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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA EFECTO EN LA CALIDAD DEL SEMEN POR LA INCLUSIÓN DE ZINC ORGÁNICO EN LA DIETA DEL VERRACO TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE MÉDICA VETERINARIA ZOOTECNISTA PRESENTA WENDY MIROSLAVA PALACIOS ZAMUDIO Tutores: MVZ. MPA. Sergio C. Ángeles Campos M.C. José Luis Pablos Hach México, D.F. Mayo 2015 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. DEDICATORIA “El agua es la cosa más suave, y aún así puede penetrar montañas y tierra. Esto muestra claramente el principio de que la suavidad supera la dureza” - Lao Tse A mis padres Gloria y Alberto, por su amor, trabajo y sacrificio en todos estos años, gracias a ustedes he logrado llegar hasta aquí y convertirme en lo que soy; son las personas más importantes para mí y por estar siempre conmigo, apoyándome durante este largo camino en mi vida, además de que siempre me impulsaron a no darme por vencida. A mi hermano Alberto y a mis sobrinos, Alberto Alexander, Allen y Jade, recuerden que el trabajo duro tiene sus recompensas. A mis tías Irma, Rosita, Marta y Alicia que también han sido un gran apoyo, y sobre todo a mi abuelita Coco, que aunque ya no está conmigo, siempre estuvo al pendiente de mi trabajo y me animó a seguir; muchas gracias abue, siempre estarás en mi corazón. AGRADECIMIENTOS Al Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Producción Porcina (CEIEPP) de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM. A la empresa NUTRIPLAN por proporcionarme el producto para poder realizar esta investigación. A los trabajadores del CEIEPP, que me ayudaron en el manejo de los animales. Por su apoyo y palabras de aliento a la Dra. Susana Espinosa y a la Dra. Alejandra Mercadillo, siempre maravillosas. A mis asesores, Dr. Sergio Angeles por apoyarme al realizar esta investigación y al Ing. José Luis Pablos por su ayuda para poder concluir este trabajo. A Jennifer Michel y Adriana Resendiz por su amistad y sus palabras de aliento en los momentos difíciles y por darme ánimos para seguir. Muchas gracias. RESUMEN Poco se sabe sobre los sistemas de alimentación y requerimientos nutricionales para los verracos; ya que una alimentación óptima permitirá al verraco alcanzar su máximo potencial genético y mantenerse saludable, que permita maximizar su eficiencia reproductiva relacionada a la cantidad y calidad de semen. Por lo que se planteó esta investigación para estudiar el efecto que tienen, el Zn orgánico e inorgánico, en los parámetros reproductivos de la especie, cuando son suplementados a la alimentación del verraco. El experimento incluyó 12 sementales de raza terminal, de 11 a 14 meses de edad, los cuales aleatoriamente se dividieron en cuatro tratamientos, donde se les suministró un producto comercial de Zn orgánico en diferentes dosis (100, 150 y 200 mg/Kg de alimento) y al grupo testigo se les administró Zn inorgánico (100 mg de óxido de Zn). Los verracos fueron alimentados con las dietas por 10 semanas. Se evaluaron los parámetros reproductivos volumen, motilidad en masa, integridad de acrosoma, integridad de membrana, anormalidades, concentración y número de dosis totales. Los datos de los parámetros reproductivos de los sementales se analizaron mediante un análisis de perfiles. En las variables evaluadas no se presentaron diferencias significativas (P>0.05) para los factores tratamiento y tiempo. Para la variable volumen no se encontró diferencia significativa (P= 0.5007); la variable motilidad en masa (P= 0.7051), no se encontró diferencia significativa; la variable integridad de acrosoma (P= 0.8877), no se encontró diferencia significativa; la variable integridad de membrana (P= 0.5083), no se encontró diferencia significativa; la variable anormalidades (P= 0.4964), no se encontró diferencia significativa; la variable concentración espermática (P= 0.7979), no se encontró diferencia significativa; y para la obtención de número de dosis totales (P= 0.6794), no se encontró diferencia significativa. Por lo cual se concluyó que a lo largo de las 10 semanas en estudio (P> 0.05), no se encontraron diferencias significativas. CONTENIDO 1. INTRODUCCIÓN 1 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 7 2.1 Generalidades 7 2.2 Requerimientos nutricionales del verraco 9 2.3 Características del Zinc 11 2.4 Metabolismo del Zinc 12 2.5 Función del Zn en la reproducción 14 2.6 Efecto de la deficiencia de Zn 16 2.7 Efecto tóxico del Zinc 17 2.8 Biodisponibilidad del Zn 18 2.9 Suplementación de Zn 20 2.10 Utilización de minerales orgánicos en la dieta para animales 21 3. JUSTIFICACIÓN 24 4. HIPÓTESIS 25 5. OBJETIVOS 26 6. MATERIAL Y MÉTODOS 27 6.1 Planteamiento experimental 27 6.2 Material 30 6.3 Área de potro 30 6.4 Fase de laboratorio 31 6.5 Análisis estadístico 34 7. RESULTADOS 42 7.1 Volumen 42 7.2 Motilidad en masa 44 7.3 Integridad de acrosoma 46 7.4 Integridad de membrana 48 7.5 Anormalidades 50 7.6 Concentración espermática 52 7.7 Número de dosis54 8. DISCUSIÓN 56 8.1 Volumen de eyaculado 57 8.2 Motilidad en masa 58 8.3 Integridad de acrosoma 59 8.4 Integridad de membrana 59 8.5 Anormalidades 60 8.6 Concentración espermática 60 8.7 Número de dosis 61 8.8 Calidad seminal 62 9. DIARREA EPIDÉMICA PORCINA (DEP) 66 9.1 Generalidades del virus de DEP 66 9.2 Observaciones durante la presencia de DEP 67 10. REFLEXIONES 70 11. CONCLUSIONES 72 12. REFERENCIAS 73 LISTA DE CUADROS Y TABLAS Cuadro 2.1 Energía 9 Cuadro 2.2 Aminoácidos (Base Total) 10 Cuadro 2.3 Minerales 10 Cuadro 2.4 Vitaminas 11 Cuadro 2.5 Ácido Linoléico 11 Cuadro 6.1 Ingredientes de dieta base 28 Cuadro 6.2 Valores esperados en la evaluación seminal 33 Cuadro 6.3 Escenarios y valores τi/σ que cumplen con las condiciones de Gill para aplicar el método de Tang 35 Cuadro 6.4 Error tipo II, β, en función del número de 20 repeticiones 36 Cuadro 7.1 Análisis de perfiles del volumen (g) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio 42 Tabla 7.1 Medias de volumen (g) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio 43 Cuadro 7.2 Análisis de perfiles de motilidad en masa (%) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio 44 Tabla 7.2 Medias de motilidad en masa (%) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio 45 Cuadro 7.3 Análisis de perfiles de integridad de acrosoma (%) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio 46 Tabla 7.3 Medias de integridad de acrosoma (%) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio 47 Cuadro 7.4 Análisis de perfiles de prueba de Host corto (%) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio 48 Tabla 7.4 Medias de la prueba de Host corto (%) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio 49 Cuadro 7.5 Análisis de perfiles de anormalidades (%) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio 50 Tabla 7.5 Medias de anormalidades (%) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio 51 Cuadro 7.6 Análisis de perfiles concentración (miles de millones de células) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio 52 Tabla 7.6 Medias de concentración espermática (miles de millones de células – mmc-) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio 53 Cuadro 7.7 Análisis de perfiles número de dosis (unidad/tubo) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio 54 Tabla 7.7 Medias de número de dosis (unidad/tubo) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio 58 Tabla 8.1 Valores de referencia para verracos jóvenes 62 Tabla 8.2 Valores obtenidos verracos Tx. 1 63 Tabla 8.3 Valores obtenidos verracos Tx. 2 63 Tabla 8.4 Valores obtenidos verracos Tx. 3 64 Tabla 8.5 Valores obtenidos verracos Tx. 4 64 Tabla 9.1 Generalidades DEP 67 EVALUACIÓN SEMINAL DE CADA TRATAMIENTO 83 Anexo 1 Tratamiento No. 1: Zn orgánico, PLEXOMIN 83 Anexo 2 Tratamiento No. 2: Zn orgánico, PLEXOMIN 84 Anexo 3 Tratamiento No. 3: Zn orgánico, PLEXOMIN 85 Anexo 4 Tratamiento No. 4: Zn inorgánico, ÓXIDO DE ZINC 86 COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LA DIETA BASE EMPLEADA EN LA ALIMENTACIÓN DE LOS SEMENTALES 87 Anexo 5 Tratamiento No. 1: Zn orgánico, PLEXOMIN 87 Anexo 6 Tratamiento No. 2: Zn orgánico, PLEXOMIN 88 Anexo 7 Tratamiento No. 3: Zn orgánico, PLEXOMIN 89 Anexo 8 Tratamiento No. 4: Zn inorgánico, ÓXIDO DE ZINC 90 LISTA DE GRÁFICAS Gráfica 7.1 Perfiles de las medias de volumen (g) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio 42 Gráfica 7.2 Perfiles de las medias de motilidad en masa (%) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio 44 Gráfica 7.3 Perfiles de las medias de integridad de acrosoma (%) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio 46 Gráfica 7.4 Perfiles de las medias de la prueba de Host corto (%) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio 