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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
 DE MÉXICO 
 
 
 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
La elutriación centrífuga como un método de sincronización de 
células animales en las diferentes fases del 
ciclo celular 
 
 
 
TESIS 
 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
 
QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO 
 
 
PRESENTA 
 
 
 
Rodrigo Rosas Becerril 
 
 
 
 
 
 
 
 MÉXICO, D.F. 2013 
 
 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
JURADO ASIGNADO 
 
PRESIDENTE: Profesor: Euclides Ávila Chávez 
VOCAL: Profesor: José Ignacio Páramo Ramírez 
Secretario: Profesor: José Antonio Serrato Pérez 
1er. Suplente: Profesor: Perla Deyanira Maldonado Jiménez 
2ndo. Suplente: Profesor: Laura Carmona Salazar 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
 
Departamento de Bioquímica del 
Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias “Ismael Cosío Villegas” 
y Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina UNAM 
 
Asesor 
 
 
Dr. José Antonio Serrato Pérez 
 
Sustentante 
 
Rodrigo Rosas Becerril 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
A la maestra Isaura Carrera por enseñarme que cuando creemos que todo lo 
sabemos es justo cuando más podemos cometer errores. 
 
A los maestros Alain Quere y José de Jesús García Valdez por mostrarme que 
cuando un hombre se concentra en un solo objetivo se vuelve igual de 
poderoso que el láser, de modo que la respuesta obvia es el cumplimiento de 
su meta. 
 
Al Dr. José Antonio Serrato Pérez por darme la oportunidad de trabajar en un 
proyecto de vanguardia, de carácter aplicativo y que pone en alto la ciencia que 
se desarrolla en México. 
 
A los miembros del jurado Euclides Ávila Chávez y José Ignacio Páramo 
Ramírez, por la revisión de los manuscritos de tesis. 
 
Agradezco al proyecto Conacyt CB-2010-155653 por el financiamiento para la 
realización del proyecto, la asistencia técnica de la M. en C. Vanessa 
Hernández del IBT-UNAM, a los Doctores Tonatiuh Ramirez del IBT-UNAM por 
el uso del Coulter-Multisizer, Lourival Possani del IBT-UNAM por donar la línea 
celular BCF2, Enrique Piña, Magdalena Vilchis, Raquel Guinzberg y Antonio 
Díaz Cruz por las facilidades otorgadas para el uso del equipo de elutriación en 
el departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina-UNAM. 
 
 
 
 
 
A mis hermanos y amigos de la Facultad de Química, así como de la Escuela 
Nacional Preparatoria No.1, Miguel, Jimena, Sandra, Martin Corona, Adrian 
Jaen, Griselda, Irving, Wily, Marlene, Alejandro y por supuesto a la MVZ 
Guadalupe Velasco con quien he crecido y madurado en los últimos años de mi 
vida, gracias por compartir conmigo, gracias por enseñarme, gracias por formar 
parte de mi vida, siempre te llevo en mi corazón. 
 
A la Familia Velasco Arguijo que siempre me ha hecho sentir como un 
integrante mas de su familia, gracias por todas las atenciones y cálidos 
recibimientos que siempre han tendió para conmigo. 
 
 A Ricardo Gracia y a Manuel Pascual por ser unas magníficas personas llenas 
de luz que han iluminado mi camino y el de las personas que me rodean, 
gracias por mostrarme el verdadero propósito de la vida. 
 
 
 
 
Dedicatorias 
 
A mi padre Ricardo Rosas Cedillo con quien en los últimos años me he 
reinventado; realmente ha sido una aventura el poder reencontrarnos y de paso 
contagiar a la familia de este nuevo estilo de vida, gracias padre por todo tu 
apoyo en esta etapa, quiero que sepas que te admiro por todo lo que haz 
logrado y te respeto por todo lo que representas para mí. 
 
A mi madre Elvia Becerril Hernández por todo su amor y afecto incondicional, 
gracias por siempre confiar en mí y apoyarme en todos mis proyectos. Me 
siento muy orgulloso de ti madre, eres un ejemplo para mi y mis hermanos. 
Gracias por toda la paciencia y el apoyo que me haz brindado en esta etapa. 
No son suficientes las palabras cuando uno quiere decir gracias desde el 
corazón. 
 
A mi hermano Hugo Alberto Rosas Becerril con quien he pasado muy buenos 
momentos, gracias por mostrarme que ante la vida hay que tener carácter y 
mantener el temple en los peores momentos. Gracias por mostrarme los 
valores de la responsabilidad y la constancia. 
 
 
A mi hermano Ricardo Israel Rosas Becerril por ser un gran maestro de la vida, 
no sabes cuánto he aprendido de ti. En la vida no hay casualidades ni “por 
ques” si no lo que hay son causalidades y “para ques”. Gracias familia los amo.
 
 
 
INDICE GENERAL 
 
1. Indice de Figuras 1 
2. Indice de Tablas 2 
3. Abreviaturas 3 
4. Resumen 5 
5. Introducción 6 
6. Antecedentes 7 
6.1. Ciclo celular 7 
6.2. Sincronización célular 7 
6.2.1. Métodos químicos de arresto celular 8 
6.2.2. Métodos físicos de sincronización celular 10 
6.3. Elutriación centrifuga y sincronización 12 
6.3.1. Principio de operación del método de elutriación centrífuga 12 
6.4. La ingeniería de cultivo de células animales y el ciclo celular 15 
7. Justificación 18 
8. Objetivos 19 
9. Hipótesis 20 
10. Materiales y métodos 21 
10.1. Modelo biológico 21 
10.2. Medios de cultivo utilizados 21 
10.3. Mantenimiento de células 22 
10.3.1. Congelación 22 
10.3.2. Descongelación 22 
10.3.3. Condiciones de cultivo 23 
 
 
 
 
 
10.3.4. Cuantificación de la concentración y la viabilidad celular 23 
10.4. Determinación del tamaño celular 24 
10.5. Sistema de elutriación 24 
10.5.1. Procedimiento de elutriación 25 
10.5.2. Preparación de muestra para inyección 28 
10.6. Determinación del contenido ADN mediante citometría de flujo 29 
10.6.1. Fijación celular 29 
10.6.2. Tinción del ADN con colorante fluorescente 30 
10.6.3. Lectura en citómetro Facs Calibur (Becton Dickinson) 30 
10.7. Consideraciones Matemáticas 31 
10.7.1. Velocidad especifica de crecimiento 31 
10.7.2. Análisis estadístico de los datos 31 
11. Resultados y discusión 33 
11.1. Caracterización del sistema de elutriación 33 
11.1.1. Caracterización del sistema de circulación del fluido 33 
11.2. Caracterización del sistema biológico 36 
11.2.1. Evaluación del crecimiento del hibridoma BCF2 36 
11.2.2. Determinación del diámetro celular 38 
11.2.3. Cálculo del flujo de elución empleando la ley de Stokes 
simplificada 39 
11.2.4. Determinación del contenido de ADN mediante citometría de 
flujo para una población no sincronizada 40 
 
 
 
 
 
11.3. Evaluación de la sincronía obtenida por el método de elutriación 
centrifuga 42 
11.3.1. Evaluación de contenido de ADN de las fracciones 
celulares obtenidas a los flujos determinados por la 
 Ley de Stokes simplificada 42 
11.3.2. Medición del contenido de ADN en la región con mayor 
presencia de células en fase G1 44 
11.3.3. Cinéticas de crecimiento de células sincronizadas, en 
frascos de cultivo de 25 cm2 49 
12. Conclusiones 52 
13. Perspectivas 53 
14. Anexo I 54 
14.1. Principios matemático de la elutriación centrifuga 54 
15. Referencia 581 
 
 
1. INDICE DE FIGURAS 
 
Figura 1. Esquema general del procedimiento de elutriación centrífuga. 
Figura 2. Esquema de la separación celular por elutriación centrífuga. 
Figura 3. Sistema de Elutriación Beckman Modelo JE-6B. 
Figura 4. Esquema de preparación de muestra. 
Figura 5. Calibración de la bomba Minipuls 3. 
Figura 6. Calibración de la bomba Masterflex. 
Figura 7. Cinética de crecimiento de la línea celular BCF2. 
Figura 8. Histograma de la distribución de diámetros del hibridoma BCF2. 
Figura 9. Distribución de tamaño relativo, complejidad celular y contenido de 
ADN de una población BCF2 no sincronizada. 
Figura 10. Distribución de tamaño relativo, complejidad celular y variación del 
contenido de ADN para una población BCF2 sincronizada. 
Figura 11. Análisis de contenido de ADN para las elutriación 1, 2 y 3, a flujos de 
24, 25, 26 y 27 mL/min. 
Figura 12. Cinéticas de crecimiento de células sincronizadas. 
Figura A1. Diagrama de la cámara de elutriación. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2 
 
2. INDICE DE TABLAS 
 
Tabla 1. Principales agentes químicos de arresto celular para células 
animales. 
Tabla 2. Métodos físicos de sincronización celular. 
Tabla 3. Características de la cámara de elutriación Standard usada en el 
proyecto. 
Tabla 4. Coeficientes de variación para las ecuaciones provenientes de las 
curvas de calibración. 
Tabla 5. Caracterización del sistema biológico. 
Tabla 6. Flujos de colecta teóricos obtenidos a partir de los datos del 
contador electrónico de partículas (Coulter Multisizer) y de la ley de 
Stokes. 
Tabla 7. Porcentaje de células en cada fase del ciclo celular de una cinética 
de crecimiento típica de BCF2 usando el modelo matemático 
Dean/Jett/Fox. 
Tabla 8. Evaluación del contenido de ADN para las fracciones obtenidas en 
el intervalo 24-27mL/min. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 
 
