Interacciones-in-vivo-de-protenas-del-sistema-de-secrecion-tipo-III-de-Escherichia-coli-enteropatogena

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
DE MÉXICO 
Interacciones in vivo de proteínas del sistema de secreción tipo III 
de Escherichia coli enteropatógena 
QUE PARA OPTAR POR EL TÍTULO DE: 
T E S I S 
MAESTRO EN CIENCIAS (BIOQUÍMICAS) 
P R E S E N T A: 
O N A S I S V I C E N T E F E R M Í N 
TUTOR: Dra. Bertha González Pedrajo - IFC 
 México, D.F. Enero, 2014 
Noviembre, 2013 
FACULTAD DE QUÍMICA 
PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO EN 
CIENCIAS BIOQUÍMICAS 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
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El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
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AGRADECIMIENTOS 
 
El presente trabajo se realizó bajo la dirección de la Dra. Bertha González Pedrajo 
y el apoyo técnico de la Dra. Norma Espinosa Sánchez, en el laboratorio 325 del 
Departamento de Genética Molecular del Instituto de Fisiología Celular de la 
Universidad Nacional Autónoma de México. 
 
 Para la realización del presente proyecto de investigación se contó con el apoyo 
de los donativos IN212911 de la Dirección General de Asuntos del Personal 
Académico, UNAM; 81847 y 180460 del CONACyT y un apoyo complementario de 
la Fundación Miguel Alemán, A.C. 
 
 Durante la realización del proyecto se recibió una beca del Consejo Nacional de 
Ciencia y Tecnología (CONACyT) con número de registro 235099. 
 
 El comité tutor que asesoró el desarrollo de esta tesis estuvo conformado por 
las doctoras: Bertha González Pedrajo, Soledad Funes Argüello y Marina 
Gavilanes Ruíz. 
 
 El jurado que examinó el presente trabajo estuvo conformado por los doctores: 
Herminia Loza Tavera, Francisco Ruiz Terán, Ángel Manjarrez Hernández, María 
del Carmen Wacher Rodarte y Gonzalo Castillo Rojas. 
 
 El trabajo se desarrolló con el apoyo técnico de los miembros de la Unidad de 
Biología Molecular: Dra. Laura Ongay Larios, Biól. Guadalupe Códiz Huerta y M. en 
C. Minerva Mora Cabrera; de la Unidad de Cómputo: Biól. Gerardo Coello Coutiño, 
Ing. Juan Barbosa Castillo e Ing. Ivette Rosas Arciniega así como del Taller de 
Mantenimiento: Ing. Aurey Galván Lobato e Ing. Manuel Ortínez Benavides. 
 
 Al Dr. Javier de la Mora Bravo cuyo apoyo técnico y asesoría fue muy importante 
para lograr los objetivos principales del presente trabajo. 
 
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 A la Mtra. Sandra Moncada Hernández, jefa de la biblioteca, por las facilidades 
proporcionadas durante el período de realización del presente trabajo. 
 
 A todos los miembros del laboratorio 325 del IFC por el apoyo brindado durante 
la realización de este trabajo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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ÍNDICE GENERAL 
Página 
I. RESUMEN………………………………………………………………………………………….. 1 
 
II. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………………. 2 
2.1 Escherichia coli……………………………………………………………………………. 2 
 2.2 E. coli diarreagénicas……………………………………………………………………. 3 
 2.3 Escherichia coli enteropatógena (EPEC)……………………………………………… 8 
 2.4 Modelo de infección por EPEC………………………………………………………. 9 
 2.5 Locus de esfacelamiento enterocítico de EPEC……………………………… 12 
 2.6 Producción de diarrea…………………………………………………………………… 13 
 2.7 Sistema de secreción tipo 3 (SST3)……………………………………………….. 14 
 2.8 Sistema de secreción tipo 3 de EPEC……………………………………………. 16 
2.9 Interruptores moleculares en el ensamblaje del SST3 de EPEC……… 19 
 2.9.1 Primer interruptor molecular: control de la secreción de 
 sustratos tempranos, de la longitud de la aguja, formación del 
 filamento y secreción de efectores……………………………………………… 21 
 2.9.2 Segundo interruptor molecular: facilita la secreción de 
 translocadores y bloquea la secreción de sustratos tardíos 
 (efectores)…………………………………………………………………………………. 23 
 
III. ANTECEDENTES……………………………………………………………………………….. 25 
 
IV. JUSTIFICACIÓN…………………………………………………………………………………. 30 
 
V. HIPÓTESIS………………………………………………………………………………………… 31 
 
VI. OBJETIVOS……………………………………………………………………………………….. 32 
 
VII. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………………………… 33 
 7.1 Cepas bacterianas y medios de cultivo………………………………………….. 33 
 7.2 Técnicas de biología molecular……………………………………………………… 33 
 7.2.1 Amplificación por PCR……………………………………………………….. 33 
 7.2.2 Purificación de DNA…………………………………………………………… 35 
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ii 
 
7.2.3 Clonación y subclonación de genes en los vectores pGADT7 y 
pGBKT7……………………………………………………………………………………… 35 
 7.2.4 Obtención de DNA plasmídico……………………………………………. 39 
 7.2.5 Análisis de restricción………………………………………………………… 39 
 7.2.6 Secuenciación…………………………………………………………………… 39 
 7.3 Preparación de células competentes Top-10 con CaCl2 y 
 transformación del DNA plasmídico……………………………………………………. 40 
 7.4 Sistema del doble híbrido en levadura…………………………………………… 41 
 7.4.1 Ensayos de interacción proteína-proteína por doble híbrido 
 en levadura………………………………………………………………………………… 43 
 7.5 Análisis de la actividad hemolítica de EPECΔescP………………………… 46 
 
VIII. RESULTADOS………………………………………………………………………………….. 47 
 8.1 Construcción de plásmidos para doble híbrido en levadura……………. 47 
 8.2 Análisis de interacción proteína-proteína por doble híbrido…………….. 49 
 8.2.1 Interacción de la proteína SepD con SepL…………………………… 49 
 8.2.2 Interacción de la proteína SepL con SepD…………………………… 51 
 8.2.3 Interacción de la proteína EscP con EscUC…………………………. 53 
 8.2.4 Interacción de la proteína EscUC con EscP.………………………… 54 
 8.2.5 Interacción de la proteína EscP con EscUCC………………………… 55 
 8.2.6 Interacción de la proteína EscUCC con EscP………………………… 56 
 8.2.7 Interacción de la proteína EscP con SepD………………………….. 58 
 8.2.8 Interacción de la proteína SepD con EscP………………………….. 59 
 8.2.9 Interacción de la proteína EscP con SepL…………………………… 60 
 8.2.10 Interacción de la proteína EscP con Tir…………………………….. 61 
 8.2.11 Interacción de la proteína Tir con EscP…………………………….. 62 
 8.2.12 Interacción de la proteína EscP con CesT…………………………. 63 
 8.2.13 Interacción de la proteína CesT con EscP…………………………. 64 
 8.2.14 Interacción de la proteína Tir con CesT…………………………….. 65 
 8.2.15 Interacción de la proteína CesT con Tir…………………………….. 66 
 8.2.16 Interacción de la proteína EscP con EscF…………………………. 67 
 8.2.17 Interacción de la proteína EscF con EscP…………………………. 68 
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iii
 
 8.3 Actividad hemolítica de la mutante EPECΔescP.................................... 69 
 
IX. DISCUSIÓN………………………………………………………………………………………. 71 
 
X. CONCLUSIONES………………………………………………………………………………… 80 
 
XI. PERSPECTIVAS………………………………………………………………………………….81 
 
XII. ANEXOS………………………………………………………………………………………….. 82 
 
XIII. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………………….. 86 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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iv 
 
ÍNDICE DE FIGURAS 
Página 
1. Esquema representativo de Escherichia coli………………………………………. 2 
2. Mecanismo de patogénesis de los seis patovares diarreagénicos de 
E. coli……………………………………………………………………………………………………. 6 
3. Modelo de infección por EPEC……………………………………………………………. 10 
4. Locus de esfacelamiento enterocítico (LEE) de EPEC………………………….. 13 
5. Esquema representativo del inyectisoma de EPEC……………………………… 18 
6. Los residuos 309-342 de Spa40, Spa40cc, son la región de 
interacción con Spa32……………………………………………………………………………. 27 
7. Alineamiento múltiple de EscU de EPEC, Spa40 de Shigella flexneri, 
SpaS de Salmonella enterica, YscU de Yersinia enterocolitica, BscU de 
Bordetella bronchiseptica, HrcU de Xanthomonas campestris y FlhB del 
sistema flagelar de Salmonella enterica………………………………………………… 28 
8. Alineamiento múltiple de EscP de EPEC, Orf16 de EHEC y Orf16 de CR.. 29 
9. Mapa de restricción y sitio de multiclonación del plásmido pGBKT7……. 37 
10. Mapa de restricción y sitio de multiclonación del plásmido pGADT7….. 38 
11. Sistema del doble híbrido en levadura……………………………………………… 42 
12. Ensayo de interacción de SepD y SepL…………………………………………….. 51 
13. Ensayo de interacción de SepL y SepD……………………………………………… 52 
14. Ensayo de interacción de EscP y EscUC…………………………………………….. 53 
15. Ensayo de interacción de EscUC y EscP…………………………………………….. 54 
16. Ensayo de interacción de EscP y EscUCC…………………………………………… 55 
17. Ensayo de interacción de EscUCC y EscP………………………………............... 56 
18. Ensayo de interacción de EscUCC y EscP…………………………………………… 57 
19. Ensayo de interacción de EscP y SepD…………………………………………….. 58 
20. Ensayo de interacción de SepD y EscP……………………………………………… 59 
21. Ensayo de interacción de EscP y SepL…………………………………………….. 60 
22. Ensayo de interacción de EscP y Tir…………………………………………………. 61 
23. Ensayo de interacción de Tir y EscP…………………………………………………. 62 
24. Ensayo de interacción de EscP y CesT...................................................... 63 
25. Ensayo de interacción de CesT y EscP……………………………………………… 64 
_____________________________________________________________________ 
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v 
 
