Efecto-de-ghrelina-y-24-tiazolidinediona-sobre-la-diferenciacion-de-tejido-adiposo-de-ovinos-in-vitro

Vista previa del material en texto

EFECTO DE GHRELINA Y 2,4-TIAZOLIDINEDIONA SOBRE 
LA DIFERENCIACIÓN DE TEJIDO ADIPOSO DE OVINOS IN VITRO 
 
 
TESIS 
 
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE: 
MÉDICA VETERINARIA ZOOTECNISTA 
PRESENTA: 
BRICIA PLATA ANAYA 
ASESOR: Dra. MARÍA OFELIA MORA IZAGUIRRE 
 
CUAUTITLÁN IZCALLI, ESTADO DE MÉXICO 2010 
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
DE MÉXICO 
 
 
 
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES 
CUAUTITLÁN 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Con cariño a mi familia que son el pilar de mi vida, 
especialmente a mi madre, mumi Te amo; a mis 
hermanos Ale y Rocker, que están siempre al pie del 
cañón, a mis amigas y amigos Ely, Sandy, Juan José 
y Héctor por haber compartido juntos, durante 
éstos 5 años, ésta generosa carrera. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
A la Universidad Nacional Autónoma de México, por ofrecerme la oportunidad de 
formar parte de “la máxima casa de estudios del país” y en especial, a la Facultad 
de Estudios Superiores Cuautitlán Campo 4 por haberme formado en el camino 
profesional y ético de la Medicina Veterinaria y Zootecnia. 
A la Doctora Ofelia Mora Izaguirre por la asesoría de esta tesis, y a su 
incondicional apoyo y amistad que me ha ofrecido al final de mi carrera. 
Al Doctor y Profesor Emérito de la FES-C Dr. Armando Shimada Miyasaka por su 
confianza. 
Al Dr. José Luis Romano por el interés y el aporte financiero de éste proyecto. 
Al Instituto de Neurobiología, en especial al Dr. Alfredo Varela por su apoyo en el 
Laboratorio A-03 de Biología Molecular. 
A la Unidad de Proteogenómica en especial a la Dra. Anaid Antaramian y a la 
M en C Adriana González Gallardo. 
A la M en C Laura González Dávalos por su atención brindada en este proyecto. 
A la Dra. Patricia García Rojas Montiel por su generosa hospitalidad durante el 
tiempo en que realicé este proyecto. 
En general a todos mis compañeros (as) del laboratorio A-03 por su amistad y 
apoyo durante la realización de este trabajo. 
 
 
 
 
El presente trabajo fue financiado por el Proyecto 12604 del Fondo Sectorial de 
Investigación en Materia Agrícola, Pecuaria, Acuacultura, Agrobiotecnología y 
Recursos Filogenéticos 
 
Se realizó en el Laboratorio A3 del Instituto de Neurobiología de la UNAM, campus 
Juriquilla 
 
INDICE GENERAL 
Resumen 1 
I.Introducción 3 
II.Revisión Literaria 5 
2.1 Producción ovina 5 
2.2 Factores que intervienen en la modulación en el consumo alimenticio 7 
2.3 Ghrelina 8 
2.3.1 Distribución de Ghrelina en los tejidos 10 
2.3.2 Estructura 10 
2.3.3 Receptor de ghrelina 12 
2.3.4 Acciones fisiológicas de la ghrelina 13 
2.3.5 Efectos sobre la secreción de GH 14 
2.3.6 Efectos sobre el balance energético 14 
2.3.7 Ghrelina y adipogénesis 15 
2.4 Tejido adiposo 16 
2.4.1 Tejido adiposo blanco 16 
2.4.2 Modelos de estudio del tejido adiposo blanco 17 
2.4.3 Diferenciación adipocitaria 19 
2.4.4 Inhibición del crecimiento 20 
2.4.5 Expansión clonal 20 
2.4.6 Expresión de genes marcadores del adipocito 20 
2.4.7 Eventos tardíos y diferenciación terminal 22 
III.Justificación 24 
IV.Hipótesis 24 
V.Objetivos 25 
VI.Material y Métodos 26 
VII.Resultados 30 
VIII.Discusión 36 
IX.Conclusiones 39 
X.Técnicas empleadas 40 
10.1 Purificación de RNA (RNeasy, Qiagen) 40 
10.2 Transcripción reversa (RT) 41 
10.3 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR convencional) 42 
10.4 Electroforesis en gel de agarosa 43 
10.5 PCR Cuantitativo 47 
XI.Bibliografía 49 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE CUADROS 
 
Cuadro 1. Neuropéptidos, neurotransmisores y hormonas involucradas 
en el control de la ingesta de alimento. 
 
8 
Cuadro 2. Alineación de los aminoácidos de ghrelina en diferentes especies. 12 
Cuadro 3. Rol de la Fisiología de Ghrelina. 14 
Cuadro 4. Modelos celulares in vitro para el estudio de la diferenciación 
adipocitaria. 
 
 
18 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
Figura 1. Estructura de ghrelina acilada. 11 
Figura 2. Cultivos primarios de tejido adiposo subcutáneo. 30 
Figura 3. Fibroblastos de tejido adiposo subcutáneo en estado 
 de preconfluencia. 
 
 
31 
Figura 4. Cultivo primario de tejido adiposo subcutáneo con 
seis diferentes tratamientos. 
 
 
32 
Figura 5. Morfología de un adipocito maduro de tejido adiposo subcutáneo. 32 
Figura 6. Efecto de ghrelina y TZD sobre los niveles de inducción del 
 mRNA de PPARγ, durante la adipogenésis en ambos tejidos. 
 
 
33 
Figura 7. Efecto de ghrelina y TZD sobre los niveles de inducción del 
mRNA de PPARγ, durante la adipogenésis en tejido adiposo subcutáneo. 
 
 
34 
Figura 8. Efecto de ghrelina y TZD sobre los niveles de inducción del 
mRNA de PPARγ, durante la adipogenésis en tejido adiposo omento. 
 
 
 
35 
 
1 
 
RESUMEN 
La ghrelina es un péptido que actúa como ligando natural del receptor de 
secretagogos de la hormona de crecimiento (GHS-R). Se ha aislado de las células 
X/A del estómago. Tiene una variedad de funciones, principalmente en la 
regulación de secreción de la hormona de crecimiento y en el metabolismo 
energético. Dentro de éste último, la ghrelina estimula el consumo de alimento e 
incrementa el peso corporal en humanos y ratas. Recientemente la ghrelina ha 
demostrado tener efectos orexigénicos y adipogénicos en ratas in vivo e in vitro. 
La ghrelina también ha mostrado un efecto adipogénico, ya que incrementa la 
expresión del receptor activado por proliferadores peroxisomales gamma (PPARγ), 
que es un receptor nuclear de hormonas necesario para el desarrollo del tejido 
adiposo. Con el objetivo de comparar el efecto adipogénico de ghrelina y 2, 4 
tiazolidinediona (2,4-TZD) en el tejido adiposo de ovino in vitro, se utilizaron 
cultivos primarios de tejido adiposo subcutáneo y de omento de 6 ovinos pelibuey. 
Los tratamientos para el proceso de diferenciación de los cultivos primarios 
consistieron en medio basal (como control negativo), medio de diferenciación 
(controlpositivo), 2,4-TZD y diferentes dosis de ghrelina (500, 1000 y 1500 pg/ml). 
Una vez diferenciadas las células, se extrajo el RNA total, posteriormente 
mediante la técnica de RT-PCR se identificó la expresión de PPARγ y se cuantificó 
mediante PCR Tiempo Real. Los resultados obtenidos muestran que los 
tratamientos de ghrelina y TZD no incrementaron los niveles de expresión de 
PPARγ sobre el medio de diferenciación (p<0.01). Los resultados muestran que el 
2 
 
medio de diferenciación fue el mejor inductor de la diferenciación adiposa de 
ovinos in vitro, medido esto a través de la expresión de PPARγ. 
Palabras clave: tejido adiposo, diferenciación adipocitaria, ghrelina, 2-4 
tiazolidinedionas, PPARγ. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 
 
I. INTRODUCCIÓN 
La ovinocultura en México representa una de las actividades del sector pecuario 
que ha experimentado un auge en los últimos años, pasó de ser una actividad de 
ahorro familiar para autoconsumo a una actividad empresarial. Un factor 
determinante que detona esta actividad es la engorda de corderos, que permite 
acceder al mercado con un producto diferente en cuanto a calidad y que lleva al 
barbacoyero a mejorar los rendimientos y consecuentemente mejorar los precios 
para el productor en menor tiempo.1 
La producción de ganado ovino para carne se desarrolla bajo diferentes contextos 
agroclimáticos, tecnológicos, sistemas de manejo y finalidad de explotación, la 
cual comprende principalmente la producción de corderos para engorda y compra-
venta de animales viejos o de reemplazo criados en praderas para engorda en 
corral. En México el principal sistema de producción para engorda se realiza de 
forma intensiva, con un aumento en los costos de producción, para lo cual se 
requiere formular estrategias especificas a corto, mediano y largo plazo, que 
permitan un adecuado manejo técnico y económico del sistema de producción. 2 
Dentro del manejo técnico podemos mencionar como las de mayor importancia, el 
uso de razas especializadas para carne y la mejora de los sistemas de 
alimentación. 2 
La alimentación representa aproximadamente el 60% de los costos de producción, 
por lo que ha sido necesario investigar acerca de los factores que se ven 
4 
 
implicados en el consumo de los animales que provoquen un aumento del mismo 
y una ganancia de peso en menor tiempo. 2 
De manera que si se tiene un buen sistema de alimentación, éste se verá reflejado 
en canales de calidad, la cual estará dada por las características del músculo y la 
grasa. 
El sabor y la ternura de las carnes están determinados por el contenido de grasa. 
Los animales alimentados bajo el sistema intensivo producen carne más aceptable 
que la proveniente de animales finalizados en pastoreo, debido a que la grasa 
corporal de éstos últimos es escasa, lo cual reduce la ternura y gustocidad de su 
carne. 
La ghrelina es una hormona que se ha relacionado con en el consumo de 
alimento, es un péptido orexigénico que se produce principalmente en el 
estómago, actúa como ligando natural del receptor del secretagogo de la hormona 
de crecimiento GHS-R, tiene efectos en el metabolismo energético y se ha 
encontrado que estimula la diferenciación del tejido adiposo blanco de ratones.3 
Con estos antecedentes resulta importante conocer el efecto de la ghrelina sobre 
la proliferación y diferenciación del tejido adiposo en ovinos, para que en el futuro 
pudiera ser usada en los sistemas de alimentación de ésta especie, mejorando la 
producción ovina y la calidad de la canal. 
 