3. ABREVIATURAS 
 
A Área de la sección transversal 
AcM Anticuerpo Monoclonal 
ADN Acido Desoxirribonucleico 
AraCTP Citosin trifosfato 
ARN Acido Ribonucleico 
Cdks Cinasas dependientes de ciclinas 
CDM Medio químicamente definido 
Cel Célula 
Ckis Inhibidores de cdk 
CO2 Dióxido de Carbono 
Ctrl Control 
C.V Coeficiente de variación 
dCTPs Trifosfatos de desoxicitidina 
DMEM Medio de cultivo Eagle modificado por Dulbecco 
DMSO Dimetil sulfóxido 
dTMP Desoxiadenosina 5'-monofosfato 
EC Elutriación Centrífuga 
ECC Elutriación Centrífuga a Contracorriente 
F Fuerza de arrastre 
F Flujo 
FACS Clasificación de células activadas por fluorescencia 
FSC Dispersión de luz frontal 
g Gramo 
Glut Glutamina 
h Horas 
IgG Inmunoglobulina o Anticuerpo de clase G 
L Litro 
m Metro 
MACS Clasificación magnética de células. 
min Minuto 
 
4 
 
µ Velocidad especifica de crecimiento 
mL Mililitro 
mM Milimolar 
mOsm Miliosmolar 
mPa Milipascal 
PBS Solución amortiguadora de fosfatos 
r Radio 
r coeficiente de correlación lineal 
RNR Ribonucleótido reductasa 
rpm Revoluciones por minuto 
σ Desviación estándar 
s Segundo 
SFB Suero fetal Bovino 
SSC Dispersión de luz lateral 
t Tiempo 
td Tiempo de duplicación 
T.A. Temperatura ambiente 
V Velocidad del fluido 
Vs Velocidad de sedimentación 
X Concentración de células viables al tiempo t 
X0 Concentración de células viables inicial 
Xtot Células totales 
%Xv Porcentaje de viabilidad 
X max Concentración celular máxima 
η Viscosidad del fluido 
μ Velocidad específica de crecimiento aparente 
µm Micra 
ρm Densidad del fluido 
ρp Densidad de la partícula 
ω Velocidad angular 
 
 
 
5 
 
4. RESUMEN 
 
La mayoría de las investigaciones que realizan experimentación con líneas 
celulares para optimizar los procesos de producción de proteínas recombinantes 
no toman en cuenta que la población es heterogénea con respecto al ciclo 
celular, es decir, se tienen subpoblaciones celulares de un mismo linaje en sus 
diferentes fases, bajo condiciones metabólicas y fisiológicas muy diferentes. 
Para poder estudiar detalladamente los múltiples procesos celulares y 
metabólicos implicados en la producción de proteínas recombinantes a lo largo 
de las diferentes fases de un ciclo de división celular es necesario utilizar células 
sincronizadas. 
En el presente trabajo se implementó y evaluó a la Elutriación Centrífuga (EC) 
como método de sincronización de subpoblaciones celulares en las diferentes 
fases del ciclo celular. La EC es un método físico de separación de poblaciones 
celulares que consigue separarlas en base a su tamaño, densidad y velocidad 
de sedimentación. En virtud de que existe una relación directa entre el tamaño y 
la fase del ciclo celular, es posible separar mediante EC a las diferentes 
poblaciones del ciclo celular (S, G1 y G2) de un mismo linaje. Los resultados 
obtenidos en el presente proyecto abarcan la caracterización del procedimiento 
de EC y del crecimiento no sincronizado del hibridoma murino BCF2 como 
modelo biológico, así como la evaluación de la sincronía en la subpoblación en 
fase G1 del ciclo celular separada mediante EC y colocada nuevamente en 
cultivo. 
Se demostró que la EC fue capaz de separar a las subpoblaciones G1, S y G2. 
Las subpoblaciónes en G1 separdas a 25 y 26 mL/min tuvieron el 79.4±3.3% y el 
78.4±6.3% de pureza respectivamente. Cinéticas de crecimiento de células 
sincronizadas mostraron un perfil de crecimiento escalonado indicativo de la 
sincronía existente. Dicho comportamiento se mantuvo durante el tiempo que se 
realizaron los cultivos (aproximadamente 60 h) mostrando divisiones celulares 
sincrónicas comparables al tiempo de duplicación determinado en cinéticas de 
crecimiento no sincronizadas. 
 
 
6 
 
5. INTRODUCCIÓN 
 
Para finales del siglo XX el cultivo de líneas celulares animales como sistema 
biológico productor de proteínas recombinantes terapéuticas se consolidó como 
el preferido por la industria farmacéutica biotecnológica debido a las ventajas 
que ofrece (plegamiento proteico correcto, glicosilación compleja y secreción del 
biofármaco) sobre sistemas como el bacteriano, vegetal o de levaduras. La 
ingeniería de cultivo celular en la actualidad se centra en optimizar la capacidad 
productiva de este sistema, lo cual requiere una experimentación más detallada 
para el entendimiento de los eventos celulares (metabólicos y fisiológicos) que 
determinan en última instancia la cantidad o calidad de las proteínas que se 
desea producir. 
Por la naturaleza de los cultivos celulares (células creciendo y duplicándose 
ininterrumpidamente), la mayoría de las investigaciones que realizan 
experimentación para optimizar la producción de proteínas recombinantes no 
toman en cuenta que la población celular es heterogénea con respecto al ciclo 
celular, es decir, se tienen subpoblaciones de un mismo linaje en las diferentes 
fases del ciclo celular en condiciones metabólicas y fisiológicas diferentes, de 
modo que, en tales circunstancias los resultados obtenidos de los diferentes 
procesos en evaluación son aparentes. 
Para poder estudiar dichos procesos detalladamente a lo largo de las diferentes 
fases de un ciclo de división celular es necesario entonces sincronizar las 
células. Entre los múltiples y muy diversos métodos de sincronización celular, en 
el presente trabajo se implementó y evaluó al método físicode separación de 
poblaciones celulares denominado Elutriación Centrífuga (EC), como 
herramienta para sincronizar en las diferentes fases del ciclo celular a las células 
animales BCF2 productoras de anticuerpo monoclonal (AcM). Lo anterior con la 
perspectiva de que en estudios posteriores se evalúe de manera detallada 
aspectos metabólicos, tales como, la síntesis y glicosilación de proteínas o el 
consumo y producción de metabolitos en las diferentes fases del ciclo celular, lo 
cual permitirá entender su contribución sobre la calidad o cantidad de las 
proteínas recombinantes producidas. 
 
7 
 
6. ANTECEDENTES 
 
6.1. CICLO CELULAR 
 
Se denomina ciclo celular a la serie de eventos que ocurren durante la 
proliferación celular para que una célula se duplique. Lo anterior implica que 
cada célula progrese exitosamente a través de las fases discretas del ciclo 
celular denominadas G1 (del inglés Gap 1), fase de síntesis (S), G2 (del inglés 
Gap 2) y mitosis (M). Las células viables y funcionales que no están en proceso 
de proliferación se les considera en fase de arresto celular (G0). Durante G1 las 
células incrementan su tamaño y biomasa hasta que entran a fase S donde los 
organelos celulares y el genoma son replicados preparándose para la división 
celular. Para el final de la fase S, una célula diploide (2n) se ha convertido en 
tetraploide (4n), conteniendo suficiente ADN y componentes celulares para 
generar dos células. Después de la fase S la célula entra a G2. Durante esta 
fase las células sintetizan las proteínas requeridas para dirigir la segregación 
cromosómica y la división celular que se llevará a cabo en la mitosis. La 
progresión de las células a través de dichas fases constituye una vuelta del ciclo 
celular. Para células de mamífero en cultivo la fase G1 dura entre 1 y 8 h, la 
fase S dura de 6 a 8 h, la fase G2 de 2 a 4 h y finalmente la mitosis dura menos 
de una hora (Vella, 1994). 
 
6.2. SINCRONIZACIÓN CELULAR 
 
La sincronización celular es una herramienta metodológica para estudiar los 
procesos celulares que ocurren durante las fases del ciclo celular (Cooper, 2002; 
Pfosser et al., 2007; Gordon y Eliott, 1977). Los métodos de sincronización 
celular permiten obtener poblaciones homogéneas de células en una fase 
determinada del ciclo celular. 
De acuerdo a su principio de operación hay dos grupos principales de métodos 
de sincronización: aquellos que detienen la progresión del ciclo celular mediante 
la exposición de las células a agentes químicos (arresto celular) y aquellos que 
 
8 
 
emplean procedimientos de separación de poblaciones basándose en las 
propiedades físicas de las células. Estrictamente, en un cultivo sincronizado, 
todas las células deberían transitar a través de las diferentes fases del ciclo 
celular y dividirse al mismo tiempo (Sharma, 1999; Planchais et al., 2000). 
Investigaciones realizadas por Cooper (2003) muestran que el uso de métodos 
químicos tales como la privación de nutrimentos esenciales, timidina y nocodazol 
generan lotes celulares con una escasa sincronía (un segundo ciclo es 
raramente observado) atribuyendo esto a la alteración de los procesos 
metabólicos y fisiológicos por parte de los agentes químicos (Cowan y Milstein, 
1972; Pardee y Keyomarsi, 1992). Con base en lo anterior, el mismo 
investigador redefine cultivo sincronizado como aquel en el que la mayoría de las 
células progresan de manera normal o no alterada (por ejemplo, sin alteraciones 
de contenido de ADN, biomasa y tamaño) a través de las fases del ciclo celular 
como un cohorte relativamente uniforme. 
 