48 Gráfica 7.5 Perfiles de las medias de anormalidades (%) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio 50 Gráfica 7.6 Perfiles de las medias de concentración (miles de millones de células) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio 52 Gráfica 7.7 Perfiles de las medias de número de dosis (unidad/tubo) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio 54 1 1. INTRODUCCIÓN Se considera que la carne decerdo es la más consumida a nivel mundial, su producción duplicó a la de res y es más del doble que la de pollo. El volumen de producción anual global de cerdo es poco menos de 100 millones de toneladas. En el 2005, el consumo per capita de carne de cerdo fue de 16 kg, sólo en los países desarrollados el promedio es de 20, 30 y hasta 40 kg. Los principales productores de carne de cerdo a nivel internacional son China, Europa, Estados Unidos y Brasil. Los mayores exportadores de carne de cerdo son la Unión Europea, seguida por Estados Unidos, Canadá y Brasil (Bobadilla et.al., 2010). Debido a sus excelentes propiedades nutricionales y a avances en producción y procesamiento de carne de cerdo, ya existen ciertos cortes que son considerados hoy en día como carne blanca. Es decir, muchos cortes magros de cerdo tienen niveles similares de grasa a una pechuga de pollo sin piel. Los productores comerciales de cerdo han hecho más eficiente la alimentación y las prácticas de crianza para entregar carne más magra a un mercado cada vez más preocupado por su salud (Cabello et.al., 2010). A nivel nacional, en el año 2008 hubo un ligero crecimiento en los niveles de importación de productos porcícolas (13.4%), situando el componente externo del abasto del mercado mexicano en el 37.5%, en si 649,100 toneladas (Tons). Por su parte, las exportaciones de carne mexicana de cerdo mantuvieron una importante tendencia de crecimiento, situación debida a la especificidad del mercado que provee en Japón, Corea y los EUA. Las ventas mexicanas de carne y productos 2 porcinos en 2008 fueron del orden de las 67,800 tons. En el año 2008 el consumo nacional aparente de carne y productos porcinos en México fue de 1, 730, 200 tons, manteniéndose una participación del 25% dentro del consumo general de carnes en el país (SAGARPA, 2009). En cuanto a las exportaciones, también se prevé un incremento impulsado por la recuperación económica de Japón y la creciente demanda del mercado chino, que si bien es muy probable que esta demanda sea cubierta por los grandes exportadores, también es cierto que abrirá oportunidades a los exportadores mexicanos (Cabello et.al., 2010). Dentro de la producción y rentabilidad porcina, la reproducción constituye uno de los factores principales y de los más importantes a ser considerados. Por lo que, se ha establecido que la producción eficiente de carne magra es el principal objetivo dentro de la explotación porcina y ésta depende de la eficiencia reproductiva; por esta razón, se hace indispensable mencionar la importancia del verraco en cualquier sistema productivo porcino que se incline hacia la calidad y la eficiencia. La tarea del verraco es cubrir y gestar al mayor número de hembras; y de sus características genéticas dependerá la potencialidad productiva que le herede a su descendencia, y también dependerá de acuerdo a sus condiciones de manejo, la salud reproductiva de la cerda servida, bien sea, por inseminación artificial (I.A.) o monta natural, como de la sobrevivencia de su progenie durante la gestación o post – parto. El verraco no sólo es utilizado como productor de semen, también desempeña funciones como reconocimiento de celo, al estimular la acción natural 3 del reflejo de inmovilidad en la cerda, madurez sexual de las mismas y el inicio del celo post – destete. El verraco es manejado como una unidad productiva de gran importancia dentro de la explotación y que afecta directa (a través de monta natural) o indirectamente (a través del semen) el rendimiento de la misma. Un verraco puede generar en monta natural 1000 lechones/año y con I.A. pueden ser varios miles de lechones/año; desde el punto de vista de la relación macho – hembra, en monta natural se necesita un verraco por cada 20 a 30 cerdas y en I.A. su relación es un macho por cada 50 a 200 cerdas (Carpio et.al., 2010). Para la selección de sementales, las principales características que se evalúan son el resultado de pruebas de comportamiento en engorda. En dichas pruebas se evalúan las siguientes características: Velocidad de crecimiento, la cual se establece con los días que el cerdo tarda en alcanzar 105Kg de peso a partir de los 20Kg El espesor de la grasa dorsal, medido a la altura de la 10a costilla al momento del pesaje final La conversión alimenticia, medida en forma individual o como máximo dos hermanos del mismo corral A partir de estos datos es factible estimar características de la canal como el rendimiento de cortes magros, sin necesidad de sacrificar animales. Además se evalúan otras características como son las morfológicas, entre ellas: Estado general de salud Conformación general 4 Aplomos Número de tetas Tamaño testicular Tamaño y conformación del prepucio (Trujillo et.al., 2002). Existen numerosas razas de cerdos y en ocasiones es difícil determinar cuál o cuáles son las más convenientes para una unidad de producción. Al elegir una raza de cerdos deben considerarse los siguientes factores: • Disponibilidad de un ganado reproductor adecuado • Fecundidad elevada y capacidad de cruzamiento • Capacidad adecuada de desarrollo • Activo temperamento pero dócil • Calidad excelente de la canal • Asimilación adecuada de los alimentos • Demanda en el mercado • Resistencia a las enfermedades Es difícil que una sola raza reúna todas estas características mencionadas anteriormente; sin embargo, deben considerarse como un punto diferencial para la selección de los animales que mejor se adapten a las condiciones de la unidad de producción (SAGARPA, 2010). Muchas empresas, que producían anteriormente razas puras, ahora han introducido líneas comerciales, ya que aumentaron el tamaño de su piara ampliando su base al mejorar sus métodos de selección, aprovecharon las ventajas comerciales de la heterosis al producir animales híbridos y mejoraron la 5 salud de sus piaras. Estas compañías tienen una serie de hatos de alta genética y salud (súper núcleos), con lo cual pueden ofrecer a los productores comerciales sementales y hembras de alta calidad. En el caso de los machos existe una mayor variación en el tipo de sementales de línea comercial que ofrecen; entre las más conocidas están los siguientes híbridos: Duroc con Hampshire Hampshire con Duroc Duroc con Large White Pietrain con Duroc Pietrain con Large White Pietrain con Hampshire Landrace Belga con Large White Landrace Alemán con Large White Pietrain, Duroc y Large White La principal característica de este tipo de machos es que provienen de líneas consanguíneas y desarrolladas en muchos casos por medio de marcadores genéticos. Estos machos aportan a la progenie de un sistema comercial una mayor velocidad de crecimiento, mejor conversión alimenticia y sobre todo mejores características de la canal, como rendimiento magro, cortes magros y peso del jamón, entre otras. Sin embargo, existen compañías que utilizan sementales de razas puras como Duroc, Hampshire, Landrace Belga y Large White principalmente (Trujillo et.al., 2002). 6 A pesar de la importancia del verraco se le ha prestado poca atención en relación a las reproductoras desde el ámbito científico. En concreto, los conocimientos acerca de los requerimientos nutricionales de los verracos son limitados; ya que la mayoría de las granjas porcinas carecen de un programa específico de alimentación para sus verracos. Normalmente se utiliza la misma dieta que reciben las cerdas gestantes y los niveles de alimentación que se establecen dependen de la condición corporal del animal, incrementando o disminuyendo la cantidad de alimento suministrado. Las razones para este tipo de alimentación son por facilidad, bajo costo de alimentación y la falta de información que contraindique esta práctica. En cualquier sistema de alimentaciónque se practique, se debe tener presente que las diferentes raciones alimenticias o la cantidad de nutrientes que se suministren, no alterará la capacidad genética del animal y su habilidad de transmitirla a sus descendientes. Un sistema óptimo de alimentación permitirá al verraco alcanzar su máximo potencial genético y mantenerse en un estado óptimo de salud, que permita maximizar su eficiencia reproductiva relacionada a la cantidad y calidad del semen, especialmente para ser usados en inseminación artificial (Carrión et.al., 2001; Campabadal, 2009). 