Distribucion-y-caracterizacion-molecular-de-mannheimia-haemolytica-y-pasteurella-multocida-en-las-principales-regiones-caprinas-del-pas

Vista previa del material en texto

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS DE LA 
PRODUCCIÓN Y DE LA SALUD ANIMAL 
 
DISTRIBUCIÓN Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE 
Mannheimia haemolytica Y Pasteurella multocida EN 
LAS PRINCIPALES REGIONES CAPRINAS DEL PAÍS 
 
 
 
TESIS 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
MAESTRÍA EN CIENCIAS DE LA PRODUCCIÓN Y DE LA SALUD ANIMAL 
 
 
 
PRESENTA: 
IMELDA MARTÍNEZ RAZO 
 
 
TUTOR PRINCIPAL 
DR. FRANCISCO AGUILAR ROMERO 
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA 
 
 
 
COMITÉ TUTOR 
DR. FRANCISCO J. TRIGO TAVERA 
SECRETARIO DE DESARROLLO INSTITUCIONAL 
DR. EFRÉN DÍAZ APARICIO 
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA 
 
 
 
 
MÉXICO, D. F. ABRIL 2013 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 2
DEDICATORIAS 
 
Dedicó este trabajo a ti, Javier Gómez, por ser la persona que me 
impulsa todos los días a seguir adelante y por apoyarme durante este 
proceso, aguantar mis días malos cuando las cosas no salían y 
siempre estar a mí lado. 
 
A mis padres porque me apoyan incondicionalmente y siguen guiando 
mi camino con sus enseñanzas. 
 
A mis hermanos, Griselda y Daniel. Además de Daniel Domínguez y 
Diego, mi sobrino. Porque siempre es un placer compartir con 
ustedes las metas logradas. 
 
A mis amigos que reforcé en esta etapa y a los nuevos que tuve la 
fortuna de conocerlos y trabajar junto con ustedes: Monse, Rosario, 
Rosa, Alma, Itzel, Ivonne, Juan, Ana, Selene, Beto, Magda, y espero 
no olvidar a alguien. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 3
AGRADECIMIENTOS 
 
Al Dr. Efrén, por depositar su confianza en mí para realizar este 
proyecto y por todo su apoyo para lograrlo. 
 
A mis tutores, Dr. Francisco Aguilar y Dr. Francisco Trigo, fue un 
placer trabajar con ustedes, gracias por enseñarme el camino y 
ayudarme con las eternas dudas. 
 
A la Dra. Beatriz Arellano por abrirme las puertas de la FMVZ cuando 
lo necesite y sé que siempre puedo contar con usted, gracias por sus 
consejos oportunos. 
 
A Gaby Palomares y Luis Núñez por estar siempre dispuestos a 
enseñar y guiarnos a todos. 
 
Al INIFAP y sus investigadores por su apoyo y amistad: Lucy, Dr. 
Marco Santillán, Dr. Luna, Mary, Isabel, Gisela, Dr. Víctor Tenorio, 
Dra. Laura Hernández, Sara. 
 
A Itzel Álvarez por ayudarme a organizarme en el proyecto y a 
trabajar todas las muestras que nos llegaron. 
 
A Daniel Martínez, mi hermano, por ayudarme en sus vacaciones con 
el pesado trabajo de laboratorio y sacarlo adelante a tiempo. 
 
A los chicos de servicio social y prácticas profesionales que me 
ayudaron con este trabajo y que con el trabajo continuo se fue 
formando una amistas: Monse, Julio César, Ana, Selene, Juan. 
Este trabajo fue financiado por el proyecto: Estudio epidemiológico de 
enfermedades que afectan la producción caprina en México”, 
SAGARPA-CONACYT 48599 y las becas otorgadas por el Fondo 
Sectorial de Investigación en Materia Agrícola, Pecuaria, Acuacultura, 
Agrobiotecnología y Recursos Filogenéticos-CONACYT. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 4
ÍNDICE 
 
Resumen 7 
Introducción 8 
 Antecedentes 8 
 Sistemas de producción 9 
 Complejo respiratorio 10 
 Taxonomía 13 
 Características generales de Mannheimia 
haemolytica y Pasteurella multocida 13 
Genoma y factores de virulencia de Mannheimia 
haemolytica y Pasteurella multocida 14 
 Cápsula 14 
Leucotoxina 15 
 Operón de la cápsula de Pasteurella multocida 16 
Técnicas de identificación de Mannheimia haemolytica 18 
Uso de genes constitutivos para tipificación 19 
 Gen sodA 20 
Técnicas de identificación de Pasteurella multocida 20 
Justificación 22 
Hipótesis 23 
Objetivo general 23 
Objetivos específicos 23 
Material y métodos 24 
Resultados 29 
Discusión 38 
Conclusiones 46 
Referencias 47 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 5
ÍNDICE DE FIGURAS 
 
Figura 1. Porcentaje de aislamientos recuperados de los 
 hisopos nasales 29 
Figura 2. Curva de disociación de Mannheimia haemolytica. 31 
Figura 3. Primera derivada negativa de Mannheimia 
haemolytica. 31 
Figura 4. PCR tiempo real para Mannheimia haemolytica. 32 
Figura 5. Curva de disociación de aislamientos positivos a 
Mannheimia haemolytica. 33 
Figura 6. PCR del gen lktA de Mannheimia haemolytica. 34 
Figura 7. PCR Múltiple de Pasteurella multocida. 35 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 6
ÍNDICE DE CUADROS 
 
Cuadro 1. Pruebas bioquímicas básicas para identificar a 24 
Pasteurella multocida y Mannheimia haemolytica. 
Cuadro 2. Secuencia de los iniciadores utilizados para 26 
identificar el gen sodA Mannheimia haemolytica. 
Cuadro 3. Secuencia de los iniciadores utilizados para 28 
el PCR múltiple capsular de Pasteurella multocida. 
Cuadro 4. Aislamientos obtenidos de Mannheimia haemolytica 30 
por estado. 
Cuadro 5. Aislamientos obtenidos de Pasteurella multocida 30 
por estado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 7
RESUMEN 
 
Distribución y caracterización molecular de Mannheimia haemolytica y 
Pasteurella multocida en las principales regiones caprinas del país 
La población caprina en México es de poco más de 9 millones de 
cabezas, siendo la segunda de América y la doceava a nivel mundial. 
A pesar de que las cabras contribuyen poco a la producción nacional, 
son el principal sostén de más de 320,000 familias localizadas 
principalmente en las zonas áridas y semiáridas del norte, en la 
Sierra madre del sur y en la zona del bajío. Las limitaciones que 
enfrenta el sistema de producción caprino son entre otras, el bajo 
ingreso económico, junto con problemas de sanidad donde no se 
cuenta con programas contra enfermedades que ocasionan pérdidas 
como es el caso de los problemas respiratorios donde no se realiza 
diagnóstico, ni prevención y lo más que se hace es tratar 
indiscriminadamente con antibióticos lo que causa resistencia 
bacteriana. El objetivo de este estudio es determinar la distribución y 
la caracterización molecular de aislamientos de Mannheimia 
haemolytica y Pasteurella multocida en cabras, en las principales 
zonas de explotación de esta especie en México. Se trabajaron 
rebaños en las zonas caprinas de los estados de Puebla, San Luis 
Potosí, Guerrero, Coahuila, Durango, Baja California Sur y 
Guanajuato. Previa identificación del padrón de productores, se 
realizaron muestreosdirigidos. Las muestras de exudado nasal de 
cabritos se obtuvieron con hisopos con medio de transporte de Ames. 
Las muestras se inocularon en placas de Agar Sangre, se incubaron a 
37°C durante 24 horas, se seleccionaron colonias sugerentes, se 
determinó su afinidad tintorial y morfología microscópica. A los 
cultivos puros se les realizaron la prueba de oxidasa y pruebas 
bioquímicas necesarias para determinar género y especie. A los 
aislamientos identificados como M. haemolytica se les caracterizó 
correctamente por PCR tiempo real a través del gen sodA, y se 
determinó la presencia del gen lktA como un factor de virulencia; a 
los aislamientos identificados como P. multocida se les determinó su 
biotipo utilizando la detección de los genes hyaD-hyaC para el biotipo 
A y el gen dcbF para el biotipo D, a través de PCR punto final. 
Asimismo, se realizó la tipificación somática por aglutinación en gel. 
Se aislaron 535 cepas, de las cuales se identificaron 46 cepas como 
M. haemolytica y siete aislamientos fueron negativos al PCR de lktA. 
Para P. multocida, se obtuvieron ocho aislamientos que fueron 
clasificados como D:3. Las pruebas moleculares fueron más 
contundentes para la identificación de estos microorganismos. 
Coahuila, San Luis Potosí y Baja California son los estados con mayor 
número de aislamientos. 
 
 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 8
INTRODUCCIÓN 
 
Antecedentes 
 
El inventario 2009 de caprinos en México, de acuerdo con el Servicio 
de Información Agroalimentaria y Pesquera, fue de 8’ 989, 262 
cabezas (SIAP, 2011). La producción caprina en el año 2010 fue de 
87, 777 toneladas de carne en pie; de 43,896 toneladas de carne en 
canal y de 162, 853 miles de litros de leche. El precio medio de la 
carne en canal fue de $40.73 por kg, de $21.02 por kg en pie y de 
$4.47 por litro de leche. El valor de la producción de ganado en pie 
fue de $1, 844, 836; de carne en canal en $1, 786, 650 y de $722, 
968 (miles de pesos) de la producción láctea. Aun cuando la 
producción y su valor no superan a otras especies domésticas, la 
caprinocultura reviste importancia por encontrarse bajo el manejo de 
la población rural de mayor marginación y representar una opción de 
integración con las actividades agrícolas de los campesinos, 
mitigando la pobreza en México, como en otros países en desarrollo 
(SIAP, 2011). Se estima que en el país existen 494, 000 unidades de 
producción caprina y que 1.5 millones de mexicanos se relacionan 
con esta actividad, ya sea de forma primaria o secundaria (Cuéllar, et 
al., 2012). 
 
