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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS 
INSTITUTO DE FISIOLOGÍA CELULAR DIVISIÓN DE NEUROCIENCIAS 
 
 
EFECTO DEL -HIDROXIBUTIRATO SOBRE LA AUTOFAGIA INDUCIDA 
POR LA PRIVACIÓN DE GLUCOSA EN NEURONAS CORTICALES DE RATA 
EN CULTIVO 
 
 
TESIS 
 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE 
DOCTORA EN CIENCIAS BIOMÉDICAS 
 
 
 
PRESENTA: 
L.N. Lucy Anita Camberos Luna 
 
 
TUTORA PRINCIPAL 
Dra. Lourdes Massieu Trigo 
Instituto de Fisiología Celular División de Neurociencias 
 
 
Ciudad Universitaria, CDMX. Septiembre 2017 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
EFECTO DEL -HIDROXIBUTIRATO SOBRE LA 
AUTOFAGIA INDUCIDA POR LA PRIVACIÓN DE 
GLUCOSA EN NEURONAS CORTICALES DE RATA EN 
CULTIVO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Presenta 
Lucy Anita Camberos Luna 
Licenciada en nutrición 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DEDICATORIAS 
A mi familia, definitivamente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS TÉCNICOS 
Agradezco al Programa de Doctorado en ciencias Biomédicas, al CONACyT (proyecto CB-
239607) y a PAPIIT (Proyectos IN204213, IN205416) por el financiamiento al proyecto y 
apoyar mi desarrollo en el doctorado. 
A la Dra. Lourdes Massieu Trigo (Instituto de fisiología celular, división de neurociencias), 
quien fungió como mi tutora durante mi doctorado. 
A la bióloga Teresa Montiel Montes, técnico académico, por su asesoría y apoyo otorgado 
para la realización de mi proyecto. 
A los doctores Adolfo García Sainz (Instituto de Fisiología Celular), Salvador Uribe (Instituto 
de Fisiología Celular) y Daniel Ortega Cuellar (Instituto Nacional de Pediatría), por ser 
también un apoyo cuando lo necesité, tanto asesoría académica como apoyo de 
infraestructura y material de laboratorio. 
A la M. en C. Ana María Escalante y al Ing. Francisco Pérez Eugenio del área de cómputo 
del instituto de fisiología celular de la división de neurociencias, por su apoyo técnico. 
A Sara Méndez (Instituto de Fisiología Celular) y Azucena Pichardo (Instituto de 
Investigaciones Biomédicas), gracias por su apoyo académico y administrativo. Por su 
disposición, su trato amable, su trabajo indispensable y por siempre tener una sonrisa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
Agradezco al programa de doctorado en ciencias biomédicas, al CONACyT (CB-239607) y 
a PAPIIT (IN204213) por apoyar mi proyecto y mi desarrollo en el doctorado. 
Agradezco el haber podido ser alumna de la UNAM. Todas las cosas que he vivido 
alrededor de ello han sido las mejores (y más difíciles) experiencias de mi vida. 
Agradezco infinitamente a la Dra. Lourdes Massieu por darme la oportunidad de integrarme 
a su equipo en el laboratorio AL-302. Ella me abrió la oportunidad de poder explotar y 
disfrutar mi trayectoria por el doctorado y gracias a eso he aprendido más de lo que hubiera 
imaginado, y me ha abierto la mente para darme cuenta de todo lo que falta por aprender. 
Le agradezco sus enseñanzas académicas, así como el ejemplo de valores y humanidad. 
Por su confianza, apoyo y empatía en los momentos difíciles (desde asuntos académicos, 
familiares o hasta cuando me terminó el novio). Tener una líder así ha sido inigualable. Ella 
ha sido mi ejemplo de trabajo, al lado de la bióloga Teresa Montiel Montes. 
A Teresa Montiel Montes le agradezco su infinita disposición para ayudarme, tanto en 
aspectos académicos como en los personales. Ha sido mi amiga y me regaló experiencias 
que seguramente no voy a olvidar nunca. Gracias por todos los detalles que cuidaste para 
hacer funcionar el laboratorio de la manera más feliz, desde el jabón para manos hasta 
cada pastel de cumpleaños y el café de cada mañana. Gracias por escucharme cuando lo 
necesité, por las pláticas tan amenas, me sacaste muchas sonrisas. 
Gracias a ambas por su esfuerzo admirable. 
A Cecilia Escalona, por su trabajo indispensable y valioso que hacía el laboratorio más 
agradable. Por las pláticas y la compañía. 
(Y entre paréntesis, una disculpa por el desastre causado y las canas verdes). 
A las ratitas que sirvieron como mi modelo experimental. Sin ellas no hubiera logrado tener 
un posgrado en ciencias biomédicas. 
Es vital agradecer a mis amigos, las personas que forman la familia que me acogió en la 
Ciudad de México y que me acompañaron en cada paso y tropiezo. Por su apoyo 
incondicional, por escucharme siempre, aunque fueran cosas anodinas, por acompañarme 
en los momentos de carcajadas, conciertos, fiestas, películas, ocio, libros, trabajo, música, 
comida, desveladas, enojos y desenojos, por tolerarme y darme mi espacio cuando mi 
humor era medio ácido o negro. Mis amigos son un caso único y además un ejemplo de 
que la dedicación, inteligencia, alegría, honestidad y diversión, son cosas que se pueden 
llevar muy bien. Gracias a mis amigos por ayudarme a crecer. Gracias porque han sido para 
mí el ejemplo de amistad más claro. 
Tengo la fortuna de poder hacer una larga lista de amigos valiosos a quienes quiero 
agradecerles el haberme acompañado en mi doctorado, y empieza de la siguiente manera: 
 
 
 
 
 
 Estefanía Ochoa Ruiz, Sonia Vargas Chávez y José Corella Vázquez, mis amigos 
del inicio del doctorado en el INP, indispensables para mí. Por su compañerismo y 
amistad. Por todo lo vivido en el primer laboratorio al que llegué, ustedes eran una 
gran motivación para ir a trabajar. También a Carmen Torres Esquivel y Cristian 
Gerónimo Olvera, quienes también son una motivación para mí, por cuya amistad 
también me siento muy agradecida. Prácticamente necesito un capítulo para esto, 
y como no se puede sólo pondré palabras clave: “¿Creen que se nos considere 
como personas serias?”, “Chayo lives”, “Seal of approval”, “B&B”, “vino tinto en 
tazas”, “alitas Tyson” “¿Cuánto cuestan los pandotas?”, “Kitty perdido en otra 
dimensión desconocida”, “¿Qué pasa, man?”, “La Kitty-trampa”, “¿De dónde lo 
sacaron?” “Lucifer del diablo” “Kitty de la creación”, “desconchaba-Kitty”, entre otras. 
Gracias por todo. 
 A mis compañeros y amigos del laboratorio AL-302 (y vecinos), Susana Flores, 
Marco Flores, Selene García de la Cadena, Gabriela Langurén, Alberto Julio 
Amilpas, Nadia Rivero, Carolina Cid, Berenice Bernal, Rafael Lazo, Mara Prior, Juan 
Carlos Gómora García, Julio Abarca, Leo García, Atza Salazar. 
 A Rodrigo Díaz Ruiz. Gracias por la paciencia, los momentos agradables y 
complicados, por confiar en mí, por tus enseñanzas, por prepararme para mi 
candidatura, eso fue para mí algo verdaderamente valioso. 
 Mis amigas y compañeras de casa que lidiaron con mi estrés y me acompañaron a 
reír también. Por los ratos de yoga, quehacer, chisme, risas o lágrimas. Por ser una 
compañía tan valiosa: Janikua Nelson, Karla Soto, y Nadia Navarrete. 
 Mis amigos y primos de Guadalajara (y más allá): Sus porras fueron alimento para 
mi alma, Cecilia Luna Luna, Diana Luna, Claudia y Elizabeth Sánchez, Carolina 
Luna, Gabriela Proa, Angélica Vargas, Andrea Vázquez, Araceli Rocha, Alejandra 
Altamirano, David Castillo, Gabriela Morales, Haranti Castellón, Verónica González, 
Mary Santana. Cada llamada, mensaje, o visita,fue vital. 
 A mis amigas de Apoyo Metabólico Nutricio, Ana Guerrero, Zully Hernández, Ma. 
Dolores Arias, Mariana Samayoa, y Gabriela Canahuate, quienes contribuyeron con 
su amistad y apoyo a mi proceso de titulación. 
 A Allyn Andonegui, agradezco por haberla encontrado, no sabría explicar el efecto 
que tuvo en mi vida. Gracias. 
 A amigos que fueron apoyo en diferentes momentos importantes y cruciales de mi 
vida, me siento afortunada y realmente agradecida por tenderme la mano: Jaime 
Gutiérrez, Rígel Juárez (Word tacha tu nombre), Alejandra Macías. 
 A la familia Luna González, que me recibieron como otro miembro más al dejar 
Guadalajara, y hasta ahora. 
 A los alumnos a los que he podido enseñarles algo, permitiendo que yo aprenda 
también. 
 
A mis cosas favoritas que le dieron los detalles pequeños pero vitales a todos estos días de 
doctorado que hicieron que pudiera sobrevivir a los buenos y no tan buenos ratos: la música 
y a las películas, es necesario, no puedo hacer nada sin música, no puedo vivir sin bailar y 
no hay nada como una buena película para descansar el cerebro. También al chocolate, la 
mantequilla de cacahuate, el café americano y al té chai. Al rhodesia, al pata negra y a la 
cineteca. A 9gag y al periódico El deforma. A mi cuarto con luz tenue en el que me siento 
en el mejor lugar para leer a gusto. 
 
A Irene Luna Márquez. Nada como sus abrazos, sus porras, sus pláticas, su compañía, su 
sonrisa. Me partió el alma que se fuera pero la tengo en un lugar único en mi corazón y mi 
memoria, y sé que ella estaría contenta conmigo en este momento tan importante para mí. 
Por último, mi familia núcleo. Formé mi definición de amor gracias a ellos. 
A mis papás, Ramón Camberos y Carmen Luna. A mis hermanos, Gabriela, Mariana y 
Daniel Camberos Luna. A mis cuñados, Macarena Rojo, Alfredo Martínez, y Cornelio 
García. A mis sobrinos Natalia, Paola, Daniel, y Santiago. Gracias por ser mi chispa. 
Gracias por siempre apoyarme en cada decisión, buena o mala, por creer en mis planes, 
por no dejarme caer nunca, por hacerme sentir segura. Por siempre estar al pendiente de 
mí, por dejarme compartir mis alegrías con ustedes. Por escucharme cuando estaba 
rendida, cuando necesitaba explotar. Por amarme como soy, tal cual. No tengo más que 
palabras para escribir aquí y de alguna manera hacerles saber lo agradecida que estoy con 
ustedes, mi familia. Espero que con mis actos pueda hacerles ver cuánto los amo y que 
también pueda devolverles de alguna manera todo lo que han hecho por mí. 
Porque son pieza clave y fundamental en cada capítulo de mi vida. Pertenezco al lugar 
donde ustedes estén, ustedes son mi hogar y mi vida. 
 
