Efecto-del-tipo-de-grasa-y-protena-dietaria-sobre-la-expresion-de-enzimas-degradadoras-de-aminoacidos-mediada-por-ppar-alfa

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS 
FACULTAD DE MEDICINA 
 
 
 
 
EFECTO DEL TIPO DE GRASA Y PROTEÍNA DIETARIA SOBRE LA 
EXPRESIÓN DE ENZIMAS DEGRADADORAS DE AMINOÁCIDOS 
MEDIADA POR PPARα 
 
 
TESIS 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
DOCTOR EN CIENCIAS 
 
PRESENTA: 
ALEJANDRA VIRGINIA CONTRERAS 
 
DIRECTOR DE TESIS 
DR. ARMANDO ROBERTO TOVAR PALACIO 
DPTO. FISIOLOGÍA DE LA NUTRICIÓN, INSTITUTO NACIONAL DE 
CIENCIAS MÉDICAS Y NUTRICIÓN SALVADOR ZUBIRÁN 
 
COMITÉ TUTOR 
DRA. NIMBE TORRES Y TORRES 
DPTO. FISIOLOGÍA DE LA NUTRICIÓN, INSTITUTO NACIONAL DE 
CIENCIAS MÉDICAS Y NUTRICIÓN SALVADOR ZUBIRÁN 
DR. FÉLIX RECILLAS TARGA 
INSTITUTO DE FISIOLOGÍA CELULAR, UNIVERSIDAD NACIONAL 
AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 
 
 
MÉXICO, D.F. JUNIO DE 2015 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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 2 
 
 
 
 
 
 
 
 A	
  
	
  
Vico†,	
  Abel	
  y	
  Elías	
  
	
  
Con	
  amor 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
†Q.E.P.D.	
  
	
   	
  
 3 
Agradecimientos	
  
	
  
Quiero agradecer a Dr. Armando Tovar Palacio, Dra. Nimbe Torres y Torres y Dr. Félix 
Recillas Targa por sus valiosas enseñanzas y consejos atinados a lo largo de estos años; a 
Dr. Adolfo García Sáinz, Dr. José Pedraza Chaverri, Dr. Alejandro Zentella Dehesa y Dra. 
Selva Rivas Arancibia por sus aportaciones para enriquecer este trabajo; y a los profesores, 
académicos y personal administrativo del Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas 
de la UNAM por ayudarme a lograr tan anhelada meta. También agradezco a mis amigos y 
compañeros del Departamento de Fisiología de la Nutrición en el Instituto Nacional de 
Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán (INCMNSZ), y del Instituto Nacional de 
Medicina Genómica (INMEGEN) por su colaboración entusiasta y apoyo incondicional; a 
Irma Silva Zolezzi por el soporte y el afecto brindados; a mi familia y amigos de siempre 
por su cariño; y especialmente a Abel Hernández Lazcano quien con su amor y compañía 
ilumina mis pasos. Con aprecio y gratitud por siempre. 
	
  
	
   	
  
 4 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El puente 
 
Entre ahora y ahora, 
entre yo soy y tú eres, 
la palabra puente. 
 
Entras en ti misma 
al entrar en ella: 
como un anillo 
el mundo se cierra. 
 
De una orilla a la otra 
siempre se tiende un cuerpo, 
un arcoíris. 
 
Yo cantaré por sus repechos, 
yo dormiré bajo sus arcos. 
 
 
 
Octavio Paz 
	
   	
  
 5 
	
  
Abreviaturas	
  
 
AADE enzimas degradadoras de aminoácidos 
AC adenilato ciclasa 
Acmsd aminocarboximuconato semialdehído descarboxilasa 
cAMP adenosín monofosfato cíclico 
ChIP ensayo de inmunoprecipitación de cromatina 
ChREBP proteína de unión al elemento de respuesta a carbohidratos 
Cpt1 carnitina palmitoil transferasa-1 
CREB proteína de unión al elemento de respuesta del cAMP 
Cth cystationasa 
Got1 glutámico-oxaloacético transaminasa 
Hal histidina amoníaco-liasa 
HNF4α factor nuclear hepático 4α 
Kynu kynureninasa 
LXRα receptor X hepático α 
Oat ornitina amino transferasa 
Pepck1 fosfoenol piruvato carboxicinasa 
PD proteína dietaria 
PPAR receptores activados por proliferadores de peroxisomas 
PPARα receptor activado por proliferadores de peroxisomas alpha 
PPARβ/δ receptor activado por proliferadores de peroxisomas beta/delta 
PPARγ receptor activado por proliferadores de peroxisomas gamma 
PPARα-/- ratones “knockout” del PPARα 
PPRE elemento de respuesta a proliferadores de peroxisomas 
PUFA ácidos grasos poli-insaturados 
RER razón de intercambio respiratorio 
RXR receptor del ácido 9-cis-retinoico 
Sds serina deshidratasa 
SREBP-1c proteína de unión al elemento regulador de esteroles 
TG triglicéridos 
 6 
VCO2 volumen de dióxido de carbono liberado 
VLDL lipoproteínas asociadas a colesterol de muy baja densidad 
VO2 volumen de O2 consumido 
WT ratones silvestres (“wild type”) 
 
 
 7 
Índice	
  de	
  contenido	
  
1	
   Resumen	
  ..............................................................................................................................	
  10	
  
2	
   Introducción	
  .......................................................................................................................	
  12	
  
2.1	
   Importancia metabólica de los aminoácidos	
  .........................................................................	
  12	
  
2.2	
   Regulación del metabolismo de los aminoácidos	
  .................................................................	
  14	
  
2.3	
   Función metabólica de los receptores activados por proliferadores de peroxisomas 
(PPAR)	
  .............................................................................................................................................................	
  17	
  
2.4	
   Regulación y función biológica del PPARα	
  ...........................................................................	
  19	
  
2.4.1	
   Regulación de la actividad transcripcional del PPARα	
  ...........................................	
  22	
  
2.4.2	
   Ligandos del PPARα	
  ...........................................................................................................	
  23	
  
2.4.3	
   Papel del PPARα en la regulación de la homeostasis energética	
  .........................	
  25	
  
3	
   Justificación	
  ........................................................................................................................	
  28	
  
4	
   Pregunta	
  de	
  investigación	
  .............................................................................................	
  29	
  
5	
   Objetivos	
  ..............................................................................................................................	
  29	
  
5.1	
   Objetivo general	
  ................................................................................................................................	
  29	
  
5.2	
   Objetivos específicos	
  .......................................................................................................................	
  29	
  
6	
   Metodología	
  ........................................................................................................................	
  30	
  
7	
   Resultados	
  ...........................................................................................................................	
  40	
  
7.1	
   Efecto de la activación del PPARα por ligandos naturales sobre la expresión de 
Sds y Cpt1	
  .......................................................................................................................................................	
  40	
  
7.2	
   Respuesta del tipo de ácido graso sobre la interacción PPARα-PPARE en la 
región promotora de Sds	
  ..........................................................................................................................	
  44	
  
7.3	
   Efecto de la concentración de proteína dietaria sobre la regulación metabólica 
mediada por el PPARα	
  .............................................................................................................................	
  47	
  
7.3.1	
   La ausencia del PPARα aumenta la concentración de glucagon al incrementar 
la ingesta de proteína dietaria	
  .........................................................................................................51	
  
7.3.2	
   La ausencia del PPARα altera el patrón de expresión hepático de AADE 
inducido por la ingesta de proteína dietaria	
  ...............................................................................	
  53	
  
7.3.3	
   La ausencia del PPARα modifica el metabolismo de aminoácidos y altera la 
acumulación de lípidos dependiendo de la concentración de proteína dietaria	
  .............	
  60	
  
7.3.4	
   La ausencia del PPARα disminuye el gasto energético y modifica el uso de 
sustratos energéticos dependiendo de la concentración de proteína dietaria	
  ..................	
  66	
  
7.3.5	
   La ausencia de PPARα disminuye la glucosa sérica y el glucógeno hepático a 
pesar del incremento en la expresión de Pepck1 en una dieta 6%-PD	
  .............................	
  69	
  
7.3.6	
   El PPARα mantiene la homeostasis metabólica al incrementar la ingesta de 
proteína dietaria a través de vías metabólicas relacionadas con el metabolismo de 
aminoácidos	
  ..........................................................................................................................................	
  72	
  
8	
   Discusión	
  .............................................................................................................................	
  78	
  
9	
   Conclusiones	
  .......................................................................................................................	
  89	
  
10	
   Perspectivas	
  .....................................................................................................................	
  90	
  
11	
   Bibliografía	
  .......................................................................................................................	
  91	
  
 8 
Índice	
  de	
  figuras	
  
 
 
Figura 1. Usos de los aminoácidos de acuerdo a su metabolismo 14 
Figura 2. Representación esquemática de la regulación transcripcional mediada por el 
PPARα 
 
21 
 
Figura 3. Estructura química de los estímulos utilizados en los cultivos primarios de 
hepatocitos 
 
31 
Figura 4. Aislamiento de los cultivos primarios de hepatocitos 40 
Figura 5. Efecto del Wy-14643 sobre la expresión de Sds y Cpt1 42 
Figura 6. Efecto temporal del Wy-14643 y la forskolina sobre la expresión de Sds y 
Cpt1 
 
43 
Figura 7. Efecto de los ligandos naturales del PPARα sobre la expresión de Sds y 
Cpt1 
 
44 
Figura 8. Inmunoprecipitación de la cromatina de los hepatocitos de rata 46 
Figura 9. Genotipificación de los ratones WT y PPARα-/- 48 
Figura 10. Efecto del ayuno sobre las concentraciones séricas de glucosa y glucagon y 
la expresión de genes 
 
49 
Figura 11. Diseño del estudio para evaluar el efecto de la concentración de proteína 
dietaria mediado por el PPARα 
 
50 
Figura 12. Efecto de la proteína dietaria sobre la concentración sérica de insulina y 
glucagon mediado por el PPARα 
 
52 
Figura 13. Gráfico de cajas y bigotes de los datos de expresión normalizados 54 
Figura 14. Gráfico de volcán para el contraste KOA20vsWTA20 57 
Figura 15. Expresión de AADE por efecto de la proteína dietaria en los ratones WT y 
PPARα-/- 
 
