organismo o tejido. No es sorprendente que la mayoría de las piruvato
cinasas estén reguladas alostéricamente. Las PKs usualmente se activan de forma
homotrópica por su sustrato (PEP) para permitir la regulación del flujo glucolítico en
10
respuesta a niveles elevados de este sustrato [Morgan y cols. 2014], aunque existen
reportes en la literatura de algunos organismos que presentan piruvato cinasas que
también muestran cooperatividad con respecto al ADP [Ng y Hamilton 1975, Guderley
1980]. Las piruvato cinasas que muestran cinética sigmoide por alguno de sus sustratos,
generalmente presentan regulación alostérica del tipo heterotrópica por diferentes
moléculas que varían según el contexto metabólico del organismo o célula. Los efectores
más comunes de las PKs son: fructosa 1,6 bisfosfato (Fru 1,6-BP), fructosa 2,6 bisfosfato
(Fru 2,6-BP), AMP, ribosa 5 fosfato (Rib 5-P) y glucosa 6 fosfato (Glc 6-P) [Muñoz y
Ponce 2003]. La mayoría de los organismos presentan al menos un gen que codifica para
una PK. Sin embargo, encontramos organismos que contienen más de un gen de piruvato
cinasa, codificando para diferentes isoformas de la enzima. Los requerimientos
metabólicos de un organismo pueden variar en función del tiempo y/o del tipo celular. Por
esta razón muchos organismos producen diferentes formas de regulación para las
isoformas de la PK. Su localización en distintos tejidos satisface las diferentes
necesidades metabólicas y de crecimiento [Jurica y cols. 1998]. Un buen ejemplo de lo
mencionado anteriormente son las piruvato cinasas de mamíferos, en donde existen 4
isoformas (R, L, M1 y M2) que exhiben diferentes propiedades cinéticas y diversos
mecanismos de regulación. La isoforma R (expresada en eritrocitos), la isoforma L, que se
encuentra en hígado donde ocurre frecuentemente la alternancia metabólica entre la
glucólisis y la gluconeogénesis, la M1 (expresada en músculo esquelético, corazón y
cerebro), tejidos donde la glucólisis es la principal vía metabólica y la isoforma M2 que se
localiza principalmente en riñon, pulmones y tejido embrionario [Mesecar y Nowak 1997].
La isoforma M1 es considerada como una enzima constitutivamente activa, no-regulada,
porque muestra cinéticas hiperbólicas (tipo Michaelis-menten) en la interacción con sus
sustratos en la mayoría de las condiciones metabólicas y no presenta activación
alostérica. Las otras tres isoformas (R, L y M2) se consideran alostéricas, debido a que
muestran cinética sigmoide en la unión del PEP y se activan por el efector heterotrópico
Fru 1,6-BP, que es producto de la reacción de la enzima fosfofructocinasa durante la
glucólisis [Jurica y cols. 1998]. Además, las isoformas L y M2 se regulan por otros
mecanismos; la L se activa por una fosforilación que ocurre en una serina localizada en
su dominio amino terminal [Prasannan y cols. 2012] y la isoforma M2 se activa por la unión
alostérica de una serina a la enzima [Chaneton y cols. 2012]. Otro ejemplo donde existen
diferentes isoformas de PK lo constituyen plantas vasculares y algas verdes, en donde
además de la forma citosólica presente en todas las células eucariotas, se encuentra una
11
isoforma plastídica y ambas enzimas difieren en sus características físicas, cinéticas y
regulatorias [Knowles y cols. 1989, Plaxton 1989, Podestá y Plaxton 1992,1994].
La presencia de isoformas de la piruvato cinasa no está restringida solo a células
eucariotas, también encontramos la existencia de isoenzimas en bacterias como E.coli y
Salmonella typhimurium, donde existen dos isoformas alostéricas de la enzima, la PykF y
PykA. Ambas isoenzimas muestran cooperatividad con respecto a la unión del PEP; sin
embargo, la PykF se activa por Fru 1,6-BP y la PykA principalmente por AMP y por
intermediarios de la vía de las pentosas fosfato [Waygood y Sanwal 1974, Garcia-Olallay
Garrido-Pertierra 1987, Malcovati y Valentini 1982]. Con base a esta característica de
regularse por activadores alostéricos de distinta naturaleza química, tradicionalmente las
piruvato cinasas se dividieron en dos grupos principales; las tipo I y tipo II. En esta
clasificación las de tipo I son las que generalmente se activan por azúcares bifosforilados,
mientras que las del tipo II responden principalmente a nucleótidos y a azúcares
monofosforilados. Sin embargo, esta clasificación no parecía totalmente adecuada a la
familia de la piruvato cinasa, debido a que no tomaba en cuenta a aquellas variantes que
carecen de regulación alostérica, como lo son las de músculo (M1) [Muirhead y cols. 1986]
y plantas [Turner y cols. 2005], o aquellas que parecen no responder ni a azúcares ni a
nucleótidos como las arqueas [Johnsen y cols. 2003].
Estructura de la piruvato cinasa
Como es común, la regulación alostérica se lleva a cabo a través de la
organización oligomérica de la enzima. Se han caracterizado un gran número de piruvato
cinasas de eucariontes y procariontes, y en la mayoría de los casos se ha observado que
son homotetrámeros con subunidades idénticas de aproximadamente 500 residuos cada
una, aunque también se han reportado estados de mayor y menor oligomerización
[Muñoz y Ponce 2003]. Por difracción de rayos X, se han obtenido las estructuras
tridimensionales de PKs de diversos organismos, como la de músculo de gato [Stammers
y Muirhead 1975, Stuart y cols. 1979] que fue la primera estructura cristalográfica que se
obtuvo de una piruvato cinasa. Posteriormente se obtuvieron las estructuras de las
enzimas de levadura [Jurica y cols. 1998], de Escherichia coli [Mattevi y cols. 1995], de
Leishmania mexicana [Rigden y cols. 1999] y de eritrocito de humano [Valentini y cols.
2002] entre otras. La mayoría de las piruvato cinasas comparten una arquitectura similar,
12
la estructura cuaternaria se encuentra altamente conservada a través de los tres dominios
de la vida. Cada subunidad consta principalmente de tres dominios estructurales,
denominados A, B y C. Sin embargo, en los eucariontes se encuentra un dominio
adicional (dominio N-terminal) que puede variar en su longitud en diferentes especies
[Jurica y cols. 1998]. La piruvato cinasa de E. coli perteneciente al grupo de las -
proteobacterias muestra 3 dominios estructurales por subunidad (Figura 3A). El dominio
A, formado por dos segmentos de aminoácidos (residuos1-70 y 171-345) es el más
grande y conservado de los 3 dominios estructurales en todos los grupos filogenéticos;
exhibe una topología clásica tipo barril (α/β)8 y se localiza en el centro de cada subunidad.
