Desmetilacion-del-satelite-2-en-cancer-de-ovario-y-su-relacion-con-inestabilidad-cromosomica

Vista previa del material en texto

UNIVERSIDAD NACIONAL 
AUTÓNOMA DE MÉXICO 
fACULTAD DE MEDICINA 
HOSPITAL GENERAL DE MEXICO 
GINECOLOGIA y OBSTETRICIA 
"Desmetilación del satélite 2 en cáncer de ovario y su 
relación con inestabilidad cromosómica" 
T E s I S 
QUE PARA OBTENER El TíTULO DE: 
ESPECIALISTA EN GINECOLOGíA Y OBSTETRICIA 
P R E S E N T A 
DR CARLOS MAURICIO ARBELAEZ MORALES 
ASESOR: DR. DIDDIER GIOVANNI PRADA ORTEGA 
DR. MANUEL BORGES 
MÉXICO D.F. Julio, 2013 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
La tesis se realizó en la Unidad de Investigación Biomédica en Cáncer del Instituto 
Nacional de Cancerología, Unidad Periférica del Departamento de Medicina Genómica y 
Toxicología Ambiental del Instituto de Investigaciones Biomédicas de la Universidad 
Nacional Autónoma de México, bajo la dirección del Dr. Diddier Giovanni Prada Ortega y 
en el Laboratorio de carcinogénesis, a cargo del Dr. Luis A. Herrera. 
2 
OR. ANTON IO GUERRERO HERNANOEZ 
Jefe de Servicio Unidad de Ginecología y Obstetricia 
Profesor Titular del Curso Universitario de Postgrado 
De Ginecología y Obstetricia UNAM 
OR. MANUE L BORGES 
Profesor Adjunto Curso Universitario de Postgrado 
De Ginecología y Obstetricia UNAM 
Asesor de tesis 
OR. DlOIER GIOVANNI PRAOA ORTEGA 
Doctor en Investigación 
Intituto Nacional de Cancerologia 
Agradecimientos 
A Dios, por darme la fartaleza, la sabiduría y el amor que necesitaba para iniciar, 
mantenerme y superar los obstáculos, 
Al Or Oidier Giovanni Prada Ortega, por su guia consejos y amistad a prueba de todo. 
Al Or Manuel Borges por sus enseñanzas diarias durante 4 añas y por su apoyo 
incondicional. 
A mi esposa Luisa Fernanda par su amar, dedicación y lealtad absoluta. 
Finalmente a tadas las persanas que han cruzado mi camino y que me han hecho más 
agradable esta etapa tan importante de mi vida, MUCHAS GRACIAS! 
4 
f-
íNDICE PAG 
RESUMEN .. ... ...... ... ........... ..... .............................................. ......................... .......................... 6 
INTRODUCCIÓN ... ............. .......•.... ....................................... .......... ............ ..• ... ..... ..... ... .......... 8 
JUSTIFICACiÓN ....... ......... .•.... ... .•....... .. .... ... .•.......... .... ... ............................ ...•..........•............. 17 
RELEVANCIA E IMPACTO .................................................................................................. ..... 17 
HIPÓTESIS ............................................................................................................. .... ..... .... ... 18 
DISEÑO DEL ESTUDIO ................................................................................................................................ 18 
OBJETIVO GENERAL ........................... ...•.........•.• ........ •..... ......... ........ ...•......... •..........•.. .......... 19 
Objetivos Especificas ...................................... ............. ........... ............. ................................... 19 
MATERIALES Y MÉTODOS ............................. ................ ...... .. .... .................... .......................... 20 
RESULTADOS ............. ............................... ....................................................... ..... ...... ... ........ 23 
DISCUSiÓN ...... ........................................................................................ .............................. 28 
CONCLUSiONES .. ....... .. ......................... .. ... ..... ............... ....... ........ .......................................... 34 
Glosario .....................•........ .•....... ..... ... ..•... ...... ... •.... ....... .... .................... ... .......• ..... ....•... ...... 3S 
Abreviaturas ....... ......... ......... ............................... ............................................. .................... 39 
REFERENCIAS BIBLlOGRAFICAS .............................. ............. ................... ............................... 41 
5 
l. RESUMEN 
Titulo: Desmetilación del satélite 2 en cáncer de ovario y su relación con inestabilidad 
cromosómica. 
Antecedentes: La metilación del DNA es una modificación epigenética en la que se 
adiciona un grupo metilo a las citosinas, la cual se asocia con la compactación de la 
cromatina a largo plazo. La metilación del DNA es llevada a cabo por las DNA-
metiltransferasas, entre las que se encuentran la DNMT1, llamada hemimetilasa y las 
DNMT3A, DNMT3B Y DNMT3L, llamadas metiladoras de novo. Son múltiples las evidencias 
que señalan que la metilación del DNA contribuye de manera importante a la adecuada 
segregación y estabilidad cromosómica. En cáncer de ovario se considera urgente la 
búsqueda de nuevos biomarcadores, asi como de herramientas moleculares que permitan 
su detección temprana y predigan su recurrencia . La inestabilidad cromosómica hace 
referencia a la formación continua de cambios cromosómicos a tasas superiores que los 
observados en células normales, e involucra tanto alteraciones numéricas (aneuploidías) 
como estructurales. A pesar de que la inestabilidad cromosómica es muy importante en 
cáncer de ovario, tanto desde el punto de vista biológico como del punto de vista clínico, 
las causas de este proceso son en su mayoría desconocidas. 
Hipótesis: La inestabilidad crómosómica es un fenómeno presente en las muestras de 
cáncer de ovario y se asocia con una intensa desmetilación pericentromérica (satélite 2). 
Materiales y Métodos: Se trata de un estudio descriptivo, de asociación . Se llevó a cabo el 
análisis de inestabilidad cromosómica en cáncer de ovario usando FISH sobre 15 muestras 
fijadas en parafina. Para analizar la metilación de las regiones pericentroméricas (satélite 
2) se llevó a cabo la técnica de bisulfito de sodio y secuenciación con urea en 2 muestras 
con elevada inestabilidad cromosómica y 2 con baja inestabilidad cromosómica . El análisis 
estadístico fue llevado a cabo usando una prueba no paramétrica (U de Mann Whitney) 
comparando la mediana de citosinas metiladas de grupos con elevada estabilidad 
cromosómica contra las muestras con baja inestabilidad cromosómica. 
6 
Resultados: Encontramos que las muestras con cáncer de ovario presentan una elevada 
variabilidad en el número modal para los cromosomas 1 y 9, con porcentajes que oscilan 
entre 20 y 68% para el cromosoma 1 y 30, 64% para el cromosoma 9. El análisis de la 
metilación del satélite 2 mostró una mediana de 15 citosinas en cada una de las muestras, 
sin obtener diferencias significativas entre las muestras. 
Conclusión: La inestabilidad cromosómica está presente en prácticamente todas las 
muestras de cáncer de ovario, sin embargo, no encontramos diferencias con respecto a la 
metilación de las regiones pericentroméricas (satélite 2) entre las muestras con una 
elevada inestabilidad cromosómica, comparado con muestras con baja inestabilidad 
cromosómica, lo que sugiere que la metilación de estas regiones no se asocia de forma 
directa con el grado de inestabilidad cromosómica en cáncer de ovario . 
7 
2. INTRODUCCiÓN 
Antecedentes e importancia del cáncer de ovario 
En el mundo, el cáncer de ovario se considera la enfermedad neoplásica 
ginecológica más letal y la quinta causade muerte por cáncer en mujeresl En 
nuestro país, el cáncer de ovario es la quinta causa de muerte por cáncer en mujeres 
y la segunda causa de muerte por cáncer de origen ginecológico.2 El riesgo vitalicio 
que tiene una mujer por cáncer de ovario es de 1.4% siendo su pico de incidencia en 
. la sexta y séptima décadas de la vida. La existencia de una historia familiar de cáncer 
mamario u ovárico, puede aumentar el riesgo vitalicio hasta llegar entre 15% y 60%. 