26. Ensayo de interacción de Tir y CesT………………………………………………….. 65 
27. Ensayo de interacción de CesT y Tir………………………………………………….. 66 
28. Ensayo de interacción de EscP y EscF………………………………………………. 67 
29. Ensayo de interacción de EscF y EscP………………………………………………. 68 
30. Actividad hemolítica de la mutante EPEC ΔescP……………………………….. 69 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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vi 
 
ÍNDICE DE TABLAS 
Página 
1. Cepas bacterianas utilizadas en este estudio……………………………………… 33 
2. Oligonucléotidos utilizados para la amplificación del dominio escUCC…… 34 
3. Relación estándar para la reacción de PCR………………………………………… 34 
4. Relación de componentes para la transformación en levadura……………. 43 
5. Tubos con agua estéril para diluciones………………………………………………. 44 
6. Diluciones progresivas de levadura para doble híbrido……………………….. 45 
7. Construcciones de DNA realizadas/utilizadas en el presente estudio….. 47 
8. Controles para analizar interacciones por doble híbrido………………………. 49 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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vii
 
ABREVIATURAS 
 
A/E Lesión de adherencia y esfacelamiento (del inglés Attaching and 
Effacing). 
AAF Fimbrias de adherencia agregativa (del inglés Aggregative 
Adherence Fimbriae). 
AD Dominio de activación de GAL4 (del inglés Activating Domain). 
BD Dominio de unión a DNA de GAL4 (del inglés Binding Domain). 
BFP Fimbria tipo IV (del inglés Bundle Forming Pilus). 
CFA Antígeno factor de colonización (del inglés Colonization Factor 
Antigen). 
CR Rojo congo (del inglés Congo Red). 
DAEC E. coli de adherencia difusa (del inglés Diffusely Adherent 
Escherichia coli). 
EAEC E. coli enteroagregativa (del inglés Enteroaggregative Escherichia 
coli). 
EAF Plásmido de virulencia EAF (del inglés EPEC Adherence Factor). 
EAST1 Enterotoxina termoestable 1 de EAEC (del inglés Enteroaggregative 
E. coli ST). 
EHEC E. coli enterohemorrágica (del inglés Enterohemorrhagic 
Escherichia coli). 
EIEC E. coli enteroinvasiva (del inglés Enteroinvasive Escherichia coli). 
EPEC E. coli enteropatógena (del inglés Enteropathogenic Escherichia 
coli). 
ETEC E. coli enterotoxigénica (del inglés Enterotoxigenic Escherichia coli). 
HUS Síndrome urémico hemolítico (del inglés Haemolytic Uremic 
Syndrome). 
LEE Locus de esfacelamiento enterocítico (del inglés Locus of 
Enterocyte Effacement). 
PAI Isla de patogenicidad (del inglés Pathogenicity Island). 
PCR Reacción en cadena de la polimerasa (del inglés Polymerase Chain 
Reaction). 
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viii 
 
REPEC EPEC de conejo (del inglés Rabbit Enteropathogenic Escherichia 
coli). 
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida (del inglés Sodium Dodecyl 
Sulfate Polyacrilamide Gel Electrophoresis). 
TEM Microscopía electrónica de transmisión (del inglés Transmission 
Electron Microscopy). 
Tir Proteína Tir (del inglés Translocated Intimin Receptor). 
UAS Secuencia regulatoria UAS (del inglés Upstream Activating 
Sequence). 
YPDA Medio de cultivo YPDA (del inglés Yeast Peptone Dextrose Adenine). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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1 
 
RESUMEN 
Escherichia coli enteropatógena (EPEC) es una bacteria gram negativa y la 
principal responsable de brotes de diarrea infantil en países en vías de desarrollo. 
La transmisión de EPEC es por vía fecal-oral y generalmente a través de manos, 
alimentos u objetos contaminados. EPEC es un patógeno extracelular que induce 
una alteración histopatológica denominada lesión A/E que se caracteriza por la 
eliminación de las microvellosidades intestinales y la adherencia íntima de la 
bacteria a la membrana de las células epiteliales. La habilidad de EPEC para 
inducir la histopatología A/E está codificada en una isla de patogenicidad llamada 
locus de esfacelamiento enterocítico (LEE). En el LEE están codificados los 
componentes estructurales que forman el sistema de secreción tipo III (SST3) a 
través del cual EPEC inyecta proteínas de virulencia al interior de la célula 
hospedera una vez que ha ocurrido la adherencia íntima de la bacteria. El SST3 
de EPEC es una estructura que forma una nanomáquina denominada 
inyectisoma, la cual se compone de un cuerpo basal y una aguja extracelular 
rígida y hueca de 23 nm de longitud, sobre la que se ensambla un filamento de 
hasta 800 nm que permite el contacto entre la bacteria y el enterocito. Se 
propone que una vez que EPEC hace contacto con la célula hospedera las 
proteínas translocadoras EspB y EspD son secretadas para formar el poro de 
translocación a través del cual se translocan los efectores hacia el citoplasma del 
hospedero. EPEC requiere algunos mecanismos para asegurar un control 
jerárquico y temporal de la secreción de proteínas a través del inyectisoma.Dicha 
regulación se lleva a cabo a nivel transcripcional, post-transcripcional, 
traduccional y post-traduccional; en esta última participan complejos 
denominados interruptores moleculares y componentes estructurales del 
inyectisoma. Se propone que dos interruptores moleculares regulan la biogénesis 
y secreción vía el SST3, uno que controla la secreción de sustratos tempranos, la 
longitud de la aguja y la formación del filamento (interruptor molecular 1) y otro 
que promueve la secreción de translocadores y bloquea la secreción de proteínas 
efectoras hasta que el SST3 hace contacto con el enterocito (interruptor 
molecular 2). En el presente trabajo se caracterizaron interacciones proteína-
proteína a través del sistema del doble híbrido entre los componentes que 
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2 
 
regulan la especificidad de secreción de sustratos en el inyectisoma de E. coli 
enteropatógena. 
 
II. INTRODUCCIÓN 
2.1 Escherichia coli. 
Escherichia coli es una bacteria Gram negativa en forma de bacilo con un 
diámetro de 0.3 – 1.5 micras. Es la bacteria anaerobia facultativa más común de 
la microbiota intestinal de animales, colonizando de forma natural la capa 
mucosa del colon. La colonización del intestino por la bacteria se inicia en las 
primeras horas de vida, estableciéndose una relación benéfica tanto para la 
bacteria como para el hospedero. En mamíferos, E. coli está involucrada en 
procesos biológicos como por ejemplo la absorción de alimentos no digeribles por 
el intestino, la síntesis de la vitamina K, así como de algunos precursores del 
complejo B y utilización del gluconato (Kaper JB, et al., 2004). En condiciones 
naturales, las cepas de E. coli (fig. 1) que conforman la microbiota no producen 
ningún daño; sin embargo, en situaciones que favorecen la salida de su hábitat 
natural o en individuos con trastornos inmunes, la bacteria puede causar 
enfermedad. Infecciones debidas a E. coli se pueden limitar únicamente a la 
mucosa intestinal o, en el peor de los casos, pueden diseminarse en todo el 
cuerpo (Kaper JB, et al., 2004). 
 
 
Fig. 1. Esquema representativo de Escherichia coli. Tomada de http://www.doctortipster.com 
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3 
 
 E. coli se consideró por mucho tiempo el principal comensal no patógeno en el 
humano. Sin embargo, a principios del siglo XX se descubrió que es capaz de 
causar una gran variedad de enfermedades en el hombre, como por ejemplo 
diarrea, colitis hemorrágica, disentería, síndrome urémico hemolítico, infecciones 
en vías urinarias, entre otras patologías (Sandner L, et al., 2001). 
 
 Existen por lo menos ocho patovares de E. coli, cada uno con sus respectivos 
atributos específicos de virulencia que causan un síndrome clínico característico. 
Dicha variedad es el resultado de la evolución y dispersión de genes de virulencia 
entre las diferentes especies; a través de la transferencia horizontal de 
elementos genéticos como plásmidos, bacteriófagos e islas de patogenicidad 
(Puente JL y Finlay BB, 2001). Sólo las combinaciones de factores de virulencia 
exitosas han persistido y llegado a ser patovares específicos de E. coli capaces de 
causar enfermedad en individuos sanos (Kaper JB, et al., 2004). 
 
 Debido al fácil acceso de estos patógenos que se ingieren con los alimentos, el 
tracto gastrointestinal es susceptible a las infecciones de E. coli diarreagénicas. 
Las enfermedades diarreicas en las que están implicadas estas cepas son un 
gran problema de salud pública a nivel mundial, provocando cerca de dos 
millones de muertes anualmente (Chen HD y Frankel G, 2005). 
 
