Determinacion-de-la-presencia-del-ranavirus-tipo-3-en-cuatro-poblaciones-de-anfibios-lithobates-montezumae-en-Mexico

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Biológicas / Saúde

Aprendiendo Medicina

2/8/2022

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Medicina

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DEL RANAVIRUS TIPO 3 EN CUATRO
POBLACIONES DE ANFIBIOS (Lithobates Montezumae) EN MÉXICO

TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA

PRESENTA
VÁZQUEZ BUCHELI JORGE ENRIQUE

Asesores:
MVZ Estela Teresita Méndez Olvera
M en C, Biol. Larisa Adriana Chávez Soriano

México, D. F. 2012

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
Restricciones de uso

DERECHOS RESERVADOS ©
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL

Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México).
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el
respectivo titular de los Derechos de Autor.

[II]

Agradecimientos

Deseo agradecerle a la Universidad Nacional Autónoma de México y a la Facultad
de Medicina Veterinaria y Zootecnia. A las que debo toda mi formación.

Al Laboratorio de microbiología agropecuaria de la Universidad Autónoma
Metropolitana unidad Xochimilco y al proyecto PAPIIT No. IN222307 por
proporcionarme los recursos para realizar mi tesis
A la Colección Nacional de Anfibios y Reptiles y al Dr. Victor Hugo Reynoso por
proporcionar las muestras de Lithobates montezumae necesarias para la
elaboración de mi Tesis.

Al Dr. Daniel Martínez Gómez y a la MVZ Estela Teresita Méndez Olvera por
darme la oportunidad de trabajar con ustedes, por su paciencia, comprensión,
consejo y apoyo.

A la M en C, Biol. Larisa Adriana Chávez Soriano por su atención y
asesoramiento.
Por último, quiero agradecer a todas las personas que dedicaron parte de su
tiempo para mejorar mi documento de tesis, especialmente a la Dra. Gisela
Martínez Romero, al Dr. Joaquín Vázquez Paredes y a todo el personal de
Genética Molecular de la FMVZ.

[III]

Dedicatoria

A mis padres: Por su amor incondicional, comprensión y apoyo. Por
acompañarme en mis éxitos y nunca abandonarme en mis fracasos. No hubiera
logrado nada sin ustedes.

A mi hermana: Por ser una gran amiga y defenderme con capa y espada siempre
que te he necesitado. Te quiero mucho.

A Emilio, Manuel, Luismi, Javier, Nancy, Paulina, Victoria y a todos mis amigos
que por falta de memoria no mencioné. Por esos grandes e inolvidables momentos
que hemos pasado juntos, por soportar mis quejas y brindarme siempre su apoyo
y consejo.

[IV]

Contenido

Página
RESUMEN………………………………………………………………1

INTRODUCCIÓN……………………………………………………….2

JUSTIFICACIÓN……………………………………………………….19

HIPOTESIS……………………………………………………………..19

OBJETIVOS…………………………………………………………….19

MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………….21

RESULTADOS………………………………………………………….28

DISCUSIÓN……………………………………………………………..38

CONCLUSIONES………………………………………………...…….46

PERSPECTIVAS……………………………………………………….46

BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………...47

RESUMEN
VAZQUEZ BUCHELI JORGE ENRIQUE. Determinación de la presencia del
ranavirus tipo 3 en cuatro poblaciones de anfibios (Lithobates montezumae)
en México (bajo la dirección de: M en C, MVZ Estela Teresita Méndez Olvera
y M en C, Biol. Larisa Adriana Chávez Soriano).
El objetivo de este trabajo fue amplificar la MCP del Ranavirus tipo 3 (FV-3)
en muestras de tejido de Ranas Moctezuma pertenecientes a la Colección
Nacional de Anfibios y Reptiles (CNAR), del Instituto de Biología de la
UNAM, al observar lesiones sugestivas a FV-3 en cortes histológicos y
empleando la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para
detectar ácidos nucleicos virales.
El estudio se realizó en 30 muestras de diferentes tejidos de Rana
Moctezuma (Lithobates montezumae) obtenidas del CNAR.
En el estudio histopatológico, 18 muestras mostraron lesiones sugerentes a
FV-3 y 12 sin lesiones. La técnica de PCR, no amplificó en ninguna muestra a
la proteína mayor de la cápside del virus.

INTRODUCCIÓN
Antecedentes
El estudio de la distribución de los agentes patógenos es muy importante, ya
que algunos de estos pueden producir un serio declive de individuos en la
población afectando con ello su viabilidad. 1-4

Las poblaciones de anfibios, a lo largo de los últimos 20 años han sido
afectadas gravemente a nivel mundial por diferentes causas como: la
contaminación, la reducción y destrucción del hábitat, la introducción de
depredadores, entre otras, causando la extinción masiva de diferentes
especies de anfibios. Otra causa de extinción, son los agentes infecciosos
que podrían ser el principal motivo del decremento de poblaciones silvestres
de anfibios. Se ha sugerido que uno de ellos podría ser el hongo quitridio
(Batrachochytrium dendrobatidis). Agentes virales podrían estar involucrados,
como los Iridovirus específicamente, del género Ranavirus .3- 5

El ranavirus fue aislado y descrito por primera vez por Granoff en 1965, en
ranas leopardo (Lithobates pipiens) provenientes de los Estados Unidos de
América y desde entonces, se ha detectado su presencia en diferentes países
alrededor del mundo. Recientemente, se han encontrado ranas infectadas
con FV-3, en países donde anteriormente no se había manifestado la
3

enfermedad como: Venezuela (2000), Argentina (2006), España (2008),
Holanda (2011) y Japón (2011). Se ha asociado con la importación de
anfibios infectados con Iridovirus, empleados como alimento o mascota
(Figura 1). 6-11,

Existe incluso la teoría de que la llegada y diseminación del FV-3 en
Sudamérica, fue probablemente a partir de 2 importaciones de rana toro
(Lithobates catesbiana) a Brasil, provenientes de Estados Unidos de América
en los años de 1935 y 1970. 7

Figura1. Distribución del ranavirus tipo 3 en 2011 a nivel mundial.
6-11

La presencia en nuestro país de especies introducidas tales como la rana
Toro (Lithobates catesbiana) en la década de 1940, la rana de uñas africana
(Xenopus laevis) en 1993 y el sapo neotropical gigante (Rhinella marina) en la
4

década de 1970, representa un gran riesgo para las poblaciones de anfibios
mexicanas, ya que además de alterar el ecosistema depredando y
compitiendo con las especies endémicas, podrían ser portadoras de
enfermedades virales que es posible diseminen en las poblaciones
autóctonas. 11-14

Éste Iridovirus causa un gran impacto ecológico debido a la elevada
mortalidad que puede provocar incluso hasta la desaparición de varias
poblaciones de anfibios. Este desequilibrio ecológico, tardaría años en su
recuperación, debido a que los anfibios forman parte de la cadena alimenticia,
que al desaparecer provocaría falta de alimento para sus depredadores y las
presas de estos anfibios podrían llegar a reproducirse en exceso,
convirtiéndose en una plaga.15

Por otro lado, los anfibios son buenos indicadores del estado de los
ecosistemas en que habitan. Al haber una disminución marcada de las
poblaciones de ranas silvestres en los diferentes niveles tróficos en los que,
participan, reflejaría un daño grave a los ecosistemas, ya sea por
contaminantes o por algunas enfermedades virales o micótica. La aparición
de las enfermedades antes mencionadas afectaría gravemente el nivel
económico mundial, porque pueden existir reservorios capaces de transmitirel virus, a partir de producciones intensivas, que estén ubicadas cerca de
5

ríos, lagos o lagunas y diseminarse fácilmente a través de agua, o a través de
la introducción de individuos o pies de crías infectados por el virus, al no
llevar a cabo una cuarentena. 16-19

Factores como mala alimentación, alta densidad de población y mala calidad
del agua son elementos que provocan estrés en los individuos, por lo tanto
promueven la secreción de hormonas de estrés como el cortisol, cuya acción
inmunosupresora contribuye a la presentación y diseminación de esta y otras
la enfermedades. 17-19

En la actualidad, en México no existen informes de casos positivos de
Ranavirus Tipo 3, por lo que es considerada una enfermedad exótica, sin
embargo la importación de anfibios y la cercanía que hay con países que ya
han sido afectados con este agente como: Venezuela, Costa Rica y Estados
Unidos de América representa un gran riesgo para el país (Tabla 1). 19-22