7 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.1 Generalidades La alimentación en algunos casos, es determinante en el comportamiento sexual de los verracos (libido, dificultad en la monta, longevidad, cantidad y calidad de semen, etc.) Algunos aspectos funcionales claves a mejorar en reproducción y su posible relación con la nutrición son: Mejora de aplomos: los problemas de aplomos dan como resultado falta de libido e incapacidad del macho para la monta, una elevada tasa de eliminación por cojeras. Controlar la condición corporal, para evitar sobrepeso. Mantener una óptima relación Ca/P para una correcta mineralización ósea (1.3-1.5:1). Niveles adecuados de vitamina D para facilitan la absorción de Ca y P (aportada en forma de 25-OH-colecalciferol, facilita su biodisponibilidad). El aporte de biotina garantiza la integridad del tejido córneo de los cascos. Libido: la hormona tiroidea regula el metabolismo basal y afecta específicamente a la reproducción. Es recomendable la inclusión de yodo en la dieta (0.5-0.8 mg/kg) y evitar la presencia de micotoxinas como la zearalenona, que interfiere en el proceso normal de espermatogénesis, reduciendo la síntesis de testosterona. Calidad espermática: el Zn tiene un papel importante en la espermatogénesis y en el proceso de maduración de las células de Leydig, responsables de la 8 síntesis de testosterona. Es conveniente la adición de Zn (100 ppm). La inclusión en el alimento de dosis efectivas de vitamina E, vitamina C y selenio, así como la de polifenoles naturales que se utilizan en parte como un sustituyente de la vitamina E, para reforzar el estado antioxidante en animales de alto rendimiento, ayudan al mantenimiento de la integridad de la membrana espermática. (Valentí, 2011; NUGASUR, 2014). Volumen de eyaculado: La suplementación con vitamina B6 y ácido fólico mejoran la producción seminal y la proporción de células espermáticas con motilidad. Los aminoácidos azufrados juegan un importante papel sobre la actividad secretora del epidídimo (Valentí, 2011). Como para cualquier proceso biológico, garantizar un estado nutricional adecuado resulta de suma importancia para la producción de semen. Una dieta cuantitativa o cualitativamente deficiente puede derivar en una disminución de la producción y calidad seminal así como un descenso de la líbido. Las necesidades nutricionales del verraco dependen de numerosos factores, (edad, raza, época del año, temperatura o nivel de explotación) no obstante, se consideran aportes adecuados de alimento de 2-2.5 Kg para verracos jóvenes y de 2.2- 3.2 Kg en el macho adulto. Para evaluar el efecto de la nutrición en la producción espermática, se debe tener en cuenta que la espermatogénesis es un proceso que requiere entre 25 y 34 días. Además, los espermatozoides necesitan entre 10 y 14 días para recorrer el epidídimo. Por ello cuando se evalúa el efecto de la nutrición sobre la 9 calidad de espermatozoide se evalúa entre 35 y 50 días, después del tratamiento (Carrión et.al., 2001). Los requerimientos minerales del verraco pueden ser subdivididos en dos áreas: 1) requeridos para crecimiento y desarrollo, y 2) requeridos para producción espermática. No se esperaría que el verraco tenga diferentes requerimientos que los de la cerda cuando los requerimientos son expresados sobre una base de cantidad de crecimiento / tejido. El otro tejido en el verraco que, sin embargo, difiere del otro sexo corresponde a los testículos, que como sería de esperarse requieren diferentes nutrientes que los demás tejidos blandos del cuerpo. Por tal razón esta es el área donde la nutrición puede aportar la mayor contribución al verraco (Mahan et.al., 2009). 2.2 Requerimientos nutricionales del verraco: A continuación se describen brevemente los requerimientos nutricionales del verraco en etapa reproductiva, de acuerdo con NRC (2012): Cuadro 2.1 Energía Energía Neta en la dieta 2,475 kcal/kg Energía Digestible en la dieta (eficaz) 3,402 kcal/kg Energía Metabolizable en la dieta (eficaz) 3,300 kcal/kg Ingesta estimada de Energía Metabolizable 7,938 kcal/día Consumo de alimento estimado + desperdicio 2,500 g/día 10 Cuadro 2.2 Aminoácidos (Base Total) Aminoácido %/kg g/día Aminoácido %/kg g/día Arginina 0.25 5.83 Fenilalanina 0.42 9.96 Histidina 0.18 4.30 Fenilalanina + Tirosina 0.70 16.55 Isoleusina 0.37 8.81 Treonina 0.28 6.70 Leucina 0.39 9.20 Trioptófano 0.23 5.42 Lisina 0.60 14.25 Valina 0.34 8.01 Metionina 0.11 2.55 Nitrógeno Total 1.41 33.48 Metionina + cisteína 0.31 7.44 Cuadro 2.3 Minerales Mineral %/kg g/día Mineral mg/kg mg/día Ca Total 0.75 17.81 Cobre 5 11.88 Fósforo Total 0.75 17.81 Yodo 0.14 0.33 Sodio 0.15 3.56 Hierro 80 190 Cloro 0.12 2.85 Manganeso 20 47.5 Magnesio 0.04 0.95 Selenio 0.30 0.71 Potasio 0.20 4.75 Zinc 50 118.75 11 Cuadro 2.4 Vitaminas Mineral cantidad/kg cantidad/día Mineral cantidad/kg cantidad/día Vitamina A 4,000 UI 9,500 UI Niacina (disponible) 10mg 23.75mg Vitamina D 200 UI 475 UI Ácido pantoténico 12mg 28.50mg Vitamina E 44 UI 104.5 UI Riboflavina 3.75mg 8.91mg Vitamina K (menadiona) 0.50mg 1.19mg Tiamina 1.0mg 2.38mg Biotina 0.20mg 0.48mg Vitamina B6 1.0mg 2.38mg Colina 1.25mg 2.97mg Vitamina B12 15µg 35.63µg Folacina 1.30mg 3.09mg Cuadro 2.5 Ácido Linoléico %/kg %/día Ácido Linoléico 0.1 2.38 2.3 Características del Zinc. El zinc es un ión metálico esencial para la vida, pequeño, hidrofílico, incoloro y diamagnético, constituyente de un gran número de proteínas, incluidas las enzimas. Es un micronutriente crítico, desde el punto de vista fisiológico, sus funciones abarcan una infinidad de actividades, como: almacenamiento y 12 liberación de insulina; confiere integridad a la membrana celular; interviene en procesos de maduración sexual y en la reproducción; participa en actividades de sensibilidad olfativa y gustativa; activo componente de la función tiroidea y de los procesos de coagulación sanguínea, y crucial para la respuesta inmunitaria (Maret, 2001; Andreini, 2006; Molokwu, 2006). Se encuentra en grandes concentraciones en tejidos del aparato reproductor del verraco, particularmente en testículos, próstata y espermatozoides (Mejía, 2007). Juega un papel importante en la espermatogénesis, en la respuesta a la LH, desarrollo de las células de Leydig y en la producción de esteroides a nivel testicular por lo que se recomiendan niveles de al menos 100 mg/kg (Carrión et.al., 2001). 2.4 Metabolismo del Zinc. Absorción: en el aparato digestivo el Zn se encuentra en forma libre, y en pequeñas cantidades se une a fosfatos, aminoácidos y ácidos orgánicos, los cuales son absorbidos principalmente en la región duodenal y parte proximal del yeyuno (Krebs, 2000) y se realiza a través de los enterocitos, y mediante su membrana basolateral se transporta hacia la circulación porta (Hernández, 2006). El Zn puede ser limitado por el contenido de fitatos, Ca y/o P. Por ello se recomienda utilizar una fuente externa de Zn en la dieta, dependiendo edad y estado fisiológico (Spears, 1996). Almacenamiento: Una vez absorbido, es transportado por la albúmina del plasma sanguíneo, y por algunas proteínas vinculantes como la transferrina y glicoproteínasricas en histidina (Cousins, 1995). Regalla y Lyons (2005) 13 estudiaron la forma en que se distribuye el Zn en la célula, y encontraron que el Zn es lábil, cambia rápidamente de ligaduras, y por ello se disocia y asocia con facilidad. El Zn por tanto se distribuye y poco tiempo se mantiene libre. El Zn se absorbe y almacena por todo el cuerpo en las vesículas citoplasmáicas y la concentración puede variar de especie a especie. Aunque, el aparato reproductor no suele ser elegido para almacenar grandes cantidades de Zn, su concentración se modifica según sea el consumo y absorción. En la medida en que se aumenta el consumo, se eleva la concentración en el tejido testicular, epididimario y prostático, así como en sus secreciones. En los testículos, cuando una dieta es baja en Zn, se genera una disminución aproximadamente del 11% en el parénquima (Evenson et.al., 1993). Movimiento y excreción: el Zn es retirado rápidamente de la sangre por los tejidos; las células expulsan el Zn a través de mecanismos de activación de genes transportadores. Las secreciones pancreáticas, biliares, gastroduodenales, del flujo trans-epitelial de los enterocitos intestinales o de otro tipo de células, así como las descamaciones células de la mucosa se convierten en una fuente endógena de Zn excretado que actúa equilibrando el contenido celular (Cousins, 2006). El páncreas y la bilis son mecanismos eficientes para la eliminación del Zn, ya que al ser excretados a través de su función exocrina llega al intestino delgado y de ahí es eliminado vía heces (Gralak, 2002, Hernández, 2006). La excreción de Zn se produce principalmente por vía fecal y aunque por la vía urinaria se excreta poca cantidad de Zn, esta suele ser definitiva y rápida. Otras vías de excreción 14 son el cabello, sudor, descamación de piel, bilis y plasma seminal (Bedwal et.al., 1994). 