De 1980 al 2009, la población nacional de ganado caprino ha 
disminuido en 6.5%, al pasar de 9.6 a 8.98 millones de cabezas. Las 
mayores concentraciones del ganado se encuentran en los estados de 
Puebla (1, 454, 041 cabezas), Oaxaca (1, 206, 183 cabezas) 
Guerrero (662, 238 cabezas), Coahuila (657, 234 cabezas), San Luis 
Potosí (618, 118 cabezas), Zacatecas (569, 178 cabezas), 
Guanajuato (559, 239 cabezas), Michoacán (465, 890 cabezas) y 
Nuevo León (390, 011 cabezas). Sin embargo, se había observado un 
aumento de la población caprina donde en 1902 era de 4.206 
millones de cabezas lo que representa un crecimiento de más del 
doble en 107 años. A principios del siglo anterior los principales 
estados con cabras eran Nuevo León (916, 915 cabezas), Coahuila 
(615, 144 cabezas), Durango (534, 304 cabezas), San Luis Potosí 
(519, 844 cabezas) y Zacatecas (429, 377 cabezas) (SIAP, 2011). 
Esto demuestra que la población caprina empezó a ser importante en 
un principio, pero ahora, aunque se ha incrementado el número de 
cabezas en un siglo, actualmente se esta reduciendo la producción. 
 
Las limitaciones que enfrenta el sistema de producción caprino son 
entre otras, el bajo ingreso económico, escaso mantenimiento de la 
tierra, pobre manejo nutricional y falta de minerales (OIEDRUS-NL, 
2012); aunado a esto, en cuestiones de sanidad no se cuenta con 
programas contra enfermedades que ocasionan pérdidas. En México 
existe muy poca información sobre las enfermedades de tipo 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 9
respiratorio que aquejan al ganado caprino. Se le ha dado poca 
importancia a este problema, aun tomando en cuenta el papel social 
que juega esta especie en la población. 
 
Sistemas de producción 
 
Considerando la preferencia en la dieta y adaptabilidad a ambientes 
adversos, no es sorprendente que la mayor concentración de cabezas 
en México sea en los estados del norte (OIEDRUS-NL, 2012), ya que 
son estados con poca lluvia y tienen un clima más seco, las 
condiciones de producción son hostiles y a la cabra se le considera 
más rústica. 
 
El 80% de la producción caprina en México se da en tierras 
comunales o ejidos (OIEDRUS-NL, 2012). Los sistemas de producción 
caprina son, en general, diferentes entre sí, con grandes rezagos 
tecnológicos y graves problemas sanitarios (Cuéllar, et al., 2012). El 
sistema extensivo es el más utilizado por sus bajos costos de 
producción, con el uso de amplias zonas áridas de arbustos y zacates, 
para la producción de cabrito (OIEDRUS-NL, 2012). También se usan 
sistemas semi-intensivo e intensivo; así como la producción de 
traspatio (Cuéllar, et al., 2012; OIEDRUS-NL, 2012). 
 
El sistema extensivo posee varias modalidades y puede ser nómada o 
trashumante, el sistema de producción sedentario y el sistema de 
producción nómada, estos sistemas se usan en clima semidesértico, 
con vegetación predominantemente arbustiva, gran escasez de agua, 
pocas vías de comunicación. En este sistema se ubica la mayor parte 
de la población caprina. Utilizan los terrenos menos productivos. No 
se proporciona alimentación suplementaria (forrajes, granos o 
suplementos). La limitante de alimentación le da la característica de 
estacionalidad marcada de los empadres, la venta de cabritos al 
destete, la nula o muy baja disponibilidad de leche para la venta y 
una escasa productividad en general (OIEDRUS-NL, 2012; Cuéllar, et 
al., 2012). 
 
Los sistemas de producción semi-intensivos consisten en 2 
actividades principales: el pastoreo y ramoneo la mayor parte del día 
y el confinamiento durante las noches donde se suplementa con 
forrajes y/o granos. Las tres variantes que se conocen son el 
pastoreo con esquilmos, sistema de producción nómada con 
esquilmos y pastoreo en praderas cultivadas. Debido a la mejor 
alimentación, se alcanza una mayor producción que en sistema 
extensivo, se puede llegar a tecnificar, hay más de una época anual 
de empadre. Este tipo de sistema lo encontramos en la región de la 
Laguna. Los principales problemas del sistema semi-intensivo son el 
elevado costo de los animales, el acceso a la superficie de esquilmos, 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 10 
mano de obra escasa, instalaciones inapropiadas y la inversión para 
la suplementación alimenticia (OIEDRUS-NL, 2012; Cuéllar, et al., 
2012). 
 
En el sistema intensivo se trabaja con una estabulación total, 
básicamente se usa para la producción de leche y esto incrementa los 
costos de producción por manejo, infraestructura, alimentación y 
personal calificado. Se utilizan forrajes, granos y esquilmos que son 
proporcionados a las cabras en el pesebre (OIEDRUS-NL, 2012, 
Cuéllar, et al., 2012). 
 
El último sistema de producción es el de traspatio o autoconsumo. Es 
el sistema más común y generalizado en México, son rebaños en 
manos de campesinos de muy bajos ingresos y marginados; sin 
embargo, constituye una fuente de ingreso y alimento para muchas 
familias mexicanas. Las cabras se alimentan por pastoreo y en raras 
ocasiones reciben suplementos, las instalaciones son deficientes, baja 
productividad, problemas sanitarios, consanguinidad (Cuéllar, et al.,2012). 
 
Complejo Respiratorio 
 
Los problemas respiratorios en las unidades de producción caprina 
son de alta frecuencia pero sólo en algunas ocasiones se realiza 
diagnóstico y prevención, y lo más que se hace es tratar con 
antibióticos de amplio espectro indiscriminadamente; lo que puede 
ocasionar resistencia bacteriana. 
 
Las enfermedades de las vías respiratorias del ganado son las 
principales causas de muerte en las explotaciones de bovinos, ovinos 
y caprinos. A pesar de que existen una gran cantidad de productos 
antibacterianos para tratar este padecimiento y así como biológicos 
para prevenirlo, el complejo neumónico continúa causando serios 
estragos en la ganadería del país (Medellín-Ledezma, 2002). 
 
Estas enfermedades son todo un complejo respiratorio donde están 
involucrados varios factores. Estos factores están compuestos por 
condiciones ambientales, un agente primario como pueden ser 
infecciones con Mycoplasma o agentes virales como el PI3, Virus 
Respiratorio Sincitial (VRS), Adenovirus (Medellín-Ledezma, 2002; 
Zecchinon, et al., 2005). 
 
Los agentes primarios y/o factores medio ambientales causan estrés 
[por ejemplo, transporte, destete, juntar animales de diferentes 
corrales (Rice, et al., 2008; Jaramillo, et al., 2009;)], por lo que se 
ve comprometido el sistema inmune del animal, posteriormente se 
involucran agentes bacterianos causando infecciones secundarias, ya 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 11 
que descienden a los pulmones y desarrollan neumonía (Gioia, et al., 
2006; Kisiela, et al., 2009). Los agentes bacterianos involucrados en 
los problemas respiratorios caprinos son principalmente dos: 
Mannheimia haemolytica y Pasteurella multocida. 
 
La enfermedad respiratoria causada por Mannheimia haemolytica es 
una de las infecciones bacterianas más importantes en el ganado 
ovino y caprino de todas la edades, con una amplia distribución, 
apareciendo en climas templados, subtropicales y tropicales 
(Donachie, 2001). 
 
Pasteurella multocida es la responsable de los brotes con 
presentación septicémica o neumónica y Mannheimia haemolytica 
sería la culpable de la enfermedad, ambas participando en la muerte 
de los corderos lactantes expuestos a la fatiga y al enfriamiento 
(Hinsch, 2010). 
 
La neumonía se desarrolla porque una infección viral previa crea un 
microambiente ideal que consiste en la presencia de células 
necróticas y líquido proteínico en los pulmones, esto altera los 
mecanismos de defensa del pulmón de dos maneras. La primera, 
eliminando las células epiteliales ciliadas traqueobronquiales y, por lo 
tanto interfiere los mecanismos de aclaramiento mucociliar de las vías 
respiratorias. Segunda, disminuyen la capacidad fagocítica de los 
macrófagos alveolares. Ambos hechos producen un depósito de 
bacterias en el pulmón y la incapacidad pulmonar para eliminarlas, 
bien por el sistema ciliar o bien por los macrófagos (Ackermann, et 
al., 2000; Martin, et al., 2002; Cunningham, et al., 2011). 
 
Además, como se mencionó anteriormente, el factor estrés causa 
inmunosupresión y entonces las bacterias comensales del tracto 
respiratorio superior se depositan en los pulmones. Posteriormente, 
las bacterias se multiplican y a causa del estrés, se liberan 
corticosteroides por la glándula adrenal, lo que disminuye los 
mecanismos de defensa del pulmón. Para empeorar el escenario, la 
deshidratación dificulta que la secreción mucosa elimine y limpie el 
tracto respiratorio. Como resultado de estos hechos, se deriva una 
infección bacteriana pulmonar que provoca la migración de una gran 
cantidad de neutrófilos hacia los alvéolos (Ackermann, et al., 2000; 
Hirsh, et al., 2004; Smith, et al., 2009; Kisiela, et al., 2009; 
Cunningham, et al., 2011). 
 
La liberación de citocinas y quimiocinas para eliminar a las bacterias 
por parte de los neutrófilos, provoca un daño de las membranas del 
epitelio alveolar, de los capilares pulmonares y de los capilares 
pleurales. Las proteínas que se filtran al espacio alveolar, al 
intersticio pulmonar y a la cavidad pleural aumentan la presión 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 12 
osmótica en esas regiones, lo que provoca el desplazamiento de 
líquido desde el espacio vascular a los espacios alveolar, intersticial y 
pleural, lo que explica la presencia del edema pulmonar 
(Cunningham, et al., 2011). 
 