Tabla 1. ESPECIES DE ANFIBIOS IMPORTADOS A LATINOAMÉRICA DESDE ESTADOS
UNIDOS DE AMÉRICA ENTRE LOS AÑOS 2003-2007.
23

Nombre común Nombre científico Destino Ejemplares exportados
Salamandra Tigre Ambystoma tigrinum
Argentina, Bahamas,
México, Panama 130
Sapo neotropical gigante Rhinella marina
Guatemala,
Honduras, México,
Nicaragua 57
Rana dardo azul Dendrobates auratus
Ecuador, Argentina,
México, Uruguay 92
Rana blanca de árbol Litoria caerula
Argentina, Chile,
Costa Rica,
Guatemala, México,
Nicaragua, Panama,
El Salvador 1,965
Perro de agua Necturus maculosus Argentina, Barbados 45
Rana toro Lithobates catesbiana Brasil, México 8,005
Rana verde Lithobates clamitans México 20
Rana leopardo Lithobates pipiens México 279
Rana de uñas africana Xenopus laevis
Argentina, Brasil,
Chile, Colombia,
Costa Rica, México,
Nicaragua, Venezuela 3,634
Total 14,227

Rana Moctezuma
La Rana Moctezuma (Lithobates montezumae) es un anfibio autóctono de
México y pertenece a la familia Ranidae. 24-26

Llega a medir entre 6 y 11 cm de longitud, su dorso es ligeramente verrugoso
con una coloración que varía de verde a café, con manchas oscuras
delineadas con halos más claros y su vientre es blanco. Su cabeza es larga y
ancha, mientras que sus extremidades son largas y robustas. 26

Las hembras suelen ser más grandes que los machos y éstos presentan
sacos bucales externos a ambos lados de la boca que son utilizados durante
el período reproductivo. 26

Distribución
El hábitat natural de estas ranas son los bosques templados, subtropicales,
lagos de agua dulce, pantanos, lagunas y estanques. Esta especie se
distribuía en 1995 desde el oriente de Jalisco hacia el este de Michoacán
cruzando a través del Estado de México, Distrito Federal, Puebla, Morelos y
Tlaxcala. También estaban distribuidas al Norte de Hidalgo, Querétaro, así
como en el Sur de San Luis Potosí. En 2008 la Comisión Nacional para el
Conocimiento y Uso de la Biodiversidad (CONABIO) realizó un monitoreo de
la especie para actualizar la información respecto a su potencial distribución
8

en el país, estudio, donde se observó que la población disminuyó
considerablemente respecto a 1995 y actualmente ha desaparecido en los
estados de Michoacán, Puebla y Tlaxcala (Figura 2). 24-26

Figura 2. Comparación de como se ha reducido la distribución de Lithobates montezumae en México
desde 1995 (Amarillo) al 2008 (Rojo).
24,25

Ciclo de vida

Estos anfibios mantienen una estrecha relación con el agua, pues pasan gran
parte de su vida en el medio acuático. Los machos fecundan los huevos
liberados previamente por las hembras, la puesta comprende entre 10,000 y
25,000 huevos. Los huevos eclosionan entre 4 y 10 días después,
dependiendo de la temperatura ambiental siendo la ideal entre los (22° a
9

27°C). A una mayor temperatura, el metabolismo de los embriones se acelera
y da como resultado una eclosión más rápida pero el porcentaje de huevos
eclosionados disminuye. A temperaturas bajas el tiempo de eclosión es más
lento pero el porcentaje de huevos eclosionados. 11,24-26

Los renacuajos se alimentan de vegetales y se desarrollan de diferente
manera con base a la disponibilidad de oxígeno en el agua, cantidad de
alimento y temperatura ambiental. Su metamorfosis puede ocurrir entre los 3
y 4 meses de edad. Esta etapa es más susceptible a enfermedades, ya que
carecen de un sistema inmune bien desarrollado y es el periodo en el cual el
proceso de metamorfosis resulta muy estresante para los renacuajos, lo que
provoca la secreción excesiva de cortisol, que tiene un efecto inmunosupresor
en el organismo. 11,24-26,

Esta especie adquiere la madurez sexual a los dos años de edad, aunque
puede variar dependiendo de la disponibilidad de alimento y temperatura
ambiental y la temporada de reproducción está marcada por el inicio de la
época de lluvias (Figura 3). 11,24-26,
10

Figura 3. Ciclo de vida del género Lithobates
24-26

Legislación
Lithobates está considerada dentro de la categoría de menor preocupación
(Figura 4), en la lista roja de especies amenazadas según la Unión
Internacional para la Conservación de la Naturaleza (IUCN). Esta
clasificación indica que es poco probable que la especie se extinga en un
futuro próximo, es decir, dentro de los próximos 100 años.
Figura 4. Criterio de clasificación establecido por la IUCN.
27

El criterio en el que se basa la IUCN para establecer a Lithobates
montezumae como especie de preocupación menor es:
a) La reducción en la población no ha sido mayor del 50% en los últimos
10 años o en las ultimas 3 generaciones.
b) La área de ocupación sea de menos de 20,000 Km2 o que la población
exista en menos de 10 localidades
c) La población efectiva sea de más de 10,000 individuos.
d) El análisis cuantitativo de la población demuestre que la probabilidad
de extinguirse en estado silvestre dentro de los próximos 100 años es
menor al 10%

Si alguno de estos criterios no se cumple, pasaría inmediatamente a la
categoría de Casi amenazada (Near threatened).

Esta rana está considerada dentro de la Norma Oficial Mexicana NOM-059-
ECOL-2010 hasta la fecha esta clasificada como sujeta a protección especial
por diversas causas como: reducción de su hábitat, cacería excesiva,
enfermedades, etc. Su distribución ha disminuido considerablemente y como
consecuencia han desaparecido varias poblaciones de este anfibio en el país
(Figura 2). 27,

Morfología del Ranavirus
De acuerdo con el Comité Internacional en Taxonomía de los Virus (ICTV), el
ranavirus es miembro de la familia Iridoviridae e incluye cinco géneros:
Iridovirus y Chloriridovirus que afectan solo a invertebrados, Megalocytivirus y
Lymphocystivirus, que afectan a peces y el género Ranavirus que afecta a
poiquilotermos. 28,29, 30

Las especies de mayor importancia del género Ranavirus son: Ranavirus tipo
3 (FV-3), Virus Epizoótico de Necrosis Hematopoyética (EHNV), Virus del Pez
Gato Europeo (ECV), el Ranavirus del Siluro (ESV) y Ranavirus Santee-
Cooper (SSRV), Iridovirus Bohle (BIV), el Virus de la Salamandra Tigre (ATV).
6, 7, 30

El Ranavirus es un virus icosaédrico, cuyo virión mide entre 120 a 200 nm
de diámetro. Su genoma está constituido por una doble cadena de ADN, el
cual tiene una longitud aproximada de 105,903 pares de bases y cuenta con
alrededor 92 marcos abiertos de lectura (ORF’s). 28,19 ,31

El virión está compuesto por una cápside externa constituida de múltiples
copias de la proteína mayor de la cápside (MCP). Tiene una membrana
lipídica y una nucleocápside interna que contiene el genoma viral y las
proteínas asociadas. La proteína mayor de la cápside (MCP) es unaproteína
13

estructural de aproximadamente 50KDa y 1,462 pb, representa cerca del 40%
del contenido proteínico del virión y se encuentra presente en todas las
especies de Ranavirus (Figura 5). 18, 19, 31, 32, 33, 34

Figura 5. Morfología del virión de ranavirus.
35

El Ranavirus tipo 3 ha sido aislado en más de 100 especies de anfibios
pertenecientes a 8 familias de anuros y 3 familias de urodelos, distribuidos en
diferentes áreas de Europa, Asia, Australia y América (Tabla 2). 17,19, 33

Tabla 2. DISTRIBUCIÓN MUNDIAL DE ANFIBIOS IDENTIFICADOS CON LA INFECCIÓN
POR RANAVIRUS.
17

Continente País Familia
Asia China Cryptobranchidae

Ranidae

Japón Myobatrachidae

Ranidae

Tailandia Ranidae
Australia Australia Myobatrachidae
Europa Belgica Salamadridae

Croacia Ranidae

Dinamarca Ranidae

Israel Bufonidae

Holanda Ranidae

Portugal Salamadridae

España Alytidae

Salamadridae

Suiza Ranidae

Reino Unido Alytidae

Bufonidae

Ranidae

Salamadridae
America Canada Ambystomatidae

Hylidae

Ranidae

Salamadridae
America Costa Rica Bufonidae

Ambystomatidae

EUA Ambystomatidae

Bufonidae

Cryptobranchidae

Dendrobatidae

Hylidae

Plethodontidae

Ranidae

Salamadridae

Scaphiopodidae

Argentina Leptodactylae

Brasil Ranidae

Uruguay Ranidae

Venezuela Bufonidae

Leptodactylae

Los factores ambientales que promueven el desarrollo de la enfermedad son
todavía desconocidos. Este virus es extremadamente resistente a las
condiciones ambientales, como la desecación por más de 100 días y a
temperaturas menores a los 70 °C. Puede permanecer viable más de 90 días
en agua destilada. 32,36