2.5 Función del Zn en la reproducción. Testículo: el efecto del Zn en el parénquima testicular se ve reflejado en los conductos seminíferos, una deficiencia afecta su desarrollo, además de intervenir en los mecanismos de inhibición de los factores de Müller y en la diferenciación testicular, por lo tanto el Zn contribuye al desarrollo y densidad de los túbulos seminíferos y participa en el crecimiento de los testículos. La concentración de Zn parece estar influenciada por la actividad sexual, por lo que el contenido de Zn en el parénquima testicular es mayor en los animales adultos que en los prepúberes (Bedwal y Bahuguna, 1994). Epidídimo: Henkel et al., (2003), descubrieron que existían dos proteínas en el epidídimo que unen al Zn, y señalaron que su concentración era cinco veces mayor en la cabeza que en la cola del epidídimo, sugiriendo que tienen una función biológica de movilizar al Zn una vez expulsado de la cola del espermatozoide. También, demostraron que el Zn que se encuentra en las células basales de epidídimo pertenece al espermatozoide; por lo tanto si el epidídimo no produce estas proteínas o sus mecanismos de excreción-absorción, son disfuncionales, el Zn puede acumularse y producir la pérdida de la homeóstasis del ión; el Zn puede reabsorberse en pequeñas cantidades en secciones del epidídimo, como la cola. El epidídimo contiene mecanismos que evitan la oxidación de las membranas espermáticas y daños en el ADN. Estos mecanismos 15 se relacionan con la superóxido dismutasa y la glutatión peroxidasa, enzimas que tienen como parte importante de su molécula al Zn. Próstata: es considerada como el órgano que mayor contenido de Zn presenta en todo el organismo (Quiles y Hevia, 2004). La próstata disminuye su peso al disminuir la concentración de Zn en ella. El crecimiento celular de este órgano es controlado a través de la inhibición de la actividad de la aconitasa mitocondrial, regulada por el Zn (el Zn inhibe la enzima metabólica, aconitasa, dentro de las mitocondrias de las células epiteliales de la próstata; mediante el bloqueo de la aconitasa, el zinc acorta el ciclo del ácido cítrico, que son la serie de reacciones necesarias para producir trifosfato de adenosina -ATP-). Asimismo, el contenido de Zn aumenta en el plasma seminal, cuando existe cambio en la absorción de este metal en el tejido prostático (Iguchi et.al, 2004; LABMEDICA, 2014). Espermatozoide: La cola del espermatozoide contiene más del 93% del Zn total, localizado especialmente en las fibras densas externas. Estas se extienden a lo largo del 60% de la longitud de la pieza principal de la cola del espermatozoide y están constituidas de proteínas estructurales que contienen una gran cantidad de cisteína. En el testículo, el Zn se une al grupo -SH de la cisteína y forma el complejo Zn-tiol, con objeto de que las fibras densas externas no se oxiden. Durante la maduración en epidídimo, el 60% del contenido mineral es expulsado y a continuación el grupo -SH es oxidado para formar puentes disulfuro (S-S), estabilizando y endureciendo las fibras densas externas (Henkel et.al., 2003). Los espermatozoides tienen un sistema muy eficaz para utilizar la energía. La incorporación de grandes cantidades de Zn protegen a las fibras densas externas 16 y la posterior expulsión del mineral, una vez que estos se hayan endurecido (durante la espermiogénesis), se convierten en un potencial regulador del gasto energético, a través de transformación de la energía en un movimiento vigoroso que desplaza a los espermatozoides de forma rápida y progresiva. El contenido de Zn en la cabeza corresponde al 7% del contenido total. Este Zn se encuentra en el ADN estabilizando la cromatina (Kvist et.al., 1987). Este contenido es cuatro veces mayor al contenido en el plasma seminal (Bedwal et.al., 1994). En los procesos de meiosis y espermiogénesis el Zn impide daños en la célula, ya que le confiere protección y apoya la síntesis de ADN espermático (Molokwu y Li, 2006). 2.6 Efecto de la deficiencia de Zn. El Zn es un citoprotector y evita la apoptosis celular a través del control de las caspasas (son enzimas proteolíticas que contienen cisteína y fracturan los sustratos, están implicadas en la apoptosis).Por tanto, al existir una deficiencia de Zn se puede encontrar disminución en crecimiento, pérdidas de peso, anormalidades del esqueleto, anorexia, disfunción inmune, degeneración ocular macular, alopecia, dermatitis, hiperqueratosis, retraso en la cicatrización de heridas, baja líbido, oligospermia y hasta infertilidad en los verracos (Mateos et.al., 1998; Taleisnik, 2006; Samuelson et.al., 1999; Molokwu, 2006; Mejía, 2007). Iguchi et al. (2004), señalan la relación que tiene una deficiencia de Zn con el hipogonadismo, acompañada de la inhibición de la espermatogénesis por disminución de testosterona. El mecanismo que puede provocar el hipogonadismo 17 y reducción en el desarrollo de los túbulos seminíferos, estaría relacionado con la inhibición de la división celular durante la mitosis ocasionada por deficiencia de Zn (Murakami et.al., 2008). En túbulos seminíferos el daño es irreversible, provocando esterilidad (Evenson et.al., 1993; Bedwal et.al., 1994). Underwood y Suttle (2003), indican pérdida de líbido en verracos, que es el tiempo que tarda en realizar la monta del maniquí. Se valora desde que el verraco entra en la sala hasta que salta sobre el maniquí de colecta. Verracos con baja libido, no muestran interés por el maniquí o se distraen fácilmente deben ser examinados para descartar posibles lesiones o patologías, y junto con la calidad seminal determinar si son aptos o no como productores de semen (De Alba, 2010). La falta de libido se presenta principalmente en cerdos jóvenes, que no tienen la edad adecuada para que el patrón hormonal desarrolle la conducta de interés sexual (<6 meses de edad), y en cerdos que tienen la edad adecuada pueden faltar los estímulos necesarioso presentarse diversos factores como un corral de difícil acceso, muchas distracciones, experiencias negativas anteriores (agresión por parte de cerdas), cerdas no en celo o un manejo violento por parte del trabajador; la forma de crianza (corrales individuales), falta de socialización (Trujillo et.al., 2002). 2.7 Efecto tóxico del Zinc. Algunos mecanismos de toxicidad de Zn están relacionados con la sustitución de este ión por otros cationes en enzimas no dependientes, inactivándolas. 18 Según Szabó et al. (2004) los cerdos tienen una alta tolerancia a consumos de Zn en exceso. Sin embargo, se ha observado que dependiendo de la fuente (como óxido de Zn) con la que se realice este exceso se puede presentar con mayor facilidad una toxicidad. Cerdos que han consumido excesos de Zn (>200 ppm por 42 días), suelen incrementar la concentración de este mineral en hígado, riñón y páncreas. Sin embargo, en piel, hueso y músculo no se observa un aumento significativo (Rojas et.al., 1995; Schiavon et.al., 2000). 2.8 Biodisponibilidad del Zn. Windisch (2002) menciona que es más correcto hablar de biodisponibilidad de la ración en su conjunto, en vez de cada una de las materias primas separadamente, aunque alguna de ellas aporte la mayor parte del Zn, por tres razones fundamentales: 1. El zinc se absorbe según las necesidades del animal. 2. En el intestino el fitato forma junto con el zinc complejos no absorbibles. 3. El grado de interacción del fitato con el zinc depende del nivel de calcio de la ración. El Zn presente en cereales tiene biodisponibilidad baja (60%) para los cerdos, (Baker y Ammerman, 1995), encontrándose la mayor biodisponibilidad en las fuentes proteicas de origen animal libre de fitatos. Si bien, en este último caso la 19 biodisponibilidad puede disminuir cuando se mezclan con sustancias ricas en fitatos y suplementos de calcio. Tucker y Salmón (1955) descubrieron que cuando las raciones a base de maíz y soya eran suplementados con un 1.5% de carbonato cálcico, fosfato cálcico y un 2% de harina de hueso en distintos tratamientos, disminuía el crecimiento y aumentaban las lesiones de paraqueratosis en cerdos. Sin embargo, todo ello se corregía cuando se suplementaba con zinc. Por otra parte, los efectos negativos de los fitatos podrían reducirse disminuyendo el aporte del calcio y fósforo en las raciones, aumentando la exposición a las fitasas vegetales, aportando fitasas microbianas o utilizando vitamina D3 hidroxilada para estimular la eficacia de las fitasas (Lei et al., 1993; Adeola et al., 1995, Welch, 1997). En este sentido, los recientes estudios llevados a cabo por Windisch et al., (2003) quienes comprobaron como la adición de fitasas a la ración de lechones mejora la biodisponibilidad del zinc. Otros estudios de biodisponibilidad de Zn han sido llevados a cabo con dietas que contienen caseína, huevo blanco o soya, ya que utilizar dietas semipurificadas para cerdos es muy costoso. Además, estudios realizados con cerdos no han demostrado diferencias en la biodisponibilidad de Zn entre fuentes orgánicas e inorgánicas. Sin embargo, se ha documentado una marcada diferencia en las dietas de aves de corral alimentadas con dietas a base de maíz, soya y Zn a partir de Zn-metionina (Wedekind et al., 1994). 