2.2 E. coli diarreagénicas. 
Los patógenos intestinales de E. coli se clasifican en ocho patovares de los 
cuales seis son diarreagénicos y son los siguientes: (1) E. coli enteropatógena 
(EPEC, por sus siglas en inglés, enteropathogenic Escherichia coli), (2) E. coli 
enterohemorrágica (EHEC, por sus siglas en inglés, enterohemorrhagic 
Escherichia coli), (3) E. coli enterotoxigénica (ETEC, por sus siglas en inglés, 
enterotoxigenic Escherichia coli), (4) E. coli enteroagregativa (EAEC, por sus siglas 
en inglés, enteroaggregative Escherichia coli), (5) E. coli enteroinvasiva (EIEC, por 
sus siglas en inglés, enteroinvasive Escherichia coli), y (6) E. coli de adherencia 
difusa (DAEC, por sus siglas en inglés, diffusely adherent Escherichia coli) (Kaper 
JB, et al., 2004). 
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4 
 
 EPEC (cepa E2348/69 O127:H7), que coloniza el intestino delgado, fue el 
primer patovar de E. coli en ser descrito. Importantes brotes de diarrea infantil en 
Reino Unido durante las décadas de 1940 y 1950 relacionaron a EPEC como la 
causa principal de esta epidemia, dado que este patovar se aisló de niños con 
diarrea pero no en niños sanos. EPEC infecta principalmente a niños menores de 
dos años en países en vías de desarrollo mientras que ha desaparecido en países 
industrializados. Desde 1979 se ha avanzado de manera importante en el 
entendimiento de la patogénesis de EPEC, tal que ahora se sabe que esta 
bacteria se adhiere al intestino por medio de una fimbria tipo IV llamada BFP 
(BFP, por sus siglas en inglés, bundle forming pilus), e induce una lesión 
histopatológica característica denominada lesión de adherencia y 
esfacelamiento, lesión A/E, que consiste en la eliminación de las 
microvellosidades del epitelio intestinal, la adherencia íntima de la bacteria al 
enterocito, así como la generación de una estructura tipo pedestal rica en actina 
que se forma debajo del sitio de adhesión de la bacteria (fig. 2) (Kaper JB, et al., 
2004). En la primera etapa de infección por EPEC, ésta se adhiere de manera no 
íntima a las células del epitelio intestinal en un patrón conocido como adherencia 
localizada, que consiste en la formación de agregados o microcolonias 
bacterianas. Dicho fenotipo es mediado parcial o totalmente por el pilus Bfp, 
fimbria que tiende a agregarse en forma de cordones permitiendo así el 
reclutamiento de bacterias en el ambiente de la célula hospedero. Se ha 
identificado que el pilus Bfp se une al compuesto de membrana N-acetil-
lactosamina en el enterocito (Clarke SC, et al., 2003; Girón JA, et al., 2002; 
Humphries RM, et al., 2010). 
 
 EHEC (cepa O157:H7) fue reconocido como agente patógeno de humanos en 
1982. EHEC es la bacteria responsable de la colitis hemorrágica y del síndrome 
urémico hemolítico (HUS, por sus siglas en inglés, haemolytic uremic syndrome) 
principalmente en niños. El principal reservorio de EHEC es el tracto intestinal de 
bovino y los primeros brotes de enfermedad se asociaron con el consumo de 
hamburguesas con carne de res media cruda, por lo que al padecimiento se le 
denominó “enfermedad de la hamburguesa”. Subsecuentemente una amplia 
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5 
 
variedad de alimentos han sido asociados con EHEC por causar estas 
enfermedades incluyendo salchichas, leche sin pasteurizar, lechugas, jugo de 
manzana, entre otros. Al igual que EPEC, EHEC contiene la isla de patogenicidad 
LEE e induce la formación de la lesión A/E, sin embargo, la infección por EHEC se 
caracteriza por la expresión de las toxinas Shiga (Stx) y la hemolisina (fig. 2) 
(Kaper JB, et al., 2004). 
 
 ETEC coloniza el intestino delgado proximal y es la principal causa de la llamada 
“diarrea del viajero” en adultos de países industrializados, afectando también aniños en países en vías de desarrollo. Patologías por ETEC se adquieren a través 
del consumo de agua y alimentos contaminados. La infección se caracteriza por 
la producción de enterotoxinas termolábiles (LT) y termoestables (ST), y está 
mediada por factores fimbriales o fibrilares denominados factores de 
colonización (CFA, por sus siglas en inglés, colonization factor antigen) (fig. 2) 
(Kaper JB, et al., 2004). GM1 y GD1b, y la enzima guanilato ciclasa, son los 
receptores en el hospedero de las enterotoxinas LT y ST, respectivamente, que al 
activarse conllevan a una deficiente absorción de electrolitos e inhibición en la 
expresión de péptidos antimicrobianos (Croxen MA y Finlay BB, 2010). 
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Fig. 2. Mecanismo de patogénesis de los seis patovares diarreagénicos de E. coli. (a) EPEC se 
adhiere a los enterocitos del epitelio intestinal en el intestino delgado y destruye la arquitectura 
normal de las microvellosidades, induciendo la lesión de adherencia y esfacelamiento. 1. 
Adhesión inicial, 2. translocación de proteínas vía SST3, 3. formación del pedestal. (b) EHEC 
también induce la lesión A/E pero en el colon. La característica distintiva de EHEC es la 
producción de la toxina Shiga. (c) ETEC también se adhiere a los enterocitos del intestino delgado 
e induce diarrea acuosa mediante la secreción de las enterotoxinas LT y ST. (d) EAEC se adhiere al 
epitelio del intestino delgado y grueso mediante una biopelícula densa y lleva a cabo su 
mecanismo de infección mediante la secreción de enterotoxinas y citotoxinas. (e) EIEC invade las 
células epiteliales del colon, lisa la vacuola y difunde a través de la célula gracias a la nucleación 
de microfilamentos de actina. La bacteria puede moverse lateralmente a través del epitelio. (f) 
DAEC provoca un mecanismo característico de transducción de señales en enterocitos del epitelio 
intestinal que se manifiesta con el crecimiento de proyecciones celulares en forma de dedos que 
rodean la bacteria (Tomada de Kaper JB, et al., 2004). 
 
 
 EAEC es reconocida por ser la causante de diarrea persistente en niños y 
adultos en países en vías de desarrollo, produciendo diarrea acuosa que a 
menudo es acompañada de moco. EAEC se adhiere a las células epiteliales en un 
patrón conocido como autoagregativo en el que las bacterias se adhieren una a 
otra en forma de “ladrillos apilados”. Es probable que esta definición acompañe 
tanto a bacterias patógenas como a las no patógenas, lo cual mantiene en 
controversia si EAEC tiene algún factor común que contribuya a su fenotipo de 
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7 
 
adherencia compartida. La estrategia básica de infección por EAEC parece 
comprender la colonización de la mucosa intestinal, predominantemente del 
colon, seguida de la secreción de enterotoxinas y citotoxinas. Estudios en 
humano indican que EAEC induce un leve pero significativo daño en la mucosa 
intestinal principalmente en el colon. Algunos de los factores de virulencia de 
EAEC son las fimbrias de adherencia agregativa (AAF, por sus siglas en inglés, 
aggregative adherence fimbriae), las proteasas involucradas en la colonización 
intestinal denominadas Pic y Pet, y la enterotoxina termoestable 1 de EAEC 
(EAST1, por sus siglas en inglés, enteroaggregative E. coli ST), una proteína de 38 
aminoácidos similar a la toxina ST en ETEC y que contribuye en gran manera a la 
diarrea acuosa (fig. 2) (Kaper JB, et al., 2004). 
 
 EIEC se caracteriza por causar colitis inflamatoria invasiva, y ocasionalmente 
disentería, pero en la mayoría de los casos provoca diarrea acuosa indistinguible 
de aquella causada por infección de otras bacterias. La primera fase de la 
patogénesis de EIEC comprende la invasión y penetración de las células 
epiteliales, seguida de la lisis de la vacuola endocítica, multiplicación intracelular, 
movimiento direccional a través del citoplasma y extensión hacia células 
epiteliales adyacentes (fig. 2) (Kaper JB, et al., 2004). 
 
 DAEC tiene un patrón de adherencia difusa en células epiteliales y es el agente 
causante de diarrea en niños menores de 1 año de edad, sin embargo se 
desconocen los detalles de su mecanismo de patogénesis. Esta bacteria 
desencadena la activación de diferentes cascadas de transducción de señales en 
los eritrocitos del intestino delgado, lo cual conduce al desarrollo de proyecciones 
celulares largas similares a dedos que envuelven la bacteria (fig. 2) (Kaper JB, et 
al., 2004). En el mecanismo de infección de DAEC todas las adhesinas Afa-Dr 
interaccionan con el receptor DAF (del inglés, decay-accelerating factor) el cual se 
encuentra en la superficie de células epiteliales y urinarias. La unión a DAF 
resulta en la agregación de moléculas DAF debajo del sitio de adhesión de la 
bacteria. Esto activa una cascada de señalización dependiente de Ca2+, la cual 
resulta en la elongación y daño de las microvellosidades del hospedero a través 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
 
8 
 
de la desorganización de componentes esenciales del citoesqueleto (Croxen MA y 
Finlay BB, 2010). 
 
2.3 Escherichia coli enteropatógena (EPEC). 
En la actualidad, la infección por EPEC es una de las causas principales de 
diarrea infantil en países en vías de desarrollo (Levine MM, et al., 1978). La 
infección ocasionada por EPEC desencadena diarrea de tipo acuoso que puede 
ocurrir en diversos grados de intensidad y es común que los niños infectados 
además presenten vómito y fiebre (Cravioto A y Vázquez V, 1988). Se han 
encontrado serotipos característicos de EPEC en aire, agua, comida y excremento 
de animales, que pueden servir como reservorios de estas bacterias (Nataro JP y 
Kaper JB, 1998). 
 