Y ya, pues. Pongámonos serios. 
 
CONTENIDO 
RESUMEN ......................................................................................................................................... 6 
ABSTRACT ....................................................................................................................................... 7 
ABREVIATURAS .............................................................................................................................. 8 
Introducción ..................................................................................................................................... 10 
I.- Cuerpos cetónicos ................................................................................................................. 10 
II.- Muerte neuronal inducida por ausencia de glucosa ........................................................ 12 
 Aumento en la producción de especies reactivas de oxígeno: ............................... 14 
 Estrés del retículo endoplásmico y respuesta a proteínas no plegadas: .............. 14 
 Activación de la calpaína: .............................................................................................. 14 
 Activación de la poli-ADP-ribosa polimerasa 1: ......................................................... 15 
III.- Efecto protector de los cuerpos cetónicos sobre enfermedades 
neurodegenerativas y daño agudo ...................................................................................... 17 
IV.- Autofagia como mecanismo de rescate ante el estrés energético en las 
neuronas ..................................................................................................................................... 19 
 IV.I Descripción de la autofagia .................................................................................... 19 
 IV.II Evidencia de la inducción de la autofagia durante la ausencia y 
reintroducción de glucosa ..................................................................................................... 22 
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ....................................................................................... 243 
HIPÓTESIS ..................................................................................................................................... 24 
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................................ 25 
METODOLOGÍA ............................................................................................................................. 25 
RESULTADOS ................................................................................................................................ 28 
El -hidroxibutirato preserva la viabilidad en neuronas sometidas a la ausencia y 
reintroducción de glucosa. .................................................................................................... 28 
El D-BHB disminuye los niveles de diferentes indicadores de autofagia en 
neuronas corticales sometidas a la ausencia y reintroducción de glucosa ............ 30 
El D-BHB restablece la activación basal del complejo mTORC1 a las 12 horas de 
reintroducción de glucosa. .................................................................................................... 38 
DISCUSIÓN ..................................................................................................................................... 40 
CONCLUSIÓN ................................................................................................................................ 42 
PERSPECTIVAS ............................................................................................................................ 44 
REFERENCIAS .............................................................................................................................. 45 
ANEXO 1 – Artículo publicado ..................................................................................................... 51 
6 
 
RESUMEN 
La glucosa es el principal sustrato energético utilizado por el cerebro, sin embargo, durante 
la cetogénesis inducida por el ayuno o la hipoglucemia prolongada, los cuerpos cetónicos 
(CC), acetoacetato (AcAc) y -hidroxibutirato (BHB) pueden servir como sustratos alternos 
a la glucosa. Los CC aumentan la viabilidad neuronal en diferentes modelos de daño, pero 
los mecanismos por los cuales ejercen su efecto protector todavía no están del todo 
dilucidados. En este estudio se investigó si el efecto protector del isómero D del BHB (D-
BHB) sobre la muerte inducida por la ausencia (AG) y reintroducción de glucosa (RG), está 
relacionado con la autofagia. La autofagia es un proceso de degradación lisosomal que se 
activa bajo estrés energético en el que se degradan proteínas y organelos dañados, 
suministrando energía para mantener la viabilidad. Dicho proceso es regulado 
negativamente por el complejo mTORC1 durante condiciones normales; sin embargo, 
durante el estrés energético, éste es fosforilado e inhibido por la cinasa activada por AMP 
(AMPK) en el residuo de serina 792, estimulando así la activación de la autofagia. 
Los resultados muestran que el proceso de autofagiase activa en las neuronas corticales 
cultivadas en condiciones de AG, como lo indica el aumento en los niveles de la forma 
lipidada y activa de la proteína LC3-II (microtubule associated protein light chain 3), la cual 
es necesaria para la formación de autofagosomas, y por el aumento en el número de 
autofagosomas. En una etapa temprana de RG ocurre la degradación del contenido 
autolisosomal, ya que los niveles de la proteína p62/SQSTM1 disminuyen. Esta proteína se 
encarga de capturar proteínas ubiquitinadas y transportarlas al autofagosoma donde serán 
degradadas junto con p62/SQSTM1 después de la fusión con el lisosoma. En cultivos 
expuestos a AG y RG en presencia de D-BHB, los niveles de LC3-II y p62/SQSTM1 decaen 
rápidamente y permanecen cercanos al nivel control durante toda la fase de RG, sugiriendo 
que el D-BHB estimula el flujo autofágico, previniendo así la acumulación de 
autofagosomas y mejorando la viabilidad neuronal. 
Por el contrario, el isómero L del BHB, que es metabólicamente inactivo, no modificó los 
niveles de LC3-II ni de p62/SQSTM1 ni durante la AG o la RG. Evidencia experimental 
indica que la activación de la autofagia durante la AG y las etapas tardías de la RG 
correlaciona con un aumento en la fosforilación de la proteína RAPTOR (la cual fosforila e 
inhibe a mTORC1), sugiriendo que la inhibición de mTORC1 participa en la activación de la 
autofagia. En presencia de D-BHB, la fosforilación tardía de RAPTOR no tiene lugar 
sugiriendo que la homeostasis celular se restablece y no se estimulan las respuestas de 
alarma en contra del estrés energético, como es la inhibición mTORC1 y la consecuente 
activación de la autofagia. 
7 
 
ABSTRACT 
Glucose is the major energy substrate in brain, however, during ketogenesis induced by 
starvation or prolonged hypoglycemia, the ketone bodies (KB), acetoacetate and -
hydroxybutyrate (BHB) can substitute glucose. KB improve neuronal survival in diverse 
injury models, but the mechanisms by which KB prevent neuronal damage are still not well 
understood. In the present study we have investigated whether protection by the D isomer 
of BHB (D-BHB) against neuronal death induced by glucose deprivation (GD), is related to 
autophagy. Autophagy is a lysosomal-dependent degradation process activated during 
nutritional stress, which leads to the digestion of damaged proteins and organelles providing 
energy for cell survival. It is negatively regulated by mTORC1 during normal conditions, 
however, during energy stress, mTORC1 is phosphorylated and inhibited by AMP-activated 
kinase (AMPK) at Ser 792 residue, thus, stimulating autophagy activation. 
Results show that autophagy is activated in cortical cultured neurons during GD, as 
indicated by the increase in the levels of the lipidated form of the microtubule associated 
protein light chain 3 (LC3-II), a protein involved in the formation of autophagosomes, and 
the augmented number of autophagic vesicles. At early phases of glucose reintroduction 
(GR), the levels of p62/SQSTM1 declined suggesting that the degradation of the 
autophagolysosomal content takes place at this time. p62/SQSTM1 recruits and transports 
ubiquitinated proteins to the autophagosome for their degradation, and it is itself degraded 
after the autophagosome-lysosome fusion. In cultures exposed to GD and GR in the 
presence of D-BHB, the levels of LC3-II and p62/SQSTM1 rapidly declined and remained 
close to basal levels during GR, suggesting that the KB stimulates the autophagic flux 
preventing autophagosome accumulation and improving neuronal survival. In contrast, the 
metabolically inactive L isomer of BHB did not alter neither LC3-II nor p62/SQSTM1 content, 
either during GD nor during GR, although it partially improved neuronal viability. 
Experiments indicate that autophagy activation during GD and the late stages of GR 
correlates with RAPTOR phosphorylation (which inhibits mTORC1) suggesting that 
mTORC1 inhibition is involved in autophagy activation. In presence of D-BHB, RAPTOR 
phosphorylation at late stages of GR does not take place suggesting that cellular 
homeostasis has been reestablished and the responses against energy stress such as 
inhibition of mTORC1 and autophagy activation are not stimulated. 
 
8 
 
ABREVIATURAS 
3-MA: 3-metiladenina 
-KG: Alfa-cetoglutarato 
AcAc: Acetoacetato 
Acetil-CoA: Acetil coenzima A 
AG: Ausencia de glucosa 
AA: Aminoácidos 
AMPK: Cinasa activada por AMP 
Asp: Aspartato 
ATP: Adenosín trifosfato 
BECN1: Beclina 1 
BHB: -Hidroxibutirato 
BHB-DH: -Hidroxibutirato deshidrogenasa 
Cat: Catalasa 
CC: Cuerpos cetónicos 
CQ: Cloroquina 
D-BHB: Isómero D del -Hidroxibutirato 
DMEM: Dubelcco´s Modified Eagle´s Medium 
DNA: Ácido desoxirribonucleico 
EAAT: Transportadores de aminoácidos excitadores 
ER: Estrés de retículo endoplásmico 
FIP200: Focal adhesion kinase family-interacting protein of 200 kDa 
GABA: Ácido -amino butírico 
GD: Glucose deprivation 
Glu: Glutamato 
HDACS: Desacetilasas de histonas 
HMG-CoA-L: Hidroximetil glutaril-CoA liasa 
HMG-CoA-S: Hidroximetil glutaril-CoA sintetasa 
Htt: Huntingtina 
Httm: Huntingtina mutada 
KB: Ketone bodies (cuerpos cetónicos) 
L-BHB: Isómero L del -Hidroxibutirato 
LC3: Microtubule-associated protein 1 light chain 3 
LC3-II: Forma lipidada de LC3 
LDH: Lactato deshidrogenasa 
MCT: Transportadores de monocarboxilatos 
mLST8: mammalian lethal with Sec13 protein 8 
mTOR: Mammalian target of ramapycin 
mTORC1: Mammalian target of rapamycin complex 1 
MTT: 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol 
NAD+: Dinucleótido de nicotinamida y adenina oxidado 
NADH: Dinucleótido de nicotinamida y adenina reducido 
NMDA: N-metil-D-aspartato 
NOX: NADPH oxidasa 
PARP 1: Poli-(ADP-ribosa)-polimerasa 1 
9 
 