El barril se caracteriza por tener tres estructuras (hélice-α) adicionales localizadas en las
asas 6, 7 y 8. Estas hélices, denominadas Aα6´, Aα7´ y Aα8´ , tienen un papel importante
en la catálisis y en la regulación alostérica por la Fru 1,6-BP en la PK tipo I. El dominio B
(residuos 71-170), también denominado como la “tapa” de la enzima, se encuentra
adyacente a la parte carboxilo terminal del dominio A. El dominio B es un barril β formado
principalmente por 8 hebras-β y sólo una hélice-α, está introducido en el asa tres del
dominio A y unido a éste por dos asas flexibles que funcionan como bisagras y que
permiten la rotación del dominio B hacia el dominio A sobre el sitio activo, llevando a la
enzima a su conformación activa o cerrada. El dominio C (residuos 352-470) está unido
por un asa desordenada y de gran movilidad (residuos 346-351) a la región amino
terminal del dominio A en un posición opuesta al dominio B. El dominio C está formado
por 5 hélices-α y 5 hebras-β con una topología αβαβαβαββα, en donde la quinta hebra β
es perpendicular al resto de las hebras paralelas [Mattevi 1995]. Estructuras
cristalográficas que presentan unido al modulador (Fru 1,6-BP o Fru 2,6-BP), revelan que
el sitio de unión al efector alostérico está localizado completamente en el dominio C, cerca
de la interacción inter-subunidades a una distancia de 40 Å del sitio activo de la misma
subunidad. Es importante mencionar que los dominios A y C establecen interacciones
importantes intra-subunidades e inter-subunidades para unir al tetrámero del lado de las
interfases A/A (interacción entre dos dominios A) y C/C (interacción entre dos dominios C)
formando un dímero de dímeros (Figura 3B), mientras que el dominio B no forma parte de
las interacciones inter-subunidades. [Donovan, 2016].
13
 
Figura 3. Estructura de la piruvato cinasa. En (A) representación en cintas de una subunidad de
la piruvato cinasa de E.coli tipo I (PDB: 1PKY), los dominios estructurales se muestran en distinto
color y están etiquetados dentro de la figura. El sitio activo y el sitio alostérico están señalados con
flechas. En (B) se muestra el tetrámero de la PK de E.coli y se indican las interfaces larga (A/A) y
corta (C/C) [Donovan y cols. 2016]. 
 
Se resolvieron las estructuras cristalográficas de las PKs de músculo de conejo
[Larsen y cols. 1994, 1997 y 1998] y de Leishmania mexicana [Morgan y cols 2010] en
presencia de diferentes ligandos (sustratos, productos, análogos, metales y efectores) y
se observó que, dependiendo de cuáles y cuántos ligandos se encuentren unidos a la
piruvato cinasa, la enzima se encuentra en distintos estados conformacionales (Figura 4).
Cuando el sitio activo está parcialmente ocupado con Mg2+, K+, piruvato o análogos del
PEP (oxalato), la enzima se encuentra en una conformación abierta o semi-cerrada, en
donde los dominios B o “tapas” exhiben diferentes grados de rotación sobre los
dominios A de cada subunidad. En el caso donde el sitio activo se encuentra totalmente
ocupado (Mg2+, K+, oxalato y ATP) la enzima adquiere una conformación cerrada en la
cual el dominio B rota 40 sobre el dominio A, acomodando de esta manera los residuosᵒ
14
que forman la estructura del sitio activo [Larsen y cols. 1997 y 1998]. En el caso de la
piruvato cinasa de Leishmania mexicana, que como se mencionó anteriormente se activa
de forma alostérica por el efector Fru 2,6-BP, esta enzima presenta aún más estados
conformacionales que dependen de si se encuentra o no ocupado el sitio del efector
alostérico, además de la unión de sus ligandos en el sitio activo (Figura 4) [Morgan y cols.
2010].
Figura 4. Representación esquemática de la transición del estado T (inactivo) al estado R
(activo) de la PK de Leishmania mexicana. En el esquema se muestra la rotación de las
subunidades dentro del tetrámero en presencia de distintos ligandos, así como los diferentes
grados de rotación que presenta el dominio B. En el estado T los monómeros adoptan una posición
más separada en el lado de las interfases (A/A) y (C/C), y los dominios B se encuentran totalmente
abiertos o alejados del dominio A. En el estado R (ATP, oxalato, K+, Mg+ y efector alostérico (en el
caso de Leishmania es Fru 2,6-BP)), se observan los dominios B cerrados sobre el dominio A
(rotación de 40 ) y las interfaces se encuentran prácticamente juntas [Morgan 2010].ᵒ
15
Como se describió anteriormente, el sitio activo de la piruvato cinasa se encuentra
en una hendidura que se forma entre el dominio B y el dominio A (Figura 5A). En las
estructuras cristalográficas de la enzima de músculo de gato [Muirhead y cols. 1986] y
músculo de conejo [Larsen y cols. 1994,1997 y 1998], se observa que la coordinación del
K+ es hexavalente; su sitio de unión está formado por el oxígeno de la carboxiamida del
residuo Asn74, el oxígeno del hidroxilo de la Ser76, el oxígeno del carboxilato del Asp112,
el oxígeno carbonilo de la Thr113 , el oxígeno del grupo fosfato del PEP o el fosfato-γ del
ATP, además de una molécula de agua dentro del sitio activo (Figura 5B). Conbase en
esto se ha propuesto que el papel del K+ sea el de coordinar y posicionar adecuadamente
al grupo fosfato del PEP para su transferencia hacia el ADP. Además, Oria-Hernández y
cols (2005) demostraron que el K+ ayuda a cerrar la tapa y a formar el sitio del nucleótido
permitiendo que el PEP o el ADP-Mg se unan de manera independiente a la enzima
(mecanismo cinético al azar en equilibrio rápido). Por otro lado, se observa que el catión
divalente también presenta una coordinación hexavalente, interaccionando con la proteína
a través del grupo carboxilato de los residuos Glu 271 y Asp 295, y además se encuentra
unido a los átomos de oxígeno del carbono 1 y el carbono 2 del oxalato, al fosfato- del
ATP y a una molécula de agua (Figura 5C).
16
Figura 5. (A) Representación en cintas de un monómero de la piruvato cinasa de músculo de
conejo (RMPK) (PDB; 1PKN). Cada dominio estructural se muestra en un color diferente; Dominio
A (verde), dominio B (azul), dominio C (rojo) y dominio N-terminal (amarillo). Dentro del círculo se
encuentra el sitio activo y los ligandos (ATP, oxalato, K+ y Mg2+). En (B) se muestra en modelo de
esferas y varas la coordinación hexavalente del K+ y la interacción con los residuos de la
proteína,del ATP y una molécula de agua. En (C) la esfera de hexa-coordinación del catión
divalente (Mg2+) dentro del sitio activo. El sitio de unión del K+ se encuentra a 5.7 Å del sitio de
coordinación del Mg2+ dentro del sitio activo.