20 2.9 Complementación de Zn. Al complementar la ración de cerdos con zinc podemos utilizar fuentes inorgánicas u orgánicas. Entre las primeras las más utilizadas se encuentran el óxido de zinc y el sulfato de zinc de calidad alimentaria. Mientras que entre las fuentes orgánicas destacamos los complejos Zn:metionina, Zn:lisina y Zn:picolinato, los cuales actúan protegiendo al zinc frente a los antagonistas naturales como son los fitatos (Quiles, 2009). Sin embargo, no está totalmente claro cuál de ambas fuentes es mejor al momento de complementar la ración del cerdo, ya que los estudios de Hill et al., (1986) no detectaron ninguna diferencia entre la administración de Zn:metionina vs. la administración de sulfato de zinc, cuando eran añadidos a raciones basales en cerdos en crecimiento. Igualmente, Swinkels et al., (1996) no encontraron ninguna diferencia entre fuentes inorgánicas (sulfato de zinc) y fuentes orgánicas (Zn:aminoácidos). Horký et al. (2011) realizó una investigación utilizando Zn orgánico e inorgánico en verracos, donde registró un 39.51% de aumento en la cantidad de eyaculado en los cerdos suplementados con Zn orgánico, mientras que en los suplementados con Zn inorgánico sólo un 29.93% de aumento. En cuanto a la concentración, el grupo experimental tuvo una ligera disminución. Ambos no presentaron cambios significativos en espermatozoides anormales. 21 2.10 Utilización de minerales orgánicos en la dieta para animales. Para poder efectuar sus funciones vitales los animales requieren el aporte de una diversidad de nutrientes esenciales, que se encuentran en principio en los vegetales. En el caso de los minerales traza como el cobre, cobalto, zinc, manganeso, hierro y selenio, los vegetales los toman del suelo y los incorporan a ciertas estructuras proteicas. A través de la evolución, los sistemas digestivos de los animales se han adaptado a la asimilación de estas formas de micronutrientes presentes en las plantas. Las dietas de los animales son complementadas con fuentes inorgánicas de minerales traza (selenitos, sulfatos, óxidos y carbonatos), que por su forma química pueden experimentar una diversidad de interacciones con otros componentes dietarios en el medio gastrointestinal; estas se traducen con frecuencia en una asimilación insuficiente de estos minerales, estados sub óptimos de salud y productividad en los animales; así como una eliminación al entorno de cantidades significativas de minerales que entonces pueden fungir como contaminantes. Para aumentar su disponibilidad biológica, los minerales traza pueden unirse o incorporarse a ligandos; moléculas que estabilizan sus cargas eléctricas y les permiten llegar en mayor proporción a los sitios de absorción, para que una vez ahí faciliten su paso hacia los enterocitos. Los aminoácidos y péptidos pequeños se consideran excelentes ligandos para los minerales traza de interés en nutrición animal. (Arrieta, 2011). 22 Los animales se fueron adaptando para digerir y absorber fuentes de minerales orgánicos a partir de materiales vegetales (cereales y forrajes) en los cuales los minerales traza (oligoelementos) presentan un enlace activo dentro de las enzimas o proteínas de la planta. Sin embargo, durante los últimos 60 años la industria de alimentos ha estado suministrando al animal principalmente minerales traza a partir de fuentes de sales inorgánicas de inferior biodisponibilidad, tales como sulfatos y óxidos. Cabe señalar que los quelatos son formas orgánicas de minerales esenciales como el cobre, hierro, manganeso y el zinc. La formación de quelatos es crítica para proteger la solubilidad del mineral durante la digestión. Este proceso de quelación de los minerales en aminoácidos y péptidos resulta en la formación de proteinatos. Esta tecnología es superior a la de otros quelatos porque mejora su biodisponibilidad y los protege contra reacciones antagónicas en las vías digestivas. Hoy en día los minerales “orgánicos” quelatados convertidos en proteinatos (resultado de la unión de una sal metálica soluble con un aminoácido) están disponibles a nivel comercial, haciendo posible el suministro de minerales traza de forma natural. Estos avances han abierto nuevas oportunidades para examinar la nutrición mineral, especialmente el uso de minerales quelatados y los beneficios de suplementar el alimento con formas “orgánicas” en contraposición con las formas inorgánicas comunes, a fin de satisfacer las demandas nutricionales con los estándares modernos de producción(Alltech, 2011). Se han desarrollado nuevos productos de forraje con biotecnología (sorgo, alfalfa y maíz forrajero), así como fuentes de macro y microelementos en forma orgánica 23 para la aplicación en la alimentación de las raciones. Estas fuentes representan factores de nutrición que puede influir favorablemente en la utilización de los nutrientes (digestibilidad y retención) y mejorar la calidad y cantidad de la producción. Debido a que su disponibilidad para los organismos es mayor que la de las sales inorgánicas, su excreción desde el cuerpo es más baja y por lo tanto existe un menor riesgo de contaminación ambiental (Zeman, 2004). En la formulación de alimentos para el ganado porcino existe gran variedad de materias primas (cereales, pastas proteicas, subproductos, grasas y/o aceites y minerales) que pueden utilizarse, pero la mayoría de las raciones equilibradas que se obtienen aún son deficientes en oligoelementos y vitaminas, por lo que es necesaria la corrección de dichas deficiencias a través de la suplementación de una premezcla. Los porcentajes más habituales de incorporación de las premezclas al alimento final suelen ser del 0.2; 0.3; 0.4 y del 0.5% (Cordero et al., 2011). Nuevos conocimientos se han generado en la determinación de los requerimientos de minerales por los cerdos, pero la introducción de nuevas formas (orgánicas vs. inorgánicas) y la disponibilidad de estas formas han cambiando la visión de muchos elementos minerales. La alimentación en exceso de algunos minerales igualmente ha aumentado la preocupación sobre la creciente concentración de minerales en el suelo, y su acumulación en las aguas superficiales y del subsuelo, perjudiciales tal vez tanto para la vida humana como para la acuática (Majan, 1997). 24 3. JUSTIFICACIÓN Existe escasa información sobre el aporte de minerales orgánicos en la dieta y el efecto que tienen sobre el verraco en etapa reproductiva, ya que la ventaja que tienen los minerales orgánicos es que pueden unirse a ligandos, los cuales les permiten llegar en mayor proporción a los sitios de absorción, para que una vez ahí faciliten su paso hacia los enterocitos y así los minerales se absorban y se aprovechen al máximo. Ya que la eficiencia reproductiva es una de las funciones que se buscan en un semental dentro de la granja. 25 4. HIPÓTESIS El Zinc, como mineral orgánico, aportado en la dieta del verraco, mejorará la calidad espermática; tomando en cuenta los parámetros de la especie: Característica macroscópica: volumen de eyaculado varía de entre 125 a 500g. Características microscópicas: motilidad en masa por encima del 75%, con un valor límite del 60% (Gómez, 2010), integridad de membrana por medio de la prueba de Host corto, porcentaje aceptable de Host (+) en semen fresco va de un 30-70% (Pérez et al., 2010), integridad del acrosoma, anormalidades (<20%), concentración espermática (De Serrano et al., 1989) y por lo tanto, número total de dosis obtenidas. 26 5. OBJETIVOS Objetivo General: Evaluar el efecto del Zn orgánico contra el Zn inorgánico en la calidad del semen del verraco. Objetivos Particulares: - Evaluar el efecto del Zinc orgánico contra el Zinc inorgánico en el volumen del eyaculado del verraco. - Evaluar el efecto del Zinc orgánico contra el Zinc inorgánico en la motilidad espermática en masa del verraco. - Evaluar el efecto del Zinc orgánico contra el Zinc inorgánico en la integridad de membrana espermática del verraco. - Evaluar el efecto del Zinc orgánico contra el Zinc inorgánico en la integridad de acrosoma espermático del verraco. - Evaluar el efecto del Zinc orgánico contra el Zinc inorgánico en la presencia de anormalidades espermáticas del verraco. - Evaluar el efecto del Zinc orgánico contra el Zinc inorgánico en la concentración espermática del verraco. - Evaluar el efecto del Zinc orgánico contra el Zinc inorgánico en el número total de dosis seminales obtenidas del verraco. 