PBS: Phosphate buffered salt 
PE: Fosfatidiletanolamina 
PLA2: Fosfolipasa A2 
p-RAPTOR: RAPTOR fosforilada 
PRAS40: Proline-rich AKT substrate 40 kDa 
PtdIns3K/Vps34: Class III phosphatidylinositol 3-kinase / mammalian vacuolar protein sorting 34 
RAPTOR: regulatory-associated protein of mammalian target of rapamycin 
RG: Reintroducción de glucosa 
rNMDA: Receptores de N-metil-D-aspartato 
ROS: Especies reactivas de oxígeno 
SERCA: ATPasa de calcio del retículo endoplásmico/sarcoplásmico 
TBS: Tris buffered salt 
ULK1: UNC-51-like kinase complex 1 
UPR: Unfolded protein response (Respuesta a proteínas no plegadas) 
VPS15: Vacuolar protein sorting 15 
XO: Xantina oxidasa 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
10 
 
EFECTO DEL -HIDROXIBUTIRATO SOBRE LA AUTOFAGIA INDUCIDA POR 
LA PRIVACIÓN DE GLUCOSA EN NEURONAS CORTICALES DE RATA EN 
CULTIVO 
Introducción 
I.- Cuerpos cetónicos 
 
Los cuerpos cetónicos (CC), acetoacetato (AcAc), -hidroxibutirato (BHB) y acetona (figura 
1A), son el producto de la degradación de los ácidos grasos y se forman en condiciones 
específicas, como el ayuno prolongado, durante el periodo de lactancia en los neonatos, al 
consumir una dieta alta en grasas y proteína (80-90%) y baja en hidratos de carbono (10%) 
(dieta cetogénica); así como también durante episodios de hipoglucemia o en pacientes con 
diabetes mellitus tipo 2 descontrolada, entre otras (Robinson, 1980). Durante un periodo 
de estrés energético, el AcAc y el BHB pueden utilizarse como sustratos alternativos, 
aportando 4.2 y 4.7 Kcal/g, respectivamente (Morris, 2005; Desrochers, 1995); La acetona 
es producto de la descarboxilación espontánea del AcAc, es volátil y se elimina por vía 
respiratoria, por lo que no puede integrarse al metabolismo. Los CC pueden aportar más 
del 60% del gasto energético de las neuronas, dependiendo de la concentración alcanzada 
en plasma (Hashim & VanItallie, 2014). 
La tabla 1 muestra el porcentaje de aporte de energía al cerebro por los cuerpos cetónicos 
dependiendo de la concentración alcanzada durante diferentesperiodos de ayuno. 
 
Duración del 
 ayuno 
Concentración de CC 
alcanzada (mM) 
% de aporte de 
energía al cerebro 
12-24 horas 0.3-0.5 3-5 
2-3 días 1.5 18 
8 días 5 60 
> 20 días 7 >60 
 
 
 
 
En condiciones fisiológicas y con niveles normales de glucosa en plasma (70-100 mg/dl), 
la concentración de los CC en sangre es menor a 0.2 mM, y la relación BHB:AcAc es 1:1. 
En un periodo de inducción de cetogénesis bajo los estímulos anteriormente mencionados, 
los niveles aumentan (>0.2 mM, hipercetonemia); si rebasan los 7 mM puede ocurrir 
cetoacidosis, condición común en pacientes diabéticos descontrolados cuyos niveles de 
cetonas pueden alcanzar los 25 mM, y en la que la relación BHB:AcAc es 10:1 (Robinson, 
1980; Laffel, 1999). 
Tabla 1. Proporción de energía aportada por los CC al cerebro durante periodos de 
ayuno en función de su concentración en plasma. (Modificada de Hashim & 
VanItallie, 2014). 
11 
 
La síntesis de cuerpos cetónicos (cetogénesis) ocurre en las mitocondrias del hígado como 
consecuencia de la -oxidación de ácidos grasos a una tasa proporcional a ésta (McGarry 
y Foster, 1980; Cotter et al., 2013); el acetil-CoA liberado se utiliza para formar compuestos 
que, al oxidarse, puedan dar lugar a acetil-CoA nuevamente, disponible para la producción 
de energía (figura 1B). La cetogénesis se da en una serie de reacciones a partir de la 
condensación de dos moléculas de acetil-CoA por medio de la enzima tiolasa, quien al 
liberar una molécula de coenzima A, da lugar a acetoacetil-CoA; posteriormente, la 
hidroximetil glutaril-CoA sintetasa (HMG-CoA-S) integra un grupo acetilo proveniente de 
una tercera molécula de acetil-CoA para formar hidroximetil glutaril-CoA. La enzima 
hidroximetil glutaril-CoA liasa (HMG-CoA-L) dará lugar al AcAc, el cual al reducirse por la 
-hidroxibutirato deshidrogenasa (BHB-DH) se convertirá en -hidroxibutirato. Éste último 
paso es reversible y depende del equilibrio redox determinado por la proporción de 
NAD+/NADH. 
Estos cuerpos cetónicos se liberan al torrente sanguíneo y son captados en el sistema 
nervioso por los transportadores de monocarboxilatos (MCT), localizados en las células 
gliales (MCT1) y las neuronas (MCT2). Éstos son oxidados en la mitocondria (cetólisis) 
produciendo acetil-CoA de nueva cuenta (figura 1C), suplementando al ciclo de Krebs y 
promoviendo la síntesis de ATP (Sokoloff, 1973; Cotter et al., 2013). La cetólisis comienza 
con la oxidación del BHB por la misma BHB-DH para convertirlo a AcAc, que al reaccionar 
con una molécula de coenzima A derivada del succinil-CoA del ciclo de Krebs, se convertirá 
a acetoacetil CoA. Finalmente, la enzima tiolasa agregará una molécula de coenzima A 
para poder liberar dos moléculas de Acetil Co-A que se integrarán al ciclo de Krebs. 
Este mecanismo de obtención de energía a partir de sustratos alternos a la glucosa en 
casos de estrés energético es muy importante, sobre todo en tejidos tan vulnerables a la 
falta de glucosa como el cerebro. 
12 
 
 
 
 
II.- Muerte neuronal inducida por ausencia de glucosa 
 
La glucosa es el principal sustrato energético en los humanos, y el cerebro, a pesar de 
constituir solamente el 2% del peso corporal, consume cerca del 25% de la glucosa total 
disponible en la sangre (Mergenthaler et al., 2013). Lo anterior implica que el cerebro es un 
órgano altamente dependiente de glucosa y, por lo tanto, vulnerable ante un desequilibrio 
en la glucemia (Swanson & Suh, 2010). Los episodios repetitivos de hipoglucemia 
moderada (60-40mg/dl) pueden impactar negativamente en la memoria y atención tanto en 
individuos sanos como pacientes diabéticos tipo I, quienes presentan mayor riesgo de 
hipoglucemia que los pacientes con diabetes tipo 2 debido al tratamiento estricto con 
esquemas de insulina (Rovira, 2002; Langurén, et. al., 2013). 
Figura 1. Cuerpos cetónicos y su metabolismo. A) Estructura de los cuerpos cetónicos. B) Cetogénesis. C) Cetólisis. 
13 
 
 En estudios in vitro de ausencia de glucosa (AG) e in vivo de hipoglucemia severa (<40 
mg/dl) y prolongada, se ha observado muerte neuronal (Suh et al., 2005; Suh et al., 2007; 
Páramo et al., 2010; García de la Cadena et al., 2014; Julio-Amilpas et al., 2015). La falla 
energética en las neuronas secundaria a la privación de glucosa desata diferentes 
mecanismos que conducen a la muerte (figura 2). Primeramente, la baja disponibilidad de 
glucosa reduce la producción de piruvato y posteriormente acetil-CoA para suplementar al 
ciclo de Krebs, por lo tanto, como mecanismo compensatorio, la glutamina se transforma 
en glutamato, quien donará su grupo amino al oxaloacetato (por medio de la aspartato 
aminotransferasa), produciendo así -cetoglutarato y aspartato, funcionando el primero 
como sustrato anaplerótico y el segundo como neurotransmisor excitador (Sutherland, et 
al., 2008). Este proceso se conoce como ciclo de Krebs truncado en el que, a partir de la 
síntesis de -cetoglutarato de la glutamina, se da lugar al resto de los intermediarios del 
ciclo de Krebs hasta la síntesis de oxaloacetato, continuando con el ciclo en compensación 
de la baja concentración de acetil CoA y la insuficiente síntesis de citrato e isocitrato. Por 
otro lado, el glutamato también puede ser transformado a -cetoglutarato por acción de la 
glutamato deshidrogenasa durante la privación de glucosa, contribuyendo así al 
mantenimiento del ciclo de Krebs (Sutherland, et al., 2008). 
Simultáneamente, la falla energética impide el funcionamiento de la bomba de Na+/K+ 
ATPasa, induciendo despolarización de las neuronas debido al aumento de Na+ intracelular. 
Dicha despolarización conduce a la liberación de aminoácidos excitadores, glutamato y 
aspartato, particularmente de aspartato debido al aumento en su concentración durante el 
ciclo de Krebs truncado (Sandberg, et al., 1986). Debido a que el gradiente de sodio se 
disipa, los transportadores de aminoácidos excitadores (EAAT) funcionan de manera 
inversa (tanto en la glía como en las neuronas), liberando glutamato al espacio sináptico, 
en lugar de recapturarlo para su almacenamiento, por lo que permanece más tiempo en el 
espacio sináptico ocasionando un proceso excitotóxico (Sandberg, et al., 1986; Camacho 
& Massieu, 2006; Vandenberg & Ryan, 2013). La excesiva liberación de glutamato 
sobreactiva los receptores a NMDA (N-metil-D-aspartato), a los receptores a ácido -amino-
3-hidroxi-5-metilo-4-isoxazolpropiónico (AMPA) y a los de ácido kaínico. Los receptores 
NMDA son altamente permeables a calcio causando un influjo de este catión a la célula. La 
misma falla energética inhibe el funcionamiento de la bomba ATPasa de calcio del retículo 
endoplásmico/sarcoplásmico (SERCA), por lo que se libera calcio reticular, contribuyendo 
al aumento en su concentración en el citoplasma (Hernández-Fonseca, et al., 2005). 
Los eventos subsecuentes desatan varios procesos que conducen a la apoptosis, entre 
ellos destacan los siguientes: 
14 
 
