Efecto-del-regulador-global-GacA-y-el-sistema-PTS-Ntr-en-el-proceso-de-enquistamiento-de-Azotobacter-vinelandii

Vista previa del material en texto

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS 
CENTRO DE CIENCIAS GENÓMICAS 
 
 
EFECTO DEL REGULADOR GLOBAL GacA Y EL SISTEMA 
PTS
Ntr
 EN EL PROCESO DE ENQUISTAMIENTO DE 
Azotobacter vinelandii. 
 
 
 
TESIS 
 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
DOCTOR EN CIENCIAS 
 
 
PRESENTA 
M. en C. ADÁN TREJO RANGEL 
 
DIRECTOR DE TESIS 
DRA. ELDA GUADALUPE ESPÍN OCAMPO 
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA 
COMITÉ TUTOR 
DR. ALEJANDRO GARCÍA DE LOS SANTOS 
CENTRO DE CIENCIAS GENÓMICAS 
DR. FEDERICO SÁNCHEZ RODRÍGUEZ 
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA 
 
 
 
CUERNAVACA, MORELOS. OCTUBRE 2019. 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
2 
 
 
 
Jurado de Examen 
 
Dr. David René Romero Camarena 
Centro de Ciencias Genómicas, UNAM 
 
Dra. Elda Guadalupe Espín Ocampo 
Instituto de Biotecnología, UNAM 
 
Dra. Gloria Soberón Chávez 
Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM 
 
Dra. María De Lourdes Girard Cuesy 
Centro de Ciencias Genómicas, UNAM 
 
Dr. Miguel Castañeda Lucio 
Centro de Investigaciones Microbiológicas, Instituto de Ciencias. BUAP 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 
 
 
 
 
 
 
 
El presente trabajo se realizó en el Departamento de Microbiología Molecular del 
Instituto de Biotecnología de la UNAM, bajo la dirección de la Dra. Elda Guadalupe 
Espín Ocampo. Este proyecto fue financiado por el proyecto CONACyT CB 25512. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
Al CONACyT y al Programa de Apoyo a los Estudios de Posgrado (PAEP) por las 
becas 315122 y 317520 otorgadas. 
A la Dra. Elda Guadalupe Espín Ocampo por darme la oportunidad de formar parte de 
su grupo y de participar en uno de sus proyectos. Y sobre todo, le agradezco la enorme 
paciencia que me tuvo y por ser tan amable conmigo. Es una gran persona y la admiraré 
siempre. 
A los miembros del comité tutoral el Dr. Alejandro García De Los Santos, y el Dr. 
Federico Sánchez por toda la asesoría otorgada para la realización de la tesis. 
Al Dr. Christian Sohlenkamp por el apoyo que me brindó al inicio del doctorado. Sus 
consejos me dieron la fuerza para continuar en este camino y además le agradezco la 
amistad que me ha brindado desde que nos conocimos. 
Al Dr. David René Romero Camarena por apoyarme al inicio del doctorado a pesar de 
las adversidades que se presentaron. 
A mi familia por ser el pilar de mi vida y que nunca han dejado de estar a mi lado: Mis 
padres Noemi y Matias; a cada uno de mis 4 hermanos: Noemi, Hiram, Judith, Ariel; a mis 
sobrinos Natalia, Fernanda, César, Valeria. Este logro tiene mucho valor gracias a ustedes. 
Los amo tanto. 
A mi esposa Getzabeth González Gutiérrez por estar siempre a mi lado, cuidarme y 
apoyarme en todo momento. Por ser la principal razón para levantarme y seguir adelante; 
por creer siempre en mí. Nadie más que tú, sabe el valor de todo esto. Eres y serás la luz 
que ilumina mi corazón. 
Al Dr. Miguel Cocotl Yañez por todas las enseñanzas que tuve a su lado. El mejor 
profesor y el mejor amigo. Mi mentor en el doctorado. No tengo palabras para agradecer 
todo el apoyo que me brindaste. Este logro también te pertenece. Agradezco la gran suerte 
que tuve al haber llegado a invadir tu mesa de trabajo. 
A Soledad Moreno y Josefina Guzmán por todo el apoyo técnico brindado durante el 
doctorado. Son un ejemplo a seguir como mujeres y como profesionistas. Solecito y 
Josecita, estoy en deuda con ustedes por todo el conocimiento que me ofrecieron y por la 
amistad que me han brindado. 
A Libertad Adaya por apoyarme tantas veces dentro y fuera del laboratorio. Gracias por la 
fabulosa amistad que me haz brindado, por compartir tu alegría en las clases, en el 
laboratorio, en las buenas y en las peores, apoyándome incondicionalmente. 
A la familia González-Gutierrez: Ana Ema, Nicolás, Made, Lalis, Eris, Bernardo, 
Mauricio, Emiliano, Sebastian. Agradezco todo el apoyo que me otorgaron durante este 
5 
 
camino y permitirme integrarme en la familia. 
A todos mis compañeros del laboratorio 6 de Microbiología Molecular: Luis Felipe, 
Beto, Pollo (y Greta), Mildred, Mario, Cosme, Leonel el inge, Elva (y Luis Alfredo), 
Chanty, Claus (agradezco tu gran apoyo, Velazquez Sanchez!! también estuviste ahí, en 
nuestro querido pasillo del lab), Leidy, July, Yaneth, Jony, dafne, Zuemy, Marce, Ramses, 
Choche (y Nancy), Adri, Armando, Mike. Gracias por todo el tiempo compartido dentro y 
fuera del laboratorio, por todas las risas y carcajadas, los desayunos, las fiestas, posadas, y 
por todo el apoyo que tuve de ustedes. 
A todos mis compañeros del futbol “Fullerenos”, “Los Chingones”, “Rucabanda” y 
“Bioperros”, en especial a Pipe, Caborca, Checho, Filly, Luchito, Ivanito, Richi, Raunel, 
Beto, Christian, con los cuales compartí muchas alegrías y experiencias gratas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6 
 
DEDICATORIA 
A mis padres Noemi y Matias. A mis hemanos Noemi, Hiram, Judith, Ariel. 
A mi esposa Getzabeth y mi hija Ana Victoria. 
A la memoria del Dr. Jesús Caballeo, el Dr. Federico Sánchez, y el Dr. Yoav Bashan. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
7 
 
ÍNDICE GENERAL 
RESUMEN………………………………………………………………….….….12 
ABSTRACT………………………………………………………………….….…13 
I. INTRODUCCIÓN................................................................................................14 
I. 1 Azotobacter vinelandii: Generalidades……….………………….…….............14 
I. 2 Alginato, poli-β-hidroxibutirato (PHB) y Alquilresorcinoles (ARs)…………..15 
I. 2.1.1 Alginato: Composición, aplicaciones y su importancia en A. 
vinelandii……………….………………………………….……………….15 
I. 2.1.2 Biosíntesis de alginato en A. vinelandii……………….…..……….16 
I. 2.1.3 Genética de la biosíntesis de alginato en A. vinelandii…................17 
I. 2.2.1 poli-β-hidroxibutirato: Composición, aplicaciones y su importancia 
en A. vinelandii…..…………………………………..…….……..….……..18 
I. 2.2.2 Biosíntesis de PHB en A. vinelandii…..….……………....………...19 
I. 2.2.3 Genética de la biosíntesis de PHB en A. vinelandii……….….........19 
I. 2.3.1 Alquilresorcinoles: Composición y su importancia en A. 
vinelandii…………………………………………………………………...20 
I. 2.3.2 Biosíntesis de alquilresorcinoles en A. vinelandii…......…………...20 
I. 2.3.3 Genética de la biosíntesis de alquilresorcinoles en A. vinelandii…..21 
I. 3 Los sistemas de regulación global Gac-Rsm, RpoS y PTS
Ntr
……….....21 
I. 3.1 El sistema de doble componente GacS/GacA…….……....….………21 
I. 3.2 El sistema Rsm………………………….…………...……..………...22 
I. 3.3 El factor sigma RpoS……….…...……………………....……............23 
I. 3.4 El sistema de fosfotransferasas PTS
Ntr
……….………………............23 
II. ANTECEDENTES……………………………………………………...……...26 
II. 1 Regulación de la biosíntesis de alginato, PHB y ARs por GacA en Azotobacter 
vinelandii a través de Rsm y RpoS…………………………………………………26 
II. 2 PTS
Ntr
 controla la síntesis de PHB y ARs en A. vinelandii……..…..…….…..27 
II. 3 Regulación del enquistamiento en A.vinelandii…………...…….…..………...29 
8 
 
III. HIPÓTESIS…………………………………………………….………...…...32 
IV. OBJETIVOS…………………………………………………….……..……...32 
IV. 1 Objetivo general………………………………………….……...…………...32IV. 2 Objetivos específicos…………………………………….……...…………...32 
V. MATERIAL Y MÉTODOS...……………………………………….….…......33 
V. 1 Cepas bacterianas, plásmidos y oligonucleótidos……………..……………...33 
V. 2 Condiciones de cultivo………………………………………………………..35 
V. 3 Procedimientos con ácidos nucleicos…..…………………………...………...36 
V. 4 Resistencia a la desecación……………………...………..……..…….............36 
V. 5 Microscopía Óptica y Electrónica……….………………………...…………..37 
V. 6 Determinación de alginato y alquilresorcinoles………………….....………...37 
V. 7 Medición de los niveles de transcritos de rpoS, ptsP, ptsO, ptsN y arsA por 
PCR cuantitativo en tiempo real (q-RT-PCR).………...………………...………....38 
V. 8 Complementación de mutantes gacA con rsmZ1 y rpoS.……...………...........38 
V. 9 Construcción de mutantes pts y mutante rsmA de A. vinelandii AEIV.............39 
V. 10 Construcción de plásmidos para sobreexpresión de EIIA
Ntr
……….………..40 
V. 11 Producción de antisuero anti-EIIA
Ntr
 en conejo.…………………….………41 
V. 12 Estado de fosforilación de EIIA
Ntr
 por PAGE nativo y Western Blot.….......41 
V. 13 Detección de RpoS por Western Blot.…………………………...….……….43 
VI. RESULTADOS………………………………………………………………..44 
VI. 1 Control del enquistamiento a través de Gac-Rsm y Gac-RpoS en A. vinelandii 
AEIV…………..…………………………………………………………………...44 
VI. 1.1 La inactivación del gen gacA abate la síntesis de ARs y el 
enquistamiento………………………………………………………….…..44 
VI. 1.2 La expresión de rsmZ1 a partir de un promotor independiente de 
GacA no restaura la capacidad de formar quistes resistentes a la 
desecación…………………………………………………………………..45 
VI. 1.3 La expresión de rpoS a partir de un promotor independiente de GacA 
no restaura la síntesis de ARs ni la capacidad de formar quistes resistentes a 
9 
 
la desecación en la mutante AEIVgacA/pMCY-Z……………………..…..46 
VI: 2 Caracterización del efecto del sistema PTS
Ntr
 sobre el proceso de 
enquistamiento en A. vinelandii AEIV..……………………….…………………...47 
VI. 2.1 Efecto de las mutaciones pts en la formación de quistes resistentes a 
la desecación……………..…………………...…………………………….47 
VI. 2.2 La mutación H68A en el sitio de fosforilación de la proteína EIIA
Ntr
 
afecta negativamente la formación de quistes resistentes a la desecación…49 
VI. 2.3 Determinación del estado de fosforilación de la proteína EIIA
Ntr
 in 
vivo…………………………………………………………………….……50 
VI. 3 Gac-PTS
Ntr
 como vía adicional de regulación del proceso de enquistamiento 
en A. vinelandii…………..........................................................................................53 
VI. 3.1 Efecto de la mutación en el gen gacA sobre el estado de fosforilación 
de EIIA
Ntr
…………………………………………………………………...53 
VI. 3.2 Efecto de la mutación en el gen gacA sobre la transcripción de ptsP y 
ptsO.….…………………………………………………………………......54 
VI. 4 Control del enquistamiento a través de Gac-Rsm y Gac-PTS
Ntr
 en A. 
vinelandii…………………………………………………………………………...55 
VI. 4.1 La mutación de los genes ptsN y rsmA no restauran la síntesis de 
ARs ni el enquistamiento en la cepa AEIVgacA…………………………...55 
VI. 4.2 Transcripción de arsA es abatida en la cepa AEIVgacA/ptsN/rsmA.55 
VII. DISCUSIÓN……………………………………………………………....….58 
VIII. CONCLUSIONES……………………………………………………..……65 
IX. PERSPECTIVAS…………………………………………………...………....65 
X. REFERENCIAS…………………………………………….………..……..….66 
XI. ANEXO. ARTÍCULO…………………………………….………..……..…..73 
 