58 
Figura 16. Validación experimental de genes diferencialmente expresados 59 
Figura 17. Concentración sérica de urea y contenido de proteína corporal en los 
ratones WT y PPARα-/- 
 
60 
Figura 18. Contenido de grasa corporal y ácidos grasos libres en los ratones WT y 
PPARα-/- 
 
63 
Figura 19. Histología del hígado de los ratones WT y PPARα-/- 64 
Figura 20. Expresión de genes involucrados en la oxidación de ácidos grasos en los 
ratones WT y PPARα-/- 
 
66 
Figura 21. Gasto energético y razón de intercambio respiratorio de los ratones WT y 
PPARα-/- 
 
68 
Figura 22. Glucosa sérica, glucógeno hepático y expresión de genes de los ratones WT 
y PPARα-/- 
 
71 
Figura 23. Vías metabólicas enriquecidas por concentración de proteína dietaria en los 
ratones WT y PPARα-/- 
 
73 
Figura 24. Red funcional para metabolismo de aminoácidos 74 
Figura 25. Ensayo de movilidad electroforética de la región promotora de la Sds 76 
Figura 26. Ensayo de gen reportero con luciferasa de la región promotora de Sds 77 
Figura 27. Regulación del PPARα sobre el metabolismo de aminoácidos 81 
Figura 28. Adaptaciones metabólicas ocurridas en los ratones WT y PPARα-/- 85 
 9 
Índice	
  de	
  Tablas	
  
 
Tabla 1. Secuencia de oligonucleótidos utilizados en el estudio 33 
Tabla 2. Composición de las dietas utilizadas en el estudio de acuerdo a la AIN-93 34 
Tabla 3. Peso corporal e ingesta de alimento de los ratones WT y PPARα-/- alimentados 
con dietas con diferente contenido de proteína dietaria 
 
50 
Tabla 4. Número de genes diferencialmente expresados por variable analizada 55 
Tabla 5. Concentración sérica de aminoácidos en los ratones WT y PPARα-/- 62 
Tabla 6. Elementos de respuesta al HNF4α en regiones promotoras de genes que 
codifican para enzimas degradadoras de aminoácidos 75 
 
 
 
 
 10 
1 Resumen	
  
 
El catabolismo de aminoácidos es una importante fuente de energía para los mamíferos 
cuando otros sustratos energéticos están en baja concentración, particularmente glucosa y 
ácidos grasos circulantes. Bajo un estado de alta demanda energética, tal como un ayuno 
prolongado, la degradación de proteínas del músculo esquelético aumenta, liberando a la 
circulación aminoácidos que son transportados al hígado y catabolizados por enzimas 
degradadoras de aminoácidos (AADE) específicas. Por otro lado, después del consumo de 
una dieta alta en proteína, la disponibilidad de aminoácidos transportados hacia el hígado 
también se incrementa, y por lo tanto su catabolismo por AADE. De tal forma que, la 
actividad de las AADE se incrementará cuando el suministro de aminoácidos circulantes 
aumente por el ayuno o por el consumo de un exceso de proteína dietaria (PD). 
La homeostasis proteica es uno de los aspectos mas importantes en la preservación de la 
funcionalidad celular. Las proteínas en el organismo tienen funciones vitales, tales como 
regulación de la estructura celular y señalización celular, y son parte de diversos procesos 
enzimáticos, por lo que su uso como fuente de energía a través de la degradación proteica 
se traducirá en pérdida de actividad biológica. De hecho, una prioridad metabólica es 
preservar la proteína corporal, la cual se acompaña por un cambio en los sustratos 
energéticos dirigido hacia el uso de ácidos grasos, por ejemplo, que son funcionalmente 
menos críticos y energéticamente mas eficientes. Sin embargo, el entendimiento de los 
mecanismos moleculares implicados en este cambio metabólico cuyo objetivo es preservar 
los aminoácidos y mantener el balance de nitrógeno corporal, a través del uso de las grasas 
como fuente de energía, es limitado. 
El receptor activado por proliferadores de peroxisomas-α (PPARα) es un importante 
regulador del uso de sustratos energéticos. El PPARα es activado por ciertos ligandos 
naturales y sintéticos para modular la expresión de sus genes blanco. El PPARα tiene una 
función principal en el almacenamiento de energía a través de modular la expresión de 
genes que codifican para enzimas involucradas en la oxidación de ácidos grasos. Además, 
se ha descrito que la expresión de genes involucrados en el metabolismo de aminoácidos es 
menor en ratones “wild-type” (WT) que en ratones “knockout” del PPARα (PPARα-/-). Sin 
embargo, la información disponible sobre la función del PPARα en la regulación de la 
 11 
expresión de AADE, particularmente acerca del mecanismo involucrado en la disminución 
de la expresión de estas enzimas, es escasa. 
En la presente tesis se evaluó el efecto de tres ligandos naturales del PPARα, los ácidos 
grasos palmítico, linoléico y oleico, y se midió su efecto sobre la expresión del gen serina 
deshidratasa (Sds) en cultivos primarios de hepatocitos de rata. Como resultado, se observó 
que estos ligandos reprimieron la activación de Sds por forskolina,y estimularon la 
expresión de la carnitina palmitoil transferasa-1. Además, se analizó el papel del PPARα 
sobre el metabolismo de los aminoácidos, usando el modelo de ratón PPARα-/- alimentado 
con dietas conteniendo concentraciones crecientes de proteína. Se midieron parámetros 
metabólicos en suero e hígado, y en muestras de hígado se evaluó la expresión génica y se 
realizaron ensayos histológicos. 
Los ratones PPARα-/- revelaron una expresión incrementada de AADE en hígado, que 
afectó el metabolismo de aminoácidos, lípidos y carbohidratos. Los ratones PPARα-/- 
presentaron una razón glucagon/insulina mayor (7.2 veces), mayor concentración de urea 
sérica (73.1%), menor contenido de proteína corporal (19.7%), y menor concentración de 
diversos aminoácidos en suero en una dieta alta en proteína cuando se compararon con 
ratones WT. A partir del análisis de enriquecimiento funcional de los genes 
diferencialmente expresados por el consumo de PD se observó una relación funcional entre 
el PPARα y el factor nuclear hepático 4α (HNF4α). Finalmente, nuestros resultados 
revelaron que el PPARα puede disminuir la expresión de AADE a través de la atenuación 
de la actividad transcripcional de HNF4α, como se observó en la región promotora de Sds. 
Los resultados obtenidos demostraron que, además de regular el metabolismo de lípidos, la 
activación del PPARα también regula el catabolismo de los aminoácidos en hígado, 
promoviendo así la homeostasis metabólica. 
 
 12 
2 Introducción	
  
2.1 Importancia metabólica de los aminoácidos 	
  
 
El principal destino metabólico de los aminoácidos es la síntesis de proteínas, péptidos y 
compuestos nitrogenados, tales como hormonas, neurotransmisores, grupos hemo y bases 
púricas y pirimídicas. Además, algunos aminoácidos participan en la biosíntesis de 
aminoácidos dispensables, por ejemplo el glutamato que interviene en la síntesis de 
glutamina, prolina y arginina; la serina en la biosíntesis de glicina y cisteína; y el aspartato 
en la de asparagina. Asimismo, la oxidación de estas biomoléculas puede contribuir de 
manera significativa en la generación de energía metabólica. La fracción de energía 
obtenida a partir de los aminoácidos varía ampliamente según el tipo de organismo y las 
condiciones metabólicas. Por ejemplo, los carnívoros pueden obtener hasta el 90% de sus 
requerimientos energéticos a partir de la oxidación de aminoácidos inmediatamente 
después de una comida1. 
Todos los tejidos tienen alguna capacidad para sintetizar los aminoácidos dispensables y 
convertir los esqueletos de carbono no amínicos en aminoácidos y otros derivados que 
contengan nitrógeno, pero es el hígado el órgano preferente del metabolismo nitrogenado. 
El hígado es el principal órgano del catabolismo de los aminoácidos con la excepción de 
los aminoácidos de cadena ramificada, los cuales son metabolizados en el músculo 
esquelético. El hígado puede obtener hasta el 50% de su energía en forma de ATP a partir 
de la oxidación de los aminoácidos, y esta energía puede ser usada durante el proceso de 
gluconeogénesis o en síntesis de urea, entre otras necesidades, dependiendo del estado 
nutricio del organismo2. 
La oxidación de los aminoácidos puede suceder durante las siguientes circunstancias 
metabólicas: 1) durante la síntesis y degradación de proteínas celulares (recambio de 
proteínas), algunos aminoácidos que se liberan de la degradación de proteínas y que no son 
necesarios para la síntesis de nuevas proteínas están sujetos a oxidación; 2) cuando una 
dieta rica en proteína es ingerida, y por lo tanto la ingesta de aminoácidos excede los 
requerimientos corporales para la síntesis de proteínas, el exceso de proteína dietaria (PD) 
es catabolizado dado que los aminoácidos no se almacenan; 3) durante el ayuno cuando los 
carbohidratos o lípidos no están disponibles, las proteínas celulares son usadas con fuente 
 13 
de energía1. 
Usualmente, el primer paso en el metabolismo de los aminoácidos que no son usados para 
la síntesis de proteínas o compuestos que contienen nitrógeno es la eliminación del grupo 
amino vía desaminación o transaminación. Mientras que las reacciones de desaminación 
involucran solo la eliminación de grupos amino, las reacciones de transaminación 
involucran la transferencia de un grupo amino a un α-cetoácido. A partir de las reacciones 
de transaminación se pueden generar aminoácidos dispensables a partir de aminoácidos 
indispensables, o bien generar un aminoácido dispensable de otro dispensable. 
El amonio formado como resultado de las reacciones de desaminación es eliminado del 
organismo a través de la formación de urea durante el ciclo de la urea2. La mayoría de los 
animales terrestres son ureotélicos, es decir que excretan el nitrógeno en forma de urea. La 
actividad de las enzimas del ciclo de la urea fluctúa con la dieta y la concentración de 
hormonas. Cuando la ingesta dietaria es principalmente proteína, los esqueletos de carbono 
de los aminoácidos son usados como fuente de energía, produciendo una gran cantidad de 
urea a partir del exceso de los grupos aminos. Por el contrario, con dietas bajas en proteína, 
la síntesis de urea disminuye y la excreción de nitrógeno en la orina decrece 
significativamente. Los glucocorticoides y el glucagon, hormonas que promueven la 
degradación de aminoácidos, estimulan la expresión del mRNA de la enzimas del ciclo de 
la urea y promueven la degradación de aminoácidos, tal como se revisará posteriormente. 
Una vez que el grupo amino ha sido eliminado del aminoácido, la molécula restante recibe 
el nombre de esqueleto de carbono o α-cetoácido. Los esqueletos de carbono pueden 
entonces metabolizarse para ser usados por la célula de múltiples formas. Por ejemplo, 
pueden usarse para producir energía, glucosa, cuerpos cetónicos, colesterol y ácidos grasos 
(Figura 1). La mayoría de los aminoácidos son degradados a uno de los siete 
intermediarios metabólicos: piruvato, α-cetoglutarato, succinil-CoA, fumarato, 
oxaloacetato, acetyl-CoA, o acetoacetato3. 
El uso potencial del esqueleto de carbono depende en parte del aminoácido a partir del cual 
se deriva. Mientras todos los aminoácidos pueden oxidarse completamente para generar 
energía, no todos pueden usarse para sintetizar glucosa2. En este sentido, los aminoácidos 
pueden agruparse en tres categorías: glucogénicos, cetogénicos, o bien, glucogénicos y 
cetogénicos. Los aminoácidos glucogénicos son aquellos que elevan la producción neta de 
 14 
piruvato o intermediarios del ciclo de Krebs, tales como α-cetoglutarato u oxaloacetato, los 
cuales son precursores de glucosa vía gluconeogénesis. Los aminoácidos alanina, cisteína, 
glicina, serina, asparagina, aspartato, isoleucina, metionina, valina, fenilalanina, glutamina, 
histidina y prolina son glucogénicos; en cuanto a los aminoácidos lisina y leucina, son los 
únicos cetogénicos que dan lugar a acetilCoA o acetoacetilCoA. Un pequeño grupo de 
aminoácidos compuesto por isoleucina, fenilalanina, treonina, triptófano y tirosina son 
precursores tanto de glucosa como de ácidos grasos, por lo que son glucogénicos y 
cetogénicos1. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Usos de los aminoácidos de acuerdo a su metabolismo. El principal destino metabólico de los 
aminoácidos es la síntesis de proteínas, péptidos y compuestos nitrogenados. El primer paso en el metabolismo 
de los aminoácidos que no son usados para la síntesis de proteínas o compuestos que contienen nitrógeno es la 
eliminación del grupo amino vía desaminación o transaminación. Los esqueletos de carbono pueden entonces 
metabolizarse y utilizarse por la célula de múltiples formas. 
 