Una fuerte historia familiar se define en las mujeres que tengan dos o más familiares 
de primer grado, que hayan sido diagnosticadas con cáncer ovárico y/o mamario. La 
herencia autosómica dominante se observa en caso de cáncer ovárico hereditario 
específico según la localización, en el síndrome de Lynch, y en el cáncer mamario / 
ovárico hereditario. Los genes de reparación del ADN MSH2 y MLH1 se encuentran 
en el síndrome de Lynch 11, cuando estén mutados. Frecuentemente se evidencian 
mutaciones en el BCRA1 y BRCA2, los que pueden representar, tanto como el 90% 
de todos los canceres en las mujeres con historias familiares de cáncer ovárico. El 
cáncer de ovario presenta una elevada mortalidad, dado que no presenta síntomas 
específicos o pruebas de tamizaje efectivas, así como estrategias de detección 
temprana. Así mismo, la recurrencia se encuentra presente hasta en el 85% de los 
casos y la supervivencia general es de aproximadamente 30% de todos los casos.' Se 
ha reportado que sólo el 35% de las pacientes muestras síntomas tempranos' y se 
sabe también que sólo el 61% de ellas se presenta con una elevación en el CA-125 
en caso de recaídas. ' 
El CA-125 es una glicoproteína con un elevado peso molecular que se encuentra en 
el epitelio del colon embrionario. Constituye el biomarcador más comúnmente 
utilizado en el cáncer ovárico. El CA-125 esta elevado en más del 80% de todos los 
casos de cáncer de ovario, conlleva una sensibili dad del 50% para el estadio I y del 
8 
80% para el estadio 11, con un va lor predictivo positivo del 10%. El CA-125 
combinado con la ultrasonografía dirigida, aumenta el va lor predictivo positivo hasta 
el 20%. Sin embargo Históricamente el CA-125, no ha sido bueno como prueba 
pesquisa para el cáncer ovárico. La data con respecto a su sensibilidad se basa en 
estudios realizados en la década de los 80 y 90. La sensibilidad de la prueba es del 
67% al 80%, la especificidad varía del 98% al 99%, sin embargo debido a la baja 
prevalencia de la enfermedad en la población y otras condiciones médicas que 
pueden elevar el CA-125, el valo r predictivo posi tivo es de solo 26%. 
Por lo tanto, en esta enfermedad se considera urgente la búsqueda de nuevos 
biomarcadores, así como de herramientas moleculares que permitan su detección 
temprana y predigan su recurrencia ,5 
Observaciones histopatológicas 
L05 cánceres ováricos en estadio precoz están muy relacionados con el tipo epitelial 
del carcinoma. La prevalencia de cáncer ovárico en estadio 1, según su tipo 
histológicos es el siguiente: serosos (4%), células claras (36%), endometroide (53%), 
mucinoso (83%) y Brenner (100%). Aunque la vasta mayoría de los carcinomas 
ováricos son carcinomas serosos, la mayoría de los canceres ováricos en estadio I 
muestran histológica endometroide o de células claras y mucinosas. Los carcinomas 
serosos tienden a se r relativamente más pequeños y bilaterales, con rápida 
diseminación hacia las cavidades pélvica y abdominal. El tiempo que trascurre desde 
la detección de una enfermedad macroscópica hasta liegar a la diseminación extra 
ovárica es breve para los carcinomas serosos, de ahí la importancia de nuevos 
biomarcadores. La clasificación de los carcinomas serosos es particularmente 
relevante para los casos de estadios inferiores. Con base a los resultados clínicos y a 
las alteraciones genéticas moleculares observadas en el carcinoma ovárico se roso, 
este puede dividirse en el carcinoma seroso de al to grado (mutaciones en el p53) y 
el carcinoma seroso de bajo grado, (mutaciones KRAS, BRAF), es decir, emergen de 
vías genéticas diferentes. 
9 
Las teorías que explican la aparición del cáncer de ovario incluyen la ovulación 
incesante, la estimulación por gonadotrofinas, estimulación hormonal e inflamación. 
Cualquier parte del ovario puede sufrir proliferación rápida e incontrolada, y puede 
subsecuentemente sufrir transformación maligna . 
Benigno 
Borderline 
l' Maligno 
Mucinoso / endoce;vical 
Benigno 
Borderline 
Maligno 
Endometriode/ endometrial 
Benigno 
Bord.erline 
Maligno 
I Células claras/ Mülleriano 
I Benigno 
Borderline 
Maligno 
Célula transicionalf transicional 
. Benigno 
Cistadenoma 
Tumor papilar superficial 
Cistoadenocarcinoma 
Cistoadenoma 
Tumor quístico 
Cistoadenocarcinoma 
Cistoadenoma /adenofibroma 
Tumor quístico 
Cistoadenocarcinoma 
-- ......... -
Cistoadenoma / adenofibroma 
Tumor quístico 
adenocarcinoma 
Brenner 
10 
rl~B~o~r~d~e~rl~in~e~·--~------~---------------T~í'p-o~B-r~e~n~n~e'r ~p-ro-I-rr'e-ra-t-iv-o-----~----~l 
I Maligno Brenner maligno/ célula transicional 
I Célula esca~os~/escal1loso 
I 
f Epitelial miXto / ,n¡;;tt, 
¡ Indiferenciado / anaplá-s-iC-O-~~~~~-~~~~~---~----~ 
Kaku T, Ogawa S, Kawano Y, et al, Histological classification of ovarian cancer. Med 
Electron Microsc. 2003; 36: 9-17 
Alteraciones en la metilación del DNA en cáncer de ovario 
La metilación del DNA es una modificación epigenética en la que se adiciona un 
grupo metilo a las citosinas, la cual se asocia con la compactación de la cromatina a 
largo plazo· En eucariontes, la metilación del DNA está implicada en la regulación 
de la expresión génica, en la diferenciación de tejidos, la regulación de la impronta 
génica, el silencia miento del cromosoma X, entre muchos otros procesos, así como 
con la estabilidad cromosómica,7 
La metilación del DNA es llevada a cabo por las DNA-metiltransferasas, entre las que 
se encuentran la DNMT1, llamada hemimetilasa y las DNMT3A, DNMT3B Y DNMT3L, 
llamadas metiladoras de novo· Se ha reportado que la metilación de novo presenta 
una elevada actividad en etapas tempranas y es necesaria para el desarrollo de los 
mamíferos, así como para la metilación de secuencias satélites pericentroméricas· 
La s DNMTs de novo contienen dominios altamente conservados como los dominios 
PWWP y el dominio ( -terminal, y en mamíferos presentan estructuras y funciones 
similares, 6 
En las enfermedades neoplásicas existen múltiples alteraciones en la metilación del 
DNA, las cuales se dividen de manera general, en hipometilación global y metilación 
aberrante 8 La primera contribuye a la pérdida de la impronta génica, a la 
II 
1 
reactivación de retrotransposones y a la inestabilidad cromosómica, entre otros 
procesos." La metilación aberrante contribuye principalmente al si lenciamiento de 
genes supresores de tumores e incluso de microRNAs. En cáncer de ovario, se ha 
reportado hipometilación que afecta a secuencias repetidas, como el satélite 2 y las 
secuencias lINE_l : ·1o así como a ciertos genes, como MeJ (methylation-contro/led 
ONAJ gene) e IGF2, un gen improntado implicado en varios tipos de neoplasias. 