 
 
 
 
10 
 
ÍNDICE DE FIGURAS 
 
Figura 1. Ciclo de vida de Azotobacter vinelandii……………………………………………….....14 
Figura 2. Micrografía electrónica de un quiste maduro de Azotobacter vinelandii………………...15 
Figura 3. Biosíntesis de alginato en Azotobacter vinelandii………………………………………..17 
Figura 4. Biosíntesis de PHB en Azotobacter vinelandii..………………………………………….19 
Figura 5. Biosíntesis de Alquilresorcinoles en Azotobacter vinelandii…………………………….21 
Figura 6. PTS de carbohidratos y PTS
Ntr
…………………………………………………………..25 
Fig 7. Modelo de regulación de la biosíntesis de alginato, PHB y ARs A. vinelandii a través de Rsm 
y RpoS………………………………………………………………………………………………27 
Fig 8. Control de la síntesis de PHB y ARs por el sistema PTS
Ntr
 en A. vinelandii………………...29 
Figura 9. Morfología de quistes y tinción de alquilresorcinoles producidos por cepas de A. 
vinlenadii AEIV con mutación en gacA, ó bajo la expresión de rsmZ1 y rpoS independiente de 
GacA…………………………………………………………………………………………………45 
Figura 10. Detección de RpoS por Western Blot en cepas de A. vinelandii AEIV con mutación en el 
gen gacA con expresión de rsmZ y rpoS independiente de GacA crecidas en BBOH………………47 
Figura 11. Morfología de quistes y tinción de alquilresorcinoles producidos por cepas de A. 
vinlenadii AEIV con mutación en ptsP, ptsO, ptsN y ptsN (H68A)………………………………...49 
Figura 12. Detección de EIIA
Ntr
 en A. vinelandii AEIV en condiciones nativas…………………...51 
Figura 13. Detección de EIIA
Ntr
 por Western Blot utilizando dos tipos de anticuerpos……………52 
Figura 14. Detección de EIIA
Ntr
 in vivo bajo condiciones nativas en cepas con sobreexpresión de 
EIIA
Ntr
 en las cepas pSAEIIA-1 y pSAH68A por Western Blot……………………………………53 
Figura 15. Detección de EIIA
Ntr
 en A. vinelandii AEIV in vivo por Western Blot en condiciones 
vegetativas y de enquistamiento……………………………………………………………………..54 
Figura 16. Morfología de quistes y tinción de alquilresorcinoles producidos por cepas 
AEIVgacA/ptsN bajo la expresión de rsmZ1 ó rpoS independiente de GacA y con mutación en el 
gen rsmA…………………………………………………………………………………………….56 
Figura 17. Modelo de regulación propuesto en donde GacA controla el enquistamiento por medio 
de las vías Gac-Rsm, Gac-PTS
Ntr
 y una vía adicional Gac-arsA……………………………………64 
 
 
 
11 
 
ÍNDICE DE TABLAS 
 
Tabla 1. Producción de alginato y enquistamiento en cepas de A. vinelandii AEIV…………...…..30 
Tabla 2. Cepas, plásmidos y oligonucleótidos utilizados en este trabajo………………………...…33 
Tabla 3. Resistencia a desecación, cuantificación de alginato y alquilresorcinoles en cepas de A. 
vinelandii AEIV con mutacion en el gen gacA, o bajo la expresión de rsmZ1 y rpoS independiente de 
GacA………………………………………………………………………………………………….44 
Tabla 4. Expresión relativa de rpoS en cepas de A.vinelandii AEIV con mutación en gacA y rpoS, ó 
con expresión del gen rsmZ1 y rpoS independiente de GacA……………………………………….47 
Tabla 5. Resistencia a desecación, cuantificación de alginato y alquilresorcinoles en cepas de A. 
vinelandii AEIV con mutacion en el gen ptsP, ptsO, ptsN y ptsN(H68A)...…………………………48 
Tabla 6. Expresión relativa de ptsP, ptsO y ptsN en cepas de A.vinelandii AEIV con mutación en 
gacA bajo condiciones vegetativas (BS) y de enquistamiento (BB)…..............................................55 
Tabla 7. Producción de alquilresorcinoles, resistencia a desecación y cuantificación de alginato en 
cepas AEIVgacA/ptsN, bajo la expresión de rsmZ1 ó rpoS independiente de GacA y con mutación en 
el gen rsmA……………………………………………………………………………………………..56 
Tabla 8. Expresión relativa de arsA en cepas de A. vinlenadii con mutación en gacA, ptsN y rsmA 
en fase vegetativa (BS) y en condiciones de enquistamiento (BB)…………………………….…..57 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
12 
 
RESUMEN 
 
Azotobacter vinelandii es una bacteria Gram negativa que lleva a cabo un proceso de 
diferenciación para formar quistes resistentes a la desecación. Durante este proceso se 
produce polihidroxibutirato (PHB), alginato y alquilresorcinoles (ARs) que son 
componentes del quiste. La expresión de genes involucrados en la síntesis de estos 
compuestos está bajo el control de la vía de regulación global GacS/A-Rsm en donde GacA 
activa la transcipción de RNAs pequeños llamados RsmZ1-7 y RsmY, los cuales 
contrarrestan la actividad represora que la proteína RsmA ejerce en la traducción de 
mRNAs involucrados en la síntesis de estos polímeros. La síntesis de PHB y ARs es 
además controlada por el sistema global de regulación PTS
Ntr
 conformadopor las enzimas 
EI
 Ntr
, Npr y EIIA
Ntr
 que participan en la transferencia de un grupo fosfato a partir del 
fosfoenolpiruvato hacia EIIA
Ntr
. En su forma no fosforilada, la proteina EIIA
Ntr
 abate la 
síntesis de PHB y ARs. En este estudio nosotros mostramos que células con una mutación 
en el gene gacA o bien mutantes que expresan a la proteína EIIA
Ntr
 en su estado no 
fosforilado tienen fenotipos negativos de enquistamiento. Interesantemente, nosotros 
encontramos que en la mutante gacA, la proteina EIIA
Ntr
 está presente en su estado no 
fosforilado. La inactivación de los genes rsmA y ptsN (que codifican para la proteína RsmA 
y EIIA
Ntr
 respectivamente) en la mutante gacA no restauraron la capacidad de producir ARs 
ni de formar quistes resistentes a desecación. Tomando juntos estos datos indican que GacA 
controla el enquistamiento por vías distintas a la de Rsm, incluyendo la vía GacA-PTS
Ntr
 
reportada en el presente estudio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
13 
 
ABSTRACT 
 
Azotobacter vinelandii is a Gram-negative bacterium that undergoes a differentiation 
process to form cysts resistant to desiccation. This soil bacterium also produces 
polyhydroxybutyrate (PHB), alginate and alkylresorcinols (ARs) that are components of 
mature cysts. The expression of genes involved in the synthesis of these compounds is 
under the control of the GacS/A-RsmA global regulatory pathway where GacA activates 
transcription of RsmZ and rsmY RNAs. These RNAs counteract the repressor activity that 
RsmA protein exerts on the translation of mRNAs involved in the synthesis of these 
polymers. The synthesis of PHB and ARs is also controlled by the PTS
Ntr
 global regulatory 
system composed by EI
 Ntr
, Npr and EIIA
Ntr
 Enzymes that participate transferring a 
phosphoryl-group from phosphoenolpyruvate to EIIA
Ntr
. When unphosphorylated, the 
EIIA
Ntr
 protein impairs the synthesis of PHB and ARs. Here we show that gacA mutants as 
well as mutants that carry EIIA
Ntr
 protein in its non-phosphorylated state have similar 
encysting negative phenotypes. Interestingly, we found that in the gacA mutant strain the 
EIIA
Ntr
 protein is present in its unphosphorylated state. Inactivation of both ptsN encoding 
EIIA
Ntr
 and the rsmA genes in the gacA mutant did not restore the capacity to produce ARs 
nor cyst formation. Taken together these data indicates that GacA controls encystment by 
different pathways from Rsm, including the novel GacA-PTS
Ntr
 pathway reported here. 
 
 
 
 
 
 
 
 
14 
 
I. INTRODUCCIÓN. 
I.1 Azotobacter vinelandii: Generalidades. 
 
Azotobacter vineladii es una bacteria gram negativa que pertenece a la clase gamma 
proteobacteria. Es aerobia obligada, de vida libre que se encuentra en el suelo y es capaz de 
fijar de nitrógeno. Las células de esta bacteria son largas y ovoides, de 2 μm o más de 
diámetro y posee flagelos periticos ó polares (Becking 2006; Setubal et al., 2009). Es 
poliploide, es decir, posee varias copias de su cromosoma. Puede tener hasta 80 copias, 
dependiendo del medio y las condiciones de cultivo así como de la fase de crecimiento. A. 
vinelandii puede crecer a partir de azúcares, alcoholes y ácidos orgánicos; además, produce 
los polímeros alginato, poli-β-hidroxibutirato (PHB) y los lípidos fenólicos 
alquilresorcinoles (ARs). (Nagpal et al., 1989). Tiene un ciclo de vida característico que 
comprende dos fases: Una fase de crecimiento vegetativo, y una fase de vida latente (Fig. 
1). 
 
 
Figura 1. Ciclo de vida de Azotobacter vinelandii. 
 
Durante la fase vegetativa, la célula presenta forma bacilar con flagelos perítricos 
que posibilitan su movilidad. Cuando se inicia el proceso de diferenciación, las células 
pierden movilidad, su pared se engruesa y se forma una estructura esférica similar a un 
quiste, con capacidad de resistencia a desecación, a la desintegración mecánica y a la 
radiación utravioleta (Lin & Sadoff, 1968; Sadoff 1975). El quiste maduro consiste de una 
15 
 
célula contraída, conocida como el cuerpo central, cubierta por dos capas, una externa 
llamada exina y una interna llamada intina, las cuales están formadas principalmente por 
alginato y alquilresorcinoles. Dentro del cuerpo central se forman gránulos de poli-β-
hidroxibutirato (PHB) (Segura et al., 2003) (Fig. 2). El enquistamiento se produce de 
manera natural en cultivos que se encuentran en fase estacionaria tardía, aunque en estas 
condiciones, sólo un bajo porcentaje del cultivo llega a formar quistes maduros. Sin 
embargo se puede inducir dicho proceso al transferir células vegetativas a un medio de 
cultivo con n-butanol (BB) o ß-hidroxibutirato (BHB) como única fuente de carbono 
(Sadoff, 1975). Bajo condiciones favorables, el quiste inicia un proceso de germinación con 
el hinchamiento del cuerpo central, se presenta la ruptura de la exina y finalmente emergen 
dos células que adquieren nuevamente movilidad (Wyss et al., 1961). 
 