 EPEC es un patógeno extracelular que induce una alteración histopatológica 
característica denominada lesión de adherencia y esfacelamiento, “lesión A/E” 
(A/E, por sus siglas en inglés, attaching and effacing), la cual se observa en 
biopsias de pacientes o animales infectados y puede reproducirse en cultivos 
celulares. El fenotipo A/E se caracteriza por la eliminación de las 
microvellosidades y la adherencia íntima de la bacteria a la membrana de la 
célula epitelial. Bajo el sitio de adhesión de la bacteria se observan marcados 
cambios del citoesqueleto del enterocito, que incluyen principalmente la 
acumulación de actina polimerizada, originándose una estructura tipo “pedestal” 
que puede extenderse hasta 10 μm fuera de la célula intestinal (Moon HW, et al., 
1983). La habilidad de EPEC para inducir esta histopatología está codificada en 
una isla de patogenicidad de 35 kb (PAI, por sus siglas en inglés, pathogenicity 
island) llamada locus de esfacelamiento enterocítico (LEE, por sus siglas en 
inglés, locus of enterocyte effacement). El locus LEE se encuentra también en 
otros patógenos de humanos y animales que producen la histopatología A/E, 
incluyendo EHEC, EPEC en conejo (REPEC, por sus siglas en inglés, rabbit 
enteropathogenic Escherichia coli) y Citrobacter rodentium, la cual induce 
hiperplasia colónica en ratones (Kaper JB, et al., 2004). 
 
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9 
 
2.4 Modelo de infección por EPEC. 
El modelo de patogénesis de EPEC se divide en tres etapas: (1) adherencia inicial, 
(2) transducción de señales y (3) adherencia íntima (Chen HD y Frankel G, 2005). 
 
 La adherencia inicial de EPEC a las células enterocíticas es un proceso 
fundamentalen el que está directamente involucrada una fimbria o pili tipo IV, 
denominada BFP. La biogénesis del pili BFP requiere 14 genes codificados en el 
plásmido de virulencia EAF (EAF, por sus siglas en inglés, EPEC adherence factor) 
(Stone KD, et al., 1996). El pili BFP permite que las bacterias se agrupen entre 
ellas y formen microcolonias, de esta manera se promueve el patrón de 
adherencia localizada típico de EPEC (Cravioto A, et al., 1979). Además del pili 
BFP, otros factores como el flagelo, la adhesina intimina y el filamento EspA son 
importantes durante la etapa de adherencia inicial de EPEC (fig. 3) (Giron JA, et 
al., 2002). 
 
 La etapa de transducción de señales ocurre después de que EPEC se adhiere al 
enterocito, entonces inyecta a la célula hospedera una serie de proteínas 
denominadas “efectores” mediante el SST3. Estos efectores de virulencia alteran 
diferentes vías de señalización de la célula eucarionte, afectan la integridad de 
las uniones estrechas, degradan la red de microtúbulos, modulan la estructura 
del citoesqueleto de actina, inducen la formación de filopodios y alteran la 
función mitocondrial (Kenny B, 2002). Un efector de gran importancia en la 
patogénesis de EPEC es la proteína Tir (Tir, por sus siglas en inglés, translocated 
intimin receptor). Después de que Tir es translocado a la célula hospedera vía el 
SST3, se inserta en la membrana plasmática del enterocito en donde adopta una 
topología de asa en la que los extremos amino y carboxilo se mantienen 
citosólicos (Campellone KG y Leong JM, 2003), mientras que su región central 
permanece extracelular y actúa como un receptor para una adhesina de 
membrana externa de EPEC llamada intimina (Kenny B, et al., 1997). Éste es el 
único ejemplo conocido en el que la bacteria transloca su propio receptor para 
unirse a las células eucariontes. Además, se han reportado otras proteínas 
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10
 
eucarióticas adicionales que también pueden actuar como receptores para la 
intimina (fig. 3) (Kaper JB, et al., 2004). 
 
 
Fig. 3. Modelo de infección por EPEC. El modelo de patogénesis de EPEC se divide en tres etapas: 
(1) adherencia inicial, (2) transducción de señales y (3) adherencia íntima. Tomada de 
http://www.fernness.com/science-15.htm 
 
 Una vez que ocurre la interacción entre Tir y la intimina se da la adherencia 
íntima de EPEC a la superficie del enterocito. Además de su papel como receptor, 
Tir tiene funciones importantes de señalización que al ser fosforilado en la 
tirosina 474, por al menos dos cinasas del hospedero, Fyn y Abl. La fosforilación 
de Tir genera un sitio de reclutamiento para las proteínas adaptadoras Nck1 y 
Nck2, llamadas conjuntamente Nck. El dominio SH3 de Nck recluta y activa a la 
proteína N-WASP, lo que conlleva a la activación del complejo remodelador de 
actina, Arp2/3, y a la acumulación de filamentos de actina por debajo del sitio de 
adhesión de la bacteria, dando lugar a la formación del pedestal característico de 
la lesión A/E (Kalman D, et al., 1999). Otras proteínas del citoesqueleto como 
vinculina, cortactina, talina y α-actinina también son reclutadas al pedestal (fig. 3) 
(Vallance BA y Finlay BB, 2000). 
 
 Por otro lado, en el LEE están codificadas 7 proteínas efectoras, Tir, Map, EspB, 
EspF, EspG, EspH y EspZ que son translocadas vía SST3 directamente a la célula 
hospedera para inducir cambios en la misma e inducir la formación de la lesión 
Adherencia íntima Transducción de señales Adherencia inicial 
EPEC EPEC 
EPEC 
eae 
eae BFP bfp 
per 
LEE Intimina 
Ca2+, IP3, PKC 
Intimina 
CesT 
EspD 
EspA 
EspB 
Actina, α-actinina, 
Talina, Ezrina, VASP, 
Arp 2/3, MLC-P, Vilina 
Tir 
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11
 
A/E. El efector Map interfiere con la estabilidad de la membrana mitocondrial 
produciendo la deformación, el crecimiento y daño total de este organelo con la 
consecuente inducción de la apoptosis celular. EspB, además de su papel en la 
formación del poro de translocación actúa como efector que impide la fagocitosis 
de la bacteria (Croxen MA y Finlay BB, 2010). EspF participa en la destrucción de 
la barrera intestinal, provocando la pérdida de resistencia transepitelial y 
aumentando la permeabilidad paracelular, lo que causa diarrea en el individuo 
infectado por EPEC. EspG activa la formación de fibras de estrés de actina y la 
destrucción de los microtúbulos interaccionando con las tubulinas por debajo del 
sitio de adherencia bacteriana. EspH se encarga de modular la estructura del 
citoesqueleto, especialmente de la actina, influyendo así en la formación del 
pedestal (Vallance BA y Finlay BB, 2000). Por otra parte, se ha identificado que 
EspZ inhibe la translocación de proteínas efectoras vía SST3, por lo que se 
propone que EspZ mide la duración del proceso de translocación de proteínas 
efectoras asegurando la colonización e infección de EPEC (Berger CN, et al., 
2012). Por otro lado, las proteínas de virulencia Nle (codificadas fuera del LEE) 
también participan en el proceso de infección por EPEC. Entre los efectores no 
codificados en el LEE, NleA (denominado EspI), NleB y Cif son esenciales para la 
virulencia de EPEC, llevando a cabo diversas alteraciones en el enterocito las 
cuales incluyen actividades apoptóticas, alterando la respuesta inmune a través 
de la inhibición de la vía NF-kB, incrementando la permeabilidad celular, 
inhibiendo la división celular, promoviendo la destrucción de microtúbulos del 
citoesqueleto, inhibiendo la opsonofagocitosis, entre otras alteraciones (García-
Angúlo VA, et al., 2012). 
 
 A pesar de los avances en el entendimiento de los mecanismos moleculares 
que inducen la lesión A/E y la formación de los pedestales de actina, todavía no 
se ha esclarecido el mecanismo global que involucra a EPEC en la diarrea. Se 
cree que la unión de la bacteria al pedestal provee una fuerte adherencia de 
EPEC a la superficie celular, previniendo que EPEC sea eliminada al sobrevenir la 
diarrea. 
 
_____________________________________________________________________ 
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12
 
2.5 Locus de esfacelamiento enterocítico de EPEC. 
Los genes necesarios para inducir la lesión A/E están codificados en una región 
cromosomal llamada locus de esfacelamiento enterocítico, LEE, la cual es una 
isla de patogenicidad de 35.6 kb que contiene 41 marcos de lectura abiertos, 
agrupados principalmente en 5 operones policistrónicos (LEE1 a LEE5) (Jarvis KG, 
et al., 1995). 
 
 En el LEE están codificados los componentes estructurales que forman el SST3, 
reguladores transcripcionales, proteínas efectoras, las proteínas involucradas en 
la adherencia íntima, chaperonas y otras proteínas cuya función es desconocida 
(Jarvis KG, et al., 1995). Los operones LEE1, LEE2 y LEE3 contienen 
principalmente los genes que codifican a los componentes estructurales del 
SST3, el LEE4 codifica a las proteínas translocadoras, y el LEE5 contiene los 
genes involucrados en la adherencia íntima. Los genes presentes en la isla LEE 
de EPEC son suficientes para inducir la lesión A/E, ya que si se transfieren a una 
cepa comensal de E. coli ésta es capaz de generar dicho fenotipo (fig. 4) 
(McDaniel TK y Kaper JB, 1997). 
 
 El LEE además contiene el gen eae que codifica para la intimina, una proteína 
de la membrana externa bacteriana de 94 kDa. Además de mediar la adherencia 
íntima de EPEC a las células del epitelio intestinal, la intimina también estimula 
diferentes respuestas inmunes, así como también la hiperplasia intestinal críptica 
(Kaper JB, et al., 2004). 
 