Igualmente en cáncer de ovario se ha reportado hipermetilación en genes 
supresores de tumores como como BRCAl, p16, MLHl, genes improntados como 
ARHl y PEG3, preapoptóticos como LOn, DAPK y PAR-4, así como de adhesión 
celular como ICAM-1." Nuestro grupo ha reportado el silencia miento aberrante del 
microRNA mir125bl en muestras de cáncer de ovario, así como en otros tipos de 
neoplasiasl ' Las causas de dichos cambios en los patrones de metilación en cáncer 
de ovario, así como en otros tipos de cáncer son en su mayoría desconocidas. 13 
Inestabilidad cromosómica en cáncer de ovario 
La inestabilidad cromosómica hace referencia a la formación continua de cambios 
cromosómicos a tasas superiores que los observados en célulasnormales, e 
involucra tanto alteraciones numéricas (aneuploidías) como estructurales. 14 Se 
considera que la inestabilidad cromosómica es un fenómeno que puede ocurrir de 
forma temprana dentro del proceso de carcinogénesis, dado que puede ser 
encontrada en lesiones premalignas como los adenomas colorrectales 15 y en 
esófago de Barret l • La inestabilidad cromosómica está asociada con la generación 
de cambios en la expresión génica en las células afectadas, permitiendo la selección 
de las células con mayor capacidad proliferativa,17.18 e incluso contribuyendo a 
fenómenos como la resistencia a agentes quimioterapéuticos.'9 
El cáncer de ovario epitelial, desde el punto de vista histológico se divide en papilar-
seroso, mucinoso, endometroide y de células claras. El cáncer seroso de alto grado 
es el subtipo más común y se distingue de otros subtipos por presentar altos niveles 
de aneuploidía, así como gran cantidad de otras alteraciones cromosómicas.'o 
12 
Pothuri y colaboradores, al analizar muestras provenientes de pacientes con 
mutaciones en BReA y comparándolas con muestras provenientes de población 
general y usando un análisis combinado (genético -molecular y morfológico) 
reportaron la presencia frecuente de aneuploidías en lesiones precursoras 
displásicas en ovario, así como de un aumento en la proliferación celular y una 
apoptosis disminuida, sugiriendo que las alteraciones cromosómicas pudieran ser un 
evento temprano en el desarrollo de cáncer de ovario. 21 
Así mismo, varios autores han reportado una asociación entre la presencia de 
aneuploidía y un peor pronóstico en cáncer de ovario. Kim y colaboradores 
evaluaron 56 muestras de esta neoplasia y encontraron que la supervivencia global 
fue menor en presencia de tumores aneuploides." De la misma manera, Ozalp y 
colaboradores analizaron 26 muestras de cáncer de ovario epitelial, los cuales 
fueron aneuploides en un 61.5% de los casos. La incidencia de aneuploidía fue 
elevada en tumores pobremente diferenciados y en enfermedad avanzada . Incluso 
este grupo reportó una menor citoreducción quirúrgica en tumores aneuploides y 
mayores tasas de recurrencia comparado con tumores diploides (p<O.05) 23 Estos 
hallazgos, así como los reportados recientemente por Lassus y colaboradores,24 
sugieren que la presencia de inestabilidad cromosómica se correlaciona con la 
agresividad del tumor, con el riesgo de metástasis y con el pronóstico clínico. A 
pesar de que la inestabilidad cromosómica es muy importante en cáncer de ovario, 
tanto desde el punto de vista biológico como del punto de vista clínico, las causas de 
este proceso son en su mayoría desconocidas. 
Desmetilación del DNA e inestabilidad cromosómica 
Son múltiples las evidencias que señalan que la metilación del DNA contribuye de 
manera importante a la adecuada segregación y estabilidad cromosómica. Dodge y 
colaboradores encontraron que al inactivar una de las DNA-metiltransferasas 
(DNMT3B) se generaron cambios importantes en el contenido cromosómico, así 
como frecuentes rezagos cromosómicos en mitosis. Adicionalmente, estas células 
13 
mostraron inmortalización espontánea. zs Igualmente en el síndrome ICF 
(inmunosupresión, inestabilidad centromérica y anormalidades faciales), el cual es 
producto la mayoría de las veces por mutaciones en la DNMT3B, coexiste la 
desmetilación en diversas regiones del genoma con inestabilidad cromosómica. 16 
Estos pacientes fallecen principalmente por infecciones, pero también se han 
reportado muertes por enfermedades neoplásicas como angiosarcomas y 
linfomas.'7-3o Estos datos sugieren que las alteraciones que involucran a la DNMT3B 
pudieran estar relacionadas con la generación de inestabilidad cromosómica. 
las secuencias satélites forman parte de regiones claves para la estabilidad y la 
adecuada segregación de los cromosomas, como el centró mero y las regiones 
pericentroméricas. Uno de los primeros trabajos donde proponen que en cáncer de 
ovario existían alteraciones en la metilación de secuencias satélites y que estas 
pudieran tener repercusiones sobre la estabilidad cromosómica fue llevado a cabo 
por Qu y colaboradores. Este grupo analizó 17 muestras de varios tipos de cáncer de 
ovario (cistoadenomas, tumores de bajo potencial maligno (lMPs), y epiteliales) y 
evaluó la metilación en las secuencias satélite 2 del cromosoma 1 y la metilación del 
satélite alfa . Se encontró una correlación entre la extensión de la hipometilación del 
satélite 2 con el grado de malignidad del tumor (p<O.Ol). la mayoría de estos 
tumores mostró también desmetilación del satéli te alfa .31 Por otra parte, Zeimet y 
colaboradores evaluaron recientemente el impacto de la desmetilación en 
secuencias UNE-1, satélite 2 y satélite alfa sobre el área nuclear, la proliferación y la 
presencia de alteraciones cromosómicas como la aneuploidía y la hiperploidía en 70 
muestras de cáncer de ovario. Se encontró que las etapas clínicas III/IV de FIGO 
presentaron mayor frecuencia de hipometilación centromérica (p=0.020) . También 
se encontró que existieron diferencias en cuanto a sobrevida libre de progresión 
(p=0.02), así como a sobrevida global (p=0.017) a partir del grado de hipometilación 
del satél ite 2 del cromosoma 1. Para la presencia de aneuploidía hubo diferencias 
estadísticas en relación a sobrevida global (p=O.031), con una tendencia hacia las 
diferencias estadísticas en supervivencia libre de progresión (p=O.07). 32 Estos datos 
14 
sugieren que tanto la aneuploidía como la metilación de satélites juegan un papel 
importante en el comportamiento clínico de la enfermedad, sin embargo, las causas 
de dichas alteraciones, así como su posible asociación son desconocidas. 
Metilación centromérica, pericentromérica y segregación cromosómica 
Hasta hace algunos años se asumía que las regiones centroméricas, compuestas 
principalmente por secuencias ricas en adeninas y tiaminas (AT), no contenían 
metilación en su DNA. Sin embargo, estudios recientes han demost rado que la 
metilación centromérica es esencial para la estabilidad de estas regiones, así como 
para localización de CENP-A, un componente clave en la organización del cinetocoro. 
Kim y colaboradores reportaron en un modelo de ratón la generación de errores en 
la segregación cromosómica y en la condensación centromérica dependientes de 
modificaciones epigenéticas en la cromatina, al alterar la presencia de Mis18a. Esto 
derivó no sólo en inestabilidad cromosómica y activación de transcritos 
centroméricos, sino también en un desarrollo anormal de los embriones de ratón ." 
De manera muy interesante, este grupo reportó que la interacción entre Mis18a y la 
cromatina centromérica fue dependiente de la DNMT3B y la DNMT3A, más no de 
otras proteínas modificadoras de histonas, como G9a, SUV39Hl y EXH2." Por lo 
tanto, este estudio sugiere que la metilación centromérica establecida por las 
DNMTs de novo es importante para la regulación de la expresión de transcritos 
centroméricos, así como en el establecimiento de otras marcas epigenéticas y para 
el adecuado funcionamiento centromérico dependiente de CENP -A. 
Las regiones pericentroméricas son dominios de cromatina que rodean a los 
centrómeros. Estas regiones son importantes para la cohesión de las cromátides 
hermanas, así como para lograr un alineamiento adecuado de los cromosomas 
durante la mitosis." Las regiones pericentroméricas se han reportado como 
desmetiladas en varios tipos de cáncer, 31.3S.37 así como en pacientes con síndrome 
ICF.'· Nuestro grupo ha reportado recientemente que la desmetilación 
pericentromérica en células somáticas adultas, específicamente de los cromosomas 
15 
1 Y 16, se asocia con la presencia de errores en la segregación de estos mismos 
cromosomas38 
Widschwendter y colaboradores analizaron la metilación de las regiones 
centroméricas y pericentroméricas (satélite 2) en 115 muestrasde cáncer de ovario 
y lo compararon contra 26 muestras de tejido no neoplásico. Ellos encontraron 
hipometilación en ambos tipos de satélites, con una relación directa con estadios 
avanzados o grados elevados de malignidad. Se encontró que las muestras con 
mayor desmetilación pericentromérica presentaron una menor supervivencia libre 
de progresión (p=O.007), así como una menor supervivencia global (p=O.005). En 
este mismo trabajo se estableció que la hipometilación pericentromérica (Grado >2 
vs. ~2) representaba un riesgo relativo de recaída en la supervivencia libre de 
enfermedad de 4.1 (1(95% 1.2-14.7) y para supervivencia global (>2 vs. ~2), el riesgo 
relativo fue de 9.4 (1(95% 2.1-41.5) (p=O.029 y p=O.003, respectivamente 9 Estos 
datos sugieren que en cáncer de ovario existen alteraciones en la metilación 
centromérica y pericentromérica, que pudiera estar incidiendo directamente sobre 
el pronóstico clínico . 