Epidemiología

El ranavirus afecta sobre todo a anfibios, aunque existen informes de
infección en peces (Waltsek, 2011) y reptiles (Marschang, 2011), los cuales
pueden ser vectores de la enfermedad. 18,19, 34,38

Puede causar una mortalidad de hasta el 100% dependiendo de la cepa y
susceptibilidad de la especie afectada. La transmisión del virus puede ser
horizontal directa (contacto entre individuos, canibalismo, etc.) u horizontal
indirecta (agua, sedimento, restos orgánicos, etc.). Se cree que puede haber
transmisión vertical, sin embargo, no ha sido comprobada (Figura 6). 18, 19, 38,
39
El número de animales infectados depende de la cantidad de virus en el
ambiente. 37,38

Figura 6. Epidemiología del ranavirus tipo 3.
18

Experimentalmente, se ha comprobado que el período de incubación del virus
oscila entre 10-30 días y una vez han aparecido los signos clínicos el tiempo
de muerte varía entre 15-30 días. 40, 41

Los signos clínicos observados en anfibios adultos son: depresión, letargia,
hiperemia palpebral, anorexia, edema, petequias, eritema de la zona ventral,
ulceras de la piel y emaciación. 17, 42, 43

Lesiones macroscópicas
En los animales afectados por ranavirus se puede observar: edema a nivel
del tejido subcutáneo ventral, equimosis cerca del uróstilo, áreas blancas o
amarillas multifocales en el parénquima del hígado y petequias en serosa,
mucosa del estómago, intestino y músculo esquelético. La vesícula biliar
puede estar agrandada. Se conocen dos síndromes causados por el FV-3: el
síndrome hemorrágico agudo que afecta principalmente a larvas y se
caracteriza por hemorragias multifocales subcutáneas especialmente a nivel
ventral, aunque también es posible encontrarlas a nivel inguinal y en la
superficie plantar. El síndrome ulcerativo crónico es más común en individuos
adultos y se caracteriza por dermatitis ulcerativa y erosiones cutáneas,
especialmente en extremidades posteriores.17, 42, 43, 44

Lesiones microscópicas
La enfermedad por ranavirus es sistémica, se caracteriza por hemorragias y
necrosis principalmente en hígado y riñón.

Se puede observar necrosis endotelial, hemorragia, edema y degeneración
del musculo esquelético. Se pueden observar cuerpos de inclusión basofílicos
intracitoplasmáticos en piel, hígado y riñón. En la etapa temprana de la
enfermedad los cuerpos de inclusión pueden ser eosinofílicos. En un estudio
donde se empleó la microscopía electrónica en diferentes porciones de
hígado de salamandras tigre (Ambystoma tigrinum) durante la etapa final de
la enfermedad se apreciaron cuerpos de inclusión intranucleares. La
presencia de cuerpos intranucleares en otros anfibios afectados por el virus
es muy rara. 17, 42-45

Diagnóstico
Para llevar a cabo el diagnostico presuntivo de esta enfermedad, es
necesario el análisis de la anamnesis y la observación de los signos clínicos,
lesiones macroscópicas y microscópicas.

Para confirmar el diagnostico, se realiza la identificación directa del virus a
través del aislamiento viral, la búsqueda de viriones maduros en el citoplasma
de células afectadas con microscopía electrónica y/o la amplificación de
ácidos nucleicos virales por medio de la técnica de reacción en cadena a la
polimerasa (PCR). 38, 40, 42, 43, 46

Justificación
Debido a que en México no se han realizado estudios para identificar la MCP
del rana virus tipo 3, en la rana Moctezuma (Lithobates montezumae) la cual
es una especie susceptible a la infección por este agente viral, se decidió
realizar el presente estudio. En el caso de que el virus esté presente en las
poblaciones estudiadas, se podrá posteriormente con otros estudios
determinar como una de las principales causas de la reducción en la
población de este anfibio. 18-21

Hipótesis:
Si México importa anfibios como alimento y mascotas de países con informes
de la presencia de ranavirus, entonces es probable que en las muestras de
Lithobates montezumae colectadas se identifique la MCP del FV-3.

Objetivo General:
Identificar la MCP del FV-3 en muestras de tejido de rana Moctezuma
(Lithobates montezumae), procedentes de 4 poblaciones con histopatología y
PCR (Tabla 3).

Objetivos Específicos:
Identificar las lesiones microscópicas sugerentes a la infección por el
Iridovirus del género Ranavirus tipo 3 en riñón, hígado y piel de Lithobates
montezumae.

Identificar la MCP del Iridovirus tipo 3, mediante la técnica de PCR,
empleando iniciadores desarrollados para amplificar un segmento
conservado del gen que codifica para la proteína mayor de la cápside (MCP-
FV3).

Obtener frecuencias de las muestras con lesiones sugerentes en el estudio
histopatológico y frecuencias de las muestras que amplificaron la MCP

Correlacionar la presencia del gen que codifica para la secuencia de la
proteína MCP-FV3 con las lesiones microscópicas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Población de estudio
Se utilizaron 30 muestras de ranas de la especie Lithobates montezumae,
que se obtuvieron de la Colección Nacional de Anfibios y Reptiles del Instituto
de Biología de la UNAM (CNAR). Se utilizaron muestras de piel, hígado,
riñón, corazón e intestino, las cuales se encontraban fijadas en formalina al
10%. Las ranas seleccionadas de la colección procedían de 4 localidades
diferentes: municipio de Guanajuato, Guanajuato (recolectados en 1994),
municipio de Yahualica de González Gallo, Jalisco (recolectados en 1995),
municipio de Ojuelos de Jalisco, Jalisco (recolectados en 1994) y del Jardín
Botánico de Ciudad Universitaria D.F. (recolectados en 1997). Las muestras
obtenidas de cada individuo, se dividieron en dos: una parte, destinada para
el estudio histopatológico, se depositó en formalina al 10%. La otra parte se
conservó en congelación para la extracción del ADN viral (Tabla 3).

Tabla 3. PROCEDENCIA Y AÑO DE RECOLECCIÓNDE LAS 30 MUESTRAS

Muestra Año Lugar de procedencia
5037-7 1994 Guanajuato, Guanajuato
5037-21 1994 Guanajuato, Guanajuato
5037-25 1994 Guanajuato, Guanajuato
5037-27 1994 Guanajuato, Guanajuato
5037-45 1994 Guanajuato, Guanajuato
6110-1 1995 Yahualica de González Gallo, Jalisco
6110-3 1995 Yahualica de González Gallo, Jalisco
6110-4 1995 Yahualica de González Gallo, Jalisco
6110-5 1995 Yahualica de González Gallo, Jalisco
6110-6 1995 Yahualica de González Gallo, Jalisco
6110-14 1995 Yahualica de González Gallo, Jalisco
6110-15 1995 Yahualica de González Gallo, Jalisco
6110-17 1995 Yahualica de González Gallo, Jalisco
6110-18 1995 Yahualica de González Gallo, Jalisco
6110-20 1995 Yahualica de González Gallo, Jalisco
6111-2 1995 Ojuelos de Jalisco, Jalisco
6111-5 1995 Ojuelos de Jalisco, Jalisco
6111-7 1995 Ojuelos de Jalisco, Jalisco
6111-9 1995 Ojuelos de Jalisco, Jalisco
6111-11 1995 Ojuelos de Jalisco, Jalisco
6111-12 1995 Ojuelos de Jalisco, Jalisco
6111-15 1995 Ojuelos de Jalisco, Jalisco
6111-17 1995 Ojuelos de Jalisco, Jalisco
6110-20 1995 Ojuelos de Jalisco, Jalisco
6111-25 1995 Ojuelos de Jalisco, Jalisco
9571 1997 Ciudad Universitaria, Distrito Federal
9572 1997 Ciudad Universitaria, Distrito Federal
9573 1997 Ciudad Universitaria, Distrito Federal
9574 1997 Ciudad Universitaria, Distrito Federal
9575 1997 Ciudad Universitaria, Distrito Federal

Estudio histopatológico
Las muestras fijadas en formalina al 10% de piel, hígado, riñón, corazón e
intestino, se incluyeron en cápsulas, fueron procesadas e incluidas en
bloques de parafina. Posteriormente, fueron cortadas con un micrótomo. Las
laminillas se tiñeron con la técnica de rutina Hematoxilina y Eosina (HE).