2.2 Regulación del metabolismo de los aminoácidos 
 
La homeostasis proteica es uno de los aspectos mas importantes en la preservación de la 
funcionalidad celular. Las proteínas en el organismo desempeñan funciones vitales, porejemplo, regulan la estructura celular y participan en vías de señalización y procesos 
enzimáticos, por lo que la degradación proteica durante un estado de ayuno prolongado se 
 15 
traducirá en la consecuente pérdida de la función biológica4. De hecho, una prioridad 
metabólica es preservar la proteína corporal, a través del uso de sustratos menos críticos 
desde un punto de vista funcional y energéticamente mas eficientes5. 
La regulación de la concentración de aminoácidos está mediada por un grupo de enzimas 
paso-limitantes de las rutas de oxidación de aminoácidos, que reciben el nombre de enzimas 
degradadoras de aminoácidos (AADE), las cuales están presentes mayormente en hígado. 
Existe una AADE para cada aminoácido con la excepción de los aminoácidos de cadena 
ramificada (BCAA)6. La mayor parte de las AADE se localizan en el hígado, y en estudios 
previos se ha demostrado que su actividad aumenta cuando se consumen dietas con un alto 
contenido de proteína7. Por el contrario, en situaciones de inanición, el esqueleto de 
carbonos se usa para la producción de energía con la resultante producción de CO2 y H2O. 
Por ejemplo, la AADE L-serina deshidratasa (SDS) es la enzima degradadora de la serina, 
que cataliza la deshidratación de este aminoácido para dar lugar a piruvato y amonio8. 
Los aminoácidos que son ingeridos a través de la dieta (exógenos) se mezclan con aquellos 
liberados durante la degradación de proteínas endógenas, y con los que son sintetizados de 
novo. De esta manera, existe un grupo de aminoácidos libres en la circulación al cual la 
célula recurre según sus requerimientos fisiológicos y/o energéticos. La mayoría de los 
aminoácidos corporales se incrementa en los organismos inmediatamente después del 
consumo de un alimento, y el incremento tiende a ser proporcional al contenido de proteína 
de la dieta9. 
Debido a que la mayoría de las AADE tienen valores altos de KmS, la tasa de oxidación de 
los aminoácidos aumenta como respuesta al incremento en la concentración del sustrato, y 
se mantiene hasta que el grupo de aminoácidos recupera su estado previo. El tiempo 
requerido para que el grupo de aminoácidos recupere su estado original depende de la 
concentración de proteína en el alimento. Si la ingesta de proteína es tan alta que el tiempo 
requerido para que el grupo de aminoácidos corporales recupere el estado normal se 
prolonga, entonces habrá una disminución transitoria en la ingesta de alimento y la mayoría 
de las AADE serán inducidas. De tal forma que, aunque el consumo de proteína continúe y 
se excedan los requerimientos fisiológicos, el grupo de aminoácidos corporales no será 
mayor que en aquellos organismos que se alimenten con una cantidad moderada de proteína. 
En contraste, si la ingesta de proteína es inadecuada, la actividad de la mayoría de AADE 
 16 
disminuye, lo que contribuye a la conservación de aminoácidos para la síntesis de proteínas 
y el mantenimiento del grupo de aminoácidos libres10. 
En estudios previos se ha reportado que la síntesis hepática de AADE está regulada en parte 
por la hormona glucagon, a través de la vía de la proteína cinasa A (PKA) dependiente de 
AMP clíclico (cAMP)11, tal como se ha observado para SDS, ornitina amino transferasa 
(OAT) e histidina amoníaco-liasa (HAL). El glucagon se produce a partir del proceso post-
traduccional del proglucagon en las células α pancreáticas y es una de las hormonas más 
importantes. El glucagon se libera de las células α pancreáticas durante el ayuno o después 
de la ingesta de dietas altas en proteína. El glucagon regula la tasa de producción de glucosa 
en el hígado a través de gluconeogénesis y glucogenólisis, consecuentemente ajustando, de 
forma concertada con la insulina, los niveles de glucosa en sangre de acuerdo a las 
necesidades del organismo12. 
Para alcanzar sus efectos intracelulares, el glucagon se une a su receptor glucoproteíco 
alojado en la membrana plasmática. El receptor del glucagon pertenece a la familia de los 
receptores acoplados a proteína G y está positivamente acoplado a la adenilato ciclasa a 
través de la proteína Gs. La unión del glucagon a su receptor favorece la liberación de la 
subunidad-α de Gs para estimular a la enzima adenilato ciclasa (AC), la cual cataliza la 
conversión de ATP a cAMP permitiendo así la activación de la vía de PKA12. PKA es un 
tetrámero compuesto de dos subunidades catalíticas y dos subunidades reguladoras que 
reprimen la activad de las unidades catalíticas cuando se encuentran unidas. El cAMP al 
unirse a las subunidades reguladoras promueve su disociación de las subunidades catalíticas. 
Las subunidades catalíticas liberadas entran al núcleo por difusión pasiva y fosforilan a la 
proteína de unión al elemento de respuesta del cAMP (CREB) en la Ser13313. 
CREB se une a los elementos de respuesta del cAMP (CRE) localizados en el promotor de 
sus genes blanco, incrementando la expresión de AADE y otras proteínas que participan en 
la vía de gluconeogénesis, tales como piruvato carboxilasa (PC), fosfoenolpiruvato 
carboxicinasa 1 (PEPCK1), y glucosa 6 fosfatasa (G6PC)14,15. Sin embargo, poco se conoce 
de los mecanismos de control transcripcional que disminuyen o reprimen la expresión de las 
AADE, aunque existe evidencia que señala que los receptores activados por proliferadores 
de peroxisomas pueden estar involucrados. 
 
 17 
2.3 Función metabólica de los receptores activados por proliferadores de 
peroxisomas (PPAR) 
 
