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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS DESARROLLO DE UN MODELO COMPUTACIONAL PARA LA SIMULACION DEL PROCESO DE FORMACIÓN DE LA VULVA EN Caenorhabditis elegans TESIS ! QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: DOCTOR EN CIENCIAS PRESENTA: ! NATHAN WEINSTEIN ZAGORIN DIRECTOR DE TESIS ! DR. LUIS ANTONIO MENDOZA SIERRA INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS COMITÉ TUTORAL DRA. MARÍA ELENA ÁLVAREZ-BUYLLA ROCES INSTITUTO DE ECOLOGÍA ! DRA. ROSA NAVARRO GONZÁLEZ INSTITUTO DE FISIOLOGÍA CELULAR MÉXICO, D.F. ABRIL DE 2015 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Agradecimientos A mi mamá, a mi papá, a mi tío Lázaro y a mi abuela Ida por todo su cariño y esfuerzo; por motivarme y confiar en mi siempre. A mi tía Bashe y a mi abuelo Jaime con quienes me gustaría poder compartir este logro. A Catalina, Gloria y Benjamín por sus consejos. A mi asesor, Luis quien siempre me apoyó y sigue apoyándome dándome la libertad, las herramientas y la ayuda necesaria para desarrollarme como investigador y poder llevar acabo este proyecto. A mis tutoras: Elena, quien con sus ideas originales y conocimientos contribuyó mucho para mejorar a mi trabajo, y Rosa, quien con sus conocimientos acerca de la biología del desarrollo en general y de C. elegans en particular contribuyó mucho en este proyecto. A mis amigos: Eugenio, León, Enrique, Yaron, Shajar y Mateo. A las personas que han colaborado en mis proyectos: Eugenio, Elena, Mariana, David, Benjamín, Stalin y Eli. A mis compañeros del laboratorio: Akram, Mariana Esther, Osiris, Adhemar, Carlos, Jeniffer, Fernanda, Alfredo y Mauricio. A mis compañeros del seminario de biología teórica del C3. A todos mis maestros. Gracias por haber compartido este proyecto conmigo Índice 1. Resumen 2. Introducción 2.1. La vulva de C. elegans como modelo para el estudio de la organogénesis 2.1.1. Una breve historia de la investigación del desarrollo de la vulva 2.1.2. Descripción general del desarrollo de la vulva 2.2. Las principales cascadas de señalización involucradas en el desarrollo de la vulva de C. elegans 2.2.1. La vía de señalización Wnt 2.2.2. La vía de señalización Notch 2.2.3. La vía de señalización RTK/Ras/ERK 2.3. Formación y mantenimiento del grupo de las células precursoras de la vulva 2.3.1. ¿Cuál es el mecanismo molecular que polariza a las células P para que sus hijas anteriores produzcan un linaje neuronal y sus hijas posteriores un linaje hipodermal? 2.3.2. La vía de Notch y la formación de la célula ancla. 2.3.3. !Las vías de señalización RTK/Ras/ERK y Wnt mantienen la competencia de las VPCs. 2.3.4. El mecanismo molecular involucrado en mantener al ciclo celular de las VPCs inactivo durante las fases larvarias L1 y L2 2.4. Proliferación y diferenciación de las células precursoras de la vulva 2.4.1. Investigación y modelado del proceso de determinación de los destinos de las células precursoras de la vulva 2.4.2. La determinación de los destinos de las células precursoras de la vulva 2.4.3. La polarización de las VPCs y las dos divisiones longitudinales 2.4.4. La tercera división de las VPCs y la diferenciación de las células vulvares adultas 2.5. Morfogénesis de la vulva 2.5.1. Conexión del útero con la vulva 2.5.2. La migración de las células vulvares hacia el centro de la vulva y la formación de los siete toroides 2.5.3. Migración, anclaje e inervación de los músculos vulvares 3. Métodos 3.1. Modelado de redes moleculares 3.1.1. Propiedades topológicas de una red reguladora de moléculas 3.1.2. Propiedades dinámicas de una red reguladora de moléculas 3.2. Artículo: Building qualitative models of plant regulatory networks with SQUAD 3.3. Artículo: Finding Missing Interactions of the Arabidopsis thaliana Root Stem Cell Niche Gene Regulatory Network 3.4. Métodos y programas para las simulación y el análisis de la dinámica de modelos de redes reguladoras de moléculas 3.5. Comparación de modelos de redes 4. Resultados y Discusión 4.1. Artículo: A network model for the specification of vulvar precursor cells and cell fusion control in Caenorhabditis elegans. 4.2. Artículo: A model of the regulatory network involved in the control of the cell cycle and cell differentiation in the Caenorhabditis elegans vulva 4.3. ¿Cómo construir un modelo integral que describa la relación entre la morfogénesis de la vulva y la diferenciación de sus células? 5. Referencias 1. Resumen Una de las preguntas más importantes de la biología del desarrollo es ¿Cómo funcionan los mecanismos moleculares involucrados en la diferenciación, dediferenciación y transdiferenciación de las células? De acuerdo con la teoría actual, cada tipo de célula se caracteriza por un patrón de activación de moléculas ya sea estable u oscilatorio que se puede observar experimentalmente. El patrón de activación de moléculas característico de cada tipo celular y las condiciones necesarias para pasar de un tipo celular a otro, son características emergentes de una red de moléculas, las cuales se regulan entre sí. En este trabajo usamos a la red de moléculas involucradas en la determinación de los destinos de las células precursoras de la vulva de Caenorhabditis elegans para estudiar al proceso de la diferenciación celular. Caenorhabditis elegans es un organismo modelo ampliamente utilizado para el estudio de la genética y el desarrollo animal por su fácil mantenimiento, cuidado, y reproducción; adicionalmente, es transparente. Fue el primer organismo multicelular cuyo genoma fue completamente secuenciado y su genoma compacto facilita su estudio a nivel genómico. Existen únicamente dos sexos: machos y hermafroditas. La vulva de Caenorhabditis elegans es un órgano sexual de los hermafroditas que conecta al útero con el exterior y que se desarrolla después de la formación del embrión. Está compuesta por siete toroides sinciciales; que son, vulA, vulB1, vulB2, vulC, vulD, vulE y vulF. Las funciones de la vulva son depositar huevos y permitir la copulación. La vulva de C. elegans es un buen modelo para el estudio de la organogénesis porque es un órgano sencillo, conocemos su linaje celular y no es un órgano esencial por lo cual muchas mutaciones que afectan al desarrollo de la vulva no son letales, lo que permite observar su efecto durante las diferentes etapas del desarrollo de la vulva. La vulva de C. elegans es uno de los órganos más simples de uno de los organismos multicelulares menos complejos y sin embargo después de más de 40 años del estudio de este órgano aún existen muchas preguntas sin responder acerca del mecanismo molecular involucrado en el control de su desarrollo. Una red de moléculas controla al desarrollo de la vulva; sus nodos son genes, proteínas, RNAs y minerales como Ca, Mg y Fe que se activan o inhiben entre sí; estas activaciones o inhibiciones son las interacciones de la red. La mayoría de lo que sabemos acerca de la red de moléculas involucrada en el control del desarrollo de la vulva se conoce gracias a estudios genéticos. Los modelos, tanto diagramáticos como dinámicos que varios grupos de investigadoresdiseñaron para describir o simular diversos aspectos de la formación de la vulva han facilitado la comprensión de su desarrollo. Algunos investigadores incluso han hecho predicciones basadas en el análisis de la dinámica de sus modelos y las han comprobado experimentalmente, pero ningún grupo de investigación había incluido en un modelo computacional de la red a la vía de señalización Wnt ni a las moléculas involucradas en el control de la fusión celular, la polarización celular o el control del ciclo celular durante la diferenciación de las células precursoras de la vulva. En este proyecto, construimos dos modelos de la red de moléculas involucradas en el control de la determinación de los destinos de las células precursoras de la vulva, en el primero incluimos a la vía de señalización Wnt, a las moléculas involucradas en el control de la fusión y la polarización celular y en el segundo incluimos al ciclo celular. Nuestro primer modelo es determinista, discreto, síncrono y multivaluado. Es el más completo que se ha publicado hasta ahora de la red de moléculas involucradas en el control de la determinación del destino de las células precursoras de la vulva al incluir a 88 moléculas. Al simular la dinámica de nuestro modelo se puede observar que el proceso de la determinación de los destinos de las células precursoras de la vulva es reversible y que el destino primario y el secundario se pueden transdiferenciar entre sí, esto corresponde con lo observado experimentalmente. Adicionalmente, nos fue posible asociar a varios genotipos mutantes con sus posibles fenotipos. Nuestro segundo modelo también es discreto, determinista y síncrono y contiene dos módulos funcionales; el primero, es un modelo simplificado de la red de moléculas involucradas en la determinación de los destinos de las células precursoras de la vulva y el segundo es un modelo de la red de moléculas involucradas en el control del ciclo celular para simular durante la formación de la vulva de C. elegans. Adicionalmente construimos una versión continua del módulo del ciclo celular para descartar que la existencia de su atractor cíclico fuese un artefacto causado por la actualización síncrona del módulo. Nuestra conclusión más importante después de simular la dinámica de nuestro modelo, después de conectar a ambos módulos, fue que la interconexión entre la red de moléculas implicadas en el control del ciclo celular y la red de moléculas involucradas en la determinación de los destinos de las VPCs causa que la determinación de los destinos sea completamente reversible, permitiendo siempre la dediferenciación y transdiferenciación de estas células y elimina la necesidad de un mecanismo de control temporal que garantice que el destino primario se diferencie antes del destino secundario. 