 La regulaciónde la transcripción de los genes del LEE depende de condiciones 
ambientales, detección del quorum y diversos reguladores transcripcionales tales 
como Ler, GrlA y GrlR, mismos que forman parte de la isla LEE. Ler, codificado en 
el primer gen del operón LEE1, regula positivamente la transcripción de los 
operones LEE2 a LEE5 y funciona como un desrepresor que contrarresta el efecto 
negativo que ejerce H-NS sobre la expresión de dichos operones. Por otro lado, 
GrlA es esencial para la activación eficiente de los genes de la isla ya que activa 
directamente al gen que codifica para Ler, con quien establece un ciclo de 
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13
 
regulación positiva ya que Ler también activa la expresión del operón grlRA, 
favoreciendo ambos la expresión de los genes del LEE. Por otra parte, GrlR actúa 
como un regulador negativo de la transcripción de la isla LEE al interactuar y, por 
lo tanto, inhibir dicha transcripción mediante su interacción con GrlA (Barba J, et 
al., 2005). 
 
 
Fig. 4. Locus de esfacelamiento enterocítico (LEE) de EPEC (Dean P, et al., 2005; modificada por 
García E). 
 
 Por otro lado, el operón per del plásmido EAF codifica para las proteínas PerA, 
PerB y PerC. PerA regula la producción de la fimbria BFP mediante la activación 
de los genes bfpA y perA. Por su parte, PerC activa la expresión del gen ler, dando 
lugar a una cascada reguladora dependiente de PerA, ya que éste autorregula la 
expresión del operón per (Barba J, et al., 2005). 
 
2.6 Producción de diarrea. 
El principal efecto que conlleva la infección por EPEC es la diarrea acuosa, que 
puede contener moco pero no sangre. Otros síntomas asociados pueden incluir 
fiebre, malestares, vómito, intolerancia a la comida, deshidratación y pérdida de 
peso. La diarrea puede durar de 5-15 días, pero puede convertirse en crónica 
(Blank TE, et al., 2002). La pérdida de las microvellosidades y en consecuencia, la 
mala absorción en esta región contribuyen a la diarrea (Chen HD y Frankel G, 
2005). Las causas de la aparición de diarrea en individuos infectados con EPEC 
son multifactoriales. Varias investigaciones han involucrado la alteración del 
_____________________________________________________________________ 
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14
 
transporte de electrolitos y la apertura de canales durante la infección. La 
alteración de la permeabilidad epitelial puede también contribuir. 
 
 La secreción de efectores por EPEC es capaz de inducir una cascada de 
señalización dentro de la célula hospedera, resultando en la fosforilación de las 
cadenas ligeras de la miosina (MLC), ocasionando un incremento en la 
permeabilidad de las uniones estrechas, afectándose el proceso de transporte y 
absorción pasiva de agua como consecuencia de la disipación del gradiente 
electroquímico (Chen HD y Frankel G, 2005). Estas alteraciones, junto con el 
esfacelamiento de las microvellosidades del epitelio, que impide la correcta 
función de absorción, son también responsables de la aparición de la diarrea 
intensa (Nataro JP y Kaper JB, 1998). Además, como consecuencia de la 
translocación de proteínas efectoras, se genera un aumento en los flujos 
intracelulares de calcio (Ca2+), inducido por el inositol-1,4,5-trifosfato (IP3), lo que 
resulta en cambios importantes del citoesqueleto del enterocito debido al 
rompimiento y polimerización de la actina. El IP3 resulta de la hidrólisis del 
fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PIP2) por la fosfolipasa C (PLC), la cual parece ser 
activada como resultado del proceso de patogénesis de EPEC (Kaper JB, et al., 
2004). 
 
 Recientemente, empleando modelos de infección in vivo con Citrobacter 
rodentium, se descubrió que las acuaporinas (canales de agua) juegan también 
un papel importante durante la producción de diarrea por patógenos A/E, 
alterándose la distribución de las mismas durante la enfermedad (Guttman JA, et 
al., 2007). 
 
2.7 Sistema de secreción tipo 3 (SST3). 
Las bacterias secretan un gran número de proteínas al medio extracelular como 
toxinas, adhesinas y enzimas hidrolíticas requeridos en procesos tales como la 
biogénesis de estructuras como el inyectisoma y flagelo, la adquisición de 
nutrientes y la expresión de factores de virulencia. A pesar del número, la 
diversidad y la amplia variedad de funciones que desempeñan las proteínas 
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15
 
secretadas (proteólisis, hemólisis, citotoxicidad, etc.) éstas son translocadas 
utilizando un número limitado de mecanismos. Las vías de secreción en las 
bacterias gram negativas han sido clasificadas en cinco grupos principales: 
secreción tipo I, II, III, IV y los autotransportadores. Dicha clasificación se basa en 
la naturaleza molecular de las maquinarias de transporte y las reacciones que 
éstas catalizan. Sin embargo, estos grupos se pueden subdividir en dos grandes 
clases dependiendo del mecanismo que se utilice para el transporte a través de 
la membrana plasmática. Las vías Sec dependientes, que utilizan el sistema de 
secreción denominado Sec, en el que las proteínas a secretarse presentan una 
secuencia señal o péptido líder en el extremo amino-terminal; y las Sec 
independientes en las que los sustratos se pueden translocar directamente 
desde el citosol hasta el exterior celular sin que exista un intermediario 
periplásmico, ni una secuencia señal en el extremo amino terminal (González 
Pedrajo B y Dreyfus G, 2003). En el presente trabajo se describe brevemente el 
SST3 poniendo especial énfasis en el SST3 de EPEC. 
 
 El SST3 es una vía Sec independiente en la que la secreción ocurre en un sólo 
paso desde el citosol hasta el exterior celular, que desempeña un papel central 
en la patogenicidad de muchas bacterias gram negativas. El SST3 ha sido 
identificado en una gran variedad de patógenos de humanos, animales y plantas, 
incluyendo especies de Bordetella, Yersinia, entre otros. Mediante este sistema 
los efectores de virulencia se pueden translocar hasta el citosol de la célula 
eucarionte. La maquinaria está conservada entre los diferentes patógenos, sin 
embargo, las proteínas secretadas difieren completamente, por lo que el mismo 
mecanismo de transporte puede generar una amplia gama de enfermedades. 
Además de su papel en la patogénesis, el SST3 se requiere para la biogénesis 
flagelar. Los sustratos a translocarse por el SST3 carecen de una señal de 
secreción definida, sin embargo, para algunas proteínas tanto del sistema 
flagelar como del de virulencia se ha demostrado que la señal se localiza en el 
dominio amino terminal. Por otro lado, en todos los SST3 estudiados existen 
proteínas chaperonas que comparten características comunes como el tamaño 
pequeño y punto isoeléctrico ácido. La exportación de algunos sustratos es 
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16
 
facilitada por dichas chaperonas, las que se propone mantienen a las proteínas 
en una conformación adecuada para la secreción, previniendo además la 
agregación prematura en el citosol. Sin embargo, el papel directo de las 
chaperonas como posible señal de reconocimiento en la secreción, así como su 
papel en la organización de la jerarquía de translocación de los efectores aún no 
ha sido demostrado (González Pedrajo B y Dreyfus G, 2003). 
 
2.8 Sistema de secreción tipo 3 de EPEC. 
El SST3 es una estructura compleja de más de 20 proteínas que forma una 
nanomáquina denominada inyectisoma, la cual funciona como una jeringamolecular para inyectar proteínas de virulencia al citosol de la célula hospedero. 
La patogénesis de EPEC se vincula estrechamente al SST3 o inyectisoma (Elliot 
SJ, et al., 1998). 
 
 El inyectisoma de EPEC se compone principalmente de dos regiones; (1) un 
cuerpo basal cilíndrico y (2) una aguja-filamento. El cuerpo basal le permite al 
inyectisoma atravesar ambas membranas celulares así como el espacio 
periplásmico. Se compone de un anillo en la membrana externa, dos anillos en la 
membrana interna, uno formado por la lipoproteína EscJ y otro formado por la 
proteína EscD, y un eje central que conecta ambos anillos dando lugar a un canal 
continuo (Marlovits TC, et al., 2004; Ogino T, et al., 2006). En EPEC la proteína 
EscC forma el anillo de la membrana externa. Este segundo anillo puede 
representar el sitio de anclaje de las proteínas membranales del aparato de 
exportación, EscR, EscS, EscT, EscU y EscV (Crepin VF, et al., 2005). 
 
 La proteína EscQ en EPEC forma un anillo citoplásmico que al parecer favorece 
la localización del complejo de la ATPasa (EscN) y su regulador negativo (EscL), en 
la base del sistema (Pallen MJ, et al., 2005). Además, se ha sugerido que EscQ, 
EscN y EscL forman un complejo ternario en el cual EscL estabiliza la interacción 
de EscQ con EscN, interacción de gran importancia que asegura la secreción en el 
SST3 (Biemans-Oldehinkel E, et al., 2011). Adicionalmente, se propone que la 
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17
 
proteína EscI conforma el eje periplásmico que comunica los anillos de las 
membranas interna y externa (Sal-Man N, et al., 2012). 
 