6.2.1. MÉTODOS QUÍMICOS DE ARRESTO CELULAR 
 
Los métodos químicos de arresto celular son privación de nutrimentos 
esenciales y uso de sustancias químicas. La técnica de privación de nutrimentos 
esenciales (Griffin, 1976) arresta a las células en G0/G1 mientras que el uso de 
sustancias químicas, es ampliamente usado, para arrestar células en las 
diferentes fases. Este tipo de métodos son caracterizados por su fácil uso, bajo 
costo y debido que se basan en la inhibición reversible de procesos específicos 
para una fase del ciclo celular.Las sustancias químicas detienen el ciclo celular a 
diferentes niveles: mediante su interacción a nivel de Cdk´s (cinasas 
dependientes de ciclinas), por la unión o inhibición a enzimas relacionadas con 
la síntesis de ADN, a través de proteólisis de los reguladores del ciclo celular o 
bien a nivel estructural mediante la inhibición de la síntesis del huso mitótico. 
Usando sustancias químicas como agentes de arresto se pueden obtener un 
número considerable de células sincronizadas (técnica preparativa); sin 
embargo, el grado de sincronía a menudo no es alto, además de que el 
 
9 
 
metabolismo celular es modificado, produciendo un crecimiento no balanceado 
que ya no corresponde al de una célula no inhibida (Cooper, 2003). 
A partir del uso de los métodos químicos se han obtenido cultivos parcialmente 
sincronizados (Bootsma et al., 1964; Tobey et al., 1967) que han permitido 
obtener datos valiosos en áreas como: síntesis de inmunoglobulinas, donde se 
descubrió que para células linfoides humanas esta se lleva a cabo 
principalmente durante la etapa tardía de la fase G1 y en la etapa temprana de la 
fase S (Fahey et al., 1971). También se conoce su éxito en los procesos 
citológicos y moleculares del ciclo celular en plantas, ya que gran parte de este 
conocimiento se debe al desarrollo de técnicas de sincronización mediante el 
uso de sustancias químicas (Ruiz et al., 2010). 
 
Entre los agentes químicos comúnmente usados para arrestar el ciclo celular de 
células animales se encuentran la hidroxiurea, afidicolina, metrotexato, timidina y 
nocodazol. A continuación se presenta una tabla donde se explica su 
mecanismo de acción. 
 
Tabla 1. Principales agentes químicos de arresto celular para células animales. Se 
muestran los principales métodos químicos, mecanismo de acción y fase del ciclo 
celular en el que se produce el arresto. 
 
Técnica Mecanismo de acción 
Bloqueo a 
nivel de: 
Referencias 
Ausencia de 
suero y 
calcio 
La ausencia de factores de 
crecimiento evita que ocurran 
las diversas señales de 
transducción que regulan el 
ciclo celular. 
G0, G1 y 
Mitosis 
(dependiendo 
del tipo de 
célula) 
Sherr, 1993; 
Griffin, 1976 
Hidroxiurea 
Inhibición de la subunidad R2 
de la enzima Ribonucleótido 
reductasa. 
G1/S 
Tobey et al., 
1990; Young y 
Hodas, 1964; 
Gao et al., 1998; 
Koç et al. 2004 
 
 
10 
 
Afidicolina 
Inhibe la DNA polimerasa α y 
δ al competir con los dCTPs 
(trifosfatos de desoxicitidina) 
por el sitio de unión a la 
enzima. 
G1/S 
Waters, 1981; 
Kumagai-Sano 
et al., 2006 
 
Metrotexato 
 
Es un inhibidor de la 
tetrahidrofolato 
deshidrogenasa que evita la 
formación de tetrahidrofolato 
necesario para la síntesis de 
timidilato, componente 
esencial del ADN. 
S Fox et al., 1987 
Timidina 
 
Inhibición de la síntesis de 
ADN que se atribuye a la 
inhibición de la síntesis de 
nucleótidos. 
G1/S Harper, 2004 
Nocodazol 
 
Inhibe la polimerización de 
tubulina In vitro e In vivo. 
G2/M 
De Brabander et 
al., 1976; 
Hoebeke et al., 
1976 
 
 
6.2.2. MÉTODOS FÍSICOS DE SINCRONIZACIÓN CELULAR 
 
A diferencia de los métodos químicos la mayoría de los métodos físicos de 
sincronización celular ofrecen un alto grado de sincronía, esto en virtud de que 
son métodos de separación. Los métodos físicos de sincronizaciónse basan en 
la separación de poblaciones en base a las propiedades físicas de la misma. Por 
ejemplo: tamaño, densidad o dispersión de luz. Las células sincronizadas por 
estos métodos tienen la característica de que no son alteradas en su 
metabolismo permitiendo estudios subsecuentes de fisiología y metabolismo 
celular. La mayoría de los métodos físicos tienen la desventaja de que no son 
preparativos (limitando su uso para un análisis metabólico poblacional) con 
excepción de la elutriación centrífuga. Sin embargo, este último requiere de un 
 
11 
 
equipo costoso además de que su operación es un tanto compleja. A 
continuación (Tabla 2) se presenta un resumen de los principales métodos 
físicos de sincronización. 
 
Tabla 2. Métodos físicos de sincronización celular. Se mencionan a los principales 
métodos físicos de sincronización, el principio mediante el cual se lleva a cabo la 
separación celular y un comentario acerca de la misma. 
 
 
Método 
 
Principio de la 
sincronización 
 
Ventajas / 
Desventajas 
 
Referencias 
Inhibición por 
contacto 
Tras la confluencia 
proteínas como la 
P27 inactivan 
complejos CDK-
ciclina y cinasas, 
dando lugar 
al arresto celular 
 
Simple, sin 
embargo, de 
baja resolución 
Polyak et al., 
1994; Harper et 
al., 1995; Xiong 
et al., 1993; 
Holley y 
Kiernan, 1968. 
Disminución de 
la temperatura 
de cultivo 
 
Inhibición de Aurora 
y Polo cinasas 
 
Simple y 
preparativa 
Rieder y Cole, 
2002; Kaufmann 
et al., 1999 
Velocidad de 
sedimentación 
Tamaño celular 
Técnica simple y 
rápida, sin 
embargo, 
de baja resolución 
y rendimiento 
Miller y Phillips, 
1969 
 
Elución por 
membrana 
Una célula es fijada 
a una membrana de 
nitrocelulosa. Tras la 
división celular la 
nueva célula es 
eluida. 
Simple y 
rápida 
 
Cooper, 2002 
Sedimentación 
isopícnica 
 
Tamaño celular 
 
Simple y rápida 
Morganthaler y 
Price, 1976 
 
12 
 
Clasificación de 
células 
activadas por 
fluorescencia 
 
Área de la superficie 
celular 
tamaño 
rugosidad celular 
Tecnología cara y 
compleja pero 
muy efectiva, alta 
resolución pero 
poco rendimiento 
 
Vaughan y 
Milner, 1989 
 
Elutriación 
Centrífuga 
Tamaño celular, 
densidad y 
configuración de la 
superficie celular 
Rápida, 
preparativa, 
procedimiento un 
poco complejo y 
tecnología cara 
Barford, 1986; 
Feder et al., 
1989; Lutz et al., 
1992; Bauer, 
1999; Lloyd et 
al., 2000; 
Banfalvi, 2008 
 
6.3. ELUTRIACIÓN CENTRÍFUGA Y SINCRONIZACIÓN 
 
6.3.1. PRINCIPIO DE OPERACIÓN DEL MÉTODO DE ELUTRIACIÓN 
CENTRÍFUGA. 
 
La elutriación centrífuga a contracorriente fue implementada como método de 
separación por el científico estadounidense P.E Lindhal (Lindhal, 1948; Bachere 
et al.,1988) y posteriormente desarrollada por la compañía Beckman Instruments 
Inc. (Lindahl, 1948; Lindahl, 1956; McEwen et al., 1968; Sanderson et al., 1976). 
La elutriación centrífuga es utilizada mayoritariamente para la separación de 
mezclas de linajes celulares (Yoshioka et al.,1997): por ejemplo para la 
separación de los diferentes tipos celulares presentes en el tejido sanguíneo 
(Coulais et al., 2012). Sin embargo, por su principio de operación es posible 
conseguir la separación de las diferentes poblaciones de ciclo celular de un 
mismo linaje. 
 
13 
 
 
 
 
Figura 1. Esquema general del procedimiento de elutriación centrífuga. Para iniciar el 
procedimiento de elutriación centrífuga se debe contar con un cultivo de células en 
crecimiento exponencial y viabilidad mayor al 90% (1), posteriormente este cultivo se 
prepara e inyecta al sistema (2) el cual separará a las subpoblaciones (3), finalmente las 
células de interés se colectan y según los fines del experimento, son fijadas ó colocadas 
nuevamente en cultivo (4). 
 