2. Introducción Una de las preguntas más importantes de la biología del desarrollo es ¿Cómo funcionan los mecanismos moleculares involucrados en la diferenciación, dediferenciación y transdiferenciación de las células? De acuerdo con la teoría actual, cada tipo de célula se caracteriza por un patrón de activación de moléculas. ya sea estable [1] u oscilatorio [2] que se puede observar experimentalmente [3]. El patrón de activación de moléculas característico de cada tipo celular y las condiciones necesarias para pasar de un tipo celular a otro, son características emergentes de una red formada por las moléculas involucradas en el control de la diferenciación y las interacciones entre ellas [4-6]. El comportamiento dinámico de las redes biológicas no es obvio o intuitivo, sino que es complejo y es necesario modelarlo y simularlo para explorarlo y entenderlo. En este trabajo usamos a la red de moléculas involucradas en la determinación de los destinos de las células precursoras de la vulva de Caenorhabditis elegans como modelo para el estudio del proceso de la diferenciación celular. El nemátodo Caenorhabditis elegans es un organismo modelo ampliamente utilizado para el estudio de la genética, el desarrollo y el comportamiento animal, por su fácil mantenimiento, cuidado y reproducción. Fue el primer organismo multicelular cuyo genoma fue completamente secuenciado. Además de ello, su genoma compacto facilita su estudio a nivel genómico y de biología molecular. Los organismos son transparentes, sólo existen C. elegans hermafroditas o machos, no hay hembras, miden alrededor de un milímetro de largo y están formados por un número pequeño de células, los hermafroditas tienen 959 y los machos 1031. Su ciclo de vida dura tres días, tiene cuatro fases larvarias; las cuales son, L1, L2, L3 y L4. En caso de falta de alimento, este nemátodo puede entrar en un estado alternativo a mediados de la fase larvaria L1, el cual es resistente al estrés y al envejecimiento (dauer stage) (Figura 1). La vulva de Caenorhabditis elegans es un órgano sexual de los hermafroditas que se desarrolla después de la formación del embrión. La vulva es un conducto que conecta al útero con el exterior. Está compuesta por siete toroides formados por nueve células, las cuales contienen 22 núcleos celulares. Los toroides se llaman igual que los tipos de células que los forman; que son, vulA, vulB1, vulB2, vulC, vulD, vulE y vulF (Figura 2). El desarrollo de la vulva ocurre en tres etapas principales las cuales son: a) formación y mantenimiento de las células precursoras de la vulva (VPCs) b) proliferación y especialización de las VPCs y de sus descendientes durante las fases larvarias L1, L2 y L3, y c) morfogénesis de la vulva durante L3 y L4, durante la cual las células vulvares migran y se fusionan para formar a los toroides, adicionalmente la vulva se conecta con los músculos y la hipodermis (la epidermis de C. elegans) (Figuras 1 y 2) [7, 8]. Fig. 1. El desarrollo de la vulva durante el ciclo de vida de C. elegans En cada transición entre las etapas larvarias, la zona agrandada esta marcada con un rectángulo morado. El ciclo de vida dura alrededor de 3 días. El huevo se desarrolla dentro del útero hasta la primera división celular, después de varios ciclos adicionales de división celular se forma la gástrula, posteriormente el embrión se hace más largo y se dobla varias veces hasta que el gusano eclosiona. Al eclosionar el gusano tiene dos filas con seis células P cada una, si no hay suficiente comida en el ambiente o hay una concentración demasiado grande de gusanos, C. elegans puede entrar en la fase dauer, que es resistente al estrés y puede durar 6 meses. Si las condiciones lo permiten, el gusano puede pasar a la fase larvaria L2, durante la fase L2 se forma la AC (célula ovalada ) y durante la transición entre L2 y L3, se determina el destino de las VPCs (primario en azul y secundario en anaranjado). Durante la fase larvaria L3 las VPCs se dividen y diferencian. Durante la transición entre las fases larvarias L3 y L4 las células de la vulva comienzan a migrar hacia el centro de la vulva en desarrollo. Durante la fase larvaria L4 ocurre la morfogénesis de la vulva y para la transición entre la fase larvaria L4 y el adulto la vulva ya está completamente formada (Figura 2). Las funciones de la vulva son depositar huevos y permitir la copulación, ambas funciones requieren que la vulva se abra formando un canal que conecta al útero con el exterior. La célula utse (uterine seam cell) forma una barrera entre la vulva y el útero, la cual se rompe durante la primera copulación o cuando la hermafrodita deposita su primer huevo. La forma de la vulva y la �������� � � �� ����� � � �������� ������������� ����� ���������������� �������� ���� ����� ��� ����� unión entre las células vulE y las células de la costura de la hipodermis lateral mantienen al canal vulvar cerrado hasta que los músculos vulvares se contraen causando su apertura (Figura 2). Fig. 2. La vulva de C. elegans al final de L4antes de la eversión Las células vulA se muestran en color ladrillo, las vulB1 en anaranjado obscuro, las células vulB2 en anaranjado claro, las vulC en amarillo, las vulD verde olivo, las vulE en verde pasto, las vulF en azul, las células musculares en verde azulado y la célula utse (el himen de C. elegans) en morado y las células de la costura (seam cells), a las que se unen la célula utse y las células vulE, en amarillo. Los círculos delimitan secciones transversales del gusano. 2.1. La vulva de Caenorhabditis elegans como modelo para el estudio de la organogénesis. La vulva de C. elegans es un buen modelo para el estudio de la organogénesis porque la vulva es un órgano relativamente sencillo, conocemos su linaje celular, el cual casi no varía entre un individuo y otro, y no es un órgano esencial por lo cual muchas mutaciones que afectan al desarrollo de la vulva no son letales, lo que permite observar el efecto que tienen muchas mutaciones durante las diferentes etapas del desarrollo de la vulva. Existen varios fenotipos observables durante el desarrollo de la vulva; en algunos, no se forma la vulva (Vul) [9, 10], en otros se forman múltiples vulvas (Muv) [9, 10], en otros se forman dos vulvas por defectos en la polarización celular (Biv), algunas mutaciones provocan defectos que hacen más difícil o imposible depositar huevos (Egl) [11], otras mutaciones causan que un hermafrodita fértil y Egl no pueda depositar los huevos que produce, estos eclosionan dentro del gusano y nacen a través de una cavidad que ellos mismos hacen (Bag), otras mutaciones causan la formación de una vulva protrusiva (Pvl) [12], y otras mutaciones provocan que no se forme el lumen de la vulva (Evl) [13]. 2.1.1 Una breve historia de la investigación del desarrollo de la vulva La vulva de C. elegans emergió como modelo para el estudio de la organogénesis a partir de investigaciones generales acerca del desarrollo de este nemátodo; específicamente, a partir de un estudio sobre el linaje postembrionario de las células de C. elegans, en el cual observaron el linaje de las células que forman la vulva [14]. En otra investigación descubrieron al grupo de competencia vulvar y las células precursoras de la vulva (VPCs) [15] al intentar responder a las siguientes dos preguntas: 1) ¿Qué tan comprometidas están las células con su destino? y 2) ¿Si se eliminan las células por ablación con laser, pueden las células aledañas remplazarlas? Y en un tercer estudio [9], buscaron genes cuyos mutantes alteran al linaje postembrionario de C. elegans, y encontraron a más de diez genes que al ser mutados, afectan al linaje de las células de la vulva. Los primeros estudios sobre el desarrollo de la vulva fueron búsquedas de genes que al ser mutados, causan un fenotipo vulvar [10, 12, 13] o búsquedas de genes cuyos mutantes suprimen al fenotipo causado por otros mutantes [16-20]. Posteriormente varios grupos de investigadores hicieron diversos estudios de genética inversa, en los cuales se muta a un gen en distintos sitios y posteriormente se observa el fenotipo que causa esta mutación [1, 21-27]. La mayoría de lo que sabemos acerca de las vías de señalización involucradas en el control del desarrollo de la vulva y la comunicación entre estas vías, se conoce gracias a los estudios genéticos mencionados anteriormente. Los modelos, tanto diagramáticos como dinámicos que varios grupos de investigadores diseñaron para describir o simular diversos aspectos de la formación de la vulva [28-43] han facilitado la comprensión de su desarrollo desde 1986. Algunos grupos de investigación incluso han hecho predicciones basadas en el análisis de la dinámica de sus modelos y las han comprobado experimentalmente [31, 38, 44]. Adicionalmente, diversos grupos observaron la morfogénesis de la vulva a través de un microscopio electrónico tanto en el tipo silvestre [7] como en diversos mutantes [45, 46]. Otros investigadores hicieron estudios de genética inversa de algunos de los genes involucrados en el control de la morfogénesis de la vulva [47, 48], que nos han permitido comprender mejor las funciones de las vías de señalización involucradas en el control de la migración y la fusión celular durante la formación de la vulva. 