 
Figura 2. Micrografía electrónica de un quiste maduro de Azotobacter vinelandii. E= Exina. I= Intina. CC= 
Cuerpo central. (Imagen tomada de Segura et al., 2009). 
 
I. 2 Alginato, poli-β-hidroxibutirato (PHB) y Alquilresorcinoles (ARs). 
I. 2.1.1 Alginato: Composición, aplicaciones y su importancia en 
Azotobacter vinelandii. 
 
 El alginato es un polisacárido producido por algas marinas como Sargassum, 
Macrocystis, Turbinaria, Lamniaria, Ascophyllum, y también por bacterias pertenecientes 
al genero Pseudomonas y Azotobacter (Rehm 2010). Está compuesto por monómeros de 
ácido gulurónico (G) y ácido manurónico (M) unidos por enlaces ß(1-4) cuyo contenido y 
distribución es variable, por lo que pueden encontrarse cadenas con secuencias alternas ó 
bloques de monómeros alternados (M-G-M-G-M-G ó G-G-G-M-M-M) que le confieren 
diferencias en sus propiedades químicas y físicas y con ello obtener ciertas funciones 
E 
I 
CC 
16 
 
biológicas en estos organismos (Hay et al., 2010; Núñez et al., 2013). Por ejemplo, en 
Pseudomonas aeruginosa, el alginato forma parte del material que le permite la formación 
de biofilm, una matriz esencial para la el proceso de infección en pacientes con fibrosis 
quística (Kobayashi 2005). En algas marinas, el alginato es un componente estructural de la 
pared celular y su presencia proporciona fuerza mecánica y flexibilidad, además de que 
previene la deshidratación una vez que el alga tiene contacto con el aire (Rehm 2010). 
Desde un punto de vista comercial, la característica más importante del alginato es 
su capacidad gelificante y de viscosidad, las cuales le proporcionan diversas aplicaciones, 
por ejemplo, en la industria alimentaria, agrícola y farmacéutica, como aditivos capaces de 
estabilizar, emulsionar y gelificar soluciones acuosas, ó también como matriz de 
inmovilización de diversos materiales biológicos (desde células de plantas, enzimas, 
microorganismos como bacterias, algas, levaduras, entre otros) que permite su fácil manejo 
(Clementi 1997). Los alginatos bacterianos como productos comerciales dependen en gran 
medida de la posibilidad de producir polímeros con un rango extendido de distribución de 
bloques M y G en comparación con el producido por algas. Las características de los 
alginatos bacterianos no dependen de las variaciones estacionales y geográficas (como es el 
caso de alginatos producidos por algas), pero sí dependen del tipo de cepa y/ó de las 
condiciones de fermentación en las cuales se produzca (Clementi 1997). 
En A. vinelandii el alginato es producido durante la fase vegetativa como un 
polisacárido extracelular ó bien durante el proceso de enquistamiento como un componente 
esencial de la cápsula del quiste. El alginato sintetizado por células en crecimiento 
vegetativo confiere la capacidad de adhesión bacteriana a superficies, mientras que durante 
el enquistamiento, el alginato juega un papel de protección para preservarlos quistes 
durante la desecación (Costerton et al., 1987; Clementi 1997). 
 
I. 2.1.2 Biosíntesis de alginato en A. vinelandii. 
 
El alginato se sintetiza a partir de la fructosa-6-fosfato que se isomeriza por la 
enzima bifuncional fosfomanosa isomerasa-guanosina difosfomanosa pirofosforilasa (PMI-
GMP ó también llamada AlgA) para producir manosa-6-P que es convertido a manosa-1-P 
por la enzima fosfomanomutasa (PMM ó AlgC); posteriormente, PMI-GMP (AlgA) 
17 
 
cataliza la conversión de manosa-1-P a GDP manosa y es oxidada por la GDP-manosa 
deshidrogenasa (GMD o AlgD) para dar GDP-manurónico. La GDP-manosa 
deshidrogenasa, codificada por el gen algD, es la enzima clave en la vía de biosíntesis del 
alginato ya que la GDP manosa es un sustrato que se comparte con la síntesis de 
lipopolisácaridos, además de que esta reacción es irreversible. La polimerización de GDP-
manurónico es llevada a cabo por la polimerasa Alg8 (MP). El ácido polimanurónico es 
entonces modificado por un complejo acetilasa compuesto por las proteinas AlgI, AlgV y 
AlgF. Algunos residuos no acetilados son convertidos a ácido gulurónico por las 
epimerasas (AlgE1-7) extracelulares produciéndose así el alginato (Fig. 3) (Larsen & Haug, 
1971; Hay et al., 2010). 
 
 
Figura 3. Biosíntesis de alginato en Azotobacter vinelandii. (Imagen modificada de Hay et al., 2010) 
 
I. 2.1.3 Genética de la biosíntesis de alginato en A. vinelandii. 
 
En A. vinelandii se han descrito los genes estructurales de la biosíntesis de alginato. 
Excepto algC, que codifica para la PMM, todos los genes involucrados se encuentran 
agrupados en su cromosoma y se transcriben a partir de varios promotores (Gaona et al., 
2004). El gen algD, que codifica para la GDP-manosa deshidrogenasa (GMD) encabeza el 
grupo de genes biosintéticos alg. Los genes alg8, alg44, algK y algJ se encuentran 
localizados después de algD y están organizados en una unidad transcripcional. Sus 
productos participan en la polimerización y secreción del alginato (Mejía-Ruiz et al., 
1997a; 1997b; Galindo et al., 2007). Inmediatamente después de estos genes, se encuentra 
18 
 
el operón algGXLVIFA. Los productos de algV, algI y algF participan en la acetilación de 
los residuos manurónicos en el periplasma; algG codifica para una epimerasa, algL para 
una alginato liasa, y algA para una enzima bifuncional que cataliza el primer y tercer paso 
de la vía (Vázquez et al., 1999). Por otra parte, existen otro grupo de genes que codifican 
para un tipo de epimerasas extracelulares llamadas algE 1-7 y algY, las cuales son 
responsables del contenido de residuos manurónicos y gulurónicos en el polímero final 
(Steigedal et al., 2008). 
 
I. 2.2.1 poli-β-hidroxibutirato: Composición, aplicaciones y su 
importancia en A. vinelandii. 
 
El poli-β-hidroxibutirato (PHB), es un biopolímero perteneciente a la familia de los 
polihidroxialcanoatos (PHA´s) de cadena corta, formado por monómeros repetidos de β-
hidroxibutirato (CH-(CH3)-CH2-CO-O) (Williams et al., 1999). Son producidos por 
diversas especies de bacterias entre las cuales se encuentran Bacillus, Methylobacterium, 
Ralstonia, Azospirillum, Pseudomonas, Azotobacter. El PHB es biodegradable, insoluble en 
agua, no tóxico, biocompatible, piezoeléctrico, termoplástico y elastomérico. Tales 
características le permiten tener aplicaciones biotecnológicas en diversos campos como la 
medicina, la industria de embalaje y alimentaria, farmacia, agricultura, así como para la 
producción de pintura (Valappil et al., 2007). 
Una de las funciones biológicas que se le atribuyen a la producción de PHB en 
bacterias es que es un material de reserva de carbono y energía que puede ser usado en 
períodos de limitación de nutrientes en el medio (Law & Slepecky 1960). En Azotobacter 
vinelandii, una función propuesta del PHB esta involucrada con el proceso de 
diferenciación celular; se ha observado que existe una correlación entre la acumulación de 
PHB y el enquistamiento. Sin embargo, mutantes incapaces de producir PHB forman 
quistes que carecen de gránulos de PHB y que son resistentes a la desecación al igual que 
cepa silvestre (Segura et al., 2003). Otra de las funciones del PHB está relacionada a la 
fijación de nitrógeno, específicamente con la protección a la nitrogenasa, ya que se ha 
propuesto que el PHB permite la protección respiratoria en ausencia de una fuente de 
carbono exógena, al proveer a la célula de una fuente de energía y de carbono rápidamente 
19 
 
oxidable, permitiendo mantener una tasa respiratoria adecuada para disminuir la 
concentración de oxígeno y contribuyendo así a la protección a la nitrogenasa (Segura & 
Espín 1998; Senior et al., 1972). 
 
I. 2.2.2 Biosíntesis de PHB en A. vinelandii. 
 
La biosíntesis de PHB en A.vinelandii se lleva a cabo en tres reacciones 
enzimáticas. La primera reacción consiste en la condensación de dos moléculas de acetil-
CoA por la enzima β-cetotiolasa para dar acetoacetil-CoA. En la segunda reacción el 
acetoacetil-CoA es reducido por la enzima acetoacetil-CoA reductasa utilizando NADPH y 
produciendo D(-)-β-hidroxibutiril-CoA. En la tercer etapa, el D-β-hidroxibutiril-CoA se 
polimeriza por la actividad de la enzima PHB sintasa (Fig. 4) (Verlinden et al., 2007). 
 
 
Figura 4. Biosíntesis de PHB en Azotobacter vinelandii. (Imagen modificada de Verlinden et al., 2007). 
 
I. 2.2.3 Genética de la biosíntesis de PHB en A. vinelandii. 
 
En A. vinelandii los genes phbA, phbB y phbC codifican para la β-cetotiolasa, 
acetoacetil-CoA reductasa y PHB sintasa, respectivamente. Los tres genes se encuentran 
agrupados formando el operón phbBAC. El cual es transcrito a partir de dos promotores 
sobrelapados, pB1 y pB2. PhbR, codificado por el gen phbR, activa la transcripción del 
operón biosintético de PHB a partir del promotor pB1, mientras que la transcripción de pB2 
es dependiente del factor σS (Peralta-Gil et al., 2002). 
 
20 
 
I. 2.3.1 Alquilresorcinoles: Composición y su importancia en A. 
vinelandii. 
 
 Los ARs son miembros de una familia de compuestos referidos como lípidos 
fenólicos homólogos de orcinol de cadenas laterales largas, los cuales han sido 
identificados en numerosas plantas (de las familias Ginkgoaceae, Anacardiaceae y 
Gramineae), en algunas familias de algas, hongos y en microorganismos, especialmente en 
cepas del género Mycobacterium, Streptomyces, Azotobacter (Kosubek et al., 1996; 
Kosubek & Tyman 1999; Baerson et al., 2010). 
Se ha reportado que los ARs presentan diversas funciones en los organismos que los 
producen. En plantas, por ejemplo, los ARs participan en la protección de las semillas 
evitando la colonización de hongos (Kosubek & Tyman 1999). En Azotobacter vinelandii, 
se ha comprobado que los ARs están presentes durante el enquistamiento y cumplen un 
papel estructural en las capas intina y exina del quiste. Sin embargo, los ARs no son 
esenciales para que los quistes resistan desecación, ya que se ha observado que en algunas 
cepas, los quistes provenientes de mutantes incapaces de sintetizar ARs son capaces de 
resistir desecación (Segura et al., 2009). 
 