27 6. MATERIAL Y MÉTODOS 6.1 Planteamiento experimental Este trabajo comprende los siguientes apartados: 1. Área de Nutrición: Se llevó a cabo en el Laboratorio del Departamento de Nutrición Animal y Bioquímica de la Facultad de Veterinaria y Zootecnia de la UNAM, para la determinación de zinc de las premezclas minerales (glicinato de zinc y óxido de zinc) se realizó mediante un análisis de espectrofotometría de absorción atómica y un Análisis Químico Proximal del alimento A, B, C y D que se utilizaron en las pruebas. Preparación de la muestra: La muestra fue deshidratada en un horno de aire forzado a una temperatura de 80°C durante 24 horas hasta peso constante, posteriormente fue molida en molino de granos Wiley Thomas utilizando una crina de 1mm. Se pesó por duplicado 1 gramo de muestra, se colocó en crisol de porcelana y se calcinó en mufla a 500°C durante 24 horas. Una vez calcinada la muestra a cada crisol se le agregó 15 ml de ácido clorhídrico 1+3 y se colocaron en parrilla de calentamiento a 250°C durante 10 minutos con el fin de llevar a cabo la digestión, se filtraron utilizando papel whatman No. 1 y fueron aforadas a 25 ml. 28 Determinación de Zinc: La determinación se llevó a cabo utilizando la técnica espectrofotometría de absorción atómica (AOAC 985.33, 2005) utilizando un espectrofotómetro Perkin Elmer TM modelo 3110, Northwark, E.U.A., con las condiciones específicas para la lectura del mineral (longitud de onda, slit, etc). El contenido de zinc fue reportado en ug/g (ppm). Además se realizó la dieta base elaborada con los requerimientos necesarios para la especie y etapa reproductiva que consistió en: Cuadro 6.1 Ingredientes de Dieta Base Ingrediente Porcentaje de inclusión sorgo molido 80.75% pasta de soya 13.8% aceite acidulado 2.50% Ortofosfato 1.37% carbonato de calcio 1.16% sal común 0.35% Toxisorb 0.02% premezcla de vitaminas premezcla mineral De acuerdo a lo que se utiliza en el CEIEPP, 0.5Kg/Ton Zn orgánico Considerando el porcentaje de inclusión del Zn en los diferentes tratamientos 29 2. Desarrollo experimental: - Área de Reproducción: Se llevó a cabo en el Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Producción Porcina (CEIEPP) de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM, ubicado en el Km. 2 de la carretera Jilotepec- Corrales, en Jilotepec, Estado de México. Se utilizaron 12 cerdos machos enteros, entre 11 a 14 meses de edad, los cuales aleatoriamente se dividieron en cuatro tratamientos, donde se les suministró un producto comercial de Zn orgánico1 en diferentes dosis y al grupo testigo se les administró Zn inorgánico (óxido de Zn). Tratamiento 1: tres cerdos suplementados con zinc orgánico, con la dosis recomendada por el producto comercial 150mg/kg de alimento Tratamiento 2: tres cerdos suplementados con zinc orgánico, con dosis por debajo de lo recomendado por el producto comercial 100mg/kg de alimento Tratamiento 3: tres cerdos suplementados con zinc orgánico, con dosis por encima de lo recomendado por el producto comercial 200mg/kg de alimento Tratamiento 4: tres cerdos suplementados con zinc inorgánico, con dosis recomendada por la NRC; el cual será el grupo control 118mg/kg de alimento A los cuales se les realizó una evaluación seminal basal y posteriormente se les proporcionó una dieta diaria en una porción de dos kilogramos de alimento al día en dos tomas (7 y 13 hrs); se suministró cada dieta 10 días sin evaluación seminal y posteriormente se colectó a cada semental 1 vez por semana (con un periodo 30 1 PLEXOMIN 26%, principio activo a base de Glicinato de Zn, Laboratorio Phytobiotics (Proporcionado por la empresa NUTRIPLAN) mínimo de descanso de cuatrodías), hasta obtener 10 evaluaciones por cada semental, en el Laboratorio del Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Producción Porcina (CEIEPP) de la FMVZ UNAM. 6.2 Material Material para proporcionar alimento de forma manual: 1. Alimento de cada grupo experimental (1, 2, 3 y 4) 2. Bolsas de plástico 3. Balanza 4. Cinta adhesiva y marcador Material para evaluación seminal: 1. Colección de semen: potro, termo con bolsa y filtro, guantes de vinilo, toallas desechables, tijeras. 2. Características macroscópicas: termoplatina, vaso de unicel, termómetro, báscula, tiras reactivas de pH. 3. Características microscópicas: microscopio, laminillas, tinciones, palillos, jeringas de 1ml, espectrofotómetro y posillos, tubos de ensayo, baño maría, agua destilada. 6.3 Área de potro Colección de semen: previamente se preparó un termo con bolsa y filtro atemperado, la colecta se realiza sobre un potro fijo situado en una sala habilitada 31 para tal efecto, así el animal se habitúo y se reduce el tiempo de salto simplificando el manejo al operario. La colecta se ha de realizar con el mayor grado de higiene que sea posible. Para ello debe vaciarse el divertículo prepucial con objeto de eliminar los restos de orina, lavar con agua y limpiar la zona con una toallita desinfectante y si es necesario recortar el pelo que se encuentra alrededor del orificio prepucial. Una vez colocado el guante no se debe tocar ningún objeto ni superficie para minimizar el riesgo de contaminación; el pene debe sujetarse colocando los dedos alrededor de la espiral del glande, ejerciendo tracción suavemente hasta su total extensión. Procurar mantener el pene de forma horizontal (en paralelo con el suelo) para evitar que por el escurra orina u otros contaminantes que caerían al termo de colecta. Una vez en este punto, el verraco dejará de empujar y comenzará a eyacular (Gómez, 2010). 6.4 Fase de Laboratorio Características macroscópicas: volumen: colocando la muestra de semen directamente sobre una balanza. olor: detectando directamente. color: observando directamente. pH: colocando una gota sobre una tira reactiva. temperatura: colocando en la muestra de semen directamente un termómetro. Características microscópicas: motilidad en masa: se coloca una gota del eyaculado sobre un portaobjetos atemperado en la termoplatina a 37ºC. Se observa al microscopio con el 32 objetivo 10x para determinar la motilidad total, que es el porcentaje de espermatozoides que se mueven en un primer golpe de vista. prueba de Host corto: consiste en someter a los espermatozoides a un medio de presión osmótica más baja que la fisiológica, la entrada de agua provoca un hinchamiento y, consecuentemente, un enrollado de flagelo dentro de la membrana (HOST+) (Pérez et al., 2010), donde se coloca un tubo de ensayo con una dilución de semen fresco (0.5ml) y agua destilada (1.5ml) y se incuba durante 30 minutos en baño maría, se observan en el microscopio con el objetivo 40x varios campos y se hace un recuento de 100 células observando el efecto de HOST (+). integridad del acrosoma: se coloca una gota de semen en un portaobjetos y una cantidad pequeña de las tinciones Eosina (2%) y azul de metileno (1%) con violeta de genciana (0.5%), mezclando con un palillo y realizando un frotis, en el microscopio se observa con el objetivo 40x, donde el acrosoma íntegro no se tiñe de color rosa. aglutinación: se valora observando diversos campos en el microscopio con el objetivo 10x y 40x, se consideran varios grados (Cuadro 2). anormalidades: se observan varios campos con el objetivo 40x, tomando en cuenta 100 células e identificar las malformaciones como morfología normal, anomalías de cabeza, anomalías de cola, gota citoplasmática proximal y distal. concentración espermática: se coloca una gota de semen en el posillo y se introduce en el espectrofotómetro SDM1, se muestra el resultado en la pantalla. 33 Cuadro 6.2 Valores esperados en la evaluación seminal Característica Rango Volumen 125 – 500 ml, valor límite de 50ml Color normal es de una tonalidad cremosa, si es muy claro indica una escasa concentración espermática. color amarillento por la presencia de orina rosáceo señala que hay sangre en el eyaculado Olor sui generis pH 7 a 7.8 con media de 7.4 (ligeramente alcalino). Motilidad en masa 75%, con un valor límite del 60% (estimación subjetiva). Aglutinación Grado 1: Un grupo de <20 espermatozoides. Grado 2: Dos grupos de <20 espermatozoides. Grado 3: Varios grupos de >20 espermatozoides. Integridad de membrana (Host corto) semen fresco de un 30-70%. Integridad de acrosoma 76-93% Anormalidades < 20% Concentración 6 – 10x108 espermatozoides/ml (Gómez, 2010; Pérez et al., 2010; De Serrano et al., 1989; Hafez et al., 2000). número total de dosis seminales: al determinar la concentración espermática, de cada colecta de los sementales, se puede estimar la cantidad de número de dosis totales que se podrían obtener, al aplicar las fórmulas: 34 Concent* Vol* Mot* Norm = TCV TCV/CDD = NDP Donde: Concent es “concentración”, medida en el espectrofotómetro. Vol es el volumen total del eyaculado. Mot es la motilidad obtenida al observar el eyaculado en el microscopio. Norm es la normalidad obtenida de un 100% al restar la anormalidad. TCV es el total de células viables. CDD es la cantidad de células deseadas por dosis (3000). NDP es el número de dosis posibles. 