2.1.2 Descripción general del desarrollo de la vulva. El desarrollo de la vulva ocurre en tres etapas principales: i) Formación y mantenimiento de las VPCs, ii) Diferenciación y proliferación de las células vulvares, y iii) Morfogénesis de la vulva. C. elegans nace con dos hileras de células de P en la región ventral media; estas células P son las progenitoras de todas las células vulvares. Durante la primera etapa larval (L1), las células P se dividen longitudinalmente y sus descendientes posteriores de la región media, P3.p-P8.p forman al grupo de competencia vulvar. Durante la segunda fase larvaria (L2), se forma la célula ancla (AC), la cual mantiene a la capacidad de las VPCs de diferenciarse en células vulvares. Durante la tercera fase larvaria (L3) las VPCs son inducidas por la AC y sus vecinas, se diferencian y adquieren un destino primario, secundario o terciario. Posteriormente las VPCs que adquirieron el destino secundario son polarizadas, después de eso, las VPCs se dividen longitudinalmente, y las hijas de la VPC que adquirieron el destino terciario se fusionan con el sincicio hipodérmico (hyp7). Las hijas de las VPCs restantes son polarizadas, y se dividen longitudinalmente por segunda vez. Al principio de la fase larvaria L4, las nietas de P6.p, que adquirió el destino primario, se dividen transveralmente. Las nietas más proximales de P5.p y P7.p, que adquirieron el destino secundario, no se dividen por tercera vez, las siguientes más proximales se dividen transversalmente, y el resto, se dividen longitudinalmente una tercera vez. La morfogénesis de la vulva comienza durante la fase larvaria L3, cuando la célula ancla rompe la membrana basal que la separa de las hijas de P6.p, y luego envía una proyección que se inserta entre las nietas más proximales de P6.p. Después de la tercera división, los descendientes de las VPCs migran hacia el centro de la vulva en desarrollo. Durante la cuarta etapa larvaria (L4), se forman los toroides vulvares, algunas de las células dentro de cada toroide se fusionan, se invagina la vulva, y se eversiona, permitiendo la formación del lumen vulvar. Posteriormente los músculos vulvares se unen a la vulva y son inervados. Por último, las ocho células pi se fusionan formando al sincicio utse. 2.2 Las principales cascadas de señalización involucradas en el control del desarrollo de la vulva de C. elegans. El desarrollo de los organismos multicelulares requiere un control muy preciso de la polarización, la diferenciación y la migración de las células que lo conforman. Uno de los mecanismos moleculares más importantes para conseguir ese fino control del desarrollo consiste en la activación espacio-temporal de vías de señalización específicas. Las vías de señalización permiten que ciertas moléculas en el microambiente extracelular cambien el patrón de activación molecular de una célula, usualmente por medio de una serie de reacciones de activación e inhibición que activan o desactivan a un grupo de factores transcripcionales en el núcleo de la célula. Los ligandos que activan a las vías de señalización algunas veces funcionan como morfógenos, un término introducido por Turing para denotar una molécula involucrada en la formación de patrones espaciales durante la morfogénesis por medio de reacciones químicas y difusión [49]. Existen varios modelos que describen el efecto de la presencia de morfógenos. Uno de los más conocidos y utilizados es el modelo de la bandera francesa [50], de acuerdo con el cual el morfógeno es secretado por una o varias células y se difunde generando un gradiente que proporciona información posicionala las células, las cuales responden a la concentración del morfógeno diferenciándose. En el caso particular en donde existen dos umbrales de expresión del morfógeno; una fila de células expuesta al gradiente de éste, se puede diferenciar en tres tipos celulares diferentes creando tres regiones que a Wolpert le recordaron la bandera de Francia. Existen otros modelos que proponen mecanismos más dinámicos para la función de los morfógenos. El modelo de reacción difusión [49] propone que en un tejido algunas células secretan un morfógeno que se difunde e inhibe la expresión del morfógeno en las células aledañas, pero otras células más lejanas perciben una concentración menor del morfógeno y lo expresan, creando un patrón que depende del gradiente inicial de concentración del morfógeno y de los parámetros cinéticos. También existe el método de la red de genes [51], el cual asume que varios genes se regulan entre sí formando una red que recibe información de su microambiente extracelular que afecta al patrón de activación de los genes, algunos de estos genes codifican proteínas que son secretadas. El resultado es que cada célula responde a la información posicional y la cambia, lo cual tiene como resultado una información posicional dinámica. Durante el desarrollo de la vulva la regulación mutua entre las vías de señalización Wnt, Notch, RTK-Ras-ERK y FGFR-Ras-ERK coordina a los mecanismos moleculares involucrados en el control de diferenciación [52], proliferación [44], migración [53] y fusión [47] celular, por medio de un fino control de la expresión y actividad de varios genes blanco; entre los cuales se encuentran los siguientes: actina (act-1, act-2, act-3, act-4, act-5), miosina (hum-1,…, hum-8, y otros), rho (ect-2 y otros), eff-1, aff-1, egl-17, lin-39, cki-1 y lin-12. A continuación presentamos a las principales vías de señalización involucradas en el control molecular del desarrollo de la vulva, las moléculas que forman parte de estas vías, y la forma en la que interactúan entre sí. En las siguientes secciones describiremos lo que se conoce acerca de sus funciones durante cada etapa del desarrollo de la vulva. 2.2.1 La vía de señalización Wnt Las proteínas Wnt son glicoproteínas modificadas por lípidos que son secretadas, están conservadas evolutivamente y forman gradientes de concentración. Estos gradientes proporcionan información posicional a las células en los tejidos en desarrollo, adicionalmente, las proteínas Wnt también pueden funcionar como señales locales por medio de las cuales una célula puede afectar a sus vecinas [54]. Las proteínas Wnt causan una gran variedad de respuestas en las células receptoras, pueden influir en la diferenciación celular por medio de la activación o inhibición de ciertos genes blanco y adicionalmente funcionan como uno de los principales mecanismos que controlan la polaridad y la migración de las células ajustando directamente al citoesqueleto [55]. Las proteínas Wnt pueden activar diferentes mecanismos de señalización. El mecanismo que ha sido estudiado más minuciosamente es la vía canónica de Wnt, la cual controla la expresión de ciertos genes blanco por medio de las proteínas efectoras de tipo β-catenina y algunos factores transcripcionales de la familia TCF/Lef1 que contienen una caja de tipo HMG [56] (Figura 3). Cuando las proteínas Wnt no están presentes en el microambiente extracelular las β-cateninas son ubiquitinadas y marcadas para ser degradadas por un complejo de proteínas que promueve la proteólisis, el cual está formado por la proteína de andamiaje Axina, APC que es el producto de un gen supresor de tumores y las cinasas CK1 y GSK3β. La vía canónica de Wnt es necesaria para controlar propiamente a la fusión celular [39, 57] y para la determinación del destino primario de las VPCs [58-60] durante la formación de la vulva de C. elegans. En C. elegans, la vía Wnt canónica (Figura 3) se activa cuando un ligando de tipo Wnt como: MOM-2, CWN-1, CWN-2, LIN-44 o EGL-20 [58] que es secretado por una célula aledaña en un mecanismo dependiente de FGF [61] AP-2 y MIG-14/Wntless [62], se une a un receptor de tipo Frizzled como MIG-1, LIN-17, MOM-5 o CFZ-2 [58], luego el complejo Wnt/Frizzled se une a una proteína de tipo Disheveled la cual puede ser DSH-1, DSH-2 o MIG-5 [56, 63], formando un complejo que inhibe la formación del complejo APR-1/PRY-1/KIN-19/GSK-3β, este complejo fosforila a las β-cateninas marcándolas para que sean ubiquitinadas y degradadas [56, 64-66]. Las β-cateninas; específicamente, HMP-2[67], SYS-1[68, 69] o BAR-1 [57], se unen a POP-1/Tcf el único miembro de la familia de factores transcripcionales TCF/LEF que se conoce en C. elegans [56], formando un complejo de proteínas que activa la transcripción de genes blanco entre los cuales se encuentran lin-39 [57] y mab-5 [56] Fig. 3. La vía de señalización Wnt canónica en C. elegans Las flechas con punta representan interacciones activadoras y las flechas sin punta representan interacciones inhibidoras, las flechas anchas representan interacciones activas y las flechas delgadas interacciones inactivas. ! Una vía divergente de la vía Wnt canónica llamada “Wnt/β-catenin asymmetry pathway” es uno de los principales mecanismos moleculares involucrados en el control de la polarización y la diferenciación de diversas células somáticas a lo largo del eje anterior-posterior [56,! 