 En la región extracelular del inyectisoma, la proteína EscF polimeriza para 
formar la aguja, estructura rígida y hueca de una longitud aproximada de 23 nm 
(Monjarás FJ, et al., 2012). Una característica distintiva del SST3 de EPEC, así 
como de otros patógenos causantes de la lesión A/E, es la polimerización de la 
proteína translocadora EspA, en la punta o región distal de la aguja. La proteína 
EspA polimeriza un filamento que se extiende formando un puente físico, de 
hasta 800 nm, que permite el contacto entre la bacteria y la membrana de la 
célula (Ghosh P, 2004). Se piensa que una vez que EPEC hace contacto con la 
célula hospedera las proteínas translocadoras EspB y EspD son secretadas. 
Ambas proteínas se ubican en la punta del filamento EspA y se insertan en la 
membrana plasmática del hospedero para formar un poro que permitirá la 
translocación de las proteínas efectoras al citoplasma de la célula hospedero (fig. 
5) (Ide T, et al., 2001). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Fig. 5. Esquema representativo del inyectisoma de EPEC. El SST3 de EPEC se compone 
principalmente de dos regiones (1) un cuerpo basal cilíndrico y (2) una aguja-filamento. El cuerpo 
basal se compone de un anillo en la membrana externa compuesto por subunidades de la 
proteína EscC. Por otro lado, en la membrana interna se ensamblan dos anillos, uno en la cara 
periplásmica de la membrana interna formado por subunidades de la lipoproteína EscJ, mientras 
que el segundo anillo, asociado con la cara citoplásmica, está formado por subunidades de la 
proteína EscD. Además, subunidades de la proteína EscI forman un eje periplásmico que 
comunica los anillos de la membrana externa e interna. La región extracelular del inyectisoma 
está formada por la aguja y el filamento. En el citoplasma de EPEC, el complejo chaperona-efector 
es dirigido hacia el aparato de exportación donde se seleccionan las proteínas que serán 
secretadas a través del sistema. 
EspA 
EspB/D 
EscF EscC 
EscI 
EscJ 
EscD 
EscL 
EscQ 
EscV,T,R,U,S 
EscN 
ME 
MI 
PC 
Hospedero 
M Sustratos tardíos 
Tir, EspZ, EspF, EspH, EspG, Map 
Sustratos intermedios 
EspA, EspB, EspD 
Sustratos tempranos 
EscI, EscF 
Segundo interruptor 
SepD/SepL 
Primer interruptor 
EscP/EscU 
Anillo en membrana externa 
EscC 
Anillos en membrana interna 
EscD, EscJ 
Eje periplásmico 
EscI 
Aparato de exportación 
EscR, EscS, EscT, EscU, EscV 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
 
19
 
2.9 Interruptores moleculares en el ensamblaje del SST3 de EPEC. 
El ensamblaje del inyectisoma es un proceso secuencial y cuidadosamente 
orquestado que requiere la coordinación de muchas proteínas localizadas en el 
citosol, en las membranas interna y externa bacteriana y en la superficie celular. 
Durante la biogénesis del inyectisoma, los componentes de los anillos 
membranales y las proteínas del aparato de exportación son secretados vía la 
maquinaria Sec, que es la vía general de secreción que media la translocación de 
proteínas a través de la membrana interna y la inserción de proteínas 
membranales; mientras que los subsecuentes componentes son exportados vía 
el SST3 (He SY, et al., 2004; Nijeholt JA y Driessen AJ, 2012). 
 
 El ensamblaje de los componentes Sec dependientes del SST3 de EPEC 
comienza con la formación del anillo de la membrana externa, el cual se extiende 
al periplasma y está formado por la secretina EscC y de los dos anillos de la 
membrana interna, formados por la proteína EscD y la lipoproteína EscJ. Con el 
ensamblaje de los anillos membranales queda constituido un canal que sirve de 
base para el ensamblaje de los componentes restantes del inyectisoma. 
Adicionalmente, se forma un complejo citosólico formado por las proteínas EscL, 
EscN y EscQ, que se ensambla en un solo paso y no requiere de las proteínas 
membranales que forman el aparato de exportación. EscN es la ATPasa necesaria 
para la secreción de sustratos vía SST3; EscL es el regulador negativo de la 
actividad de la ATPasa y EscQ forma un anillo citoplásmico, el anillo C, cuyo 
homólogo en Salmonella podría funcionar como una plataforma de secreción 
selectiva de translocadores y efectores, asegurando la jerarquía de secreción vía 
el SST3 (Biemans-Oldehinkel E, 2011; Dewoody RS, et al., 2013; Diepold A, et al., 
2010; Lara-Tejero M, et al., 2011; Monjarás FJ, et al., 2012). 
 
 El aparato de exportación está compuesto de las proteínas integrales de 
membrana EscR, S, T, U y V, y se ensambla en la cavidad de los anillos de la 
membrana interna. Aunque se conoce poco sobre la función de las proteínas que 
forman el aparato de exportación en el proceso de ensamblaje del inyectisoma, 
se cree que dichas proteínas actúan como receptores que reconocen las señales 
_____________________________________________________________________ 
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20
 
de secreción de los sustratos y forman un canal de secreción en la membrana 
interna. YscV de Yersinia, y EscV en EPEC, al parecer interaccionan con sustratos 
del SST3, chaperonas y proteínas solubles del aparato de exportación. YscU, en 
EPEC EscU, controla el cambio en la especificidad de secreción de subunidades 
de la aguja a proteínas translocadoras y efectoras. Sobre YscR, S y T se sabe que 
son importantes para promover la polimerización de YscV. En conjunto, los anillos 
membranales, la ATPasa, el anillo C y el aparato de exportación, forman un 
cuerpo basal completo y funcional para la secreción de sustratos (Dewoody RS, et 
al., 2013; Diepold A, et al., 2010; Diepold A, et al., 2011; Ghosh P, 2004; He SY, 
et al., 2004). 
 
 Una vez que se ha completado la formación del cuerpo basal comienza la 
secreción de sustratos vía SST3. Existe una jerarquía en la secreción de dichos 
sustratos, misma que depende tanto de la etapa del ensamblaje del inyectisoma 
como de la funcionalidadde dicha estructura. Los primeros sustratos en ser 
secretados vía SST3 son los sustratos tempranos, que en EPEC son EscI, 
componente principal del eje periplásmico, y EscF, la aguja. Posteriormente, se 
secretan los sustratos intermedios, EspA, EspB y EspD, que forman el filamento y 
el poro de translocación, finalmente se secretan los sustratos tardíos, que son las 
proteínas efectoras o de virulencia Tir, EspZ, EspF, EspH, EspG y Map (Deane JE, 
et al., 2010; Pallen MJ, et al., 2005). 
 
 Los mecanismos para asegurar un control jerárquico y temporal del ensamblaje 
de los componentes del SST3 están en proceso de estudio. Sin embargo, se ha 
propuesto la existencia de dos interruptores moleculares conservados en los 
SST3 de bacterias gram negativas. El primer interruptor molecular controla la 
longitud de la aguja, el cambio en la especificidad de secreción de sustratos 
tempranos a intermedios, la formación del filamento EspA y la secreción de 
efectores. El segundo interruptor molecular controla el cambio en la especificidad 
de secreción de sustratos intermedios a tardíos, bloqueando la secreción de 
proteínas efectoras durante la morfogénesis del filamento en EPEC (Deane JE, et 
al., 2010; O’Connell CB, et al., 2004). 
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2.9.1 Primer interruptor molecular: control de la secreción de sustratos 
tempranos, de la longitud de la aguja, formación del filamento y secreción de 
efectores. 
El cambio en la especificidad de secreción de sustratos tempranos a intermedios 
se lleva a cabo una vez que se ha ensamblado la aguja, alcanzando una longitud 
de ~23 nm en EPEC, entonces se activa el primer interruptor molecular. Este 
proceso implica dos mecanismos: (1) la medición de la longitud de la aguja y (2) 
la interacción de ‘la regla molecular’ con proteínas de la familia EscU/YscU/FlhB 
de la membrana interna (Dewoody RS, et al., 2013; Thomassin JL, et al., 2011; 
Wagner S, et al., 2010). 
 
 El control de la longitud de la aguja es un proceso altamente regulado en el que 
se ha implicado en Y. enterocolitica a la proteína YscP, miembro de la familia de 
proteínas T3S4 (del inglés, Type III Secretion Substrate Specificity Switch), que 
también incluye a Spa32 en Shigella, InvJ en Salmonella y recientemente a EscP 
en EPEC. En ausencia de la proteína YscP, las mutantes sobresecretan YscF (EscF 
en EPEC) y forman inyectisomas con agujas extremadamente largas pero 
defectuosas en la secreción de proteínas efectoras. Además, deleciones e 
inserciones en la secuencia de yscP conllevan al ensamblaje de agujas cortas y 
largas, respectivamente; por lo que existe una correlación linear entre el número 
de residuos de aminoácidos de YscP y la longitud de la aguja, sugiriendo que 
YscP en su conformación extendida funciona como ‘regla molecular’ (Dewoody 
RS, et al., 2013; Journet L, et al., 2003; Monjarás FJ, et al., 2012; Wagner S, et 
al., 2010). 
 
 En el modelo de ‘regla molecular’ de Journet y colaboradores, se propone que 
YscP se secreta vía SST3 y funciona como un polipéptido anclado al extremo 
distal de la aguja en crecimiento, así como, a la base de la misma. Al mismo 
tiempo se secretan subunidades de la aguja hasta que ésta alcanza la longitud 
de la proteína YscP extendida; en este punto, YscP interacciona con YscU, 
proteína transmembranal del aparato de exportación, y provoca un cambio en la 
especificidad de secreción de sustratos lo cual finaliza la secreción de 
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subunidades de la aguja (sustratos tempranos) permitiendo la secreción de los 
sustratos intermedios (primer interruptor molecular). Recientemente, Wagner y 
colaboradores, demostraron que se requiere sólo una molécula de YscP por 
inyectisoma para controlar la longitud de la aguja. Además se observó que YscP 
no es totalmente indispensable para el cambio en la especificidad de sustratos 
(puesto que éste puede ocurrir de forma espontánea aunque ineficiente) pero sí 
favorece que éste ocurra; lo mismo sucede con EscP en EPEC según datos 
publicados por nuestro laboratorio (Journet L, et al., 2003; Monjarás FJ, et al., 
2012; Wagner S, et al., 2010). 
 