Cuando M. haemolytica se aloja en los pulmones, secreta la 
leucotoxina que junto con el LPS inician una respuesta inflamatoria 
intensa con la acumulación de fibrina. P. multocida no produce 
leucotoxina, pero al encontrarse en los pulmones inicia una respuesta 
inflamatoria por el LPS. La cápsula, la habilidad de captar hierro y tal 
vez la unión al fibrinógeno mejora la sobrevivencia de la bacteria 
dentro de la lesión. Los signos clínicos se presentan de 1 a 2 semanas 
después del estrés (Hirsh, et al., 2004). 
 
M. haemolytica provoca un curso de enfermedad más rápido y más 
severo que P. multocida; sin embargo, en dependencia de las 
infecciones asociadas, las dos pueden producir la muerte del animal 
(Alonso, et al., 2002). 
 
En el caso de M. haemolytica puede ser que los signos clínicos no se 
manifiesten y el animal aparece muerto. Los signos clínicos de la 
forma aguda de la pasteurelosis neumónica son apatía, anorexia, 
fiebre superior a 40.6°C, varios grados de hipernea y disnea, también 
hay tos dolorosa. No se aprecian claramente los sonidos anormales 
en la auscultación, y los sonidos respiratorios son bajos y 
prolongados. Frecuentemente se observan descargas serosas nasal y 
ocular, es frecuente encontrar en estados terminales salida de fluido 
espumoso por la boca. En casos subagudos o crónicos los signos 
clínicos pueden ser transitorios y menos evidentes que en la 
enfermedad aguda. El rango de mortalidad puede ser del 10% o 
menos (Donachie, 2001; Smith, et al., 2009). 
 
Todos estos factores provocan que los lóbulos craneoventrales 
pulmonares se vean afectados de forma bilateral (Smith, et al., 
2009). Las lesiones observadas son extensas hemorragias 
equimóticas en la región de la tráquea y sobre la zona costal. 
Petequias subpericárdicas y subpleurales, así como una cantidad 
variable de exudado claro y amarillo en las cavidades pleural y 
pericárdica. Los pulmones exudan un líquido hemorrágico espumoso 
cuando se cortan. Los casos crónicos desarrollan una consolidación, 
especialmente en las partes craneal y ventral de los pulmones, que 
puede aparecer recubierta por un exudado pleural verdoso y 
gelatinoso. Las partes consolidadas de esos pulmones contienen 
áreas irregulares de necrosis de color verde marrón, cada una de las 
cuales presenta un margen hemorrágico oscuro. Los nódulos 
linfáticos bronquiales se encuentran aumentados de tamaño, lisos y 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 13 
pálidos o con petequias (Martin, et al., 2002; Smith, et al., 2009; 
Hinsch, 2010). 
 
Taxonomía 
 
M. haemolytica y P. multocida pertenecen a la familia 
Pasteurellaceae, que es clasificada como una γ-proteobacteria e 
incluye patógenos humanos y animales del género Mannheimia, 
Pasteurella, Haemophilus, Actinobacillus e Histophilus (Gioia, et al., 
2006). 
 
Son células en forma de coco, ovoide o bacilar, de 0.3 a 1 µm de 
diámetro y de 1 a 2 µm de longitud. De forma sencilla o menos 
frecuentemente en pares o cadenas cortas. Poseen tinción bipolar, es 
Gram negativa, no móvil, anaeróbica facultativa, el rango de 
temperatura de crecimiento es de 22 a 44°C, el óptimo es de 37°C. 
Catalasa positiva, reduce los nitratos a nitritos, gelatinasa negativa, 
negativa a MR-VP. No producen lisina y arginina descarboxilasa. La 
glucosa y otros compuestos son fermentados con la producción de 
ácido, perousualmente no produce gas. Parasita las membranas 
mucosas de las vías respiratorias superiores y el tracto digestivo de 
algunos mamíferos y aves (Krieg, et al., 1984). Algunas cepas son 
pleomórficas sobre cultivos primarios obtenidos de muestras clínicas. 
Varias pasteurelas son similares en apariencia, son colonias redondas 
y grisáceas de 1 a 3 mm de diámetro. P. multocida presenta colonias 
mucoides, lisas y algunas variantes azules. Crecen en agar sangre 
donde M. haemolytica produce zonas de β-hemólisis. Algunas cepas 
de M. haemolytica crecen en Agar Mc Conkey (Krieg, et al., 1984; 
Gyles, et al., 2001; Martin, et al., 2002; Smith, et al., 2009). 
 
Características generales de M. haemolytica y P. multocida 
 
Los serotipos prevalentes de M. haemolytica son A1 y A2, y para P. 
multocida, los serotipos capsulares que afectan a los rumiantes son A 
y D (Gyles, et al., 2001; Martin, et al., 2002; Smith, et al., 2009). En 
México, el serotipo más frecuentemente aislado en bovinos es el A1 y 
en ovinos es el A2 (Blanco-Viera, et al., 1993; Blanco-Viera, et al., 
1995; Pijoan, et al., 1999; Morales, 2004) 
 
M. haemolytica y P. multocida son integrantes de la microbiota 
normal de las vías respiratorias y orofarínge de los pequeños 
rumiantes, manteniendo una relación simbiótica con su hospedero 
(Medellín-Ledezma, 2002; Zecchinon, et al., 2005; Rice, et al., 
2008). 
 
Todas las especies de Mannheimia son patógenos oportunistas y son 
frecuentemente aislados de portadores asintomáticos, en pequeños 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 14 
rumiantes produce neumonía y septicemia. Aún no está claro que 
mecanismos se llevan a cabo para que cambie de organismo 
comensal a patógeno (Poulsen, et al., 2006; Kisiela, et al., 2009). Y 
se ha logrado el aislamiento de esta bacteria en tracto respiratorio 
superior (Poulsen, et al., 2006). 
 
Genoma y factores de virulencia de M. haemolytica y P. 
multocida 
 
Ambos géneros, Mannheimia y Pasteurella cuentan con diferentes 
factores de virulencia. Los genes asociados a la virulencia codifican 
productos o regulan la virulencia, son requeridos para su actividad o 
son involucrados en procesos metabólicos esenciales cuando cambian 
de comensal a patógeno. 
 
Cápsula 
Es una estructura común a los dos géneros bacterianos, es un 
polisacárido, un polímero de unidades repetitivas de secuencias de 
oligosacáridos. Estos son altamente hidratados, con la propiedad de 
prevenir la desecación bacteriana. La cápsula tiene la habilidad de 
unir metales iónicos y aminoácidos cargados positivamente. Estas 
propiedades pueden ayudar a mantener los nutrientes cerca de la 
célula. Esta cápsula ayuda a inhibir la fagocitosis enmascarando la 
superficie celular y es considerada como un componente que 
incrementa la patogenicidad, ya que resiste la lisis vía complemento 
(Slauson, et al., 2002; Gyles, et al., 2004; Kisiela, et al., 2009). 
 
La cápsula de M. haemolytica le da la propiedad de adherencia y 
resistencia a la fagocitosis a través del complemento, debido a que no 
se reconoce como ajeno y por su composición, que está formada por 
repeticiones de disacáridos de ácido N-acetilmanosaminurónico y N-
acetilmanosamina (Ackermann, et al., 2000; Gioia, et al., 2006). 
 
Además de la cápsula, existen otros factores de virulencia en M. 
haemolytica, como la leucotoxina, las sialoglicoproteasas, que 
rompen las glicoproteínas de macrófagos u otros leucocitos; las 
neuraminidasas, que remueven los residuos de ácido siálico de la 
mucina del hospedero favoreciendo la adhesión y colonización (Hirsh, 
et al., 2004); las proteínas captadoras de hierro, que ayudan en la 
adquisición de hierro y asociadas en la transcripción y expresión de la 
leucotoxina (Gioia, et al., 2006). Además el LPS, quien modula la 
actividad de los leucocitos y tiene actividad endotóxica; también la 
fimbria/adhesina que participa en la fijación y colonización y la 
enzima superóxido dismutasa que le ayuda a sobrevivir al estallido 
respiratorio (Gyles, et al., 2004; Kisiela, et al., 2009). Todos estos 
factores de virulencia trabajan en conjunto para lograr la colonización 
del hospedero. 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 15 
El LPS de M. haemolytica induce una respuesta de citocinas 
inflamatorias liberadas por los macrófagos al unirse a CD14, 
formando un complejo CD14-LPS que se une a los receptores tipo 
Toll; además el LPS no causa daño directamente a las células 
epiteliales del tracto respiratorio, pero actúa en conjunto con la 
leucotoxina que tiene efecto sobre los macrófagos alveolares (Hirsh, 
et al., 2004; Gioia, et al., 2006); en estudios in vitro muestran que la 
leucotoxina, en conjunto con el LPS estabilizan la degradación de esta 
y mejoran los efectos biológicos. Los leucocitos alveolares son 
simultáneamente expuestos a ambos factores de virulencia in vivo y 
las interacciones sinérgicas observadas en estos estudios pueden 
representar un fenómeno biológico relevante (Jeyaseelan, et al., 
2002). 
 
Leucotoxina 
Es el principal factor de virulencia de M. haemolytica, es una citolisina 
formadora de poros que destruye leucocitos (Hirsh, et al., 2004). La 
leucotoxina es una exotoxina de 104 kDa que se produce durante la 
fase logarítmica de crecimiento. Es una toxina dependiente de calcio, 
miembro de la familia RTX de toxinas, llamadas así porque contienen 
una región conservada de 9 repeticiones de aminoácidos ricas en 
glicina y aspartato [XLXGGXG(N/D)D] (Repeat in toxins). Ésta es una 
toxina extracelular que actúa sobre la superficie celular de leucocitos 
polimorfonucleares (Cossart, et al., 2000; Slauson, et al., 2002; 
Jeyaseelan, et al., 2002; Aulik, et al., 2010). Es una toxina formadora 
de poros, afectando la permeabilidad de la membrana celular y abre 
paso a macromoléculas del interior de la célula, por lo tanto causa 
muerte celular. Esta clase de proteínas suelen ser amfipáticas, es 
decir, con una parte que interactúa con la cavidad hidrofílica llena de 
agua y la otra interactúa con las cadenas lipídicas o el segmento no 
polar de las proteínas integrales de la membrana. Es citolítica en 
bajas concentraciones y apoptótica en altas, provocando un rápido 
cambio osmótico en las células, la formación de poros y necrosis, las 
consecuencias tempranas de la pérdida de la barrera permeable son 
la liberación de citosinas y la activación de proteasas intracelulares 
(Cossart, et al., 2000; Confer, 2009; Aulik, et al., 2010). 
 