70];! notablemente, las VPCs P5.p y P7.p son polarizadas por esta vía de señalización [71]. La vía “Wnt/β-catenin asymmetry pathway” de C. elegans (Figura 4) se activa cuando una célula es expuesta a un gradiente de ligandos Wnt; específicamente, MOM-2, CWN-1, CWN-2, LIN-44 y EGL-20 [58]. En la parte de la célula expuesta a una mayor concentración de los ligandos de tipo Wnt (mitad derecha de la figura 2), el ligando de tipo Wnt se une a el receptor membranal LIN-17, LIN-18 o CAM-1 activándolo [58, 71], posteriormente, una proteína de tipo Dishevelled, específicamente, MIG-5 DSH-1 o DSH-2 [56, 63], se une al receptor activado. La parte de la célula expuesta a una menor concentración del ligando de tipo Wnt (mitad izquierda de la figura 2), acumula complejos de las proteínas WRM-1/LIT-1/APR-1 [56, 72] en la membrana. Una vez que la célula se divide, en la hija expuesta a una menor concentración del ligando Wnt, se forman complejos de APR-1/PRY-1/KIN-19/GSK-3β que activan la ubiquitinacion y degradación de las β-cateninas [56, 64-66], existen cuatro β-cateninas en C. elegans, específicamente, WRM-1[73], HMP-2[67], SYS-1 [68, 69] y BAR-1 [57]. El resultado es que en la célula hija expuesta a una menor concentración del ligando POP-1 inhibe la transcripción de ciertos genes blanco en el núcleo. Mientras que en la célula hija expuesta a una mayor concentración de Wnt se inhibe la formación de complejos APR-1/PRY- 1/KIN-19/GSK-3β, aumenta la concentración de β-cateninas y se forman complejos de β- catenina/POP-1, que activa la transcripción de ciertos genes blanco. Adicionalmente, algunas de las proteínas POP-1 restante se unen a complejos WRM-1/LIT-1, los cuales son transportados fuera del núcleo de la célula lo cual previene la inhibición de la transcripción de los genes blanco [56, 71, 73, 74]. ! ! Fig. 4. La vía “Wnt/β-catenin asymmetry pathway” polariza una célula En esta figura, la parte derecha de la célula está expuesta a una concentración más alta de ligandos de tipo Wnt. Las flechas con punta representan interacciones activadoras y las flechas sin punta representan interacciones inhibidoras, las flechas anchas representan interacciones activas y las flechas delgadas interacciones inactivas. 2.2.2 La vía de señalización Notch Notch es una vía de señalización fundamental para el control de la diferenciación celular durante el desarrollo animal. El análisis genético de la vía de Notch en C. elegans ha enfatizadociertas características de esta vía esencial que están evolutivamente conservadas en otros nematodos, las moscas Drosophila y los vertebrados [75, 76]. En C. elegans varios procesos de especialización celular requieren a una de las dos proteínas de tipo Notch, las cuales son LIN-12 y GLP-1 [77]. LIN-12 se requiere durante la determinación de los destinos de las VPCs, y durante la diferenciación de la célula ancla. Adicionalmente, la función de ambas proteínas es necesaria para dirigir la morfogénesis del sistema digestivo de C. elegans por medio del control de la fusión celular [78] . La vía de Notch (Figura 5) se activa cuando la concentración en el microambiente extracelular de uno de los cuatro ligandos de la familia DSL (Delta- Serrate-LAG-2) los cuales son: LAG-2 [77, 79], DSL-1 [80], APX-1 [81] y ARG-1 [82], rebasa cierto umbral. Los ligandos de tipo DSL se unen a uno de los dos receptores ortólogos de NOTCH de Drosophila; específicamente LIN-12 o GLP-1[77], LIN-12 es más importante durante el desarrollo de la vulva. Después de su activación, LIN-12 es cortada en el sitio extracelular 2 en un proceso mediado por SUP-17 [83] o ADM-4 [84], posteriormente, LIN-12 es dividida una segunda vez en el sitio trans-membranal 3, esta segunda división es mediada por el complejo formado por SEL- 12 o HOP-1 [85], APH-1 [86], APH-2 [87], y PEN-2 [88]. El fragmento intracelular resultante de LIN-12 es transportado al núcleo donde se une a LAG-1 [89] (CSL) y SEL-8 [90],!formando un complejo que activa la transcripción de ciertos genes blanco [75], a los cuales se les denomina genes blanco de la señal lateral, entre los que se encuentran ark-1, lip-1, dpy-23, lst-1, lst-2, lst-3, lst-4, mir-61, y lin-11 [91, 92], entre otros. La vía de Notch incluye al menos dos circuitos de retroalimentación positiva; primero, LIN-12 activa al complejo formado por LAG-1, SEL-8 y LIN-12 que activa la transcripción de lag-1 y lin-12 [89, 93-95], y segundo, el complejo LIN- 12/SEL-8/LAG-1 activa la transcripción de mir-61 que inhibe a VAV-1 y VAV-1 inhibe a LIN- 12, consecuentemente LIN-12 evita indirectamente la inhibición de LIN-12 [96]. ! Fig. 3 La vía de Notch en C. elegans Las flechas con punta representan interacciones activadoras y las flechas sin punta representan interacciones inhibidoras, las flechas anchas representan interacciones activas y las flechas delgadas interacciones inactivas. 2.2.3 La vía de señalización RTK-Ras-ERK La GTPasa Ras tiene funciones importantes en múltiples vías de señalización, una de las más importantes es la vía RTK-Ras-ERK [97]. La vía de señalización RTK-Ras-ERK se encuentra evolutivamente conservada en otros nematodos, las moscas Drosophila y los vertebrados y está involucrada en el control de diversos procesos biológicos entre los cuales se encuentra la proliferación celular [98, 99]. Durante el desarrollo de la vulva de C. elegans, la vía de señalización RTK-Ras-ERK es necesaria para permitir que las VPCs se dividan [100], para prevenir la fusión celular en las células que no deben fusionarse [47, 53], y para permitir la especificación del destino primario de las VPCs [59]. Para que la vía RTK/Ras/ERK [97] (Figura 6) pueda ser activada en la vulva de C. elegans, primero una célula cercana debe expresar y secretar al factor de crecimiento epidérmico LIN- 3/EGF [27]. En el tipo silvestre, la célula ancla expresa y secreta LIN-3/EGF, la expresión de LIN-3/EGF en la AC requiere la función del factor de transcripción HLH-2/E/Daughterless y de un receptor nuclear de hormonas (NHR) no identificado [101], la expresión de LIN-3 en las células vulF es dependiente de nhr-67 y egl-38 [23]. LIN-3 es sintetizado inicialmente como una proteína transmembranal, y se requiere la función de la proteína ROM-1 para generar una forma difusible por medio de la proteólisis de LIN-3 [102]. Adicionalmente, los genes SynMuv (Synthetic Multivulva) regulan a la expresión de lin-3 en muchos tejidos, entre ellos la célula hyp7 [103]. Una vez que LIN-3/EGF está presente en el microambiente extracelular, es necesario que las VPCs puedan responder a esta señal y para eso es necesaria la función del receptor LET- 23/EGFR [19], un complejo formado por tres proteínas que contienen un dominio PDZ; específicamente, LIN-2, LIN-7, y LIN-10 [104] deben interactuar con EPS-8 [105] para permitir que LET-23/EGFR se localice en la membrana basolateral de las VPCs, mientras que ARK-1 [106], SLI-1 [107], UNC-101 [108], DPY-23 [91], LST-4 [91], RAB-7 [109] y varios componentes del complejo ESCRT, [109] regulan negativamente a RTK/Ras/ERK y probablemente promueven la endocitosis y la degradación lisosomal de LET-23, DEP-1 inhibe la función de LET-23 probablemente por medio de la defosforilación directa de ciertas tirosinas clave [110]. Cuando LIN-3 se une a LET-23, el receptor se dimeriza y fosforila a su región terminal C exponiendo tirosinas fosforiladas que funcionan como sitios de unión para la proteína SEM-5 [18, 106, 111]. Cuando SEM-5 es activada al unirse a los sitios mencionados anteriormente, recluta a SOS-1 [111, 112], que es un factor de intercambio de guaninas (GEF), que activa a LET-60/Ras [113] por medio de la facilitación de la conversión de LET-60-GDP a LET-60-GTP [112], mientras que GAP-1, GAP-2 y GAP-3 facilitan la conversión de LET-60-GTP a LET-60-GDP [114-116], inhibiendo así la función de LET-60. Adicionalmente, let-60 es regulado negativamente por dos microRNAs: mir-84 y let-7 [117]. Si la concentración de LIN-3 en el microambiente extracelular no es muy alta, LET-60-GTP puede activar a RGL-1 lo cual causa que RGL-1 active a RAL-1 y promueva la determinación del destino vulvar secundario [118]. Alternativamente si la concentración de LIN-3 es lo suficientemente alta, LET-60-GTP puede iniciar la activación de LIN-45/Raf [16, 119], adicionalmente, LIN-45 debe ser defosforilada por SOC-2 [120] en algunos sitios y por CNK-1 [121] en otros sitios para activarse. Al activarse, LIN- 45 se une a las proteínas de andamiaje; KSR-1 y KSR-2 [122], las cuales también son activadas por SUR-6, probablemente son inhibidas por PAR-1 y activadas por las proteínas transportadoras de Zinc CDF-1 y SUR-7 [120]. El complejo LIN-45/KSR-1/KSR-2 fosforila y activa a MEK-2 [121, 123], y MEK-2 fosforila y activa a MPK-1 [124]. MPK-1 entonces es transportada al núcleo , en donde fosforila y activa a varias proteínas blanco, entre las cuales están: LIN-1 [125], LIN-31 [126], EOR-1, EOR-2 [127, 128], LIN-39 [25, 57, 129, 130] y dos subunidades del complejo Mediador: SUR-2 y LIN-25 [97, 131-133]. Al estar fosforiladas, las proteínas LIN-1 y LIN-31 activan a la expresión de lin- 39, mientras que cuando no están fosforiladas, la inhiben. LIN-39 fosforilada activa su propia expresión [25, 130], y también activa a la transcripción de lin-12 y lag-2 [134]. Adicionalmente, el complejo Mediador activa la expresión de apx-1, dsl-1 y lag-2 [79, 80]. ! ! Fig. 6. La vía de RTK/Ras/ERK en la vulva de C. elegans Las flechas con punta representan interacciones activadoras y las flechas sin punta representan interacciones inhibidoras, las flechas anchas representan interacciones activas y las flechas delgadas interacciones inactivas. 