Se creó una tabla para describir la presencia y severidad de las principales
lesiones características de FV-3 observadas: focos de necrosis en hígado,
focos de necrosis en riñón, edema subcutáneo, inflamación en riñón y de
cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos en piel. La severidad de las lesiones
se dividieron en: Sin lesión, escaso, moderada, abundante. jjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjj

Extracción de ADN viral de las muestras de órganos
Con el fin de eliminar el formaldehído de los tejidos, cada muestra fue
sometida a un pre-tratamiento de lavado con solución salina fisiológica
amortiguado con fosfatos (PBS) en abundancia durante 12 hr. Para la
extracción de ADN de los tejidos fijados, se utilizó el protocolo descrito por
Kattenbelt (2000) donde se tomaron 200 mg de cada una de las muestras de
cada uno de los órganos haciendo una mezcla de hígado, riñón y piel. Los
órganos se cortaron en trozos pequeños utilizando un bisturí. Los fragmentos
fueron colocados en un tubo de fondo cónico de 15 ml y se le agregaron 1.5
ml de solución de lisis (25 mM tris HCl pH 8.0, 25 mM EDTA pH 8.0, 1% SDS,
24

proteinasa K 0.2 mg/ml) y fueron incubados durante 12 hr a 50°C.
Posteriormente, se agregó 1 volumen de fenol-cloroformo 1:1 y se
homogenizaron vigorosamente con un agitador vortex. Después fueron
centrifugadas a 10,200 rpm durante 2 min y se recuperó el sobrenadante,
este procedimiento se repitió dos veces. Al sobrenadante recuperado se le
agregó 1/10 de volumen de acetato de sodio 3M pH 6.0 y 2.5 volúmenes de
etanol al 100% frío. La muestra se dejó reposando por 5 min a temperatura
ambiente y se centrifugó a 11,200 rpm por 12 min. Finalmente, la pastilla fue
resuspendido en 25 ɥ l de TE 10:1 (10 mM Tris HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH
8.0) y congelado a -70°C hasta su uso. 47

Amplificación del gen de la proteína mayor de la cápside del Ranavirus
tipo 3.
Para la detección específica de la MCP del Ranavirus tipo 3 se diseñaron un
par de iniciadores, los cuales amplifican un segmento conservado de la MCP.
Para el diseño de estos iniciadores se emplearon las secuencias disponibles
en las bases de datos del (GenBank) del NCBI (National Center for
Biotechnology Information). La secuencia de dichos iniciadores es: sentido 5’
GACTTGGCCACTTATGAC 3’ y contrasentido 5’ GTCTCTGGAGAAGAAGAA
3’. Las condiciones en la PCR fueron: un ciclo de desnaturalización inicial de
95°C por 5 min, 30 ciclos de desnaturalización a 95°C por 1 min, alineamiento
a 54°C por 1 min y extensión a 72°C por 1 min, y un ciclo de extensión final a
25

72°C por 5 min. Para verificar que los resultados obtenidos en la PCR y evitar
falsos negativos por inhibidores en la muestra se utilizó un control interno (CI)
de 700 pares de bases (pb), a una concentración de ADN de 0.26 ɥ g/ul. Los
productos amplificados, tanto de la muestra (500pb) como del control interno
(700pb), fueron visualizados en geles de agarosa al 1.5 %, fueron teñidos con
bromuro de etídio por 10 min y se utilizó en cada gel el marcador molecular
de 100 a 5000 pb (Generuler). 47

Al realizar la electroforesis, en cada pozo se agregaron los siguientes
productos: 2 ɥ l de buffer de carga (1x) y 2ɥ l del amplificado de la muestra de
ADN junto con 2 ɥ l del control interno y se empleó un marcador molecular
(Generuler) de 100 a 5000 pb.

Construcción del control interno de amplificación (CIA).
El CIA consiste en la amplificación de la secuencia del gen de resistencia a
kanamicina (APH) del ADN del plásmido PUC4K, que al mismo tiempo
amplifica con el ADN de la MCP del ranavirus durante la PCR. 48

La función del control interno de amplificación es distinguir resultados
negativos verdaderos de falsos resultados negativos causados por un mal
funcionamiento de la PCR debido a inhibiciones, deterioro de los reactivos de
PCR, etc. 48
26

Para obtener el ADN del plásmido se hizo una transfección de bacterias de
Escherichia coli con PUC4K y se cultivó durante 12 hrs. en medio LB con
Kanamicina (100 mg/ml) y se amplificó mediante la técnica de PCR (Figura 7).

El CIA debe encontrarse a una concentración mínima detectable para que el
resultado no se vea afectado por la competencia entre el ADN del CIA y el
ADN de la muestra, por lo que se cuantificó por densidad óptica el ADN del
producto, por último se realizaron diluciones con el fin de encontrar la
concentración mínima detectable del control interno. 48

Figura 7. Construcción del control de amplificación interna.
47

Se diseño el CIA a partir de la secuencia de resistencia a kanamicina de
PUC4K con una longitud de 700 pb y la siguiente secuencia: Sentido 5’
GTCTCTGGAGAAGAAGAAATGAGCCATATTCAACGGG 3’ y contrasentido
5’ GACTTGGCCACTTATGACTTAGAAACTCATCGAGCATC 3’

Los iniciadores coinciden reconocen una secuencia del gen de resistencia
APH, por lo cual durante la PCR quedará unido a los iniciadores de FV3 y
amplificará (Figura 8).

Figura 8. Unión del gen APH con los iniciadores de FV3

Análisis estadístico
Con los resultados obtenidos en los exámenes histopatológicos y los
obtenidos en la PCR se analizaron las frecuencias relativas y absolutas para
realizar un gráfico de barras para cada técnica.

RESULTADOS
El estudio histopatológico se realizó con el fin de identificar lesiones
características de FV-3 tales como: cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos,
hemorragias inflamación linfocítica, edema y necrosis. De esta manera se
podrá establecer un diagnostico presuntivo.

De las muestras analizadas por medio de las técnicas histológicas, 18/30
mostraron lesiones sugerentes a ranavirus tipo 3, de las cuales en 15
muestras se observó edema subcutáneo, 12 exhibieron necrosis hepática
(Figura 10), 7 con necrosis renal (Figura 11), 4 presentaron cuerpos de
inclusión eosinofilicos en piel (Figura 12). Las 18 muestras con lesiones
sugerentes de infección por ranavirus, presentaron inflamación linfocítica en
riñón (Figura 10). Ver Tabla 4 y Figura 9).

Figura 9. Comparación de frecuenciasde las muestras clasificadas como sugerentes a FV-3
y sin lesiones según la observación histopatológica

Tabla 4

LESIONES DE LAS 18 MUESTRAS SOSPECHOSAS OBSERVADAS POR MEDIO DE
HISTOLOGÍA

Muestras Necrosis Necrosis Edema SC Inflamación Cuerpos de
en hígado en riñón en riñón inclusión IC
en piel

5037-7 + - - + + -
5037-45 - + + + + + + + + + +
6110-3 - + + + + + -
6110-6 - + + + + + + -
6110-14 + + - + + + + + -
6110-15 + + - + + + + -
6110-17 +++ - + + + +
6110-18 - - + + + + +
6110-20 - - + + + + -
6111-5 + + + + + + + -
6111-7 - + + + + + + +
6111-11 + - + + + + + + -
6111-12 + - - + + + -
6111-17 + - - + + -
6111-20 + - + + -
9571 + + - + + -
9572 + + + + + + + -
9573 + + + + + + + + + -

Total 12/18 7/18 15/18 18/18 4/18

67% 39% 83% 100% 22%

Clasificación de la lesión. (-): Sin lesión, (+): Escaso, (++): Moderado, (+++): Severo

Figura 10. Hígado. Foco de necrosis e inflamación linfocítica. (flecha) H-E 400X

Figura 11. Riñón. Necrosis tubular (Flecha negra) y edema intersticial moderado (Flecha blanca), H-E
400X

10 ɥm

Figura 12. Piel. Cuerpo de inclusión intracitoplasmáticos en los queratinocitos del estrato espinoso
(Flecha) H-E 400X

10 ɥm
33

Amplificación de la secuencia de la proteína mayor de la cápside
Se utilizó la técnica de PCR para amplificar un segmento del genoma la MCP
del virión, con un tamaño de aproximadamente 500 pb, es la secuencia más
utilizada alrededor del mundo debido que es útil para identificar cualquier
especie de ranavirus, cabe mencionar que el único ranavirus que afecta a
anuros es el FV-3. Este segmento ha sido empleado con éxito por Pearman
(2004), Fox (2006), Mazzoni (2009), entre otros. 33, 49-51

Otras secuencias como las de los genes de expresión rápida (IEG) del FV-3:
Centro de Control de Impronta-169 (ICR-169) y Centro de Control de
Impronta-489 (ICR-489) y las secuencias de las proteínas de expresión rápida
del FV-3: Proteína de célula infectada-18 (ICP-18) y Proteína de célula
infectada-46 (ICP-46) también son utilizadas, sin embargo son específicas del
FV-3 y no sirven para identificar otras especies de Ranavirus 63-65

Al realizar la técnica de PCR, ninguna de las 30 muestras amplificó el
segmento del Ranavirus tipo 3 (Tabla 4, Figura 13-18).