La leucotoxina provoca una respuesta inflamatoria que puede llevar a 
un edema intenso y necrosis en los pulmones del ganado infectado. 
Las cepas con leucotoxina defectuosa son parcialmente atenuadas, 
sugiriendo que otros factores de virulencia son importantes en la 
patogénesis. El control de la expresión en los factores de virulencia 
de M. haemolytica es interesante para cambiar de comensal a 
patógeno (Gioia, et al., 2006). La leucotoxina tiene efecto sobre la 
superficie celular de leucocitos, causando lesiones en la membrana 
(poros de 0.6 a 1 nm de diámetro) que llevan a la salida de calcio, 
entrada de potasio, ondas osmóticas coloidales y eventualmente se 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 16 
da la lisis celular (Jeyaseelan, et al., 2002; Czuprynski, 2009), se une 
a β2-integrina (CD18) que se encuentra en la superficie celular de 
neutrófilos, macrófagos, plaquetas y linfocitos (Hirsh, et al., 2004; 
Gioia, et al., 2006). 
 
Entre los leucocitos, los macrófagos son más resistentes a la acción 
de la leucotoxina que los neutrófilos, a su vez los macrófagos 
alveolares de bovinos adultos resisten más que los de becerros 
menores a 16 semanas de edad. Existe evidencia que indica que la 
movilización de neutrófilos para combatir la infecciónes ineficaz y por 
el contrario, contribuye al desarrollo de lesiones en el pulmón 
(Zecchinon, et al., 1995). 
 
La síntesis, activación y producción de la leucotoxina está regulada a 
través de un operón policistrónico, el cual contiene los genes lktC, 
lktA, lktB y lktD. El gen lktA codifica una proteína pro-leucotoxina 
inactiva, no citotóxica, se activa por la acilación de ácidos grasos del 
producto del gen lktC. Este proceso de activación remueve las cargas 
de la toxina, incrementado la hidrofobicidad de la proteína. La 
leucotoxina acilada se une al receptor que fue identificado como el 
receptor transmembranal CD18, la constante subunidad β de la 
familia β2-integrina. El complejo CD18 con CD11a forma el antígeno 1 
asociado a la función linfocítica (LFA-1), el cual es responsable de la 
alta afinidad de adhesión de la leucotoxina a los leucocitos y 
plaquetas de rumiantes. La repetición del nonapéptido de la molécula 
de leucotoxina es el ligando para LFA-1 en las células huésped. La 
leucotoxina se une a la secuencia señal de 5-17 aminoácidos del 
CD18 y es requerido para la muerte celular y citotoxicidad restringida 
de los leucocitos de rumiantes, porque la secuencia señal de CD18 no 
esta presente sobre los leucocitos maduros de otras especies 
mamíferas (Jeyaseelan, et al., 2002; Rice, et al., 2008; Aulik, et al., 
2010). 
 
Operón de la cápsula de P. multocida 
P. multocida tiene cinco serogrupos capsulares reconocidos: A, B, D, 
E y F. Recientemente fue determinada la composición de la cápsula 
de éstos serogrupos. El serogrupo A tiene como componente 
polisacárido capsular principal al ácido hialurónico que es sensible a la 
acción de la hialuronidasa. El material capsular de los serogrupos D y 
F fue identificado primariamente a través de la acción de las 
mucopolisacaridasas, provocando una decapsulación, entonces se 
propone que estas cápsulas contienen heparina para el serogrupo D y 
condroitín sulfato para el serogrupo F. El análisis monosacárido del 
serogrupo B determinó que la cápsula está compuesta de arabinosa, 
manosa y galactosa en una proporción de 0.5:2:0.8. La composición 
química del serogrupo E aun es desconocida (Townsend, et al., 
2001). 
 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 17 
El tipo de enfermedad está relacionado con el tipo capsular 
involucrado: la septicemia hemorrágica es generalmente causada por 
los serogrupos B y E, y afecta al ganado bovino y búfalos (ambos 
serogrupos son exóticos en México), el cólera aviar es provocado por 
los serogrupos A, F y ocasionalmente el D; la rinitis atrófica en cerdos 
se desarrolla por cepas productoras de toxinas, usualmente del 
serogrupo D. Por último, las infecciones del tracto respiratorio son 
causadas por el serogrupo A (Gyles, et al., 2004; Kumar, et al., 
2004). También se ha reportado pasteurelosis neumónica en bovinos, 
ovinos y caprinos, bisonte americano, yak, elefante, camello, caballo 
y otros animales silvestres (Kumar, et al., 2004). 
 
El loci biosintético de los biotipos capsulares se ha identificado dentro 
de una región específica de serogrupo, esta organización fue descrita 
en 3 regiones, donde las regiones 1 y 3 contienen los genes 
involucrados en la translocación y sustitución de fosfolípidos, 
mientras que la región 2 está involucrada en la formación de 
monómeros de azúcar activados y el ensamble de los polímeros de 
polisacáridos (Boyce, et al., 2000a; Hunt, et al., 2000; Townsend, et 
al., 2001). 
 
El producto de los primeros cuatro genes (hexADCB) de la región 1, 
se encuentra involucrado en la exportación de polisacáridos a la 
superficie, que a su vez forman las proteínas que tienen similitud a 
las proteínas involucradas en el transporte ATP dependiente de otros 
géneros bacterianos capsulados, por ejemplo Haemophilus influenzae, 
Escherichia coli y Neisseria meningitidis (Chung, et al., 1998; Boyce, 
et al., 2000b; Hunt, et al., 2000). 
 
Los productos de los cinco genes siguientes (hyaABCDE) de la región 
2 codifican para las proteínas involucradas en la formación de los 
monómeros de azúcar activados y el ensamble de los polisacáridos 
(ácido hialurónico) del serogrupo A. Así mismo, dichos genes 
codifican las enzimas capaces de unir el ácido UDP glucorónico y el 
UDP-N-acetil glicosamina, así como la polimerasa capaz de ensamblar 
los monosacáridos. Los genes hyaA y hyaD presentan una gran 
similitud y se ha propuesto que cada uno codifica para agregar los 
monómeros activados de azúcar para la formación de los 
polisacáridos. Se ha descrito que el gen hyaC tiene la función de 
codificar una enzima semejante a la UDP-glucosa deshidrogenasa, la 
cual cataliza la conversión de UDP-glucosa a ácido UDO-glucorónico, 
el cual es un componente de la cápsula del serogrupo A. Las 
funciones de los genes hyaB y hyaE aún permanecen desconocidas 
(Chung, et al., 1998; Hunt, et al., 2000). 
 
En la región 2 del serogrupo D se presentan cuatro genes dcbEFCB, 
con la misma orientación que los genes hyaABCDE del serogrupo A. El 
gen dcbB es homologo del gen hyaB mientras que el gen dcbC es 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 18 
homologo de hyaC, con 98 y 92% de similitud respectivamente. El 
producto del gen dcbF no presenta similitud con el gen hyaD del 
serogrupo A, sin embargo, presenta una similitud del 54% a la glicosil 
tranferasa KfiC de la cápsula de Escherichia coli K5. El producto del 
gen dcbF es similar en 56% al gen hyaE, dcbF es ligeramente más 
pequeño (Townsend, et al., 2001). 
 
Los productos de los genes finales (phyAB) de la región 3 codifican 
para la formación de proteínas involucradas en la sustitución de 
fosfolípidos de ácido hialurónico anterior a la translocación (Chung, et 
al., 1998; Hunt, et al., 2000). 
 
Otros factores de virulencia conocidos para P. multocida son los 
producidos por los biotipos capsulares A y D, una toxina conocida 
como PMT (Toxina de P. multocida), es una proteína citotóxica que 
actúa a través de complejas vías de señalización intracelular para 
estimular el rearreglo del citoesqueleto. Es un potente mitógeno para 
fibroblastos, y actúa vía osteoblastos para estimular osteoclastos, 
también es conocida como una toxina dermonecrótica y juega un 
papel muy importante en la rinitis atrófica (Register, et al., 2006). La 
adhesión en las células huésped esta dado por proteínas codificadas 
por genes, son aparentemente una hemoaglutinina filamentosa PfhB1 
y PfhB2, la subunidad fimbrial PftA y FimA, Flp_1, Flp_2. La expresión 
de fimbrias da como resultado la adhesión a células eucariotas. 
También se encuentran las proteínas captadoras de hierro como 
factor de virulencia para sobrevivir en el hospedero (Gyles, et al., 
2004). 
 
La toxina PMT es codificada por el gen toxA, este gen se ha utilizado 
como blanco para desarrollar pruebas de PCR que lo identifiquen 
(Register, et al., 2006). 
 
Técnicas de identificación de M. haemolytica 
 
Desde su identificación como género bacteriano, la familia 
Pasteurellaceae ha tenido constantes reclasificaciones. Luis Pasteur 
identifica a Pasteurella como causante del cólera aviar en 1880. En 
1929 por sus características bioquímicas y morfológicas fue llamada 
Pasteurella septica y después en 1939 ya se conoce como Pasteurella 
multocida (Dabo, et al., 2008). La pasteurelosis neumónica en ovejas 
fue descrita por primera vez en 1931 pero hasta los años 60, con las 
técnicas de serotipificación y biotipificación, no se logró establecer la 
etiología de la enfermedad. Posteriormente, se logra definir 
Pasteurella multocida y Pasteurella haemolytica (Martin, et al., 2002). 
 
Theodore Kitt identificó por primera vez en 1885 a M. haemolytica, 
nombrándola Bacterium bipolare. Hasta 1932 se le clasifica como 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/http://www.novapdf.com/
 19 
Pasteurella haemolytica, con 2 biotipos y 17 serotipos (Zecchinon, et 
al., 2005; Rice, et al., 2008). Estos serotipos se determinaron en 
función de la técnica de hemoaglutinación indirecta, cuyo resultado 
depende de los polisacáridos capsulares presentes en cada uno de los 
serotipos (Martin, et al., 2002; Haig, 2011). 
 