I. 2.3.2 Biosíntesis de alquilresorcinoles en A. vinelandii. 
 
En la ruta de biosíntesis de ARs intervienen un grupo de proteínas denominadas 
ArsA, ArsB, ArsC y ArsD. ArsA es una sintasa que cataliza la síntesis del ácido graso de 
22-26 carbonos n-behenil-CoA a partir de acetil-CoA y la condensación de varias 
moléculas de malonil-CoA. ArsB y ArsC son policetido sintasas de tipo III y su actividad 
se basa en producir alquilresorcinoles ó alquilpironas utilizando el n-behenil-CoA como 
sustrato. ArsB sintetiza 5-n-heneicosilresorcinol por condensación aldólica entre C2 y C7 y 
ArsC sintetiza 6-n-alquilpironas. ArsD se encarga de catalizar la modificación 
posttraduccional del dominio ACP (proteína acarreadora de acilos) de la proteína ArsA, 
uniendo covalentemente“un brazo” de 4-fosfopanteteína proveniente de malonil-CoA y de 
esta manera hacer funcional a ArsA para aceptar a sus sustratos (Funa et al., 2006; Segura 
et al., 2009) (Fig. 5). 
21 
 
 
Figura 5. Biosíntesis de alquilresorcinoles en Azotobacter vinelandii. 
 
I. 2.3.3 Genética de la biosíntesis de los alquilresorcinoles en A. 
vinelandii. 
 
Se ha identificado un grupo de genes que codifican para la síntesis de ARs que se 
encuentran organizados en el operón arsABCD (Funa et al., 2006). Su transcripción 
comienza a partir de un único promotor, el cual es activado directamente por la proteína 
ArpR, un regulador perteneciente a la familia LysR cuyo coinductor es acetoacetil-CoA. La 
transcripción del gene arpR es activada por ArpR y es dependiente de RpoS (Romero et al., 
2013). Adicionalmente, la proteína RsmA reprime la expresión de ArpR a nivel 
postranscripcional uniéndose a la región 5´no traducida de su mRNA (Romero et al., 2016). 
 
I. 3 Los sistemas de regulación global Gac-Rsm, RpoS y PTS
Ntr
. 
I. 3.1 El sistema de doble componente GacS/GacA. 
 
El sistema GacS/GacA es un sistema de transducción de señales de dos 
componentes utilizado por una gran variedad de especies bacterianas del subgrupo γ y tiene 
la función de contender y responder a cambios ó señales del medio ambiente (Heeb & Hass 
2001; Lapouge et al., 2008). El sistema consiste de una proteína transmembranal con 
actividad cinasa llamada GacS la cual presenta una región con dominios periplásmicos y 
una región citoplásmica con varios motivos que tienen relación directa con el proceso de 
fosforilación. GacS se autofosforila y transmite el grupo fosfato al regulador de respuesta 
22 
 
GacA. Esta proteína está constituída por un dominio de fosforilación y un dominio de unión 
a DNA. La fosforilación de GacA genera cambios conformacionales en la proteína y esto 
posibilita su pegado a la región promotora de sus genes blanco (Parkinson & Kofoid 1992; 
Stock et al., 2000). Se han identificado cerca de 20 homólogos de GacS/GacA en bacterias 
entéricas (por ejemplo E. coli, Salmonella, Erwinia, Pseudomonas, Vibrio, Azotobacter 
entre otros) (Haas & Keel 2003). Se ha observado además que este sistema ayuda a estos 
organismos a adaptarse a diferentes condiciones en respuesta a cambios ambientales, ya 
que controla la producción de metabolitos secundarios, enzimas extracelulares, factores de 
virulencia ó biocontrol y productos extracelulares, los cuales están relacionados con la 
adaptación al ambiente (Heeb & Haas 2001; Lapouge et al., 2008). Se ha reportado que el 
sistema de dos componentes GacS/GacA controla sus blancos de forma indirecta, activando 
la expresión de RNAs pequeños no codificantes llamados CsrB/CsrC (en E.coli) ó 
RsmY/Z/ (en Pseudomonas spp.) (Humair et al., 2010). 
 
I. 3.2 El sistema Rsm. 
 
El sistema Rsm constituye un sistema global de regulación que controla la expresión 
de genes bacterianos a nivel postranscripcional. Este sistema se ha encontrado en bacterias 
como Pseudomonas spp. y Azotobacter y es homólogo al sistema Csr descrito en E.coli. 
Está compuesto por una pequeña proteína efectora de unión a RNA llamada RsmA (CsrA 
en E. coli), la cual reconoce secuencias GGA cercanas y/o dentro del Shine Delgarno (SD) 
de ARN mensajeros blanco impidiendo así su traducción (Romeo 1998). El segundo 
componente del sistema es RsmY/Z/W/V (CsrB/CsrC en E. coli), los cuales son RNAs 
pequeños no codificantes que antagonizan la actividad de RsmA/CsrA. La estructura 
secundaria de estos RNAs presenta varias estructuras de tallo y asa, encontrándose en estas 
últimas, secuencias repetidas que son reconocidas por RsmA/CsrA. De esta forma, 
RsmY/Z/W/V (CsrB) secuestra a las moléculas de RsmA/CsrA dejando libre el mRNA 
para ser traducido y así inhibir la actividad de RsmA/CsrA (Romeo 1998; Vakulskas et al., 
2015; Miller et al., 2016; Janssen et al., 2018). 
 
 
23 
 
I. 3.3 El factor sigma RpoS. 
 
El factor sigma alternativo RpoS pertenece a un grupo de subunidades de la RNA 
polimerasa que reconocen regiones promotoras de genes y dirigen a la holoenzima hacia 
ellos para su transcripción. E. coli tiene 7 factores sigma, cada uno de los cuales es 
responsable para la regulación de genes bajo condiciones específicas (Storvik & Foster 
2010). Por ejemplo, el factor sigma RpoD dirige la RNA polimerasa a transcribir genes 
“housekeeping” que específicamente son expresados durante la fase exponencial. El factor 
sigma RpoS, por su parte, está presente en bajos niveles en fase logarítmica y su expresión 
es inducida en respuesta a una gran variedad de tipos de estrés cuando entra en fase 
estacionaria. Cuando los niveles de RpoS son altos, compite con el factor sigma RpoD por 
el núcleo de la RNA polimerasa, y así activar la transcripción de genes necesarios para 
contender al estrés (Typas et al., 2007). Estudios en expresión global de genes en E. coli 
han concluido que más del 10% de su genoma es controlado por RpoS. Es por ello que el 
factor sigma alternativo σ
S
 (codificado por el gene rpoS) es considerado el regulador 
maestro de la respuesta al estrés (Hengge-Aronis 1996; Dong et al., 2008; Battesti et al., 
2011). Este mecanismo de respuesta regulado por RpoS es una función conservada en 
gamma y beta proteobacterias. Además, al igual que otros reguladores transcripcionales, 
RpoS es altamente regulado a nivel de la transcripción, traducción y degradación (Battesti 
et al., 2015). 
 
I. 3.4 El sistema de fosfotransferasas PTS
Ntr
. 
 
En E. coli y muchas otras bacterias gram-negativas, el sistema de fosfotransferasas 
PTS (phosphotransferase system) actúa como un sistema sensor de señales del ambiente y 
tiene una gran importancia en el metabolismo celular de la bacteria. El sistema PTS está 
formado por un grupo de enzimas que llevan a cabo una transferencia de un grupo fosfato a 
partir de fosfoenolpiruvato (Lee et al., 2013). Se conocen dos tipos de PTS y su diferencia 
radica en la composición de las enzimas que lo conforman así como en la función que 
desempeñan (Fig. 6): 1) PTS de carbohidratos: Está formado por las proteínas EI, HPr y el 
complejo proteico EII (EIIA, EIIB, EIIC). Este sistema es inducido en presencia de 
24 
 
azúcares y ciertos carbohidratos en el medio y su función es transportar tales sustratos a la 
célula a través de una cascada de fosforilación desde el fosfoenolpiruvato que inicia con la 
autofosforilación de la proteína EI, la cual transfiere el grupo fosfato a HPr y esta a su vez a 
EIIA, en donde EIIB recibe el grupo fosfato y finalmente lo transfiere al azúcar unido a 
EIIC (Postma et al., 1993; Deutscher et al., 2006; Li et al., 2016). 2) PTS asociado a 
nitrógeno (PTS
Ntr
): Se compone de 3 proteínas: EI
Ntr
, codificada por el gene ptsP, NPr 
codificada por el gene ptsO, y EIIA
Ntr
 codificada por el gene ptsN. Tales proteínas son 
homólogas a EI, HPr y EIIA del sistema PTS de carbohidratos, llevando a cabo la 
transferencia del grupo fosfato a partir de fosfoenolpiruvato (Powell et al., 1995; Plüger & 
Görke 2010). Sin embargo, el sistema PTS
Ntr 
carece de las subunidades homólogas a EIIB y 
EIIC, por lo que la proteína EIIA
Ntr
 es considerada como el aceptor final del grupo fosfato 
(Deutscher et al., 2014). Hasta ahora, se desconoce el sustrato que reciba el fosfato por 
parte de EIIA
Ntr
, pero se ha sugerido que este sistema funciona principalmente en la 
regulación de diversos procesos fisiológicos que involucra la participación de alguna de las 
proteínas del sistema PTS
Ntr
 siendo estas dependientes de su estado de fosforilación (Lee et 
al., 2013; Lüttman et al., 2015). Asimismo, se ha sugerido que el papel de EI
Ntr
 y NPr en la 
regulación es en general indirecto y es mediado via fosforilación de EIIA
Ntr
, por lo que esta 
proteína sería el principal regulador en tales procesos (Galinier & Deutscher 2017). Por 
ejemplo en E.coli, EIIA
Ntr
 controla la homeostasis de potasio y lo realiza a través de dos 
vías: En presencia de niveles bajos de K
+
, EIIA
Ntr
 no fosforilada interacciona con la cinasa 
sensora KdpD estimulando su actividad cinasa sobre el regulador de respuesta KdpE, el 
cual activa la transcripción del operón kdpFABC que codifica para un transportador de K
+
 
de alta afinidad (Lüttman et al., 2009). En presencia de altos niveles de K
+
, EIIA
Ntr
 no 
fosforilada interacciona con TrkA (una subunidad del transporte de potasio de baja afinidad 
Trk) y bloquea el transporte del catión (Lee et al., 2007). Por otro lado, EIIA
Ntr
 no 
fosforilada interacciona con la cinasa sensora PhoR, aumentando la fosforilación del 
regulador de respuesta PhoB y a su vez la expresión del regulón pho, el cual es necesario 
para la respuesta a la escasez de fosfato (Lüttman et al., 2012). En otro caso, EIIA
Ntr
 no 
fosforilada interactúa con el regulador de respuesta SsrB de Salmonella virulence in vivo, 
reduciendo la expresión de la isla de patogenicidad 2 (SPI-2). Además, la interacción de 
EIIA
Ntr
 fosforilada y SsrB fue observada in vitro (Choi et al., 2010); también se ha 
25 
 
reportado que EIIA
Ntr
 no fosforilada interactúa con enzimas metabólicas espefíficas, como 
la subunidad E1 del complejo piruvato deshidrogensa (PDH) de Pseudomonas putida 
(Pfüger et al., 2011) y la enzima bifuncional SpoT (ppGpp sintasa/hidrolasa) de Ralstonia 
eutropha (Karstens et al., 2014). 
Otra característica interesante en el sistema PTS
Ntr
 es la presencia del domino GAF 
en el extremo N-terminal de la proteína EI
Ntr
, el cual es un módulo sensorial que puede unir 
a varios ligandos (Aravind & Ponting 1997). Se ha reportado que en bacterias como 
Escherichia coli, Sinorhizobium meliloti y Caulobacter crescentus el domino GAF de la 
proteína EI
Ntr
 actúa como un receptor de moléculas como cGMP, glutamina y α-
cetoglutarato (Lee et al., 2013; Goodwin & Gage 2014; Ronneau et al., 2016). 
 