 Por otro lado, los miembros de la familia de proteínas YscU/FlhB/Spa40 poseen 
un dominio carboxilo citoplásmico (C) que sufre un procesamiento autocatalítico 
produciendo un subdominio C-terminal (CC), el cual permanece estrechamente 
asociado con el subdominio N-terminal de la región carboxilo (CN) asociado a la 
membrana. Dicha autoproteólisis ocurre entre los residuos de aminoácidos 
asparagina (Asn) y prolina (Pro) en el motivo altamente conservado NPTH. 
Mutaciones que modifican o eliminan la Asn o Pro del NPTH evitan la 
autoproteólisis e interfieren con la función de interruptor molecular. El fenotipo de 
dichas mutantes consiste en la no secreción de sustratos intermedios, como 
EspA, EspB y EspD en EPEC. Por tanto, Sorg y colaboradores propusieron que la 
autoproteólisis de YscU se requiere para que ésta adopte la conformación 
adecuada que permita el reconocimiento de las proteínas translocadoras y su 
secreción (Deane JE, et al., 2010; Edqvist PJ, et al., 2003; Sorg I, et al., 2007; 
Zarivach R, et al., 2008). 
 
 Finalmente, en EPEC los homólogos de YscP y YscU son las proteínas EscP y 
EscU, y recientemente se demostró que éstas regulan en EPEC la longitud de la 
aguja y el cambio en la especificidad de secreción de sustratos tempranos a 
intermedios y tardíos (Monjarás FJ, et al., 2012; Zarivach R, et al., 2008). 
 
 
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23
 
2.9.2 Segundo interruptor molecular: facilita la secreción de translocadores y 
bloquea la secreción de sustratos tardíos (efectores). 
Las proteínas translocadoras no son necesarias para que se lleve a cabo la 
secreción tipo III en ensayos in vitro en los sistemas bacterianos, pero sí se 
requieren para la translocación de efectores debido a que ensamblan el conducto 
de translocación y el poro en la membrana del hospedero. Cada bacteria tiene 
sus propios efectores de acuerdo a sus propias estrategias de patogénesis, sin 
embargo, los translocadores están generalmente conservados entre los 
patógenos. Debido a que los translocadores se requieren para la inyección de 
efectores al interior del hospedero, se propone que los patógenos han 
desarrollado mecanismos que aseguran que los translocadores sean secretados 
previo a los efectores (Deng W, et al., 2005). 
 
 El segundo interruptor molecular regula la transición en la secreción de 
translocadores (sustratos intermedios) a efectores (sustratos tardíos). Se ha 
identificado una familia de proteínas que regulan la secreción de sustratos a este 
nivel, MxiC en Shigella, SsaL e InvE en Salmonella, YopN en Yersinia y SepL y 
SepD en EPEC. Todos los miembros de esta familia de proteínas evitan la 
secreción de efectores ya que su deleción causa la hipersecreción de éstos. 
Además, mutantes en sepL o sepD presentan un fenotipo adicional, que es la 
anulación de la secreción de las proteínas translocadoras EspA, EspB y EspD y, 
por tanto, no hay formación del filamento EspA ni translocación de proteínas 
efectoras al interior de la célula hospedero. Estas observaciones muestran la 
habilidad del SST3 de EPEC para discriminar entre la secreción de las proteínas 
translocadoras y de las efectoras. Con base en esto se ha propuesto que esta 
familia de proteínas juega un papel directo en la secreción vía SST3 facilitando la 
secreción de translocadores y reprimiendo la de efectores hasta que el 
inyectisoma hace contacto con la célulaeucarionte (Kresse AU, et al., 2000; 
O’Connell CB, et al., 2004; Pallen MJ, et al., 2005). 
 
 SepL es una proteína de 351 aminoácidos cuya masa molecular es de 39.9 
kDa, es una proteína soluble citoplásmica aunque se ha encontrado además en 
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fracciones de membrana interna y externa. SepL se considera un componente no 
estructural del sistema de secreción pero es esencial para la secreción de 
translocadores y, por tanto, es requerido para desarrollar la lesión A/E. SepL 
interacciona físicamente con SepD, una proteína que se ha encontrado asociada 
a membrana a pesar de carecer de dominios transmembranales y de su 
predicción citosólica. Se cree que SepD se requiere para la localización de SepL 
en la membrana interna bacteriana. La deleción del gen sepD tiene el mismo 
fenotipo que una mutante en sepL, abate la secreción de translocadores e 
hipersecreta efectores, como por ejemplo Tir. Debido a su fenotipo se propuso, y 
ahora está demostrado, que SepL y SepD interaccionan y forman un complejo 
que regula el cambio en la especificidad de secreción de sustratos intermedios a 
tardíos (Deng W, et al., 2005; O’Connell CB, et al., 2004; Wang D, et al., 2008). 
 
 Aunque no se conoce a detalle el mecanismo de funcionamiento del segundo 
interruptor molecular, una reciente hipótesis propone que el complejo SepL-SepD 
bloquea la secreción de efectores mientras se ensambla el translocón. Se ha 
reportado que la interacción de SepL-Tir es importante para retener la secreción 
de los efectores debido a que la secreción de Tir se requiere para la secreción de 
los demás efectores. Una vez formado el poro de translocación en el hospedero la 
bacteria detecta una disminución en la concentración de calcio, señal que se 
transmite mediante un mecanismo desconocido al complejo SepL-SepD 
causando su disociación o cambio conformacional, permitiendo así la salida de 
los efectores directamente al citoplasma de la célula hospedero. Se ha reportado 
que la quelación de calcio en el medio reduce la secreción de proteínas 
translocadoras e incrementa la del efector Tir en EPEC y DAEC, fenómeno que 
también ocurre en Yersinia spp., donde bajas concentraciones de calcio 
favorecen la secreción del efector YopE y otros factores de virulencia (Ide TS, et 
al., 2001; Kenny BA, et al., 1997; Lee VT, et al., 2001; Thomas NA, et al., 2007; 
Wang D, et al., 2008). 
 
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III. ANTECEDENTES 
Existen varios estudios en diferentes especies bacterianas que sugieren la 
interacción entre las proteínas EscP y EscU, componentes del primer interruptor 
molecular en EPEC. El concepto de interruptor molecular o switch para el cambio 
en la especificidad de sustratos del SST3 se acuñó primero en el sistema flagelar. 
El flagelo bacteriano consiste de tres partes: el cuerpo basal, el cual está 
embebido en la pared celular y en las membranas de la bacteria; el gancho, el 
cual está localizado en la superficie celular; y un largo filamento flagelar, el cual 
se ensambla después del gancho y sirve para impulsar a la bacteria (Moore SA y 
Jia Y, 2010; Mizuno S, et al. 2011; Anderson JK, et al., 2009). 
 
 Cepas mutantes en el gen flagelar fliK de Salmonella typhimurium exhiben un 
fenotipo denominado ‘poligancho’ caracterizado por la presencia de un gancho 
extremadamente largo y carente del filamento, siendo la longitud normal del 
gancho de 55 nm (Williams AW, et al., 1996; Minamino T, et al., 1999). Sin 
embargo, el fenotipo de mutantes en fliK puede ser suprimido por mutaciones en 
el gen que codifica la proteína FlhB, proteína que forma parte del aparato de 
exportación del sistema flagelar de Salmonella (Williams AW, et al., 1996; Hirano 
T, et al., 1994). Un fenómeno similar ocurre en el sistema de virulencia de 
Xanthomonas, donde mutaciones en la proteína HrcU (FlhB) suprimen el fenotipo 
de mutantes en la proteína HpaC (FliK), restaurándose así la secreción de las 
proteínas del translocón (Lorenz C y Büttner D, 2011). En relación con estos 
datos se ha demostrado que FliK interacciona con el dominio citoplásmico de 
FlhB, miembro de la familia Spa40/YscU a la que también pertenece la proteína 
EscU de EPEC. De esta forma, después del ensamblaje del gancho y una vez que 
éste ha alcanzado su longitud correcta, FliK regula un cambio en la especificidad 
de reconocimiento de sustratos al modificar la conformación topológica de FlhB, 
deteniendo así la exportación de subunidades del gancho y promoviendo la 
secreción de la flagelina, cuyas subunidades forman el filamento (Ryan KA, et al., 
2005; Evans LD, et al., 2006). 
 