5 
 
II. REVISIÓN DE LITERATURA 
2.1 Producción ovina 
La producción pecuaria en México genera entre otros, uno de los nutrientes 
importantes en la dieta de los mexicanos: la proteína animal, la cual se puede 
obtener de productos de origen animal, como la carne de ovino. 4 
Actualmente México cuenta con 7, 305, 578 cabezas de ovinos registrados en 
2007, que generaron 48 534 toneladas de carne que fueron destinadas al 
consumo, en su mayoría para barbacoa, produciéndose un consumo per cápita de 
0.8 kg/habitante. La mayor producción se concentra en los estados de México, 
Hidalgo, Veracruz y Puebla.5, 6 
La producción nacional de carne, cubre aproximadamente el 56% del consumo, lo 
que genera que el 44% sea de importación de países como Australia, Nueva 
Zelanda y Estados Unidos, principalmente. 8 
Como ya se mencionó, en los últimos años se han registrado cambios en cuanto a 
la integración de la cadena de la industria ovina en México, que se reflejan en 
cambios drásticos en el esquema de producción y transformación, de manera 
resumida, se puede decir que se ha modificado el objetivo de la producción ovina, 
que ha mantenido el inventario con un ligero crecimiento de 2.43% de acuerdo a la 
Tasa Media Anual de Crecimiento (TMAC) y se ha mejorado significativamente la 
producción y productividad, situación que en gran medida se debe a que se han 
6 
 
integrado esquemas de engordas intensivas tecnificadas.6 La engorda y 
finalización de corderos en corral es hoy en día parte fundamental dentro de la 
industria ovina mexicana, por lo que, es de gran importancia hacer investigaciones 
acerca de técnicas que mejoren la productividad de las engordas de corderos, 
tratando con esto de encontrar estrategias que permitan eficientizar al máximo la 
utilización de los recursos y mejorar los parámetros productivos de los corderos 
para lograr con esto mejorar la rentabilidad de la ganadería ovina.7 Una de las 
principales herramientas para mejorar la productividad de los corderos en 
engorda, es el poder influir sobre el consumo voluntario (CV) de alimento, ya que 
de este depende gran parte de la productividad del animal. 8 Si se ve al cordero 
como un medio para producir alimento de origen animal de alta calidad para el 
consumo humano y la materia prima para conseguir esto, es el alimento que 
consume el cordero, entonces incrementar el CV del animal dará como resultado 
una más rápida transformación a carne para consumo humano. Sin embargo, para 
tratar de manipular el consumo de los animales es necesario conocer la fisiología 
del mismo. 
 
 
 
 
7 
 
2.2 Factores que intervienen en la modulación del consumo alimenticio 
La regulación del balance de nutrientes depende de una estrecha relación entre lo 
que se ingiere, para mantener un estado nutritivo constante y en lo que se 
consume, para ejecutar las funciones de un individuo. De manera que el 
organismo controla mediante diversos estímulos el apetito y la saciedad.9 
La modulación de la ingesta puede ser regulada por dos vías: central y periférica. 
El hipotálamo contiene múltiples sistemas neuronales, algunos contribuyen en la 
regulación de la homeostasis del balance energético; otros estimulan el consumo 
de alimento (señales orexigénicas) y otros lo disminuyen (señales 
anorexigénicas).9 
Los primeros investigadores observaron que las lesiones en diversas áreas del 
hipotálamo afectaban el comportamiento alimentario y la regulación del peso 
corporal. Así, las lesiones bilaterales del hipotálamo ventromedial producían 
hiperfagia y obesidad, mientras que las lesiones laterales se traducían en afagia y 
pérdida de peso. Recientes investigaciones señalan que existen otras zonas del 
cerebro implicadas en la regulación del apetito. Adicionalmente a esta regulación 
central existen otras sustancias que se originan en la periferia, la mayoría 
constituidas por péptidos como la colecistocinina CCK, la insulina, el péptido 
similar al glucagón (GLP), la ghrelina, la leptina, así como la glucosa y otras 
sustancias producidas por el metabolismo (ver cuadro 1). 9 
 
8 
 
Cuadro 1. Neuropéptidos, neurotransmisores y hormonas involucradas en el 
control de la ingesta de alimento. Abreviaturas, AgRP: péptido relacionado agouti; 
CART: transcrito regulado por cocaína y anfetamina; CCK: colecistoquinina; CRH: 
hormona liberadorade corticotropina; GLP-1: péptido similar al glucagon 1; MCH: 
hormona concentradora de los melanocitos; α- MCH: hormona estimulante de los 
melanocitos; NPY: neuropéptido Y; POMC: pro-opiomelanocortina; PYY: péptido 
YY (adaptado de Perelló et al., 2004) 9 
Origen Actividad 
Orexigénica 
Actividad 
Anorexigénica 
Hipotalámico NPY CRH 
 Galanina Urocortina 
 β -endorfina α-MSH 
 Dinorfinas GLP-1 
 Encefalinas CART 
 MCH Neurotensina 
 Orexinas 
 AgRP Serotonina 
 Glutamato GABA 
 
Noradrenalina 
 
Periférico Glucocorticoides Insulina 
 Ghrelina Leptina 
 PYY 
 CCK 
 
2.3 Ghrelina 
Algunos de lo factores que estimulan el apetito son producidos en el estómago, 
convirtiéndolo en uno de los principales reguladores de la ingesta; incluso el efecto 
físico del llenado mismo del estómago es un factor limitante para el consumo. Se 
ha mencionado que alimentos demasiado voluminosos determinan rápidamente 
9 
 
que el animal deje de comer, incluso dietas voluminosas y pobres en nutrientes. El 
estómago está comunicado con el sistema nervioso central por medio del nervio 
vago, en dicha comunicación, utiliza péptidos como neuromedina B y péptido 
liberador de la gastrina en dicha comunicación.10, 11 
En la actualidad se conocen muchos factores que intervienen en la regulación del 
consumo alimenticio. Uno de esos factores que se ha investigado en años 
recientes es la ghrelina, una hormona involucrada en el consumo voluntario y en el 
metabolismo energético.3 
Las primeras moléculas con actividad liberadora de la hormona de crecimiento 
GH (por sus siglas en inglés) se sintetizaron por Bowers et al., (1984) y se les 
denominó secretagogos de GH.12 Posteriormente se sintetizaron otros compuestos 
similares, de naturaleza tanto peptídica como no peptídica, recibiendo en conjunto 
el nombre de secretagogos de hormona de crecimiento (GHS).13 Estos 
compuestos liberadores actúan a través de receptores. El descubrimiento y 
clonación en 1996 del receptor específico para secretagogos de la hormona de 
crecimiento (GHS-R), puso de manifiesto la existencia de un ligando endógeno 
para este receptor.14 Kangawa et al., 1990, purificaron a partir de estómago de 
rata el ligando endógeno para los receptores de secretagogos de GH 
denominado Ghrelina. El termino Ghrelina es una palabra de raíz indoeuropea 
“ghr” que significa “crece”, en vista de la capacidad que tiene este péptido para 
liberar GH.3, 15 
10 
 
2.3.1 Distribución de Ghrelina en los tejidos 
El mayor sitio de producción de ghrelina es el estómago en su parte fúndica, 
principalmente por las células enteroendócrinas, llamadas células tipo A, que 
están presentes en las glándulas oxínticas del estómago, también se produce en 
el intestino delgado y grueso. Estas células contienen gránulos densos y 
compactos con ghrelina y constituyen cerca de la quinta parte de las células 
enteroendócrinas de la mucosa oxíntica en animales adultos. Existen otros 
órganos donde se ha localizado la expresión de RNAm de ghrelina como la 
hipófisis, hipotálamo, corazón, hígado, páncreas endocrino, pulmón, tejido adiposo 
blanco, gónadas y linfocitos.15, 16 
2.3.2. Estructura 
La ghrelina es un péptido de 28 aminoácidos, el cual se encuentra unido a un 
ácido graso, en el residuo 3 de serina contiene 8 carbonos, esta acilación es 
crucial para su acción orexigénica y para la liberación de la GH, mediante la unión 
con el GHS-R (figura 1). 15 
En el fondo gástrico se produce gran cantidad de ghrelina, la cual inicialmente no 
posee acilación en la estructura y por lo tanto no genera actividad con el GHS-R, 
pero se ha demostrado que al igual que la ghrelina completa induce 
adipogénesis.17 
11 
 