 
Figura 6. PTS de carbohidratos y PTS
Ntr
. En el modelo canónico del sistema de fosfotransferasas, la enzima 
EI (ó EI
Ntr
) se autofosforila a partir de fosfoenolpiruvato (PEP). La transferencia del grupo fosfato continúa 
hacia HPr (ó NPr) y EIIA (EIIA
Ntr
). En el sistema PTS
Ntr
 también EI
Ntr
 se autofosforila a partir del PEP, 
fosforila a NPr y esta última a EIIA
Ntr
, sin embargo, se desconoce un substrato que reciba el fosfato por parte 
de EIIA
Ntr
 (Modificado de Pflüger & Görke 2010). 
 
 
 
 
 
26 
 
II. ANTECEDENTES. 
II. 1 Regulación de la biosíntesis de alginato, PHB y ARs por GacA en A. 
vinelandii a través de Rsm y RpoS. 
 
En A. vinelandii, GacA es un regulador positivo de la síntesis de alginato, PHB y 
ARs y su control lo ejerce indirectamente de dos maneras. La primera, a través del sistema 
Rsm, el cual está formado por la proteína RsmA y ocho RNAs no codificantes llamados 
RsmZ (1-7) y rsmY. Se ha demostrado que RsmZ1 y RsmZ2 son capaces de unirse a RsmA 
in vitro, y que la proteína RsmA se une a los RNA mensajeros (mRNAs) de algD, phbR y 
arpR (Manzo et al., 2011; Hernández-Eligio et al., 2012; Romero et al., 2016) donde algD 
codifica para GDP-manosa deshidrogenasa, una enzima clave para la biosíntesis de alginato 
(Campos et al., 1996), phbR codifica para el activador transcripcional de la biosíntesis de 
PHB (Hernández-Eligio et al., 2011), y arpR codifica para el activador transcripcional del 
operón arsABCD de la biosíntesis de ARs (Romero et al., 2013). Asimismo, se ha 
documentado que GacA es capaz de activar la transcripción de RsmZ (1-7) y RsmY 
(Hernández-Eligio et al., 2002) y con ello evita que RsmA se una a los mRNAs de algD, 
phbR y arpR, favoreciendo su traducción y con ello la síntesis de alginato, PHB y ARs 
(Fig. 7). 
Además GacA podría estar controlando la síntesis de alginato, PHB y ARs a través 
de la regulación positiva que ejerce sobre la expresión de RpoS, ya que el mRNA de rpoS 
no fue detectado en una mutante gacA de A. vinelandii ATCC 9046 en fase estacionaria 
(Castañeda et al., 2001). Aunque se desconoce el mecanismo por el cual GacA controla la 
expresión de rpoS, se ha documentado que una mutante en el gene rpoS es incapaz de 
sintetizar ARs (Cocotl-Yañez et al., 2011) y que la transcripción de algD, phbR y arpR son 
RpoS dependientes (Castañeda et al., 2001; Peralta-Gil et al., 2002; Romero et al., 2013: 
Romero et al., 2016) (Fig. 7). 
27 
 
 
Figura 7. Modelo de regulación de la síntesis de alginato, PHB y ARs a través de GacA en A. vinelandii. 
GacA activa la transcripción de 8 RNAs pequeños no codificantes RsmZ (1-7) y rsmY, los cuales se unen a la 
proteína RsmA (representada en círculo oscuro) y evitan que interaccione con la región líder de los mRNAs 
de algD, phbR, phbB y arpR, inhibiendo su traducción y favoreciendo la síntesis de alginato, PHB y ARS. Por 
otro lado, GacA podría estar controlando la síntesis de alginato, PHB y ARs a través de RpoS. La 
transcripción de los genes algD, phbR, phbB y arpR (representados por rectángulos y flechas) son RpoS 
dependientes. Lineas con barras: regulación negativa; líneas con punta de flecha: regulación positiva; línea 
punteada con punta de flecha: regulación hipotética. 
 
II. 2 PTS
Ntr
 controla la síntesis de PHB y ARs en A. vinelandii. 
 
Otro sistema de regulación involucrado en el control de PHB y ARs en A. vinelandii 
es PTS
Ntr
. Este sistema ha sido estudiado mayoritariamente en la cepa UW136, la cual 
contiene una mutación en el gene algU y por lo tanto es incapaz de producir alginato y de 
formar quistes (Moreno et al., 1998). En esta cepa, la inactivación de los genes ptsP (EI
Ntr
) 
y ptsO (NPr) abaten la producción de PHB y ARs, mientras que en una mutante en el gen 
ptsN (EIIA
Ntr
) incrementa la acumulación de estos compuestos. Los efectos negativos 
observados en estos fenotipos se deben a que las mutaciones en los genes ptsP y ptsO 
disminuyen la expresión del operón phbBAC y de phbR para la síntesis de PHB, así como 
de arsA y arpR para la síntesis de ARs, mientras que en la mutante ptsN los niveles de 
expresión fueron superiores (Segura & Espín 1998; Noguez et al., 2008; Muriel et al., 
2015). Estos resultados suponen que las mutaciones en ptsP y ptsO afectarían la 
transferencia del grupo fosfato hacia EIIA
Ntr
, por lo que esta proteína en su forma no 
28 
 
fosforilada sería la que ejerce el efecto negativo sobre la síntesis de tales compuestos. Esta 
hipótesis fue confirmada cuando a una cepa que expresa sólo a EIIA
Ntr
 no fosforilada 
(debido a una mutación en el sitio de fosforilación de EIIA
Ntr
) presentó los efectos 
negativos similares a los de las cepas con mutación en ptsP y ptsO, confirmando que la 
proteína EIIA
Ntr
 en su estado no fosforilado afecta negativamente la síntesis de PHB y ARs 
(Noguez et al., 2008; Muriel et al., 2015). 
En otro estudio recientemente documentado en A. vinelandii UW 136, se observó 
que mutaciones en los genes ptsP y ptsO disminuyen la estabilidad de RpoS, mientras que 
en la mutante ptsN es restaurada (Muriel-Millán et al., 2017). Similar a la mutante ptsP, la 
estabilidad de RpoS fue reducida en la cepa que expresa sólo EIIA
Ntr
 no fosforilada, pero se 
restaura en cepas con mutaciónes en los genes clpA, clpX y clpP. Los genes clpA y clpX 
codifican para chaperonas, mientras que clpP codifica para una serina proteasa. Cada 
chaperona puede formar junto con la proteasa el complejo proteolítico ClpAP y ClpXP para 
llevar a degradación ciertas proteínas (Ortega et al., 2004). Dado que mutaciones en los 
genes clpX ó clpP incrementan los niveles de RpoS en la cepa silvestre y en la mutante 
ptsP, se confirmó que RpoS es degradado por el complejo ClpXP y la presencia de la 
proteína EIIA
Ntr
 no fosforilada induce la degradación de RpoS a través del complejo 
proteolítico ClpAP, afectando la síntesis de PHB y AR´s (Muriel-Millánet al., 2017) (Fig. 
8). 
 
 
29 
 
 
Fig 8: Control de la síntesis de PHB y ARs por el sistema PTS
Ntr
 en A. vinelandii. En condiciones en donde la 
proteína EIIA
Ntr
 se encuentre en su estado no fosforilado, el reconocimiento y degradación de RpoS por el 
complejo ClpAP es inducido, reduciendo la transcripción de genes relacionados a la síntesis de PHB y ARs. 
Adicionalmente, EIIA
Ntr
 reprime la expression de los operones biosinteticos phbBAC y arsABCD a nivel pos 
transcripcional por una via no explorada. Lineas con punta de flecha indican activación; línea con barra: 
repression. Lineas punteadas: mecanismos no definidos (Muriel et al., 2017). 
 
II. 3 Regulación del enquistamiento en A. vinelandii. 
 
El alginato es el único polímero esencial para la formación de quistes resistentes a la 
desecación. Mutaciones en genes que abaten su síntesis también abaten la formación de 
quistes (Campos et al., 1996; Castañeda et al., 2000). En el caso contrario, mutantes que no 
pueden sintetizar PHB tienen la capacidad de formar quistes maduros (Segura et al., 2003), 
y mutantes que no sintetizan ARs forman quistes que estructuralmente presentan una 
morfología alterada en la exina pero pueden resistir desecación (Segura et al., 2009). Como 
se ha mencionado anteriormente, GacA es un regulador positivo de la síntesis de alginato y 
su control lo ejerce a través del sistema Rsm. Por lo tanto, se puede especular que una vía 
por la cual GacA controla el enquistamiento sea a través del sistema Rsm (Gac-Rsm). En la 
Tabla 1 se observa que en una mutante gacA se abate la síntesis de alginato y por lo tanto 
no se producen quistes resistentes a la desecación. Asimismo, en una mutante rsmZ1 
(rsmZ1 codifica para uno de los sRNA´s no codificantes de la familia RsmZ) la producción 
de alginato disminuye 5 veces en comparación con la cepa silvestre, pero es suficiente para 
que en esta cepa se produzcan quistes resistentes a la desecación. Sin embargo, en la cepa 
30 
 
AEIVgacA/pMM2, en la cual rsmZ1 se expresa bajo un promotor independiente de GacA, 
no se producen quistes resistentes a la desecación, a pesar de que esta cepa produce 
alginato. Estos datos nos indican que además del control de la síntesis de alginato a través 
de la activación de RsmZ, GacA controla la expresión de genes que son esenciales para la 
formación de quistes resistentes a la desecación por una vía independiente de Rsm. 
 
Tabla 1. Producción de alginato y enquistamiento en cepas de A. vinelandii AEIV. 
Cepa Genotipo 
Producción Alginato 
(µg/mg of proteína) 
Resistencia a 
desecación (%) 
AEIV wild-type *1147 + 89 6.5 + 1.21 
AEIVgacA gacA::Gm *< 0.01 <0.0001 
AEIVrsmZ1 rsmZ::Km *250 + 18 **6.1 + 0.95 
AEIVrsmZ1/pCV2 rsmZ::Km/rsmZ1
+
 *840 + 65 **5.8 + 0.83 
AEIVgacA/pMM2 gacA::Gm/rsmZ1
+
 *720 + 83 **< 0.0001 
AEIV/pMCY2 AEIV/rsmA
+
 200 + 15 **5.4 + 1.14 
AEIVrpoS rpoS::Sm *812 + 118 *< 0.0001 
*Datos tomados de Manzo et al., 2001; Cocotl-Yañez et al., 2014. **Datos realizados en este 
trabajo. 
 