16 
3. JUSTIFICACiÓN 
La inestabilidad cromosómica es un proceso que se encuentra presente en la 
mayoría de los tumores sólidos, sin embargo, sus causas en cáncer de ovario son 
inmensamente desconocidas. Es importante eva luar si la metilación de las regiones 
pericentroméricas pudiera estar relacionada con la inestabilidad cromosómica en 
cáncer de ovario, dado que estas regiones son claves en la segregación 
cromosómica . 
4. RELEVANCIA E IMPACTO 
Los resultados de este estudio permitirán tener una idea del papel de la 
metilación pericentromérica en cáncer de ovario y si pudieran estar relacionadas 
con el grado de inestabilidad cromosómica, asi como detrminar el empleo de dicho 
análisis como un posible biomarcador para detección temprana y de agresividad en 
cáncer de ovario. 
17 
5. HIPÓTESIS 
La inestabilidad crómosómica es un fenómeno presente en las muestras de cáncer 
de ovario y se asocia con una intensa desmetilación pericentromérica (satélite 2) . 
6. DISEÑO DEL ESTUDIO 
Se trata de un estudio descriptivo, retrospect ivo, de asociación entre la presencia de 
inestabilidad cromosómica y la desmetilación del satélite 2 en muestras de 
pacientes con cáncer de ovario . 
18 
7. OBJETIVO GENERAL 
Determinar la presencia de inestabilidad cromosómica en cáncer de ovario y 
determinar si el grado de inestabilidad está relacionado con la metilación de las 
regiones pericentroméricas (satélite 2) . 
Objetivos Específicos 
1. Determinar el grado de inestabilidad cromosómica en cáncer de ovario, usando 
técnicas validadas previamente. 
2. Determinar la metilación en las regiones pericentroméricas en muestras con 
elevada inestabilidad cromosómica y comparar con muestras con escasa 
inestabilidad cromosómica . 
3. Comparar la metilación observada en muestras de cáncer de ovario con la 
obtenida en líneas celulares con inestabilidad cromosómica (OVCAR3) y sin esta 
(HCT116). 
19 
8. MATERIALES Y MÉTODOS. 
Muestras 
Se obtuvieron 15 muestras de cáncer de ovario embebidas en parafina del archivo 
de histopatología . Dado que fue un estudio piloto, descriptivo, de no-intervención, 
este estudio no fue sometido al comité de ética de la institución. 
Cultivo celular 
Línea celular HCT116: Es una línea celular de cáncer colorrectal con un punto de 
monitoreo de la mitosis funcional. Vogelstein y colaboradores han caracterizado esta 
línea celular y han determinado que no presenta inestabilidad cromosómica. 14 Líneas 
celulares de cáncer de ovario OVCAR3: línea de cáncer de ovario con demostrada 
inestabilidad cromosómica por nuestro grupo. 
Hibridación in situ Fluorescente de los Cromosomas 1,9, 16 Y Y 
la hibridación in situ fluorescente se llevó a cabo sobre laminillas con células 
binucleadas de acuerdo a protocolos establecidos por lemieux y colaboradores.'9 Usamos 
sondas dirigidas contra las regiones pericentroméricas de los cromosomas 1 (Aquarius), 9 
(Aquarius) . la desnaturalización fue llevada a cabo a 75°C y la hibridación a 37°C durante 
toda la noche en una cámara húmeda . Las laminillas se contra-tiñeron con DAPI 
(Vectashield H-1200). las muestras fueron analizadas para evaluar la presencia de errores 
señales para cada uno de los cromosomas evaluados y se determinó el número modal 
20 
contando 50 núcleos de células tumorales de cada una de las muestras, usando un 
microscopio de LUV Axioscop 2 mot plus (Ze iss ). Las fotografías de las laminillas fueron 
procesadas usando el software Adobe Photoshop CS software. 
Análisis de los patrones de metilación específicos en las regiones repetidas 
(satélite 2) de las regiones pericentroméricas 
Se extrajo el DNA de los cultivos de las muestras usando la técnica de 
fenol/cloroformo, posterior al desparafinado. Posteriormente, el DNA extraído se sometió 
a la reacción de bisulfito de sodi0 4o Usamos la la reacción de bisulfito de sodio (2.6M) más 
urea, llevando la reacción química de 9s· C a SS·C durante 20 ciclos. Para la amplificación 
de estos fragmentos se usaron los siguientes primers: Satélite 2: Primers silvestres: sat2 -
384U (s'-ATGGAAATGAAAGGGGTCATCATCT-3') y sat2-781L (5'-
ATICGAGTCCATICGATGATICCAT-3'). Primers modificados (Primera ronda): sat2biup-lf 
(5'- TIGAATGGAAATGAAAGGGGTIATIA-3') Y 
C[G/A]AATCCATIC[G/A]ATAATICCATICC-3'). Segunda 
TGGAAATGAAAGGGGTIATIATTIA-3' ) y 
sat2biup-2r 
ronda : st2biup -3f 
st2biup-4r 
(5'-
(5'-
(5'-
AATICCATICCATICCATICCATIC[G/A)ATA-3'). Aproximadamente 200 ng de DNA 
convertido con bisufi to de sodio se usó en una reacción de 100 ~I con 200~M de MgCI" 
O.5~M de cada primer y 1.2SU de Ta q polimerasa; la reacción de PCR se llevó a cabo 
usando las siguientes condiciones en un termociclador 2729 (Applied Biosystems) : 9S·C 
por 5 min por un ciclo, luego 9S·C por un minuto, 6S·C por un minuto, 72·C por 2 minutos, 
durante 30 ciclos, seguido de 72·C por 7 minutos por un solo ciclo. Los fragmentos fueron 
amplificados, ligados a un vector y clonados, para posteriormente ser llevados a 
21 
secuenciación, obteniendo por lo menos 2 clonas de cada grupo experimental. 
Adiciona lmente, se determinó el patrón de metilación del satélite 2. 
Análisis Estadísticos 
Se determinaron la cantidad de sitios CpG metilados en el fragmento amplificado y 
se determinaron las diferencias estadísticas entre los grupos usando la prueba U de Mann 
Whitney. El análisis estadístico fue llevado a cabo usando el software MiniTab14. Los 
valores críticos se determinaron usando una probabilidad de 0.05 de error tipo 1. 
22 
RESULTADOS. 
Las muestras con cáncer de ovario muestras grados elevados de inestabilidad 
cromosómica 
llevamos a cabo una inmunofluorescia indirecta contra los cromosomas 1 y 9 en 
muestras embebidas en parafina de cáncer de ovario (Figura 1). Se encontró que la gran 
mayoría de las muestras presentaron un número modal de 2 para los cromosomas 1 y 9. 
Únicamente una muestra presentó un número modal de 1 para el cromosoma 1. Sin 
embargo, la variabilidad en dicho número modal varió entre el 30 y el 65%, sugiriendo una 
variabilidad importante en prácticamente todas las muestras (Tabla 1). Únicamente en 
una muestra no fue posible determinar dicho número modal para el cromosoma 9 
(muestra 2) . De este listado, se seleccionaron las muestras con mayor variabilidad en el 
número modal (mayor inestabilidad cromosómica) para el análisis de met ilación de las 
regiones pericentroméricas (satélite 2). 
Figura 1. Las muestras con cáncer de ovario presentaron altos niveles 
de inestabilidad cromosómica. Rojo: cromosoma 1, verde: cromosoma 
9. 
23 
Cromosoma 1 Cromosom.9 
I lvartr.1 Mod. 
, , 
IJ FriICClon '" 36% Muutr.2 Mod. , N/A 
fr.cclon '" N/ A I 1uu!r.3 Mod. 