Se identificaban dos especies de Pasteurella haemolytica por su 
capacidad de fermentar la arabinosa (Biotipo A) o la trealosa (Biotipo 
T), y cada una estaba asociada con un síndrome clínico distinto, los 
serotipos 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 16 y 17 eran biotipo A y 
los serotipos 3, 4, 10 y 15 eran biotipo T (Martin, et al., 2002; 
Zecchinon, et al., 2005; Rice, et al., 2008). Después se reclasifica al 
biotipo T (junto con sus serotipos 3, 4, 10 y 15) como Pasteurella 
trehalosi, siendo después Biberstenia trehalosi. Posteriormente el 
serotipo 11 se reclasificó como Mannheimia glucosida (Hirsh, et al., 
2004; Zecchinon, et al., 2005; Rice, et al., 2008). El biotipo A cambió 
de género bacteriano y se clasifica como Mannheimia haemolytica 
gracias a la técnica de hibridación DNA-DNA, pero no todas eran 
tipificables y entonces se encuentran más especies: Mannheimia 
varigena, M. granulomatis, M. glucosida y M. ruminalis (Angen, et al., 
1999). 
 
Se ha manejado como métodos para tipificar a M. haemolytica, 
perfiles bioquímicos, fagotipos, serotipificación, perfiles de proteínas 
de membrana externa y susceptibilidad a quimioterapéuticos, entre 
otros; además se han usado como método de diagnóstico, aunque 
con resultados no muy efectivos (Suástegui, 2010), hay otras 
técnicas moleculares como la subunidad 16S rRNA (Zecchinon, et al., 
2005; Poulsen, et al., 2006), electroforesis de campo pulsado, PCR de 
secuencias repetitivas (Klima, et al., 2010), que han dado pie a las 
nuevas clasificaciones. 
 
Uso de genes constitutivos para tipificación 
 
Los métodos de biología molecular actuales han permitido delinear el 
género Mannheimia spp., se han utilizado técnicas como el PCR 
intragénico RNAt y la secuencia de análisis de genes como el de la 
subunidad 16S rRNA, rpoB y sodA (Angen, et al., 1999; Zecchinon, et 
al., 2005; Suástegui, 2010). Desafortunadamente, no todos los 
protocolos son rápidos y/o sirven para la detección simultánea de 
Mannheimia spp. en muestras de cultivos y tejidos sin utilizar geles 
para electroforesis o análisis de secuencias. El gen de la subunidad 
16S rRNA es considerado como una herramienta estándar de 
taxonomía bacteriana, utilizado para definir la relación filogenética y 
como principal gen de identificación (Janda, et al., 2002; Rodicio, et 
al., 2004). 
 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 20 
Los genes blanco que son seleccionados deben ser funcionalmente 
constantes, que actúen como relojes moleculares del cambio 
evolutivo microbiano. Ellos deben tener un segmento común en todas 
las bacterias y ser flanqueado por regiones variables o altamente 
variables (Highlander, 2001). 
 
El gen rpoB pertenece a la subunidad β de la RNA polimerasa 
(Adékambi, et al., 2009), la cual lleva a cabo la mayor función 
catalítica de la RNA polimerasa, contiene regiones alternadas, 
conservadas y variables, algunos estudios han indicado que la región 
hipervariable es la más adecuada para la identificación y 
discriminación filogenética en los niveles de especie y subespecie. 
 
Gen sodA 
La secuencia de análisis del gen sodA ha sido recientemente usada 
para la identificación de Mannheimia spp. demostrando una exitosa 
capacidad de discriminación entre las especies de este género 
(Gautier, et al., 2005). Se ha elegido esta región como un objetivo 
para el PCR en tiempo real (qPCR). El gen sodA codifica la enzima 
superóxido dismutasa dependiente de manganeso (Mn-SOD). El 
análisis de la secuencia del gen sodA Mn-SOD ha sido usado 
exitosamente para el diagnóstico de especies como Streptococcus, 
Enterococcus y Staphylococcus. En estos géneros la región del sodA 
tiene un mejor poder discriminatorio que el mostrado en el método 
del gen de la subunidad 16S rRNA. El gen sodA se ha utilizado para 
diferenciar especies relacionadas dentro del género Mannheimia y 
Pasteurella (Gautier, et al., 2005; Guenther, et al., 2008). 
 
Técnicas de identificación para P. multocida 
 
Las cepas de P. multocida se han serotipificado sobre la base del tipo 
somático y capsular estableciendo una correlación entre el 
microorganismo y la enfermedad causada por éste, hasta el momento 
ha sido útil su aplicación empleando técnicas como la 
hemoaglutinación indirecta, y la inmunoelectroforesis. Se han usado 
pruebas no serológicas para la tipificación capsular como son la 
prueba de hialuronidasa para identificar al serogrupo A (Carter, et al., 
1975) que se basa en la despolimerización de la cápsula del ácido 
hialurónico al estar en contacto con Staphylococcus aureus y la 
floculación por acriflavina para identificar al serogrupo D (Carter, et 
al., 1973). 
 
Los serogrupos capsulares A, B, C y D fueron identificados por 
procedimientos de hemoaglutinación pasiva (Carter, 1955). El tipo C 
fue subsecuentemente descartado por no ser un tipo válido y después 
fue añadido el tipo E (Carter, 1961). En estudios posteriores Namioka 
y Murata (1961) demostraron que las tinciones de P. multocida tenían 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 21 
diferentes tipos O (somáticos), basados sobre el uso de células 
tratadas con ácido y procedimientos de absorción de aglutinina. Ellos 
designaron serovariedades por un número, el cual indicaba el tipo O, 
seguido del tipo capsular. Heddleston et al. (1972) identificó 
diferentes serovariedades por medio de una prueba de difusión en gel 
empleando un antígeno obtenido de células llevadas a 100°C. 
Identificaron 16 tipos somáticos (Krieg, et al., 1984; Dagleish, et al., 
2010). Quedando, por ejemplo serogrupo A serovariedad 3 (A:3); es 
decir, la cápsula es de tipo A y el serogrupo somático es 3. 
 
La prueba de hemoaglutinación indirecta (HAI) presenta 
complicaciones por la dificultad en la preparación del antisuero y los 
antígenos específicos para los diferentes biotipos, además de la 
existencia de reacciones cruzadas de P. multocida con algunas 
bacterias Gram negativas como Neisseria catarrhalis y Yersinia 
pseudotuberculosis, esto es en el caso de bovinos, pudiendo 
sensibilizarlos. Las pruebas de hialuronidasa y acriflavina son pruebas 
no serológicas para el reconocimiento de los serogrupos capsulares A 
y D respectivamente. Estas pruebas se basan en la despolimerización 
de la cápsula de ácido hialurónico del serogrupo A en presencia de 
Staphylococcus aureus (productora de la enzima hialuronidasa) y la 
floculación de las cepas del serogrupo D en presencia de acriflavina. 
Son pruebas basadas en las características fenotípicas. Existen otras 
técnicas que se han desarrollado y publicado para realizar la 
serotipificación de este microorganismo incluyen la aglutinación 
específica, protección pasiva en modelo ratón, precipitación-difusión 
en agar, contrainmunoelectroforesis; sin embargo, las más utilizadas 
para la realización de estudios epidemiológicos son las pruebas de 
hialuronidasa y acriflavina (Leotta, et al., 2006; Campuzano, 2007). 
 
El desarrollo de técnicas moleculares ha permitido utilizar más 
herramientas para tipificar a P. multocida, entre las cuales se han 
utilizado el análisis de ADN plasmídico, análisis con endonucleasas de 
restricción, ribotipificación, PCR, amplificación de fragmentos 
polimórficos largos (AFLP), éstas han permitido detectar las 
variaciones genéticas entre las cepas y facilitar su identificación 
(Blackall, et al., 2000; Leotta, et al., 2006; Dabo, et al., 2008). 
 
Se han establecido varias técnicas de PCR para identificar a P. 
multocida, siendola técnica más fácil de realizar como la PM-PCR; es 
decir, PCR de P. multocida (Kumar, et al., 2004), el PCR múltiple de 
la cápsula que provee una alternativa rápida y altamente específica 
en comparación con la serotipificación capsular convencional 
(Townsend, et al., 2001). 
 
 
 
 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 22 
JUSTIFICACIÓN 
 
Existen muchos estudios epidemiológicos que reportan la presencia 
de Mannheimia haemolytica y Pasteurella multocida en los problemas 
respiratorios de bovinos y ovinos. En México, se han realizado 
estudios en éstas especies, donde se demuestra que están presentes 
éstos agentes bacterianos, pero en caprinos existe poca información 
sobre los serotipos que los afectan. 
 
En la actualidad, el tratamiento preventivo y curativo para las 
enfermedades respiratorias en caprinos se ha conducido con el 
modelo para bovinos y ovinos ya que comparten similitud como 
especies animales; sin embargo, los escasos estudios epidemiológicos 
realizados en cabras muestran una metodología básica, con pruebas 
fenotípicas, pero no se han hecho estudios con técnicas moleculares 
en México. Las pruebas moleculares han demostrado ser más 
contundentes ya que se basan en la presencia de los genes y no en 
su expresión. 
 
Con base a estos antecedentes, nace la inquietud por saber en que 
situación se encuentra la mannhemiosis y pasteurelosis caprina en 
nuestro país. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 23 
HIPÓTESIS 
 
Mannheimia haemolytica y Pasteurella multocida tienen una amplia 
distribución en las principales regiones caprinas del país, y los 
serotipos presentes son variables. 
 
OBJETIVO GENERAL 
 
Determinar la distribución y caracterización molecular de aislamientos 
de Mannheimia haemolytica y Pasteurella multocida en cabras de las 
principales zonas productivas en México. 
 
OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
 
 Aislar Pasteurella multocida y Mannheimia haemolytica a partir 
de hisopos nasales obtenidos de cabras. 
 Realizar pruebas bioquímicas para determinar género y especie 
de los aislamientos sospechosos. 
 Tipificar los aislamiento de Mannheimia haemolytica a través 
del gen sodA. 
 Determinar en los aislamientos de Mannheimia haemolytica la 
presencia del gen lktA. 
 Determinar grupo capsular identificando los genes hyaD-hyaC 
para el biotipo A y el gen dcbF para el biotipo D de los 
aislamientos de Pasteurella multocida. 
 Determinar los serotipos somáticos de los aislamientos de 
Pasteurella multocida por inmunodifusión en gel. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 24 
MATERIAL Y MÉTODOS 
 
Aislamientos bacterianos a partir de hisopos nasales 
 
Se realizaron muestreos de conveniencia en rebaños de las zonas 
caprinas con producción relevante en México (Puebla, San Luis Potosí, 
Guerrero, Coahuila, Durango, Baja California Sur y Guanajuato). Se 
realizaron muestreos dirigidos junto con una encuesta epidemiológica 
de cabritos con problemas respiratorios para poder identificar a los 
factores predisponentes. Los cabritos seleccionados para muestreo 
tenían secreción nasal y ocular, tos, estertores en la auscultación 
torácica, depresión, fiebre. La edad máxima considerada para los 
muestreos fue de 12 meses. Se tomaron hisopos nasales por la 
facilidad del muestreo y porque se podían trabajar un mayor número 
de muestras. 
 
Los hisopos se colectaron en medio de transporte Ames con carbón y 
fueron mantenidos en refrigeración hasta trabajarlos en el 
laboratorio. 
 
Estos hisopos se sembraron en agar sangre y Mc Conkey, se 
incubaron a 37ºC durante 24 horas, a las cepas sugerentes se les 
realizó tinción de Gram y después de confirmar que eran cocobacilos 
Gram negativos, se realizaron las pruebas bioquímicas para 
corroborar su identidad. 
 
Pruebas bioquímicas 
 
Las pruebas bioquímicas realizadas fueron oxidasa, citrato, TSI, SIM 
y urea. Se utilizaron aislamientos de campo de M. haemolytica y P. 
multocida como controles (Cuadro 1). 
 
Cuadro 1. Pruebas bioquímicas básicas para identificar a Pasteurella 
multocida y Mannheimia haemolytica. 
Prueba bioquímica Pasteurella multocida Mannheimia haemolytica 
Oxidasa + + 
Citrato + + 
TSI 6 6 
SIM Motilidad -, Indol + Motilidad -, Indol - 
Urea - - 
 
A los aislamientos identificados como P. multocida se les determinó 
su tipo capsular utilizando las técnicas convencionales (hialuronidasa 
y acriflavina) y moleculares (PCR). 
 
 
 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 25 
Extracción de ADN 
 
Se realizó la extracción de ADN a partir de todas las cepas aisladas, 
para lo cual se inocularon en agar sangre con 5% de sangre de 
bovino desfibrinada, se incubaron a 37°C por 24 horas en aerobiosis. 
El cultivo se cosechó de las placas de agar sangre y fue colocado en 
500 µl de agua estéril y calentado en Baño María a 80°C durante 15 
minutos. Posteriormente se realizó la técnica de extracción con 
tiocianato de guanidina (Sigma), se agregaron 550 µl de solución de 
lisis (tiocianato de guanidina 5M [Sigma], EDTA 0.1M [JT Baker], 
sarcosil 0.05% peso/volumen [Sigma]), se mezcló en vortex durante 
15 minutos. Posteriormente, se agregaron 250 µl de acetato de 
amonio 7.4 M [JT Baker], se mezcló en vortex y se dejó en hielo 
durante 10 minutos. Se adicionaron 500 µl de cloroformo-alcohol 
isoamílico (24:1 V/V) y se mezcló en vortex durante 5 minutos, se 
centrifugó a 13 500 xg por 5 minutos, se recuperó el sobrenadante 
en un tubo nuevo y se volvió a agregar 500 µl de cloroformo-alcohol 
isoamílico (24:1 V/V) y se mezcló en vortex durante 1 minuto, se 
repitió la centrifugación y el sobrenadante se recuperó en un tubo 
nuevo. Por último se precipitó con 0.7 volúmenes de isopropanol [JT 
Baker] durante 10 minutos, después se centrifugó a 13, 500 xg por 5 
minutos, se decantó el sobrenadante y la pastilla se lavó con etanol al 
70% en tres ocasiones, centrifugándolo por 17, 900 xg por 1 minuto. 
El ADN se dejó secar y después se resuspendió con 100 µl de agua 
estéril. 
 
El ADN reconstituido de cada aislado se corrió en un gel de agarosa al 
1% a 80 volts durante 40 minutos, para comprobar su integridad, 
posteriormente se cuantificó con ayuda de un espectrofotómetro 
(Spectrophotometer Nano Drop ND-1000®) a 260/280 en un rango 
de 1.8 a 2. 
 
PCR tiempo real para M. haemolytica para identificar el gen 
sodA 
 
Los aislamientos identificados como Mannheimia de acuerdo a las 
pruebas bioquímicas antes mencionadas, se les determinó su especie 
utilizando la prueba de PCR tiempo real identificando al gen sodA. Se 
realizó una curva de límite de detección, la bacteria de referencia se 
colocó en caldo BHI y se cultivó toda la noche en agitación (220 rpm) 
a 37°C hasta alcanzar una DO600 de 1.0. Para la cuantificación de 
UFC (Unidades Formadoras de Colonia), se realizaron diluciones 
decuples seriadas (10-1 – 10-7) del cultivo en caldo y se colocaron 3 
gotas (20 µl cada una) en placas de agar sangre con 5% de sangre 
de bovino desfibrinada, se incubaron a 37°C por 24 horas en 
aerobiosis y se contaron las colonias en la dilución, que fueron 
claramente visibles. 
 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 26 
Los iniciadores utilizados para identificar el gen sodA se muestran en 
el cuadro 2. Son los reportados por Guenther, et al (2008). Cada 
iniciador fue analizado por Blast y para revisar propiedades biofísicas 
y la formación de dímeros se analizaron sus características con el 
Oligoanalyzer 3.0 [IDT SciTools 
(http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/Default.aspx)]. 
 
Cuadro 2. Secuencia de los iniciadores utilizados para identificar el 
gen sodA de Mannheimia haemolytica. Tomados de Guenther, et al 
(2008). 
 Secuencia del iniciador 
(Sentido/contrasentido) 
Tamaño 
del 
producto 
(pb) 
M. 
haemolytica 
5’-AGCAGCGACTACTCGTGTTGGTTCAG-3’ 
5’-AAGACTAAAATCGGATAGCCTGAAACGCCTG-3’ 
143 
 
La detección de Mannheimia fue realizada y estandarizada primero en 
el PCR punto final, comprobando las condiciones de alineamiento de 
los iniciadores, posteriormente se realizó la detección en tiempo real 
analizando con el termociclador de Roche®, LightCycler 480 con el 
método de SYBR Green. Se trabajó en tiempo real por el número de 
aislamientos a clasificar, optimizar tiempos y costos. En una placa de 
96 pozos se colocó la cepa de referencia de M. haemolytica como 
control positivo y a E. coli como control negativo. En cada pozo se 
colocaron 250 ng/µl de ADN, 10 µl del Master mix (Roche®) (contiene 
Taq polimerasa), 0.25 µl de cada iniciador (10 µmol) y agua grado 
PCR cbp 20 µl de volumen final. Las condiciones de amplificación 
fueron las siguientes: el primer paso de 95°C por 10 minutos fue 
seguido de 40 ciclos de 95°C por 15 segundos para la 
desnaturalización, 64°C por 30 segundos para la alineación y 72°C 
por 15 segundos para la extensión; y la extensión final a 72°C por 10 
minutos. Después de la amplificación, se realizó el ensayo de 
disociación con la fluorescencia medida desde los 65 a los 95°C, 
registrando la disminución de la intensidad de ésta durante el proceso 
de disociación. Los resultados fueron analizados usando el software 
LightCycler 480II (Roche®). 
 
PCR de leucotoxina de M. haemolytica 
 
A las cepas identificadas como M. haemolytica se les determinó la 
presencia del gen lktA que codifica para la leucotoxina inactiva 
mediante PCR punto final. Los iniciadores que se utilizaron en este 
caso fueron: 5’-GGTGAAGGTTACGACCGAGTT-3’ y 3’-
CTTCACGGTTGCCCACTAATG-5’. Se elaboraron con el programa 
ClustalX 2.1 De igual manera fueron analizados con Blast y 
Oligoanalyzer 3.0. El producto esperado era de 172 pb. La 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/Default.
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 27 
preparación de este PCR fue con un volumen final de 20 µl, de los 
cuales 3 µl fueron de amortiguador 1X (Invitrogen®), 3.3 µl de MgCl2 
(Invitrogen®) a una concentración de 50 mM, 2 µl de dNTP’s 10 mM 
(Invitrogen®), 0.5 µl de Taq polimerasa (Invitrogen®), 0.5 µl de cada 
iniciador a una concentración de 10 µmol, 250 ng/µl de ADN y agua 
grado PCR cbp 20 µl. Las condiciones de amplificación que se 
utilizaron fueron: desnaturalización inicial a 95°C por 5 minutos, 
seguida de 35 ciclos de desnaturalización a 95°C por 30 segundos, 
amplificación a 59°C por 30 segundos, extensión a 72°C durante 30 
segundos y una extensión final de 72°C por 5 minutos. Los productos 
fueron visualizados en electroforesis en geles de agarosa al 2%, 
teñido con bromuro de etidio. 
 