Ambas, ghrelina acilada y ghrelina desacilada están presentes en la circulación 
periférica, siendo la ghrelina desacilada la que se encuentra en mayor proporción 
en la circulación, esto sucede porque el ácido graso de la serina 3 es altamente 
inestable.18 
 
Figura 1. Estructura de ghrelina acilada (adaptado de Kojima et al., 2004) 
La ghrelina humana y la de la rata son péptidos de 28 aminoácidos, mientras que 
la de ovino esta compuesta de 27 aminoácidos, por la ausencia de la glutamina en 
la posición 14 de la cadena.19 
En la mayoría de los mamíferos en que se han estudiado las secuencias de 
aminoácidos de la ghrelina, estas han mostrado un alto grado de similitud, ya que 
los 10 aminoácidos N-terminales son idénticos y la acilación del residuo 3 se ha 
encontrado en las especies de vertebrados estudiadas que incluyen aves, reptiles, 
anfibios y peces. Incluso se ha comprobado con la observación in vitro, que un 
Acilo 
12 
 
fragmento acilado con solo los primeros 5 aminoácidos de la cadena N-terminal, 
estimula el GHS-R con una potencia similar al del péptido completo (cuadro 2).20 
Cuadro 2. Alineación de los aminoácidos de ghrelina en diferentes especies 
(adaptado de Kojima et al., 2005)24 
Mamífero 1 * 10 20 28
Humano G S S F L S P E H Q R V Q Q R K E S K K P P A K L Q P R
Mono Rhesus G S S F L S P E H Q R A Q Q R K E S K K P P A K L Q P R
Ratón G S S F L S P E H Q K A Q Q R K E S K K P P A K L Q P R
Gerbo de Mongolia G S S F L S P E H Q K T Q Q R K E S K K P P A K L Q P R
Rata G S S F L S P E H Q K A Q Q R K E S K K P P A K L Q P R
Perro G S S F L S P E H Q K L Q Q R K E S K K P P A K L Q P R
Cerdo G S S F L S P E H Q K V Q Q R K E S K K P A A K L K P R
Borrego G S S F L S P E H Q K L Q – R K E P K K P S G K L K P R
Bovino G S S F L S P E H Q K L Q – R K E A K K P S G K L K P R
Aves 1 * 10
Pollo G S S F L S P T Y K N I Q Q Q K D T R K P T A R L H
Pato G S S F L S P E F K K I Q Q Q N D P T K T T A K I H
Emu G S S F L S P D Y K K I Q Q Q K D P R K P T T K L H
Ganso G S S F L S P E F K K I Q Q Q N D P A K A T A K I H
Pavo G S S F L S P A Y K N I Q Q Q K D T R K P T A R L H P R
Peces 1 * 10 20 23
Trucha Arcoiris 1 G S S F L S P S Q K P Q V R Q G K G K – P P R V
Trucha Arcoiris 2 G S S F L S P S Q K P Q G K G K – P P R V
Anguila Japonesa G S S F L S P S Q R P Q G K D K K P P R V
Pez Dorado G T S F L S P A Q K P Q – – G R R P P R V
Pez Zebra G T S F L S P T Q K P Q – – G R R P P R V
Tilapia G S S F L S P S Q K P Q N K V K S S R I
Anfibio
Rana Toro G L T F L S P A D M Q K I A E R Q S Q N K L R H G N M N 
 
2.3.3. Receptor de ghrelina 
Los receptores para los secretagogos pertenecen a la familia de receptores 
acoplados a proteína G, con siete dominios transmembrana y están integrados por 
366 aminoácidos. Estos receptores se han expresado principalmente en 
hipotálamo e hipófisis y se han aislado dos tipos de secuencias GHS-R1a y 
13 
 
GHS-R1b. El GHS-R1a, es el receptor activo a los secretagogos de GH. 3, 20 El 
receptor activo para ghrelina se ha localizado en órganos como corazón, riñón, 
hígado, páncreas, estómago e intestinos además en tejido adiposo, sin embargo, 
el receptor para ghrelina se encuentra en mayor cantidad en los núcleos arcuato y 
ventromedial del hipotálamo y en la glándula hipófisis.21 
2.3.4. Acciones fisiológicas de la ghrelina 
La amplia distribución del GHS-R, indican que la ghrelina producida y secretada 
en el estómago puede tener una variedad de funciones regulatorias en el cerebro 
y tejidos periféricos a través de diversas vías (cuadro 3).22 La actividad fisiológica 
más estudiada ha sido por su capacidad como factor liberador de la hormona 
GH.17 Estudios recientes demuestran que la ghrelina tiene efectos orexigénicos y 
adipogénicos en ratones. Datos publicados indican que la ghrelina antagoniza las 
acciones de la leptina en la rata a través de la activación del receptor neuropéptido 
Y-Y1 hipotalámico. Así también se ha reportado que estimula la prolactina, ACTH 
y cortisol, en humano. La inducciónde ghrelina incrementa el peso corporal y el 
tejido adiposo. 22 
 
 
 
14 
 
Cuadro 3. Papel fisiológico de la Ghrelina (adaptado de Susuki et al., 2006)23 
Metabolismo 
energético 
Estimula el apetito 
 Promueve el almacenamiento de tejido adiposo 
Tracto 
gastrointestinal 
Promueve la motilidad gástrica 
Sistema endocrino Estimula la secreción de ACTH 
 Estimula la secreción de la GH 
Sistema 
cardiovascular 
Incrementa el gasto cardiaco 
 Disminuye la presión arterial, sin ningún cambio 
significativo en la frecuencia cardiaca 
 
2.3.5 Efectos sobre la secreción de la hormona de crecimiento. 
La ghrelina actúa sobre el GHS-R, incrementando el Ca2+ intracelular utilizando a 
éste como segundo mensajero, y estimulando así la liberación de GH. La actividad 
de ghrelina es similar a la hormona liberadora de GH, (GHR) solo que ésta última 
utiliza AMPc como segundo mensajero. El efecto máximo de estimulación por la 
ghrelina es dos a tres veces más que GHRH in vivo. La inyección de ghrelina 
induce la potente liberación de GH en ratas y humanos. 24 
2.3.6 Efectos sobre el balance energético 
Diversos estudios en diferentes especies han mostrado que la administración de 
ghrelina favorece un incremento en la ingesta de alimento. La ghrelina ejerce 
15 
 
efectos sobre el balance energético de manera dependiente e independiente del 
aumento de la ingesta de alimentos. Los efectos sobre la ingesta y de adiposidad, 
son independientes de los efectos sobre la secreción de GH, que son mediados 
por mecanismos centrales específicos.20 La ghrelina está contenida en neuronas 
del núcleo arqueado del hipotálamo, que es una región que regula el apetito. A 
este respecto, se ha encontrado que la ghrelina aumenta la expresión en neuronas 
del núcleo arqueado hipotalámico de dos péptidos con claros efectos orexigénicos: 
neuropéptido Y (NPY) y la proteína relacionada con la proteína Agouti (AgRP). En 
contraste con la leptina que disminuye la expresión de NPY y AgRP, también la 
ghrelina inhibe neuronas que producen propiomelanocortina (POMC) y el 
transcrito regulado por cocaína y anfetamina (CART) las cuales producen efectos 
anorexigénicos. 24 
2.3.7 Ghrelina y adipogénesis 
Ghrelina tiene diferentes líneas de estudio, entre ellas su participación en el 
metabolismo energético, estimulación del consumo de alimento, inducción de 
adipocidad y aumento del peso corporal.25 Choi et al., 2003, demostraron que la 
ghrelina aplicada sobre preadipocitos de rata (de tejido adiposo blanco de 
regiones epididimal y parametrial) in vitro inducía la diferenciación hacia adipocitos 
maduros. También evaluaron la expresión del RNAm del PPARγ, que es usado 
como un indicador en el proceso de diferenciación de preadipocitos, observando 
un incremento de esta expresión por medio de RT-PCR.22 
16 
 
La ghrelina desacilada es una de las formas de ghrelina que se presenta en mayor 
concentracion en la circulación, siendo la forma que más participa en el proceso 
de diferenciación in vitro. Aunque ambas formas participan en el proceso de 
adipogenesis, solo la ghrelina desacilada ha demostrado que no utiliza al receptor 
GHSR 1α para su función, al contrario de la forma acilada de ghrelina.26, 27 
2.4 Tejido Adiposo 
El tejido adiposo se distribuye en diferentes zonas del cuerpo, principalmente en 
área dérmica, subcutánea, mediastínica, mesentérica, perigonadal, perirrenal y 
retroperitoneal.28 Los mamíferos cuentan con dos tipos de tejido adiposo: el tejido 
adiposo pardo o marrón y el tejido adiposo blanco, ambos tienen funciones 
distintas. El tejido adiposo blanco almacena la energía sobrante en forma de 
triacilgliceroles y cuando la ingesta es menor al gasto energético libera ácidos 
grasos libres y glicerol, mientras que el tejido adiposo pardo provee energía en 
forma de calor.29 
2.4.1 Tejido adiposo blanco 
El tejido adiposo blanco, lo constituyen diversos tipos celulares, como son: 
adipocitos (en ellos se almacenan las gotas de grasa), preadipocitos (células 
comprometidas con el linaje adipocitario pero vacías de lípidos), fibroblastos, 
células mesenquimales, células sanguíneas, células endoteliales y neurocitos. 30 
17 
 