2.3!Formación!y!mantenimiento!del!grupo!de!las!células!precursoras!de!la! vulva.! C. elegans nace con dos filas de células P que contienen 6 células cada una, estas células son, de anterior a posterior; P1/2, P3/4, P5/6, P7/8, P9/10, P11/12. Durante la primera etapa larvaria (L1) las células P migran hacia la línea ventral de tal manera que 10 horas más tarde las células forman una sola fila, P1-P12 [135], la migración de las células P hacia la línea media ventral requiere de la función de ref-2(+) [136], rho-1(+), unc-73(+), let-502(+) [137] y ect-2(+)[138].! Curiosamente, antes de que la formación de una sola fila de célulasP, no es posible saber cual de las dos células de cada par PN/M, la derecha o la izquierda se volverá la anterior y cual se convertirá en la posterior.!Inmediatamente después de la formación de una sola fila, las células P se dividen longitudinalmente, las hijas anteriores de cada célula P adquieren un destino neuronal y se desprenden de la hipodermis, mientras que las hijas posteriores de las células P adquieren un destino hipodermal (Figura 7, 10h). Durante la segunda fase larvaria (L2) la vía de Notch especifica cual célula de la gónada; Z1.ppp o Z4.aaa, se convierte en la célula ancla (Figura 7, 12h).! Durante las fases larvarias L1 y L2, las vías de señalización Wnt y RTK/Ras/MAPK mantienen la competencia de las células precursoras de la vulva (VPCs) por medio de la inhibición de la fusión celular, y la actividad de CKI-1 evita que las VPCs se dividan.! Fig. 7 Formación y mantenimiento de la competencia de las VPCs En todas las figuras anterior es hacia la izquierda, a menos que se especifique de otra manera. En esta figura mostramos una vista ventral. Fase larvaria L1: 0h) C. elegans recién nacido con dos filas de células P de color verde, 10h) Gusano con una sola fila de células P, las cuales se dividieron longitudinalmente, las hijas anteriores que adquirieron un destino neuronal se muestran en azul marino y las hijas posteriores que adquirieron un destino hipodermal, en verde, 12h) Principio de la fase larvaria L2: Las VPCs (Mostradas en verde P1.p, P2.p, P3.p, P4.p, P5.p, P6.p, P7.p y P8.p) no se fusionan con hyp7 y la célula ancla (anaranjado) se diferencio. 2.3.1 ¿Cuál es el mecanismo molecular que polariza a las células P para que sus hijas anteriores produzcan un linaje neuronal y sus hijas posteriores un linaje hipodermal? El mecanismo involucrado en la polarización de las células P no se conoce, pero es probable que involucre a la variación de la vía canónica de Wnt llamada “Wnt/β-catenin asymmetry pathway” que es uno de los mecanismos principales que permiten la polarización de las células de C. elegans [56, 71] (Figura 4), y es necesaria para la polarización correcta de las células de la juntura (seam cells) [70], sin embargo, las hijas anteriores de las células de la juntura producen un linaje hipodermal y sus hijas posteriores un linaje neuronal, lo opuesto a lo que ocurre con las células P; adicionalmente la función de la variación asimétrica de la vía de Wnt es necesaria para la polarización correcta de las VPCs P5.p y P7.p durante la fase larvaria L3 [41]. Los siguientes genes son blancos probables de la vía asimétrica de Wnt en las células P; elt- 1, lin-26, elt-3, nhr-25, grh-1 y nhr-23 [139], están involucrados en el control de la diferenciación de las células hipodermales. Los genes lin-22 y cbp-1 que inhiben a la determinación del destino neuronal en ciertas células hipodermales, y los genes lin-32, hlh-2 y hlh-14 que son necesarios para la diferenciación de las neuronas [140]. 2.3.2 La vía de Notch y la formación de la célula ancla La célula ancla (AC) es la fuente de la señal inductiva que es necesaria para el mantenimiento de la competencia y la diferenciación de las VPCs. La célula ancla es esencial para el desarrollo de la vulva y la ablación por laser de la AC impide la formación de la vulva por que causa que las VPCs se fusionen con hyp7 durante la fase larvaria L1 [141, 142]. Las células de la gónada Z1.ppp y Z4.aaa pueden potencialmente convertirse en la AC. El proceso por medio del cual estas dos células se diferencian, de tal manera que una se convierte en la AC y la otra se convierte en una célula uterina ventral (VU) durante la fase larvaria L2, depende del orden en el que se forman las dos células y del resultado de una competencia entre ambas células por la expresión de LAG-2. Inicialmente, tanto Z1.ppp como Z4.aaa expresan lin-12/Notch y lag-2/Delta, cualquier diferencia inicial en la actividad de lin-12 en ambas células es amplificada por que LIN-12 activa al complejo LAG-1/SEL-8, el cual a su vez activa a la transcripción de lin-12 formando un circuito de retroalimentación positiva. La diferencia amplificada de actividad de lin-12 entre Z1.ppp y Z4.aaa, causa que una célula acumule más LIN-12 en su membrana y deje de transcribir lag-2 y esa célula se diferencia para volverse una célula VU. La expresión de lag-2 en la otra célula aumenta cada vez más hasta que empieza a transcribir lin-3, deja de expresar a lin-12, y se convierte en la célula ancla [95]. Los genes nhr-67 y hlh-2 tienen funciones importantes durante la formación de la célula ancla; la función de nhr-67 es necesaria para la expresión de lag-2 en la AC y la expresión de lin- 12 en las tres células VU y sus descendientes, adicionalmente, cuando se pierde la función de nhr-67 la célula que normalmente se diferenciaría en una célula VU adquiere el destino de una AC adicional [143], la AC requiere la función de hlh-2 para poder expresar a lag-2 y lin-3 [95], y la función de hda-1, que codifica a un componente del complejo NuRd (the nucleosome remodeling and deacetylation complex), también es necesaria para la diferenciación de la AC antes de egl-43 y nhr-67 [144]. 2.3.3 Las vías de señalización RTK/Ras/ERK y Wnt mantienen la competencia de las VPCs Las VPCs se forman durante la fase larvaria y no deben fusionarse con hyp7 ni diferenciarse durante la fase larvaria L2. Las vías de señalización Wnt [56] canónica y RTK/Ras/ERK [97] mantienen la competencia y el potencial de diferenciación de las VPCs, principalmente por medio de la activación de la expresión de lin-39 [57]; la actividad del gen Hox lin-39 es necesaria para la formación de las VPCs y para evitar que se fusionen con hyp7 y la expresión de los genes Hox mab-5 y ceh-13 delimita al área donde puede formarse el grupo de competencia vulvar [145, 146]. Durante la fase larvaria L1, la actividad de ref-2(+) es necesaria para generar a las células Pn.p y la actividad de lin-39(+) y ref-2(+) es necesaria para inhibir a la expresión de eff-1 y evitar que las células Pn.p se fusionen con hyp7; LIN-39 junto con sus cofactores, CEH-20 y UNC-62, activa la expresión de ref-2. Las VPCs posteriores P7.p y P8.p expresan MAB-5, otro gen Hox que también activa la expresión de ref-2 [47, 136, 147, 148]. En mutantes de pérdida de función de ref-2 las células P no migran hacia la columna ventral, sino que después de cierto tiempo las células P se fusionan con hyp7, se mueren por apoptosis, o se dividen una vez y después se mueren por apoptosis, adicionalmente, ref-2(RNAi) débil causa que P3.p-P6.p se fusionen con hyp7 [136]. P9.p, P10.p, y P11.p requieren la actividad de ref-1(+) para fusionarse con hyp7 [149]. Adicionalmente, en los mutantes de pérdida de función de lin-39, la transcripción de eff-1 no es inhibida y durante la fase larvaria L1, todas las células Pn.p se fusionan con hyp7, en los mutantes de pérdida de función de eff-1 ninguna de las células Pn.p se fusiona con hyp7 [47]. Dos factores transcripcionales de tipo GATA con dedos de zinc, ELT-5/EGL-18 y ELT-6, previenen la fusión de las VPCs con hyp7 durante la fase larvaria L2; ELT-5 y ELT-6 están presentes en las VPCs durante la fase larvaria L2 y la pérdida de la función de elt-5 y elt-6 causa que las VPCs se fusionen con hyp7 durante la fase larvaria L2, LIN-39 y CEH-20 directamente regulan la transcripción de al menos una de las isoformas de elt-5/egl-18 [47, 150]. 2.3.4 El mecanismo molecular involucrado en mantener al ciclo celular de las VPCs inactivo durante las fases larvarias L1 y L2. El control temporal es uno de los problemas fundamentales que debe resolver el mecanismo que controla al desarrollo de los organismos biológicos. Incluso cambios sutiles en los genes involucrados en el control temporal del desarrollo de un organismo pueden causar defectos letales o producir un fenotipo que le confiere una ventajaevolutiva al organismo. En el nemátodo C. elegans los genes heterocrónicos codifican a algunos de los principales componentes del mecanismo molecular involucrado en el control temporal del desarrollo [151]. Algunos de los genes heterocrónicos involucrados en el control temporal del desarrollo de la vulva son: lin-14, que codifica un factor transcripcional que promueve los destinos celulares característicos de la fase larvaria L1 [152], hbl-1 que codifica un factor transcripcional relacionado con hunchback de Drosophila [153], y lin-28 que codifica una proteína citoplásmica con una región que se activa durante períodos de baja temperatura y que contiene dedos de zinc [154], LIN-28 y HBL-1 promueven ciertas características de los destinos celulares de la fase larvaria L2. La pérdida de función de lin-14 o lin-28 causa una transición prematura de la fase G1 a la fase S del ciclo celular [155], y las VPCs se dividen precozmente durante la fase larvaria L2 [48]. CKI-1, es un inhibidor de cinasas dependiente de ciclinas ortólogo de p21/p27 de los mamíferos que inhibe la progresión del ciclo celular [156], se comienza a expresar durante la fase larvaria L1 tardía y está ausente cuando las VPCs se dividen, la pérdida de la función de cki-1 causa que las VPCs se dividan precozmente. Durante las fases larvarias L1 y L2, las proteínas codificadas por lin-14 [156], lin-25, sur-2, mdt-13, mdt-23, lin-1 y lin-31 [100]! activan la expresión de cki-1. Las proteínas SUR-2, LIN-25, LIN-1 y LIN-31 son fosforiladas por la vía de señalización RTK/Ras/ERK [97], que es activada durante la fase larvaria L3 antes de la primera división longitudinal de las VPCs, lo cual sugiere que la vía de señalización RTK/Ras/ERK es necesaria para la activación del ciclo celular de las VPCs [48, 100]. CKI-2 es otro inhibidor de cinasas dependiente de ciclinas de C. elegans, y la presencia de CDK-2 activo es suficiente para prevenir la progresión del ciclo celular y la división celular, la redundancia entre CKI-1 y CKI-2 es una posible razón por la cual RNAi de CKI-1 únicamente causa un solo ciclo adicional de división celular en las VPCs [157]. En resumen, el gusano nace con dos filas de células P que contienen seis células cada una, durante la