 Aumento en la producción de especies reactivas de oxígeno: 
Estudios in vivo mostraron que las especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en 
inglés) se producen principalmente durante la fase de reintroducción de glucosa (RG); es 
decir, cuando la glucosa se encuentra disponible nuevamente luego de un periodo de 
hipoglucemia o isquemia cerebral. Sin embargo, durante la fase de ausencia de glucosa 
(AG) el aumento de calcio intracelular también desata la producción de ROS por la 
activación de reacciones enzimáticas. Se forma principalmente superóxido producido por 
enzimas dependientes calcio, como la xantina oxidasa (XO), la fosfolipasa A2 (PLA2) y la 
NADPH oxidasa (NOX) (Suh, et al., 2007; Páramo et al., 2010). 
 Estrés del retículo endoplásmico y respuesta a proteínas no plegadas: 
Dado que el plegamiento de proteínas es un proceso que requiere altas cantidades de 
energía, la falta de glucosainduciría la acumulación de proteínas no plegadas debido a la 
falta de glucosa necesaria para modificaciones postraduccionales (glucosilación), o a la 
misma falla energética, ya que el plegamiento proteico es un proceso celular 
energéticamente costoso. Dicha acumulación de proteínas no plegadas induce una 
respuesta ante la alteración en la homeostasis celular ocasionada por los agregados 
proteicos, denominada respuesta a proteínas no plegadas, o UPR, por sus siglas en inglés 
(unfolded protein response) (Malhotra, et al., 2007). 
Se ha identificado la activación de elementos de la vía de las proteínas no plegadas durante 
la AG en neuronas cultivadas de hipocampo y la activación subsecuente de las caspasas-
7 y -12, lo cual contribuye a la muerte neuronal (García de la Cadena et al. 2014). La 
participación de la vía mitocondrial de la apoptosis en el daño hipoglucémico también se ha 
sugerido, dada la liberación del citocromo c de la mitocondria y la activación de la caspasa-
3 durante la hipoglucemia inducida in vivo (Ferrand Drake et al. 2003). 
 Activación de la calpaína: 
La entrada de calcio y la producción de ROS estimulada por la privación de glucosa también 
induce la activación de la calpaína, que es una proteasa dependiente de calcio implicada 
en la muerte neuronal excitotóxica. Los inhibidores de NOX, XO y PLA2, o inhibidores de la 
liberación de calcio del retículo endoplásmico disminuyen la producción de ROS y la 
actividad de la calpaína durante la AG, contribuyendo a la sobrevivencia neuronal en células 
hipocampales (Páramo et al., 2013). 
 
15 
 
 Activación de la poli-ADP-ribosa polimerasa 1: 
Los eventos promovidos por el proceso excitotóxico eventualmente llegan a dañar al DNA, 
por lo que los mecanismos de reparación se activan; uno de esos mecanismos es llevado 
a cabo por la poli-(ADP-ribosa)-polimerasa 1 (PARP-1, por sus siglas en inglés). Dicha 
enzima utiliza las ADP-ribosas del NAD+, por lo tanto, durante la AG, la excesiva activación 
de la PARP-1 consume el NAD+ disponible para su funcionamiento, contribuyendo a la falla 
energética y desatando la apoptosis. En ratas sometidas a hipoglucemia inducida por 
insulina, los inhibidores de la PARP-1 reducen significativamente el daño y la muerte 
neuronal en distintas regiones del cerebro (Suh et al. 2003). 
En la figura 2 se esquematizan los eventos que se desatan durante la falla energética y que 
conducen al daño excitotóxico en neuronas. 
16 
 
Figura 2. Mecanismos de muerte neuronal por ausencia de glucosa. La falla energética induce la 
transaminación compensatoria del Glu para producir α-KG y contribuir a la generación de energía, lo cual 
ocasiona que aumente simultáneamente la concentración de Asp. La falta de ATP impide la función de la bomba 
Na+/K+ ATPasa, por lo que el Na+ intracelular también aumenta, estimulando la despolarización de la célula y 
posterior liberación de AA excitadores, Glu y Asp. Por otro lado, el aumento de Na+ intracelular estimula la función 
reversa de los EAAT, que liberaran Glu en lugar de recapturarlo. El exceso de AA excitadores en el espacio 
sináptico sobreactiva a los rNMDA, quienes permiten la entrada de Ca2+ a la célula; la SERCA también contribuye 
al aumento de Ca2+ intracelular al detenerse su actividad dada la falta de ATP; secundario a ello, la activación de 
enzimas como PLA2, NOX, XO, estimulan la producción de ROS y el daño al DNA; la PARP-1 se activa para 
reparar el daño al DNA, sin embargo depleta el NAD+ intracelular, empeorando la falla energética. La calpaína se 
activa por calcio y contribuye a la activación de las caspasas-7 y -12. Lo anterior conduce a la apoptosis mediada 
por la liberación de citocromo C de la mitocondria y la activación de las caspasas-3 y -7. La línea punteada en el 
ciclo de Krebs indica que está truncado y no hay síntesis de citrato e isocitrato por la falta de acetil-CoA. Gln= 
Glutamina. Glu= Glutamato. Asp= Aspartato. a-KG= a-Cetoglutarato. AA= Aminoácidos. EAAT= Transportadores 
de aminoácidos excitadores. rNMDA= Receptores a NMDA. SERCA= bomba ATPasa de calcio del retículo 
endoplásmico/sarcoplásmico. PLA2= Fosfolipasa A2. NOX= NADPH oxidasa. XO= Xantina oxidasa. ROS= 
Especies reactivas de oxígeno. Cit. C= Citocromo C. PARP-1= Poli-(ADP-ribosa)-polimerasa 1. rAMPA/rKa= 
Receptores a AMPA y receptores a ácido kaínico. 
 
17 
 
III.- Efecto protector de los cuerpos cetónicos sobre enfermedades 
neurodegenerativas y daño agudo 
 
Alrededor del año 1910 se comenzaron a describir los efectos del ayuno sobre la 
salud, reportando que éste mejoraba la calidad de vida e incluso podía eliminar 
manifestaciones de enfermedad, entre ellas los ataques epilépticos (Wheless, 2008), cuya 
fisiopatología se asociaba a desbalances en el equilibrio ácido-base del organismo, 
inclinándose hacia la alcalinización sistémica (Barborka, 1928). Es por eso que se propuso 
que la dieta alta en grasas y baja en carbohidratos simularía los efectos del ayuno y además 
induciría la producción de moléculas que acidificaran el ambiente celular (cuerpos 
cetónicos), revirtiendo así los ataques convulsivos (Barborka, 1928; Wheless, 2004). A 
principios de 1920 comenzó a utilizarse la dieta cetogénica en la clínica Mayo, en relación 
4:1 grasas:hidratos de carbono y proteínas, dirigida a pacientes pediátricos con epilepsia 
refractaria, disminuyendo considerablemente el número de episodios convulsivos, incluso 
eliminándolos por completo en algunos pacientes (Barborka, 1928; Freeman, 1999). A partir 
de entonces se amplió la aplicación de la terapia con dieta cetogénica hacia diversos 
trastornos neurodegenerativos. Se ha reportado que reducen la degeneración en modelos 
de enfermedad de Parkinson, Alzheimer y Huntington (Kashiwaya et al. 2000; Tieu et. al 
2003; Ruskin et al. 2011). Por otro lado, los CC protegen a las neuronas ante un evento de 
daño agudo, como la hipoglucemia inducida por insulina o la isquemia cerebral, al 
administrarse exógenamente en etapas tempranas (hasta 24 horas) posteriores al daño 
(Julio-Amilpas, et al., 2015; Suzuki, et al., 2002). 
Los monocarboxilatos tales como los CC, pueden mantener la transmisión sináptica durante 
la ausencia de glucosa o inhibición de la glucólisis con iodoacetato (Izumi, et al., 1997). El 
pre-tratamiento con dieta cetogénica en ratas a las que se les indujo hipoglucemia con 
insulina previene la muerte de neuronas corticales e hipocampales en ratas inmaduras, 
efecto asociado a una elevación en la concentración plasmática de BHB aproximadamente 
de 1.7 mM (Yamada, et al., 2005). 
Resultados anteriores de nuestro laboratorio demuestran que el AcAc puede prevenir 
eficientemente la muerte neuronal en el hipocampo de ratas y en cultivo primario de 
hipocampo, secundaria a un evento excitotóxico inducido por la administración del inhibidor 
de los transportadores de glutamato, PDC (L-trans-pirrolidin-2,4-dicarboxylato), o a la 
inhibición de la glucólisis con iodoacetato, ya sea administrado como pre-tratamiento o en 
una fase aguda (Massieu et al. 2003). 
18 
 
Hasta hace apenas unos años, a partir de diversos estudios tanto in vitro como in vivo, 
comenzaron a dilucidarse los mecanismos por los cuales los CC procedentes de la dieta 
cetogénica conferían un efecto neuroprotector, siendo su papel metabólico al que más se 
atribuía dicho efecto. Estudios previos de nuestro laboratorio demuestran que tanto el 
isómero “D” del BHB (D-BHB) como el AcAc previenen la muerte neuronal secundaria a la 
hipoglucemia en un modelo in vivo, y a la AG y la inhibición de la glucólisis (con iodoacetato) 
in vitro, a través de un mecanismo mediado por la preservación de los niveles de ATP. 
También se descubrió que los CC, incluyendo al isómero “L” no metabolizable del BHB (L-
BHB), tienen la capacidad de disminuir la producción y atrapar ROS (Massieu, et al., 2003; 
Haces, et al., 2008; Julio-Amilpas et al. 2015). 
Los CC preservanla función mitocondrial, proporcionando NADH y succinato para los 
complejos I (NADH deshidrogenasa) y II (succinato deshidrogenasa) respectivamente, 
como se vio en modelos in vitro e in vivo de la enfermedad de Parkinson y Huntington. En 
estos estudios se reportó que el D-BHB evita el daño tisular secundario a la inhibición de la 
cadena respiratoria con 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) y ácido 3-
nitropropiónico (3-NP), respectivamente (Tieu, et al., 2003; Lim, et al., 2011). El BHB 
también preserva el estado redox mitocondrial y el potencial de membrana mitocondrial, 
como se reportó en células SH-SY5Y de neuroblastoma, luego de la inhibición del complejo 
II mitocondrial con 3-NP (Imamura, et al. 2006). 
Posteriormente, se descubrió que los CC, especialmente el BHB, poseían otras 
propiedades más allá de su función metabólica. Una de ellas es su papel en la regulación 
epigenética. De hecho, el BHB se ha encontrado como una marca en la cromatina, 
modificación epigenética conocida como -Hidroxibutirilación (Xie, et al., 2016). 
En un estudio en el que se usó un modelo transgénico de la enfermedad de Huntington, los 
ratones R6/2, cuyas características son atrofia estriatal, agregación de huntingtina mutada 
(Httm) y desacetilación de la histona H4, así como en células PC12 con expresión de 
HttmQ103 (mutada agregada a 103 residuos de glutamina), se observó que el tratamiento 
tanto con D-BHB como L-BHB (4 mM) preserva la acetilación en dicha histona; el efecto se 
asocia a que el BHB mantiene la actividad de las acetilasas de histonas (Lim, et al., 2011). 
En concentraciones de 1-2 mM en plasma (inducidos por dieta cetogénica, o en modelos 
de restricción calórica o ayuno), el D-BHB puede inhibir directamente a las desacetilasas 
de histonas (HDACS); el D-BHB preserva la acetilación de residuos de lisina de la histona 
H3, lo cual se asocia con la estimulación de la expresión de genes encargados de la defensa 
antioxidante, como el factor de transcripción NRF2 (Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 
19 
 