Varios estudios señalan que los adipocitos derivan de un precursor embrionario 
multipotente, el cual tiende a diferenciarse en células unipotentes y éstas a su vez 
generan otros linajes celulares como condrocitos, miocitos, osteoblastos y 
adipocitos. 31 
2.4.2 Modelos de estudio del tejido adiposo blanco 
El estudio de los procesos de diferenciación adipocitaria se ha realizado mediante 
diferentes modelos celulares in vitro, que han permitido conocer los eventos 
moleculares y celulares que se llevan a cabo durante la transición de células 
indeferenciadas llamados preadipocitos hasta la formación de células grasas 
redondeadas maduras. Estos modelos son principalmente las líneas celulares 
preadipocitarias y los cultivos primarios de células precursoras provenientes del 
estroma vascular del tejido adiposo (Cuadro 4).28, 31 
 
 
 
 
 
 
18 
 
Cuadro 4. Modelos celulares in vitro para el estudio de la diferenciación 
adipocitaria (adaptado de Moreno et al., 2002) 28 
Líneas 
celulares 
Origen /Especie 
Indicadores de la 
diferenciación 
Categorias 
ES Blastocitos/Embrión ratón Ácido retinóico Totipotente 
Ta1 
Fibroblastos 10 T1/2 tratados con 5-
azacitidina/Embrión ratón 
10%, SFB
1
, Insulina, 
dexametazona Multipotente 
3T3-L1 Fibroblastos/Embrión ratón 10%, SFB, Insulina, 
dexametazona, IBMX
2
 
Unipotente 
3T3-F442A Fibroblastos/Embrión ratón 10%, SFB, insulina Unipotente 
Ob17 Grasa epididimal/ratón ob/ ob adulto 8% SFB, insulina, 
tridoyotironina 
Unipotente 
Cultivos 
Primarios 
Origen Inductores de la 
diferenciación 
Categorías 
Rata Células estromas vasculares de grasa 
subcutánea, epididimal, retroperitoneal. 
Insulina con o sin SBF Unipotente 
Ratón Células estroma vasculares de grasa 
subcutánea 
Insulina, HDL
3
, dexametazona Unipotente 
Cerdo Células estromas vasculares de grasa 
subcutánea 
Insulina con o sin 
glucocorticoides 
Unipotente 
Humano Células estroma vasculares de grasa 
subcutánea y omental. 
Insulina y glucocorticoides Unipotente 
1. SFB suero fetal bovino; 2. IBMX: isobutilmetilxantina; 3. HDL: lipoproteínas de alta densidad. 
Las líneas celulares preadipocitarias como la 3T3-L1 y la 3T3-F442A las cuales 
fueron aisladas por clonación desde células derivadas de embrión de ratón se han 
utilizado ampliamente para el estudio de la diferenciación adipocitaria. Son de 
morfología fibroblástica, aunque están comprometidas a la línea adipocitaria. Son 
células aneuploides, y esta característica puede influir en su capacidad para 
diferenciarse, de forma que los procesos in vitro no reflejan completamente lo que 
sucede en una situación in vivo.29 
 
19 
 
Los cultivos primarios de células precursoras se pueden obtener de diversas 
especies, en diferentes etapas del desarrollo postnatal y de diferentes depósitos 
grasos, esto es importante porque existen diferencias en el comportamiento 
metabólico de las células maduras según su origen anatómico, además de ser 
células diploides, que a diferencia de las líneas celulares reflejan mejor una 
situación in vitro.28, 29 
Tanto las líneas celulares de preadipocitos, como los cultivos primarios en su fase 
de crecimiento, son muy parecidos morfológicamente a los fibroblastos.30 Una vez 
que las células han alcanzado la confluencia, el tratamiento con inductores 
adecuados de la diferenciación conduce a un cambio drástico en la forma de las 
células.29,31 Los tratamientos incluyen inductores adipogénicos como la 
dexametasona (corticoide), isobutilmetilxantina (IBMX) que estimula el aumento de 
la concentración del AMPc y altas concentraciones de insulina, en presencia de 
suero fetal bovino. 28 
También se han usado ligandos de PPARγ, comolas tiazolidinedionas TZDs, 
estimulantes de la adipogénesis en líneas celulares y cultivos primarios. 29 
2.4.3 Diferenciación adipocitaria 
La diferenciación de las células del tejido adiposo es un proceso en el que los 
preadipocitos deben interrumpir su crecimiento y salir del ciclo celular previamente 
a su conversión terminal en adipocitos. En este proceso van adquiriendo la 
expresión de numerosos genes característicos del adipocito maduro, lo que 
20 
 
aunado a su función conducirá finalmente a la obtención del fenotipo característico 
del adipocito.32 
2.4.4 Inhibición del crecimiento 
Una vez que los preadipocitos alcanzan la confluencia, sufren inhibición por 
contacto, entonces cesa su multiplicación dejando que se exhiban algunos de los 
marcadores que conducirán a la diferenciación. La expresión de la 
lipoproteínlipasa (LPL) se considera como un marcador temprano de la 
diferenciación adipocitaria, se presenta de manera espontánea al mismo tiempo 
que se alcanza la confluencia, lo que sugiere que la LPL refleja el cese de la 
multiplicación.31, 33 
2.4.5 Expansión clonal 
Los tratamientos que inducen la adipogénesis promueven a los preadipocitos a 
que generar una o dos rondas de expansión clonal, antes de que se transcriban 
los genes marcadores del adipocito y su fenotipo. Esta expansión mitótica clonal 
de células comprometidas es esencial para completar la diferenciación terminal en 
adipocitos maduros.29 
2.4.6 Expresión de genes marcadores del adipocito 
Se han descrito dos familias de factores de transcripción, los exaltadores de unión 
a proteínas en sitios CCAAT (C/EBPs, por sus siglas en inglés) pertenecientes a la 
familia de región básica del cierre de leucina (bZIP) y los receptores proliferadores 
21 
 
de peroxisomas activados, especialmente el gama (PPAR, por sus siglas en 
inglés). Estos factores han sido identificados como los reguladores directos de 
genes adipogénicos.32 
La primera fase de la cascada de adipogénesis inicia con el incremento de la 
expresión y acumulación de los factores de trascripción C/EBPβ y C/EBPδ, 
estimulados in vitro por medio de isobutilmethilxantina y dexametasona, 
respectivamente. Se acumulan dentro de las primeras 4 horas, pero son 
inicialmente inactivos. En este proceso las células reingresan al ciclo celular y es 
cuando experimentan la expansión mitótica clonal.34, 35,36 
Durante la transición de la fase G1 a S, C/EBPβ es hiperfosforilado 
secuencialmente y de esta forma pasa a ser activo, siendo responsable de iniciar 
la activación del C/EBPα. La transcripción y activación de C/EBPα puede ser 
regulada mediante insulina.32, 37 
La segunda fase se presenta con la activación de los factores de transcripción de 
C/EBPα y PPARγ los cuales activan la expresión de la mayoría de los genes que 
caracterizan al fenotipo adipocitario, como son la sintasa de ácidos grasos (FAS, 
por sus siglas en inglés), la glicerolfosfato deshidrogenasa, la acetil CoA 
carboxilasa (ACO), el receptor de glucosa (GLUT4), el receptor de insulina y la 
proteína ligadora de ácidos grasos (aP2/FABP, por sus siglas en inglés), ambos 
tienen un efecto sinérgico sobre el proceso de diferenciación adipocitaria.38 
22 
 
PPARγ es un miembro de la superfamilia de receptores nucleares hormonales y 
como factor de transcripción necesita heterodimerizar con otro receptor nuclear de 
hormona, el receptor X de retinoides (RXR) para unirse al DNA y ser 
transcripcionalmente activo.29 Existen dos isoformas del PPAR γ, γ1 y γ2, siendo 
γ2 expresada en grandes cantidades en el tejido adiposo y está más relacionada 
con el metabolismo lipídico.39 
Las tiazolidinedionas (TZD’s), fármacos con acción antidiabética, actúan como 
ligandos directos de PPARγ, y se ha observado que son potentes y efectivos 
estimulantes de la adipogénesis.40, 41 Los factores de transcripción C/EBPb y 
C/EBPd parecen jugar también un importante papel en la inducción de PPARγ.42 
 
2.4.7 Eventos tardíos y diferenciación terminal 
En la fase final de la diferenciación, los adipocitos en cultivo incrementan 
marcadamente la lipogénesis de novo, observándose, por tanto, un incremento en 
la expresión y actividad de enzimas implicadas en esta ruta, tales como la 
sintetasa de ácidos grasos, enzima málica y la glicerol 3-fosfato deshidrogenasa; 
en esta etapa aumenta también considerablemente la sensibilidad a la insulina, 
debido a un gran aumento en el número de receptores de insulina y 
transportadores de glucosa dependientes de insulina (GLUT4). La diferenciación 
de los adipocitos conlleva una pérdida de receptores adrenérgicos β1, mientras 
que se produce un incremento de los β2 y β3, resultando un incremento total en el 
23 
 
número de receptores adrenérgicos. Además, se expresan y sintetizan también 
otros genes y productos específicos de los adipocitos como aP2, una proteína 
fijadora de ácidos grasos específica de adipocitos y perilipina, una proteína 
asociada a las gotas de lípidos.31 
 
 
 
 
 
 
 
24 
 
 
 
III. JUSTIFICACIÓN 
En roedores se ha observado que la aplicación de ghrelina promueve la 
adipocidad, lo que aunado al hecho de que en el promotor del gen de ghrelina 
existe un sitio PPRE para que se una PPARγ, sirve de justificación para plantear la 
posibilidad de que la aplicación de ghrelina en ovinos estimulará la proliferación y 
diferenciación de adipocitos in vitro, lo que a futuro podrá ser probado in vivo y 
permitirá su uso como fármaco para mejorar la calidad de la canal en ésta 
especie. 
 