Actividad dependiente e independiente de catión monovalente
El efecto activador que tienen los cationes monovalentes (M+) sobre las enzimas
es un fenómeno muy estudiado y se encuentra muy extendido en la naturaleza. El grupo
de Boyer [Kachmar y Boyer, 1953] fue el primero en describir el efecto activador del
potasio sobre la actividad catalítica de la piruvato cinasa y a partir de esa fecha se han
descrito más de un centenar de enzimas que necesitan de algún catión monovalente para
desempeñar su función o estabilizar su estructura [Suelter, 1970, Larsen y Reed 2001, Di
17
Cera 2004 y 2006, Ramírez-Silva y Oria-Hernández 2008]. La PK de músculo fue la
primera enzima en la que se demostró el requerimiento absoluto de catión monovalente
para llevar a cabo su catálisis. La piruvato cinasa representa un ejemplo excelente de
activación por (M+), ya que el efecto activador del K+ sobre esta enzima es el mayor
reportado. La actividad de la PK de músculo de conejo (RMPK), determinada en las
mismas concentraciones de sustratos en presencia del K+ es de 250 μmoles min-1 mg-1 de
proteína, mientras que en ausencia del K+ es de 0.02 μmoles min-1 mg-1 de proteína, lo que
representa una activación por K+ de 12,500 veces [Kayne 1971]. Sin embargo a pesar de
que desde hace tiempo se sabe que la piruvato cinasa se activa en presencia de K+ y de
los avances obtenidos para la comprensión de este efecto tanto en la piruvato cinasa
como en otras enzimas, aún no se ha logrado entender del todo el papel del potasio en la
catálisis de la PK ni los mecanismos moleculares de esta reacción. 
La gran mayoría de las enzimas activadas por catión monovalente, incluyendo a la
piruvato cinasa, expresan su máxima actividad en presencia de K+, aunque otros cationes
monovalentes como Rb+, NH4+ y Tl+ pueden activarla hasta en un 80%, mientras que
cationes monovalentes como Na+, Li+ y Cs+ no tienen un efecto activador significativo
[Kayne 1971]. Estos resultados sugieren que existe una correlación entre el tamaño del
catión y su efecto activador. Los cationes activadores ( K+, Rb+, NH4+ y Tl+) tienen radios
iónicos similares, mientras que Li+ y Na+ poseen radios iónicos menores y Cs+ presenta
un radio iónico mayor. La localización intra ó extra celular de las enzimas está relacionado
con la selectividad por el M+; aquellas enzimas que se encuentran en el espacio
intracelular tienen preferencia por K+, mientras que las extracelulares utilizan
preferentemente al Na+, lo que sugiere que la selectividad por cationes monovalentes es
el resultado de una adaptación evolutiva a las condiciones del ambiente celular [Di Cera,
2004]. 
Por otro lado, cuando la PK se encuentra en medios con bajo contenido de agua
(micelas invertidas [Ramírez-Silva y cols. 1993]) o baja actividad de agua (mezclas
binarias agua-dimetilsulfóxido [Ramírez-Silva y cols. 2001]) la enzima es capaz de
expresar actividad en ausencia de potasio. Estos datos sugieren que en estas
condiciones, la PK es llevada a su conformación activa o cerrada, lo que imita el papel
activador del K+.
Anteriormente se pensaba que el requerimiento por K+ era una propiedad general
de todas las piruvato cinasas, pero con el tiempo se incrementó el número de PKs
18
caracterizadas y se observó que organismos como Escherichia coli PykA o tipo II
[Waygood y cols. 1975], Phycomyces blakesleeanus [Busto y cols. 1988],
Corynebacterium glutamicum [Jetten y cols.1994], Zymomonas mobilis [Steiner y cols.
1998], Thermoproteus tenax [Schramm y cols. 2000], Synechococcus pcc 6301 [Knowles
y cols. 2001], Archaeglobus fulgidus, Pyrobaculum aerophilum, Aeropyrum pernix,
Thermotoga marítima [Johnsen y cols. 2003] y Thermofilum pendens [De la Vega-Ruiz y
cols. 2015] poseen piruvato cinasas que presentan actividad independiente de catión
monovalente. La actividad independiente de K+ es muy variable; oscila entre 25 μmol min-1
mg-1 y 700 μmol min-1 mg-1. A este respecto Laughin y Reed exploraron las bases
moleculares de este fenómeno y compararon la secuencia de aminoácidos de la piruvato
cinasa de músculo de conejo (RMPK) contra dos PK de bacteria (E.coli y C. glutamicum)
que no requieren de M+ para expresar actividad catalítica. El resultado significativo de
esta investigación fue que en la RMPK se encuentra un glutámico en la posición 117,
mientras que en la secuencia de la enzima de las bacterias este E117 esta sustituido por
una lisina en la misma posición (K117) (Figura 6). El E117 se localiza en una región
cercana al sitio activo, a una distancia de 4.7 Å del sitio de coordinación del K+, adyacente
a la prolina 116 que es la región de bisagra que abre o cierra la tapa de la enzima durante
el ciclo catalítico y por lo tanto forma parte del asa de subida que comunica al dominio A
con el dominio B o tapa de la PK (Figura 7). Los autores construyeron la mutante sencilla
E117K de la piruvato cinasa de músculo de conejo y observaron que dicha mutante
presenta una actividad independiente de K+ de 30 μmol min-1 mg-1 de proteína y no
presenta activación por catión monovalente. Debido a la proximidad de la cadena lateral
del residuo 117 al sitio de unión del K+, los autores propusieron que la actividad
independiente de (M+) se atribuye a que el grupo amino protonado de la lisina provee la
carga positiva interna que sustituye el requerimiento de K+ para llevar a cabo la catálisis
[Laughlin y Reed, 1997].
19
Figura 6. Alineamiento las secuencias de la PK de músculo de conejo, C. glutamicum y E.
coli tipo II. La región del alineamiento es del residuo 111 al 120 y la numeración es con respecto a
la secuencia de la piruvato cinasa de músculo de conejo (RMPK). La posición 117 está dentro del
cuadro, el glutámico 117 aparece en rojo y la lisina 117 en azul. Los residuos que covarían (113,
114 y 120 ) con el aminoácido 117 se marcan de distinto color. Se muestra la secuencia de la
mutante sencilla E117K de RMPK [Laughlin y Reed, 1997].
 
Figura 7. Región del área del sitio de coordinación del K+ y la posición del residuo E117 con
respecto al sitio activo de RMPK (PDB;1PKN). El residuo 117 se localiza en el asa de subida
que comunica el dominio A con el dominio B y se encuentra a 4.7 Å de distancia del K+.