, , 
I fr.wOn ""' ,,% ulUtra4 Moda , , 
FracGoon ". '" Mu.Slr.S Moda 1 , 
FraccIón "" 56. MuesIT16 Madi , , 
~ra<x,,;n 'O, "'" Muas! .. 1 Mad. , , 
~ruoón '"" "'" 
I 
uutrUI Moca , , 
I FraCCión ,.,. ,,. 
uen ... .,. MOCllll 
S;". S~" ~r.wón I Muntr.l0 Mod. , , I Fratclón ..,. <4, 
uutr.ll Madi ,, 
fr.tc!ón ' 0% ... 
M .... tr.12 Moda , , 
~r.cción 52. ... 
~ueJtfl13 Mod. , , 
Fraooon - , .. ~Ul!stfl14 Moda , , 
Fra tDOn ... ... 
,"ulutn 15 Moda , , 
Flilooón , .. ". 
Tabla 1. Determinación de la ploidía para los cromosomas 1 y 9 en muestras de cáncer de 
ovario. Azul : muestra con baja inestabilidad cromosómica. Rojo: muestra con elevada 
inestabilidad cromosómica. 
La metilación en las muestras de cáncer de ovario con alta y baja inestabilidad 
cromosómica mostraron patrones simi lares de metilación en las regiones 
pericentroméricas (Satélite 2) . 
Dos de las muestras con elevada y baja inestabilidad cromosómica fueron llevadas a 
reacción de bisulfito de sodio y secuenciación. Se secuencia ron por lo menos 6 clonas para 
cada uno de las muestras. Se encontró que no existió un patrón de desmetilación claro en 
las regiones pericentroméricas (satél ite 2) en ambos tipos de muestras (Figura 2). 
24 
•• •• ••• • • ••••• • •• 
r------~ .... L ~ -<.e___-~ ...... e___il.HI.HI.~.H.H ............... >_-~.e___il.o--
- . ------.. ~ . . ... . . ... .. . ~ 
~e___-_e__---__.. ~ • • •• : - , ••••• J}-il.>----;( - l -
r---._---_.' -----{: .... ..----;( • • •• c.. .. . .. .. .. . .... v.... . 
• • • • ••• • • ••• •• ~:>-, ---<l.0-- -~ 
( !un.¡ • •• ~ ..., ,....------..<: • • • ••••• • -.-
n",,. , • ~ . •• ~ • • • • •• . :---*""". • • 
n",,, , • ' . •• - • • • • .. ,)--, - - • • 
(km~ 4 • •• •• • • • • • • •••• • • • 
"""" • • •• •• • • • • • • •••• a • • 
"""" • • •• •• • • • • • • •••• r • -
,) Ol!sml!tllada 
• Ml!tilada 
,/ No Idl!ntificada 
Figura 2. Aná lisis de metilación del satélite 2 en muestras de cáncer de ovario con baja 
inestabilidad cromosómica (arriba) V alta inestabilidad cromosómica (abajo) . 
Las líneas celulares con ausencia de inestabilidad cromómica (HCTl16) y elevada 
inestabilidad cromosómica no mostraron diferencias importantes en cuanto a la 
metilación de las regiones pericentroméricas (satélite 2) 
Evaluamos el mismo fragmento en dos líneas celulares para compararlas con 
muestras de pacientes con cáncer de ovario _ Encont ramos que tanto las líneas con 
adecuada estabilidad cromosómica (HCT116) como las líneas con alta inestabilidad 
cromosómica, no mostraron desmetilación importante de las regiones pericentroméricas 
(satélite 2) (Figura 3) _ 
25 
HCTll6 
"""" • 
n.~, 
Clona j • 
OVCAR3 
t ... , • 
, , • , 
i I 
lr ' • • 
•• • • 
/. . • • 
•• •• 
, , • " " u U 1 ~1 ' In 
I I I I I -I---!+-I 
• • • • - • • .. . 
• • • • • ':-(. • .. e 
• • • • • • V-q • •• 
• •••• •••••• 
(, Desmetllada 
• Metilada 
<l No identificada 
" .. ,. 
I 
• " 
• 
• ' ~ 
• • 
Figura 3. Análisis de metilación del satélite 2 en líneas celulares con 
adecuada estabilidad cromosómica (HCT116) y con una elevada 
inestabi li dad cromosómica (OVCAR3) . 
• 
• 
• 
• 
la metilación de las regiones pericentroméricas (satélite 2) no se relaciona con el grado 
de inestabilidad cromosómica tanto en líneas celulares como en muestras de pacientes 
con cáncer de ovario 
Encontramos que las líneas celulares sin inestabilidad cromosómica (HCTl16) mostraron 
una mediana de CpGs metiladas de 15. la línea celular con elevada inestabilidad 
cromosómica (OVCAR3) mostró una mediana de 15, aunque solo logramos evaluar una 
clona en esta línea celular. Sin embargo, con las muestras de cáncer de ovario con elevada 
inestabilidad cromosómica (muestras 3 y 10) encontramos una mediana de 15 y de 17, 
comparado con las muestras con menor inestabil idad cromosómica (muestras 1 y 3), las 
cuales mostraron medianas de 14 y 16). los análisis estadísticos no mostraron diferencias 
entre los grupos (Figura 4) . 
26 
20 
• 8 e • ~ 16 " B .~ [J E " • e 12 . ~ 
~ 
v 
• ~ 
• 8 e • 'O • :;; 
4 
O 
1-«:T1l6 Muestra MIIE'$tr.l Muestl ;¡ Muc~lf¡¡ OVCAR3 
8 10 3 1 
Figura 4. Mediana de metilación del satélite 2 en líneas celulares con ausencia de 
inestabilidad cromosómica (HCT1 16), muestras de cáncer de ovario con baja 
inestabilidad cromosómica (muestra 1 y 8). muestras con alta inestabilidad cromosómica 
(muestras 3 y 10) Y línea celular con alta inestabilidad cromosómica (OVCAR3). 
27 
9. DISCUSiÓN. 
Hemos encontrado que todas las muestras evaluadas (15 muestras) muestran 
niveles elevados de variabilidad en relación al número modal para los cromosomas 1 y 9, 
sugiriendo la presencia de inestabilidad cromosómica. La inestabilidad cromosómica hace 
referencia a la formación continua de cambios cromosómicos, tanto numéricos ( 
aneuploidías), como estructurales, a tasas superiores que los observados en células 
normales. " Se considera que la inestabilidad cromosómica es un fenómeno que puede 
ocurrir de forma temprana dentro del proceso de carcinogénesis, dado que puede ser 
encontrada en lesiones premalignas como los adenomas colorrectales 'S y en esófago de 
Barret.16 Igualmente, se sabe que la inestabilidad cromosómica está asociada con la 
generación de cambios en la expresión génica en las células hijas, permitiendo la selección 
de las células con mayor capacidad proliferativa, 17.1. e incluso contribuyendo a fenómenos 
como la quimiorresistencia.19 
En cáncer de ovario, Friedlander y colaboradores encontraron que en las etapas 
tempranas de esta neoplasia (FIGO I y 11), únicamente el 40% de los tumores fueron 
aneuploides, mientras que en etapas avanzadas (FIGO 111 y IV), el 100% presentaron 
aneuploidía" Igualmente, pacientes con cáncer de ovario con laparotomías negativas (sin 
hallazgos macroscópicos de evidencia tumoral) mostraron contenidos cromosómicos 
diploides, así como una mayor sobrevida.42 Por lo tanto estod datos nos sugieren que la 
inestabilidad cromosómica está presente en cáncer de ovario y pudiera estar relacionada 
con la agresividad de la enfermedad. 