 
IV. HIPÓTESIS 
La ghrelina actuará como promotor de la diferenciación adipocitaria de ovinos in 
vitro y ello se medirá mediante la expresión del factor de transcripción PPARγ. 
 
 
 
25 
 
 
V. OBJETIVOS 
 
Objetivo general 
Determinar el efecto de la ghrelina sobre la diferenciación del tejido adiposo ovino 
in vitro. 
 
Objetivos específicos 
1.- Evaluar el efecto de diferentes dosis de ghrelina (500, 1000 y 1500 pg) sobre la 
diferenciación de tejido adiposo blanco de ovino in vitro. 
2.- Evaluar el efecto de TZD sobre la diferenciación de tejido adiposo blanco de 
ovino in vitro. 
3.- Identificar la expresión del RNAm de PPARγ por PCR convencional y 
cuantificarlo mediante PCR cuantitativo. 
 
 
26 
 
VI. MATERIAL Y MÉTODOS 
Ubicación 
Este trabajo se realizó en el Laboratorio de RuMeN (Ruminología y Metabolismo 
Nutricional) de la FES-Cuautitlán ubicado en el laboratorio A-03 del Instituto de 
Neurobiología de la UNAM Campus Juriquilla, Querétaro. 
Animales 
Se usaron 6 ovinos Pelibuey, los cuales fueron sacrificados para obtener muestras 
de tejido adiposo de dos diferentes depósitos, subcutáneo y omento. 
Cultivos primarios de adipocitos 
Para el cultivo celular se recolectó tejido adiposo subcutáneo y de omento 
(aproximadamente 10 g) de cada uno de los animales, los cuales fueron 
depositados en tubos de 50 ml con 15 ml de medio basal cada uno. El medio basal 
consistió en una solución Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), que 
contenía 5% de suero fetal bovino (SFB), 100 mM de ácido ascórbico, 100 U/ml de 
penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina. Para la obtención de la pastilla celular las 
muestras fueron digeridas en una solución salina de Hanks balanceada (HBSS) 
que contenía 100 U/ml de penicilina, 100 g/ml estreptomicina y 250 ng/ml de 
anfotericina B, con 1 mg/ml de colagenasa tipo I por 2 h a 37°C con una agitación 
de 95 rpm. Las muestras se filtraron y centrifugaron por 5 min a 106 rcf. Se retiró 
el sobrenadante y se diluyó la pastilla de células con medio basal para ser 
27 
 
sembrado en cajas de 24 pozos con 0.5 ml en cada uno, incubándolas a 37°C con 
95 % de humedad relativa y 5% de CO2. Los cultivos celulares fueron lavados con 
solución salina de fosfatos (PBS 1X) después de 5 h. Una vez alcanzada la 
preconfluencia, se indujo la diferenciación de preadipocitos de los cultivosañadiendo al medio los agentes adipogénicos 3-isobutil-1-metilxantina 0.5 mM, 
0.25 μM dexametasona y 2.5 μg/ml de insulina por 2 días y aplicando a su vez los 
tratamientos, los cuales consistieron en medio basal (como control negativo), 
medio de diferenciación (control positivo), 20μM de 2,4-TZD y diferentes dosis de 
ghrelina (500, 1000 y 1500 pg/ml), utilizando 4 pozos por tratamiento. El medio fue 
reemplazado con DMEM que contenía 5% SFB, 2.5 μg/ml de insulina y se cambió 
cada tercer día. 
Extracción de RNA de células, PCR convencional y PCR cuantitativo 
Una vez que las células se diferenciaron se les extrajo el RNA total (Rneasy kit®, 
Qiagen, Apéndice 10.1), y a partir de éste se realizó una transcripción reversa, con 
la enzima superscript transcriptasa reversa (RT. Apendice 10.2) (Lifes 
Technologies, Inc), obteniéndose el DNA complementario. El RT se realizó 
utilizando oligo (dT). 
12-18 Una vez obtenido el producto de RT, este fue amplificado 
mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR. Apendice 10.3) con 
oligonuclétidos específicos para PPARγ, como indicador de diferenciación 
adiposa. Los oligonucleótidos utilizados fueron: Sentido 5´-
GACTTGAACGACCAAGTAACTC y Antisentido 5´-CTCTGCTAATACAAGTCCT. 
28 
 
La expresión de PPARγ fue detectada en gel de agarosa al 1% con una banda de 
511 pb. 
Posteriormente se cuantificó la expresión del gen de PPARγ mediante PCR 
cuantitativo o de tiempo real (Apéndice 10.5). Para ello se emplearon otro par de 
oligonucleótidos específicos, siendo éstos: el sentido 5´-
CTTCAGCTTTCTCCCTGAGC; y el antisentido 5´- GTCTGCCTGACGGTTCTTA. . 
Las muestras se prepararon por duplicado, incluyendo un blanco que sustituye al 
cDNA por agua, y se prepararon a su vez las mismas muestras pero utilizando 
oligos sentido y antisentido para el gen de β-actina citosólica como gen endógeno 
o de referencia. 
El producto del PCR se secuenció para comprobar que correspondiera a ghrelina 
en la Unidad de Proteogenómica del Instituto de Neurobiología de la UNAM 
campus Querétaro. La secuenciación se realizó en un 310 Abiprism sequencer 
con la versión 3 Big Dye de Applied Biosystems. Esta herramienta de biología 
molecular se basa en la determinación de la secuencia sucesiva de nucleótidos 
en una muestra de DNA. El método más popular para hacerlo se llama método de 
determinación por dideoxinucleótidos, porque utiliza nucleótidos sintéticos durante 
la reacción. 
Para secuenciar una muestra de DNA, este se desnaturaliza durante 5 minutos a 
94°C, debido a que el templado de DNA que se necesita para secuenciar tiene 
que ser de cadena sencilla. 
29 
 
Análisis Estadístico 
Para el análisis de resultados se utilizó un diseño estadístico completamente al 
azar con arreglo factorial, siendo la variable de respuesta el número de copias del 
mensajero de PPARγ. 
El modelo empleado fue: 
Y = µ + Tt i + Tej j + Tt-Tej j + E 
Donde: 
 Y = Variable de respuesta: número de copias de PPARγ; 
µ = Media poblacional; 
Tt i = Efecto del tratamiento en su i-ésimo nivel; 
Tej j = Efecto del tejido en su jotaésimo nivel; 
Tt-Tej j = interacción tratamiento-tejido 
E = error experimental. 
 
30 
 
VII. RESULTADOS 
Cultivos primarios 
Posteriormente al sembrado de los preadipocitos, tratados con medio basal, se 
registraron los cambios morfológicos de dichas células, ya que estos cambios 
enfatizan el momento para la aplicación de los medios de diferenciación con los 
diferentes tratamientos. 
Inicialmente los cultivos primarios de tejido adiposo de ovino presentaron células 
de morfología similar a fibroblastos, eritrocitos y algunos contaminantes como 
agentes patógenos u otros tipos celulares (figura 2). 
 
Figura 2. Cultivo primario de tejido adiposo subcutáneo. La flecha indica una célula de 
morfología similar a fibroblasto posterior a las 5 horas de haberse sembrado. Análisis en 
microscopio de fluorescencia, fotografías tomadas a 10X. 
 
fibroblasto 
eritrocito 
31 
 
Después de las 5 horas, se realizaron los lavados con PBS 1X, para mantener a 
las células viables, quitando con ello cualquier agente que estuviera contaminando 
el medio, evitando que los fibroblastos no compitieran por nutrientes y espacio en 
el proceso de proliferación. Durante el estado de preconfluencia (figura 3a), las 
células comenzaron a multiplicarse y se expandieron llenando la superficie de los 
pozos (figura 3b). Una vez logrado este estadío, se aplicaron los tratamientos de 
ghrelina y 2,4 -TZD utilizando los medios de diferenciación I y II. 
 
Figura 3. Fibroblastos de tejido adiposo subcutáneo en estado de preconfluencia. En la 
figura a los fibroblastos se encuentran en proceso de multiplicación en medio basal; en la 
figura b ya están confluentes logrando ocupar toda la superficie del pozo. Análisis en 
microscopio de fluorescencia, fotografías tomadas a 10X. 
En el proceso de diferenciación de los preadipocitos a adipocitos, se notaron los 
cambios morfológicos de una célula fibroblástica a un adipocito maduro, de 
conformación redonda y con gránulos de grasa, vistos microscópicamente en el 
campo obscuro, como una gota brillante dentro de la célula. A nivel microscópico 
todos los tratamientos generaron diferenciación de los preadipocitos, sin embargo 
el tratamiento con medio de diferenciación mostró el proceso más tempranano que 
los demás tratamientos (figura 4 y 5). 
a b 
32 
 
 
Figura 4. Cultivo primario de tejido adiposo subcutáneo con seis diferentes tratamientos. 
Cantidad de células diferenciadas con los diferentes tratamientos. (a) Medio basal (control 
negativo), (b) Medio de Diferenciación, (c) 2,4 -TZD, (d) ghrelina 500pg, (e) ghrelina 
1500pg, (f) ghrelina 1500pg. Análisis en microscopio de fluorescencia, fotografías 
tomadas a 10X. 
 
 
Figura 5. Morfología de un adipocito maduro de tejido adiposo subcutáneo. (a) 
Tratamiento con ghrelina y (b) tratamiento con 2,4 -TZD. Análisis en microscopio de 
fluorescencia, fotografías tomadas a 40X. 
 