Para obtener una población homogénea de células mediante elutriación 
centrífuga en el equipo de Beckman (véase figura 1) se inyecta una suspensión 
celular heterogénea que será transportada hasta la cámara de separación 
mediante una fase líquida (por ejemplo: amortiguador PBS o medio de cultivo). 
La corriente de este medio entra a la cámara en sentido opuesto al campo de 
fuerza centrífuga que existe cuando el rotor está funcionando (véase figura 2). 
Dentro de la cámara diversas variables como: densidad de la partícula (g/mL), 
tamaño de partícula (μm), densidad del fluido (g/mL), fuerza centrífuga (rpm), 
viscosidad del fluido (mPa/s), flujo a contracorriente (mL/min) y velocidad del 
fluido (m/s) establecen un equilibrio permitiendo el mantenimiento de las células 
en una posición espacial determinada dentro de la cámara de acuerdo a su 
velocidad de sedimentación (m/s). Las células serán secuencialmente 
expulsadas del rotor basándose principalmente en su tamaño (las más pequeñas 
eluirán primero y las grandes eluiran al final cuando el equilibrio dentro de la 
cámara sea alterado mediante el incremento del flujo de volumen o la 
1 
2 
4 
 
 
 
 
 
3 
 
14 
 
disminución de la velocidad de centrífugación o fuerza centrífuga (Lindhal, 
1948). 
 
 
 
Figura 2. Esquema de la separación celular por elutriación centrífuga. A) Muestra 
suspendida en medio, el cual entra a la cámara. B) Tendencia a la sedimentación de 
partículas en función de sus tamaños. En rojo se observa la frontera de elutriación. C) Al 
alterar el equilibrio las partículas más pequeñas eluyen primero. Tomadó de Developing 
Elutriation Protocols, Technical information, Beckman Instruments Inc. 1994. 
 
De esta forma células de determinado tamaño pueden ser selectivamente 
removidas de la cámara (para una descripción detallada del procedimiento de 
Elutriación centrífuga en el equipo Beckman véase el apartado 10.5.1 de la 
sección Materiales y Métodos). 
 
El uso de la elutriación centrífuga ofrece ventajas sobre los métodos químicos 
tradicionales de arresto celular en virtud de que no alteran el metabolismo y/o la 
fisiología celular, por lo tanto, los resultados obtenidos son representativos de lo 
que ocurre en las células en las diferentes fases del ciclo celular y no del efecto 
del agente químico de arresto celular (Cooper, 2003). En comparación con los 
demás métodos físicos de separación, la elutriación centrífuga es el método 
ideal de sincronización cuando se requieren concentraciones de células en el 
orden de 108 además de que se cuenta con la posibilidad de utilizar el sistema 
de manera aséptica. 
 
Diferentes grupos de investigación han aprovechado las ventajas que ofrece la 
elutriación centrífuga para el estudio de multiples aspectos del ciclo celular, tales 
como: el rol de las ciclinas y cinasas en la regulación del ciclo celular (Borycki et 
Fuerza centrífuga Contra corriente 
A B C 
 
15 
 
al.,1995; Lukas et al.,1995; Ezhevsky et al.,1996; Pusch et al., 1996; Mikulits et 
al., 1997), la síntesis de novo de proteínas como chaperonas (Mikulits et al., 
1996; Vaughn et al., 1996; Dittmar et al., 1997), la sensibilidad celular a 
radiaciones y sustancias químicas (Buchholz et al., 1995; Davis et al., 1995; 
Keng et al 1995; Mitchell et al., 1995; Ramachandran et al., 1996; Terui et al., 
1995; Evans et al., 1996; Gupta et al., 1996), la identificación de enzimas de 
importancia para la división celular (Marshak y Russo, 1994; Tsai et al.,1996; 
Bianchi et al., 1997), la sensibilidad del ciclo celular debida a señales 
transmitidas por citocinas (Breder et al., 1996; Spivak et al., 1996) entre muchas 
otras. Algunos autores se han encargado de fundamentar la técnica de 
elutriación centrífuga. Barford (1986), describe un modelo matemático que 
permite realizar predicciones acerca de la velocidad de flujo necesaria para 
separar una población celular. Bauer (1999) por su parte desarrolló un rotor y 
cámara de centrífugación con capacidad de 0.5 mL cuya funcionalidad fue 
comprobada al trabajar con células linfoides. Recientemente Banfalvi (2008) 
reportó un procedimiento para la separación de un cultivo de células CHO 
(células ováricas de hámster chino) en las diferentes fases del ciclo celular. La 
separación fue evaluada mediante mediciones fluorométricas de contenido de 
ADN, mostrando que la técnica permite separar de manera eficiente las 
diferentes poblaciones de ciclo celular. Sin embargo, no evaluó la viabilidad 
celular tras la elutriación y tampoco muestra una visión cuantitativa de la calidad 
de la separación. Estas ultimas investigaciones dan una base teórico - práctica 
que fundamentan la factibilidad de la técnica. Exceptuando la investigación de 
Bauer (1999) todos los resultados fueron obtenidos con el sistema de elutriación 
de la compañía Beckman Instruments. 
 
6.4. LA INGENIERÍA DE CULTIVO DE CÉLULAS ANIMALES Y EL CICLO 
CELULAR. 
 
En general una célula somática después de dividirse entra en G0 donde puede 
permanecer viable por periodos de tiempo indefinidos (según el tipo de célula) 
ejerciendo sus funciones hasta morir, pero conservando su potencial para 
 
16 
 
dividirse si se presenta el estímulo necesario. En contraste, las células animales 
utilizadas en biotecnología para la producción de proteínas de interés 
terapéutico, son líneas celulares transformadas que proliferan indefinidamente y 
no entran a G0 después de su ciclo de división celular en tanto no existan 
factores de cultivo (limitación de nutrimentos, acumulación de metabolitos 
tóxicos, etc.) que comprometan su viabilidad (Flickinger y Drew, 1999). 
Desde el punto de vista de la ingeniería de cultivo de células animales para la 
producción de proteínas recombinantes, las implicaciones del ciclo celular en el 
desempeño de los cultivos y sobre la cantidad y calidad de las proteínas 
recombinantes producidas no ha sido ampliamente estudiado. 
Existe evidencia de que el control de la división celular mediante técnicas 
moleculares puede mejorar la productividad de los cultivos, representando una 
estrategia para optimizar la producción de proteínas recombinantes a partir de 
líneas celulares de importancia económica (Fussenegger et al., 1997). Se han 
realizado algunos estudios para entender la relación entre el ciclo celular y la 
producción de proteínas recombinantes, por ejemplo: estudios sobre la 
expresión de genes anti-apoptóticos (Figueroa et al., 2007), la expresión de 
genes relacionados con la regulación de ciclo celular (Fussenegger et al., 1998; 
Bi et al., 2004), el plegado y ensamblaje en el retículo endoplasmático (Hayes et 
al., 2010), la traducción (Underhill et al., 2005) y la secreción de proteínas 
(Dinnis et al., 2006; Peng et al., 2010). Sin embargo, la naturaleza heterogénea 
de las poblaciones celulares utilizadas en los estudios anteriores genera 
resultados aparentes que realmente no permiten evaluar el impacto de los 
procesos que ocurren en cada una de las fases del ciclo celular. Muy pocos 
estudios se han realizado utilizando poblaciones celulares sincronizadas en las 
diferentes fases del ciclo celular. 
Al-Rubeai y Emery (1990) usaron métodos de sincronización química para 
estudiar el metabolismo en hibridomas. La sincronización de los cultivos fue 
lograda a partir de la adición de timidina la cual arrestó a las células en G1 
provocando el aumento en la velocidad específica de producción máxima de 
anticuerpo monoclonal (al-Rubeai y Emery, 1990); este tipo de evaluación 
presenta un problema ya que como se mencionó anteriormente el uso de 
 
17 
 
agentes químicos de arresto altera el metabolismo celular (Cowan y Milstein, 
1972). 
Feder et al., (1989) mediante elutriación centrífuga obtuvieron poblaciones 
homogéneas de células CHO con el objetivo de evaluar el patrón de expresión 
de la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR) y sus niveles de ARNm en las 
diferentes fases del ciclo celular. Esta investigación concluyó que la actividad y 
expresión de la enzima DHFR no cambian a través de las diferentes fases del 
ciclo celular por lo cual ésta no puede ser considerada una enzima regulada por 
el ciclo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
18 
 
7. JUSTIFICACIÓN 
 
Los cultivos de células animales para la producción de proteínas recombinantes 
de interés terapéutico se desarrollan con líneas celulares proliferando de manera 
heterogénea, es decir, con células transitando en las diferentes fases del ciclo 
celular de manera no sincronizada durante todo el tiempo de cultivo. Como 
resultado solo se puede evaluar el metabolismo y los procesos celulares de 
forma aparente. 
De tal forma que, si se desea estudiar dichos procesos detalladamente a lo largo 
de las diferentes fases de un ciclo de división celular es necesario entonces 
sincronizar las células. Entre los diversos métodos de sincronización celular en 
el presente trabajo se evaluó a la elutriación centrífuga que es un método 
preparativo de separación de células con base en su tamaño, que por su 
principio de operación no altera la fisiología y el metabolismo celular, lo cual es 
una ventaja sobre los métodos químicos de sincronización que ofrecen una 
escasa sincronía además de alterar dichos procesos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
19 
 
8. OBJETIVOS 
 
Objetivo general: 
 
 Implementar un procedimiento preparativo para la obtención de hibridomas 
BCF2 sincronizados en las diferentes fases del ciclo celular en condiciones 
asépticas. 
 