PCR múltiple capsular para P. multocida 
 
Para el PCR de P. multocida se buscaron varios genes y se 
estandarizó un PCR Múltiple, teniendo como objetivo 3 genes. Se 
buscó una secuencia específica para identificar a P. multocida como 
género que es la secuencia KMT y el biotipo de las cepas fue 
determinado utilizando la detección de los genes hyaD-hyaC para el 
biotipo A y el gen dcbF para el biotipo D, genes que codifican para la 
formación de la cápsula en ambos serotipos (Towsend, et al., 2001). 
Los iniciadores utilizados para este PCR se muestran en el cuadro 3. 
La preparación de este PCR fue con un volumen final de 30 µl, de los 
cuales 5 µl fueron de amortiguador 1X, 3.4 µl de MgCl2 a una 
concentración de 50 mM, 2 µl de dNTP’s 10 mM, 0.5 µl de Taq 
polimerasa, 1 µl de cada iniciador a una concentración final de 10 
µmol, 250 ng/µl de ADN y agua grado PCR cbp 30 µl. Las condiciones 
de amplificación que se utilizaron fueron: desnaturalización inicial a 
95°C por 5 minutos, seguida de 30 ciclos de desnaturalización a 95°C 
por 30 segundos, amplificación a 56.5°C por 30 segundos, extensión 
a 72°C durante 30 segundos y una extensión final de 72°C por 5 
minutos para los 3 genes. Los productos fueron visualizados en 
electroforesis con un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de 
etidio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 28 
Cuadro 3. Secuencia de los iniciadores utilizados para el PCR múltiple 
capsular de Pasteurella multocida. Tomados de Towsend, et al. 
(2001) 
Biotipo Gen Secuencia (sentido/contrasentido) Tamaño del 
producto 
(pb) 
Todos KMT1 5’-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3’ 
5’-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3’ 
460 
A hyaD-
hyaC 
5’-TGCCAAAATCGCAGTCAG-3’ 
5’-TTGCCATCATTGTCAGTG-3’ 
1,044 
D dcbF 5’-TTACAAAAGAAAGACTAGGAGCCC-3’ 
5’-CATCTACCCACTCAACCATATCAG-3’ 
657 
 
Serotipos somáticos de P. multocida 
 
El serotipo somático de los aislamientos de P. multocida se determinó 
por aglutinación en gel con antisueros específicos. Las cepas se 
inocularon en placas de agar sangre que contenía 5% de sangre de 
bovino desfibrinada a 37°C por 24 horas en aerobiosis. Fueron 
cosechadas en 1 ml de PBS 0.02 M con 0.3% de formalina y 0.85% 
de NaCl. Las células fueron calentadas en Baño María a 100°C 
durante 60 minutos y sedimentadas por centrifugación a 7, 000 xg 
por 30 minutos. El sobrenadante fue usado como el antígeno en el 
sistema GDPT (Gel Diffusion Precipitin Test). Los antisueros fueron 
preparados como indicó el fabricante. Para la realización de la prueba 
se preparó un agar gel con 0.9% de agar Noble y 8.5% de NaCl. Se 
calentó a 56°C y fue colocado en placas, las placas se conservaron en 
una cámara húmeda a temperatura ambiente hasta su uso. En cada 
placa se perforaron pozos, formando una roseta de 6 pozos con un 
pozo central, en el pozo central se colocó el antisuero y en los pozos 
de la periferia se colocaron los antígenos problema, se incubó a 37°C 
durante toda la noche y en donde se observó una línea de 
precipitación debida a una reacción positiva antígeno-anticuerpo de 
un serotipo somático. Se trabajaron los serotipos 1, 3, 4 y 5. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 29 
RESULTADOS 
 
Aislamientos bacterianos a partir de hisopos nasales. 
Se trabajaron 1,498 hisopos de exudado nasal de cabras con un 
cuadro clínico de enfermedad respiratoria, es decir, secreción nasal y 
ocular, tos, anorexia, depresión; de los cuales se aislaron 535 cepas, 
teniendo un porcentaje de recuperación del 36% (Figura 1). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
De estos aislamientos positivos al género Mannheimia/Pasteurella, se 
realizaron pruebas bioquímicas confirmando el género y especie. Se 
obtuvo 92% de Mannheimia haemolytica (491 aislamientos) y 8% de 
Pasteurella multocida (44 aislamientos). 
 
Las muestras se recuperaron de los estados de Puebla, Coahuila, 
Guanajuato, Guerrero, Baja California Sur, Querétaro, San Luis Potosí 
y Durango. Los aislamientos por estado se muestran en los cuadros 4 
y 5. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Positivo
Negativo
 
Aislamientos 
64% 
36% 
Figura 1. Porcentaje de aislamientos recuperados de los hisopos nasales. 
Se lograron aislar un 36% del total de los hisopos trabajados, representado por 
535 cepas. 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 30 
Cuadro 4. Aislamientos obtenidos de Mannheimia haemolytica por 
Estado de la República Mexicana. 
Aislamientos de M. haemolytica 
Estado No. muestras No. aislamientos Porcentaje 
San Luis Potosí 707 231 47.1% 
Baja California Sur 363 113 23% 
Coahuila 211 86 17.5% 
Puebla 148 34 6.9% 
Guerrero 20 16 3.3% 
Durango 35 10 2% 
Querétaro5 1 0.2% 
Total 1489 491 100% 
 
Cuadro 5. Aislamientos obtenidos de Pasteurella multocida por Estado 
de la República Mexicana. 
Aislamientos de P. multocida 
Estado No. muestras No. Aislamientos Porcentaje 
Coahuila 211 16 36.4% 
Puebla 148 11 25% 
Baja California Sur 363 9 20.4% 
San Luis Potosí 707 4 9.1% 
Guanajuato 9 2 4.5% 
Guerrero 20 1 2.3% 
Durango 35 1 2.3% 
Total 1493 44 100% 
 
En M. haemolytica el mayor número de aislamientos se obtuvo de 
San Luis Potosí (47.1%) y Baja California Sur (23%), le siguen 
Coahuila (17.5%), Puebla (6.9%), Guerrero (3.3%), Durango con 2% 
y Querétaro con el menor porcentaje (0.2%). 
 
En el caso de P. multocida el mayor número de aislamientos se 
recuperaron de Coahuila (36.4%) y Puebla (25%), le siguió Baja 
California Sur (20.4%), San Luis Potosí (9.1%), Guanajuato (4.5%) y 
por último Guerrero y Durango con un 2.3% cada uno. 
 
PCR Tiempo Real para M. haemolytica, identificando el gen 
sodA. 
 
La prueba se estandarizó con las cepas de campo de M. haemolytica, 
en cada caso se utilizó la curva de disociación para poder comparar el 
comportamiento de los aislados (Figura 2). En la línea azul marino se 
muestra el control positivo de M. haemolytica y en la línea azul claro 
se encuentra el control negativo, en este caso se usó E. coli, que 
forma una línea basal. De esta forma se comprobó que la 
temperatura de disociación del producto de amplificación de M. 
haemolytica es de 89ºC. 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 31 
 
 
 
 
 
 
Además se corroboró que la primera derivada negativa tuviera un 
comportamiento específico para la cepa de referencia mostrando solo 
un pico (Figura 3). En la línea azul marino se observa un único pico 
que evidencia especificidad para M. haemolytica ya que solo hubo un 
producto de amplificación y la línea basal de color azul claro es E. 
coli, donde no hubo amplificación. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A través de la PCR Tiempo Real se lograron identificar y clasificar 46 
cepas como M. haemolytica de 491 aislamientos (9.37%), esto se 
logró por el gen sodA. Las cepas que se aislaron por estado son: San 
Luis Potosí 14 aislados, Baja California Sur 14 aislados, Coahuila 10 
aislados, Puebla 5 aislados y Durango 2 aislados. La prueba se realizó 
por triplicado. El control positivo que se utilizó fue una cepa de campo 
Figura 2. Curva de disociación de Mannheimia haemolytica. La línea azul 
marino representa al control positivo, cepa de referencia de M. haemolytica y la 
línea azul claro representa al control negativo, Escherichia coli. De esta manera 
se comprobó que la amplificación es específica para M. haemolytica. 
Figura 3. Primera derivada negativa de Mannheimia haemolytica. Línea 
azul marino corresponde a la cepa de referencia de M. haemolytica. Línea azul 
claro, cepa de Escherichia coli. El pico demuestra que hay un comportamiento 
específico para la cepa de referencia, y el control negativo se mantiene basal al 
no haber respuesta con los iniciadores. 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 32 
de M. haemolytica y como control negativo se utilizó una cepa de 
campo de E. coli (Figura 4 y 5). 
 
En la figura 4 se puede observar los aislamientos positivos a M. 
haemolytica en color rojo, se observa que el valor de Cp estuvo en un 
rango de 15-30 y la línea verde es el control negativo, que se 
mantiene de forma basal. 
 
En la figura 5 se encuentra la gráfica de disociación de los 
aislamientos positivos a M. haemolytica, donde, de igual manera, las 
líneas azul marino muestran como los aislamientos tienen un 
comportamiento específico para estos iniciadores y el control negativo 
en color azul cielo se mantiene de forma basal. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. PCR Tiempo Real para Mannheimia haemolytica. Las líneas 
rojas corresponden a aislamientos positivos de M. haemolytica y la línea verde 
representa al control negativo (cepa de Escherichia coli). Se tomaron como 
aislamientos positivos cuando, entre los 15 y 30 ciclos, la curva de 
amplificación estaba en su fase exponencial. 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 33 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PCR de lktA de los aislamientos de M. haemolytica. 
 
Se realizó la prueba de PCR punto final a los 46 aislamientos positivos 
a M. haemolytica, se obtuvo una banda de 172 pb que corresponden 
al gen lktA de la leucotoxina, encontrando que en siete aislamientos 
no se obtuvo el producto de PCR esperado. El control positivo fue una 
cepa de campo de M. haemolytica y el control negativo fue agua. La 
prueba se realizó por triplicado. De los siete aislamientos negativos, 
cinco fueron de Baja California Sur, uno de San Luis Potosí y uno de 
Coahuila (Figura 6). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Curva de disociación de aislamientos 
positivos a Mannheimia haemolytica. Las líneas de 
color azul fuerte dan un pico que indica que son positivas 
a M. haemolytica. La línea azul claro se mantiene basal 
ya que es el control negativo (cepa de Escherichia coli). 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 34 
 
 
 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 
 
 
 
 
 
 
 
 
PCR múltiple capsular de P. multocida. 
 