28 
Adionalmente, evaluamos la metilación de las regiones pericentroméricas (satélite 
2) en muestras con elevada inestabilidad cromosómica y con baja inestabilidad 
cromosómica, provenientes de muestras con cáncer de ovario. Encontramos que no 
existieron diferencias importantes en cuanto a la metilación del estas regiones en ambos 
grupos de muestras evaludas. La metilación del DNA es una marca epigenética asociada 
principalmente al silencia miento a largo plazo, sin embargo se sabe que dicho 
silenciamiento es dependiente de otras marcas epigenéticas en las histonas, incluyendo 
metilaciones y acetilaciones principalmente, cuyas proteínas generadoras de estas 
marcas, como por ejemplo G9a, EZH2 y SUV39Hl, interactúan directa e indirectamente 
con las DNMTs4 3 En las enfermedades cancerosas, se saben que existen múltiples 
alteraciones en la metilación del DNA, las cuales se dividen en hipometilación global y 
metilación aberrante" La primera se sabe que contribuye a la pérdida del silencia miento 
de regiones improntadas, a la inestabilidad cromosómica, a la reactivación de 
retrotransposones, entre otros procesos. La metilación aberrante contribuye 
principalmente, al silencia miento de genes supresores de tumores e incluso de 
microRNAs, como nuestro grupo lo ha reportado recientemente para el mir-125bl'2 Las 
causas de dichos cambios en los patrones de metilación en cáncer son inmensamente 
desconocidas. Previamente se ha reportado que existe desmetilación de las regiones 
pericentroméricas en cáncer de ovario: sin embargo, nosotros mediante este abordaje 
cuantitativo no observamos dicha desmetilación. 
En este trabajo encontramos que tanto las lineas celulares con elevada 
inestabildiad cromosómica como aquellas con baja inestabilidad cromosómica, y 
29 
prácticamente todas las muestras evaluadas provenientes de pacientes con cáncer de 
ovario, mostraron nieveles similares de metilación en las regiones pericentroméricas. La 
metilación del DNA es una modificación química, en la que se adiciona un grupo metilo a 
las citosinas, las cuales están usualmente próximas a una guanina (llamados dinucleótidos 
CpG). En eucariontes, la metilacióndel DNA es una marca epigenética asociada a la 
regulación de la expresión génica, a la diferenciación de tejidos, la regulación de la 
impronta génica, al silencia miento del cromosoma X, entre otros muchos procesos. 7 La 
metilación denominada de novo hace referencia a aquella metilación llevada a cabo por 
las DNA-metiltransferasas (DNMTs) que no muestran preferencia por DNA hemimetilado, 
a diferencia de lo que ocurre con la DNMn (proceso llamado "metilación de 
mantenimiento"). La metilación de novo es llevada a cabo en mamíferos por las DNMT3A, 
DNMT3B Y DNMT3L. Se sabe que la DNMT3B está frecuentemente sobre-expresada en 
varios tipos de tumores· 4.46 Una de las razones por la cual creemos que estos tumores 
pudieran llegar a presentar niveles de metilación pericentromérica prácticamente 
normales pudiera ser explicado por la sobre-expresión de las DN MTs de novo, sin 
embargo, este dato debería confirmarse en otros estudios. 
Son múltiples las evidencias que señalan que la metilación del DNA contribuye de 
manera importante a la adecuada segregación y estabilidad cromosómica. Dodge y 
colaboradores inactivaron la Dnmt3b en fibroblastos embrionarios de ratón y evaluaron el 
efecto de la ausencia de esta DNMT sobre la proliferación celular, así como sobre la 
estabilidad cromosómica. Este grupo encontró que dicha inactivación generó cambios 
importantes en el contenido cromosómico, así como frecuentemente rezagos 
30 
cromosómicos en mitosis. Adicionalmente, estas células mostraron inmortalización 
espontánea." De la misma manera, existe un modelo in vivo en humanos de alteraciones 
en la metilación y la presencia de alteraciones cromosómicas. El síndrome ICF 
(inmunosupresión, inestabilidad centromérica y anormalidades faciales) es producto de 
mutaciones en la DNMT3B, las cuales se asocian con desmetilación en dive rsas regiones 
del genoma, incluyendo secuencias repetidas, así como inestabilidad cromosómica, 
manifestado como múltiples alteraciones numéricas y estructurales que involucran 
principalmente los cromosomas 1, 9 Y 16.26 Estos pacientes fallecen principalmente por 
infecciones, pero también se han reportado muertes por enfermedades neoplásicas como 
angiosarcomas y linfomas.'Bo Estos datos sugieren que las alteraciones que involucran a 
la DNMT3B están relacionadas con la generación de inestabilidad cromosómica y con el 
proceso carcinogénico. 
Las regiones pericentroméricas son dominios de cromatina que rodean a los 
centró meros. Estas regiones son importantes para la cohesión de las cromátides 
hermanas, así como para lograr un alineamiento adecuado de los cromosomas durante la 
mitosis. 34 Estas regiones están compuestas por secuencias repetida s en tandem, como las 
secuencias satélites 2 y 3, Y contienen múltiples modificaciones epigenéticas para 
mantener las características propias de la heterocromatina que contribuyen a la 
estabilidad y adecuada segregación cromosómica." Las secuencias repetidas forman una 
gran parte del genoma de los mamíferos, sin embargo su estudio es complejo y no se 
aborda de manera tradicional en los estudios genómicos. Se estima que las secuencias 
repetidas tipo satélite 2, las cuales se encuentran principalmente en las regiones 
31 
pericentroméricas de los cromosomas 1, 9 Y 16, pueden llegar a corresponder hasta un 2% 
del genoma 47 Esta secuencia pericentromérica se ha reportado como desmetilada en 
varios tipos de cáncer,'us-37 así como en pacientes con síndrome ICF. 26 Widschwendter y 
colaboradores han reportado que la hipometilación del satélite 2 en cáncer de ovario se 
relaciona con estadios clínicos más avanzados, así como con etapas histológicas más 
elevadas.9 Por otra parte, este mismo grupo llevó a cabo un análisis más completo y 
encontró que dicha hipometilación se asoció con una menor supervivencia libre de 
enfermedad, así como una menor sobrevida global. 48 Recientemente, Zimet y 
colaboradores han relacionado la presencia tanto de aneuploidía como de hipometilación 
en el satélite 2 con una menor supervivencia libre de progresión y una menor 
supervivencia global en esta misma patología. " Por otra parte, nuestro grupo ha 
reportado recientemente que la desmetilación en secuencias repetidas en células 
somáticas adultas, específicamente secuencias localizadas en las regiones 
pericentroméricas de los cromosomas 1 y 16, se asocia con la presencia de errores en la 
segregación de estos mismos cromosomas.38 Estos datos sugieren que la desmetilación 
pericentromérica pudiera estar asociada con la generación de inestabilidad cromosómica, 
así como jugar un papel en el comportamiento clínico de algunas enfermedades 
neoplásicas. 
En nuestro estudio, no estamos encontrando una correlación directa entre 
desmetilación del satélite 2 y la presencia de inestabilidad cromosómica, lo que pudiera 
explicarse por el pequeño número de muestras evaluadas, así como otros factores que 
32 
pudieran estar presentes en cáncer de ovario, como pudiera ser la expresión de la 
ONMT3B, la cual no se ha evaluado aún. 
33 
CONClUSIONES 
La inestabilidad cromosómica está presente en prácticamente todas las muestras de 
cáncer de ovario, sin embargo, no encontramos diferencias con respecto a la metilación 
de las regiones pericentroméricas (satélite 2) entre las muestras con una elevada 
inestabilidad cromosómica, comparado con muestras con baja inestabilidad cromosómica, 
lo que sugiere que la metilación de estas regiones no se asocia de forma directa con el 
grado de inestabilidad cromosómica en cáncer de ovario . 
Glosario. 
Aneuploidía: Anormalidad en la división de material genético, caracterizado por la 
segregación inadecuada de cromosomas completos, dejando a la célula con un número 
cromosómico diferente al número haploide. Incluyen las pérdidas y/o ganancias 
cromosómicas. 
Carcinogénesis: Proceso en el cual se genera una célula con proliferación no controlada,e 
invasión a tejido circundante, capacidad de neo·vascularización y migración a tejidos 
diferentes a 105 de su linaje. 
Citosina: Es una de las 5 bases nitrogenadas del genoma y se encuentra en el DNA y en el 
RNA. Es un derivado pirimidínico. Su nucleósido es la citosina y se aparea en el modelo de 
Watson y Crick y forma tres puentes de hidrógeno con la guanina. 
Cromatina: Es un complejo de DNA y proteínas (histonas y no histonas). Se encuentra en 
el núcleo de las células eucariontes y dentro del nucleoide en las células procariontes. Las 
principales proteínas que componen la cromatina son las histonas. 
DAPI: 4,6.diamino·2-fenilindole. Tinción fluorescente que se une al DNA. 