 
 
 
 
 
a b f e d c 
a b 
33 
 
Cuantificación del RNAm de PPARγ 
Los niveles de expresión del gen de PPARγ inducidos por 2,4 -TZD y ghrelina 
fueron iguales a los del medio basal (figura 6) para los cultivos primarios de tejido 
adiposo de ovino in vitro, en contraste con el medio de diferenciación (control 
positivo), que marcó mayores niveles de inducción. 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Efecto de ghrelina y 2,4 -TZD sobre los niveles de inducción del mRNA de 
PPARγ, durante la adipogénesis en ambos tejidos. El medio basal representa el control 
negativo y el medio de diferenciación el control positivo. 
El efecto en el tejido adiposo subcutáneo, los niveles de expresión del RNAm de 
PPARγ efectuadas por 2,4 -TZD y ghrelina son iguales a las del medio basal 
(control negativo), el tratamiento que marcó mayores niveles de inducción fue el 
medio de diferenciación (figura 7). 
1
1.689
1.170
0.749
1.138 1.115
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
Medio 
Basal
Medio de 
Diferenciación
TZD Ghrelina 
500 pg
Ghrelina 
1000 pg
Ghrelina 
1500 pg
Tratamiento
V
e
c
e
s
 d
e
 i
n
d
u
c
c
ió
n
 d
e
l 
 
m
R
N
A
 d
e
 P
P
A
R
γ
Efecto de ghrelina y TZD sobre la inducción del mRNA de PPARγ de
cultivos primarios de tejido adiposo subcutáneo y omento de ovino
1
1.689
1.170
0.749
1.138 1.115
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
Medio 
Basal
Medio de 
Diferenciación
TZD Ghrelina 
500 pg
Ghrelina 
1000 pg
Ghrelina 
1500 pg
Tratamiento
V
e
c
e
s
 d
e
 i
n
d
u
c
c
ió
n
 d
e
l 
 
m
R
N
A
 d
e
 P
P
A
R
γ
Efecto de ghrelina y TZD sobre la inducción del mRNA de PPARγ de
cultivos primarios de tejido adiposo subcutáneo y omento de ovino
P<0.01, n=6, EE= 0.16 
a 
a a 
a 
a 
b 
34 
 
Para el caso del tejido adiposo de omento, los niveles de expresión del RNAm de 
PPARγ fueron iguales en los diferentes tratamientosen comparación con el medio 
basal (figura 8). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7. Efecto de ghrelina y 2,4 - TZD sobre los niveles de inducción del RNAm de 
PPARγ, durante la adipogenésis en tejido adiposo subcutáneo. Efecto en una población 
de seis animales, con una p< 0.01. 
 
 
 
 
 
1
2.195
1.318
1.088 1.153
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0.583V
e
c
e
s
 d
e
 i
n
d
u
c
c
ió
n
 d
e
l 
 
m
R
N
A
 d
e
 P
P
A
R
γ
Medio 
Basal
Medio de 
Diferenciación
TZD Ghrelina 
500 pg
Ghrelina 
1000 pg
Ghrelina 
1500 pg
Tratamiento
Efecto de ghrelina y TZD sobre la inducción del mRNA de PPARγ de
cultivos primarios de tejido adiposo subcutáneo de ovino
1
2.195
1.318
1.088 1.153
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0.583V
e
c
e
s
 d
e
 i
n
d
u
c
c
ió
n
 d
e
l 
 
m
R
N
A
 d
e
 P
P
A
R
γ
Medio 
Basal
Medio de 
Diferenciación
TZD Ghrelina 
500 pg
Ghrelina 
1000 pg
Ghrelina 
1500 pg
Tratamiento
Efecto de ghrelina y TZD sobre la inducción del mRNA de PPARγ de
cultivos primarios de tejido adiposo subcutáneo de ovino
a 
a 
a a 
a 
b 
35 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8. Efecto de ghrelina y 2,4 -TZD sobre los niveles de inducción del RNAm de 
PPARγ, durante la adipogenésis en tejido adiposo omento. Efecto en una población de 
seis animales, con una p< 0.01. 
 
 
 
 
 
1
1.182
1.021
0.915
1.188
1.076
0
0.5
1
1.5
2
2.5
V
e
c
e
s
 d
e
 i
n
d
u
c
c
ió
n
 d
e
l 
 
m
R
N
A
 d
e
 P
P
A
R
γ
Efecto de ghrelina y TZD sobre la inducción del mRNA de PPARγ de
cultivos primarios de tejido adiposo omento de ovino
Medio 
Basal
Medio de 
Diferenciación
TZD Ghrelina 
500 pg
Ghrelina 
1000 pg
Ghrelina 
1500 pg
Tratamiento
1
1.182
1.021
0.915
1.188
1.076
0
0.5
1
1.5
2
2.5
V
e
c
e
s
 d
e
 i
n
d
u
c
c
ió
n
 d
e
l 
 
m
R
N
A
 d
e
 P
P
A
R
γ
Efecto de ghrelina y TZD sobre la inducción del mRNA de PPARγ de
cultivos primarios de tejido adiposo omento de ovino
Medio 
Basal
Medio de 
Diferenciación
TZD Ghrelina 
500 pg
Ghrelina 
1000 pg
Ghrelina 
1500 pg
Tratamiento
a 
a 
a 
a 
a 
a 
36 
 
 
VIII. DISCUSIÓN 
Con base en los resultados obtenidos (Figuras 7, 8 y 9) podemos observar que ni 
la ghrelina ni la 2,4 -TZD aumentaron la expresión del RNAm del PPARγ, el cual 
fue utilizado con indicador de la diferenciación de los preadipocitos obtenidos a 
partir del tejido adiposo subcutáneo y de omento. Es decir, comparados con el 
medio de diferenciación (control positivo) ninguno de los tratamientos mostró ser 
superior a dicho control positivo. En el caso de los cultivos realizados a partir del 
omento, la TZD y la ghrelina fueron iguales al control positivo, no así para los 
cultivos de tejido adiposo subcutáneo donde los tratamientos con TZD y ghrelina 
fueron inferiores al control positivo. Estos resultados muestran que existe un 
efecto sobre la diferenciación adiposa dependiendo de la región anatómica con la 
cual se esté trabajando, en éste sentido en humanos se ha observado que la 
ghrelina acilada y desacilada in vitro en cultivos de adipocitos obtenidos del 
omento estimula la expresión del RNAm de PPARγ y SREBP1, éstos autores 
reportan el uso de dosis menores a las empleadas en éste trabajo. 44 
Por otro lado, Choi et al., (2003) obtuvieron un incremento de la expresión del 
RNAm de PPARγ en preadipocitos de las regiones epididimal y parametrial de 
ratas de cuatro semanas de edad, cuando aplicaron ghrelina en unas dosis de 
10-8 M, es decir casi 10 veces más que la empleada en éste trabajo.22 
37 
 
Es decir, además de la región anatómica, la diferenciación adiposa inducida por 
ghrelina también está afectada por la dosis empleada, lo que nos sugiere que en 
posteriores experimentos podrían probarse dosis superiores a las utilizadas. 
El efecto de la ghrelina sobre el aumento de la adiposidad, sobre todo la del tipo 
visceral en roedores ya ha sido probado por otros autores sin embargo su efecto 
sobre el tejido adiposo subcutáneo o sobre el aumento del consumo voluntario in 
vivo aún no es muy claro. 44, 25 
Recientemente se ha reportado que el efecto de la ghrelina sobre el tejido adiposo 
visceral tal vez no sea aumentando la diferenciación, lo que podría explicar porque 
en éste trabajo no se observó un aumento del RNAm de PPARγ, sino provocando 
un aumento en el volumen celular mediante la reducción en la exportación de 
lípidos vía el transportador G1 del casette de unión al ATP (Davies et al., 2009); 
los mismos autores señalan que el tratamiento con ghrelina no reguló ninguno de 
los biomarcadores de adipogenesis que ellos probaron en tejido adiposo visceral 
(PPARγ o CCAAT/potenciador de la proteína alfa) ni tampoco los reguladores de 
los substratos de entrada al tejido adiposo (glut4, lipoporoteína lipasa o CD36), 
aunque si observaron un incremento en la expresión del RNAm de SREBP1.45 
Estos autores mencionan que el efecto de ghrelina en el tejido adiposo también se 
ve afectado por el estado energético del propio tejido así como por mecanismos 
de ajuste fino de movilización de ácidos grasos, que en los rumiantes se sabe son 
de vital importancia por el estado de gluconeogénesis constante. 46 
38 
 
Por otro lado, se ha demostrado la presencia del receptor de ghrelina (GHS-R) en 
diferentes tejidos entre ellos el estómago, la región hipotalámica, el corazón, el 
pulmón, el páncreas, el intestino, el riñón y el tejido adiposo. Choi et al. (2003) 
demostraron la expresión de GHS-R en adipocitos aislados y cultivados de rata y 
midieron un aumento en la expresión del RNAm de dicho receptor por efecto de la 
adición de ghrelina en el medio de cultivo, en ovinos ya esta reportada la 
presencia de dicho receptor y se ha visto una inhibición en su expresión por efecto 
del uso de antagonistas in vitro, sin embargo no existen reportes del efecto de la 
ghrelina sobre su expresión, por lo que éste es un tema aún por estudiar en 
rumiantes productores de carne.22, 47 
En el futuro, resultará interesante estudiar el efecto de la ghrelina no solo sobre el 
tejido adiposo, sino también sobre el músculo en especies productoras de carne, 
dado su posible uso como agente promotor de la calidad y la cantidad de carne. 
 