Los PPAR son factores de transcripción que pertenecen a la superfamilia de receptores 
nucleares, son activados por ligandos y controlan la expresión de genes principalmente a 
través de su unión a elementos de respuesta en el DNA localizados en regiones promotoras, 
que son denominados elementos de respuesta a proliferadores de peroxisomas (PPRE). Para 
unirse al DNA, los PPAR forman heterodímeros con el receptor del ácido 9-cis-retinoico 
(RXR), y reclutan una variedad de cofactores tales como, CBP/p300 y SRC-116. Se han 
descrito tres isotipos distintos, α, β/δ y γ, cada uno con características particulares en cuanto 
a su distribución, selectividad por el ligando y función. Dentro del sistema de nomenclatura 
para la superfamilia de los receptores nucleares, la cual está dividida en 6 subfamilias, los 
PPAR pertenecen a la subfamilia 1, en la cual, además de los PPAR, se incluyen otros 10 
grupos de receptores (TR, RAR, PPAR, REV-ERB, E78, RZR/ROR, CNR14, ECR, VDR, 
DHR96, y NHR1)17. 
Los tres isotipos de la familia de los PPAR tienen una organización proteica por dominios, 
similar a la mayoría de los miembros de la superfamilia de receptores nucleares. Los 
dominios mejor caracterizados son el dominio de unión a DNA (DBD) y el dominio de 
unión a ligando (LBD). El LBD consiste de 12 α-hélices que delimitan una cavidad 
hidrofóbica en forma de Y, que constituye una cavidad de unión a ligando relativamente mas 
grande que en otros receptores18. Esta característica puede explicar la capacidad de los 
PPAR de unirse a un amplio rango de compuestos lipofílicos naturales y sintéticos con un 
grupo carboxilo. La cavidad de unión a ligando del PPARβ/δ es significativamente menor 
que la correspondiente de los PPARα y PPARγ, las cuales son similares entre ellas en forma 
y tamaño. Estas diferencia pueden explicar porque son pocos los ligandos del PPARβ/δ que 
han sido reportados en comparación con los del PPARα y PPARγ, y puede indicar que el 
tamaño de las cavidades contribuye a la especificidad del ligando de cada isotipo19. Cabe 
mencionar que diferencias de un solo aminoácido puede determinar la selectividad por el 
ligando de cada isotipo. 
La activación de los PPAR dependiente de ligando estabiliza el LBD en una estructura 
relativamente rígida y compacta en la que la hélice 12 está en una conformación que 
promueve la unión de proteínas coactivadoras y, de hecho, tiene un función crítica enla 
 18 
estimulación de genes blanco20. Usualmente, el remodelamiento de nucleosomas, por 
ejemplo por desacetilación de histonas y reposicionamiento, es necesario para permitir la 
formación del complejo de iniciación de la transcripción. 
El PPARα, también conocido como miembro 1 del grupo C de la subfamilia 1 de receptores 
nucleares (NR1C1), fue el primero en describirse como un receptor que es activado por 
proliferadores de peroxisomas21. Dos isotipos relacionados adicionalmente fueron 
encontrados y caracterizados: el PPARβ/δ (NR1C2) y el PPARγ (NR1C3)22. Cada uno de 
los isotipos de los PPAR es codificado en un gen independiente, y hasta la fecha, diversas 
funciones celulares y sistémicas se les han atribuido, teniendo un alcance mayor a la 
estimulación de la proliferación de peroxisomas en roedores, efecto por el cual adquirieron 
su nombre. En relación a sus funciones fisiológicas y de desarrollo, los PPAR muestran 
patrones de expresión tejido e isotipo específicos23. Por ejemplo, el PPARα se expresa en 
altos niveles en órganos que llevan a cabo un mayor número de reacciones catabólicas como 
son el tejido adiposo pardo, hígado, corazón, riñón e intestino24. De los tres isotipos, el 
PPARβ/δ tiene el patrón de expresión mas amplio y los niveles de expresión en ciertos 
tejidos depende del estado de proliferación y diferenciación celular. Funciones importantes 
se han asociado a este isotipo en la piel, placenta, intestino, músculo esquelético, tejido 
adiposo y cerebro23. El PPARγ se expresa como dos isotipos, γ1 y γ2, que difieren en sus 
extremos amino terminal. Altas concentraciones del PPARγ2 se encuentran en el tejido 
adiposo25, mientras que el PPARγ1 tiene un patrón de expresión más amplio, el cual se 
extiende a tejidos como el intestino, cerebro, células vasculares, y células inflamatorias e 
inmunes26. 
Consistentemente con su distribución en tejidos con altas tasas catabólicas de ácidos grasos 
y alta actividad peroxisomal, el papel más importante del PPARα es la regulación de 
homeostasis energética27. Especialmente en hígado, el PPARα activa el catabolismo de los 
ácidos grasos, estimula la gluconeogénesis y la síntesis de cuerpos cetónicos, y está 
involucrado en el control del ensamblaje de lipoproteínas28. El PPARα también estimula la 
síntesis del grupo hemo y el catabolismo del colesterol. Además, atenúa las respuestas 
inflamatorias y participa en el control del metabolismo de aminoácidos y síntesis de 
urea29,30. El incremento de la oxidación de ácidos grasos mediado por el PPARα disminuye 
la concentración circulante de triglicéridos, la esteatosis en hígado y músculo, y reduce la 
 19 
adiposidad, lo cual mejora la sensibilidad a la insulina31. Los fármacos del grupo de los 
fibratos, tales como el gemfibrozil, clofibrato y fenofibrato, que son usados para tratar la 
hipertrigliceridemia, son activadores del PPARα. Los agonistas del PPARα tienen además 
actividad anti-inflamatoria significativa que juega un papel importante como parte de sus 
acciones protectoras dentro de sistema cardiovascular32. 
El PPARβ/δ es necesario para el desarrollo del intestino y la placenta, y también está 
involucrado en el control de la homeostasis energética por medio de la estimulación de 
genes relacionados con el catabolismo de ácidos grasos y termogénesis adaptativa33,34. 
Además, juega un papel importante en el control de la proliferación celular, diferenciación y 
supervivencia, y está involucrado en la reparación de tejidos35. En modelos animales, los 
agonistas del PPARβ/δ retardan el incremento de peso durante el consumo de una dieta alta 
en grasa y mantienen la sensibilidad a la insulina, probablemente a través de la estimulación 
de la termogénesis así como del metabolismo de ácidos grasos en músculo esquelético36. 
El PPARγ es un actor principal en la diferenciación del tejido adiposo y el mantenimiento de 
las funciones específicas del adipocito, tales como almacenamiento de lípidos en el tejido 
adiposo blanco y la disipación de energía en el tejido adiposo pardo. Además, se requiere 
para la supervivencia de adipocitos diferenciados37,38. El PPARγ está involucrado en el 
metabolismo de glucosa mejorando la sensibilidad a la insulina39. Entre los compuestos 
sintéticos que selectivamente activan al PPARγ se encuentran las tiazolidinedionas, que son 
compuestos sensibilizadores a la insulina usados para tratar la hiperglicemia en diabetes tipo 
2. El uso clínico de estos agonistas así como el descubrimiento de mutaciones dominante 
negativas deletéreas raras, que conllevan a un síndrome de lipodistrofia parcial y resistencia 
severa a la insulina, han permitido el conocimiento y entendimiento de las funciones de este 
isotipo en humanos40. 
 
2.4 Regulación y función biológica del PPARα 
 
La distribución del PPARα en el organismo es amplia, se expresa principalmente en hígado, 
corazón, riñón y grasa parda. En estos tejidos modula la transcripción de genes relacionados 
con diversos procesos biológicos, principalmente con el metabolismo de lípidos, la 
homeostasis de la glucosa, la inflamación y el proceso hepatocarcinogénico23,24. 
 20 
El PPARα tiene una estructura de dominio funcional análoga a los de otros miembros de la 
familia de receptores nucleares. El DBD está flanqueado por una región N-terminal 
conocida como dominio de activación independiente a ligando (AF-1) que es activado por 
fosforilación. El DBD le confiere al PPARα la capacidad de unirse al PPRE en el promotor 
de genes blanco. La secuencia consenso de DNA de los PPRE es AGGTCANAGGTCA, 
donde N puede ser cualquier nucleótido, y está flanqueada río arriba por secuencias ricas en 
A y T. El extremo C-terminal contiene el dominio E regulado por ligando (AF-2) o LBD, en 
el cual se localiza el sitio de unión al ligando, cavidad con un volumen de aproximadamente 
1300 Å cúbicos27,41. Los estudios de cristalografía han revelado que la unión del ligando al 
PPARα induce una estabilización global de la conformación del receptor, misma que facilita 
las interacciones proteína-proteína con coactivadores (agonistas unidos al PPARα) o 
correporesores (antagonistas unidos al PPARα). Los complejos de correpresión o 
coactivación poseen distintas actividades enzimáticas, tales como acetilación, desacetilación, 
metilación y desmetilación. El reclutamiento orquestado de coactivadores y correpresores 
permiten la descompactación de la cromatina y el ensamblaje del complejo de preiniciación 
en los promotores. Además, la respuesta transcripcional está fuertemente influida por la 
estructura química del ligando y la naturaleza del PPRE (Figura 2)42. 
Por otra parte, la actividad del PPARα es regulada por fosforilación. El tratamiento con 
insulina incrementa la fosforilación del PPARα y aproximadamente duplica su actividad 
transcripcional en células HepG2 en cultivo. Esta fosforilación mediada por insulina 
involucra los aminoácidos Ser12 y Ser2144. Los estímulos por estrés ejercen un incremento 
en la fosforilación del PPARα en miocitos cardiacos neonatales de rata por la ruta de la 
proteína cinasa activada por mitógeno-p38 (MAPK)45. La MAPK p38 fosforila los residuos 
de Ser 6, 12 y 21 localizados en el dominio A/B N terminal de la proteína, lo que mejora 
significativamente la transactivación dependiente de ligando del PPARα. Por otro lado, 
también se ha descrito que el PPARα es fosforilado por la proteína cinasa C (PKC). La 
inhibición de la actividad de PKC afecta la actividad del PPARα dependiente de ligando, 
además, la proteína del PPARα purificada es fosforilada in vitro por las proteínas 
recombinantes de PKCα y –βII. Así, la ruta de señalización de PKC puede actuar como un 
interruptor molecular para las propiedades de transactivación y transrepresión del PPARα, 
lo cual involucra la fosforilación de Ser179 y Ser23046. 
 21 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura2. Representación esquemática de la regulación transcripcional mediada por el PPARα. Regulación de 
la transcripción mediada por el PPARα dependiente de la unión del ligando y el reclutamiento de 
coactivadores43. Abreviaturas: APO, apolipoproteína; BAF60, gen 1 relacionado a brahma/factor 60 asociado a 
brahma; CD36, cluster de diferenciación 36; CPT-1, carnitina palmitoil transferasa 1; CYP, citocromo P-450; 
FGF21, factor 21 de crecimiento de fibrobastos; HMGCAS2, hidroximetilglutaril CoA sintasa 2; p300, 
acetiltransferasa de histonas p300; PGC1α, coactivador 1α del receptor activado por proliferadores de 
peroxisomas γ; PPRE, elemento de respuesta a proliferadores de peroxisomas; RNA POLII, RNA polimerasa 
II; SRC, coactivador del receptor esteroideo; SREBP1-c, proteína 1c de unión al elemento regulatorio de 
esteroles; SW1/SNF, complejo de modificación de cromatina de intercambio/ sacarosa no fermentable. 
 