Objetivos particulares: 
 
 Evaluar a la elutriación centrífuga como método de sincronización de 
hibridomas BCF2 en las diferentes fases del ciclo celular. 
 Determinar las condiciones óptimas para la obtención de células BCF2 
sincronizadas en la fase G1 del ciclo celular. 
 Obtener células sincronizadas en la fase G1 del ciclo celular con alto 
grado de sincronización y en condiciones asépticas. 
 Cultivar In vitro las células sincronizadas en la fase G1 del ciclo celular 
para comprobar la sincronía. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
20 
 
9. HIPÓTESIS 
 
- En virtud de que existe una relación directa entre el tamaño y la fase de 
ciclo celular, el método de elutriación centrífuga por su principio de 
operación separará eficientemente a las subpoblaciones G1, S y G2 de un 
cultivo no sincronizado de células BCF2. 
- Si la elutriación centrífuga es capaz de separar las subpoblaciones 
celulares G1, S y G2 de un cultivo de hibridomas BCF2 no sincronizado, 
el análisis de contenido de ADN revelará el grado de sincronía de dichas 
subpoblaciones, y su comportamiento en cultivo mostrará un perfil de 
crecimiento sincrónico escalonado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
21 
 
10. MATERIALESY MÉTODOS 
 
10.1. MODELO BIOLÓGICO 
 
El hibridoma murino BCF2 utilizado en este proyecto se derivó de una línea de 
ratones Balb/c. El AcM que produce dicho hibridoma es de clase G (IgG1), 
neutralizante y específico contra la toxina 2 del veneno del alacrán Centruroides 
noxius Hoffmann. Dicha toxina es el péptido más tóxico del conjunto de toxinas 
presentes en el veneno. Este AcM inhibe la unión de la toxina con las 
membranas sinaptosomales del cerebro de ratón, mostrando así una actividad 
neutralizante in vivo (Zamudio et al., 1992). La línea celular fue proporcionada 
por el Dr. Lourival Possani del Instituto de Biotecnología de la U.N.A.M. 
 
10.2. MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS 
 
Medio de Eagle modificado por Dulbecco (Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium) 
 
El medio DMEM Gibco® sin SFB No. de catálogo 12430-120; fue usado como 
medio de elución (en lugar de amortiguador) para las elutriaciones donde se 
requirió colocar en cultivo a las células sincronizadas. 
 
Chemically Defined Hybridoma Medium (CDM) 
 
El medio CDM Gibco® No. de catálogo 11279-023 fue usado como medio de 
cultivo para la línea celular BCF2. Dicho medio es específico para hibridomas 
murinos productores de anticuerpos monoclonales. Se suplementó con 
L-glutamina 8 mM (Sigma, 3126, St. Louis, MO) para su uso. 
 
 
 
 
 
 
22 
 
10.3. MANTENIMIENTO DE CÉLULAS 
 
10.3.1. CONGELACIÓN 
 
Preparación de banco celular; procedimiento general. 
1.- Contar con un cultivo creciendo en fase exponencial y con una viabilidad 
≥ 90%. 
2.- Determinar la concentración celular y calcular el volumen a usar de medio de 
criopreservación considerando que al fin del proceso cada criovial debe contar 
con una concentración de entre 5 – 10x106 células viables por mL. 
3.- Preparar el volumen requerido de medio de criopreservación mezclando 
medio fresco (suplementado con Glutamina 8mM) con DMSO, 45% y 10% 
respectivamente del volumen final considerado para el banco celular. 
4.- Centrifugar el volumen de medio de cultivo celular en tubos cónicos por 10 
min a 100 g para formar el botón celular. 
5.- Posterior a la centrifugación eliminar medio en un tubo cónico estéril para su 
posterior utilización (medio acondicionado). 
6.- Con el otro 45% del volumen final -utilizando medio acondicionado- 
resuspender células. Una vez resuspendidas mezclar los volúmenes de los 
puntos 3 y 5 en frío. 
7.- Dispensar 1 mL por criovial. 
8.- Iniciar la congelación pasando consecutivamente de la temperatura ambiente 
a -20 °C, -70 °C y finalmente a N2 líquido. 
 
10.3.2. DESCONGELACIÓN 
 
1.- Verter 4 mL de medio CD Hybridoma suplementado con glutamina a un tubo 
cónico de 15 mL. 
2.- Pasar 5 mL de medio CD Hybridoma suplementado con glutamina a un 
frasco T de 25 cm2. 
3.- Descongelar un vial de la línea celular BCF2 pasando a 37°C lo más rápido 
posible. 
 
23 
 
4.- Traspasar el volumen del criovial (1 mL) al tubo del paso 1. 
5.- Centrífugar a 800 rpm por 10 min. 
6.- Eliminar el sobrenadante del tubo cónico con pipeta de 5.0 mL, teniendo 
cuidado de no aspirar el pellet celular. 
7.- Tomar el volumen del paso 2 y resuspender el pellet celular en el tubo cónico. 
8.- Tomar el volumen con células suspendidas y verterlo en el mismo frasco T de 
25 cm2. 
9.- Colocar en incubadora a 37°C, 5% CO2 y humedad a saturación. 
 
10.3.3. CONDICIONES DE CULTIVO 
 
Los cultivos para caracterización cinética de la línea celular se realizaron por 
triplicado, iniciando con un inóculo de 0.1x106 cel mL-1 en frascos de cultivo 25 
cm2 con 5 mL de medio de cultivo. Se tomó muestra cada 24 horas. 
 
Las elutriaciones se llevaron a cabo con células en crecimiento exponencial, en 
un intervalo de concentración entre 1.5 y 2.0x106 cel mL-1 y con una viabilidad 
mayor al 90%. Los cultivos ocupados para llevar a cabo cinéticas de 
sincronización, se iniciaron con un inóculo ≤ 0.2x106 cel mL-1 en frascos de 
cultivo de 25 cm2, conteniendo 5 mL de medio de cultivo. Se tomó muestra 
aproximadamente cada 3 h. 
Todos los cultivos celulares se incubaron a 37°C en un ambiente con 5% de CO2 
y humedad a saturación. 
 
10.3.4. CUANTIFICACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN Y LA VIABILIDAD 
CELULAR 
 
La concentración y viabilidad celular se determinó mediante la técnica de 
exclusión usando la cámara de Neubauer y el colorante azul de tripano (Sigma 
T8154). El colorante es un indicador de la integridad de la membrana 
citoplasmática. Mediante esta tinción, las células muertas son permeables al 
colorante y se tiñen de azul, mientras que las vivas permanecen refringentes. 
 
24 
 
10.4. DETERMINACIÓN DEL TAMAÑO CELULAR 
 
Para determinar el diámetro celular relativo se usó el contador electrónico de 
partículas Beckman Coulter Multisizer™ 3 (con una tubo de apertura de 70 μm) 
con solución salina 0.9 % como electrolito. Para calibrar el equipo se usaron 
esferas de látex de diámetro conocido. El principio de operación del equipo es 
denominado “Electrozone sensing” y se basa en el paso de una solución 
adecuada de células a través de un orificio al cual se le aplica un voltaje. Al fluir 
las partículas a través del orificio se genera un pequeño pulso de voltaje o pico, 
la altura del pico es medida y comparada con los datos obtenidos de una 
muestra de látex estándar. 
 
10.5. SISTEMA DE ELUTRIACIÓN 
 
El sistema de elutriación consiste en un sistema de circulación de fluido 
acoplado a un rotor para ultracentrífuga ensamblable el cual contiene una 
cámara de separación de células. 
El rotor está diseñado para usarse a una velocidad máxima de 6000 rpm y para 
separar células de 5 µm a 50 µm de diámetro. En la Tabla 3 se muestran las 
características de la cámara de separación Standard que es la que se utilizó en 
el presente trabajo. 
 
Tabla 3. Características de la cámara de elutriación Standard usada en el proyecto. 
 
Cámara 
de 
separación 
 
 
Tamaño de partícula 
(μm) valor mínimo y 
máximo 
 
Variación del 
diámetro de partícula 
en una población 
eluida (μm) 
 
Capacidad de la 
cámara valor 
mínimo y valor 
máximo 
(millones de 
células) 
Volumen de 
la cámara 
(mL) 
 
Standard 5 – 50 2.5 – 5.0 107 – 109 4.2 
 
 
 
25 
 
El sistema de circulación de fluido está constituido por: 
 Una jeringa y un “By pass” específicos para la inyección de la muestra 
 Bomba peristáltica de velocidad variable. En el proyecto se usaron 2, la 
bomba Masterflex (Cole Parmer) y la Minipuls 3 (Gilson). 
 Manómetro. 
 Una cámara para disminuir turbulencias después de la inyección 
 Una manguera para transportar el medio liquido de elección y la muestra. 
 Un reservorio para el medio liquido de elutriación. 
 Tubos para colectar muestra. 
En la figura 3 se esquematiza el sistema de elutriación y sus partes. 
 
 
Figura 3. Sistema de elutriación JE-6B. Dentro de un marco amarillo se muestra el 
sistema de circulación de fluido y dentro de un marco rojo se muestra el rotor. También 
se observan los elementos esenciales del sistema de elutriación: reservorio de buffer, 
bomba peristáltica, cámara de mezclado, manómetro, inyector de muestra, centrífuga y 
rotor. Tomado de Developing Elutriation Protocols, Technical information, Beckman 
Instruments Inc. 1994. 
 