etapa larval L1 las células P migran hacia la línea media ventral formando una fila de células P, a continuación, las células P se dividen longitudinalmente, sus hijas anteriores adquieren un destino neuronal y sus hijas posteriores adquieren un destino hipodérmico. Algunas de las células Pn.p se fusionan con hyp7. Las vías de señalización Wnt y RTK/Ras/MAPK mantienen el potencial de diferenciación de las VPCs P3.p, P4.p, P5.p, P6.p, P7.p y P8.p en parte por medio de la inhibición de su fusión con hyp7. Uno de los principales mecanismos moleculares involucrados en el mantenimiento de la quiescencia del ciclo celular durante las fases larvarias L1 y L2 es la activación de cki-1-1 por lin-14, lin-1 y lin-31. Después de la transición de la fase larvaria L2 a la L3, el miRNA lin-4 inhibe a la traducción de LIN-14 y la vía de señalización RTK/ Ras/MAPK regula negativamente a la transcripción de cki-1, lo que permite la progresión del ciclo celular en las VPCs. 2.4 Proliferación y diferenciación de las células precursoras de la vulva. Durante la fase larvaria L2 tardía, después de que las VPCs se forman, su potencial de diferenciación es conservado, se forma la célula ancla, el miRNA heterocrónico lin-4 es activado y la actividad de cki-1 es inhibida, las células precursoras de la vulva están listas para responder a las señales extracelulares involucradas en el control de la determinación de sus destinos y adquirir uno de los tres destinos vulvares, el destino primario se caracteriza por la expresión de egl-17 [158] y la división transversal de sus nietas, el destino secundario se caracteriza por la expresión de lin-11 [159] y lip-1 [160] y también por los diversos planos de división de sus nietas, las más proximales no se dividen, las siguientes más proximales se dividen transversalmente y las demás se dividen longitudinalmente, y las VPCs que adquieren el destino terciario, se dividen longitudinalmente y sus hijas se fusionan con hyp7 [7, 52]. Después de adquirir su destino, todas las VPCs se dividen longitudinalmente una vez, posteriormente las VPCs que adquirieron el destino terciario (P3.p, P4.p, y P8.p) se fusionan con hyp7, las hijas restantes de las VPCs se dividen longitudinalmente, después todas las nietas de P6.p que adquirió el destino primario, y dos de las nietas de P5.p y P7.p, que adquirieron el destino secundario, se dividen transversalmente, y las cuatro nietas más distales de P5.p y P7.p se dividen longitudinalmente [7] (Fig 7). Las 22 células resultantes son inducidas por la AC y otras células cercanas y se inducen entre sí para diferenciarse en los siete tipos de células vulvares adultas [21, 48, 161]. ! ! Fig. 7. Proliferación y diferenciación de las células vulvares P6.p adquiere el destino primario, P5.p y P7.p adquieren el destino secundario y P3.p, p4.p y P8.p (no mostradas) adquieren el destino terciario. Las VPCs que adquieren el destino primario o secundario se dividen longitudinalmente dos veces. Posteriormente las nietas de P6.p se dividen transversalmente, las biznietas proximales de P6.p se convierten en células vulF (azul) y las biznietas distales de P6 se convierten en células vulE (verde menta). Las nietas más proximales de P5.p y P7.p se convierten en células vulD (verde olivo), las siguientes nietas más proximales de P5.p y P7.p se dividen transversalmente y sus hijas se diferencian en células vulC (amarillo), el resto de las nietas de P5.p y P7.p se dividen longitudinalmente. Las cuatro biznietas más distales de P5.p y P7.p se diferencian en células vulA (rojo), las siguientes más distales se convierten en células vulB1 (anaranjado obscuro) y el resto de las biznietas de P5.p y P7.p se convierten en células vulB2 (anaranjado claro). ! ! 2.4.1 Investigación y modelado del proceso de determinación de los destinos de las células precursoras de la vulva. El proceso de determinación de los destinos de las VPCs es un excelente ejemplo de diferenciación por inducción [162], y ha sido estudiado más que cualquier otra etapa del desarrollo de la vulva. Antes de que se conocieran detalladamente las vías de señalización involucradas en el control de la determinación de los destinos de las VPCs, los modelos diagramáticos propuestos por Sternberg y Horvitz [141, 163] contribuyeron para mejorar nuestra comprensión del proceso de determinación de los destinos de las VPCs. Sternberg y Horvitz [141], primero propusieron dos importantes modelos del sistema involucrado en el control de los destinos de las VPCs; a) el modelo de la diferenciación por gradiente; de acuerdo a este modelo, un gradiente de la señal inductiva secretada por la AC induce con una concentración más alta de señal inductiva a la VPC más cercana, la cual es P6.p, a adquirir el destino primario, y las siguientes células más cercanas, P5.p y P7.p son inducidas por una concentración menor de la señal inductiva y adquieren el destino secundario, y b) el modelo secuencial; de acuerdo con el modelo secuencial, la determinación de los destinos ocurre en dos pasos, primero la AC induce a P6.p y causa que adquiera al destino primario, y segundo, P6.p induce a sus vecinas por medio de la señal lateral y entonces P5.p y P7.p adquieren al destino secundario. El segundo modelo diagramático de la determinación de los destinos de las VPCs propuesto por Sternberg y Horvitz [163], fue el resultado de un esfuerzo para integrar a los fenotipos, causados por ciertas mutaciones sencillas, reportados en otros estudios [10, 164] y los efectos de algunas mutaciones dobles que los autores observaron experimentalmente [163]. Su segundo modelo incluyeal gradiente de la señal inductiva secretada por la AC, a la señal lateral con su receptor, LIN-12, y adicionalmente, Sternberg y Horvitz predijeron la inhibición mutua que existe entre la determinación del destino primario, el destino secundario y el destino terciario. Después de los esfuerzos de modelado mencionados anteriormente, la necesidad de encontrar a los genes y proteínas que componen a las vías de señalización involucradas en las determinación de los destinos de las VPCs y la necesidad de estudiar al orden epistático entre esas moléculas era evidente, y los trabajos de investigación que respondieron a esa necesidad llevaron a una mejor comprensión de las vías de señalización RTK-Ras-ERK [97], FGF [97], Notch [75], y Wnt [56], y la intercomunicación entre estas vías de señalización [22, 26, 61, 134]. Las importantes vías de señalización mencionadas anteriormente y la intercomunicación entre ellas forman una red reguladora de moléculas que contiene muchos circuitos de regulación, tanto positivos como negativos y por lo tanto los modelos dinámicos son necesarios para explorar y la comprender como cambia el patrón de activación de nodos de una red de moléculas con esas características a través del tiempo. Una vez que se conto con más información disponible acerca de las vías de señalización relevantes, algunos grupos de investigadores construyeron modelos enfocados en la importancia del control secuencial durante la determinación de los destinos de las VPCs [28, 29, 31, 33, 44]. En el primero de estos estudios, los autores diseñaron un modelo dinámico basado en el modelo diagramático propuesto por Sternberg y Horvitz en 1989 [163]. El comportamiento dinámico del modelo enfatizó la importancia del control temporal durante la determinación de los destinos de las VPCs, el modelo incluso requiere la existencia de un mecanismo parecido a un semáforo que previene que dos VPCs vecinas puedan diferenciarse al mismo tiempo [29]. En 2007 Fisher et al., extendieron a su modelo por medio de la inclusión de varios mecanismos de intercomunicación entre las vías de señalización RTK-Ras-ERK y Notch, el resultado fue un modelo más robusto ante cambios en la sincronización de la determinación de los destinos de las VPCs aledañas y demostraron experimentalmente la existencia de un periodo de tres horas entre la determinación del destino primario y la determinación del destino secundario. En otro estudio reciente [44], los autores demostraron que el ciclo celular y la vía de Notch están coordinados por tres interacciones moleculares y posteriormente usan al ciclo celular como organizador temporal de un modelo dinámico de la determinación de los destinos de las VPCs. Otros grupos de investigadores se han enfocado en la importancia del gradiente de concentración de la señal inductiva y el de la señal lateral; los modelos que estos grupos han construido, usan un conjunto de ecuaciones diferenciales para explorar cómo la inhibición mutua entre la vía de Notch y la vía de RTK-Ras-ERK afecta al comportamiento dinámico de la red de moléculas involucradas en la determinación de los destinos de las VPCs [30, 35, 38, 40]. Giurumescu et al., [30], propusieron que la interconexión entre las vías amplifica a la percepción celular del gradiente de la señal inductiva y polariza a la señal lateral, lo cual mejora a la segregación de los destinos más de lo que sería posible en cualquier modelo en el que la vía de Notch y la vía de RTK-Ras-ERK no estén interconectadas. En su siguiente esfuerzo de modelado, Giurumescu et al., [35], construyeron una versión multicelular de su modelo en la cual incluyeron a las seis VPCs, y usaron a los parámetros del modelo para construir un diagrama de fase de los fenotipos, en el cual cada punto representa a un patrón diferente de destinos, por ejemplo, el patrón que corresponde al tipo silvestre, el cual es (3º, 3º, 2º, 1º, 2º, 3º). Los autores utilizaron al modelo para predecir la existencia de algunos patrones de destinos que aún no habían sido observados, por ejemplo, su modelo les permite predecir los patrones de destinos más probables