2), que promueve la expresión de enzimas antioxidantes como la superóxido dismutasa y 
la catalasa (Newman y Verdín, 2014; Shimazu, 2013; Xie, 2015). 
En otros aspectos, existen estudios que asocian al BHB con la modulación de procesos 
inflamatorios, reduciendo la actividad del inflamasoma NLRP3, sistema asociado a la 
enfermedad de Alzheimer (Youm, 2015). También, la oxidación de CC promueve la 
activación de los canales de potasio dependientes de ATP, lo cual impide la salida de K+ de 
la célula, induciendo así hiperpolarización y menor excitabilidad, proceso asociado a la 
disminución de los ataques convulsivos (Yellen, 2008; Lutas & Yellen, 2013). En relación a 
la inhibición de la hiperexcitabilidad, los CC pueden inhibir al transportador vesicular de 
glutamato en las neuronas, impidiendo su almacenamiento y liberación al espacio sináptico 
(Juge, et al., 2010). 
El campo de investigación acerca del efecto protector de los cuerpos cetónicos y sus 
mecanismos es cada vez más amplio, incluso se han comenzado a aplicar distintos 
enfoques terapéuticos para inducir la cetogénesis y aprovechar sus efectos de manera más 
práctica y llevadera para el paciente, en contraste con la dieta cetogénica, como el uso de 
triglicéridos de cadena media, los cuales, al no necesitar transporte a través de los 
quilomicrones desde el intestino hasta el hígado, ni requieren carnitina para introducirse a 
la mitocondria, son rápidamente oxidables, por lo tanto inducen una rápida síntesis de acetil 
CoA que se convierte en cuerpos cetónicos (Page, et al. 2009). 
 
IV.- Autofagia como mecanismo de rescate ante el estrés energético en las 
neuronas 
 
 IV.I Descripción de la autofagia 
 
En casos de estrés energético, la célula cuenta con mecanismos encargados de mantener 
la viabilidad, y uno de ellos es la macroautofagia (también llamada simplemente autofagia). 
Esta consiste en el reciclaje de organelos dañados o proteínas de larga vida por medio de 
su degradación vía lisosomal, tanto en condiciones basales para mantener la homeostasis 
celular, o bien, en situaciones de estrés energético para el suministro de sustratos que 
restauren los niveles de ATP (figura 3) (Laplante et al. 2013; Rubinsztein et al. 2012; 
Kroemer et al. 2010; Tanida et al. 2011). 
La autofagia consta de varias fases orquestadas por una gran cantidad de proteínas 
específicas, lo cual hace que ésta tenga diversos puntos críticos de control. De manera 
inicial implica la formación de un fagóforo, que es una estructura que se forma a partir de la 
20 
 
membrana de algunos organelos, como el retículo endoplásmico, las mitocondrias, o 
incluso el núcleo, que al elongarse se convertirá en una vesícula de doble membrana 
(autofagosoma) que deberá fusionarse con los lisosomas (autolisosoma) para dar lugar a 
la degradación de su contenido (Levine et al. 2005; Yang & Klionsky, 2010; Baek et al. 2012; 
Kim, 2014; Kishi-Itakura, et al., 2014). 
Luego de un estímulo de estrés celular como la falta de nutrimentos, se desatan señales 
que iniciarán la autofagia. Una de esas señales es el aumento en el índice AMP/ATP debido 
a la falta de sustratos que promuevan la fosforilación oxidativa del AMP luego de la cadena 
de transporte de electrones; en dichas circunstancias se activa la cinasa activada por AMP 
(AMPK) que tiene diversos blancos de fosforilación que regulan la autofagia, positiva o 
negativamente (Sarkar, 2013). 
El complejo ULK1 (UNC-51-like kinase complex 1), integrado por la cinasa ULK1, ATG13, 
FIP200 (focal adhesion kinase family-interacting protein of 200 kDa) y ATG101, participa 
como regulador positivo de la autofagia (Kishi-Itakura, et al., 2014). Durante el estrés 
energético, la AMPK puede fosforilar directamente a ULK1 en los residuos de serina 317 y 
777 (Kim, et al., 2011), promoviendo la estabilidad del complejo y con ello el reclutamiento 
de proteínas necesarias para la formación del fagóforo, como lo es el complejo 
PtdIns3K/Vps34 (class III phosphatidylinositol 3-kinase / mammalian vacuolar protein 
sorting 34) formado por VPS34, BECN-1 (Beclina 1), ATG14 y VPS15 (Wirawan, et al., 
2012; Rubinsztein, et al., 2012; Sarkar, 2013; Kishi-Itakura, et al., 2014). 
Por otro lado, el complejo mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1) mantiene 
inhibida a la autofagia bajo condiciones basales. Dicho complejo está compuesto por las 
proteínas mTOR (mammalian target of rapamycin), PRAS40 (proline-rich AKT substrate 40 
kDa), mLST8 (mammalian lethal with Sec13 protein 8), DEPTOR (DEP-domain-containing 
mTOR-interacting protein) y RAPTOR (regulatory-associated protein of mammalian target 
of rapamycin). mTORC1 funciona como cinasa de treoninas y serinas y responde a 
estímulos energéticos (en presencia de nutrimentos, sobretodo aminoácidos), promoviendo 
la traducción y el crecimiento celular (Gwinn et al., 2008; Sengupta & Sabatini, 2010). El 
complejo mTORC1 fosforila a ULK1 en el residuo de serina 757, induciendo su disociación 
e inactivación y regula negativamente a la autofagia (Jung et al., 2010). Sin embargo, en 
las condiciones de estrés energético AMPK puede fosforilar a RAPTOR en el residuo de 
serina 792, inhibiendo al complejo mTORC1 e impidiendo que fosforile a ULK1, estimulando 
así el inicio de la autofagia (Gwinn, et al., 2008; Shimobayashi et al., 2014). 
21 
 
Una vez iniciada la señalización que promueve la autofagia, comienza a formarse el 
fagóforo, éste es una estructura de aislamiento la cual puede nacer a partir de la membrana 
de algunos órganos como el retículo endoplásmico o las mitocondrias, y se va elongando a 
la vez de que va encerrando contenido citoplasmático destinado a degradarse; cuando se 
cierra completamente queda como una estructura de doble membrana (Hamasaki, et al., 
2013; Shibutani & Yoshimori, 2014). 
Para la formación y elongación del fagóforo,son necesarias las reacciones de conjugación 
de tipo ubiquitinación (Sarkar, 2013; Kishi-Itakura, et al., 2014). Primero se hace un enlace 
covalente entre las proteínas ATG5 y ATG12, mediado por las proteína ATG7 (tipo E1) y 
ATG10 (tipo E2). Una vez conjugados, ATG5 y ATG12 se asocian a ATG16 (tipo E3), 
formando así el complejo ATG5-ATG12-ATG16, quien es el encargado de la elongación del 
fagóforo (Sarkar, 2013). 
Por otro lado, la proteína LC3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3) se asocia al 
fagóforo para promover su cierre (Sarkar, 2013). LC3 es una proteína citosólica asociada a 
microtúbulos que se corta constitutivamente por Atg4B en un residuo de glicina en el 
extremo carboxilo terminal; esta forma cortada se denomina LC3-I y es todavía inactiva 
(Tanida, 2011). Para que pueda ser completamente funcional requiere lipidarse con 
fosfatidiletanolamina en el fagóforo durante el proceso de elongación, y a esta forma 
lipidada se le denomina LC3-II. El proceso anterior también se realiza a través de 
reacciones de tipo ubiquitinación, en las que ATG7 (tipo E1) traspasa a LC3-I hacia ATG3 
(tipo E2), para que ésta pueda ser lipidada, con ayuda del complejo ATG5-ATG12-ATG16 
(tipo E3). La proteína WIPI2 (49 kDa WD-40 repeat containing protein that Interacts with 
PtdIns) interactúa con ATG16 y con ULK1 para cooperar al proceso de lipidación de LC3-I 
y para su ubicación en el fagóforo, lo cual promoverá el cierre de éste (Polson, et al., 2010; 
Sarkar, 2013; Kim et al. 2014; Russell, et al., 2014). Las moléculas de LC3-II que queden 
ubicadas dentro del autofagosoma serán degradadas junto con todas las estructuras 
citoplasmáticas engullidas, y junto con la membrana interna de la estructura. Dado que LC3-
II se va formando conforme se estimula la autofagia, el aumento en los niveles de LC3-II 
funciona como un excelente indicador de la formación de autofagosomas (Sarkar, 2013; 
Kim et al. 2014). 
Para que el autofagosoma madure debe fusionarse con los lisosomas (formando así 
autolisosomas) para dar lugar a la fase de degradación. Los lisosomas se fusionan con la 
membrana externa del autofagosoma (Hamasaki, et al., 2013). Entre otras proteínas, 
22 
 
dineína y LC3-II, participan mediando el transporte vesicular asociado a microtúbulos 
dirigiendo los autofagosomas hacia los lisosomas (Pankiv et al., 2010). 
En la membrana externa quedan unidas las proteínas restantes de LC3-II que pueden ser 
cortadas y recicladas para utilizarse posteriormente. En la membrana interna también hay 
moléculas de LC3-II; a ellas se une la proteína p62/SQSTM1, que es una proteína 
encargada de dirigir a proteínas ubiquitinadas destinadas a degradarse por autofagia y, 
dado que queda dentro del autolisosoma junto con dichas proteínas, también se degrada 
con todo el cargo (Komatsu & Ichimura, 2010); por lo tanto, experimentalmente, 
p62/SQSTM1 funciona como un indicador del flujo autofágico (Komatsu & Ichimura, 2010; 
Katsuragi, et al., 2015). Las hidrolasas lisosomales como las catepsinas B y D, lipasas y 
enzimas lisosomales son las encargadas de degradar el contenido reclutado (Bjorkoy et al., 
2009; Tanida, 2011; Dodson et al., 2013). 
La recuperación del índice ATP/AMP, secundaria al suministro de sustratos, y la presencia 
de aminoácidos liberados posteriormente a la etapa de degradación, vuelve a activar a 
mTORC1 y se detiene la autofagia (Rubinsztein, 2012; Li et al. 2013; Sarkar, 2013; Russell 
et al. 2014). 
 