Tabla 4

RESULTADOS DE LA TECNICA DE PCR, ANALIZANDO LAS 30 MUESTRAS EN RANAS
DE 4 DIFERENTES LOCALIDADES DE MÉXICO

Localidad Positivo Negativo

Yahualica de González Gallo, Jalisco 0 10

Ojuelos de Jalisco, Jalisco 0 10

Guanajuato 0 5

Ciudad Universitaria, Distrito Federal 0 5

Total 0 30

Con la finalidad de evitar falsos negativos se agregó el control interno. El cual
amplificó en 28/30 muestras, demostrando que no hubo falsos negativos y
confirmando que el proceso de PCR se realizó correctamente. En 2/30
muestras el control interno no amplificó (Figura 16 y 18).

Figura 13. Resultados de la técnica de PCR para las muestras de Guanajuato: (1) 5037-7, (2) 5037-21,
(3) 5037-25, (4) 5037-27, (5) 5037-45. No hubo amplificación para la MCP. Marcador molecular
Generuler (M), Control interno de 700 pb (CI), Posición esperada para la amplificación de la secuencia
de la proteína mayor de la cápside de 500 pb (MCP). Teñido con bromuro de etídio (2µg/ml).

Figura 14. Resultados de la técnica de PCR para las muestras de Yahualica de González Gallo: (1)
6110-1, (2) 6110-3, (3) 6110-4, (4) 6110-5, (5) 6110-6. No hubo amplificación para la MCP. Marcador
molecular Generuler (M), Control interno de 700 pb (CI), Posición esperada para la amplificación de la
secuencia de la proteína mayor de la cápside de 500 pb (MCP). Teñido con bromuro de etídio (2µg/ml).
36

Figura 15. Resultados de la técnica de PCR para las muestras de Yahualica de González Gallo: (1)
6110-14, (2) 6110-15, (3) 6110-17, (4) 6110-18, (5) 6110-20. No hubo amplificación para la MCP.
Marcador molecular Generuler (M), Control interno de 700 pb (CI), Posición esperada para la
amplificación de la secuencia de la proteína mayor de la cápside de 500 pb (MCP). Teñido con bromuro
de etídio (2µg/ml).

Figura 16. Resultados de la técnica de PCR para las muestras de Ojuelos de Jalisco: (1) 6111-2, (2)
6111-5, (3) 6111-7, (4) 6111-9, (5) 6111-11. No hubo amplificación para la MCP. Marcador molecular
Generuler (M), Control interno de 700 pb (CI), Posición esperada para la amplificación de la secuencia
de la proteína mayor de la cápside de 500 pb (MCP). Teñido con bromuro de etídio (2µg/ml).

Figura 17: Resultados de la técnica de PCR para las muestras de Ojuelos de Jalisco: (1) 6111-12, (2)
6111-15, (3) 6111-17, (4) 6111-20, (5) 6111-25. No hubo amplificación para la MCP. Marcador
molecular Generuler (M), Control interno de 700 pb (CI), Posición esperada para la amplificación de la
secuencia de la proteína mayor de la cápside de 500 pb (MCP). Teñido con bromuro de etídio (2µg/ml).

Figura 18: Resultados de la técnica de PCR de las muestras de Cd. Universitaria (1) 9571, (2) 9572, (3)
9573, (4) 9574, (5) 9575. No hubo amplificación para la MCP. Marcador molecular Generuler (M),
Control interno de 700 pb (CI), Posición esperada para la amplificación de la secuencia de la proteína
mayor de la cápside de 500 pb (MCP). Teñido con bromuro de etídio (2µg/ml).

DISCUSIÓN
El ranavirus tipo 3 es un virus icosaédrico perteneciente a la familia
Iridoviridae que afecta a más de 100 especies de anfibios, causa síndrome
hemorrágico en larvas y síndrome ulcerativo en adultos, llegando a ocasonar
mortalidad de hasta el 100%.19, 28, 33

La probabilidad de que el virus esté presente en el país es alta, Mazzoni
(2011) demostró que este virus además de encontrarse en los Estados
Unidos de América, se ha confirmado su presencia desde el año 2006 en
países como Venezuela, Argentina y Uruguay. 18,33

México es el quinto país con mayor diversidad de anfibios en el mundo,
estimándose en 361 especies. De estar presente el ranavirus en nuestro país
tendría un gran impacto ecológico negativo, la resistencia del ranavirus al
medio ambiente y la gran mortalidad que causaría, representaría un grave
problema.52

Teacher (2010), demostró que a causa de la presencia de ranavirus en
Inglaterra disminuyo un 81% la población de Rana temporaria entre 1997 y
2008, mientras que Miller (2002) describe que las poblaciones de Ambystoma
tigrinum en Canadá y de Pelophylax esculentusen Dinamarca, han
disminuido considerablemente e incluso se encontraron muy pocos individuos
39

de Ambystoma maculatum en sitios conocidos como zonas de reproducción
en Carolina del Norte en Estados Unidos de América.17, 53,54

Económicamente, la presencia del ranavirus en nuestro país causaría
grandes pérdidas a los ranicultores esto se debe a que México es el sexto
mayor productor de ancas de ranas a nivel mundial y produciendo 174 ton al
año, de las cuales se exporta casi 1 ton a los Estados Unidos de América
(figura 19). 55

Figura 19. Principales productores de rana a nivel mundial.
55

De las muestras analizadas en el estudio histopatológico, se encontraron en
total 18 muestras sugerentes a infección por FV-3 debidas a lesiones
microscópicas tales como: la presencia de focos de necrosis en hígado y
riñón, presencia de células inflamatorias (linfocitos), existencia de edema en
hígado y riñón y la existencia de cuerpos de inclusión intracitoplásmicos en
las células de la epidermis. Es común encontrar este tipo de lesiones en el
síndrome ulcerativo de FV-3 (Tabla 3, Figura 9).

Comparando los hallazgos identificados en el presente estudio con el de
Mazzoni (2011) en Brasil y Une (2011) en Japón estudiaron dos diferentes
poblaciones de Lithobates catesbiana destinadas a la producción de carne
que resultaron ser positivas a ranavirus tipo 3. Las lesiones histológicas en
ambas poblaciones fueron: cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos en piel,
edema, áreas de necrosis en hígado, necrosis tubular y glomerular. 7,8

A pesar de que 18/ 30 muestras presentaban algunas de las lesiones
microscópicas que sugerían una infección por Iridovirus como necrosis
hepática y renal, cambios vasculares como edema y los cuerpos de inclusión
en piel, se requiere confirmar el agente con otras pruebas diagnosticas. La
OIE recomienda diferentes pruebas para identificar al ranavirus, como:
histopatología, para identificar focos de necrosis y cuerpos de inclusión
intracitoplasmáticos en hígado, riñón y/o piel. La microscopia electrónica para
41

observar al virión. El aislamiento del virus usando diferentes cultivos celulares
como BF-2 (bluegill fry), FHM (fathead minnow), EPC (epithelioma
papulosum cyprini) y CHSE-214 (Chinook salmon embryo cell line),
inmunohistoquimica para detectar la reacción antígeno-anticuerpo y la técnica
de PCR para amplificar una secuencia del genoma del virus.20

En este caso, al tratarse de muestras conservadas en formalina, no podría
emplearse la técnica de aislamiento viral. Por otro lado, el método de
conservación en formalina al 10% es una técnica válida y ampliamente
utilizada para fijar muestras, conservando la estructura de los tejidos y del
virión junto con la de sus ácidos nucleicos y proteínas por varios años. Palero
(2010) extrajo ADN de un tejido fijado en formalina al 10% por más de 25
años. Entonces en este caso, a excepción del aislamiento viral, sería valido
utilizar cualquiera de las técnicas recomendadas por la OIE, ya que el virión
conserva su estructura, proteínas y ácidos nucleicos. 20,54

En 15 de las muestras se observó edema pudiendo originarse por el cambio
originado en la presión hidrostática, al aumentar la permeabilidad de los
vasos sanguíneos durante una reacción infamatoria.

En 12 de las muestras se encontró necrosis en hígado y 7 muestras
mostraron necrosis en riñón y todas las muestras tenían infiltración linfocítica.
Estas lesiones posiblemente son causadas por un agente infeccioso.