 
 
 
 22 
2.4.1 Regulación de la actividad transcripcional del PPARα 
 
La regulación transcripcional mediada por el PPARα requiere heterodimerización con el 
receptor X retinoideo (RXR; NR2B)47. Cuando el heterodímero es activado por un ligando, 
modula la regulación transcripcional a través de la unión al PPRE22. El PPRE está 
usualmente presente en una o múltiples copias en la región promotora de los genes blanco, y 
también puede estar localizado en la región transcrita proximal de ciertos genes 
respondedores al PPARα48. El heterodímero formado por el PPARα y el RXR se une a los 
sitios 5´y 3´de los PPRE, respectivamente. Además, se ha observado que la región que 
flanquea en el extremo 5´ influye en la unión selectiva entre los diferentes isotipos de los 
PPAR49. 
El control transcripcional del heterodímero PPARα/RXR requiere la interacción con 
complejos correguladores, tanto coactivadores para la estimulación o correpresores para la 
inhibición de la expresión de genes blanco 50. Los PPAR, como otros receptores nucleares, 
interactúan con coactivadores tales como SRC-1 (coactivador 1 del receptor esteroideo), o 
correpresores como N-CoR (correpresor nuclear) y SMRT (mediador de silenciamiento para 
los receptores retinoide y de la hormona tiroidea). Además, el PPARα puede interaccionar 
con CBP/300, miembros de la familia SRC/p160, PBP/MED1, PRIP/NCoA6, PRIC285, 
PRIC295, PRIC320, PGC-1α, y PGC-1β, así como a proteínas asociadas a coactivadores, 
tales como PIMT (NCoA6IP) y CARM-151. 
El complejo coregulador de interacción con el PPARα (PRIC) constituido por coactivadores 
conocidos como CBP, SRC-1, PBP, PRIP, PIMT, TRAP100, SUR-2, y PGC-1, y algunas 
otras proteínas designadas como PRIC300, -285, -177, y -145, que fue aislado de extractos 
nucleares de hígado de rata, revela la presencia de muchos de estos correguladores formando 
un mega complejo52. Esta diversidad da lugar a múltiples aspectos de estudio sobre la 
importancia evolutiva de la versatilidad y complejidad de las moléculas correguladoras, y su 
relativa abundancia en varios tipos celulares. Asimismo, muestra la relativa afinidad de estas 
moléculas para un receptor nuclear durante la orquestación transcripcional de un gen, en una 
célula, y en un estado específico del desarrollo. Por lo que, la acción selectiva de uno de los 
tres isotipos de PPAR in vivo es resultado de una compleja interrelación entre el nivel de 
expresión de cada uno de ellos y RXR, la afinidad por un PPRE específico en el promotor, la 
 23 
disponibilidad del ligando y los cofactores, y la posibilidad de la unión de otro factor de 
transcripción en la vecindad del PPRE, todo esto en una condición específica53. 
 
2.4.2 Ligandos del PPARα 
 
Para llevar a cabo su función biológica, el PPARα es activado por ligandos, los cuales se 
clasifican en dos categorías generales: sintéticos y naturales. Los ligandos sintéticos, 
también conocidos como proliferadores de peroxisomas, incluyen a los fibratos. Los fibratos 
son una clase de fármacos hipolipemiantes, entre los que se encuentran el clofibrato, el 
fenofibrato, el gemfibrozil, el bezafibrato, el ciprofibrato, el nafenopin, el metil clofenapato, 
y el Wy-14643 o ácido priníxico. Estos compuestos químicos poseen una estructura diversa 
que induce respuestas similares y reproducibles en hígado de ratón y rata, promoviendo la 
proliferación de peroxisomas en células parenquimales de hígado, así como la activación 
transcripcional de genes involucrados en la oxidación de ácidos grasos54. 
Los ligandos naturales del PPARα incluyen ácidos grasos saturados e insaturados de cadena 
larga y sus derivados, como las prostaglandinas D1 y D2, así como los ácidos grasos 
ramificados pristánicos y fitánicos55. Los ácidos grasos monocarboxílicos de cadena larga 
(16-20 carbonos) con varios dobles enlaces son los ligandos que han mostrado una óptima 
actividad de unión55,56. Además, los ligandos naturales pueden ser generados durante el 
catabolismo de ácidos grasos y la síntesis de nuevos lípidos in vivo, tal como el 1-palmitoil-
2-oleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (16:0/18:1-GPC), un ligando endógeno que induce la 
expresión génica dependiente del PPARα y disminuye la esteatosis hepática57. 
Los ácidos grasos de la dieta influyen en la salud humana y sobre diversos indicadores 
relacionados con el estado de salud. En recientes años muchos estudios se han enfocado en 
tratar de elucidar el modo de acción a través del cual los ácidos grasos provenientes de la 
dieta favorecen cambios en la función celular, tanto a corto como a largo plazo. 
Actualmente, existe evidencia que muestra que los ácidos grasos, particularmente los ácidos 
grasos insaturados, ejercen muchos de sus efectos a través de modular la transcripción 
génica regulando la actividad de factores de transcripción, como los PPAR58. 
Los estudios epidemiológicos realizados en el grupo poblacional de los Esquimales, y otros 
numerosos estudios tanto clínicos como en animales, han demostrado los efectos benéficos 
 24 
de los ácidos grasos poli-insaturados (PUFA), incluyendo su impacto en la salud en 
enfermedades crónicas relacionadas con obesidad59,60. De hecho, la ingesta dietaria de 
PUFA n-3 (aceite de pescado) ha revelado ser altamente efectiva en disminuir la 
concentración de triglicéridos (TG) y lipoproteínas asociadas a colesterol de muy baja 
densidad (VLDL), tanto en animales como en humanos con hipertrigliceridemia61. En 
particular, el ácido eicosapentaenoico (20:5 n-3, EPA) y el ácido docosahexanoico (22:6 n-3, 
DHA), provenientes de los aceites de pescado, mejoran la oxidación de los ácidos grasos a 
través de procesos estimulados por el PPARα62. 
Además de los ácidos grasos EPA y DHA, los ácidos linoleico conjugados (CLA) son 
también potentes y bien conocidos agonistas del PPARα. Los CLA son una familia de por lo 
menos 28 isómeros del ácido linoleico encontrados principalmente en la carne y productos 
lácteos provenientes de rumiantes. Los CLA han recibido gran atención en décadas recientes 
debido a los beneficios que han mostrado en roedores, dentro de los cuales se incluyen 
reducción en el riesgo a cáncer, aterosclerosis, obesidad y diabetes. Entre los varios 
isómeros, evidencia reciente sugiere que los isómeros 9-cis, 11-trans-CLA y 10-trans, 12-
cis-CLA son los responsables de las propiedades biológicas de la regulación del peso 
corporal y la homeostasis de glucosa63. Asimismo, se ha mostrado que la tolerancia a la 
glucosa mejora después de la alimentación con CLA en modelos animales con resistencia a 
insulina, tales como la ratas Zucker obesas y la ratas Zucker diabéticas64,65. 
El fitol, un componente de la clorofila abundante en numerosas fuentes naturales incluyendo 
varios vegetales, también se ha identificado como un activador específico del PPARα. El 
fitol induce un incremento de la actividad de luciferasa dependiente del PPARα. Además, la 
adición de fitol incrementa la expresión de genes blanco del PPARα, tantoa nivel de mRNA 
como a nivel de proteína66. El leucotrieno B4 (LTB4) es otro ligando conocido del PPARα 
que conecta a este receptor nuclear con las respuestas inflamatorias e inmunes. Los ácidos 
hidroxieicosatetraenoico 19 y 20 (19- y 20-HETE) son los productos más importantes 
obtenidos por el citocromo P450 y la conversión catalítica del ácido araquidónico que 
participan en el sistema cardiovascular, la función renal, la proliferación celular y la 
inflamación. Los HETEs se unen y activan al PPARα en células HepG2 transfectadas con el 
PPARα humano67. 
 25 
El hígado y el músculo esquelético son considerados como los principales tejidos blanco en 
los cuales los ligandos del PPARα mejoran la oxidación de los ácidos grasos. 
Adicionalmente, en estudios recientes se ha evidenciado que el intestino delgado también 
puede ser un importante blanco del PPARα. De hecho, el tratamiento con fibratos disminuye 
la concentración de TG en sangre en ratones alimentados con dieta alta en grasa, al 
incrementar la oxidación de ácidos grasos vía la activación del PPARα68. Los resultados 
sugieren la posibilidad de que la oxidación de ácidos grasos a través de la activación del 
PPARα en el intestino contribuye a la disminución de la secreción de TG del intestino hacia 
el torrente sanguíneo60. 
 