Otra de las posibles vías por las que GacA estaría controlando el enquistamiento es a 
través de RpoS (Gac-RpoS). Se conoce que durante la fase de crecimiento de A. vinelandii 
ATCC 9046 el mRNA de rpoS es detectado durante la fase estacionaria. Sin embargo, en 
una mutante gacA no hay detección de mRNA de rpoS en ninguna de las fases de 
crecimiento (Castañeda et al., 2001). Bajo este argumento, GacA estaría participando en el 
control de RpoS aunque aún no es claro su mecanismo. Por otro lado, ya que se ha 
reportado que RpoS está involucrado en el proceso de enquistamiento, en la Tabla 1 se 
muestra que una cepa con mutación en el gen rpoS no se afecta la síntesis de alginato pero 
los quistes producidos por esta cepa son incapaces de resistir desecación. Asimismo, esta 
cepa no produce ARs y los quistes carecen de las capas intina y exina (Cocotl-Yañez et al., 
2011). En conjunto, estos antecedentes nos permiten especular que GacA estaría 
controlando el enquistamiento a través de RpoS. 
En el presente trabajo se planteó estudiar al sistema PTS
Ntr
 como una vía adicional 
por la cual GacA estaría controlando el enquistamiento (Gac-PTS
Ntr
). Hasta la fecha, se 
desconoce si en A. vinelandii PTS
Ntr
 ejerce un efecto sobre la formación de quistes 
resistentes a desecación, ya que su estudio se ha centrado en determinar cómo este sistema 
31 
 
regula la síntesis de PHB y ARs a través de la proteína EIIA
Ntr
 no fosforilada (Noguez et 
al., 2007; Muriel-Millán et al., 2015). Por otro lado, se comprobó recientemente que 
EIIA
Ntr
 no fosforilada induce la degradación de RpoS mediada por el complejo proteolítico 
ClpAP (Muriel-Millán et al., 2017). Dado que RpoS controla el enquistamiento (Cocotl-
Yañez et al., 2011) y PTS
Ntr
 controla genes que participan en la síntesis de componentes 
relacionados a la formación de quistes (Noguez et al., 2007; Muriel-Millán et al., 2015), 
sería de gran relevancia estudiar el efecto del sistema PTS
Ntr
 sobre el proceso de 
enquistamiento a través de la proteína EIIA
Ntr
 no fosforilada, la cual podría estar controlada 
por GacA. 
De acuerdo a lo anterior, en el presente trabajo se propuso elucidar el control del 
proceso de enquistamiento a través de las vías Gac-Rsm y Gac-RpoS así como determinar 
si el sistema PTS
Ntr
 es una vía adicional que participa en este proceso y que se encuentra 
bajo el control de GacA (Gac-PTS
Ntr
). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
32 
 
III. HIPÓTESIS. 
 
GacA controla el enquistamiento por las vías Gac-Rsm, Gac-RpoS y una vía 
adicional Gac-PTS
Ntr
, donde GacA afecta el estado de fosforilación de EIIA
Ntr
. 
 
IV. OBJETIVOS. 
 
IV. 1 Objetivo general. 
 
Caracterizar la regulación del proceso de enquistamiento establecida través de GacA 
sobre el sistema PTS
Ntr
 como una vía adicional a la ejercida por GacA vía el sistema Rsm y 
RpoS en A. vinelandii. 
 
IV. 2 Objetivos específicos. 
 
- Estudiar la relación entre GacA y el sistema Rsm, RpoS y PTS
Ntr
 en las vías de regulación 
del proceso de enquistamiento de Azotobacter vinelandii. 
 
- Caracterizar el efecto regiulador del sistema PTS
Ntr
 sobre el proceso de enquistamiento en 
A. vinelandii. 
 
- Determinar el papel de la proteína GacA en el estado de fosforilación de EIIA
Ntr
 durante 
el enquistamiento. 
 
 
 
 
 
33 
 
V. MATERIAL Y MÉTODOS. 
V. 1 Cepas bacterianas, plásmidos y oligonucleótidos. 
 
Las cepas bacterianas, plásmidos y oligonucleótidos utilizados en este trabajo se 
describen en la Tabla 2. 
 
Tabla 2. Cepas, plásmidos y oligonucleótidos utilizados en este trabajo. 
Cepa, plásmido, 
oligonucleótido Descripción Referencia 
Azotobacter vinelandii 
AEIV 
 
 
 
Silvestre, mucoide 
 
 
 
Svein Valla (Norwegian 
University of Science and 
Technology) 
 
AEIVgacA AEIV con mutación gacA::Gm Manzo et al., 2012 
AEIVgacA/pMCY-ZKm 
 
AEIVgacA con plásmido pMCY-ZKm cointegrado 
en el cromosoma 
Este trabajo 
 
AEIVrpoS AEIV con mutación rpoS::Sp Cocotl-Yañez et al., 2014 
AEIVrpoS/pSMrpoS 
AEIVrpoS que contiene el plásmido pSMrpoS 
para expresar a rpoS independiente de GacA Este trabajo 
AEIVgacA/pSMrpoS 
AEIVgacA que contiene el plásmido pSMrpoS 
para expresar rpoS independiente de GacA Este trabajo 
AEIVgacA/pMCY-ZKm/ 
pMCY-rS2 
AEIVgacA/pMCY-ZKm que contiene el plásmido 
pMCY-rS2 
 
Este trabajo 
 
AEIVptsP AEIV con mutación ptsP::Tc Este trabajo 
AEIVptsO AEIV con mutación ptsO::Sp Este trabajo 
AEIVptsN AEIV con mutación ptsN::Km Este trabajo 
AEIVptsP/ptsO AEIVptsP con mutación ptsO::Sp Este trabajo 
AEIVptsP/ptsN AEIVptsP con mutación ptsN::Km Este trabajo 
AEIVpALA8 
AEIV con plásmido pALA8 cointegrado en el 
cromosoma para expresar a H68A EIIA
Ntr
 no 
fosforilable Este trabajo 
AEIVpALA7 
 
AEIV con plásmido pALA7 cointegrado en el 
cromosoma para expresar a EIIA
Ntr
 fosforilableEste trabajo 
AEIVgacA/pALA7 
AEIVgacA con plásmido pALA7 cointegrado en el 
cromosoma para expresar a EIIA
Ntr
 fosforilable Este trabajo 
AEIVgacA/ptsN AEIVgacA con mutación ptsN::Km Este trabajo 
AEIVgacA/ptsN/pMM2 
 
AEIVgacA/ptsN con plásmido pMM2 para la 
expression rsmZ1 a partir de un promotor 
independiente de GacA Este trabajo 
34 
 
AEIVgacA/ptsN/pSM-rS1 
AEIVgacA/ptsN con plásmido pSM-rS1 para la 
expresión de rpoS a partir de un promotor 
independiente de GacA Este trabajo 
AEIV/pSAEIIA-1 
 
AEIV con plásmido pSAEIIA-1 para expresar a 
EIIA
Ntr
 fosforilable a partir de un promotor gyrA 
Este trabajo 
 
AEIV/pSAH68A 
 
AEIV con plásmido pSAH68A para expresar a 
EIIA
Ntr
-H68A no fosforilable a partir de un 
promotor gyrA 
Este trabajo 
 
AEIVptsP/pSAEIIA-1 
 
AEIVptsP con plásmido pSAEIIA-1 para expresar 
a EIIA
Ntr
 fosforilable a partir de un promotor gyrA 
Este trabajo 
 
AEIVptsO/pSAEIIA-1 
 
AEIVptsO con plásmido pSAEIIA-1 para expresar 
EIIA
Ntr
 fosforilable 
Este trabajo 
 
AEIVgacA/pSAEIIA-2 
 
AEIVgacA con plásmido pSAEIIA-2 para 
expresar a EIIA
Ntr
 fosforilable 
Este trabajo 
 
AHrsmA UW 136 con mutación rsmA::Sp 
Hernández-Eligio et al., 
2002 
LSW1 UW 136 con mutación ptsP::Tc Muriel-Millán et al., 2015 
RN6 UW 136 con mutación ptsO::Sp Noguez et al., 2007 
RN4 UW 136 con mutación ptsN::Km Noguez et al., 2007 
Escherichia coli 
DH5α 
 
BL21 (DE3) 
supE44, ∆lacU169, hsdR17, recA1, endA1, 
gyrA96, relA1 
F
-
 ompT hsdSB (r
-
B m
-
B) gal dcm 
 
 
Hanahan, 1983 
Invitrogen 
BpALA7 BL21 con plásmido pALA7 Este trabajo 
BpALA8 BL21 con plásmido pALA8 Este trabajo 
Plásmidos 
pBBRIMCS-2 
 Vector de clonación, Km
r
 
Kovach et al., 1995 
 
pBBRIMCS-3 
 Vector de clonación, Tc
r
 
Kovach et al., 1995 
 
pBBRIMCS-5 
 Vector de clonación, Gm
r
 
Kovach et al., 1995 
 
pJET1.2/blunt Vector de clonación ThermoScientific 
pET24a Vector de expresión, Km
r
 Novagen 
pJETpgyrA pJET1.2 con región promotora de gyrA Muriel-Millán et al., 2015 
pMCY-rS2 pSMrpoS, Tc
r
 Este trabajo 
pGyrS pJETpgyrA con el gen rpoS bajo el promotor gyrA Este trabajo 
pSMrpoS 
 
pBBR1MCS-2 con el gen rpoS bajo el promotor 
Km 
Cocotl-Yañez et al., 2011 
 
pSM-rS1 
 
pBBR1MCS-3 con el gene rpoS bajo el promotor 
gyrA 
Este trabajo 
 
35 
 
pGyrZ 
pJETpgyrA con el gen rsmZ1 bajo el promotor 
gyrA Este trabajo 
pMCY-ZKm pGyrZ con resistencia a km Este trabajo 
pBRpgyrA pBR1MCS-3 con region promotora de gyrA Este trabajo 
 
pALA7 pET24a con ptsN silvestre, Km
r
 Noguez et al., 2008 
pALA8 pET24a con mutación H68A en el gene ptsN
 Noguez et al., 2008 
pMM2 pJB3Tc20 con el gene rsmZ1 bajo el promotor lac Manzo et al., 2012 
pSAEIIA-1 
 
pBBR1MCS-5 con el gen ptsN bajo el promotor 
gyrA, Gm
r
 
 
Este trabajo 
pSAEIIA-2 
 
pBBR1MCS-2 con el gen ptsN bajo el promotor 
gyrA, Km
r
 Este trabajo 
pSA-H68A 
 
pBBR1MCS-5 con ptsN-H68A bajo el promotor 
of gyrA, Gm
r
 Este trabajo 
Oligonucleótidos (5'-3') 
ptsNup1 GGCTTCATATGATCAGACTCGAAGACAT Noguez et al., 2008 
ptsNlow2 CGGAACTCGAGCAGGCTCTTCTGTGC Noguez et al., 2008 
fw-gyrA CCAGCAAGGGCAAGGTCTA Noguez et al., 2008 
rev-gyrA TCGTCCAGCGGCAACAGGT Noguez et al., 2008 
RTupRpoS AGGATGTCCTGGACGATGAG Cocotl-Yañez et al., 2011 
RTdownRpoS TCCAGCGCCCTAGTGTAGTC Cocotl-Yañez et al., 2011 
RvptsNTH ATCGGTACCTTACAGGCTCTTCTGTGCG Este trabajo 
FwptsNTH ATCGAGCTCATGATCAGACTCGAAGACATT Este trabajo 
arsA-RT-F CACCCTCGTCAATCTGCTC Romero et al., 2016 
arsA-RT-R GATCCTGGTCGAAGACCTTG Romero et al., 2016 
ptsNfw AAGAAACGCGCTCTCGAATA Este trabajo 
ptsNre AGTTTTTCACGGGCAATCAG Este trabajo 
ptsOfw GCGAAGTCACCATCATCAAC Este trabajo 
ptsOre CTCTTGCCATGCACCAGATT Este trabajo 
ptsPfw GCAAGATCGTCCAGGAAGTG Este trabajo 
ptsPre GCAGATAGACCGAGCACACC Este trabajo 
 
V. 2 Condiciones de cultivo. 
 
Los cultivos de A. vinelandii se realizaron en medio Burk-Sacarosa (BS) con la 
siguiente composición (en g/L): K2HPO4, 0.8; KH2PO4, 0.2; Na2SO4, 0.183; MgCl2-6H2O, 
0.16; FeSO4-7H2O, 0.005; Na2MoO4-2H2O, 0.0002; CaCl2-2H2O, 0.073 (Kennedy et al., 
1986). Para las condiciones de crecimiento vegetativo, el medio de cultivo se suplementó 
con 2% sacarosa mientras que para las condiciones de enquistamiento se suplementó con 
36 
 
0.2% de n-butanol (medio BB). Los cultivos en medio líquido se llevaron a cabo en 
matraces de 125 ml con 25 ml de medio ó de 250 ml con 50 ml de medio en incubadora a 
30 °C con agitación a 200 rpm durante 30 hrs para el crecimiento vegetativo y 120 hrs para 
enquistamiento. Los cultivos de E. coli DH5 se crecieron en medio Luria-Bertani (LB) a 
37°C. La composición del medio es la siguiente (en g/L): bacto peptona, 10; extracto de 
levadura, 5; cloruro de sodio, 10. La concentración de antibióticos usados (en mg/ml) para 
A. vinelandii fué la siguiente: tetraciclina (Tc), 20; Kanamicina (Km) 3; ácido naliríxico 
(Nal), 20; espectinomicina (Sm) 20 y gentamicina (Gm) 1.5, mientras que para E. coli: Km 
30 (Kennedy et al., 1986). 
Para las conjugaciones bacterianas se utilizó medio BS-LB (78% BS y 22% LB) 
adicionado con 15 mM de acetato de amonio NH4C2O2H3 y 0.2% de glucosa, libre de 
antibiótico. Los cultivos fueron incubados a 30 °C durante 24-48 horas (Page & Von 
Tigerstrom 1978; Bali et al., 1992). 
 