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26
 
 Una regulación de la secreción similar se ha reportado en el sistema de 
virulencia de varias especies bacterianas tales como Salmonella, Shigella, 
Yersinia y Xanthomonas, por mencionar algunos ejemplos (Rüssmann H, et al., 
2002; Tamano K, et al., 2002; Magdalena J, et al., 2002; Lorenz C y Büttner D, 
2011). En Salmonella, una cepa mutante en el gen invJ ensambla inyectisomas 
con agujas extremadamente largas y no es capaz de secretar proteínas efectoras, 
lo cual sugiere que en esta mutante no funciona el primer interruptor molecular 
(Rüssmann H, et al., 2002). Por otro lado, un trabajo reciente en Shigella muestra 
que la proteína Spa32 participa en el control de la longitud de la aguja, y que la 
proteína es funcionalmente equivalente e intercambiable con su homólogo InvJ 
de Salmonella y que se secreta vía SST3 (Tamano K, et al., 2002). Se demostró 
por TEM (por sus siglas en inglés, Transmission Electron Microscopy) que al 
deletar el gen que codifica para Spa32, los SST3 de Shigella poseen agujas de 
varias longitudes, en el rango de entre 40 y 1,150 nm siendo entre 40 y 50 nm la 
longitud normal. Al complementar la cepa Δspa32 con la proteína Spa32 se 
restauró el rango normal de longitud de la aguja. Además, en este mismo estudio 
se demostró que la proteína Spa32 es esencial para la funcionalidad del SST3 ya 
que es crucial para el ensamblaje de SST3 funcionales que permitan a la bacteria 
infectar al hospedero. Este estudio representa la primera evidencia estructural y 
funcional de que Spa32 es una proteína secretada vía SST3 y responsable de 
controlar la longitud de la aguja del mismo (Tamano K, et al., 2002). El conjunto 
de datos obtenidos en el sistema flagelar, así como, en los sistemas de virulencia 
bacterianos apoyan fuertemente la hipótesis de un interruptor molecular general 
formado por los miembros de la familia de proteínas FliK/InvJ/Spa32 y los 
miembros de la familia FlhB/YscU/Spa40. 
 
 Una vez observada la interrelación que existe entre miembros de ambas 
familias de proteínas se han llevado a cabo estudios para caracterizar este 
interruptor molecular. Por ejemplo, se ha reportado en Shigella que en ensayos 
de copurificación tipo pull down la proteína Spa32, interacciona con el extremo 
carboxilo de Spa40 (Botteaux A, et al., 2008). En Xanthomonas también se 
demostró por ensayos de copurificación tipo pull down que la proteína HpaC, 
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27
 
interacciona con el extremo carboxilo terminal de HrcU, y que dicha interacción se 
lleva a cabo sólo después de la autoproteólisis del C-terminal de HrcU con la 
consecuente formación de los subdominios HrcUCN y HrcUCC. Gracias a estos 
hallazgos se reconoció la importancia del motivo NPTH localizado en elextremo 
carboxilo terminal de los miembros de la familia FlhB/YscU/Spa40, por ser éste el 
sitio donde ocurre dicha proteólisis. Además de los estudios de interacción in 
vitro de estas proteínas también se han reportado ensayos de interacción in vivo 
mediante la técnica del doble híbrido. Por ejemplo, en S. flexneri se reportó que 
Spa32 interacciona con el extremo carboxilo terminal de Spa40 pero 
específicamente con el subdominio Spa40CC, localizado entre los aminoácidos 
309-342 (fig. 6) (Botteaux A, et al., 2010). 
 
 
 
Fig. 6. Los residuos 309-342 de Spa40, Spa40cc, son la región de interacción con Spa32. (a) 
Esquema topológico de la proteína Spa40 entera. (b) Alineamiento de la secuencia de Spa40CT 
con YscUC y FlhBC. Los residuos de aminoácidos encerrados en un margen representan el dominio 
de interacción de Spa40 con Spa32 (Botteaux A, et al., 2010). 
 
 
 
 
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 En el laboratorio se realizó un análisis bioinformático de EscU y EscP, previo a 
éste trabajo, para conocer las propiedades fisicoquímicas de estas proteínas y ver 
si existían características compartidas con las proteínas de la familia 
FlhB/YscU/Spa40 con EscU y de miembros de la familia FliK/InvJ/Spa32 con 
EscP (Monjarás Feria J, 2013). El análisis bioinformático indica que EscU 
comparte ≈ 40% de identidad con las proteínas de la familia FlhB/YscU/Spa40, y 
al igual que todas las proteínas de esta familia presenta cuatro dominios 
transmembranales y un dominio carboxilo terminal citoplásmico que se 
autoproteoliza entre la asparagina 262 y la prolina 263 del motivo NPTH (Fig. 7). 
 
 
 
Fig. 7. Alineamiento múltiple de EscU de EPEC, Spa40 de Shigella flexneri, SpaS de Salmonella 
enterica, YscU de Yersinia enterocolitica, BscU de Bordetella bronchiseptica, HrcU de 
Xanthomonas campestris y FlhB del sistema flagelar de Salmonella enterica (Tomado de 
Monjarás Feria J, 2013). 
 
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 Por otro lado, se realizó una búsqueda para encontrar proteínas con similitud 
de secuencia a EscP, usando la herramienta BLAST, donde las únicas proteínas 
relacionadas con el SST3 que se mostraron fueron las proteínas homólogas a 
EscP de los patógenos A/E Citrobacter rodentium (CR) y Escherichia coli 
enterohemorrágica (EHEC). EscP de EPEC comparte 97% de identidad con la 
proteína Orf16 de EHEC y 78% con Orf16 de CR (Fig. 8). 
 
 
Fig. 8. Alineamiento múltiple de EscP de EPEC, Orf16 de EHEC y Orf16 de CR. En negro se marcan 
los aminoácidos idénticos, en gris los aminoácidos similares y se subraya con verde los primeros 
35 aminoácidos de Orf16 de CR que no se reportaron cuando se secuenció el LEE de CR 
(Monjarás Feria J, 2013). 
 
 Ahora bien, este conjunto de datos sugiere la existencia de un interruptor 
molecular también en EPEC el cual estaría constituido principalmente por la 
proteína EscU, miembro de la familia FlhB/YscU/Spa40, y EscP, miembro de la 
familia de proteínas T3S4. En este trabajo se evaluó dicha interacción en un 
sistema in vivo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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IV. JUSTIFICACIÓN 
 
El ensamblaje del inyectisoma es un proceso ordenado y altamente regulado que 
permite la correcta biogénesis de esta estructura. Las interacciones proteína-
proteína tienen un papel central en este proceso ya que permiten la formación de 
complejos que participan en el reconocimiento diferencial de las proteínas de 
secreción por los componentes del sistema secretor. Ahora bien, en nuestro 
grupo de investigación estamos interesados en entender el mecanismo a través 
del cual se lleva a cabo la regulación de la secreción ordenada de proteínas a 
través del SST3 de Escherichia coli enteropatógena. El entendimiento de los 
mecanismos moleculares que regulan el proceso de secreción es crucial para la 
búsqueda de blancos terapéuticos que contrarresten la patogenicidad de esta 
bacteria. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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V. HIPÓTESIS 
 
La proteína EscP interacciona con componentes del sistema de secreción tipo III 
para la regulación de la secreción jerárquica de sustratos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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VI. OBJETIVOS 
 
General 
Caracterizar las interacciones proteína-proteína entre los componentes que 
regulan la especificidad de la secreción en el inyectisoma de Escherichia coli 
enteropatógena. 
 
Específicos 
1. Subclonación y clonación de los genes escP, escUC, escUCC, escN, sepL, 
sepD, tir, cesT y escF en los vectores de expresión pGADT7 y pGBKT7. 
2. Evaluación de las interacciones proteína-proteína usando el sistema del 
doble híbrido en levadura. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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VII. MATERIALES Y MÉTODOS 
 
7.1 Cepas bacterianas y medios de cultivo. 
Todas las cepas bacterianas utilizadas en el presente trabajo se cultivaron a 
37°C, en medio Luria Bertani (LB, 10 g peptona, 5 g extracto de levadura, 10 g 
de NaCl) o en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, de Gibco). 
Cuando se requirió, el medio se suplementó con ampicilina [100 μg/ml], 
kanamicina [50 μg/ml], estreptomicina [50 μg/ml] y/o tetraciclina [25 μg/ml] 
(tabla 1). 
 
Tabla 1. Cepas bacterianas utilizadas en este estudio 
Cepa Descripción Fuente/Referencia 
Top-10 
Cepa con una eliminación parcial del 
gen lacZ que permite la α-
complementación. Tiene una alta 
eficiencia de transformación. Resistente 
a estreptomicina. 
Invitrogen 
XL1-Blue 
Cepa derivada de K12. Mutante en la 
endonucleasa I. Resistente a 
tetraciclina. 
Stratagene 
Cepas de EPEC 
E2348/69 EPEC silvestre O127:H26. Resistente a 
estreptomicina. 
Donada por el Dr. J. L. 
Puente 
ΔescN 
E2348/69 conteniendo una eliminación 
en fase del gene escN. Resistente a 
estreptomicina. 
Donada por el Dr. J. L. 
Puente 
ΔescP 
E2348/69 conteniendo una eliminación 
en fase del gene escP e inserción de un 
casete de kanamicina. Resistente a 
estreptomicina y kanamicina. 
Monjarás Feria, J. 
2012 
 
 
7.2 Técnicas de biología molecular. 
 
7.2.1 Amplificación por PCR. 
A partir de la secuencia del DNA cromosomal de EPEC se diseñaron cebadores 
específicos para amplificar el dominio escUCC del gen escU por PCR (PCR, por sus 
siglas en inglés, Polymerase Chain Reaction), utilizando la enzima Taq DNA 
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34
 
polimerasa (Invitrogen) y los oligonucleótidos enlistados en la siguiente tabla 
(tabla 2). 
 
 El fragmento amplificado escUCC se visualizó mediante electroforesis en gel de 
agarosa al 1% en TAE 1X, mismo que se tiñó en una solución de bromuro de 
etidio y se observó en una lámpara de luz ultravioleta. 
 
Tabla 2. Oligonucleótidos utilizados para la amplificación del dominio escUcc 
Cebador Secuencia 5’ → 3’ Sitio de restricción 
escUccNdeIFw GTTATTGTTCATATGCCGACTCAC NdeI 
escUccBamHIRv TGAGCAAGGATCCGATTAATAATC BamHI 
 
 
 Los parámetros para llevar a cabo la amplificación mediante la técnica