Desmetilación: Hace referencia a la pérdida de 105 grupos metilo y en el DNA ocurre de 
manera activa durante la embriogénesis y en la gametogénesis y pasivamente en 
múltiples procesos, como por ejemplo en el envejecimiento. 
DNMT: DNA-metiltransferasas. Enzimas responsables de transferir el grupo metilo de SAM 
al carbono 5 de las citosinas. 
35 
Epigenética: Suma de todas las modificaciones en la cromatina, que colectivamente 
establecen y propagan los diferentes patrones de expresión génica (transcripción) y el 
silenciamiento en el mismo genoma . 
Errores en la segregación: Hace referencia a anormalidades que involucran la segregación 
de los cromosomas a las células hijas, que pueden derivarse en la pérdidao ganancia de 
cromosomas completos. 
Heterocromatina : Son aquellas regiones de cromatina que no son transcripcionalmente 
activas, que forman grandes bloques de DNA e histonas y que contienen marcas 
epigenéticas características. Se divide en heterocromatina constitutiva y facultativa. La 
primera es aquella que siempre permanecerá en estado silente y un ejemplo de ésta es el 
centró mero. La facultativa es aquella heterocromatina que en un momento dado puede 
cambiar su conformación y generar expresión de sus secuencias, siendo el mejor ejemplo 
el cromosoma X inactivo. 
Heterocromatinización:Es el proceso de formación de heterocromatina, el cual 
usualmente ocurre después de cada síntesis de DNA en ciertas regiones. Su formación al 
parecer depende de las modificaciones epigenéticas sobre las histonas. 
Hipometilación global : Término que nació con la medición de metilación global en el DNA 
mediante HPLC, donde se encontró que las células cancerosas presentaban menor nivel 
de citosinas metiladas comparado con las contrapartes no cancerosas. Posteriormente se 
descubrió que este fenómeno ocurría principalmente en regiones repetidas y 
retrotransposonas. 
36 
Inestabilidad cromosómica: Fenómeno descrito para las células cancerosas, donde se 
sabe que coexisten en un mismo tejido, células con diferente cantidad de material 
cromosómico y constantemente ocurren ganancias y pérdidas de cromosomas en dichas 
células, así como aberraciones estructurales en los cromosomas que van generando hijas 
con diferente cantidad y contenido de material genético. 
Islas CpG: Son regiones genómicas que contienen una mayor frecuencia de dinucleótidos 
CG. En mamíferos contienen entre 300 a 3000 pares de bases en su longitud y se 
encuentran en cerca del 70% de los promotores de los genes. Usualmente no se 
encuentran metiladas. 
Maquinaria de metilación del ONA: Son aquellas proteínas que dirigen, orquestan y 
mantienen la metilación en las citosinas del genoma. 
Metafase: Etapa de la mitosis en las células eucariontes en la cual los cromosomas 
condensados se alinean en una línea ecuatorial antes separar las cromátidas hacia las 
células hijas. 
Metilación de novo: Es aquella metilación sobre hebras de ONA sintetizadas que se 
genera sin la presencia de una hebra parental metilada. 
Metilación: Adición de un grupo metilo (CH,-) en un sustrato. 
Nucleosoma: Unidades repetidas de organización de las fibras de cromatina dentro de los 
cromosomas, la cua l consiste en alrededor de 150 pares de bases del ONA y dos moléculas 
de cada una de las siguientes histonas: H2A, H2B, H3 Y H4. 
37 
Palindrómico: Referente a las secuencias palindrómicas, es decir, secuencias de ácidos 
nucléicos que son idénticas a su hebra complementaria cuando cada una es leída en la 
di rección co rrecta (5' -3'). 
Patrón de Metilación: Modificación específica de metilación de citosinas en una secuencia 
o en un genoma completo. 
Pericentromérico: Alrededor del centrómero. 
Poliploidía: Fenómeno celular en el cual existen más de dos paquetes completos (sets) de 
cromosomas homólogos y se denominan de acuerdo al número de sets que contenga en 
el núcleo (triploidía, tetraploidia, pentaploidía, etc.). 
Primer: Secuencia de oligonucleótidos que reconocen un fragmento de una secuencia de 
interés. 
Reacción de bisulfito de sodio: Reacción química donde el DNA se expone a bisulfito de 
sodio para sulfonar las citosinas no metiladas y luego modificarla químicamente para que 
sea más parecida a los uracilos que a las citosinas y por ende sea secuenciada como 
tia mina, permitiendo una visualización de los patrones de metilación citosina por citosina . 
Replicación del DNA: Hace referencia a la generación de una hebra de DNA idéntica a la 
hebra parental, logrando así una réplica del genoma de la célula madre. 
Satélite-2: Secuencias repetidas en tanda (llamado en tandem) que conforman grandes 
regiones de heterocromatina, como las regiones pericentroméricas. Tienen gran cantidad 
38 
de citosinas metiladas y otras modificaciones epigenéticas como trimetilación de las lisinas 
9 en la histona H3. 
Síndrome ICF: Síndrome clínico caracterizado por inmunodeficiencia, inestabilidad 
centromérica y anormalidades faciales, el cual es causado usualmente por mutaciones en 
la DNMT3B, con desmetilación de varias regiones del genoma, incluyendo las regiones 
pericentroméricas. 
Transcripción: Proceso mediante el cual la célula expresa su genoma y lo convierte en 
moléculas transportadoras de la información genética, el mRNA. 
39 
Abreviaturas. 
S-MC: 5-metilcitosinas 
CpG: Dinucleótido Citosina:Guanina acomodado de forma palidrómica en ambas hebras. 
DAPI: 4,G.diamino-2·fenilindole. 
DNA: Ácido desoxirribonucleico 
DNMTs: DNA·metiltransferasas 
FISH: Hibridación in situ fluorescente 
h: horas 
ICF: Síndrome de inmunodeficiencia, inestabilidad centromérica, anormalidades faciales 
P b: pares de bases 
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa 
RPM: Revoluciones por minuto. 
40 
10. REFERENCIAS 
1. Jemal, A., 5iegel, R., Xu, J. & Ward, E. Caneer statisties, 2010. CA CancerJ Clin 60, 277-300. 
PM I D: 19474385; http://dx. doLorg/ 1947431O.19473322/ caac.19472006. (2010) . 
2. http://globoca n. ia re. Ir Ila cts heet. asp. 
3. Modugno, F. & Edwards, R.P. Ovarian caneer: prevention, deteclion, and treatment 01 the 
disease and its recurrence. Molecular mechanisms and personalized medicine meeting 
reporto IntJ Gynecal Cancer 22,545-57 (2012). 
4. Bradley, E.J., Pitts, M.K., Redman, C.W. & Calvert, E. The experience 01 long-term hospital 
lollow-up lar women who have sullered earlv stage gvnecological cancer: a qualitative 
interview study. IntJ Gynecal Cancer 9, 491-496 (1999) . 
5. 5uh, K.5., et al. Ovarian caneer biomarkers lor molecular biosensors and translational 
medicine. Expert Rev Mal Diagn 10, 1069-1083 (2010). 
6. Jurkowska, R.Z., Jurkowski, T.P. & Jeltsch, A. Structure and lunction 01 mammalian DNA 
methyltranslerases. Chembiaehem 12, 206-222 (2011) . 
7. Rodriguez-Dorantes, M., Tellez-Aseeneio, N., Cerbon, M .A., Lopez, M . & Cervantes, A. 
[DNA methylation: an epigenetic process 01 medical importance] . Rev Invest Clin 56, 56-71 
(2004) . 
8. Jones, P.A. & Liang, G. Rethinking how DNA methvlation patterns are maintained. Nat Rev 
Genet 10, 805-811 (2009). 
9. Widschwendter, M., et al. DNA hvpomethylation and ovarian cancer biology. Cancer Res 
64, 4472-4480 (2004). 
10. Pattamadilok, J., et al. LlNE-l hypomethylation level as a potential prognostic lactor lar 
epithelial ovarian cancer. IntJ Gynecol Cancer 18, 711-717 (2008) . 
11. Balch, c., Fang, F., Matei, D.E., Huang, T.H. & Nephew, K.P. Minireview: epigenetic ehanges 
in ovarian cancer. Endocrinalagy 150, 4003-4011 (2009). 