 IV.II Evidencia de la inducción de la autofagia durante la ausencia y 
reintroducción de glucosa 
 
A pesar de que la autofagia se describió en principio como un proceso citoprotector, la 
evidencia de la intercomunicación entre ésta y otros procesos de muerte celular como la 
apoptosis va en aumento (Yousefi, et al. 2006; Maiuri et al. 2007; Shi et al. 2012; Delgado, 
et al., 2014). 
Hasta hace pocos años el papel de la autofagia durante la hipoglucemia/AG o la isquemia 
cerebral era controversial. Se había asociado su activación con la muerte neuronal, a la que 
se le denominó muerte autofágica (Jang et al., 2013; Maiuri, et al., 2007; Liu, et al., 2010). 
En modelos de isquemia/hipoxia cerebral, se observó que la inhibición de la autofagia 
previene la muerte neuronal (Levine, et al. 2005; Koike et al. 2008; Kang et al. 2011; Shi, et 
al. 2012) sugiriendo su contribución al daño cerebral. 
Por el contrario, se reportó que la administración de inhibidores de la autofagia (bafilomicina 
y 3-MA) durante la fase de RG, luego de un periodo de AG, induce la activación de proteínas 
proapoptóticas (Jang et al. 2013), sugiriendo un papel protector de la autofagia. 
En estudios de privación de oxígeno y glucosa (OGD, oxygen-glucose deprivation, por sus 
siglas en inglés) en células PC12 sometidas a un protocolo de precondicionamiento 
23 
 
isquémico in vitro, se observó que la autofagia funciona como un mecanismo que contribuye 
a mantener la viabilidad celular en dichas condiciones, ya que tanto la formación de 
autofagosomas como su degradación aumentan luego del evento de OGD, y esto se asoció 
con menor número de células apoptóticas (Park et al. 2009). 
En modelos de enfermedad de Huntington, la autofagia previene la neurodegeneración ya 
que constituye un mecanismo de degradación de proteínas agregadas como la huntingtina 
mutada (Bjorkoy et al. 2005; Nixon, 2013), y en concordancia con esto, se ha observado 
que los ratones con una mutación nula en el gen Atg5 desarrollan neurodegeneración, al 
igual que la mutación del gen de Atg7 (Hara, et al., 2006: Komatsu, et al., 2006). 
Experimentos recientes de nuestro grupo muestran que la autofagia se activa de manera 
temprana después de retirar la glucosa del medio de cultivo en neuronas de corteza cerebral 
de rata; sin embargo, el proceso ocurre de manera aberrante dando lugar a una autofagia 
no funcional que contribuye a la muerte. Los resultados sugieren que la asociación de la 
autofagia con la muerte neuronal está relacionada a su mal funcionamiento, que involucra 
la disfunción lisosomal y liberación de catepsinas (Gerónimo-Olvera et al., 2017). 
Existen estudios que plantean que la integridad de los lisosomas, tanto en la fase de 
iniciación como en la fase de degradación, es esencial para que el proceso de autofagia 
se dé adecuadamente (Li et al., 2013). Por lo tanto, se requiere que el proceso autofágico 
funcione óptimamente en todas sus fases para que pueda tener efecto citoprotector (Liu, et 
al., 2010). 
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 
La autofagia se activa en respuesta a la privación de nutrientes a través de la inhibición de 
la vía de mTORC1, pero puede ocurrir de manera aberrante y contribuir a la muerte celular. 
Los CC se oxidan en las neuronas como sustratos alternativos a la glucosa, suministran 
energía y reducen la muerte neuronal en condiciones de hipoglucemia in vivo y de AG in 
vitro. Por lo tanto, en este estudio nos propusimos investigar si el efecto protector del D-
BHB está relacionado con la inducción de una respuesta autofágica funcional dependiente 
de mTORC1. 
 
24 
 
 
 
HIPÓTESIS 
El D-BHB favorecerá la viabilidad neuronal durante la AG y RG a través de la inducción de 
la autofagia funcional dependiente de la vía de mTORC1. 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Proceso autofágico. Durante condiciones normales, el complejo mTORC1 regula negativamente a la 
autofagia por medio de la fosforilación inhibidora del complejo ULK1 en el residuo de serina 757. Sin embargo, 
durante el estrés energético inducido por la AG se activa la AMPK al aumentar los niveles de AMP. ULK1 se activa 
secundario a su fosforilación por AMPK en los residuos de serina 317 y 777, ya que se permite su estabilidad 
gracias a la inactivación del complejo mTORC1, quien es inhibido gracias a la fosforilación del residuo de serina 
792 mediada por AMPK. La activación de ULK1 estimula el reclutamiento de proteínas necesariaspara la 
formación del fagóforo, que, al elongarse y madurar, se convertirá en un autofagosoma maduro, con ayuda de 
LC3-II. p62/SQSTM1 conduce hacia el autofagosoma al contenido citoplasmático que se va a degradar. Tanto las 
moléculas de LC3-II que quedan dentro del autofagosoma, como p62/SQSTM1, se degradan durante la última 
fase, luego de la fusión con los lisosomas. 
25 
 
OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
 
1. Determinar el efecto del D-BHB sobre la formación y degradación de 
autofagosomas durante la AG y la RG. 
2. Evaluar si la inducción de la autofagia durante la AG y RG es dependiente de la vía 
de mTORC1. 
3. Determinar si el efecto neuroprotector del D-BHB está relacionado con la 
activación de la vía de mTOR. 
 
METODOLOGÍA 
 
Cultivo celular: Se extrajeron cortezas de embriones de ratas de 17 días de gestación, 
posteriormente se sometieron a un proceso de disgregación mecánica y a otro proceso de 
disgregación con tripsina al 0.5%. Se sembraron en condiciones adherentes con poli-L-
lisina en cajas de 35 mm o cajas de 12 pozos, según lo requerían los experimentos, a una 
densidad de 2.5x106 o 10x106 células por caja, respectivamente (2.2x105 células/cm2 en 
todos los casos. Se utilizó medio neurobasal suplementado con 0.5 mM de glutamina, 1% 
de B27 con antioxidantes (acetato de DL--Tocoferol, DL--Tocoferol, catalasa, superóxido 
dismutasa) + 1% de B27 sin antioxidantes y 2% de gentamicina. A los 4 días in vitro (DIV) 
se adicionó medio fresco suplementado con citosina-D-arabinosa (0.8M) para reducir el 
crecimiento de glía. Los experimentos se realizaron a los 8 DIV. 
 
Tratamiento durante la AG: Transcurridos 8 DIV se sometió a las células a un tratamiento 
con un medio de cultivo sin glucosa (DMEM, Dubelcco´s Modified Eagle´s Medium sin 
glucosa) durante 1 y 2 horas seguidos de 3, 6 y 20 horas de RG adicionando el medio 
Neurobasal previamente retirado. Inmediatamente después se extrajeron las células y se 
obtuvieron homogenados para posteriromente realizar los inmunoblots para las proteínas 
de autofagia. En el caso de la identificación de la fosforilación de RAPTOR se extrajeron 
las células a las 3, 12 y 20 h después de la RG. Ambos protocolos se realizaron en presencia 
o ausencia de D-BHB, a una concentración final de 10 mM durante el periodo de AG y 5 
mM durante la RG. Este protocolo de administración de D-BHB derivó de experimentos 
previos que indicaron que éste es óptimo para prevenir la muerte de las neuronas. Los 
26 
 
cultivos también fueron tratados con 10 mM de 3-metiladenina (3-MA inhibidor de la 
fosfatidilinositol 3-cinasa de clase III) y 20 M de cloroquina (CQ, inhibidor de la degradación 
autolisosomal por alcalinización del medio intralisosomal), para inhibir la formación de 
autofagosomas y la etapa de la degradación de la autofagia, respectivamente. También se 
utilizó 150 mM de trehalosa, un disacárido que induce la autofagia impidiendo la captación 
de glucosa por medio de la inhibición de los transportadores GLUT (Mardones, et al., 2016; 
Chen, et al, 2016). 
 
Evaluación de viabilidad por MTT: Luego del periodo de AG (2 h) y RG (22 h) en presencia 
o ausencia de D-BHB, se realizó un ensayo colorimétrico basado en la reducción del 
Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT), el cual se convierte en sal de 
formazán. El método consiste en incubar a las células por 50 minutos con 30 l de MTT por 
cada 500 l de medio de cultivo, después se aspira el medio para luego solubilizar el MTT 
con isopropanol y leer su absorbancia en el espectrofotómetro a 570 nm. La cantidad de 
células viables es proporcional a la cantidad de formazán producido. 
 
Evaluación de viabilidad por LDH (lactato deshidrogenasa): Se realizó el ensayo luego 
de 2 h de AG y 17 h de RG en presencia o ausencia de D-BHB. La determinación se realiza 
monitoreando la disminución de la absorbancia a 340 nm que resulta de la conversión del 
NADH a NAD+ utilizado por la enzima lactato deshidrogenasa que se libera al medio de 
cultivo cuando hay daño a la membrana y muerte celular, al transformar el piruvato a lactato. 
El ensayo se prepara agregando piruvato (20 mM) y NADH (9.4 mM) a una alícuota de 
medio, se deja incubar por cinco minutos y después se lee la absorbancia inicial; se deja 
incubar otros cinco minutos y se vuelve a leer la absorbancia. Se reporta la diferencia de 
las dos lecturas de absorbancia para identificar la cantidad de NADH utilizado por la enzima 
lactato deshidrogenasa para reducir al piruvato y convertirlo a lactato. Una mayor diferencia 
entre la absorbancia inicial y la final significa una mayor utilización del NADH, indicando 
que hubo mayor liberación de lactato deshidrogenasa al medio, y por lo tanto, mayor 
cantidad de células dañadas. 
 