 
 
 
 
 
 
 
39 
 
 
IX. CONCLUSIONES 
 
La hormona ghrelina no afecta la diferenciación del tejido adiposo subcutáneo ni 
de omento de ovino in vitro. 
El ligando sintético de PPARγ, 2, 4 TZD tampoco promovió la diferenciación 
adiposa de ovinos in vitro. 
Los mejores inductores de la diferenciación adiposa de ovinos in vitro fueron 3-
isobutil-1-metilxantina, dexametasona e insulina quienes aumentaron dos veces la 
expresión de PPARγ, gen maestro de la diferenciación adiposa. 
El presente trabajo servirá como referencia para futuras investigaciones sobre el 
efecto de ghrelina en la especie ovina, para lograr en un futuro cercano, mejorar la 
producción de ésta especie en México. 
 
 
 
 
40 
 
X. TÉCNICAS EMPLEADAS 
A continuación se describen las técnicas de Laboratorio antes mencionadas de 
manera más detallada. 
10.1 Purificación de RNA (RNeasy, Qiagen). 
1.- Colorar cada tratamiento (4 pozos) en un tubo de 1.5 ml con 350 µl de buffer 
RLT y agregar 3.5 µl de B mercaptoetanol. 
2.- Centrifugar el lisado por tres minutos a máxima velocidad y tomar solo el 
sobrenadante en un tubo nuevo. 
3.- Agregar un volumen de etanol al 70 % al lisado homogenizado y mezclar muy 
bien, homogenizando. 
4.- Pasar no mas de 700 µl de la muestra al RNeasy mini spin columna (el cual 
debe estar en un tubo colector), centrifugar por 15 segundos a 10 621 rcf. Si hay 
mas de 700 µƖ del lisado adicionarlo en la misma columna secuencialmente. 
Eliminar el líquido del tubo colector. 
5.- Agregar 70 µƖ del buffer RW dentro de la columna y centrifugar por 15 
segundos a 10 621 rcf para lavar. Descartar el líquido. 
6.- Agregar 500 µƖ de bufferRPE en la columna y centrifugar por dos minutos a 
máxima velocidad. Este paso puede repetirse para quitar cualquier residuo de 
etanol de la columna. 
7.- Volver a centrifugar a máxima velocidad por un minuto. 
41 
 
8.- Transferir la columna a un tubo colector nuevo y agregar 30 µƖ de agua libre 
de RNasa directamente en la columna. Eluir centrifugado por un minuto a 10 621 
rcf. 
9. Almacenar en alícuotas a -70° C. 
 
10.2 Transcripción reversa (RT). 
Transcripción reversa. 
1.- Preparar la siguiente reacción en un tubo de 500 µƖ 
2 mg de RNA 
6 µƖ de Buffer RT 5x. 
0.75 µƖ DNAsa. 
cbp 30 µƖ de agua. 
2.- Incubar a T ambiente durante 15 minutos. 
3.- Incubar a 70 ° C durante 5 minutos. 
4.- Añadir los siguientes reactivos 
1 µƖ oligonucleótido sentido ( Oligo dT 5 mM) 
1 µƖ dNTP´s (10 mM) 
5.- Incubar a T ambiente durante 5 minutos. 
42 
 
6.- Incubar en hielo mientras se añade 
2 µƖ Buffer 5x. 
3 µƖ DTT (0.1M) 
1 µƖ inhibidor RNAsa. 
7.- Homogenizar e incubar 42° C durante 2 minutos. 
8.- Añadir 1mµƖ de enzima RT-Superscript II (Invitrogen) 
9.- Incubar a 42° C durante 50 min. 
10.- Incubar 70° C durante 15 minutos. 
11.- Poner el cDNA en hielo. 
 
10.3 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR convencional). 
1.- Preparar la siguiente reacción. 
1 µƖ MgCl 50mM 
2.5 µƖ Buffer 10x. 
1 µƖ DNTP´s 10mM 
1 µƖ Oligo sentido (10mM) 
1 µƖ Oligo antisentido (10mM) 
43 
 
3 µƖ cDNA. 
0.5 µƖ Taq polimerasa (Invitrogen) 
14 µƖ Agua 
2.- Incubar 2 minutos a 94° C. 
3.- Incubar 40 ciclos de: 
45 segundos a 94° C. 
1 minuto a 56° C. 
1 minuto a 72° C. 
4.- Incubar finalmente 2 minutos a 72° C. 
5.- Mantener en refrigeración. 
 
10.4 Electroforesis en geles de agarosa. 
Electroforesis para DNA. 
1.- Gel de agarosa al 1%. 
2.- En 30 ml de buffer TBE agregar 0.30 gr de agarosa. 
3.- Calentar 30 segundos en horno de microondas. 
4.- Agregar 16 µl de bromuro de Etidio (0.5 mg/ml) 
5.- Colocar la mezcla en el molde y dejar solidificar por 30 minutos. 
44 
 
6.- Aplicar las muestras en un volumen de 10µl con jugo azul 1x. 
7.- Correr las muestras en el gel a 80 voltios durante 45 minutos. 
8.- Observar en transiluminador. Es posible visualizar 20 ng de DNA en el gel. 
9.- Fotografiar con tiempo de exposición 1 y apertura de 8 ó 5.4 
 
Electroforesis para RNA. 
(Condiciones desnaturalizantes) 
Antes de usar el aparato de electroforesis, debe lavarse de la siguiente manera. 
1.- Lavar con SDS 0.5% en agua DEPC (c/gasa). 
2.- Enjuagar con agua DEPC. 
3.- Enjuague con H2O2 3% en agua DEPC. 
4.- Enjuague con agua DEPC. 
5.- Enjuague con etanol absoluto. 
6.- Dejar secar. 
Preparación del gel agarosa / formaldehido (p/30ml) 
Agarosa 0.3gr 
Agua 21.6 ml 
MOPS 10x 3 ml 
45 
 
Hervir hasta solubilizar y agregar 
Formaldehido 12.3 M 5.4 ml 
Colocar en el molde y dejar enfriar. 
 
Buffer de corrida 
 MOPS 10x 22ml 
 Formaldehido 13.2 ml 
 Agua DEPC 184.8 ml 
Preparación de la muestra 
Agua + RNA 5µl (2-5 µl) 
 MOPS/FA 5µl (MOPS 10x 20 µl + FA 32µl + Agua 8µl) 
Calentar a 65° C por 5 minutos y poner en hielo 
Agregar 
 Sol. Ficoll/BBP 2 µl (loading biffer) 
 Bromuro de Etidio 1µl (1µg/µl) 
Centrifugar 10 segundos 
Colocar la muestra en el gel y correr a 80 voltios por 45 minutos 
Observar en el transiluminador 
46 
 
Fotografiar. 
 El gel al 1% es conveniente para moléculas de RNA de 500 pb – 10 kb, un 
porcentaje mayor es para moléculas más pequeñas. 
 Las condiciones desnaturalizantes del gel son necesarias para que el RNA 
se separe adecuadamente, pues tiende a formar estructuras secundarias. 
 
Solución Ficol/BBP 
 30µl Ficol 
 10µl Azul de bromofenol saturado 
Buffer MOPS 10x 
 20g MOPS 
 25ml Acetato de Na 1M, pH 6 
 10 ml EDTA 0.5 M, pH 8 
 450 ml Agua. 
Ajustar el pH a 7 con NaOH (10N) y guardar protegido de la luz. 
 
 
 
 
 
47 
 
10.5 PCR Cuantitativo. 
RNA amplificación Kit (2015137, Roche) 
Equipo 
Termociclador Light Cycler (Roche, Alemania) 
1.- Preparar la siguiente reacción en tubos capilares especiales para el equipo 
empleado. 
Master Mix 6 µl 
cDNA 1 µl 
Oligo sentido 0.24 µl 
Oligo antisentido 0.24 µl 
Agua 4.26 µl 
Mg Cl2 0.5 µl 
2.- Mezclar los ingredientes de la reacción y centrifugar para bajarlos. 
3.- Colocar los capilares en el rotor. 
4.- Amplificar en el Termociclador. 
 
Condiciones de amplificación. 
Desnaturalización inicial: 94 ºC por 2 min; 
Desnaturalización: 94 ºC por 30 s; 
48 
 
Alineación: 58 ºC por 8 s; y 
Extension: 72 ºC por 8 s, por 55 ciclos. 
Las lecturas del amplificado fueron realizadas durante la extensión de cada ciclo 
de amplificación y durante la tercera parte de la desnaturalización. 
Importante: Antes de comenzar a correr la muestra de interés debe realizarse 
una curva estándar amplificando cantidades conocidas de DNA (ver manual de 
usuario del Termociclador Light Cycler, Roche). 
 