V. 3 Procedimientos con ácidos nucleicos. 
 
La manipulación de DNA se realizó siguiendo los protocolos descritos por 
Sambrook et al., 1989. La extracción y purificación de RNA total se realizó según lo 
reportado por Barry et al., 1992. El DNA cromosomal usado como templado para 
los PCR´s fue obtenido de la cepa silvestre AEIV. La secuencia de los 
oligonucleótidos usados en este trabajo se encuentra descrita en la Tabla 2. 
 
V. 4 Resistencia a la desecación. 
 
Células vegetativas incubadas durante 30 h en medio BS fueron lavadas y 
transferidas a placas con medio BS ó BB e incubadas a 30°C durante 5 días (período de 
inducción al enquistamiento). Posteriormente las células fueron colectadas y alrededor de 
10
6
 UFC fueron colocadas en filtros millipore y sometidas a un período de desecación a 
30°C por 5 días. El porcentaje de resistencia a desecación se obtuvo realizando cuenta 
viable en cada uno de los períodos de inducción/desecación, el cual corresponde a la 
diferencia entre el número de células que germinaron después de inducir el enquistamiento 
37 
 
y el número de células que germinaron de quistes resistentes a la desecación (Campos et 
al., 1996; Segura et al., 2003; Gimmestad et al., 2006; Cocotl-Yañez et al., 2014). 
 
V. 5 Microscopía Óptica y Electrónica. 
 
La visualización de células vegetativas y quistes de cada cepa de A. vinelandii fue 
realizada con el apoyo de un microscopio Olympus BX41 (objetivo 100X). Los quistes se 
lograron diferenciar cuando los alquilresorcinoles fueron teñidos con una solución al 0.5% 
de Fast Blue en ácido acético al 5%. En cada cepa se observaron 10 muestras y en cada una 
fueron tomadas aleatoriamente 10 imágenes correspondientes a secciones ópticas de la 
muestra, con el apoyo de una cámara Pixera acoplada al microscopio (con el software 
Pixera studio Pro). La visualización de la ultraestructura de los quistes fue realizada 
utilizando microscopía electrónica de transmisión. Se utilizaron células creciendo en medio 
BB durante 5 días y preparadas como lo describe previamente Mejía-Ruíz et al., (1997). El 
procesamiento y análisis de las muestras se realizó en la Unidad de Microscopía 
Electrónica del Instituto de Biotecnología de la UNAM. 
 
V. 6 Determinación de alginato y alquilresorcinoles. 
 
Para cuantificación de alginato de cada cepa de A.vinelandii, se incubaron matraces 
de 250 ml con un volumen de 50 ml de medio BS durante 48 h a 30ºC. El alginato fue 
previamente separado de las células por centrifugación y precipitado con 2 volúmenes de 
alcohol isopropílico.La producción de alginato fue medida por determinación 
espectrofotométrica de los ácidos urónicos por el método de carbazol (Knutson & Jeanes 
1968; Blumenkrantz & Asboe-Hansen 1973). 
Para la cuantificación de ARs, se realizaron dos extracciones con acetona en cada 
muestra: La primera, con duración de 1 hora a temperatura ambiente, para posteriormente 
centrifugar la muestra, colectar el sobrenadante y almacenarlo; mientras se realizó una 
segunda extracción a la muestra durante 12 horas a temperatura ambiente. Los dos extractos 
fueron mezclados y usados para la determinación de alquilresorsinoles por 
espectrofotometría, utilizando Fast Blue B. Se realizó una curva estándar con orcinol para 
38 
 
determinar la concentración de ARs (Tluscik et al., 1981; Segura et al., 2003; Segura et al., 
2009). El contenido de proteína de las células usado para la determinación de alginato y 
ARs fue medido de acuerdo al método descrito por Lowry et al., (1951). Todos los ensayos 
se realizaron por triplicado. 
 
V. 7 Medición del los niveles de transcritos de rpoS, ptsP, ptsO, ptsN y arsA por 
PCR cuantitativo en tiempo real (q-RT-PCR). 
 
Los niveles de expresión de rpoS, ptsP, ptsO, ptsN y arsA fueron medidos por 
qRT-PCR como fue reportado previamente (Noguez et al., 2008; Muriel-Millán et al., 
2015; Romero et al., 2016). Para la extracción de RNA, los cultivos fueron crecidos en 
medio BB y las células fueron colectadas a las 48 horas (en la medición del transcrito de 
rpoS), y crecidos en medio BS (30 hrs) y BB (48 hrs) para la medición del transcrito de 
ptsP, ptsO, ptsN y arsA. Las muestras de RNA fueron tratadas con DNAsa y la auscencia 
de DNA contaminante en fue verificada por PCR. La cuantificación indirecta de transcritos 
mediante PCR en tiempo real se realizó empleando el equipo Light Cycler 480 II de 
Roche®. Los primers usados para el análisis de la expresión de rpoS, ptsP, ptsO, ptsN, 
arsA, y gyrA (este gen utilizado como control interno para normalizar el nivel del transcrito 
de los genes) se muestran en la Tabla 2. Para la obtención de cDNA de los transcritos de los 
genes, asi como la mezcla y condiciones de reacción para su cuantificación, se utilizó el 
protocolo reportado por Muriel-Millán (2015). Todos los ensayos se realizaron por 
triplicado. Los datos son presentados como cambio en los niveles de mRNA (media±SD) 
de la cepa mutante comparada con la cepa silvestre, y analizados por el método 2
-∆∆CT
 
reportado por Livak & Schmittgen (2001). 
 
V. 8 Complementación de mutantes gacA con rsmZ1 y rpoS. 
 
El plásmido suicida pMM2 (Manzo et al., 2011) y el plásmido pMCY-Zkm, el cual 
es incapaz de replicarse en A. vinelandii, fueron usados para obtener la expresión de rsmZ1 
independiente de GacA. Para ello, el plásmido pMM2 fue tranferido por conjugación dentro 
de las cepas AEIVgacA y AEIVgacA/ptsN para producir las cepas AEIVgacA/pMM2 y 
39 
 
AEIVgacA/ptsN/pMM2 respectivamente. Para obtener el plásmido pMCY-ZKm, pMM2 
fue digerido utilizando las enzimas de restricción BamHI y HindIII para obtener un 
fragmento de 400 pb conteniendo el gene rsmZ1 sin promotor pero con su SD. Este 
fragmento fue rellenado utilizando la enzima Klenow (Thermo scientific) y clonado dentro 
del plásmido pJETgyrA (Muriel-Millan et al., 2015) digerido previamente con la enzima 
EcoRI para generar el plásmido pGyrZ. Posteriormente este plásmido fue digerido con la 
enzima ScaI para introducir un fragmento de 1.2 kb el cual contenía el gen de resistencia a 
kanamicina y con ello obtener el plásmido pMCY-ZKm. La cepa AEIVgacA fue 
transformada con pMCY-ZKm por cointegración dentro del cromosoma produciendo la 
cepa AEIVgacA/pMCY-ZKm. 
Por otro lado, los plásmidos pSMrpoS (Cocotl- Yañez et al., 2011), pMCY-rS2 y 
pSM-rS1, los cuales contienen la secuencia completa que codifica al gen rpoS, fueron 
usados y transferidos por conjugación dentro de las cepas AEIVgacA, AEIVrpoS, 
AEIVgacA/pMCY-ZKm y AEIVgacA/ptsN para producir las cepas AEIVgacA/pSMrpoS, 
AEIVrpoS/psMrpoS, AEIVgacA/pMCY-ZKm/pMCY-rS2 y AEIVgacA/ptsN/pSM-rS1 
respectivamente. Para producir el plásmido pMCY-rS2, el plásmido psMrpoS (Cocotl-
Yañez et al., 2011) fue digerido con SacII y rellenado con Klenow. Un fragmento 1.4 kb 
que contiene el cassette de resistencia a tetraciclina y el cual fue aislado previamente del 
plásmido pBSL141 (Alexeyev et al., 1995) fue introducido dentro del plásmido psMrpoS 
produciendo el plásmido pMCY-rS2. Para producir el plásmido pSM-rS1, psMrpoS fue 
digerido con las enzimas de restricción BamHI y HindIII para remover un fragmento de 
1040 pb que contiene el gen rpoS con su SD pero careciendo de su región promotora. Este 
fragmento fue clonado dentro del sitio EcoRI del plásmido pJETgyrA (Muriel-Millan et al., 
2015). La orientación del inserto fue determinada por PCR. El plásmido producido pGyrS 
fue digerido con BgIII y clonado en el sitio SmaI del plásmido pBR1MCS-3 produciendo el 
plásmido pSM-rS1. 
 
V. 9 Construcción de mutantes pts y mutante rsmA de A. vinlandii AEIV. 
 
DNA total de las cepas RN4, RN6 y LSW1 (Noguez et al., 2008; Muriel et al., 
2015) fue aislado y usado para transformar en la cepa AEIV. Transformantes resistentes a 
40 
 
kanamicina (cepa AEIVptsN), espectinomicina (cepa AEIVptsO) y tetraciclina (cepa 
AEIVptsP) fueron aisladas y se confirmó por PCR que portaran las mutaciones ptsN::Km, 
ptsO::Sp y ptsP::Tc. Asimismo, las cepas AEIVptsP/ptsN y AEIVptsP/ptsO fueron 
generadas usando DNA total de la cepa RN4 y RN6 para transformar en la cepa AEIVptsP. 
La cepa silvestre de A. vinelandii AEIV fue transformada con los plásmidos pALA7 y 
pALA8 (Noguez et al., 2008) los cuales son incapaces de replicarse en A. vinelandii, 
mientras que la cepa AEIVgacA/pALA7 fue transformada con el plásmido pALA7. 
Recombinantes resistentes a kanamicina fueron elegidas como aquellas que cointegraron 
estos plásmidos en sus cromosomas. Para generar la cepa AEIVgacA/ptsN/rsmA, la cepa 
AEIVgacA/ptsN fue transformada con DNA total de la cepa AHrsmA (Hernández-Eligio et 
al., 2002). Transformantes resistentes a Gm/Km/Sp fueron aisladas para confirmar la 
mutación rsmA::Sp por PCR. 
 