12. Soto-Reyes, E., et 01. Disruption 01 CTCF at the miR-125b110cus in gynecological eaneers. 
BMC Caneer 12, 40 (2012) . 
13. Schools, T., etal. DNA methylation ehanges are a late event in acute promyelocytie 
leukemia and coincide with loss oltranseription lactar binding. Blaad 121, 178-187 (2013) . 
14. Lengauer, c., Kinzler, K.w. & Vogelstein, B. Genetie instability in colorectal eancers . Nature 
386, 623-627 (1997). 
15. Judson, H., et al. Relationship between point gene mutation, chromosomal abnormalily, 
and tumour suppressor gene methylalion status in eolorectal adenomas. } Pathal210, 
344-350 (2006). 
16. Chaves, P., et 01. Chromosomal analysis 01 Barrett's eells : demonstration 01 instability and 
deteetion 01 Ihe metaplastic lineage involved. Mad Pathal 20, 788-796 (2007) . 
17. Gao, e, et al. Chromosome instability, chromosome transcriptome. and clonal evolution 
01 tumor cell populations. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 8995-9000 (2007) . 
18. Torres, E.M., Williams, B.R. & Amon, A. Aneuploidy: ce lis losing their balance. Geneties 
179, 737-746 (2008). 
19. Siavoshian, S., et al. Cloning 01 a human cancer cellline (N5CLC-N6) and comparative study 
01 the clones in vilro. Anticancer Res 18, 193-200 (1998). 
20. Wang, Z.c., et al. Proliles 01 genomic instability in high-grade serous ovarian caneer predict 
treatment outcome. Clin Caneer Res 18, 5806-5815 (2012). 
21. Pothuri, B., et al. Genetie analvsis 01 the early natural history 01 epithelial ovarian 
carcinoma. PLaS One 5, e10358 (2010). 
41 
22. Kim, Y.T., et al. Prognostie signifieanee of DNA quantifieation by flow eytometry in ovarian 
tumors . Int } Gynaecol Obstet 88, 286-291 (2005). 
23 . Ozalp, S., Ya lein, O.T., Gulbas, Z., Tanir, H.M . & Minsin, T. Effect of eellular DNA content on 
theprognosis of epitheJial ovarian eaneers. Gynecol Obstet Invest 52, 93-97 (2001). 
24. Lassus, H., Staff, S., Leminen, A., Isola, J. & Butzow, R. Aurora-A overexpress ion and 
aneuploidy prediet poor outeome in serous ovarian carcinoma. Gynecol Onco/120, 11-17 
(2011). 
25. Dodge, J.E., et al. Inaetivation of Dnmt3b in mouse embryonie fibroblasts results in DNA 
hypomethylation, ehromosomal instability, and spontaneous immortalization. } Biol Chem 
280, 17986-17991 (2005) . 
26. EhrJieh, M., et al. ICF, an immunodefieiency syndrome: DNA methyltransferase 36 
involvement, ehromosome anomaJies, and gene dysregulation. Autoimmunity 41,253-271 
(2008) . 
27. van den Brand, M ., Flueke, U.E., Bult, P., Weemaes, e.M. & van Deuren, M . Angiosarcoma 
in a patient with immunodeficiency, centrameric region instability, facial anomalies (ICF) 
syndrome. Am } Med Genet A 155A, 622-625 (2011). 
28. Andre, N., etaJ. Macrophage activation syndrome mimicking life-threatening infection in a 
patient with variable immunodeficiency, centrameric instability, and facial anoma lies. 
Pediatries 114, 1127 (2004). 
29. 5ehuetz, e., et al. ICF syndrome: high variability of the ehromosomal phenotype and 
association with elassieal Hodgkin Iymphoma. Am } Med Genet A 143A, 2052-2057 (2007). 
30. Hagleitner, M.M ., et al. CJinieal spectrum of immunodeficieney, eentromerie instability and 
facial dys morphism (ICF syndrome). } Med Genet 45, 93-99 (2008). 
31. Qu, G., Dubeau, L. , Narayan, A., Yu, M .e. & Ehrlieh, M. Satellite DNA hypomethylation vs. 
overall genomic hypomethylation in ovarian epithelial tumors of different malignant 
potential. Mutat Res 423, 91-101 (1999) . 
32. Zeimet, A.G ., et al. DNA ploidy, nuelear size, proliferation index and DNA-hypomethylation 
in ovarian ean·eer. Gynecol Onco/1 21, 24-31 (2011). 
33 . Kim, 1.5., et al. Roles 01 Mis18alpha in epigenetie regulation 01 eentromerie ehromatin and 
CENP-A loading. Mol Ce1/ 46, 260-273 (2012). 
34. Ng, T.M., Waples, W.G., Lavoie, B.D. & 6iggins, 5. Perieentromerie sister ehromatid 
cohesion promotes kinetoehore biorientation. Mol Biol Ce1/ 20, 3818-3827 (2009). 
35. Wong, N., et al. Hypomethylation of ehromosome 1 heteroehromatin DNA eorrelates with 
q-arm copy gain in human hepatoeellular carcinoma. Am } Pathol159, 465-471 (2001). 
36. Tsuda, H., Takarabe, T., Kanai, Y., Fukutomi, T. & Hirohashi, 5. Correlation of DNA 
hypomethylation at perieentromerie heteroehromatin regions of eh romosomes 16 and 1 
with histologica l features and chromosomal abnormallties of human breast carcinomas. 
AmJ Pathol 161, 859-866 (2002) . 
37 . Nakagawa, T., et 01. DNA hypomethylation on perieentromerie sate llite regions 
signiliean tly correlates with loss of heterozygosity on ehromosome 9 in urothelial 
carcinomas . } UroI 173, 243-246 (2005) . 
38. Prada, D., et 01. Satellite 2 demethylation indueed by 5-azaeytidine is assoeiated with 
missegregation of ehromosomes 1 and 16 in human somat ie eells. Mutat Res 729,100-105 
(2012). 
39. Lemieux, N., Dutrillaux, B. & Viegas-Pequignot, E. A simple method for simultaneous R- or 
G-banding and fluoreseenee in situ hybridization of small single-copy genes. Cytogenet Cell 
Genet 59,311-312 (1992). 
-12 
40. Wilson, V.L. & Jones, P.A. DNA methvlation decreases in aging but not in immortal cells. 
Science 220, 1055-1057(1983). 
41. Friedlander, M.L., et al. PloidV as a prognostic lactor in ovarian cancer. Int J Gynecal Pathal 
2, 55-63 (1983). 
42. Berchuck, A., et al. Plaidv analvsis 01 epithelial ovarian cancers using image cytometry. 
Gynecol Onco/ 44, 61-65(1992). 
43. Cedar, H. & Bergman, Y. Linking DNA methvlation and histone modification : patterns and 
paradigms. Nat Rev Genet 10, 295-304(2009). 
44. Saito, Y., et al. Expression 01 mRNA lor DNA methvltranslerases and methvl-CpG-binding 
proteins and DNA methvlation status on CpG islands and pericentromeric satellite regions 
during human hepatocarcinogenesis. Hepatalagy 33, 561-568(2001). 
45. Robertson, K.D., et al. The human DNA methvltranslerases (DNMTs) 1, 3a and 3b: 
coordinate mRNA expression in normal tissues and overexpression in tumors. Nucleic 
Acids Res 27, 2291-2298(1999) . 
46. Kanai, Y., Ushijima, S., Kondo, Y., Nakanishi, Y. & Hirohashi, S. DNA methvltranslerase 
expression and DNA methylation of CPG islands and peri-centromeric satellite regions in 
human colorectal and stomach cancers. Int J Cancer 91,205-212(2001). 
47. Jeanpierre, M. Human satellites 2 and 3. Ann Genet 37, 163-171 (1994). 
48. Ehrlich, M ., et al. Quantitative analvsis 01 associations between DNA hvpermethvlation, 
hvpomethvlation, and DNMT RNA levels in ovarian tumors. Oncogene 25,2636-2645 
(2006). 
43 
	Portada 
	Índice 
	1. Resumen 
	2. Introducción 
	3. Justificación 4. Relevancia e Impacto 
	5. Hipótesis 6. Diseño del Estudio 
	7. Objetivo General 
	8. Materiales y Métodos 
	9. Discusión 
	10. Referencias