para distintos niveles de señal inductiva y adicionalmente, su modelo ofrece una perspectiva evolutiva interesante, porque cambiando el valor de ciertos parámetros del modelo, es posible simular al proceso de determinación de los destinos de los nemátodos C. briggsae y C. remanei. Hoyos, et al. construyeron un modelo similar [38] el cual fue el primer modelo de la red de moléculas involucradas en la determinación de los destinos de las VPCs en el que tanto un mecanismo basado en el control temporal como un mecanismo basado en el gradiente de la señal inductiva son suficientes para dirigir al proceso de determinación de los destinos de las VPCs. Su modelo también fue el primero en incluir un mecanismo por medio del cual una VPC aislada, en un microambiente extracelular con una concentración moderada de señal inductiva puede adquirir el destino secundario. De acuerdo con el mecanismo incluido, la VPC aislada, en un micro- ambiente extracelular con una concentración moderada de señal inductiva, comienza a secretar DSL-1, el cual es uno de los principales componentes de la señal lateral y luego la VPC aislada responde a su propia señal lateral y adquiere al destino secundario. Posteriormente los autores comprobaron experimentalmente que la pérdida de función de dsl-1 reduce la probabilidad de que una VPC aislada adquiera al destino secundario. Cambiando los parámetros de este modelo también es posible simular al proceso de determinación de los destinos en los siguientes nemátodos relacionados: C. brenneri, C. briggsae y C. remanei, ofreciendo una perspectiva evolutiva. Los autores también propusieron que las diferencias en el proceso de determinación de los destinos de las VPC entre las diferentes especies se deben a cambios en la dinámica de la expresión de ciertos genes, y no a cambios en la topología de la red. La gran cantidad de información que existe acerca de la red de moléculas involucradas en la determinación de los destinos de las VPCs hace que este sistema sea muy atractivo para probar nuevas técnicas para el modelado de redes de moléculas [32-34, 36, 37, 40]. Una de estas técnicas es particularmente interesante [40] porque permite visualizar que tan comprometidas están las VPCs con el destino que adquirieron; específicamente, los autores diseñaron e implementaron una metodología que permite construir y visualizar al paisaje epigenético que corresponde al proceso de determinación de los destinos de las VPCs. Los paisajes epigenéticos [165] se construyen a partir de un método que permite calcular el potencial de diferenciación de cada patrón de activación de moléculas, si se acomoda a todos los patrones posibles en dos dimensiones, es posible visualizar al paisaje epigenético como una superficie tridimensional, que se parece a la topología de un terreno, el cual incluye montañas que representan a células que aún no se han diferenciado y que se pueden diferenciar y convertirse en muchos otros tipos de células, incluye también valles que representan a células ya diferenciadas, y también incluye a las barreras que separan a los estados que tienen el potencial para adquirir un destino celular, de los estados que tienen el potencial para adquirir otros destinos celulares. Adicionalmente, es posible visualizar al efecto que tienen las mutaciones que cambian al paisaje epigenético y analizar los cambios. ! Fig. 8. La topología del modelo propuesto por Weinstein y Mendoza (2013) Las flechas continuas con punta triangular representan activaciones, las flechas punteadas con punta romboidal representan inhibiciones. Las flechas rojas representan predicciones soportadas por el modelo. La vía de señalización RTK/Ras/ERK en azul, la vía de señalización Wnt en anaranjado, la vía de señalizaciónNotch en verde y los genes Hox y otras moléculas involucradas en el control de la fusión celular en amarillo. 2.4.2 La determinación de los destinos de las células precursoras de la vulva. Inicialmente todas las células precursoras de la vulva tienen un potencial de diferenciación similar; específicamente, una VPC puede adquirir el destino primario y expresar egl-17 [166], adquirir el destino secundario y expresar lin-11 y lip-1 ó adquirir el destino terciario, que no expresa ningún marcador especifico. Varios experimentos de ablación celular han demostrado que si una VPC es removida experimentalmente, entonces la VPC más cercana adquiere el destino que le correspondía a la VPC faltante [15,! 141]. Adicionalmente, si todas las VPCs excepto P3.p son removidas por ablación con láser, P3.p puede adquirir al destino primario o al secundario, dependiendo de qué tan lejos queda P3.p de la célula ancla [141]. Después de que se diferencia la célula ancla, durante la fase larvaria L2, la AC comienza a secretar LIN-3/EGF [27, 101], MOM-2 y LIN-44 [71], al poco tiempo de eso, la concentración de estos ligandos alrededor de la VPC más cercana, que es P6.p se eleva hasta que la vía de RTK/Ras/ERK se activa, más tarde, durante la transición entre la fase larvaria L2 y la L3, aproximadamente 25 horas después del nacimiento del gusano P6.p expresa a los genes: lag-2, apx-1, dsl-1 [80], lin-39 [24] y al marcador del destino primario egl-17 [31, 166]. La actividad de la vía canónica de Wnt también es necesaria para la determinación del destino primario de las VPCs [57]. Durante la fase larvaria L2, LIN-14 inhibe a LIN-12, pero durante la fase larvaria L3, la concentración del miRNA lin-4 aumenta, se une al mRNA de lin-14 y activa su degradación, permitiendo que la vía de Notch sea activada [167]. El destino secundario es redundantemente inducido por las vías de señalización Notch y RTK/Ras/ERK. Tres horas después de que P6.p adquiere al destino primario, P6.p induce a P5.p y P7.p a adquirir el destino secundario por medio de la expresión de los tres ligandos de tipo DSL; específicamente APX-1 y LAG-2 son proteínas transmembranales que inducen a las VPCs vecinas desde la membrana de P6.p por medio del contacto físico, mientras que DSL-1 es una proteína que puede ser secretada y actuar a cierta distancia [38]. Posteriormente, los ligandos de tipo DSL se unen a LIN-12 y activan a la vía de Notch que activa la transcripción de los genes blanco de la señal lateral (LSTs), entre los cuales se encuentran los marcadores del destino secundario lin-11 y lip-1 [168]. Alternativamente, una VPC aislada, en un microambiente extracelular con una concentración moderada de LIN-3 también puede adquirir el destino secundario, dos mecanismos podrían estar involucrados en este proceso; específicamente, a) la concentración moderada de LIN-3 puede activar a LET-60/Ras, pero no lo suficiente para que active a LIN-45/Raf, en lugar de eso, LET-60/Ras activa a RGL-1 y RGL-1 a su vez activa a RAL-1 y RAL-1 directamente ó indirectamente activa la determinación del destino secundario e inhibe la determinación del destino primario de las VPCs [118], y b) la VPC aislada secreta DSL-1, formando un circuito autócrino que activa a la vía de Notch y la expresión de los LSTs [38]. LIN-39 fosforilado activa su propia transcripción [25, 130],! formando un circuito de retroalimentación positiva que estabiliza a la determinación del destino primario. LIN-12/LAG- 1/SEL-8 activa directamente la transcripción de lag-1 y lin-12 [89, 93-95]!y también promueve indirectamente su localización en la membrana; porque uno de los genes blanco de la señal lateral es el miRNA mir-61 que inhibe la transcripción de VAV-1 y VAV-1 promueve la endocitosis y la degradación de LIN-12 [96], formando dos circuitos de retroalimentación positiva que estabilizan al destino secundario. Las vías de señalización RTK/Ras/ERK y Notch se inhiben mutuamente en todas las VPCs [91, 168]; específicamente, RTK/Ras/ERK inhibe a Notch cuando el complejo Mediador que es uno de los efectores principales de la vía de RTK/Ras/ERK, promueve la endocitosis de LIN-12 [169], la vía de Notch inhibe a la vía de RTK/Ras/ERK porque algunos de los LSTs inhiben a diferentes componentes de la vía RTK/Ras/ERK, LIP-1 regula negativamente a la actividad de MPK-1 [26, 160] y ARK-1 inhibe a LET-23 [106], pero no se sabe exactamente cuales son los blancos de lst-1, lst-2, lst-3, lst-4 y dpy-23 [91]. ! Fig. 9. La determinación de los destinos de las VPCs Las flechas con punta representan interacciones activadoras y las flechas sin punta representan interacciones inhibidoras, las flechas anchas representan interacciones activas y las flechas delgadas interacciones inactivas. Los componentes de la vía de RTK/Ras/ERK se muestran en azul, mientrasmás obscuro el azul, más activo el componente. Los componentes de la vía de Notch se muestran en anaranjado si están activos, si están inactivos se muestran en amarillo. 25 horas después del nacimiento del gusano la VPC P6.p (azul pastel) responde a la señal inductiva y comienza a expresar a los marcadores del destino primario y a los ligandos de tipo DSL, la vía de Notch es inhibida y el destino primario es estabilizado por medio de la autoactivación de LIN-39. Tres horas más tarde P5.p (anaranjado pastel) y P7.p (no se muestra) responden a la concentración moderada de la señal inductiva y a la señal lateral de P6.p, adquieren el destino secundario, expresan a los genes blanco de la señal lateral e inhiben a la vía de señalización RTK/Ras/ERK. El destino secundario es estabilizado por la autoactivación de LIN-12. 