6.5 Análisis estadístico Determinación del número de repeticiones Se determina el número de repeticiones en cada grupo o tratamiento basado en el método de Tang (Kuehl, 2001) y una variación del mismo de acuerdo a Gill (1978). En un experimento o ensayo clínico con t tratamientos o grupos en comparación y con una probabilidad de error tipo I fija, P(I) = α; el método de Tang proporciona la probabilidad de error tipo II, P(II) = β, que se comete al rechazar la hipótesis nula de igualdad de efectos de tratamientos -cuando esta es verdadera- con un número de repeticiones determinado. El procedimiento consiste en obtener Φ para un valor de r, definida como: Φ = (r/t Σ(τi/σ)2 )1/2 , 35 y mediante las cartas o gráficas de este mismo autor se encuentra el valor de β correspondiente. Los valores de τi y σ se obtienen de un experimento o ensayo anterior, consultado en la literatura. En ocasiones no es fácil encontrar reportes o trabajos similares publicados previamente y para subsanar esta deficiencia, existe una variante del método de Tang, donde i) la expresión τi/σ se considera el efecto del tratamiento estandarizado por σ; ii) la diferencia entre tratamientos, en este caso dos, sea máximo la amplitud del intervalo 1σ; y iii) para facilitar la obtención de posibles respuestas de las τi/σ, se considera necesario que Σ(τi/σ) = 0. (Gill, 1978). Esta variante del método de Tang plantea que el investigador puede formular (t-1) escenarios. En este caso con t = 4 se tienen tres escenarios. Se puede pensar, a priori, que los tratamientos tendrán diferente respuesta en una amplitud de 1σ. Se puede considerar que habrá un valor bajo y un alto de τi/σ, en el Cuadro 3. se muestran los posibles valores τi/σ que cumplen con las condiciones mencionadas. Cuadro 6.3 Escenarios y valores τi/σ que cumplen con las condiciones de Gill para aplicar el método de Tang. Posibles valores de τi/σ , i = 1, 2, 3, y 4 Escenario E1 -0.5 0 0 0.5 E2 -0.5 -0.25 0.25 0.5 E3 -0.4 -0.2 0 0.6 36 A modo de ejemplo, consideremos el escenario E1, donde se plantea una posible distribución de los efectos de tratamientos estandarizados por el error estándar experimental τi/σ: -0.5, 0, 0 y 0.5, respectivamente. De esta forma la expresión de Φ es: Φ = (r/4 [(-0.5) 2 + (0) 2 + (0) 2 + (0.5)2])1/2 = (r/4 [0.5])1/2 = (0.125r)1/2 Se proponen diferentes número de repeticiones y se obtienen los correspondientes valores de Φ y β, para ν1 = t-1 = 4-1=3, ν2 = t(r-1) =4(r-1) y α = 0.05. Se realizó el ejercicio para 10, 15, 18 y 20 repeticiones, obteniéndose con r = 20 valores para β, fluctuando entre 0.08 a 0.24, con un promedio de β igual a 0.15, mismos que se presentan en el Cuadro 4. Cuadro 6.4 Error tipo II, β, en función del número de 20 repeticiones Escenario Repeticiones (r) Φ Β E1 20 1.581 0.24 E2 20 1.766 0.14 E3 20 1.871 0.08 Planteamiento experimental Se empleó un diseño experimental completamente aleatorizado de cuatro tratamientos correspondientes a las dietas. El método de Gill (1978) y Tang 37 (Kuehl, 2001) indican veinte repeticiones por tratamiento pero en el CEIEPP proporcionaron tres verracos por tratamiento. Con esto se realizó el experimento, a pesar de que se conoce la discrepancia que la teoría marca con las posibilidades reales experimentales. Se elaboraró una base de datos en Excel y se procesó con los paquetes estadísticos JMP, versión 5.0 (2002). Análisis de las variables reproductivas del semen del verraco: Se empleó un análisis de varianza multivariado de cuatro tratamientos correspondientes a las dietas y con veinte repeticiones, siendo la unidad experimental es el verraco. Los datos obtenidos durante las pruebas de calidad de semen, como son las variables cualitativas color, olor, pH –medido en ácido, neutro y alcalino- y aglutinación se les determinó semanalmente la proporción en la que se presentaron. Para el análisis de las respuestas de naturaleza continua observadas cada ocho días como son volumen, motilidad en masa, integridad de acrosoma, integridad de membrana (prueba de Host corto), anormalidades, concentración espermática y número de dosis se les determinó sus estadísticas descriptivas como son media, desviación estándar, mediana, primer y tercer cuartiles, y sus valores mínimo y máximo. El modelo correspondiente a una observación yijk es: yijk = µk + τik + Ԑijk , 1< i < 4, 1< j < 3, 1< k 10 Donde: µk es el efecto de la media general en la k-ésima semana, 1< k < 10. Valor desconocido. 38 τik es el efecto del i-ésimo tratamiento en la k-ésima semana, 1 < i < 4, 1 < k < 10. Valor desconocido. Ԑijk es el error experimental cometido en la j-ésima repetición del i-ésimo tratamiento de la k-ésima semana, 1< i < 4, 1< j < 3, 1< k <10. Es una variable aleatoria con media cero y varianza σ2, y no correlacionada con otro error experimental de cualquier otra observación. yijk es el valor observado de la variable en estudio Y, correspondiente a j-ésima repetición del i-ésimo tratamiento de la k-ésima semana, 1< i < 4, 1< j < 3, 1< k <10. Es una variable aleatoria con media µk + τik y varianza σ2, y no correlacionado con cualquier otra observación. Análisis de experimentos como este, se denominan análisis de perfiles y una excelente descripción de él lo hace Candelo (2014). Esta autora considera que las gráficas de las medias aritméticas obtenidas durante las 10 semanas en estudio se denominan perfiles y se obtendrán uno para cada tratamiento. Se entiende por perfil a la gráfica de segmentos de recta que unen a las respuestas obtenidas de un mismo individuo en mediciones sucesivas de tiempo. Estos perfiles se analizarán de acuerdo a la técnica de análisis de perfiles propuesta por Morrison (1967), en donde postula tres hipótesis: 1. Paralelismo de los perfiles 2. Igualdad de los efectos entre tratamientos 3. Igualdad de los efectos dentro de cada tratamiento Las hipótesis anteriores dan respuesta a las siguientes preguntas: 39 1. ¿Los patrones a lo largo de las 10 semanas evaluadas son iguales para cada uno de los tratamientos en estudio? 2. ¿Existen diferencias en las respuestas entre cada tratamiento, a lo largo del tiempo evaluado? 3. ¿Las respuestas en cada uno de las repeticiones evaluadas, son las mismas dentro de cada tratamiento? A continuación se describe brevemente en qué consiste el análisis de perfiles: 1. Paralelismo de los perfiles El análisis de las hipótesis de paralelismo (Ho1) para las variables de calidad de semen, es análogo a un Análisis de Varianza Multivariado (MANOVA). Para el análisis estadístico se empleará el programa estadístico JMP versión 5.0 (2002). A partir de éste se obtendrán las matrices de las sumas de cuadrados y cuadrados medios de los tratamientos (B = [bij]) y del error (E = [eij]), para asociarlos a los elementos B* = [bij*] y E* = [eij*], mediante: bij* = bij – (bi+1j) – (bij+1) + (bi+1j+1) 1<i<p-1 1<j<p-1 eij* = eij – (ei+1j) – (eij+1) + (ei+1j+1) 1<i<p-1 1<j<p-1 Similar al caso multivariado, el estadístico de prueba para la hipótesis de paralelismo es Lambda de Wilks (λ) donde: ǀE*ǀ ǀM’ EMǀ ǀE* + B*ǀ ǀM’ (E + B)Mǀ Con la aproximación de Bartlet, λ de Wilks es: λ = = - n – 1 - 1 (p – 1 + t Inλ ∩ x2 ((p – 1)(t – 1)) 2 40 El criterio de rechazo de Ho1 se postula “Si el valor transformado de λ > x2(p-1)(t-1); α”. 2. Igualdad de los efectos entre tratamientos Para el análisis de la hipótesis de igualdad de efectos entre tratamientos (Ho2) (con glicinato de Zn y con óxido de Zn), se empleará como estadístico de prueba el criterio de Wilks (λ), el cual se obtendrá del análisis multivariado de los tratamientos, empleando el programa estadístico JMP versión 5.0 (2002). 