Con el objetivo de determinar la frecuencia en la naturaleza de esta sustitucióndel
Glu por la Lys en la posición 117 y relacionar el papel activador del K+ con la historia
evolutiva, Oria-Hernández realizó un extenso estudio filogenético de la familia de la
20
piruvato cinasa con las secuencias reportadas hasta el 2004. El análisis muestra un árbol
filogenético de 230 secuencias con una topología dicotómica, en el que el 52.6% (121
secuencias) presentan Glu en la posición 117 (numeración de acuerdo a la secuencia de
RMPK) y el 46% (106 secuencias) presentan Lys; además, se observan dos secuencias
con Ser y una con Arg en la misma posición (Figura 8). Esta dicotomía evidente permitió
separar a la familia de las piruvato cinasas en dos grupos; el grupo I que posee el E117 y
el grupo II que contiene a la Lys117. Con base en dichos resultados, es evidente que la
característica de ser independiente de K+ es tan frecuente como la dependencia por el
catión monovalente. Adicionalmente se observó que los residuos de las posiciones 113,
114 y 120 covarían con la posición 117, es decir, el 80% de las enzimas del Grupo I
presentan la secuencia T113/K114/E117/T120, mientras que en el grupo II el 77% tienen
L113/Q114/K117/ y un residuo hidrofóbico (I, V, L) en la posición 120 (Figura 8) [Oria-
Hernandez y cols. 2006].
21
Figura 8. Ánálisis filogenético de la piruvato cinasa. Se muestran las secuencias entre los
residuos 110 y 124. Se observa la topología dicotómica del árbol filogenético representada por dos
colores azul y rojo. En la rama roja se agrupan las piruvato cinasas que presentan Glu en la
posición 117, las que están marcadas con asterisco están caracterizadas y presentan dependencia
de K+. En la rama azul se agrupan las piruvato cinasas con Lys 117, las que están marcadas con
asterisco están caracterizadas y son independientes de K+. Los residuos en las posiciones 113,
114, 117 y 120 están representados en los siguientes colores: Glu en rojo, Lys en azul, Thr en
verde, Gln en morado, Leu/Val/Ile en rosa y Ser en amarillo. Tomado de (Oria-Hernández y col.,
2006).
22
Es relevante mencionar que en el análisis filogenético se observa que la mayoría de
los organismos presentan un solo tipo de PK, que puede pertenecer al grupo I o al grupo
II, con excepción del grupo taxonómico de las -proteobacterias, que presentan enzimas
de ambas ramas del árbol filogenético (Figura 9). A este grupo pertenece Vibrio cholerae,
bacteria que produce la enfermedad del cólera. Como se indicó anteriormente, V.
cholerae posee tres genes en total que codifican para piruvato cinasa y están distribuidos
en dos cromosomas. Presenta un gen (pykF) para una PK que tiene el glutámico y dos
genes (pykA-1, pykA-2) que codifican para dos PKs que contienen la lisina en la posición
117 (numeración de acuerdo a la secuencia de la RMPK). Hasta el momento no se sabe
si los tres genes son funcionales o cual es el papel metabólico de estas isoformas,
aunque las secuencias indican un marco de lectura abierto con todas las secuencias
consenso presentes. No obstante, no existe ningún estudio de las PKs de V. cholerae en
la literatura. En este trabajo se va a caracterizar la enzima que pertenece al grupo I (pykF)
y una del grupo II (pykA-1), referidas en este trabajo como VcIPK y VcIIPK
respectivamente, y ambas enzimas se localizan en el cromosma 1 del genoma de
V.cholerae.
23
Figura 9. Árbol filogenético de la familia de la piruvato cinasa. Se utilizaron las secuencias de
230 piruvato cinasas de diversos grupos taxonómicos que se representan en colores distintos. El
único grupo taxonómico que aparece en ambas ramas del árbol es el de las -proteobacterias, que
se encuentra indicado en un rectángulo en ambos lados. Cada una de las secuencias se identifica
por su número de acceso en el NCBI. Los puntos indican nodos respaldados en 70% (abiertos),
80% (grises) o 90% (cerrados) de 500 bootstraps replicados al azar por los métodos de vecino
más cercano, mínima evolución y máxima parsimonia. Tomado de [Oria-Hernández y col., 2006].
24
Mecanismo cinético
En 1961 se obtuvieron los primeros avances acerca del mecanismo cinético de la
piruvato cinasa de músculo de conejo [Reynard y cols. 1961]. Los experimentos
demostraron que la interacción de la enzima con los sustratos (PEP y ADP) se lleva a
cabo de manera independiente, que el evento de fosforilación del ADP se realiza cuando
están unidos ambos sustratos, que el ATP es un inhibidor competitivo de ambos sustratos
y que los valores cinéticos de Km concuerdan con los valores de Kd obtenidos con la
técnica de ultracentrifugación. Con base en estos resultados los autores propusieron que
la enzima sigue un mecanismo secuencial al azar en equilibrio rápido. Este hallazgo se
corroboró más adelante por varios grupos de investigación [Mildvan y Cohn, 1965] donde
se observó similitud entre las constantes cinéticas y las constantes de disociación del
ADP en función del pH. Posteriormente, estos mismos autores exploraron el mecanismo
cinético mediante ensayos cinéticos de velocidad inicial, inhibición por producto, unión de
ligandos al equilibrio y experimentos de resonancia magnética nuclear (RMN o velocidad
de relajación de los protones del agua) [Mildvan y Cohn 1966]. En este estudio los autores
observaron una coincidencia entre las constantes de disociación obtenidas por RMN, las
obtenidas cinéticamente y las observadas en los estudios de unión al equilibrio. Asimismo,
los patrones de inhibición no competitivos junto con la similitud en las constantes de unión
obtenidas por los diferentes métodos confirman el esquema de cinética de equilibrio y la
unión al azar de los sustratos a la enzima.
En 1973 Ainsworth y Macfarlane realizaron un estudio cinético sobre velocidades
iniciales e inhibición por producto. Los patrones de velocidad inicial muestran
independencia en la unión de cada sustrato con respecto a la concentración del otro. Los
estudios de inhibición por producto muestran que el ATP-Mg es un inhibidor competitivo
tanto del ADP-Mg como del PEP, mientras que el piruvato es un inhibidor competitivo del
PEP y no competitivo del ADP-Mg. En conjunto, estos datos confirmaron una vez más que
la enzima sigue un mecanismo secuencial al azar en equilibrio rápido.