10.5.1. PROCEDIMIENTO DE ELUTRIACIÓN 
 
En la figura 1 se presenta un esquema general del procedimiento de elutriación. 
El procedimiento detallado se presenta a continuación.26 
 
1.- Abrir la tapa de la ultracentrífuga J2-21, colocar el rotor de elutriación y 
verificar su correcta colocación. 
2.- Enroscar las mangueras de entrada y salida a las conexiones hembra del 
rotor y colocar el seguro. 
3.- Conectar la sección de manguera de la bomba peristáltica al resto del 
sistema de elutriación. 
4.- Encender la bomba peristáltica y la ultracentrífuga. 
 a) Circular en todo el sistema de elutriación etanol al 70% durante 
aproximadamente 15 min para sanitizar ó desinfectar. 
b) Ajustar velocidad de centrífugación y temperatura según convenga. 
Ambos incisos dependerán del tipo de experimento que se desee realizar. Ver 
punto número 6. Finalidades del experimento. 
5.- Realizar calibración inicial del flujo de la bomba: 
a) Tomar mediciones dentro del intervalo de estudio. Por ejemplo, en el intervalo 
35-44 rpm para la bomba Gilson y 0.8-1 para la bomba Masterflex se esperarían 
flujos entre 22-27 mL/min y 22-31.5 mL/min respectivamente. Si no se registran 
estos flujos, tomar en cuenta para corrección. 
b) Una vez que los flujos reales muestran una tendencia lineal, calcular el 
coeficiente de correlación (valor esperado ≥ 0.99) y obtener la ecuación de la 
recta. 
c) A partir de la ecuación de la recta obtener las rpm de trabajo que se usaran 
durante la elutriación. 
6.- Una vez obtenida la calibración inicial de la bomba, el procedimiento de 
elutriación puede realizarse de manera aséptica o no, según sea la finalidad del 
experimento. 
Si la finalidad del experimento es realizar análisis de ciclo celular, continuar el 
procedimiento de manera no aséptica y considerar lo siguiente: 
a) Condiciones de uso del elutriador: 4.0°C y 2000 rpm. 
b) Circular dentro del sistema etanol al 70% para eliminar residuos de otros 
experimentos y para obtener la calibración inicial. 
c) Circular buffer PBS no estéril para eliminar presencia de etanol y como 
medio de elutriación. Contar aproximadamente con 2 L del buffer. 
 
27 
 
 
Si el experimento se lleva a cabo para colectar células sincronizadas e iniciar 
cinéticas de sincronización continuar el procedimiento de manera aséptica y 
considerar lo siguiente: 
a) Condiciones de uso del elutriador: T.A. y 2000 rpm. 
b) Circular dentro del sistema etanol al 70% para sanitizar. 
c) Circular PBS estéril para obtener la calibración inicial y eliminar toda 
presencia de etanol. Contar aproximadamente con 2 L del buffer estéril. 
d) Encender un mechero cerca del área de trabajo. ATENCIÓN: Alejar el 
contenedor de etanol y asegurarse de eliminar cualquier presencia de 
esta sustancia antes de encender el mechero. 
e) Circular medio de cultivo DMEM (sin SFB) como medio de elutriación para 
colectar fracciones celulares. Contar aproximadamente con 1 L de medio. 
7.- Rotular un par de tubos cónicos por muestra (para los controles solo se 
evalúa un tubo) y colocarlos en una gradilla de la siguiente manera: 23-24 
mL/min, Ctrl 1, 24-25 mL/min; Ctrl 2, 25-26 mL/min; Ctrl 3, 26-27 mL/min y Ctrl 4. 
En los tubos control se colectara un minuto del fluido para pesarlo y obtener el 
flujo (mL/min) real. En los tubos correspondientes a fracciones elutriadas se 
colectarán 100 mL por fracción (en 2 tubos cónicos de 50 mL). Se podrá 
etiquetar más tubos según los requerimientos del experimento. 
8.- Circular dentro del sistema el medio de elutriación y asegurarse de eliminar 
toda presencia de burbujas en el sistema. 
9.- Inyectar la muestra a un flujo de 22mL/min (Véase: Preparación de muestra 
para inyección). Una vez que el lote celular está dentro de la cámara del 
elutriador aumentar el flujo lentamente hasta 23 mL/min y dejar pasar 2-3 min 
para eliminar restos celulares (lavado). Con la finalidad de no alterar el equilibrio 
del sistema aumentar una décima de rpm cada cuatro segundos durante el uso 
de la bomba Minipuls 3. 
10.- Posterior al lavado, comenzar a colectar fracciones en el orden indicado en 
el punto 7 al mismo tiempo que se aumenta paulatinamente el flujo de 23 a 24 
mL/min. 
11.- Continuar colectando las demás fracciones y controles. 
 
28 
 
12.- Graficar los controles para corregir o corroborar flujos de bomba. 
13.- Si se desea realizar análisis de ciclo celular; seguir procedimiento: 
10.6 Determinación del contenido de ADN mediante citometría de flujo. 
14.- Si se desea realizar cinéticas de sincronización continuar con este 
procedimiento: 
a) Centrífugar las fracciones colectadas a 800rpm por 10 min. 
b) Decantar sobrenadante en la campana de flujo laminar. 
c) Resuspender células de cada fracción en 5 mL de medio CD-Hybridoma. 
d) Colocar el contenido celular de cada fracción en frascos T de 25 cm2. 
e) Incubar los frascos de cultivo de 25 cm2 a 37°C, 5% de CO2 y humedad a 
saturación. 
f) Realizar conteo celular. Si se obtiene una concentración menor a 0.2x106 
células viables/mL calcular el tiempo necesario para que se alcance esta 
concentración e iniciar cinética de sincronización. 
g) Los conteos celulares deberán realizarse con la frecuencia requerida, 
considerando que solo se puede tomar el 5% del volumen de un frasco. 
 
10.5.2. PREPARACIÓN DE MUESTRA PARA INYECCIÓN. 
 
1.- Dentro de la campana de flujo laminar, pasar el volumen de los diferentes 
frascos de cultivo de 175 cm2 a un solo frasco T de 175 cm2 y colocarlo 
verticalmente. 
2.- Colocar el volumen total en tubos de 50 mL de fondo cónico y centrifugarlos a 
800 rpm durante 10 min. 
3.- Eliminar el sobrenadante, juntar y resuspender todos los pellets celulares en 
un volumen total de 5 mL. 
4.- Verter el volumen en un recipiente estéril adecuado para poder introducirlo en 
una jeringa estéril de 10 mL, tapar la punta con la aguja y su capuchón. 
5.- Enroscar la jeringa en la válvula de inyección de 3 vías del elutriador, 
destinada para la inyección de muestra. 
 
29 
 
6.- Accionar el “By pass” e inyectar lentamente el total de la muestra a un flujo 
menor de 1 mL/min. Durante la inyección la muestra pasa a la cámara de 
mezclado. 
7.- Una vez inyectada la muestra, cerrar el ¨By pass¨ para anular la valvula de 
inyección y que la muestra pase a la cámara de elutriación. 
8.- Continuar con el procedimiento de elutriación, apartado 10.5.1. 
 
En la figura 4 se presenta un esquema general del proceso de preparación de la 
muestra. 
 
 
Figura 4. Esquema general de preparación de muestra. Una vez que se cuenta con un 
cultivo celular de características adecuadas (1), es vertido en tubos cónicos (2) para su 
centrífugación (3). Posteriormente el botón celular es resuspendido en 5 mL (4) y 
colectado para su inyección (5). 
 
10.6. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE ADN MEDIANTE 
CITOMETRÍA DE FLUJO. 
 
10.6.1. FIJACIÓN CELULAR 
 
1.- Previamente preparar suficientes tubos para citómetro con 2 mL de etanol al 
70%. Colocarlos en hielo para evitar que el ADN se dañe ya que la mezcla de 
etanol al 70% con el buffer de elutriación es exotérmica. 
2.- Centrífugar las muestras provenientes de elutriación a 1200 rpm. 
1 2 3 
4 5 
 
30 
 
3.- Eliminar el sobrenadante de las muestras dejando aproximadamente 0.5 mL 
en cada uno de los tubos que forman una fracción (2 tubos), de modo que el 
volumen total por fracción será de 1 mL. 
4.- Resuspender las células y verter dicho volumen en los tubos para citómetro 
con etanol. Mantener los 3 mL en hielo hasta su lectura. (Nota importante: Las 
células deben ser vertidas mediante goteo en el tubo con etanol, el cual se 
encuentra en agitación; esto aseguraque las células se dispersen y no se 
agreguen durante la fijación con etanol). 
 
10.6.2. TINCIÓN DEL ADN CON COLORANTE FLUORESCENTE 
 
1.- Centrífugar a 1200 rpm los tubos provenientes de fijación con etanol. 
2.- Decantar etanol 
3.- Agregar los siguientes reactivos en el orden mencionado: 
950 μL de amortiguador buffer PBS 1X 
10 μL de RNAasa A 10 mg/mL 
 40 μL de Ioduro de propidio 1 mg/mL 
4.- Incubar 30 min en obscuridad previo a la lectura. 
 
10.6.3. LECTURA EN CITÓMETRO FACS CALIBUR (BECTON DICKINSON) 
 
Las lecturas de contenido de ADN se llevaron a cabo en el citómetro Facs 
Calibur (Becton Dickinson) el cual cuenta con el software de análisis “Cell quest”. 
Las muestras se leyeron a un velocidad media de 35 µL/min. Los gráficos 
mostrados fueron generados a partir del análisis de 10 000 eventos usando los 
detectores FSC (dispersión de luz frontal), SSC (dispersión de luz lateral), FL2-
Area y FL2-ancho con un umbral lectura S2. Se realizó discriminación de 
dobletes, tripletes y “debris” celular. 
 