3. Igualdad de los efectos dentro de cada tratamiento I. Si Ho1 no fue rechazada, es decir, los perfiles son paralelos, lambda de Wilks para Ho3 es : ǀE*ǀ ǀA’ EMǀ ǀE* + H*ǀ ǀA’ EA + H*ǀ Donde E es la matriz periodo por periodo (pxp) de suma de cuadrados y cuadrados medios correspondientes al error empleado en el análisis. La matriz H* está definida por: El criterio de decisión para rechazar Ho3 es “Si el valor transformado de λ > x2(t(p-1), α” II. Si Ho1 fue rechazada, es decir, los perfiles no son paralelos, el análisis de la igualdad de los efectos dentro de cada tratamiento se realiza por separado para cada tiempo. Empleando para ello el estadístico de prueba de T2 de Hotelling’s. t i = 1 λ = = ∑ ni (ӯ *i., ӯ´i.) H * = 41 T2 = niȲ’i. C’(CSiC’)-1 CȲi. El estadístico de prueba de T2 está asociado con la distribución F mediante: El criterio de decisión para rechazar Ho3 es “Si el valor transformado de F >F(p,n-p),α”. F = ni – p + 1 (ni – 1)(p – 1) T2 ∩F(p,n-p) 42 7. RESULTADOS Volumen El análisis de perfil para la variable volumen muestra que no existe paralelismo entre los perfiles (Cuadro 7.1). Indicando que la adición de zinc orgánico e inorgánico no tuvo efecto significativo. Cuadro 7.1 Análisis de perfiles del volumen (g) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio. Basal Semana 1 Semana 2 Semana 3 Semana 4 Semana 5 Fc 0.6802 2.4812 1.6443 0.663 1.8026 0.7028 Prob F> Fc 0.5884 0.1353 0.2549 0.5977 0.2246 0.5765 Semana 6 Semana 7 Semana 8 Semana 9 Semana 10 Fc 1.0416 0.2249 0.2711 0.8861 0.338 Prob F> Fc 0.4251 0.8765 0.8446 0.4884 0.8192 En la Gráfica 7.1 se presentan los perfiles obtenidos para los cuatro tratamientos en estudio durante las 10 semanas, con base a los resultados mostrados en la Tabla 7.1. Gráfica 7.1 Perfiles de las medias de volumen (g) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio. Tr at am ie nt o LS M ea ns 0 100 200 300 400 1 2 34 Basal Semana1 Semana2 Semana3 Semana4 Semana5 Semana6 Semana7 Semana8 Semana9 Semana10 Responses43 Tabla 7.1 Medias de volumen (g) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio. Tratamiento Basal Semana1 Semana2 Semana3 Semana4 Semana5 1 166 219.333 283.667 201 217 223.667 2 163.667 91.667 149.667 163.667 146.333 171.333 3 194 237.333 142 190.667 279.333 209.667 4 248 214.333 246 264.667 214 266.333 Tratamiento Semana6 Semana7 Semana8 Semana9 Semana10 1 246 233.667 211.667 223 196.333 2 146 185.333 155 130 161.333 3 193.667 223.667 183.333 180.667 224.667 4 244.667 251 237 229 236 No se encontró diferencias significativas entre los cuatro tratamientos (P= 0.5007), así como a lo largo de las 10 semanas (P>0.05). El análisis de cada semana no detectó diferencias significativas entre los cuatro tratamientos en estudio (P>0.05). 44 Motilidad en masa El análisis de perfil para la variable motilidad en masa muestra que no existe paralelismo entre los perfiles (Cuadro 7.2). Indicando que la adición de zinc orgánico e inorgánico no tiene efecto significativo. Cuadro 7.2 Análisis de perfiles de motilidad en masa (%) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio. Basal Semana 1 Semana 2 Semana 3 Semana 4 Semana 5 Fc 0.1941 0.1932 0.3118 1.1978 0.8995 0.8085 Prob F> Fc 0.8975 0.8981 0.8166 0.3707 0.4826 0.524 Semana 6 Semana 7 Semana 8 Semana 9 Semana 10 Fc 0.735 0.8516 1.2077 0.6468 0.6231 Prob F> Fc 0.5599 0.5038 0.3676 0.6066 0.6198 En la Gráfica 7.2 se presentan los perfiles obtenidos para los cuatro tratamientos en estudio durante las 10 semanas, con base a los resultados mostrados en la Tabla 7.2. Gráfica 7.2 Perfiles de las medias de motilidad en masa (%) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio. Tr at am ie nt o LS M ea ns 0 20 40 60 80 100 12 34 Basal Semana1 Semana2 Semana3 Semana4 Semana5 Semana6 Semana7 Semana8 Semana9 Semana10 Responses 45 Tabla 7.2 Medias de motilidad en masa (%) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio. Tratamiento Basal Semana1 Semana2 Semana3 Semana4 Semana5 1 73.333 65 68.333 58.333 60 60 2 68.333 71.667 68.333 91.667 83.333 86.667 3 76.667 65 81.667 83.333 88.333 91.667 4 61.667 55 61.667 68.333 81.667 83.333 Tratamiento Semana6 Semana7 Semana8 Semana9 Semana10 1 65 68.333 68.333 76.667 70 2 86.667 80 90 90 70 3 91.667 95 86.667 95 95 4 88.333 95 91.667 88.333 93.333 No se encontró diferencias significativas entre los cuatro tratamientos (P= 0.7051), así como a lo largo de las 10 semanas (P>0.05). El análisis de cada semana no detectó diferencias significativas entre los cuatro tratamientos en estudio (P>0.05). 46 Integridad de acrosoma El análisis de perfil para la variable integridad de acrosoma muestra que no existe paralelismo entre los perfiles (Cuadro 7.3). Indicando que la adición de zinc orgánico e inorgánico no tiene efecto significativo. Cuadro 7.3 Análisis de perfiles de integridad de acrosoma (%) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio. Basal Semana 1 Semana 2 Semana 3 Semana 4 Semana 5 Fc 0.4505 1.7632 1.0657 1.5121 1.7618 0.3399 Prob F> Fc 0.7239 0.2317 0.4162 0.284 0.232 0.7974 Semana 6 Semana 7 Semana 8 Semana 9 Semana 10 Fc 1.4029 0.3033 2.4456 0.9327 1.2067 Prob F> Fc 0.3111 0.8224 0.1387 0.4684 0.3679 En la Gráfica 7.3 se presentan los perfiles obtenidos para los cuatro tratamientos en estudio durante las 10 semanas, con base a los resultados mostrados en la Tabla 7.3. Gráfica 7.3 Perfiles de las medias de integridad de acrosoma (%) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio. Tr at am ie nt o LS M ea ns 10 30 50 70 90 1 23 4 Basal Semana1 Semana2 Semana3 Semana4 Semana5 Semana6 Semana7 Semana8 Semana9 Semana10 Responses 47 Tabla 7.3 Medias de integridad de acrosoma (%) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio. Tratamiento Basal Semana1 Semana2 Semana3 Semana4 Semana5 1 73.27 85.14 78.58 44.383 47.73 69.75 2 89.96 82.897 67.217 74.987 78.737 63.55 3 89.55 95.633 83.517 74.397 75.47 75.403 4 82.8 90.423 73.44 69.163 75.237 63.667 Tratamiento Semana6 Semana7 Semana8 Semana9 Semana10 1 83.893 80.573 77.763 67.66 75.89 2 76.123 73.097 63.907 61.29 66.707 3 72.19 74.417 55.58 74.803 72.907 4 86.44 64.663 73.573 62.977 55.907 No se encontró diferencias significativas entre los cuatro tratamientos (P= 0.8877), así como a lo largo de las 10 semanas (P>0.05). El análisis de cada semana no detectó diferencias significativas entre los cuatro tratamientos en estudio (P>0.05). 48 Integridad de membrana (Prueba de Host corto) El análisis de perfil para la variable prueba de Host corto muestra que no existe paralelismo entre los perfiles (Cuadro 7.4). Indicando que la adición de zinc orgánico e inorgánico no tiene efecto significativo. Cuadro 7.4 Análisis de perfiles de prueba de Host corto (%) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio. Basal Semana 1 Semana 2 Semana 3 Semana 4 Semana 5 Fc 0.2025 0.0836 1.5871 0.0004 0.723 0.5739 Prob F> Fc 0.6623 0.7784 0.2363 0.9852 0.415 0.4662 Semana 6 Semana 7 Semana 8 Semana 9 Semana 10 Fc 0.0284 3.3358 2.6802 2.4171 0.0001 Prob F> Fc 0.8695 0.0977 0.1326 0.1511 0.9962 En la Gráfica 7.4 se presentan los perfiles obtenidos para los cuatro tratamientos en estudio durante las 10 semanas, con base a los resultados mostrados en la Tabla 7.4. Gráfica 7.4 Perfiles de las medias de la prueba de Host corto (%) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio. Tr at am ie nt o LS M ea ns 20 40 60 80 100 1 2 34 Basal Semana1 Semana2 Semana3 Semana4 Semana5 Semana6 Semana7 Semana8 Semana9 Semana10 Responses 49 Tabla 7.4 Medias de la prueba de Host corto (%) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio. Tratamiento Basal Semana1 Semana2 Semana3 Semana4 Semana5 1 55.31 67.797 67.44 61.38 58.33 74.117 2 70.117 81.207 77.443 81.343 75.987 79.963 3 73.457 74.063 74.843 78.013 71.323 82.4575555555555555 4 59.837 65.727 76.85 62.19 72.483 78.51 Tratamiento Semana6 Semana7 Semana8 Semana9 Semana10 1 77.85 70.343 77.823 69.157 76.08 2 79.53 55.547 84.22 81.123 82.843 3 82.487 82.93 71.927 76.46 75.153 4 77.683 81.62 68.507 81.983 78.6 No se encontró diferencias significativas entre los cuatro tratamientos (P= 0.5083), así como a lo largo de las 10 semanas (P>0.05). El análisis de cada semana no detectó diferencias significativas entre los cuatro tratamientos en estudio (P>0.05). 82.457 7 50 Anormalidades El análisis de perfil para la variable anormalidades muestra que no existe paralelismo entre los perfiles (Cuadro 7.5). Indicando que la adición de zinc orgánico e inorgánico no tiene efecto significativo. Cuadro 7.5 Análisis de perfiles de anormalidades (%) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio. Basal Semana 1 Semana 2 Semana 3 Semana 4 Semana 5 Fc 0.4028 1.0346 0.913 1.0671 2.0878 2.5661 Prob F> Fc 0.7551 0.4278 0.4767 0.4156 0.1802 0.1274 Semana 6 Semana 7 Semana 8 Semana 9 Semana 10 Fc 0.1919 0.427 0.2594 2.3015 0.2469 Prob F> Fc 0.899 0.7392 0.8527 0.1539 0.8614 En la Gráfica 7.5 se presentan los perfiles obtenidos para los cuatro tratamientos en estudio durante las 10 semanas, con base a los resultados mostrados en la Tabla 7.5. Gráfica 7.5 Perfiles de las medias de anormalidades (%) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio. Tr at am ie nt o LS M ea ns 0 20 40 60 80 12 34 Basal Semana1 Semana2 Semana3 Semana4 Semana5 Semana6 Semana7 Semana8 Semana9 Semana10 Responses 51 Tabla 7.5 Medias de anormalidades (%) de semen de los verracos de los cuatro tratamientos en estudio. Tratamiento Basal Semana1
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