En 4 muestras se observaron cuerpos de inclusión eosinofílicos
intracitoplasmáticos, lo cual sugiere un agente viral, como los herpesvirus y
adenovirus son agentes que también son capaces de producirlos. No
obstante, estos cuerpos de inclusión son intranucleares a diferencia de los del
Ranavirus, que son intracitoplasmáticos y los de adenovirus son basofílicos.
Miller (2011) señala que los cuerpos de inclusión son intranucleares, sin
embargo solo se han encontrado en la etapa terminal de la enfermedad en
Ambystoma tigrinum y no se han identificado en otras especies. Los
herpesvirus se diferencian de los ranavirus por la formación de tumores en
piel y riñón, mientras que los adenovirus causan focos de necrosis, infiltrado
heterofílico e inclusiones intranucleares afectando principalmente el tracto
respiratorio. 17, 56-59, 62

Se debe considerar la participación de otros agentes como Aeromona
hydrophyla, Edwardsiella tarda, Chryseobacterium meningosepticum, que
ocasionan lesiones similares. Los primeros tres agentes causan inflamación,
edema, hemorragia, focos de necrosis y úlceras en piel, aunque ninguno de
estos agentes produce cuerpos de inclusión 56-61
43

Incluso el agente Batrachochytrium dendrobatidis puede causar lesiones
similares como ulceración de la piel y hemorragias. De estar presente, se
observarían los esporangios de este hongo y queratinización en la piel
durante el estudio histopatológico, los cuales que no fueron identificados en el
presente estudio. 53-59

Los cuerpos de inclusión en la epidermis no emiten el diagnóstico definitivo
de ranavirus, y pueden asociarse a cúmulos de proteína, pigmentos y
sustancias minerales. 63

Se utilizó la técnica de PCR para identificar la MCP del FV-3 en las muestras
de Lithobates montezumae. En las muestras de rana Moctezuma (Lithobates
montezumae) no hubo amplificación de la MCP del FV-3. Esto puede deberse
a la ausencia del virus en las muestras analizadas, que el virus se haya
degradado al no tener un buen manejo durante la recolección de la muestra o
que la cantidad del virus presente en la muestra no haya sido suficiente para
ser detectado por la PCR (1 ng/μl) o el gel de agarosa (10 ng/μl).

En dos muestras (6111-9 y 9573) no amplificó el control interno. Esto
posiblemente se deba a factores inhibidores de la PCR. Las muestras podrían
haber tenido factores inhibidores de PCR derivados de la muestra, en este
44

caso la melanina y del proceso de extracción del ADN como: residuos de
etanol, solventes orgánicos, sales y/o detergentes. 50, 51

El adicionar un control positivo en otro pozo del gel serviría para tener un
resultado más confiable, ya que en el caso de que se haya amplificado ADN
mediante la PCR, serviría para comparar el tamaño de estas bandas con el
control positivo y evitar así falsos positivos, en caso de no amplificar
significaría que se cometió algún error durante el proceso de extracción de
ADN. Sin embargo, la enfermedad por ranavirus es considerada exótica en
nuestro país, por lo que esta prohibido traer el agente a México según la Ley
Federal de Sanidad Animal. En caso de sospechar de una enfermedad
exótica en México se debe notificar al Servicio Nacional de Sanidad Inocuidad
y Calidad Agroalimentaria (SENASICA/SAGARPA), recolectar y enviarle las
muestras sospechosas para que confirmen su presencia o ausencia,
mediante el uso de las pruebas diagnósticas adecuadas.

Se debe añadir un control negativo, en el que se agregarán todos los
reactivos menos ADN, esperando que no haya amplificación, si existiera
amplificación significaría que algún reactivo esta contaminado. 63

Se debe considerar que el área nacional de distribución del anfibio ha
disminuido significativamente desde el año 1995 hasta la época actual (Figura
3) por lo que se recomendaría realizar otro estudio para conocer si el virus se
encuentra actualmente en territorio mexicano. 43

Se recomienda utilizar muestras más recientes de un anfibio que sea igual o
más susceptible al virus, que tenga una mayor distribución en México, como
la rana toro (Lithobates catesbiana), sería lo más adecuado para conocer si
existe el FV-3 en territorio mexicano. 66

Si se desea conocer conmayor confianza la situación de Lithobates
montezumae respecto a ranavirus, se debería solicitar un permiso de muestro
a la Secretaría del Medio Ambiente y Recursos Naturales (SEMARNAT),
exponiendo el motivo de la recolección, o bien, recolectar agua y heces en
zonas donde se conozca que la densidad de Lithobates montezumae sea
alta. Harp (2006) menciona que se puede obtener el virión de este tipo de
muestras. 38

A pesar de que no se haya comprobado la presencia del FV-3 en el país es
necesario que se sigan tomando las medidas adecuadas para que las
diferentes especies de anfibios que existen en México no se vean afectadas
por el virus, ni se disemine la enfermedad. Por ejemplo, exigir el certificado
46

zoosanitario de los anfibios que ingresen al país y dejarlos en período de
cuarentena. Además se debe hacer monitoreos constantes para verificar el
estado de la población de Lithobates montezumae

CONCLUSIÓNES
 No se amplificó la proteína Ranavirus tipo 3 en alguna de las 30
muestras estudiadas de Lithobates montezumae. esto puede deberse
a que el virus no haya estado presente en la muestras analizadas, se
haya degradado o no haya la cantidad suficiente de virus en la
muestra.

 Es necesario que las autoridades zoosanitarias de México realicen un
monitoreo en las poblaciones de anfibios en México para descartar la
posible presencia del virus en México

PERSPECTIVAS
Se recomienda realizar un muestreo más grande de Lithobates
montezumae para conocer la distribución actual de la especie y
conocer los factores que están provocando la disminución de sus
poblaciones.
47

 Para conocer la situación actual de México respecto al ranavirus tipo 3
se recomienda realizar un estudio utilizando un anfibio con mayor
distribución en el país como Lithobates catesbiana.

 Si se desea utilizar una especie bajo protección especial para
identificar al FV-3 se sugiere utilizar muestras de agua, sedimento y
heces de donde habiten estas especies.

 Se recomienda utilizar una prueba diagnóstica más sensible como la
RT-PCR para identificar a la MCP del FV-3.

 Es necesario utilizar técnicas de diagnóstico, como: microscopía
electrónica, aislamiento viral, inmunohistoquimica, etc., para identificar
al agente causal de las lesiones observadas mediante la
histopatología.
.

Bibliografía:

1. Browne R., Mendelson J., McGregor Reid G., Alford R., Zippel K. y
Pereboom J. Amphibian Conservation Research Guide.
REHABILITATION. Bélgica: IUCN/ASG/Amphibian Ark, 2009: 23.

2. Dirzo, R. y Raven P.Global state of biodiversity and loss. Rev.
Environ. 2003; 28: 138-167.

3. Schock D., Bollinger T. y Collins J. Mortality Rates Differ Among
Amphibian Populations Exposed to Three Strains of a Lethal
Ranavirus. Rev. Ecohealth. 2010; 6(3): 438-448.

4. Dszak P., Berger L., Cunningham A., Hyatt A., Green D. y Speare R.
Emerging Infectious Diseases and amphibian population declines.
Rev. Emerging Infectious Diseases. 1999; 269: 347–350. 5(6): 735-
736.

5. Santos-Barrera G. Enfermedades infecciosas y su papel en la
declinación mundial de las poblaciones de anfibios. Rev.
Biodiversitas CONABIO. 2004; 56: 1-2.
49

6. Granoff A., Came E., Rafferty A. The isolation and properties of
viruses from Rana pipiens: their possible relationship to the renal
adenocarcinoma of the leopard frog. Rev. Annals of the New York
Academy of Sciences. 1965; 126: 237-255.

7. Mazzoni R. Current understanding of Ranaviruses in South America.
First International Ranavirus Symposium memories; 2011Julio 8;
Minneapolis (Minnesota) EUA. EUA: Joint Meeting of Ichtyologists and
Herpetologists, AC, 2011.

8. Une Y. Emergence of Ranaviruses in Japan. First International
Ranavirus Symposium memories; 2011Julio 8; Minneapolis
(Minnesota) EUA. EUA: Joint Meeting of Ichtyologists and
Herpetologists, AC, 2011.

9. Duffus A. Ranaviruses in European Amphibians. First International
Ranavirus Symposium memories; 2011Julio 8; Minneapolis
(Minnesota) EUA. EUA: Joint Meeting of Ichtyologists and
Herpetologists, AC, 2011.
50

10. Gray M. Are Ranaviruses Capable of Causing Population Extirpations
and Contributing to Species Declines? First International Ranavirus
Symposium memories; 2011Julio 8; Minneapolis (Minnesota) EUA.
EUA: Joint Meeting of Ichtyologists and Herpetologists, AC, 2011.