 
 
 
 
31 
 
10.7. CONSIDERACIONES MATEMÁTICAS 
 
10.7.1. VELOCIDAD ESPECÍFICA DE CRECIMIENTO 
 
La velocidad específica de crecimiento es una propiedad de los cultivos 
celulares; dicho valor es reproducible bajo condiciones de crecimiento 
específicas. La μ se calculó a través de la regresión lineal obtenida de la gráfica 
de Ln (X/X0) contra tiempo. Donde X y X0 son la concentración de las células 
viables al tiempo t y al inicio del cultivo, respectivamente. 
 
dx/dt = μX (1) 
 
Integrando: 
 
Ln (X/X0)=μt (2) 
 
El cálculo de la velocidad específica de crecimiento (µ) se realizó como parte de 
la caracterización del sistema biológico, además de que su valor fue empleado 
en los cálculos de predicción de concentración celular para los subcultivos. 
 
10.7.2. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS DATOS 
 
Para el análisis estadístico de las curvas de calibración, cinéticas de crecimiento 
y contenido de ADN en el intervalo 24-27 mL/min se usaron los siguientes 
parámetros de estadística descriptiva: 
- Desviación estándar (σ) como medida de centralización o dispersión de 
los datos. 
- Coeficiente de variación (c.v): Su fórmula expresa la desviación estándar 
como porcentaje de la media aritmética, mostrando una mejor 
interpretación porcentual del grado de variabilidad que la desviación típica 
o estándar. A mayor valor del coeficiente de variación mayor 
 
32 
 
heterogeneidad de los valores y a menor c.v mayor homogeneidad en los 
valores de la variable. 
- Coeficiente de correlación (r): el coeficiente de correlación lineal mide el 
grado de relación entre las variables cuando dicha relación es lineal. La 
correlación es tanto más fuerte cuanto más se aproxime a 1. 
 
Para la obtención de los porcentajes de las poblaciones en las diferentes fases 
del ciclo celular a partir de los resultados de contenido de ADN, se usó el modelo 
matemático Dean/Jett/Fox del software de análisis FlowJo. 
El software FlowJo ajusta los datos obtenidos del análisis de ciclo celular usando 
el modelo pragmático de Watson o el modelo Dean-Jett-Fox. Estos modelos son 
usados para definir a las poblaciones en G1, S y G2 del ciclo celular. Ambos 
modelos ajustan a dichas poblaciones a una curva Gaussiana. El modelo de 
Watson no hace suposiciones acerca de la distribución de la fase S si no que del 
total de la población resta los datos pertenecientes a las poblaciones G1 y G2 y 
posteriormente se construye una función que se adapte a los datos restantes. El 
modelo de Dean/Jett/Fox ajusta la fase S a un polinomio de segundo grado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
33 
 
11. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
Para mostrar los resultados obtenidos, el presente apartado se dividió en tres 
secciones: 
 
11.1. Caracterización del sistema de elutriación. 
11.2. Caracterización del sistema biológico. 
11.3. Evaluación de la sincronía obtenida. 
 
Las primeras dos secciones permitieron determinar las condiciones de trabajo 
ideales para la realización de los experimentos de separación de células BCF2 
en las diferentes fases del ciclo celular; la tercera sección se enfocó en 
determinar la sincronía existente en las fracciones obtenidas. 
 
11.1. CARACTERIZACIÓN DEL SISTEMA DE ELUTRIACIÓN 
 
Para caracterizar al sistema de elutriación nos basamos en la “Ley de Stokes” la 
cual describe matemáticamente el proceso de elutriación. En el Anexo I se 
desarrolla el principio matemático que rige el proceso de elutriación centrifuga. 
 
11.1.1. CARACTERIZACIÓN DEL SISTEMA DE CIRCULACIÓN DE FLUIDO 
 
Se caracterizó el perfil de flujos de las bombas peristálticas Masterflex y Minipuls 
3. Debido al tipo de control y escala “analógica” que tiene la bomba Masterflex el 
error que el experimentador comete al manipular el equipo se incrementa, sin 
embargo, con la ventaja de que el intervalo de operación es amplio, de 0 a 80 
rpm, permitiendo flujos altos. La bomba Minipuls 3 es de fácil manipulación 
debido a su control digital, el cual permite realizar cambios de incluso décimas 
de rpm. La desventaja es que la bomba presenta un intervalo de operación 
menor, de 0 rpm a 48 rpm. 
 
 
34 
 
La calibración de las bombas peristálticas se llevó a cabo colectando el volumen 
de agua destilada bombeado en un minuto, el cual posteriormente fue pesado 
para determinar el volumen exacto. Los volúmenes colectados pertenecen a 
flujos en el intervalo 19-28 mL/min para la bomba Minipuls y 9-49 mL/min para la 
bomba Masterflex. A continuación se muestran los perfiles de flujo obtenidos de 
un triplicado experimental tanto para la bomba peristáltica Minipuls 3 (Véase 
Figura 5) como para la bomba peristáltica Masterflex (Véase Figura 6). En cada 
uno de ellos podemos observar una relación lineal entre el flujo de salida del 
sistema de elutriación en funcionamiento (a 2000 rpm) y las RPM dadas por 
cada una de las bombas peristálticas. 
 
 
Figura 5. Calibración de la bomba Minipuls 3. Se muestran los valores promedio de un 
triplicado experimental, las barras de error (que representan la desviación estándar de 
cada punto), la ecuación de la recta junto con los valores de desviación estándar de la 
pendiente y ordenada y finalmente el coeficiente de correlación lineal. 
 
y = 0.661(±0.0121)x - 1.53 (±0.481) 
r = 1 
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
25 30 35 40 45 50
F
lu
jo
 
(m
L
/
m
in
) 
RPM 
 
35 
 
 
 
Figura 6. Calibración de la bomba Masterflex. Se muestran los valores promedio de un 
triplicado experimental, las barras de error (que representan la desviación estándar de 
cada punto), la ecuación de la recta junto con los valores de desviación estándar de la 
pendiente y ordenada y finalmente el coeficiente de correlación lineal. 
 
La ecuación de la recta para cada una de las bombas indican que para realizar 
cambios de 1 mL/min se deben realizar cambios de 0.02 (en la escala) para la 
bomba Masterflex y 1.51 rpm para la bomba Minipuls 3. 
El coeficiente de correlación calculado indicó prácticamente nula la variabilidad 
en la respuesta obtenida. También se calculó el coeficiente de variación (CV) 
para los valores de pendiente y ordenada de cada una de las ecuaciones. Los 
valores se muestran a continuación: 
 
 
 
 
 
 
y = 48.751(±0.423)x - 16.504(±2.14)r = 0.999 
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0.45 0.65 0.85 1.05 1.25 1.45
F
lu
jo
 
(m
L
/
m
in
) 
Valor de escala 
 
36 
 
Tabla 4. Coeficiente de variación para las ecuaciones provenientes de las curvas de 
calibración. Se presentan los C.V para las pendientes y ordenadas obtenidas de un 
triplicado experimental. 
 
Bomba peristáltica CV de la pendiente (%) CV de la ordenada (%) 
Minipuls 3 3.3 3.4 
Masterflex 3.5 12.08 
 
El CV expresa la desviación estándar como porcentaje de la media aritmética, 
mostrando una mejor interpretación porcentual del grado de variabilidad que la 
desviación típica o estándar. A mayor valor del CV mayor heterogeneidad de los 
valores y a menor CV, mayor homogeneidad en los valores de las pendientes y 
ordenadas. Como se puede observar en la Tabla 4 la bomba Minipuls presentó 
un alto grado de reproducibilidad en sus flujos mientras que la bomba Masterflex 
presentó menor reproducibilidad debido a su valor de C.V= 12.08%. 
 
11.2. CARACTERIZACIÓN DEL SISTEMA BIOLÓGICO. 
 
El modelo biológico fue caracterizado de tres formas: 
 Mediante la evaluación del crecimiento de BCF2 en las condiciones de 
cultivo adecuadas. 
 Determinación de la distribución de tamaño de una población no 
sincronizada en crecimiento exponencial. 
 Y mediante el análisis de contenido de ADN por citometría de flujo de una 
población no sincronizada. 
 
11.2.1. EVALUACIÓN DEL CRECIMIENTO DEL HIBRIDOMA BCF2 
 
Se realizaron 3 cinéticas de crecimiento en frascos de cultivo de 25 cm2 (cultivo 
estático) con el objetivo de conocer el comportamiento de la línea celular con 
respecto al tiempo en medio de cultivo específico para hibridoma. Para obtener 
el perfil mostrado en la Figura 7, a los frascos se les tomó una muestra cada 24 
h teniendo en cuenta que el volumen total extraído de cada frasco no 
 
37 
 
sobrepasara el 10% del volumen inicial. A cada una de las muestras se les 
evaluó la concentración de células viables (Xv/mL), concentración celular total 
(Xtot/mL) y viabilidad celular (%Xv). Con los datos de la concentración celular 
viable se determinó la velocidad específica de crecimiento aparente (µ) y a su 
vez el tiempo de duplicación celular (td). Véase Tabla 5. 
 
Figura 7. Cinética de crecimiento de la línea celular BCF2. En esta gráfica se muestran 
los promedios de tres cinéticas junto con las barras de error que representan la 
desviación estándar de cada punto. , células viables (Xv/mL); , células 
totales( Xtot/mL) y , viabilidad celular (%Xv). 
 