 
 
 
 
 
49 
 
XI. BIBLIOGRÁFIA 
1. ARTEAGA JD. Situación actual y perspectivas de la industria ovina en 
México. Revista del Borrego, Edición Especial. Julio-Octubre 2002. 
2. BERUMEN A. Rentabilidad de una explotación ovina en el trópico (resumen). 
1er Simposium Internacional sobre Ovinocultura Tropical. Tabasco, México. 
2004. pp. 60-67. 
3. SEOANE LM, LAGE M, AL-MASSADI O, DIÉGUEZ C, CASANUEVA FF. 
Papel de la ghrelina en la fisiopatología del comportamiento alimentario. 
Rev Med Univ Navarra 2004; 48: 11-17. 
4. www.fao.org.mx 
5. www.inegi.gob 
6. www.siap.sagarpa.gob.mx 
7. CUÉLLAR A. Perspectivas de la producción ovina en México para el año 
2010. La Revista del Borrego. 2007; 47. 
8. GÓMEZ J. Alternativas de mercado para la carne Ovina en México. 
http://www.webveterinaria.com/~amteo/boletin/10/mercado.html 
9. PERELLÓ M, SPINEDI E. Aspectos neuroendocrinos de la obesidad. 
Medicina Buenos Aires 2004; 64: 257-264. 
10. STRADER D, WOODS S. Gastrointestinal hormones and Food Intake. 
Gastroenterology 2005;128: 175-191. 
11. CUMMINGS E, OVERDUIN J. Gastrointestinal regulation of food intake. 
Clinical Investigation. 2007; 117: 13-23 
http://www.fao.org.mx/
http://www.inegi.gob/
http://www.siap.sagarpa.gob.mx/
http://www.webveterinaria.com/~amteo/boletin/10/mercado.html
50 
 
12. MOMANY FA, BOWERS CY, REYNOLDS GA, HONG A, NEWLANDER K. 
Conformation energy studies and in vitro and in vivo activity data on growth 
hormone-relasing peptides. Endocrinology 1984; 114: 1531-1536. 
13. GHIGO E, ARVAT E, MUCCIOÑI, CAMANNI F. Growth hormone-relasing 
peptides. Eur J Endocrinol 1997; 136: 445-460. 
14. PONG SS, CHAUNG LY, DEAN DC, NARGUND RP, PATCHETT AA, 
SMITHH RG. Identification of a new G-protein-linked receptor for growth 
hormone secretagogues. Mol Endocrinol 1996; 10: 57-51. 
15. KOJIMA M, HOSODA H, DATE Y, NAKAZATO M, MATSUO H, KANGAWA 
K. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. 
Nature 1999; 402: 656-660. 
16. DATE Y, KOJIMA M, HOSODA H, SAWAGUCHI A, MONDAL MS, 
SUGANUMA T, MATSUKURA S, KANGAWA K, NAKAZATO M. Ghrelin, a 
novel growth hormone-releasing acylated peptide, is synthesized in a 
distinct endocrine cell type in the gastrointestinal tracts of rats and humans. 
Endocrinology 2000a; 141, 4255– 4261. 
17. PÉREZ E. Evaluación de la respuesta productiva de corderos tratados con 
ghrelina sintética humana administrada por vía intravenosa, intramuscular o 
subcutánea. Tesis maestría. UNAM Qro. 2008. 
18. HOSODA H, DOI K, NAGAYA N, OKUMURA H, NAKAGAWA E, 
ENOMOTO M, ONO F, KANGAWA K. Optimum collection and storage 
conditions for ghrelin measurements: Octanoyl modificaction of ghrelin is 
51 
 
rapidly hydrolized to desacyl ghrelin in blood samples.Clin Chem 2004; 50: 
1077-1080. 
19. KAIYA H, KOJIMA M, HOSODA H, RILEY LG, HIRANO T, GRAU EG, 
KANGAWA K. Amidated fish ghrelin: purification, cDNA cloning in the 
Japanese eel and its biological activity. Journal of Endocrinology. 2003; 176: 
415-423. 
20. DEL RINCÓN JP. Ghrelina un péptido modulador del metabolismo 
energético. Revista de endocrinología y Nutrición 2007; 15: 138-148. 
21. HOLST ND, HOLLIDAY B, ELLING CE, COX HM, SCHWARTZ TW. 
Common Structural Basis for Constitutive Activity of the Ghrelin Receptor 
Family. The Journal of Biological Chemistry 2004; 279: 53806–53817. 
22. CHOI K, ROH S, HONGY, SHRESTHA Y, HISHIKAWA D, CHEN C. The 
Role of Ghrelin and Growth Hormone Secretagogues Receptor on Rat 
Adipogenesis. Endocrinology 2003; 144(3):754–759. 
23. SUZUKI H, MASAOKA T, HIBI T. Ghrelin - a novel appetite-stimulating 
hormonewhich also affects gastrointestinal functions. The Korean journal of 
gastroenterology 2006; 48(2):82-88. 
24. KOJIMA M, KANGAWA K. Ghrelin: structure and Function. Physiological 
Reviews 2005; 85: 495-522. 
25. ZHANG W, CHAI B, LI J, WANG H, MULHOLLAND M. Effect of des-acyl 
ghrelin on adiposity and glucose metabolism. Endocrinology 2008; 149(9): 
4710-4716. 
https://www.researchgate.net/author/Hidekazu+Suzuki
https://www.researchgate.net/author/Tatsuhiro+Masaoka
https://www.researchgate.net/author/Toshifumi+Hibi
52 
 
26. GIOVAMBATTISTA A, GAILLARD R, SPINEDI E. Ghrelin gene-related 
peptides modulate rat white adiposity. Vitamins and Hormones 2008; 77: 
171-205. 
27. PATEL AD, STANLEY S, MURPHY K, FROST G, GARDIER J, KENT A. 
Ghrelin stimulates insulin-induced glucose uptake in adipocytes. Regulatory 
Peptides 2006; 136: 17-22. 
28. MORENO MJ, MARTÍNEZ JA. El tejido adiposo: órgano de almacenamiento 
y órgano secretor Adipose tissue: a storage and secretory organ. 
Departamento de Fisiología y Nutrición. Universidad de Navarra. ANALES 
Sis San Navarra 2002, 25(1): 29-39. 
29. RODRIGUEZ DE LA C ML. Diferenciación adipocitaria y factores 
reguladores de la biogénesis mitocondrial. Efectos de los fármacos 
antirretrovirales (tesis de doctorado) Barcelona España Universidad de 
Barcelona 2004. 
30. AILHAUD G, HAUNER H. Development of white adipose tissue. Handbook 
of Obesity. New York: Marcel Dekker Inc, 1998: 359.378. 
31. GREGOIRE F, SMAS C, SUL HS. Undestanding adipocyte differentiation. 
Phisyol Rev 1998; 78: 783-809. 
32. MACDOUGALD OA, LANE MD. Transcriptional regulation of gene 
expression during adipocyte differentiation. Annu Rev Biochem 1995; 64: 
345-358. 
53 
 
33. RICHON VM, LILE RE, McGEHEE RE. Regulation and expression of 
retinoblastoma proteins p107 and p130 3T3-L1 adipocyte differentiation. J 
Biol Chem 1997; 272: 10117-10124. 
34. YEH, WC, CAO Z, CLASSON M, MCKNIGHT SL. Cascade regulation of 
terminal adipocyte differentiation by three members of the C/EBP family of 
leucine zziper proteins. Genes Dev 1995; 9: 168-181. 
35. TANG QQ, LANE MD. Activation and centromeric locaizationof 
CCAAT/enhancer-binding proteins during the mitotic clonal espresion of 
adipocyte differentiation. Genes Dev 1999; 13: 2231-2241. 
36. TANG QQ, OTTO TC, LANE MD. Mitotic clonal expansion: a synchronus 
process required for adipogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003; 100: 
44-49. 
37. MELINA M, RAMON G. Chromatin and chormatin-modifying proteins in 
adipogenesis. Biochem. Cell Biol 2007; 85: 397-410 
38. SPIEGELMAN BM, CHOY L, HOTAMISLIGIL GS, GRAVES RA, 
TONTONOZ P. Regulation of adipocyte gene expression in differentiation 
and syndromes of Obesity/diabetes. J. Biol. Chem. 1993; 268: 6823-6826. 
39. MUKHERJEE R, JOW L, CROSTON GE, PATERNITI JR. Identification, 
characterization, and tissue distribution of human peroxisome proliferator-
activated receptor (ppar) isoforms ppargamma2 versus ppargamma1 and 
activation with retinoid x receptor agonists and antagonists. J. Biol. Chem. 
1997; 272: 8071-8076. 
54 
 
40. LEHMANN JM, MORRE LB, SMITH-OLIVER TA, WILKINSON WO, WILSON 
TM, KLIEWER SA. An antidiabetic thiazolidinedione is a high affinity ligand 
for peroxisome proliferator-activated receptor γ. J Biol Chem 1995; 270: 
12953-12956. 
41. SPIEGELMAN BM. PPAR-γ: adipogenic regulator and thiazolidinedione 
receptor. Diabetes 1998; 47: 507-514. 
42. WU Z, BUCHER NLR, FARMER SR. Conditional ectopic expression of C/EBPβ 
in NIH-3T3 cells induces PPARγ and stimulates adipogenesis. Genes Dev 
1995; 9: 2350-2363. 
43. HONDARES E. Thiazolidinediones and rexinoids induce peroxisome 
proliferator-activated receptor-coactivator (PGC)-1alpha gene transcription: 
an autoregulatory loop controls PGC-1alpha expression in adipocytes via 
peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivation. 
Endocrinology 2006; 147(6): 2829-2838. 
44. RODRÍGUEZ A, GÓMEZ-AMBROS J, CATALÁN V. Acylated and desacyl 
ghrelin stimulate lipid accumulation in human visceral adipocytes. Int J Obes 
(lond). 2009; 33(5): 541-52. 
45. DAVIES JS. Ghrelin induces abdominal obesity via GHS-R-dependent lipid 
retention. Mol Endocrinol. 2009; 23(6): 914-24. 
46. SHIMADA A. Nutrición animal. Editorial Trillas. México 2003. 
47. RHO S. Inhibition of grow hormone secretagogue receptor antagonist, [D-
Lys-3]-GHRP-6, in adipogenesis of ovine and rat adipocytes. Animal 
Sciencie Journal. 2005; 76(4): 381-386. 
	Portada
	Índice General
	Resumen
	I. Introducción
	II. Revisión de Literatura
	III. Justificación IV. Hipótesis
	V. Objetivos
	VI. Material y Métodos
	VII. Resultados
	VIII. Discusión
	IX. Conclusiones
	X. Técnicas Empleadas
	XI. Bibliografía