2.4.3 Papel del PPARα en la regulación de la homeostasis energética 
 
En estudios previamente realizados se ha demostrado que los tres miembros de la subfamilia 
del PPAR participan en el metabolismo energético. El PPARα y el PPARβ/δ principalmente 
actúan como reguladores catabólicos del gasto de energía, mientras que el PPARγ regula el 
metabolismo anabólico a través del almacenamiento de energía. 
La regulación del metabolismo de lípidos está principalmente coordinada por el hígado, 
órgano que activamente metaboliza ácidos grasos como fuente de energía, y produce VLDL 
para suministrar de forma constante ácidos grasos a los tejidos periféricos69. Diversos 
aspectos del metabolismo hepático de lípidos están bajo el control del PPARα, incluyendo la 
captura y absorción de ácidos grasos a través de las membranas, la activación, transporte 
intracelular y oxidación de ácidos grasos, cetogénesis, almacenamiento de TG y lipólisis. 
La lipogénesis consiste en la síntesis de ácidos grasos de novo y la subsecuente conversión 
de estos ácidos grasos en TG. En el hígado, la lipogénesis está regulada por factores de 
transcripción como la proteína de unión al elemento regulador de esteroles (SREBP-1c), la 
proteína de unión al elemento de respuesta a carbohidratos (ChREBP) y el PPARγ. La 
evidencia reciente sugiere que el PPARα también influye en la lipogénesis, incrementando 
la transcripción de la estearoil-CoA desaturasa-1 (Scd-1) y otros genes lipogénicos, por 
medio de la regulación de SREBP-1c y el receptor X hepático α (LXRα)70. Hebbachi y 
colaboradores, han sugerido que el PPARα participa en la generación de un ligando 
endógeno de LXRα, ya que la administración de un ligando no esteroidal sintético de LXRα 
 26 
en ratones deficientes del PPARα resulta en la inducción de genes lipogénicos. Sin 
embargo, el papel del PPARα en lipogénesis, aunque modesto, puede sugerir un mecanismo 
compensatorio por la remoción de ácidos grasos durante estados como el ayuno70. 
Por otro lado, el hígado también juega un importante papel en la oxidación de ácidos grasos, 
cuyo catabolismo está regulado por el PPARα. La oxidación de ácidos grasos ocurre en tres 
organelos celulares, con una mayor proporción correspondiente a la β-oxidación confinada a 
mitocondrias y peroxisomas, mientras que la ω-oxidación catalizada por CYP4A tiene lugar 
en el retículo endoplásmico. Algunas de las enzimas clave involucradas en estos tres 
sistemas de oxidación de ácidos grasos tienen elementos PPRE y son reguladas por el 
PPARα21. La β-oxidación mitocondrial está principalmente involucrada en la oxidación de 
la mayor porción de los ácidos grasos de cadena corta (<C8), mediana (C8-C12) y larga (C12-
C-20), y constituye la primera fuente de e nergía derivada de los ácidos grasos. Entre las 
enzimas reguladas por el PPARα, se encuentran la acil-CoA de cadena larga sintetasa y la 
carnitina palmitoil transferasa-1 (CPT1), las cuales son esenciales para generar los acil-CoA 
y facilitar la entrada de la acil-carnitina en la mitocondria, respectivamente71. 
La β-oxidación peroxisomal está básicamente dirigida al metabolismo de ácidos grasos de 
cadena muy larga (>C20), ácidos grasos ramificados, y ácidos dicarboxílicos. Los sustratos 
de esta ruta de oxidación son menos abundantes y relativamente más tóxicos, por lo que no 
son procesados por el sistema de oxidación mitocondrial. Sin embargo, la β-oxidación 
peroxisomal es requerida para acortar las cadenas muy largas de los ácidos grasos, y 
entonces los acil-CoA más cortos generados pueden ser transportados a la mitocondria para 
completar ahí el proceso de β-oxidación. La inducción coordinada del sistema de β-
oxidación peroxisomal por los proliferadores de peroxisomas está bien establecida y es 
regulada por el PPARα72. Algunas de las enzimas de la β-oxidación peroxisomal son 
inducidas por ligandos del PPARα, tal como la acil-CoA oxidasa 1 (ACOX1), la cual es 
responsable de la oxidación inicial de los acil-CoA de cadena muy larga para dar lugar a su 
correspondiente trans-2-enoil-CoA. 
Adicionalmente al proceso β-oxidativo en peroxisomas y mitocondrias, los ácidos grasos 
también pueden ser oxidados por la ω-oxidación microsomal, la cual se lleva a cabo por las 
enzimas CYP4A que también son reguladas por el PPARα73. El primer paso de la vía ocurre 
en el retículo endoplásmico, en donde los ácidos grasos saturados y no saturados son 
 27 
hidroxilados, y luego son oxidados para dar lugar a ácidos dicarboxílicos en el citosol. Los 
ácidos dicarboxílicos son convertidos a dicarboxilos-CoA que entran a los peroxisomas para 
ser metabolizados por las enzimas β-oxidativas clásicas. Los ácidos dicarboxílicos son 
únicos y sirven como sustrato del sistema de β-oxidación peroxisomal, además de que 
también son ligandos del PPARα. Por lo que pareciera que los ácidos grasos dicarboxílicos 
propician su propio metabolismo al inducir la activación del PPARα74,75. 
Antes de que los ácidos grasos puedan ser metabolizados en el hígado, deben ser 
transferidos a través de la membrana celular. Algunos estudios han demostrado que el 
PPARα incrementa la expresión de proteínas transportadoras de ácidos grasos, tales como 
Slc27a1, Slc27a2, y Slc27a4 en hígado69. Además, agonistas del PPARα también inducen 
una marcada expresión hepática del transportador/receptor Cd36, que afecta la captura 
hepática de ácidos grasos, el almacenamiento de TG y la secreción de TG unidos a VLDL76, 
así como de genes que codifican para las proteínas de unión a ácidos grasos, Fabp1, Fabp2, 
Fabp3, Fabp4 y Fabp569. 
Además, recientemente se ha evidenciado que el PPARα ejerce un efecto sobre la 
regulación del metabolismo de los aminoácidos y la síntesis de urea. Los ratones PPARα-/- 
revelaron un incremento en la expresión de varios genes asociados al metabolismo de 
aminoácidos, incluyendo algunas AADE30. Adicionalmente, se han identificado PPARE en 
la región promotora de genes que codifican para AADE, y en estudios in vivo e in vitro se 
ha demostrado que la adición de Wy-14643, ligando sintético específico del PPARα, 
reprime la expresión de AADE e induce la expresión de genes involucrados en la oxidación 
de ácidos grasos como Cpt177. Por otro lado, la suplementación de ratas con Wy-14643 
resultó en la inducción de cambios en los niveles plasmáticos de aminoácidos, con una 
marcada elevación de la concentración de varios aminoácidos glucogénicos y sin la 
alteración de los aminoácidos de cadena ramificada78. 
Las evidencias anteriores tienen gran importancia desde un punto de vista metabólico, ya 
que sugieren que laactividad transcripcional del PPARα permite la oxidación de ácidos 
grasos sin comprometer la de los aminoácidos. Este proceso de adaptación adquiere 
relevancia desde un punto de vista energético, ya que al no existir un reservorio natural de 
aminoácidos, es necesario evitar una posible degradación continua de estos sustratos. De tal 
forma que se conserve el grupo de aminoácidos corporales como precursores de compuestos 
 28 
nitrogenados biológicamente importantes, tales como, aminas, nucleótidos, glutatión y 
cofactores. Por tal motivo se presenta el siguiente trabajo de tesis a fin de contribuir al 
entendimiento de los mecanismos moleculares que están implicados en la regulación 
metabólica, que favorece la preservación de los aminoácidos para mantener el balance del 
nitrógeno corporal a través del uso de las grasas como fuente de energía. 
3 Justificación	
  
 
Los nutrimentos pueden de manera directa o indirecta regular la vía de expresión de genes 
que codifican para proteínas, especialmente enzimas involucradas en rutas metabólicas 
relacionadas con el uso de carbohidratos, lípidos y aminoácidos. El efecto directo de los 
nutrimentos puede ser a través de la unión específica sobre ciertas proteínas para activar su 
función transcripcional. Tal es el caso del PPARα, que se activa principalmente por ácidos 
grasos provenientes de la dieta, los que actúan como ligandos naturales para inducir la 
expresión de genes involucrados en la oxidación de ácidos grasos, y mantener así el balance 
de lípidos celulares en el hígado79. El PPARα, además de ser considerado como un 
importante sensor de lípidos en la célula, también está involucrado en la regulación de los 
carbohidratos, lo que pone de manifiesto su relevante papel en la homeostasis metabólica. 
En cuanto a la regulación indirecta de los nutrimentos, estos pueden generar un estado 
hormonal específico que a su vez regule la expresión de algunos genes, teniendo un efecto 
importante sobre el balance energético de los organismos. Por ejemplo, en estudios previos 
se ha demostrado que el nivel de glucagon liberado de las células α del páncreas depende de 
la concentración de proteína en la dieta, observándose una mayor estimulación cuando la 
relación de proteína/carbohidratos es alta, y disminuyendo cuando esta relación es baja80,81. 
Por otro lado, el consumo de proteína en la dieta tiene como propósito principal el proveer 
aminoácidos que son utilizados principalmente para la síntesis de proteínas, y para algunos 
otros compuestos nitrogenados como neurotransmisores y bases nitrogenadas82. Bajo 
condiciones de restricción alimentaria se puede acelerar el catabolismo de aminoácidos 
provenientes de proteínas intracelulares, por lo que para conservar el contenido de proteína 
corporal, condición prioritaria para el organismo, se requiere hacer uso de sustrato 
energéticos como los lípidos. El PPARα, además de regular mecanismos involucrados en el 
 29 
catabolismo de lípidos, también ha sido relacionado con el metabolismo de los aminoácidos. 
Recientemente, se ha demostrado que los ratones PPARα-/- presentan una expresión 
aumentada de varios genes asociados al metabolismo de aminoácidos, incluyendo genes que 
codifican para AADE30. 
Considerando lo anteriormente expuesto, se plantea el presente estudio para evaluar la 
regulación de la expresión de AADE mediada por el PPARα, analizando el efecto que los 
ligandos naturales del PPARα (ácidos grasos) y la concentración de proteína en la dieta 
ejercen sobre esta regulación. Por lo que con este estudio se pretende: 
1) Fortalecer el entendimiento del mecanismo de regulación del PPARα sobre el 
metabolismo de los aminoácidos; 
2) Generar conocimiento sobre la función del PPARα en la regulación de la expresión de 
AADE; 
3) Contribuir en la comprensión de la regulación del metabolismo hepático a través de los 
nutrimentos de la dieta, que nos permite maximizar el uso de los sustratos energéticos para 
evitar alteraciones metabólicas en detrimento de la salud. 
4 Pregunta	
  de	
  investigación	
  	
  	
  
 
¿Cuál es el efecto del tipo de ácido graso y proteína dietaria sobre la regulación de la 
expresión génica de AADE mediada por el PPARα in vitro e in vivo? 
5 Objetivos	
  
5.1 Objetivo general 
 
Evaluar el efecto del tipo de grasa y proteína dietaria sobre la regulación de la expresión de 
AADE mediada por el PPARα in vitro y en un modelo de ratón PPARα-/- 
5.2 Objetivos específicos 
 
1. Determinar el efecto del tipo de ácido graso, poliinsaturado, monoinsaturado y 
saturado, como ligandos del PPARα, sobre la expresión de Sds y Cpt1 en cultivos 
primarios de hepatocitos de rata 
 30 
2. Determinar la respuesta del tipo de ácido graso sobre la interacción PPARα−PPARE 
en la región promotora de Sds en cultivos primarios de hepatocitos de rata 
3. Determinar el efecto de la proteína dietaria mediado por el PPARα sobre parámetros 
bioquímicos, tales como glucosa, aminoácidos, ácidos grasos libres, glucagon e 
insulina en los ratones WT y PPARα-/- 
4. Medir el efecto de la concentración de proteína dietaria sobre la expresión génica en 
hígado de ratones WT y PPARα-/- 
5. Establecer una vía de regulación del metabolismo de aminoácidos mediado por el 
PPARα, como parte del efecto que este receptor nuclear ejerce sobre la homeostasis 
metabólica 
6 Metodología	
  