Por otro lado, la Dra. Ramírez Silva observó que en ausencia de K+ la afinidad del
complejo ADP-Mg depende de la concentración de PEP, indicando que sin catión
monovalente la unión del PEP afecta la unión del ADP-Mg. Por esta razón se realizaron
estudios de velocidad inicial de la reacción de la PK de músculo de conejo en presencia y
en ausencia de K+ a concentraciones variables de uno de los sustratos y a diferentes
concentraciones fijas del otro. Los resultados de los gráficos de dobles recíprocos de la
25
velocidad inicial en ausencia de K+ indicaron que la enzima sigue un mecanismo
secuencial ordenado en equilibrio rápido con PEP como primer sustrato, mientras que en
presencia de K+ los patrones de intersección de los gráficos de dobles recíprocos son
compatibles con un mecanismo cinético al azar en equilibrio rápido. Esto fue confirmado
posteriormente con ensayos de inhibición sin salida, utilizando oxalato como inhibidor del
PEP y ADP-Cr2+ como inhibidor del ADP-Mg [Oria y cols 2005]. Además, estos autores
exploraron el mecanismo cinético en la mutante sencilla E117K de músculo de conejo, en
donde se observa que la enzima presenta un mecanismo al azar en equilibrio rápido en
ausencia de K+. Estos resultados sugieren, que en la RMPK, la carga interna positiva de la
Lys117 o del K+ inducen el cierre sobre el dominio B sobre el sitio activo y facilitan el
arreglo de los residuos involucrados en la unión del nucleótido, permitiendo la unión al
azar del PEP y del ADP-Mg en el sitio activo. En este contexto De la Vega-Ruiz y cols.
estudiaron el mecanismo cinético de la piruvato cinasa de Termofilum pendens(TpPK),
que pertenenece al subdominio Crenarchaeota y se encuentra en la rama de las enzimas
independientes de K+ en el árbol filogenético de la familia de las PKs. La TpPK contiene
una Val en la posición 117 (numeración de acuerdo a la secuencia de RMPK), es decir, no
posee la carga positiva interna de la Lys 117 y no es activable por catión monovalente. No
obstante, sigue el mecanismo al azar en equilibrio rápido [De la Vega-Ruiz y cols. 2015],
al igual que en la mutante E117K de músculo de conejo en ausencia de K+ [Oria-
hernandez y cols. 2005]. Este hallazgo mostró que el PEP y el ADP-Mg se unen de
manera independiente al sitio activo, a pesar de no poseer una carga interna positiva y de
no requerir K+ para su catálisis. Como se mencionó anteriormente, no existe información
sobre las características cinéticas o estructurales de las PK de V. cholerae, ni estudios
sobre el mecanismo cinético de una piruvato cinasa silvestre que contenga la Lys en la
posición 117, por lo que el estudio del mecanismo cinético de las piruvato cinasas de
Vibrio cholerae tipo I (VcIPK) y tipo II (VcIIPK) puede proporcionar un punto de
comparación sobre el papel activador del K+ en las PK.
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OBJETIVOS
Objetivo general
El objetivo de este proyecto es dilucidar la contribución de cada una de las
isoenzimas a la actividad de piruvato cinasa en Vibrio cholerae. Se realizará la
caracterización bioquímica de las piruvato cinasas de V.cholera tipo I (VcIPK) y tipo II
(VcIIPK), y se determinará la expresión de sus genes pyk-F y pykA-1 en Vibrio cholerae.
Objetivos particulares
 Clonar, sobreexpresar y purificar las PKs de V.cholerae tipo I (VcIPK) y tipo II
(VcIIPK).
 Realizar la caracterización cinética de VcIPK y VcIIPK.
 Determinar el mecanismo cinético mediante estudios de velocidad inicial y de
inhibición sin salida de VcIPK y VcIIPK.
 Estudiar el efecto de los activadores alostéricos y de los cationes divalentes (M2+)
sobre la estructura de ambas PKs por medio de estudios de fluorescencia
intrínseca y de anisotropía de fluorescencia.
 Estudiar la expresión de las piruvato cinasas (VcIPK y VcIIPK) en la cepa
V.cholerae CVD103 , utilizando la técnica de Western blot.
27
MATERIALES Y MÉTODOS
Reactivos
Las endonucleasas y la DNA ligasa T4 se adquirieron en New England Biolabs
(UK), la Taq DNA polimerasa platinum en Invitrogen life Technologies (MA, USA), la
fosfatasa alcalina de camarón en Roche Applied Science, el kit de purificación de
plásmidos Miniprep por QIAGEN (N.V.). La cepa de E. coli BL21 CodonPlus-pLysS, los
vectores pMCSG7 y los oligonucleótidos fueron adquiridos en Invitrogen. El Dr. Bolivar
Zapata del Instituto de Biotecnología UNAM nos donó amablemente el plásmido pTrc99A
y la cepa PB25 -PKI--PKII de E.coli. La lactato deshidrogenasa de músculo de puerco
(LDH) se obtuvo como suspensión de sulfato de amonio de Roche Applied Science
(Mannheim, Alemania). Los antibióticos (ampicilina y cloranfenicol), el HEPES y las sales
de ciclohexilamonio de ADP y PEP, se adquirieron de Sigma-Aldrich Co.(USA). La sal de
sodio de NADH se convirtió a sal de ciclohexilamonio por cromatografía de intercambio
iónico siguiendo el protocolo del fabricante (Sigma-Aldrich). Las columnas de intercambio
iónico, exclusión molecular fueron de Pharmacia, las columnas de Niquel y de desalado
fueron de GE Healthcare . Las tabletas de inhibidores de proteasas (complete) se
obtuvieron de Roche. El Dr. Carlos Eslava del Departamento de Salud Pública de la
Facultad de Medicina de la UNAM nos donó amablemente la cepa de V.cholerae CVD
103. Los péptidos que se usaron para la elaboración de los anticuerpos se mandaron a
sintetizar en Gene Script (NJ, USA).
Clonación, sobreexpresión y purificación de VcIPK y VcIIPK
Los genes de las piruvato cinasas pyk-F y pyk-A1 de V.cholerae (cepa el TOR
N16961) se amplificaron a partir del DNA genómico por PCR usando los oligonucleótidos
para VcIPK FW 5’-TACTTCCAATCCAATGCTAAAAAGACCAAAATCGTATGTACGATT-3’
y RV 5’-TTATCCACTTCCAATGTTACAGTAGGTGTACTGATGCAGTGTT-3’ y para
VcIIPK: FW 5’-TACTTCCAATCCAATGCTAGCTCAACTTTGCGTAGAACAAAAAT-3’ y RV
5’-TTATCCACTTCCAATGTTAATAGACAGGTAAGATGCGCATACA-3’. Cada inserto se
introdujo en el vector de expresión pMCSG7 siguiendo el protocolo de ligación
independiente de clonación (LIC), basado en el sistema pET que contiene una cola de
seis histidinas (His6) en el extremo amino terminal y un sitio de corte para la proteasa
28
Tobacco Etch Virus (TEV) [Stols y cols. 2002]. Los vectores se modificaron con la
endonucleasa de restricción SspI, y se trataron con la DNA polimerasa T4 en presencia
de dGTPs y los productos de PCR se trataron con la polimerasa en presencia de dCTPs.