Se aislaron un total de ocho cepas que fueron identificadas por PCR 
múltiple y en todas se observó una banda 460 pb que corresponde al 
gen KMT de Pasteurella multocida y una banda de 657 pb que 
corresponde al gen dcbF para el biotipo capsular D (Figura 7). De los 
ocho aislamientos positivos, cinco correspondían al estado de 
Coahuila, dos de Puebla y uno de Baja California Sur. En el PCR 
múltiple se utilizaron cepas de campo como control positivo, las cepas 
eran P. multocida biotipo D y A y agua como control negativo. La 
prueba se realizó por triplicado. 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. PCR del gen lktA de Mannheimia haemolytica. 
Carril M. Escalera de bases de 100 pb (Invitrogen®). Carril 1-12. 
Aislamientos de Baja California Sur. Carril 13. Control positivo, 
cepa de referencia de M. haemolytica. Carril 14. Control negativo 
agua. El producto de 172 pb indica la presencia del gen lktA, pero 
en 2 aislamientos no hubo producto de amplificación. 
100 pb 
300 pb 
2 072 pb 
200 pb 
600 pb 
172 pb 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 35 
 
 M 1 2 3 4 5 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Serotipos somáticos de P. multocida. 
 
Los ocho aislamientos confirmados en el PCR múltiple como P. 
multocida mostraron en el sistema GDPT una banda de precipitación 
para el serotipo 3, confirmando que todos los aislamientos obtenidos 
de hisopos nasales de cabra fueron D:3. Cinco aislamientos 
correspondían al estado de Coahuila, dos aislamientos de Puebla y 
uno de Baja California Sur. En el sistema se utilizaron cepas de 
campo como control positivo, las cepas eran P. multocida serotipo 
D:3, A:3 y A:1 y agua como control negativo. La prueba se realizó 
por triplicado. 
 
Encuestas 
 
En las encuestas se pudo observar por región que en Baja California 
Sur el fin zootécnico más utilizado es la producción de cabrito, 
seguido por la producción de carne y doble propósito (producción de 
leche y carne); el sistema de producción más utilizado es el pastoreo 
libre, aunque también hay mixto e intensivo. Los cabritos en 
lactancia no salen al campo con las madres. Reportan cabritos con 
problemas respiratorios, secreción y tos, principalmente en la época 
invernal, aunque también en sequía y lluvias, sin datos exactos de 
2 000 pb 
100 pb 
200 pb 
400 pb 
800 pb 
1 200 pb 
 460 pb 
 657 pb 
Figura 7. PCR Múltiple de Pasteurella multocida. Carril M. 
Escalera de bases,100 pb (Invitrogen®). Carril 1. Control 
positivo, cepa P. multocida biotipo D. Carril 2-5. Aislamientos 
positivos a P. multocida biotipo D. Los aislamientos obtenidos de 
hisopos nasales que pasaron las pruebas bioquímicas básicas 
amplificaron un producto de 460 pb clasificándolas como P. 
multocida y un producto de 657 pb que indican que son biotipo D. 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 36 
proporción. A pesar de la observación de estos signos la mayoría no 
vacuna. Además, tienen más de una especie en las unidades de 
producción siendo los bovinos la especie más frecuente. 
 
En Coahuila, el fin zootécnico predominante es el de producción de 
leche y doble propósito (producción de leche y carne). Los sistemas 
de producción utilizados son principalmente el mixto (pastoreo con 
encierro nocturno), seguido de pastoreo libre. En este caso los 
cabritos si salen al pastoreo con las madres. Algunos presentan 
problemas respiratorios principalmente en época de verano e 
invierno, sin datos de proporción. En su caso, solo vacunan contra 
Brucella. La mayoría convive con otras especies, las más comunes 
son aves, seguidas de ovinos y porcinos. Llama la atención que no 
reportan problemas respiratorios como la principal causa de muerte 
en cabritos pero si en animales adultos. 
 
Para el caso de Durango, el municipio que se muestreó fue Gómez 
Palacio únicamente donde el tipo de explotación es básicamente de 
doble propósito (producción de leche y carne). El sistema de 
producción que utilizan es libre pastoreo e intensivo. En el caso del 
libre pastoreo, los cabritos si salen al campo junto con las madres, 
pero durante enero y febrero no salen. Reportan nacimiento de crías 
débiles. Igual que en Coahuila solo vacunan contra Brucella. Conviven 
con otras especies, principalmente aves, porcinos y felinos. La 
mayoría desparasita. Como en Coahuila, no reportan problemas 
respiratorios como la principal causa de muerte en cabritos pero si en 
animales adultos. 
 
En Puebla todos los tipos de explotación muestreados eran de 
producción de carne. El sistema de producción que emplean era 
pastoreo libre y mixto. También hay otras especies animales dentro 
de la explotación, en su mayoría ovinos, seguidos de bovinos y 
porcinos. Tienen programas de desparasitación. Reportan neumonía 
como principal enfermedad entre los cabritos (sin datos de 
proporción), pese a esto la mayoría no vacuna. 
 
La situación en San Luis Potosí no varía mucho. Tienen unidades de 
producción de doble propósito (producción de leche y carne), 
producción de cabrito, leche y pie de cría. Reportan nacimiento de 
cabritos débiles y enfermedades respiratorias en todas las épocas del 
año, principalmente en invierno (sin datos de proporción), pero en 
este caso la mayoría si aplica una vacuna triple (P. multocida A y D, 
M. haemolytica A1, Clostridium chauvoei y Cl. septicum) y 
desparasitan de forma periódica. Las cabras conviven con otras 
especies, principalmente ovinos, aves, bovinos y porcinos. 
 
De manera individual se puede resumir que la condición corporal de 
los cabritos en general era buena, la mayoría eran hembras y nacidos 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 37 
dentro del mismo rancho, pero no son vacunados. En la mayoría de 
los casos reconocen que los problemas respiratorios entre los cabritos 
son muy comunes pero no toman medidas preventivas, no todos 
salen al pastoreo y se quedan en las instalaciones lo que podría 
favorecer a los factores predisponentes, todos desparasitan pero no 
vacunan para prevenir o reducir los problemas respiratorios, solo 
contra brucelosis y enfermedades clostridiales. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 38 
DISCUSIÓN 
 
Algunos sistemas de identificación bacteriana ofrecen varias ventajas 
sobre las pruebas convencionales, hay pruebas más especializadas 
que permiten una identificación más exacta como el API, y suelen ser 
costosas preparaciones, a menudo las reacciones bioquímicas 
observadas con sistemas comerciales no se correlacionan bien con los 
resultados de las pruebas convencionales (Janda, et al., 2002). El API 
ha sido un sistema muy utilizado desde 1975, pero las pruebas 
incluidas no han cambiado desde entonces. Una de las consecuencias 
de todas estas limitaciones es que algunos sistemas comerciales 
tienen gran dificultad en la identificación de ciertos grupos de 
bacterias, tales como especies de Pasteurella o especies de 
Haemophilus (Janda, et al., 2002). Aunque es conocida la rapidez y el 
uso de los microsistemas API o cualquier otro, en este estudio se 
decidió usar pruebas bioquímicas convencionales por el número de 
muestras a trabajar, logrando identificar a los aislamientos por medio 
de una prueba bioquímica básica. Aunque no fue definitiva la 
identificación, ya que más adelante usamos pruebas moleculares para 
confirmar lo obtenido a través de las pruebas bioquímicas. 
 
En algunos estudios han identificado a M. haemolytica y P. multocida 
a través de pruebas bioquímicas, sobre todo estudios epidemiológicos 
no tan recientes, estos se han hecho en diferentes especies pero 
hablando de cabras y, sobre todo en el país, no hay muchos datos 
publicados. En el trabajo realizado por Blanco-Viera, et al. (1995) 
aislaron a P. multocida serotipo A en un 61% y al serotipo D en 25%, 
estos aislamientos fueron obtenidos de lesiones neumónicas de 
bovinos y ovinos. Sin embargo, en este estudio se aisló M. 
haemolytica y P. multocida a partir de hisopos nasales obtenidos de 
cabritos con signología respiratoria, logrando un mayor porcentaje de 
aislamiento de la primera que de la segunda. 
 
La mayoría de los estudios en ganado bovino reporta una mayor 
frecuencia de afecciones por P. multocida en comparación con M. 
haemolytica (Dabo, et al., 2008). En otros, como por ejemplo, en el 
Reino Unido la pasteurelosis neumónica bovina se da por infección 
con P. multocida y ésta ha incrementado en prevalencia en el ganado 
del 2001 al 2005 donde fue frecuentemente diagnosticada como la 
causa de neumonía bacteriana bovina y excede el número de brotes 
causadas por M. haemolytica (Dagleish, et al., 2010). En el caso de 
cabras, en el presente estudio se aisló en mayor número de veces a 
M. haemolytica, donde los cabritos presentaban signos de problemas 
respiratorios. 
 
M. haemolytica es el microorganismo más comúnmente aislado de los 
pulmones de ganado bovino y ovino con enfermedad respiratoria 
severa (McClenahan, et al., 2008). En casos de fiebre de embarque 
Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/)
http://www.novapdf.com/
http://www.novapdf.com/
 39 
en bovinos se comporta como la más aislada, pero en los casos 
fatales en ganado de engorda se aísla más P. multocida (Dabo, et al., 
2008). 
 
En ovinos la prevalencia de aislamientos bacterianos varía entre 10 y 
40%. En todos los casos las neumonías ocupan siempre uno de los 
primeros lugares como causa de mortalidad (Trigo, 1987). 
 
Un estudio realizado en México, informa una prevalencia de lesiones 
neumónicas del 8.7% para becerros Holstein y en explotaciones de 
bovinos lecheros se han encontrado en animales de desecho una 
presencia de entre 13 y 31% entre 1976 y 1983, las lesiones indican 
neumonía en general sin importar el agente infeccioso o etiología 
(Trigo, 1987). 
 
En el presente estudio se realizó la identificación molecular de M. 
haemolytica a través del gen sodA, ya que es un gen constitutivo. Se 
han empleado otros genes constitutivos para caracterizar 
aislamientos, estos se recomiendan cuando la identificación por 
medios fenotípicos es complicada, difícil o requiere de mucho