2.4.3 La polarización de las VPC y las dos divisiones longitudinales La red de moléculas involucradas en el control del ciclo celular y la red de moléculas involucradas en el control de la determinación de los destinos de las VPCs están interconectadas y la diferenciación de las VPCs está sincronizada con el ciclo celular [44, 170]. Durante la fase larvaria L3, la inhibición de LIN-14 por lin-4 tiene un efecto adicional, LIN-14 activa la transcripción de cki-1 y la inhibición de LIN-14 debilita a la inactividad del ciclo celular [171], adicionalmente, las proteínas LIN-1 y LIN-31 cuando no están fosforiladas, regulan positivamente a cki-1, tanto LIN-1 como LIN-31 son fosforiladas por la vía de RTK/Ras/ERK socavando aún más a la estabilidad de la inactividad del ciclo celular [100]. Como resultado de la acción de RTK/Ras/ERK y lin-4, poco tiempo después de la determinación de sus destinos, las VPCs, se dividen longitudinalmente y producen una hija anterior y una hija posterior. Las VPCs están expuestas a gradientes de cuatro ligandos de tipo Wnt; específicamente, EGL-20 es secretado por células cercanas a la cola, lo cual causa que la parte posterior de la VPCs esté expuesta a una concentración mayor de EGL-20 que su parte posterior, estableciendo la polaridad inicial de las VPCs por medio del receptor CAM-1 y la proteína Van Gogh/VANG-1 [71]. Adicionalmente, la AC secreta LIN-44 y MOM-2 [71] y los mioblastos sexuales (SM) que son inducidos (por EGL-17/FGF, que es secretado por P6.p) a migrar hacia la región que se encuentra dorsal a la AC secretando CWN-1 [61]. LIN-44, MOM-2 y CWN-1 se unen a los receptores LIN-17 y LIN-18, a la variación de la vía de Wnt “Wnt/β-catenin asymmetry pathway” y revierten la polaridad de P7.p que ahora tiene una polaridad anterior a la cual se le conoce como polaridad refinada, adicionalmente los ligandos LIN-44, MOM-2 y CWN-1 secretados desde la región de la célula ancla fortalecen a la polaridad posterior de P5.p. Después de que las VPC son polarizadas y después de la transición entre la fase larvaria L2 y la L3, las VPCs se dividen longitudinalmente, las dos hijas de P6.p expresan egl-17 [158] y ligandos de tipo DSL. Posteriormente, los ligandos de tipoWnt secretados por la AC y los ligandos de tipo DSL expresados por las hijas de P6.p, activan la transcripción de lin-11 [159] y lip-1 [160], por lo cual, P5.pp y P7.pa que son las hijas proximales de P5.p y P7.p, expresan lin- 11 y lip-1 más que sus hijas distales P5.pa y P7.pp. Posteriormente, las hijas de las VPCs que adquieren el destino terciario (P3.pa, P3.pp, P4.pa, P4.pp, P8.pa y P8.pp) se fusionan con hyp7. P6.pa y P6.pp no se fusionan con hyp7 por que las vías de señalización RTK/Ras/ERK y Wnt activan a ELT-6, EGL-18 y LIN-39 que inhiben la transcripción del fusógeno EFF-1 [47], adicionalmente, LIN-39 activa la transcripción de egl-18 and elt-6, y ELT-6 activa la transcripción de lin-39 formando un circuito de retroalimentación positiva [172]. El mecanismo que evita que las hijas de las VPCs que adquieren el segundo destino se fusionen con hyp7 no se conoce con certeza pero es probable que los dos siguientes mecanismos estén involucrados; primero, una actividad moderada de las vías de señalización RTK/Ras/ERK y Wnt en las células del destino secundario puede que sea suficiente para inhibir la actividad de EFF-1, pero en algunos mutantes de ganancia de función de lin-12, la célula ancla no se forma y todas las VPCs adquieren al destino secundario y no se fusionan con hyp7, el mecanismo molecular que inhibe a la transcripción de eff-1 en dichas células probablemente involucra a la vía de Notch, por que algunas de las regiones que regulan la transcripción de eff-1 contienen regiones con sitios de unión probables de LAG-1/CSL y la vía de Notch inhibe la función de eff-1 durante la formación del tracto digestivo de C. elegans [78]. Las hijas de las VPCs que no se fusionan con hyp7 se dividen longitudinalmente [8]. Los tres complejos de CDK/Cyclina que son los principales reguladores de la progresión del ciclo celular, regulan también a la vía de Notch. Específicamente, el complejo CDK-4/CYD-1 que es necesario para la progresión del ciclo celular durante la fase G1 inhibe la endocitosis de LIN-12, estabilizando su localización en la membrana celular; el complejo CDK-2/CYE-1 que es necesario para permitir la transición de G1 a S inhibe también la degradación de LIN-12-intra, que es el fragmento de LIN-12 que funciona como factor de transcripción en el núcleo y el complejo CDK-1/CYB-3 que es necesario para permitir la transición de la fase G2 a la fase M activa también a la degradación de LIN-12-intra en el núcleo [44]. En resumen, el gen heterocrónico lin-14 y los factores transcripcionales LIN-1 y LIN-31 mantienen al ciclo celular inactivo durante L2. Durante L3 lin-4 inhibe la transcripción de lin-14 y la vía de señalización RTK/Ras/ERK fosforila a LIN-1y LIN-31, permitiendo que las VPCs se dividan longitudinalmente. Las vías de señalización RTK/Ras/ERK y Notch inhiben la fusión de las hijas de las VPCs que adquieren el destino primario y secundario respectivamente con hyp7, las hijas de las VPCs que adquieren el destino terciario se fusionan con hyp7. La vía de Wnt “Wnt/β-catenin asymmetry pathway” polariza a P5.p y P7.p. y las hijas de las las VPCs P5.p, P6.p y P7.p se dividen longitudinalmente. 2.4.4 La tercera división de las VPCs y la diferenciación de las células vulvares adultas. Después de la segunda división longitudinal, los patrones de activación de genes de las nietas de las VPCs son casi iguales a las de sus padres y son muy diferentes de los patrones de expresión reportados para las células adultas de la vulva (Tabla 1), sin embargo, a las nietas de las VPCs ya se les asignan los siguientes destinos vulvares; de proximal a distal a partir del centro de la vulva en proceso de desarrollo, a P6.pap y P6.ppa se les asigna el destino vulF, a P6.paa y P6.ppp se les asigna el destino vulE, a P5.ppp y P7.paa se les asigna el destino vulD, a P5.ppa y P7.pap se les asigna el destino vulC, a P5.pap y P7.ppa se les asigna el destino vulB y a P5.paa y P7.ppp se les asigna el destino vulA (Figura 11), [7, 48, 161]. Tabla 1. Los patrones de expresión de lin-39 [24], nhr-67 [23] , cog-1 [173], zmp-1 [59, 174], egl-38 [175], lin-11 [159], lip-1 [160] y egl-17 [158] en las células de la vulva durante L3, L4 y la adultez:. vulA vulB1 vulB2 vulC vulD vulE vulF LIN-39 L4 L3 tardía L3 tardía NHR-67 L4 tardía, Adulto L4 tardía, Adulto Adulto Adulto Adulto COG-1 L4 temprana L4 temprana L4 temprana L4 temprana y media L4 temprana y media L3 tardía a L4 media temprana L3 tardía, L4 temprana ZMP-1 Adulto L4 tardía, Adulto L4 tardía, Adulto EGL-38 L4 media y tardía LIN-11 L3 tardía a L4 media L3 tardía a L4 media L3 tardía a L4 media L3 tardía a L4 media L3 tardía a L4 media LIP-1 L3 tardía L3 tardía L3 tardía L3 tardía L3 tardía EGL-17 L4 tardía, Adulto L4 tardía, Adulto L3 tardía L3 tardía Algunas de las nietas de las VPCs se dividen durante la transición entre la fase larvaria L3 y L4; primero las células progenitoras de las células vulE se dividen transversalmente, después, las células progenitoras anteriores de vulA y vulB se dividen longitudinalmente, más tarde, las células progenitoras posteriores de vulA y vulB se dividen longitudinalmente y finalmente, las progenitoras de las células vulC y vulF se dividen transversalmente, formando al patrón característico de división celular ”LLTN TTTT NTLL” en el cual T representa una división transversal, N quiere decir que la célula no se divide y L representa una división longitudinal [7]. La división de las nietas de las VPCs P5.p y P7.p requiere la actividad de cog-1 y bed-3 [176] y bed-3 activa la transcripción de lin-39 [172]. Se conoce poco acerca del mecanismo molecular que controla la dirección de la tercera división de las células vulvares; específicamente, la pérdida de la función de las dos GTPasas parecidas a Rac ced-10 y mig-2 o del factor de intercambio de guaninas (GEF) unc-73/Trio ó de lin-40/MTA que es un componente del complejo NuRD, causa que las células de tipo vulC y vulE se dividan longitudinalmente u oblicuamente en lugar de dividirse transversalmente. Adicionalmente, algunas mutaciones de lin-11 causan que las células de tipo vulC y vulD se dividan longitudinalmente [177] y la vía de señalización Wnt regula la expresión de lin-11 [92] y la rotación del huso mitótico de los blastómeros EMS y ABar [62], esto junto con el hecho de que varios ligandos de tipo Wnt son secretados por la AC y algunas células de la vulva en desarrollo sugiere que la vía de Wnt podría estar involucrada en la determinación de el plano de división de las nietas de las VPCs, pero esto aún no ha sido comprobado experimentalmente. ! Fig. 10 Tercera división de las células vulvares Después de que las células que adquieren al destino primario o secundario se dividen longitudinalmente dos veces, durante la fase larvaria L3 y después de que la AC (verde claro) invade entre las nietas de P6.p, (parte superior de la figura). Algunas de las nietas de P5.p, P6.p and P7.p se dividen una tercera vez (parte inferior de la figura); específicamente, las nietas de P6.p se dividen transversalmente, las biznietas proximales de P6.p se convierten en células vulF (azul) y las biznietas distales de P6 se convierten en células vulE (verde menta). Las nietas más proximales de P5.p y P7.p se convierten en células vulD (verde olivo), las siguientes nietas más proximales de P5.p y P7.p se dividen transversalmente y sus hijas se diferencian en células vulC (amarillo), el resto de las nietas de P5.p y P7.p se dividen longitudinalmente. Las cuatro biznietas más distales de P5.p y P7.p se diferencian en células vulA (rojo), las siguientes más distales se convierten en células vulB1 (anaranjado obscuro) y el resto de las biznietas de P5.p y P7.p se convierten en células vulB2 (anaranjado claro). Los factores transcripcionales cog-1,
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