Evaluación de la viabilidad con fluorescencia: Para corroborar la viabilidad se utilizaron 
marcadores fluorescentes para las células vivas y muertas, calceína-AM y homodímero de 
etidio, respectivamente. La calceína-AM es un marcador que es captado y procesado por 
esterasas inespecíficas dentro de las células vivas, emitiendo una coloración verde. En 
27 
 
cambio el homodímero de etidio es un compuesto impermeable que solo logra entrar a las 
células cuando la membrana está comprometida, se une al DNA y emite una coloración 
roja. Dichos marcadores se añadieron al medio de cultivo (calceína 2 M y homodímero de 
etidio 1 M) después de 22 h de RG durante 30 min, posteriormente se enjuagaron con 
medio Lockey y se tomaron imágenes usando microscopía confocal (FV 1000; Olympus) 
con láser Ar 488 nm (para la calceína) y Ar 596 nm (para el etidio). 
 
Observación de la formación de autofagosomas mediante microscopía confocal: Se 
evaluó la presencia de los autofagosomas en neuronas cultivadas en ausencia de glucosa 
con o sin D-BHB utilizando el marcador fluorescente Cyto-ID en células vivas a diferentes 
tiempos de AG siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células se pre-incubaron 20 
min con Cyto-ID antes de ser expuestas a 30, 60 y 90 minutos de AG con o sin D-BHB en 
la cámara de perfusión. Se utilizó Hoechst para identificar los núcleos. Se cuantificó la 
cantidad de partículas positivas a Cyto-ID utilizando el sistema de análisis Fiji del software 
ImageJ, tomando en cuenta partículas positivas con un tamaño promedio de 0.52 m2. 
 
Inmunocitoquímica: Luego de 2 h de AG y 2 h de AG + 3 h de RG, las células se 
enjuagaron con PBS 0.1M, se fijaron con metanol durante 20 minutos y luego se bloquearon 
con PBS/albúmina al 5% con suero de caballo al 5% y tritón X-100 al 0.1% durante una 
hora. Se incubaron los anticuerpos primarios (LC3 o p62/SQSTM1) en concentración 1:500 
(para ambos anticuerpos) durante toda la noche a 4°C; Se utilizaron anticuerpos 
secundarios acoplados a fluoróforos (FITC anti-conejo en una dilución 1:500 para LC3 y 
p62/SQSTM1). Los núcleos se identificaron con Hoechst. Se observó presencia de puncta 
positivos a LC3 como indicador de la formación de autofagosomas y positivos a de 
p62/SQSTM1 como indicador de la fase de degradación de la autofagia 
 
Western blot: Luego de los tratamientos de AG/RG, en presencia o no del D-BHB, en el 
cultivo de neuronas corticales, se prepararon extractos proteicos de las células cultivadas 
en cajas de 35 mm, previamente enjuagadas con 1 ml de PBS, utilizando 100l de buffer 
de lisis celular a base de cloruro de sodio (150 mM), dodecil sulfato de sodio (SDS) 1 %, 
tritón 1 %, y deoxicolato de sodio 0.5 %, todo disuelto en buffer de tris-HCl 50 mM. Se 
añadió complete en concentración 2:1 en el buffer, que consiste en una preparación 
comercial de inhibidores de proteasas y fosfatasas (cOmplete ®, Roche). Posteriormente, 
el lisado fue centrifugado a 10,000 rpm durante 5 minutos a 4°C. Se obtuvo el sobrenadante 
28 
 
y se desechó el pellet. La concentración de proteínas en el sobrenadante se cuantificó por 
mediodel método de Lowry. Las proteínas fueron desnaturalizadas con buffer de Laemmli 
4x + mercaptoetanol mientras se hervían durante 3 minutos. Las proteínas en los extractos 
celulares se separaron mediante electroforesis, en geles de acrilamida / bis-acrilamida al 
18 % (para LC3-II) y al 10 % (para BECN1, p62/SQSTM1, y pRAPTOR); posteriormente se 
realizó una electrotransferencia a una membrana de PVDF previamente activada con 
metanol, después se bloquearon con leche descremada en polvo, diluida al 5 % en buffer 
TBS-Tween. Posteriormente se incubaron los anticuerpos primarios durante toda la noche 
en una solución de leche + TBS-Tween igual a la que se utilizó para bloquear las 
membranas. Los anticuerpos primarios se incubaron a una concentración 1:1000, para LC3-
II, BECN1, pRAPTOR, 1:500 para p62/SQSTM1, y 1:3000 para actina (como control de 
carga). Se utilizó anticuerpo secundario anti-conejo a una concentración igual de 1:7000 
para la reacción con los anticuerpos primarios para LC3-II, BECN1, p62/SQSTM1, y 
pRAPTOR, así como anticuerpo secundario anti-ratón en concentración 1:7000 incubado 
durante 2 horas a temperatura ambiente. La reacción del inmunoblot se detectó con sustrato 
de quimioluminiscencia acoplado a peroxidasa de rábano. 
 
Análisis estadístico: Los datos se expresan como la media + error estándar y fueron 
analizados con ANOVA de una vía seguido de una prueba post hoc de comparación múltiple 
de Fisher. 
 
RESULTADOS 
El -hidroxibutirato preserva la viabilidad de neuronas sometidas a la ausencia y 
reintroducción de glucosa. 
 
Experimentos previos del laboratorio han mostrado que concentraciones de 5 y 10 mM de 
D-BHB reducen eficientemente la muerte neuronal en cultivos expuestos a condiciones de 
deficiencia de energía inducida por privación de glucosa (Julio-Amilpas, et al. 2015). En 
experimentos piloto se establecieron las condiciones de incubación de D-BHB tanto durante 
la AG como la RG que redujeran eficientemente la muerte de las neuronas corticales. Con 
base en los resultados que se muestran en la figura 1 se escogió una concentración de D-
BHB de 10 mM durante la AG y de 5 mM durante la RG para prevenir la muerte neuronal. 
 
29 
 
 
 
 
Con el objetivo de estudiar si el BHB era el único CC que tenía un efecto protector en las 
neuronas expuestas a AG/RG, se realizó una curva dosis-respuesta del efecto del AcAc 
sobre la viabilidad de los cultivos usando los ensayos de MTT y LDH. No se observó ningún 
efecto reductor de la muerte a ninguna de las concentraciones probadas (figura 1B). Con 
base en estos resultados se continuó investigando únicamente el efecto del D-BHB. 
Para corroborar el efecto protector del D-BHB en contra de la muerte inducida por la AG/RG, 
se realizaron ensayos con marcadores de células vivas y muertas (calceína-AM y 
homodímero de etidio, respectivamente). Como se observa en la figura 2, la AG induce 
muerte neuronal, detectada por el aumento de las células positivas a homodímero de etidio 
(rojo) y la reducción de las células positivas a calceína-AM (verde). La adición de D-BHB 
revierte este efecto. 
 
Figura 2. El D-BHB protege contra la muerte neuronal inducida por AG en cultivos de neuronas 
corticales. Imágenes representativas de células teñidas con calceína (verde) y homodímero de etidio (rojo) 
para monitorear células vivas y muertas, respectivamente. 
Figura 1. El D-BHB preserva la 
viabilidad neuronal durante la 
AG/RG, no así el AcAc. A) Las células 
fueron incubadas con 10 mM de D-BHB 
ya sea solo durante la AG o la RG, o 10 
mM durante la AG + 5 mM durante la 
RG. Las barras representan porcentaje 
de actividad de LDH en el medio 
(izquierda) y porcentaje de reducción de 
MTT en la mitocondria de las células 
vivas (derecha) luego de 2 h de AG + 17 
y 22 h de RG, respectivamente. 
B) Curva dosis-respuesta del efecto del 
AcAc para MTT y LDH. Las células se 
incubaron con 1, 2, 5 y 10 mM de AcAc 
durante la AG y se repitió la dosis 
durante la fase de RG. Las barras 
representan porcentaje de actividad de 
LDH en el medio (izquierda) y 
porcentaje de reducción de MTT en la 
mitocondria de las células vivas 
(derecha) luego de 2 h de AG + 17 y 22 
h de RG, respectivamente. 
Los datos representan la media ± 
error estándar y fueron analizados 
con ANOVA de una vía y prueba post-
hoc de Fisher. *P < 0.05 relativo a AG 
(n = 3-4). 
 
30 
 
El D-BHB disminuye los niveles de diferentes indicadores de autofagia en neuronas 
corticales sometidas a la ausencia y reintroducción de glucosa 
 
Una vez corroborado el efecto protector del D-BHB durante la AG/RG, se cuantificaron por 
medio de western blot los niveles de proteínas importantes para el desarrollo de la autofagia 
en dichas condiciones, con el objetivo posterior de asociar ambos sucesos. 
Para realizar los ensayos de western blot de los indicadores de autofagia, las células fueron 
expuestas a 1 y 2 h de AG y a 3, 6, y 20 h de RG, y se trataron con o sin 10 mM de D-BHB 
únicamente durante la AG, o 10 mM durante la AG + 5mM durante el periodo de RG, dosis 
que resultaron más efectivas en la sobrevivencia durante la AG/RG. 
Inicialmente se consideró importante el estudio de los niveles de BECN1, ya que es una 
proteína importante para el inicio de la formación de autofagosomas. 
Los niveles de BECN1 en neuronas cultivadas en AG durante 2 horas no cambiaron, 
mientras que disminuyeron después de 3 h de RG. Cuando el D-BHB se incuba durante la 
AG y la RG, los niveles de BECN1 disminuyen, en particular en el periodo de RG (figura 
3A). Esto implica que, posiblemente, el D-BHB regule negativamente la producción de 
BECN1, o que aumente su degradación. 
 
El aumento en los niveles de LC3-II es considerado como un indicador de la formación de 
autofagosomas. Los resultados muestran que la ausencia de glucosa indujo un aumento en 
la lipidación de LC3. Los niveles de LC3-II aumentan a las 2 h de AG; sin embargo, estos 
disminuyen cuando se reintroduce glucosa por un periodo de 3 h. Cuando se agrega D-
BHB durante el periodo de AG se observó una disminución en los niveles de LC3-II desde 
las 2 h de AG y regresaron a los niveles control en el periodo de RG (figura 3B). Se utilizó 
trehalosa como control positivo de la inducción de autofagia (Mardones, et al., 2016). 
Lo anterior sugiere que el D-BHB induce una menor producción de autofagosomas durante 
la AG, así como una recuperación de la autofagia basal más rápida al momento de la RG. 
 