11. Comisión Nacional para el conocimiento y uso de la biodiversidad.
México. [http://www.conabio.gob.mx/] CONABIO. c1992-2012
[Actualizada 20 Enero 2010; citado 12 de Febrero 2012]. Rana Toro.
Disponible.en: http://www.conabio.gob.mx/invasoras/index.php/Rana
_toro.

12. Ávila-Villegas H., Rodríguez-Olmos L. y Lozano-Román L. Rana toro
(Lithobates catesbeianus): anfibio introducido en Aguascalientes,
México. Rev. Bol. Soc. Herpetol. Mex. 2007; 15(1):16-17.

13. Comisión Nacional para el conocimiento y uso de la biodiversidad.
México. [http://www.conabio.gob.mx/] CONABIO. c1992-2012
[Actualizada 20 Enero 2010; citado 12 de Febrero 2012].Xenopus
laevis. Disponible.en: http://www.conabio .gob.mx/conocimiento/exoti
cas/fichaexoticas/Xenopuslaevis00.pdf.

http://www.conabio.gob.mx/
http://www.conabio.gob.mx/invasoras/index.php/Rana%20_toro
http://www.conabio.gob.mx/invasoras/index.php/Rana%20_toro
http://www.conabio.gob.mx/
51

14. Phillips B. y Shine R. The morphology, and hence impact, of an
invasive species (the cane toad, Bufo marinus): changes with time
since colonization. Rev. Animal Conservation. 2005; 8:407-413.

15. Ballue F.Introduction to conservation genetics. Introduction. What
causes extinctions?. Estados Unidos de America: Editorial:
Cambridge, 2010: 7-8.

16. Velázquez V y Vega C. Los peces como indicadores del estado de
salud de los ecosistemas acuáticos. Rev Biodiversitas. 2004; 52: 12-
15.

17. Miller D., Gray M. y Storfer. Ecopathology of Ranaviruses Infecting
Amphibians. Rev. Viruses. 2011; 3: 2351-2373.

18. Gray M., Miller D. y Hoverman J. Ecology and pathology of amphibian
ranaviruses. Rev. Diseases of aquatic organisms. 2009; 87: 243-266.

19. Carey C., P. Pessier A. y Peace A. Pathogens, infectious disease,
and immune defenses. Pathogens, Infectious Disease, and Immune
Defenses. Estados Unidos de America Editorial: Harpercollins, 2003:
127-136.
52

20. Organización mundial de sanidad animal [Base de datos]. Paris: La
Asociación c2003-2012 [Actualizada 20 Junio 2011; citado 20 Junio
2011]. Incidencia de la enfermedad por país. Disponible en:
http://web.oie.int/wahis/public.php.

21. Chacón A., Díaz De Pascual A., Barrio C. Presencia de bufo
glaberrimus (Anura: bufonidae) en Venezuela. Rev. Acta Biológica
Venezuelica. 2000; 20: 65-69.

22. Speare R, Freeland W y Bolton S. A possible Iridovirus in erythrocytes
of Bufo marinus in Costa Rica. Rev. Journal of wildlife diseases. 1991;
27(3):457-462.

23. Fish and Wildlife Services [www.fws.org] Washington D.C.: Fish and
Wildlife Services, INC.; c1956-2012 [Actualizada 17 Febrero 2012;
Citada 24 Abril 2012]. Petition: To List All Live Amphibians in Trade as
Injurious Unless Free of Batrachochytrium dendrobatidis. Disponible
en: http://www.fws.gov/fisheries/ANS/pdf_files/Petition_Salazar_Bd_
amphibian.pdf.

http://web.oie.int/wahis/public.php
http://www.fws.gov/fisheries/ANS/pdf_files/Petition_Salazar_Bd_%20amphibian.pdf
http://www.fws.gov/fisheries/ANS/pdf_files/Petition_Salazar_Bd_%20amphibian.pdf
53

24. Unión Internacional para la conservación de la naturaleza: Lista roja
de especies amenazadas [Base de datos]. United Kingdom: La
asociación c2001-2011 [Actualizada 1 Noviembre 2011; citado 28
Noviembre 2011].Disponible en: http://www.iucnredlist.org/apps/redlist
/details/58671/0.

25. Comisión Nacionalpara el conocimiento y uso de la biodiversidad.
México. [http://www.conabio.gob.mx/].CONABIO c1992-2012.
[Actualizada 20 Junio 2011; citado 28 Agosto 2009]. Rana
montezumae (Rana de Moctezuma). Área de distribución potencial.
Disponible.en: http://www.conabio.gob.mx/informacion/metadata/gis
/rana_montgw.xml?_httpcache=yes&_xsl=/db/metadata/xsl/fgdc_html.
xsl&_indent=no.

26. Integrated Taxonomic Information System [http://www.itis.gov].
Estados Unidos de America: La Asociación c1995-2012 [Actualizada
22Octubre 2010; citado 7 Marzo 2012]. Lithobates montezumae.
Disponible.en: http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search
_topic=TSN&search_value=775101.

http://www.iucnredlist.org/apps/redlist
http://www.conabio.gob.mx/informacion/metadata/gis
http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search
54

27. Secretaria de medio ambiente y recursos naturales
[http://www.semarnat.gob.mx]. Mexico: SEMARNAT c2000-2012
[Actualizada 23Septiembre 2009; citado 1 Abril 2012]. NORMA
Oficial Mexicana NOM-059-ECOL-2010, Protección ambiental-
Especies nativas de México de flora y fauna silvestres-Categorías de
riesgo y especificaciones para su inclusión, exclusión o cambio-Lista
de especies en riesgo. Disponible en: http://www. Mexiconservacion
.org/Documentos/NOM-ECOL-059-2010A.pdf.

28. Bollinger T., Mao J., Shock D., Brigham M. y Chinchar G. Pathology,
isolation, and preliminary molecular characterization of a novel
iridovirus from tiger salamanders in Saskatchewan. Rev. Journal of
Wildlife Diseases. 1999; 35(3):413-429 28.

29. Eaton H., Metcalf J., Penny E., Tcherepanov V., Upton C., Brunetti C.
Análisis genómico comparativo de la familia Iridoviridae: volver a
anotar y definir el conjunto básico de los genes Iridovirus. Rev.
Virology Journal. 2007; 4:11.

30. International Comitte on Taxonomy of Virus. Estados Unidos de
Ámerica. [http://ictvonline.org/index.asp] ICTV. C2005-2012
[Actualizada 10 Febrero 2012; citado 1 de Octubre 2012]. Rana Toro.
Disponible.en: http://ictvonline.org/virusTaxonomy.asp?version=2011

31. Chinchar G., Kwang Y. y Jancovich J. The Molecular Biology of Frog
Virus 3 and other Iridoviruses Infecting Cold-Blooded Vertebrates.
Rev. Viruses. 2011; 3: 1959-1985.

32. Lightne D. Paris: La Asociación c2003-2012 [Actualizada 3Marzo
2012; citado 3 Marzo 2012]. Manual de Pruebas de Diagnóstico para
los Animales Acuáticos 2012. Disponible en:
http://www.oie.int/es/manual-de-pruebas-de-diagnostico-para-los-
animales-acuaticos/.

33. Waltsek T., Miller D., Drecktrah B., Briggler J., MacConell B., Hudson
C., et.al. Isolation of Frog Virus 3 from Pallid Sturgeon
(Scaphirhynchusalbus) Suggests an Interclass Host Shift. First
International Ranavirus Symposium memories; 2011Julio 8;
Minneapolis (Minnesota) EUA. EUA: Joint Meeting of Ichtyologists and
Herpetologists, AC, 2011.
http://ictvonline.org/index.asp
http://ictvonline.org/virusTaxonomy.asp?version=2011
http://www.oie.int/es/manual-de-pruebas-de-diagnostico-para-los-animales-acuaticos/
http://www.oie.int/es/manual-de-pruebas-de-diagnostico-para-los-animales-acuaticos/
56

34. Mazzoni R,,AlbenonesJ.,Fleury L.,Elsner D.,Wilia M.,Nunes I., et. al.
Mass mortality associated with a frog virus 3-like Ranavirus infection in
farmed tadpoles Rana catesbeiana from Brazil. Rev. Diseases of
aquatic organisms. 2009; 86(3): 181-191.

35. Chinchar G.. Ranaviruses: Past, Present and Future. First
International Ranavirus Symposium memories; 2011Julio 8;
Minneapolis (Minnesota) EUA. EUA: Joint Meeting of Ichtyologists and
Herpetologists, AC, 2011.