Los productos de LIC (pMCSG7/VcIPK y pMCSG7/VcIIPK) se transformaron en células
competentes de Escherichia coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL. Para verificar la ausencia de
mutaciones, los plásmidos que contenían los insertos, se aislaron y se secuenciaron.
Las células BL21 transformadas con el plásmido pMCSG7/VcIPK o
pMCSG7/VcIIPK se cultivaron en placas Petri con medio LB que contenía cloramfenicol
34 µg/mL y ampicilina 100 µg/mL. Se resuspendieron todas las colonias crecidas en la
placa con medio LB y se inocularon 4L de medio LB que contenían 34 µg/mL y ampicilina
100 µg/mL. Los cultivos se incubaron a 37°C hasta que alcanzaron una D.O. de
aproximadamente 0.4. Posteriormente se enfriaron los matraces a una temperatura de
15°C y se inició la inducción con 0.5 mM de isopropil -1-tio-β-D-galactopiranósido (IPTG)
durante toda la noche. Los cultivos crecidos durante toda la noche se cosecharon
centrifugando 10 minutos a 20,000 × g. Las células se resuspendieron en 200 mL de
HEPES 200 mM (pH 7.5), EDTA 1 mM. La suspensión se diluyó 1:1 con HEPES 200 mM
(pH 7.5), sacarosa 1 M y lisozima (0.6 mg/gr de células) y se agitó suavemente a
temperatura ambiente durante 20 minutos. Se produjo un choque osmótico con un
volumen igual de agua destilada y se agito a 4°C durante 20 minutos. Los esferoplastos
se centrifugaron 20 minutos a 10,500 × g. El sobrenadante se descartó y la pastilla se
resuspendió en 25 mL de amortiguador que contenía KH2PO4 50 mM pH 8, imidazol 10
mM, KCl 300 mM. Se adicionó media pastilla de la mezcla de inhibidores de proteasas y
MgCl2 a una concentración final de 40 mM y se agitó durante 5 minutos a temperatura
ambiente. Los esferoplastos se lisaron por sonicación (5 minutos) utilizando un sonicador
450 Branson en 20 ciclos de 15 segundos de sonicación por 45 minutos de enfriamiento a
una potencia de 30 Watts. La suspensión obtenida de la sonicación se centrifugó 20
minutos a 13,250 × g colectando el sobrenadante. 
El sobrenadante se pasó a través de una columna de Niquel His Trap FF (GE
Healthcare) equilibrada previamente con KH2PO4 50 mM pH 8.0, imidazol 10 mM y KCl
300 mM y se eluyó con un gradiente líneal de imidazol (10-500 mM). Las fracciones que
presentaron mayor actividad de PK (aproximadamente en 200 mM del gradiente de
imidazol), se juntaron y concentraron por filtración en membrana (Centricon de una
membrana de 100 K). La proteína concentrada se desaló en una columna Hi Trap
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Desalting (GE healthcare) equilibrada con HEPES 50 mM pH 7.5. Las fracciones con
mayor actividad, se mezclaron, concentraron y precipitaron en 80% de sulfato de amonio
y se almacenaron a 4 C. Se cuantificó la concentración de proteína en diferentes pasosᵒ
de la purificación por el método del ácido bicinconínico (BCA) y se les midió la actividad
en el espectrofotómetro con alícuota de 1μl de la enzima.
Desafortunadamente, a pesar de varios intentos, no fue posible remover la cola de
polihistidinas de las PKs, auncuando se incubaron por 48 hrs a 30°C en presencia de la
proteasa TEV, lo que sugiere que el sitio de corte no se encuentra accesible a esta
proteasa. Por esta razón, en las purificaciones subsecuentes el paso de incubación con la
proteasa TEV se omitió para ambas enzimas, y se trabajó las enzimas que presentan la
cola de histidinas. El rendimiento de purificación para ambas enzimas fue de ~40 mg por 4
litros de cultivo y la pureza de VcIPK y VcIIPK fue de 90 y 88%, respectivamente como se
determinó por análisis de densitometría después de teñir los geles de poliacrilamida SDS-
PAGE (Laemmli al 12.5%, 4 ºC y 160V) con azul de Coomasie (brilliant blue). Las
proteínas se identificaron positivamente por espectrometría de masas (Espectrómetro de
masas BRUKER microflex MALDI-TOF) en el laboratorio de la Dra. Adela Rodríguez del
Instituto de Química, UNAM para obtener el grado de pureza y la masa molecular de las
isoenzimas. Para determinar el estado de oligomerización de las enzimas, se cargaron 50
μg de VcIPK y VcIIPK en un gel nativo azul (BN-PAGE) y se corrió durante toda la noche
a 4 ºC como describe [Schägger y Von Jagow 1991] con un gradiente de acrilamida de 4-
11% y como marcadores de peso molecular se utilizaron 100 μg de extracto solubilizado
de membranas invertidas con lauril maltósido de Paracoccus denitrificans y 100 μg de
extracto de mitocondrias de hígado de rata.
Para descartar si la cola de histidinas tiene algún efecto sobre el comportamiento
cinético de las PKs de V.cholerae , el gen de VcIPK se subclonó en el plásmido pTrc99A y
se transformó en la cepa de E.coli PB25 -PKI--PKII (que tiene interrumpidos los genes
de las PKs endógenas de E.coli por cassettes de cloranfenicol y kanamicina,
respectivamente. Las células se crecieron, indujeron, cosecharon y lisaron como se
describió anteriormente En este protocolo los esferoplastos se resuspendieron en 20 mL
de HEPES 10 mM pH 7.0 y el sobrenadante que se obtuvo después de los ciclos de
sonicación, se precipitó con 50% de sulfato de amonio manteniendo constante el pH (7.0).