 
Cultivos primarios de hepatocitos. Los cultivos primarios de hepatocitos de rata se 
obtuvieron usando el método de perfusión con colagenasa de Berry y Friend83, que consiste 
en canular y eliminar los restos de sangre del hígado in vivo y perfundirlo con colagenasa en 
un sistema de recirculación. Brevemente, ratas Wistar macho (200-300 g) se 
laparotomizaron bajo los efectos anestésicos de éter etílico, y los hepatocitos se recolectaron 
a través de la perfusión del hígado in situ con la enzima colagenasa. La vena cava inferior se 
ligó y en la cava superior se insertó una cánula, a través de la cual se realizó una perfusión 
con solución amortiguadora Krebs-Ringer oxigenada libre de calcio, cuyo pH se mantuvo en 
7.4 usando una mezcla de gases de O2-CO2, hasta que se eliminaron del hígado los restos de 
sangre. Entonces, el hígado se perfundió con colagenasa tipo IV (Sigma-Aldrich, St. Louis, 
MO, USA) al 1% en solución en un sistema de recirculación, hasta que el hígado comenzó a 
desintegrarse de forma visible (aproximadamente 10 min). El hígado se aisló y colocó en 
medio DMEM con suero fetal bovino (FBS) al 10% (Sigma-Aldrich) conteniendo 
penicilina/estreptomicina (100 U/ml y 100 mg/ml). Los hepatocitos se filtraron y se lavaron 
dos veces con el medio DMEM-FBS al 10% (Invitrogen, Waltham, Massachusetts, USA). 
La viabilidad celular del homogenizado obtenido se determinó con azul de tripano (Sigma-
Aldrich). Los cultivos (65,000 células/cm2) se incubaron a 37 oC con el medio de cultivo 
 31 
durante 4 h, al término de las cuales se cambió por medio fresco y se dejaron incubar 
durante 16 h. 
Tratamiento de los cultivos primarios con estímulos. Los cultivos se incubaron con 
diferentes estímulos disueltos en medio DMEM libre de suero, durante 2, 4, 6, 12 y/o 16 h. 
Se evaluó el ligando sintético del PPARα, Wy-14643 (Biomol, Farmingdale, NY, USA), 
en concentraciones de 50, 100 o 200 µM; el inductor del cAMP, forskolina a 10 µM; y los 
ligando naturales ácido palmítico, ácido linoléico, y ácido oleíco a 200 o 500 µM (Figura 
3). Se evaluaron las sales sódicas de los ácidos grasos. 
 
A B 
 
C D 
 
 
 
E 
 
 
 
 
Figura 3. Estructura química de los estímulos utilizados en los cultivos primarios de hepatocitos. Forskolina 
(A); Wy-14643 (B); ácido palmítico (C); ácido linoléico (D); ácido oleíco (E). 
 
Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Los cultivos primarios de 
hepatocitos se crecieron en placas de 10 cm2, a una concentraciónde 70,000 células/cm2. 
Los cultivos se incubaron con y sin Wy-14643 por un periodo de 6 h, al término del cual se 
adicionó la solución amortiguadora de entrecruzamiento con 1% de formaldehído 
directamente al medio, y se dejaron en agitación por 10 min. Una vez transcurrido el tiempo 
se detuvo la reacción con la adición de glicina 2.5 M, teniendo una concentración final de 
 32 
125 mM, y se mantuvo la agitación durante 5 min más. Al término, se retiró el medio y se 
lavaron las células con solución amortiguadora de fosfatos (PBS) frío con el inhibidor de 
proteasas, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF, Sigma-Aldrich) por tres veces. 
Posteriormente, se adicionó 1ml de solución amortiguadora de lisis y se incubaron a 4 oC 
por 5 min. La cromatina se sonicó con 15 pulsos de 30 seg y una amplitud de 35%. Una vez 
obtenida la cromatina en fragmentos de 500-700 pb, se midió la concentración proteica del 
lisado a través del método de Bradford, y se ajustó a 4 µg/µl adicionando solución 
amortiguadora de lisis. Un volumen de 100 µl de cromatina ajustada se diluyó con 9 partes 
de solución amortiguadora con inhibidores de proteasas. Se adicionó 4 µg de anticuerpo por 
cada inmunoprecipitación y se dejó rotando a 4 oC durante una noche. Posteriormente, se 
adicionaron 15 µl de perlas de agarosa A/G y se incubaron por 2 h en rotación a 4 oC. Las 
perlas se centrifugaron a 2000 rpm por 1 min a 4 oC, y se lavaron secuencialmente con las 
soluciones amortiguadoras de Paro I, Paro II y Paro III con inhibidores, durante 10 min 
rotando a 4 oC en cada lavado. Finalmente, las perlas se lavaron 2 veces con solución 
amortiguadora TE con inhibidores, se agregó 150 ul de la solución de lavado con 2 µl de 
proteinasa K y 1 µl de RNAsa, y se dejaron a 65 oC durante una noche. El DNA se precipitó 
con la técnica de fenol-cloroformo, y se resuspendió con 50 µl de agua estéril. El DNA 
obtenido se utilizó para realizar las PCR usando “primers” flanqueantes específicos de los 
diferentes cinco PPARE en el gen Sds (Tabla 1). Se utilizó una marca de acetilación de la 
histona 3 (AcH3) como control positivo del ensayo. 
Animales. Ratones macho WT (cepa C57BL/6) y PPARα-/- de 7-9 semanas de edad con 
peso promedio de 22.4±0.5 g se alimentaron con una de las dietas experimentales (Tabla 2). 
Los ratones PPARα-/- carecen del PPARα funcional y presentan alteraciones constitutivas en 
el metabolismo, especialmente en lo referente al catabolismo, almacenamiento y regulación 
de lípidos84. Brevemente, el modelo de ratón PPARα-/- se obtuvo usando un vector con el 
segmento del exon 8 del gen del PPARα, al que se deletaron 83 bp y reemplazaron con un 
cassette de resistencia a neomicina. El vector se introdujo por electroporación en células 
blanco J1 ES derivadas de la cepa 129S4. Las células blanco derivadas de una sola clona se 
inyectaron en blastocistos de ratones C57BL/6N de 3-5 días y se implantaron en ratonas 
pseudo-preñadas. Se generaron cinco quimeras 129S4 X C57BL/6, de las cuales tres machos 
se cruzaron con hembras C57BL/6. 
 33 
Tabla 1. Secuencia de oligonucleótidos utilizados en el estudio. 
Ensayo ChIP 
Sds-CHIP-434 forward 
Sds-CHIP-634 reverse 
Sds-CHIP-1076 forward 
Sds-CHIP-1162 reverse 
Sds-CHIP-1337 forward 
Sds-CHIP-1508 reverse 
ctc cac atc agc tct gca ctc 
cac atc att tgc ctc ctg tgt 
tgt tta tgc ctg tgg aca cac 
acc acc acc act atc acc atc 
tca tcc ctg ttt aca cac gaa 
tga ttg aca ccc ctt gct tac 
Genotipificación de ratones 
Alpha FOR 
Alpha REV 
Alpha NEO 
gag aag ttg cag gag ggg att gtg 
ccc att tcg gta gca ggt agt ctt 
gca atc cat ctt gtt caa tgg c 
EMSA 
HNF4α consensus forward tca gct tgt act ttg gta caa ct 
HNF4α consensus reverse agt tgt acc aaa gta caa gct ga 
HNF4α consensus mutated forward tca gct tct act tag gta caa ct 
HNF4α consensus mutated reverse agt tgt acc taa gta gaa gct ga 
Rattus norvegicus 
HNF4α Sds forward 
 
tat ggc tgg cct gtg gct gtt tc 
HNF4α Sds reverse 
HNF4α Sds mutated forward 
HNF4α Sds mutated reverse 
Mus musculus 
HNF4α Sds forward 
HNF4α Sds reverse 
HNF4α Sds mutated forward 
HNF4α Sds mutated reverse 
gaa aca gcc aca ggc cag cca ta 
tat ggc tag cct gcc gct gtt tc 
gaa aca gcg gca ggc tag cca ta 
 
ctg tgg agg cca agg ttc ttt ccc a 
acc ctt tct tgg aac cgg agg tgt c 
ctg tgg agg ttg ggg ttc ttt ccc a 
agg gtt tct tgg ggt tgg agg tga tc 
Mutagénesis dirigida 
HNF4α Sds mutagenesis forward atg gcc aag aaa cag cgg cag gct agc cat atg gca act cac 
HNF4α Sds mutagenesis reverse gtg agt tgc cat atg gct agc ctg ccg ctg ttt ctt ggc cat 
Construcciones del promotor de Sds 
Sds -1769/+290 forward gcg atg gtg tgc tca ca 
Sds -1159/+290 forward caa gtc tct cac cta acg cag tcc cac c 
Sds -875/+290 forward caa aat cta ccc ttc tc 
Sds +8/+290 forward 
Sds constructs reverse 
gag gga ctg gga ctc 
aga ctt ctg ccg tgg aac cca tgc cg 
Las bases subrayadas corresponden a las mutaciones en las secuencias. 
 
La descendencia heterocigota se cruzó para producir ratones homocigotos para el gen 
alterado85. A partir de seis ratones PPARα-/- (tres hembras y tres machos) donados por Dr. 
Frank J. Gonzalez del Center for Cancer Research, National Cancer Institute (Bethesda, 
MD, USA), se generó una colonia en el bioterio del Instituto Nacional de Ciencias Médicas 
y Nutrición Salvador Zubirán para realizar los ensayos que se describen en este trabajo. 
Para evaluar el efecto de la concentración de PD se usaron 24 ratones macho PPARα-/- y 
30 WT de 7-9 semanas de edad (n=4 PPARα-/- y n=5 WT, por grupo). Los ratones se 
alimentaron con tres diferentes dietas isocalóricas en un esquema de horario restringido de 
8 h (de 8 am a 4 pm), para sincronizar su consumo de alimento y evitar variabilidad 
hormonal y metabólica, por un periodo de 8 días. Al término de los 8 días, los ratones que 
 34 
consumieron una misma dieta se dividieron en dos grupos, ratones mantenidos en ayuno de 
16 h (de las 4 pm a las 8 am del día siguiente), y ratones en estado de postprandio de 3 h 
(de las 8 am a las 11 am). Después de los periodos de ayuno o postprandio, los ratones se 
sometieron a eutanasia, y a partir de cada ratón se extrajo hígado y sangre. El hígado se 
congeló en nitrógeno líquido, se separó el plasma, y ambos se almacenaron en 
ultracongelador a -70oC. El alimento consumido y la ganancia de peso se registraron 
diariamente. 
Dietas. La dietas se formularon siguiendo las recomendaciones del Instituto Americano de 
Nutrición (AIN-93)86. Se prepararon tres dietas con diferentes concentraciones de proteína, 
6% (baja concentración de proteína), 20% (concentración adecuada para cubrir el 
requerimiento de proteína) y 50% (dieta con un exceso de proteína). El contenido de 
proteína de las dietas se ajustó modificando la cantidad de carbohidratos añadidos (Tabla 
2). 
 