V. 10 Construcción de plásmidos para sobreexpresión de EIIA
Ntr
. 
 
 El plásmido pjETgyrA fue digerido con la enzima BglII para obtener un fragmento 
de DNA de 0.3 Kb correspondiente a la región promotora del gene gyrA (pgyrA) (Muriel et 
al., 2015); este fragmento fue rellenado con la enzima Klenow y clonado en el vector 
pBBR1MCs-5 previamente digerido con las enzimas hindIII/BamHI (Alexeyev et al., 
1995). El nuevo plásmido pBRpgyrA fue usado para construir los plásmidos de 
sobreexpresión de EIIA
Ntr
. 
Por PCR, se amplificó un fragmento de ADN de 500 pb que contenía el gen 
completo ptsN utilizando los primers RvptsNTH y FwptsNTH (Tabla 2) el cual fue 
rellenado con la enzima Klenow y clonado en el plásmido pBRpgyrA (previamente digerido 
con NCOI), produciendo el plásmido pSAEIIA-1. Para producir pSAEIIA-2, el gen de 
resistencia a kanamicina obtenido del vector pBSL98 (Alexeyev et al., 1995), fue insertado 
en un sitio único SmaI dentro del plásmido pSAEIIA-1. Para producir el plásmido 
pSAH68A, se amplificó un fragmento de 0.5 kb de DNA cromosmal de la cepa pALA8 que 
contenía el fragmento completo de ptsN-H68A, utilizando los primers RvptsNTH y 
FwptsNTH; este fragmento fue clonado en el vector pBRpgyrA (previamente digerido con 
NCOI), produciendo así el plásmido pSAH68A. Los plásmidos fueron transferidos por 
41 
 
conjugación en las cepas AEIV, AEIVptsP, AEIVptsO y AEIVgacA, para generar las cepas 
AEIV/pSAEIIA-1, AEIVptsP/pSAEIIA-1, AEIVptsO/pSAEIIA-1, AEIVgacA/pSAEIIA-2 
y AEIV/pSAH68A, respectivamente. 
 
V. 11 Producción de antisuero anti-EIIA
Ntr
 en conejo. 
 
La producción de anticuerpos policlonales en conejo se llevó a cabo en 2 partes: 1) 
Expresión y purificación de EIIA
Ntr: Se utilizó la cepa E.coli BL21 (DE3) junto con los 
plásmidos pALA7 y pALA8 (Noguez et al., 2008) para construir la cepas BpALA7 y 
BpALA8 por transformación y así poder expresar la proteína EIIA
Ntr
-6his. Posteriormente, 
la cepa BpALA7 fue crecida a 37ºC toda la noche en medio líquido LB. 50 ml de LB 
fueron inoculados con 500 µL del preinóculo e incubados a 37ºC y 250 rpm hasta alcanzar 
una D.O.600nm de 0.2-0.4. Se indujo la expresión del gen ptsN agregando al cultivo IPTG a 
una concentración final de 0.3 mM y se incubó durante 3 horas a 37ºC. La proteína EIIA
Ntr
-
6his fue purificada por medio de cromatografía de afinidad empleando agarosa-Ni-ácido-
nitrilotriacético (Ni-NTA) (Qiagen). 2) Producción de antisuero anti-EIIA
Ntr
 en conejo: Una 
vez purificada la proteína EIIA
Ntr
, se resuspendió en una mezcla de PBS estéril y adyuvante 
completo de Freund que fue inyectada en conejo raza Nueva Zelanda siguiendo el 
protocolo de descrito por Muriel-Millán (2015). La obtención de conejos, así como el 
proceso de inmunización, se realizó en la Unidad de Bioterio del Instituto de Biotecnología 
de la UNAM. 
 
V. 12 Estado de fosforilación de EIIA
Ntr
 por PAGE nativo y Western Blot. 
 
Para la determinación del estado de fosforilación de EIIA
Ntr
 in vivo, se tomó como 
referencia la metodología reportada por Powell et al., (1995) y Takahashi et al., (1998) 
empleada en E.coli, y la reportada por Pflüger & de Lorenzo (2007) aplicada en 
Pseudomonas. La técnica está basada en la separación y migración electroforética de la 
proteína EIIA
Ntr
 en condiciones nativas y su posterior detección utilizando anticuerpos 
mediante ensayos de Western Blot. Para el caso de Azotobacter vinelandii, la técnica 
incluyó diversas modificaciones y aportaciones que se dividen en tres partes: 1) Separación 
42 
 
electroforética de EIIA
Ntr
 mediante PAGE nativo; 2) detección de EIIA
Ntr
 con anticuerpos 
anti-EIIA
Ntr
, y 3) identificación y sobreexpresión de EIIA
Ntr
 en A. vinelandii in vivo. La 
metodología completa se realizó de la siguiente manera: Cultivos con cepas de A. vinelandii 
que sobreexpresaban la proteína EIIA
Ntr
 fueron crecidas en 100ml de medio líquido BS 
(crecimiento vegetativo, 30°C por 48 hrs) ó medio BB (enquistamiento, 30°C por 120 hrs). 
Posteriormente las células fueron cosechadas por centrifugación, lavadas y resuspendidas 
en 1 ml de buffer de lisis (900 μl de B-PER (Thermo scientific), 66 μl de lisozima (10 
mg/ml) y 34 μl de complete protease inhibidor cocktail (Roche). Las muestras fueron 
incubadas en hielo durante 15 minutos y lisadas por sonicación (3 pulsos de 15 segundos) 
para después ser centrifugadas a 4°C durante 20 minutos a 14000 xg. Posteriormente, 15 μl 
del sobrenadante de cada muestra fueron resuspendidos en 5 μl de buffer de carga (10% 
glicerol, 40 mM glicina, 5 mM Tris, pH 8.9 y 0.005% w/v de azul de bromofenol). La 
separación de la proteína EIIA
Ntr
 fue realizada en condiciones nativas por electroforesis en 
gel al 10% (1.9 ml de solución acrilamida/bisacrilamida, 29:1; 1 ml de buffer TBE 10X; 
2.79 ml H2O; 80 μl APS (20%) y 2.5 μl de TEMED) aplicando a la cámara buffer TBE y 
con un tiempo de migración de 90 minutos a 4°C y 19 mA. 
Una vez finalizada la electroforesis nativa, las proteínas fueron transferidas a una 
membrana de nitrocelulosa de 0.45 micrometros (Amersham) con el apoyo de una cámara 
de transferencia a 12 mA por 10 minutos. Posteriormente, la membrana fue bloqueada con 
albúmina al 3% por 1 hora, lavada tres veces con Buffer salino Tris (TBS) pH 7.5 
adicionado con 0.1% Tween 20 (TBST). La proteína EIIA
Ntr
 fue detectada usando el 
antisuero anti-EIIA
Ntr
 a una dilución 1:2000 en buffer TBS interactuando con la membrana 
durante 1 hora a 28 °C. Una vez finalizado este tiempo, la membrana fue lavada 3 veces 
con Buffer TBST para adicionar anticuerpo secundario anti-conejo IgG acoplado a 
fosfatasa alcalina (Promega, USA) diluido 1:10000 en Buffer TBST, y finalmente 
revelando con el kit BCIP/NBT (Invitrogen). 
Previo a los ensayos de detección de EIIA
Ntr
 realizados en las cepas de A. 
vinelandii, la metodología fue aplicada en las cepas BpALA7 y BpALA8 con la finalidad 
de confirmar la detección de EIIA
Ntr
 en condiciones nativas (gel al 10%). Posteriormente, 
se realizaron ensayos de detección en las cepas AEIVpALA7 y AEIVgacA/pALA7 en 
condiciones desnaturalizantes (gel SDS al 12%) y nativas (gel al 10%). Para ello, las cepas 
43 
 
fueron crecidas en 300 ml de medio líquido BS a 30°C por 48 hrs. A continuación, las 
células fueron cosechadas y divididas en 4 tubos Eppendorf de 1ml para ser lisadas con 
Buffer de lisis y centrufigar a 4°C por 20 minutos, retirar el sobrenadante, y finalmente 
concentrar la muestra utilizando amicon de 0.5 ml (Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filter 
Unit. Merk Millipore Ltd.). La detección por Western Blot se llevó a cabo utilizando 
anticuerpo anti-His (anti-ratón, 6x-His Tag Monoclonal Antibody. Thermo Scientific) y 
Luminol como sustrato (SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate. 
Thermo Scientific). 
Por otro lado, se realizó electroforesis nativa a las cepas BpALA7, BpALA8, 
AEIVpALA7 y AEIVgacA/pALA7. Las bandas que aparecieron fueron cortadas del gel 
para mandarse a secuenciar al Instituto de investigación clínica de Montreal (IRCM 
Proteomics Discovery Platform of the Montreal Clinical Research Institute) para su 
identificación por espectrometría de masas LC-MS/MS en el sistema Easy-nLC II (Proxeon 
Biosystems, Odense, Denmark) acoplado al Orbitrap Q Exactive (ThermoFisher Scientific, 
Bremen, Germany). 
 
 V. 13 Detección de RpoS por Western Blot. 
 
 Para la detección de RpoS, se utilizaron anticuerpos policlonales contra RpoS 
(Muriel-Millan et al., 2015). A partir de cultivos crecidos en medio BB, 20μg de proteína 
fueron mezclados con el buffer de carga para SDS-PAGE y calentados a 95ºC por 10 
minutos. Los extractos fueron agregados a un gel desnaturalizante al 12% para separar las 
proteínas y posteriormente ser transferidas a una membrana de nitrocelulosa de 0.45 
micrometros (Amersham). La detección de RpoS fue realizada utilizando suero de conejo 
anti-RpoS a una dilución 1:2000 en Buffer TBST seguido por un anticuerpo secundario 
anti-conejo IgG acoplado a la fosfatasa alcalina (Abcam) a una dilución 1:10000 en TBST. 
Finalmente, las membranas fueron reveladas aplicando el kit BCIP/NBT (Invitrogen). 
 
 
 
 
44 
 
VI. RESULTADOS. 
VI. 1 Control del enquistamiento a través de Gac-Rsm y Gac-rpoS en A. 
vinelandii AEIV. 
VI. 1.1 La inactivación del gen gacA abate la síntesis de ARs y el 
enquistamiento. 
 
Puesto a que GacA es un regulador positivo de la síntesis de alginato y su control lo 
ejerce a través del sistema Rsm (Manzo et al. 2011), se esperaba que una vía por la cual 
GacA controla el enquistamiento sea a través del sistema Rsm (Gac-Rsm). En la Tabla 3 se 
muestra que la cepa AEIVgacA es incapáz de formar quistes resistentes a la desecación y 
de producir ARs, en contraste a lo presentado por la cepa silvestre. Por otro lado, células 
inducidas al enquistamiento de la cepa silvestre y la cepa AEIVgacA fueron teñidas con 
Fast Blue B para la visualización del fenotipo de síntesis de ARs y su observación bajo un 
microscopio de luz. Como se muestra en la Figura 9 (a, b), la cepa silvestre presenta una 
coloración rojiza correspondiente a la tinción de alquilresorcinoles, la cual se encuentraría 
distribuida en la membrana celular y en la exina, componente estructural del quiste. Como 
se esperaba, la tinción no fue observada en la cepa AEIVgacA. El uso de microscopía 
electrónica permitió visualizar los componentes del quiste en cada cepa a nivel estructural. 
De este modo, en la Figura 9 (c) se muestra el quiste desarrollado en la cepa silvestre, el 
cual está compuesto por un cuerpo central con gránulos de PHB y rodeados