Para evaluar la fase de degradación de la autofagia se cuantificaron los niveles de 
p62/SQSTM1, ya que esta proteína se queda secuestrada junto con todo el cargo debido a 
que se transporta hacia el autofagosoma con proteínas ubiquitinadas destinadas a 
degradarse. 
De acuerdo a los resultados no hubo cambio en la cantidad de dicha proteína durante la 
fase de AG, pero ésta disminuye después de 3 h de RG. En presencia de D-BHB, los niveles 
de p62/SQSTM1 son menores al control tanto en la fase de AG como en la de RG (figura 
31 
 
3C), sugiriendo que el cuerpo cetónico promueve la degradación autofágica desde etapas 
tempranas de AG y durante la RG. 
 
 
 
Dado que los resultados de los western blot sugieren que el D-BHB disminuye la 
acumulación de autofagosomas, y esto podría deberse a una mayor degradación de los 
autofagosomas formados, se realizó una inmunocitoquímica para observar la agregación 
de LC3 y corroborar lo anterior. 
Dado que LC3 es una proteína citosólica que en condiciones normales está asociada a 
microtúbulos, al momento de la estimulación de la formación de autofagosomas, LC3 se 
activa (cortándose y lipidándose) y se dirige hacia los autofagosomas, por lo que en la 
inmunocitoquímica se puede observar en la célula un patrón punteado distribuido por el 
citosol. 
La figura 4 muestra una disminución en la inmunoreactividad de LC3 (puncta) en presencia 
de D-BHB luegode la AG y durante la fase de RG. Esto significa que, probablemente el 
cuerpo cetónico disminuye la formación de autofagosomas. 
Figura 3. Disminución de 
los diferentes indicadores 
de autofagia en presencia 
de D-BHB durante la AG y 
la RG. A) BECN 1, B) LC3-
II, C) p62/SQSTM1. Los 
datos representan la media 
± error estandar (n=3-6). Los 
datos fueron analizados por 
ANOVA de una vía seguido 
de una prueba post hoc de 
Fisher *p <0.05 vs. control y 
& p<0.05 vs D-BHB. 
T, Trehalosa. 
32 
 
Se usó cloroquina como control positivo para detener la degradación autolisosomal y 
observar claramente los agregados (puncta) de LC3, ya que la cloroquina es un fármaco 
que detiene el proceso de degradación impidiendo la acidificación de los lisosomas. 
También fue posible el observar como la agregación de p62/SQSTM1 fue menor en 
presencia del D-BHB durante toda la etapa de RG (3, 6 y 20 horas), como se muestra en la 
figura 5. 
Otra manera de corroborar los hechos anteriores es observando la formación de 
autofagosomas, lo cual es posible utilizando un marcador de autofagosomas, como los es 
el Cyto-ID, que es un colorante fluorescente que identifica estructuras como autofagosomas 
inmaduros, autofagosomas, y autolisosomas. Con lo anterior, se pudo identificar y 
cuantificar la formación de los autofagosomas durante la AG en presencia o ausencia de D-
BHB (figura 6A), y se observó que en presencia de D-BHB se formó un número menor de 
autofagosomas después de 1 h de AG y una tendencia a formar un menor número de 
autofagosomas hasta las 1.5 h de AG, aunque no resultó significativa (figura 6B). Lo anterior 
corrobora los resultados obtenidos con los western blot y la inmunocitoquímica. 
Hasta el momento, los resultados sugieren que durante la AG hay formación de 
autofagosomas y que en presencia del D-BHB esta formación es menor, e incluso hace que 
la cantidad de éstos disminuya más rápidamente, sugiriendo que probablemente el cuerpo 
cetónico estimule la degradación autofágica. 
 
33 
 
 
Figura 4. El D-BHB disminuye la agregación de LC3 durante la AG/RG. 
Inmunocitoquímica de LC3 (verde) y tinción hoechst para núcleos (azul). Los cultivos fueron expuestos 
únicamente a 2 h de AG ó a 2 h AG + 3 h RG en presencia ó ausencia de D-BHB. También fueron expuestos a 
2 h de AG + 3 h de RG + D-BHB + cloroquina (CQ). En presencia de D-BHB se observan menos puncta positivos 
a LC3 tanto durante la AG como la RG. La CQ revierte el efecto del D-BHB observándose agregados de LC3. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. El D-BHB disminuye la agregación de p62/SQSTM1 durante la AG/RG. Inmunocitoquímica para 
p62/SQSTM1 (verde) y cotinción nuclear con hoechst (azul) después de 3, 6 y 20 h de RG posteriores a 2 h 
de AG. (20X). 
 
34 
 
 
 
 
 
 
 
 
Posteriormente se investigó si la disminución en los niveles de LC3-II y de p62/SQSTM1 
por el D-BHB puede deberse a la estimulación del flujo autofágico. Para esto, se utilizó 
cloroquina (CQ), un inhibidor de la degradación autofágica debido a que impide la 
acidificación de los lisosomas. Como se puede observar en la figura 7, en presencia de CQ 
los niveles de p62/SQSTM1 y LC3-II se recuperaron en la fase temprana de RG (3 h). El 
efecto del D-BHB fue completamente revertido por la CQ, sugiriendo que, efectivamente, el 
flujo autofágico está activo durante la RG y es estimulado por el D-BHB. A tiempos largos 
de RG (6 y 20 horas) se observó el mismo efecto. 
Figura 6. El D-BHB induce una rápida disminución del número de autofagosomas durante la AG. A) 
Cultivos corticales expuestos a AG en presencia o ausencia de D-BHB. Imágenes representativas muestran 
la formación de los autolisosomas usando el kit Cyto-ID (verde) y coteñidas con Hoechst (azul) durante 0.5-
1.5 h de AG. B) Cuantificación de partículas positivas a Cyto-ID. 
35 
 
 
 
 
 
 
 
 
Para determinar el papel de la autofagia sobre la sobrevivencia después de la AG/RG, se 
utilizó un inhibidor del complejo PtdIns3K/Vps34, (3-MA). La inhibición de la autofagia 
previene la muerte neuronal inducida por la AG (figura 8A y 8B). Además, el 3-MA disminuyó 
los niveles de LC3-II (figura 7C), sugiriendo que la autofagia contribuye al proceso de 
muerte neuronal desatado después de la AG/RG. 
 
 
 
Figura 7. El D-BHB estimula la fase de degradación de la autofagia. Efecto de la CQ sobre los niveles 
de LC3-II y p62/SQSTM1 en cultivos expuestos a 2 h de AG y 3, 6 y 20 h de RG en presencia o ausencia 
de D-BHB. Western blots representativos de la cuantificación del índice LC3-II/LC3-I (A) y niveles de 
p62/SQSTM1/Actina (B). Las barras representan la media ± error estándar (n=3-6). Datos analizados con 
ANOVA de una vía seguido de una prueba post hoc de Fisher. *p<0.05 vs. control, & p<0.05 vs AG sin D-
BHB, # p<0.05 vs. células expuestas a AG/RG sin CQ. 
36 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Por otro lado, se determinó si el papel del D-BHB sobre la viabilidad neuronal está asociado 
principalmente a su acción metabólica más que a otros mecanismos (por ejemplo: 
mecanismos antioxidantes). Para ello, utilizamos el isómero no fisiológico del BHB, el 
isómero L-BHB, ya que éste no contribuye a la generación de ATP pero sí es capaz de 
disminuir la producción de ROS ejerciendo un efecto protector contra la muerte, aunque de 
menor magnitud que el del D-BHB (Julio-Amilpas, et al. 2015). Los resultados (figura 9) 
muestran que los niveles de BECN1 y LC3-II no se alteraron por la presencia de L-BHB 
durante la fase de AG o durante la RG temprana; sin embargo, los niveles de p62/SQSTM1 
mostraron una tendencia a disminuir durante ambas fases, aunque no fue significativa. 
Figura 8. La inhibición de la autofagia con 3-MA protege contra la muerte neuronal inducida por AG. 
Cultivos expuestos a 2 h de AG en presencia de 3-MA y 22 h de RG. La viabilidad se evaluó cuantificando 
la liberación de LDH (A) y la reducción de MTT (B). Las barras representan la media ± error estándar (n=6). 
Los datos se analizaron por ANOVA de una vía seguido de una prueba post hoc de Fisher. *p<0.005 vs 
control y &p<0.05 vs AG. Un western blot representativo del efecto inhibidor del 3-MA sobre la 
transformación de LC3-I a LC3-II se muestra en (C). 
37 
 
 
 
 
 
 
 
Los resultados anteriores en su conjunto sugieren que, durante la AG, la célula se vale de 
mecanismos de respuesta al estrés energético para mantener su viabilidad y uno de ellos 
es la autofagia; sin embargo, la degradación autofágica no ocurre eficazmente a menos de 
que el D-BHB esté presente. 
 
 
 
 
Figura 9. El L-BHB no tiene efecto sobre la autofagia durante la AG y la RG temprana. Western blots 
representativos y gráficas con la cuantificación respectiva de la densidad óptica de cada indicador de 
autofagia, BECN1/actina (A), índice LC3-II/LC3-I (B) y p62/SQSTM1/Actina (C) (n=4). 
38 
 
El D-BHB restablece la activación basal del complejo mTORC1 a las 12 horas de 
reintroducción de glucosa. 
 
La proteína cinasa activada por AMP (AMPK) es un sensor energético que responde ante 
el estrés por disminución en el índice ATP/AMP. Al ser activada, estimula la inducción de la 
autofagia de manera indirecta, mediante la fosforilación inhibidora de la proteína RAPTOR 
(en la serina 792), que forma parte del complejo mTORC1, y de manera directa fosforilando 
a ULK1 en los residuos de serina 317 y 777. Dado que el D-BHB funciona como un sustrato 
energético y que restaura los niveles de ATP durante la AG (Julio-Amilpas, 2015), es 
probable que AMPK se encuentre inactiva en presencia del D-BHB y no fosforile a 
RAPTOR. En esta condición la autofagia se encontraría inhibida, ya que la señal de estrés 
disminuye y la síntesis de proteínas u otros procesos dependientes de energía podrían 
reactivarse. 
Debido a lo anterior, evaluamos el estado de activación de la proteína RAPTOR por medio 
de western blot con un anticuerpo específico para la forma fosforilada en el residuo de