Al cabo de una hora de agitación suave a 4°C, la suspensión se centrifugó durante 20
minutos a 20,000 × g. Se colectó el sobrenadante y se adicionó sulfato de amonio para
obtener una concentración de 90%. La muestra se mantuvo en agitación suave a 4°C
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durante una hora y se centrifugó 20 minutos a 20,000 × g. El sobrenadante se descartó y
la pastilla se resuspendió en 3 mL de HEPES 25 mM (pH 7.0) y glicerol al 10%. La
solución se dializó en presencia de HEPES 50 mM (pH 7.0) con dos cambios, el primero
después de una hora y el segundo durante toda la noche a 4°C. La suspensión obtenida
se concentró y se pasó a través de una columna de exclusión molecular Sephacryl 300
(S-300,16/60 120ml) equilibrada previamente con HEPES 25 mM (pH 7.0), KCL 50mM y
glicerol, al 10%. Se determinó la actividad de todas las fracciones. La actividad de PK se
encontró en las fracciones que salieron después de una hora de corrida en un volumen de
elución de 60 mL. Se juntaron las fracciones de máxima actividad y se pasaron por una
columna de Carboximetil-Sefarosa (2.6 x 5cm) previamente equilibrada con HEPES 25
mM, glicerol al 10% pH 7.0. La columna se eluyó con 60ml del mismo amortiguador y en
el eluído se obtuvo a la piruvato cinasa. Finalmente el eluído se pasó a través de una
columna de DEAE-sefarosa (1.6x10cm) equilibrada previamente con HEPES 25
mM,glicerol 10% y pH 7.0 .La columna se lavó con 5 volúmenes de columna del mismo
amortiguador, posteriormente la proteína se eluyó con un gradiente lineal de 0 a 1 M de
KCl. La piruvato cinasa eluyó a una concentración de 170 mM de KCl. Las fracciones con
mayor actividad se mezclaron, concentraron y se agregó 10 % de glicerol para su
almacenamiento. El rendimiento de la purificación fue de alrededor de 2.4 mg de
proteína por litro de cultivo. El glicerol al 10% se adicionó con el objetivo de aumentar la
estabilidad de la enzima, debido a que en purificaciones anteriores se observaba que la
actividad decaía rápidamente. La columna de exclusión molecular se incluyó, con la
finalidad de eliminar proteínas que estaban presentes durante todo el proceso de
purificación de la piruvato cinasa en protocolos anteriores. Aún después de este paso no
pudimos separar a una proteína que comigraba con la PK. La proteína contaminante
corresponde a la triptofanasa endógena de E.coli (identificada por el Dr. Guillermo
Mendoza con espectrometría de masas) que tiene un punto isoeléctrico de 5.88, muy
cercano al de la piruvato cinasa tipo I que es de 5.79 y tiene un peso molecular
(53.33KDa) muy similar al de la PK VcI (50.439 KDa) además de presentar el mismo
estado de oligomerización tetramérico. Con la finalidad de comparar la actividad
enzimática de la proteína que presenta la cola de histidinas con la que no las tiene, se
realizaron ensayos de actividad a una fuerza iónica constante de 150 mM, en donde la
Ko.5 para PEP fue de 0.55 ± 0.015 mM y 0.68 ± 0.016 mM para la proteína con y sin
Histag6, respectivamente. La Ko.5 del ADP fue de 0.26 ± 0.03 mM y de 0.27 ± 0.02 mM para
la proteína con y sin la cola de histidinas, respectivamente. La respuesta al efector
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alostérico fue prácticamente la misma, en presencia de 2 mM de Fru 1,6 BP la Ko.5 para
PEP fue 0.069 ± 0.004 mM y 0.060 ± 0.004 para la enzima con y sin colas,
respectivamente. Por otro lado, la Vmax disminuyó un 40% en la enzima que no presenta
las colas de histidina. Esta diferencia significativa puede deberse a que la VcIPK es
inestable y el protocolo de purificación dura 3 días. Además la presencia de otras
proteínas contaminantes, siendo la triptofanasa de E.coli la más abundante podría
explicar la disminución en la Vmax. Por estas razones los estudios en VcIPK y VcIIPK se
realizaron en las proteínas que presentan la cola de histidinas.
Ensayos de la actividad de VcIPK y VcIIPK.
La concentración de las proteínas (VcIPK y VcIIPK) se determinó usando el
método del ácido bicinconínico (BCA). Las enzimas libres de sulfato de amonio (VcIPK,
VcIIPK y LDH) se obtuvieron usando columnas de centrifugación que contenían Sephadex
G-25 equilibradas previamente en Tris-HCl 50 mM (pH 7.0) como se detalla en [Ramírez-
Silva y cols. 1993]. La contaminación por NH4+, Na+ y K+ en las mezclas de reacción se
encuentra por debajo del limite de detección (10 μM) como se indica en [Ramírez-Silva y
cols. 1993]. La actividad enzimática se obtiene en un sistema acoplado a la LDH,
siguiendo espectrofotométricamente la oxidación del NADH a una absorbencia de 340 nm
[Buchner y Pleiderer 1995] en mezclas de reacción que contenían HEPES 50 mM (pH
7.0) y las concentraciones de cationes monovalentes (Li+,Na+,K+, NH4+, Rb+ y Cs+),
cationes divalentes (Mg2+ y Mn2+), sustratos (PEP y ADP), moduladores alostéricos (Fru
1,6-BP y Rib 5-P) e inhibidores (oxalato y ADP-Cr2+) indicados en cada experimento. Las
concentraciones del complejo ADP-Mg y de Mg2+ libre se calcularon con el programa
CHELATOR [Shoenmakers y cols.1992], considerando el pH, la fuerza iónica y la
temperatura. Las concentraciones del complejo ADP-Mn y Mn2+ libre se calcularon usando
la Kd para el Mn2+ [Susan-Resiga y Nowak 2004]. Las concentraciones del PEP ionizado
(PEP3-) se calcularon considerando un valor de pK de 6.3 [Dougherty y Cleland 1985].
Para compensar la fuerza iónica que aportan las diferentes concentraciones de ligandos
requeridas para cada experimento, se adicionó cloruro de tetrametilamonio (TMACl) para
mantener la fuerza iónica constante. En los ensayos de inhibición por oxalato, la
concentración de LDH adicionada a la mezcla de reacción fue de 5 veces mayor para
contrarrestar elefecto inhibidor que tiene el oxalato sobre la LDH. La actividad específica
de la PK no se modificó al usar concentraciones mayores de LDH. Todos los ensayos se
realizaron en condiciones de velocidad inicial y el curso temporal de la reacción fue lineal.
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La determinación de la actividad enzimática se inició con la adición de la PK. Todos los
ensayos se realizaron a 25 ºC y pH 7.0.
Estudios cinéticos
Los patrones de velocidad inicial se determinaron variando las concentraciones del
sustrato PEP3- a concentraciones fijas variables de ADP-Mg para el caso de VcIPK y
ADP-Mn para VcIIPK. Los datos de velocidad inicial se graficaron como dobles reciprocos
y cada curva se ajustó individualmente a la forma lineal de la ecuación de Michaelis-
Menten (Origin 7.0).
Dependiendo del patrón de intersección que se obtuvo en los gráficos de los
dobles recíprocos, los datos se ajustaron globalmente por regresión no lineal a las
ecuaciones de un mecanismo al azar en equilibrio rápido o secuencial ordenado en
equilibrio rápido (las ecuaciones se muestran en las tablas de los resultados
correspondientes).
Los experimentos de inhibición se llevaron a cabo variando la concentración de
uno de los sustratos y manteniendo fija variable la concentración del segundo sustrato a
diferentes concentraciones fijas del inhibidor. El oxalato se usó como análogo sin salida
del PEP y el Cromo-ADP (ADP-Cr2+) como análogo sin salida del ADP-Mg o ADP-Mn. Los
datos obtenidos se analizaron por regresión lineal (gráficos de dobles recíprocos y
regráficos de las pendientes o interceptos versus la concentración de inhibidor) y
regresión no lineal ajustando globalmente los datos a las ecuaciones correspondientes a
una inhibición competitiva, no competitiva y mixta. Todos los ensayos de VcIPK se
realizaron en presencia del modulador alostérico Fru 1,6-BP y los de VcIIPK en presencia
de Rib 5-P.