Tabla 2. Composición de las dietas utilizadas en el estudio de acuerdo a la AIN-93. 
 AIN-93G (g/kg) 
6% proteína/77% 
carbohidrato 
AIN-93G (g/kg) 
20% proteína/63% 
carbohidrato 
AIN-93G (g/kg) 
50% proteína/33% 
carbohidrato 
Almidón 485.88 397.50 209.94 
Caseína (>85% proteína) 60 200.0 500.0 
Dextrinas 161.36 132.0 69.72 
Sacarosa 122.24 100.0 52.82 
Aceite de soya 70.0 70 70 
Fibra (celulosa) 50.0 50.0 50.0 
Mezcla de minerales 35.0 35.0 35.0 
Mezcla de vitaminas 10.0 10.0 10.0 
L-cistina 3.0 3.0 3.0 
Colina 2.5 2.5 2.5 
 
Procedimientos analíticos. En los ratones, la glucosa sérica se midió usando el analizador 
bioquímico, YSI 2700 SELECT (YSI Incorporated, Yellow Springs, OH, USA). Los niveles 
de glucagon sérico se midieron por radioinmunoensayo usando un kit de Millipore 
(Millipore, Billerica, MA, USA) que utiliza glucagon marcado con 125I y un anticuerpo anti-
glucagon. La concentración de insulina se determinó usando un kit de ELISA para insulina 
(Millipore). La concentración de ácidos grasos no esterificados totales en suero se midió 
usando un kit colorimétrico basado en la acil-CoA oxidasa (Roche Applied Science,Penzberg, Upper Bavaria, Germany). La determinación de urea en suero se realizó en un 
 35 
analizador químico Synchron CX 5 Pro (Beckman Instruments, Brea, CA, USA) a través de 
la actividad de la enzima ureasa. La determinación de aminoácidos en suero se realizó por 
cromatografía de gases, usando el kit E2:faast (Phenomenex, Torrance, CA, USA) para el 
análisis fisiológico de aminoácidos libres por GC-FID, en un cromatógrafo de gases Agilent 
6850 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). 
Determinación de glucógeno hepático. Para la cuantificación del glucógeno hepático de 
los ratones se utilizó el reactivo de antrona en una solución al 0.05% en H2SO487. 
Brevemente, 100 mg de tejido se colocaron en 5 ml de ácido tricloroacético (TCA) al 5% y 
se homogenizó por 1 min. Se tomó 1 ml, se adicionaron 2 ml de KOH a 10 N y los tubos se 
colocaron en un baño con agua hirviendo por 1 hora. Los tubos se taparon con una canica, 
de tal forma que se permitiera la condensación y el retorno de los vapores, pero que evitara 
la presurización de los tubos. Después los tubos se enfriaron en hielo, se adicionó 1 ml de 
ácido acético glacial para neutralizar el exceso de alcalinidad, y se adicionaron lentamente 2 
ml de esta solución a 4 ml de reactivo de antrona, previamente colocado en tubos inmersos 
en agua fría para evitar calentamiento excesivo. Después de mezclar, los tubos se colocaron 
en agua hirviendo por 10 min. Al término, la densidad óptica se leyó en un 
espectrofotómetro a 650 nm usando como blanco TCA al 5% tratado con el mismo 
procedimiento. Para calcular la cantidad de glucógeno, se prepararon 7 soluciones estándar 
de glucosa a una concentración dentro del intervalo de 0 a 0.6 mg/ml. Un valor de 0.9 se 
utilizó en el cálculo para convertir el valor de glucosa a glucógeno87. 
Extracción de RNA. La extracción de RNA de cultivos primarios de hepatocitos y del 
hígado de los ratones se realizó a través del método de cloroformo-fenol-tiocianato de 
guanidina, utilizando una solución de TRIzol (Invitrogen). Posteriormente, el RNA se 
cuantificó por espectrofotometría (1 DO @ 260 nm = 40 mg/ml), y se realizó un gel 
desnaturalizante de agarosa al 1% para determinar su integridad. 
Análisis de expresión de genoma completo. La integridad del RNA usado en el análisis 
de expresión de genoma completo se evaluó con un RNA 6000 LabChip kit en un 
Bioanalizador 2100. El RNA hepático de 3 o 4 ratones individuales se analizó por 
microarreglos de expresión (Affymetrix) de acuerdo a las instrucciones del proveedor para 
el GeneChip Mouse Gene 1.0 ST Array. 
Preprocesamiento de datos de expresión. A partir de los archivos resultantes del escaneo 
de los microarreglos (extensión .cel) se realizó el preprocesamiento de los datos, es decir, 
 36 
el tratamiento previo al análisis e interpretación de resultados. La normalización es un tipo 
particular de preprocesamiento necesario para identificar y descartar las diferencias o 
variaciones sistemáticas a través de los datos. En un principio, los valores de intensidad se 
transformaron usando logaritmo base 2 para mejorar las características de la distribución 
de los datos. Se utilizó como método de normalización el de datos completos por Quantiles 
bajo el proyecto de Bioconductor en plataforma R88. 
Clasificación y comparación de los perfiles de expresión. El valor de “fold change” para 
un gen dado en dos muestras de interés se calculó dividiendo los valores observados entre 
ellas, por lo que es referido como una razón o tasa. Para seleccionar los genes 
diferencialmente expresados se realizó la prueba de hipótesis usando el modelo estadístico 
moderated t-statistic, el cual fue evaluado para cada sonda y cada contraste, usando el 
paquete Limma89. El valor de p (p-value) asociado se ajustó por múltiples pruebas usando 
el método False Discovery Rate (FDR), y el método de Benjamini y Hochberg's se utilizó 
para controlar la tasa de falsos descubrimientos90. 
Análisis de enriquecimiento funcional de genes anotados. A partir de los genes 
diferencialmente expresados se realizó un análisis de enriquecimiento funcional, a través 
del uso de la fuente bioinformática DAVID (The Database for Annotation, Visualization 
and Integrated Discovery)91. Posteriormente, se utilizó el programa Ingenuity Systems 
(Qiagen, Hilden, Germany) para identificar la interrelación biológica de los genes 
diferencialmente expresados. 
Cuantificación relativa por PCR en tiempo real (PCR-TR). La determinación de los 
niveles de expresión de los genes Sds y Cpt1 en hepatocitos de rata se realizó utilizando RT-
PCR en un ABI Prism 7000 (Applied Biosystems). La validación de los resultados de 
expresión hepática obtenidos en los microarreglos se realizó también a través de RT-PCR. 
Brevemente, el cDNA se obtuvo a partir de 300 ng total de RNA usando el primer 
Oligo(dT)12-18 (Invitrogen). El nivel de expresión para cada gen se determinó por 
triplicado usando una sonda y un par de “primers” Taqman® (Applied Biosystems, 
Carlsbad, CA, USA) siguiendo el protocolo del proveedor, y utilizando a β-actina como gen 
de expresión constitutiva. 
Análisis de western blot. Los cultivos de hepatocitos o fragmentos de hígado se 
homogenizaron con 150 µl de solución amortiguadora RIPA conteniendo fluoruro de sodio 
 37 
1 mM, ortovanadato de sodio 2 mM y tabletas de una mezcla de inhibidores de proteasas 
(Roche Applied Science). La concentración de proteína se cuantificó con el ensayo de 
Bradford y se ajusto a 10 µg/µl. El contenido de proteína total (20 µg) se cargó en un gel al 
8% de poliacrilamida en una proporción 1:1 con solución amortiguadora de Laemmli con 
mercaptoetanol. La electroforesis vertical se llevó a cabo durante 30 min a 75 volts y 
posteriormente 1.15 h a 100 volts. Las proteínas del gel se transfirieron a una membrana de 
PVDF en una cámara semiseca (transblot) por 30 min a 15 volts y amperaje controlado 
dependiente del área de la membrana. La membrana se bloqueo con una solución de leche 
sin grasa (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), e incubó por 16 h a 4˚C con los anticuerpos anti-
HNF4α, anti-PPARα o anti-SDS (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA). El 
anticuerpo para β-actina (Santa Cruz Biotechnology) se utilizó como control de carga. Las 
proteínas se identificaron por quimioluminiscencia con una película fotográfica, y se 
analizaron las imágenes por densitometría usando el software ImageJ 1.43, National 
Institutes of Health, USA (http://rsbweb.nih.gov/ij/). 
Composición corporal. Se usaron ratones macho WT y PPARα-/- de 7 semanas de edad, 
los cuales se alimentaron ad libitum durante 9 días con tres diferentes dietas isocalóricas, 
conteniendo (Tabla 2), 6%, 20% y 50% de PD (n=4 por grupo). El alimento consumido y 
la ganancia de peso se registraron diariamente. Al término de este periodo, se practicó 
eutanasia por asfixia con CO2, y los animales se evisceraron, se pesaron, y secaron a 60 °C 
hasta obtener peso constante (7 días). El contenido de agua se determinó como el peso 
perdido durante el secado. Los esqueletos secos resultantes después de la evisceración se 
molieron usando licuadora de acero y se analizó el contenido de nitrógeno por el método 
Kjeldahl, a través de la digestión de las muestras con ácido sulfúrico concentrado; el 
amonio resultante se destiló y tituló con una solución alcalina. La cantidad de nitrógeno de 
los esqueletos se multiplicó por 6.25 para obtener el porcentaje de proteína corporal92. El 
contenido de grasa corporal se determinó a partir una alícuota de los esqueletos molidos 
usando el método Soxhlet93. 
Análisis histológico. Las muestras de hígado de ratones WT y PPARα-/- se fijaron con una 
solución de paraformaldehído al 4% (w/v) disuelto en solución amortiguadora de fosfato. 
Posteriormente el tejido se deshidrato, a través de lavados de 10 min con diferentes 
soluciones de etanol (70%, 90%, 96% y 100%). Posteriormente,