36. Bosch J. Nuevas amenazas para los anfibios: enfermedades
emergentes. Rev. MUNIBE, 2003; 16: 56-70.

37. Marschang R., Stohr A., Blahak S. Papp T., Caeiro M., Alves A., et. al.
Ranavirus in European reptiles. First International Ranavirus
Symposium memories; 2011Julio 8; Minneapolis (Minnesota) EUA.
EUA: Joint Meeting of Ichtyologists and Herpetologists, AC, 2011.

38. Warne R., Crespi E., Brunner J. Escape from the pond: stress and
developmental responses to ranavirus infection in wood frog tadpoles.
Rev. Functional Ecology. 2011; 25: 139-146.

39. Harp E., Petranka J. Ranavirus in wood frogs (Rana sylvatica):
potential sources of transmission within and between ponds. Rev.
Journal of Wildlife Diseases. 2006; 42(2): 307-318.

40. Brunner J., Richards K., Collins J. Dose and host characteristics
influence virulence of ranavirus infections. Rev. Oecologia. 2005;
144:399-406.

41. Docherty D., Meteyer C., Wang J., Mao J., Case S. y Chinchar
Gregory V. Diagnostic and molecular evaluation of three iridovirus-
associated salamander mortality events. Rev. Journal of wildlife
Diseases. 2003; 39(3):556-566.

42. Wright- Brent K. y Whitaker R. Amphibian medicine and breeding.
Pathology of amphibia. Estados Unidos de America: Editorial:
Krieger, 2001: 418-419.

43. Teacher A., Garner T. y Nichols R. Population genetic patterns
suggest a behavioral change in wild common frogs (Rana temporaria)
following disease outbreaks (Ranavirus). Rev. Molecular Ecology.
2009; 18:3163-3172.

44. Une Y., Akiko S., Hiroki M., Katsuki N., y Masaru M. Ranavirus
Outbreak in North American Bullfrogs (Rana catesbiana). Rev.
Emerging Infecting Diseases. 2009; 15(7): 1146–1147.

45. Gallia L., Pereira A., Márquez A., Mazzoni R. Ranavirus detection by
PCR in cultured tadpoles (Rana catesbiana Shaw, 1802) from South
America. Rev.Aquaculture.2006; 257: 78-82.

46. Hoorfar J., Malorny B. , Abdulmawjood A. , Cook N. , Wagner M. y
Fach P. Practical Considerations in Design of Internal Amplification
Controls for Diagnostic PCR Assays. Rev. Journal of clinical
microbiology. 2004; 42(5): 1863-1868.

47. Kattenbelt A., Hyatt' A., Gould A. Recovery of ranavirus dsDNA from
formalin-fixed archival material. Rev. Diseases of aquatic organisms.
2000; 39: 151-154.

48. Hoorfar J., Malorny B., Abdulmawjood A., Cook N., Wagner M. y
Fach P. Practical Considerations in Design of Internal Amplification
Controls for Diagnostic PCR Assays. Rev. Journal of clinical
microbiology. 2004; 42(5): 1863-1868.

49. Fox S., Greer A., Torres-Cervantes R. y Collins J. First case of
ranavirus-associated morbidity and mortality in natural populations of
the South American frog Atelognathus patagonicus. Rev. Diseases of
aquatic organisms. 2006; 72: 87-92.

50. Pearman P., Garner T. Straub M. Y Greber U. Response of the italian
agile frog (Rana latastei) to a ranavirus, frog virus 3: a model for viral
emergence in naive populations. Rev. Journal of Wildlife Diseases.
2004; 40(4):660-669.

51. Nalc¸aciog˘ R.,Agah I.,Vlak Just Zihni D.˘ y VanOers M. The Chilo
iridescent virus DNA polymerase promoter contains an essential AAAAT
motif. Rev. Journal of General Virology. 2007; 88: 2488-2494.

http://jcm.asm.org/search?author1=A.+Abdulmawjood&sortspec=date&submit=Submit
http://jcm.asm.org/search?author1=N.+Cook&sortspec=date&submit=Submit
http://jcm.asm.org/search?author1=M.+Wagner&sortspec=date&submit=Submit
http://jcm.asm.org/search?author1=P.+Fach&sortspec=date&submit=Submit
60

52. Comisión Nacional para el conocimiento y uso de la biodiversidad.
México. [http://www.biodiversidad.gob.mx].CONABIO c1992-2012.
[Actualizada 20 Junio 2011; citado 17 Junio 2012]. Biodiversidad
mexicana. Anfibios. Disponible.en: http://www.biodiversidad.gob.mx
/especies/gran_familia/animales/anfibios/anfibios.html.

53. Teacher A., Cunningham A. y Garner T. Assessing the long-term
impact of Ranavirus infection in wild common frog populations. Rev.
Animal conservation. 2010; 13: 514-522.

54. Palero F., Hall S., Clark P., Johnston D., Mackenzie-dodds J. y Thatje
S. DNA extraction from formalin-fixed tissue:new light from the deep
sea. Rev. Scientia Marina. 2010; 74(3): 465-470.

55. Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la
Agricultura [http://www.fao.org] Software for fishery statistical time
series. C1945 [Citada 17 de Junio del 2012] Disponible en:
http://www.fao.org/fishery/statistics/software/fishstatj/en.

56. Mauel M., Miller D., Frazier K., E. Hines II M. Bacterial pathogens
isolated from cultured bullfrogs (Rana castesbeiana). Rev. J Vet
Diagn. 2002; 14:431–433.
http://www.biodiversidad.gob.mx/
http://www.fao.org/
http://www.fao.org/fishery/statistics/software/fishstatj/en
61

57. Yan-qing G., Xin-zhong C. Study on the Cultured Bullfrog Infected with
Edwardsiella tarda. Rev. Journal of Fujian fisheries; 2002; 65-69.

58. Schadich E., Cole A.. Pathogenicity of Aeromonas Hydrophyla,
Klebsiella pnemoniae and Proteus mirabilis to Brown Tree Frogs
(Litoria ewingii). Re. Comparative Medicine.2010; 60(2):114-117.

59. Hill W., Newman S., Craig L., Carter C., Czarra J,, Brown P. Diagnosis
of Aeromonas hydrophila, Mycobacterium species, and
Batrachochytrium dendrobatidis in an African Clawed Frog (Xenopus
laevis). Rev. Journal of the American Association for Laboratory
Animal Science. 2010; 49(2): 215-220.

60. Huys G., Pearson M., Kämpfer P., Denys R., Cnockaert M., Inglis V.,
et. al. Aeromonas hydrophila subsp. ranae subsp. nov., isolated from
septicaemic farmed frogs in Thailand. Rev. International Journal of
Systematic and Evolutionary Microbiology. 2003; 53(3):885-891.

61. Suykerbuyk P., Vleminckx K., Pasmans F., Stragier P.,Ablordey A., Thi
T., et. al. Mycobacterium liflandii Infection in European Colony of
Silurana tropicalis. Rev. Emerging Infectious Diseases. 2007; 13(5):
743-745.

62. Van Beurden S. and Engelsma M. Herpesviruses of Fish, Amphibians
and Invertebrates. Herpesviridae - A Look Into This Unique Family of
Viruses. Holanda: Editorial: Intech, 2012: 217-224.

63. Universidad Miguel Hernández de Elche [http://webvision. umh.es/].
Departamento de Histología. La asociación c1996-2012. [Actualizada
23 Diciembre 1998; citado 12 Abril 2012;].TEMA 17: PEROXISOMAS.
INCLUSIONES CITOPLASMATICAS. Disponible en: http://webvision
.umh.es/docencia/biocelular/temas/peroxisomas.html#ñ.

64. Jancovich J.,Mao Jinghe,Chinchar G.,Wyatt C.,Case S.,Sudhir K., et. al.
Genomic sequence of a ranavirus (family Iridoviridae) associated with
salamander mortalities in North America. Rev. Virology. 2003; 316: 90-
103.

65. Eguiarte L., Souza V. y Aguirre X. Ecología molecular. Guía práctica
sobre la técnica de PCR. México: Editorial: Universidad Nacional
Autónoma de México, 2007: 517-540.

66. Instituto Tecnológico Superior de Calkiní [http://www
.itescam.edu.mx] Unidad de Epidemiología Clínica y Bioestadística.
La asociación c2001-2012. [Actualizada 6 Marzo2001; citado 30 Abril
2012;].Determinación de tamaño muestral. Disponible en: http://www
.itescam.edu.mx/principal/sylabus/fpdb/recursos/r53794.PDF.

Portada
Contenido
Resumen
Introducción
Justificación Hipótesis Objetivo General
Objetivos Específicos
Materiales y Métodos
Resultados
Discusión
Conclusiones
Bibliografía