Síntesis y purificación del Cromo-ADP 
El Cromo-ADP (ADP-Cr2+) se preparó de acuerdo a [DePamphilis y Cleland 1973]
con algunas modificaciones. Una solución de 40 mL de ADP 20 mM se mezcló con 40 mL
de CrCl3 20 mM para obtener un volumen final de 80 mL. La mezcla se colocó en un baño
de temperatura controlada a 80 ºC durante 10 minutos. El producto de la reacción se
enfrió en hielo por 20 minutos. La solución se pasó a través de una columna con resina
Dowex 50WX2-100 (15 x 1.5 cm), se lavó con 10 volumenes de columna y se eluyó con
un gradiente lineal de 0-2 M de HClO4.. Las fracciones que contenían el ADP-Cr2+ se
mezclaron, se diluyeron 1:20 y se cargaron en una nueva columna de Dowex, que se lavó
con 10 volumenes de agua. 
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La 
porción superior de la resina que presentaba la mayor adsorción de ADP-Cr2+ se transfirió
a una columna vacía y el ADP-Cr2+ se eluyó con un pulso de 2 M de HClO4. Las fracciones
que contenían la mayor concentración de ADP-Cr2+ se combinaron y se neutralizaron a
pH de 3.0 con bicarbonato de tetrametilamonio. La suspensión formada se colocó a 4 ºC
durante 12 hrs y se centrifugó para separar el perclorato de tetrametilamonio formado en
la reacción. El ADP-Cr2+ purificado se analizó por espectrofotometría de UV/Vis. El
rendimiento de la reacción fue alrededor de un 40%. El análisis de la muestra confirmó la
identidad del compuesto e indicó una pureza del 90%.
Experimentos de Fluorescencia 
Los espectros de emisión de fluorescencia intrínseca y la anisotropía de
fluorescencia se realizaron en un espectrofluorómetro de conteo de fotones ISS PC1 (ISS,
Urbana, IL, USA) a 25 ºC. Las proteínas se excitaron a una longitud de onda de 280 nm y
la emisión se colectó de 290 a 400 nm con apertura de la banda de excitación y emisión
de 8 nm. Los espectros de las mezclas de cada condición sin la proteína se restaron de
aquellos que contenían a la PK (VcIPK y VcIIPK). La determinación de la anisotropía (r)
se realizó a la longitud de onda de máxima emisión obtenida para cada muestra. La
fluorescencia intrínseca y la anisotropía de fluorescencia se determinaron en presencia de
los ligandos que se indican en el pie de la Figura 17.
Anticuerpos policlonales anti-VcIPK y anti-VcIIPK
Los péptidos de VcIPK y VcIIPK se sintetizaron en Genescript (NJ.USA). Estos
péptidos comprenden del residuo 419 al 436 (CVVDAIDNTDAFYHLGKEI) para VcIPK y
del residuo 427 al 444 (CYFDTKQASGLEAAIAALD) para VcIIPK. Ambos péptidos se
acoplaron en una Cys a la proteína hemocianina de lapa marina (KLH) para obtener
mayor respuesta inmune. Presentan el amino-terminal acetilado y el carboxilo-terminal
amidado. Se utilizaron dos conejos machos recién destetados a los cuales se les extrajo
sangre para el suero pre-inmune y 15 días después comenzaron los 4 ciclos de
inyecciones con los péptidos antigénicos que fueron : el primero con adyuvante completo,
se mezclaron 200 μg de cada péptido en 500 μl de amortiguador de fosfatos (PBS) y una
vez mezclado se agregó 500 μl de adyuvante completo de Freund (Sigma) para formar
una emulsión estable y posteriormente se inocularon los conejos subcutáneamente en el
músculo largo de la pata posterior. Las siguientes inyecciones se realizaron siguiendo el
mismo procedimiento y se llevaron a cabo cada tres semanas para reforzar la respuesta
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inmune. Al final del ciclo, se obtuvieron 20 mL de sangre de cada conejo, se separó el
suero por centrifugación a 3000 rpm a 4 ºC durante 15 minutos, se hicieron alícuotas de
50 μl y finalmente se almacenaron a -70 ºC. 
Inmunodetección de VcIPK y VcIIPK con Western Blots
Los extractos de las células de las cepas de V.cholerae (CVD 103), E.coli DH5α y E.coli
PB25 se diluyeron en una relación 1:20 en un amortiguador que contenía Tris-HCl 20 mM
pH 7.6, glicerol 10%, sacarosa 50 mM, EDTA 1 mM, ATP 1 mM, inhibidor de proteasas
fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1mM, benzamidina 5 mM y 4 tabletas por litro de
inhibidor de proteasas complete y despúes las células se lisaron por sonicación. La
concentración de proteínas se determinó por el método de Lowry y se cargaron muestras
de 30 μg en geles desnaturalizantes SDS-PAGE (geles de poliacrilamida Laemmli al 8%)
durante toda la noche a 10 ºC. Asimismo, en el mismo gel se cargaron 0.5 y 1 ug de las
proteínas recombinantes VcIPK y VcIIPK, respectivamente. Al día siguiente se incubó el
gel durante 30 minutos en el amortiguador de transferencia en agitación suave.
Previamente se cortó un segmento de membrana (PVDF) del tamaño aproximado del gel
que se va a transferir y se incubó en metanol por 5 minutos con agitación suave y
posteriormente en el amortiguador CAPS 10 mM pH 11.0 y metanol 10% durante 10
minutos. En la rejilla de transferencia se colocó una esponja gruesa previamente
humedecida con el amortiguador de transferencia y encima un papel filtro del tamaño de
la esponja y humedecido con el mismo amortiguador. Sobre este papel se colocó el gel
que se va a transferir y encima la membrana del lado donde se transferirán las proteínas
del gel, evitando la formación de burbujas. La rejilla se insertó en la cámara de
transferencia en presencia del amortiguador de transferencia, se colocó en una cámara
con hielo y se corrió durante dos horas a 100 mA a 4ºC. Posteriormente la membrana se
incubó durante 2 horas en una solución de leche baja en grasas y PBS-T al 5% para
bloquear los sitios inespecíficos de unión al anticuerpo en la membrana. Después se
agregaron los anticuerpos policlonales anti-VcIPK y anti VcIIPK con un factor de dilución
de 1:30,000 y se incubaron durante toda la noche. Posteriormente se lavó 3 veces con
PBS durante 5 minutos y se agregó nuevamente leche al 5% con el anticuerpo secundario
de cabra anti-IgG de conejo (Santa cruz Biotechnology) para el anticuerpo contra VcIPK y
VcIIPK y streptacina-HRP contra los estándares de peso