Tabla 5. Caracterización del sistema biológico. Se muestran los valores promedio de 
los parámetros obtenidos a partir de tres cinéticas de crecimiento de la línea celular 
BCF2 * Valor a las 120 h / ** Valor a las 96 h. 
 
Células totales (Xtot/mL)* (2.5x10
6 ± 0.3) cel mL-1 
Viabilidad máxima (Xv max)** (90.3 ± 2.4) % 
Concentración máxima (X max)** (2.1 x10
6 ± 0.2) cel mL-1 
Velocidad especifica de crecimiento (µ) (0.033±0.001) h
-1 
Tiempo de duplicación 20.90 h 
 
A partir del análisis de estos resultados se determinó el intervalo de tiempo ideal 
para subcultivar, cosechar y realizar elutriaciónes con una viabilidad ≥90% lo 
0
20
40
60
80
100
120
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
0 50 100
C
o
n
ce
n
tr
a
ci
ó
n
 c
e
lu
la
r 
 
(m
il
lo
n
e
s 
d
e
 c
é
lu
la
s/
m
L
) 
Tiempo (h) 
V
ia
b
ilid
a
d
 ce
lu
la
r (%
X
v
) 
 
38 
 
cual asegura que las células no han entrado en ningún proceso apoptótico. Este 
intervalo corresponde a 84 h (1.5 x106 cel mL-1) – 96 h (2.1 x106 cel mL-1). 
 
11.2.2. DETERMINACIÓN DEL DIÁMETRO CELULAR 
 
De la ecuación derivada de la ley de Stokes (ecuación 5 del Anexo I) la única 
variable a determinar para conocer el flujo de elución es el diámetro celular; de 
modo que este se determinó experimentalmente usando el contador electrónico 
de partículas Beckman Coulter Multisizer™ 3. Al analizar una muestra de cultivo 
creciendo en fase exponencial, el equipo determina la distribución de tamaños y 
lo representa mediante un histograma donde la altura de cada barra es el 
número de las células con determinado diámetro (Véase Figura 8). Se determinó 
que el rango de diámetros de una población no sincronizada se encuentra 
mayoritariamente entre 12 y 18 micras. 
 
 
 
Figura 8. Histograma de la distribución de diámetros del hibridoma BCF2. Se muestra 
un histograma obtenido al graficar número de células vs tamaño celular. Los datos 
fueron obtenidos en el Coulter Multisizer 3. 
 
39 
 
11.2.3. CÁLCULO DEL FLUJO DE ELUCIÓN EMPLEANDO LA LEY DE 
STOKES SIMPLIFICADA 
 
Sustituyendo los valores de diámetro de la población BCF2 en la ecuación 
simplificada de la Ley de Stokes (ecuación 5) se determinaron los flujos a los 
cuales las poblaciones con determinado valor de diámetro serían eluidas de la 
cámara de elutriación (Tabla 6). 
 
Tabla 6. Flujos de colecta teóricos obtenidos a partir de los datos del contador 
electrónico de partículas (Coulter Multisizer) y de la ley de Stokes. 
 
DIAMETRO 
(μm) 
FLUJOS 
CALCULADOS 
(mL/min) 
11.6 20.5 
12.3 23 
12.9 25.5 
13.5 28 
14.1 30.5 
14.7 33 
15.2 35.5 
15.8 38 
16.3 40.5 
16.8 43 
17.2 45.5 
 
Como se observa en la Tabla 6, células con diámetros menores a 11.6 µm 
eluyen a 20.5 mL/min de modo que flujos menores a este no permiten la salida 
de alguna subpoblación celular de la cámara de separación. Lo anterior permitió 
eliminar restos celulares evitando la salida de las células. 
 
 
 
40 
 
11.2.4. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE ADN MEDIANTE 
CITOMETRÍA DE FLUJO PARA UNA POBLACIÓN NO 
SINCRONIZADA 
 
Para determinar la distribución del contenido de ADN de un cultivo no 
sincronizado de BCF2 en medio para hibridomas suplementado se tomó muestra 
a las 0, 24, 48, 72 y 96 horas. Cada muestra fue fijada y teñida con ioduro de 
propidio según el apartado 10.6. Los resultados de dicha determinación, la 
distribución de tamaño relativo de la población y el aumento de la granularidad 
con respecto al tiempo se muestran en la Figura 9. 
 
 
Figura 9. De izquierda a derecha. Distribución de tamaño relativo, complejidad celular 
(medición relativa de la cantidad de organelos) y contenido de ADN de una población 
BCF2 no sincronizada. 
 
 
41 
 
Mediante el software FlowJo se cuantificó el porcentaje relativo de las 
subpoblaciones G1, S y G2 en un cultivo no sincronizado de la línea celular 
BCF2 según el modelo matemático Dean/Jett/Fox. Los resultados se muestran 
en la Tabla 7. Se determinó que en todo el tiempo la distribución de ADN es 
heterogénea y que la población predominante en un cultivo de BCF2 no 
sincronizado desde las cero hasta las 96 horas siempre fue la población en fase 
S, seguida de la población en fase G1 y finalmente la población en fase G2. Sin 
embargo, cabe señalar que del análisis de contenido de ADN mostrado la Figura 
9 observamos que el mayor número de células con el mismo contenido de ADN 
se encuentran en fase G1, esto debido a que el ancho del pico es menor y la 
altura máxima, lo cual a su vez indica una menor variación del contenido de 
ADN. Por lo tanto, si se desea obtener la mayor cantidad de células con un alto 
grado de sincronización, se deberá de colectar a las células en fase G1. 
 
Tabla 7. Porcentaje decélulas en cada fase del ciclo celular de una cinética de 
crecimiento típica de BCF2 no sincronizada usando el modelo matemático 
Dean/Jett/Fox a partir de la determinación contenido de ADN. 
 
Tiempo 
(h) 
Fase del ciclo celular 
G1 (%) S (%) G2 (%) 
0 24.7 57.8 16.9 
24 31.3 46.4 21.8 
48 31.8 42.4 26.1 
72 24.6 57.8 16.2 
96 23.8 53.9 18.2 
 
A partir de los resultados de la determinación de contenido de ADN y los 
resultados de determinación de tamaño, se infirió el diámetro de las poblaciones 
celulares en G1 y G2. Puesto que el contenido de ADN en G2 es del doble que 
en G1 y esto a su vez es directamente proporcional al tamaño de la célula; los 
diámetros más chicos de la distribución (véase Figura 8) corresponderían a la 
población en fase G1 y los diámetros más grandes corresponderían a la 
población en fase G2. 
 
 
42 
 
11.3. EVALUACIÓN DE LA SINCRONÍA OBTENIDA POR EL MÉTODO DE 
ELUTRIACIÓN CENTRÍFUGA 
 
11.3.1. EVALUACIÓN DE CONTENIDO DE ADN DE LAS FRACCIONES 
CELULARES OBTENIDAS A LOS FLUJOS DETERMINADOS POR 
LA LEY DE STOKES SIMPLIFICADA 
 
Una vez realizadas las caracterizaciones del sistema biológico y de elutriación se 
llevaron a cabo diversas elutriaciones. La obtención de fracciones celulares de la 
línea celular BCF2 en las diferentes fases del ciclo celular fue el objetivo. Se usó 
el sistema de elutriación a 2000 rpm variando los flujos de la bomba peristáltica 
Masterflex entre 10 y 50 mL/min. El medio de elutriación utilizado fue el 
amortiguador isotónico PBS (330 mOsm) y la carga de células a separar fue de 
107 células en 5 mL de inyección. 
 
Se realizó un barrido del contenido de ADN de las diferentes poblaciones 
presentes en un cultivo de BCF2 obtenidas a partir de los flujos determinados 
previamente por la ley de Stokes, (Véase Tabla 6). La Figura 10 muestra los 
resultados, donde se observa la variación del contenido de ADN para las 
fracciones colectadas a los diferentes flujos, aumentando 2.5 mL/min, partiendo 
de 20.5 mL/min y hasta 45.5 mL/min. En las dos primeras series de gráficos se 
observó un aumento de tamaño y granularidad celular mientras que en la tercera 
serie se observó la variación del contenido de ADN conforme se colectaron 
fracciones a flujos cada vez más altos. 
 
 
43 
 
 
Figura 10. De izquierda a derecha. Distribución de tamaño relativo, complejidad celular y 
variación del contenido de ADN para una población fraccionada de BCF2. Fracciones 
obtenidas con bomba peristáltica MasterFlex. 
 
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o o .- --.~ -- -o o .- --.~ -- -o o .- --.~ -- -o o .- - 30.5 ..... Un-oin -
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Taonafto T~""" Conteroido de ADN 
 
44 
 
Comparando el control con las fracciones obtenidas; se identificaron las 
diferentes poblaciones celulares por su contenido de ADN; de modo que entre 
20.5 y 28 mL/min se logró separar una población enriquecida en G1, de 28 a 
35.5 mL/min una población enriquecida en S y finalmente de 35.5 a 45.5mL/min 
una población enriquecida en G2. 
Se determinó que en el intervalo de flujo de 23 –27 mL/min se podría colectar de 
manera particular a la población G1 con un alto grado de sincronización. 
Posteriores elutriaciones se enfocaron a colectar fracciones en esta región con 
poblaciones mayoritariamente en fase G1, lo cual también nos permitió evaluar 
el comportamiento del sistema de elutriación en un intervalo de flujos más corto. 
 
11.3.2. MEDICIÓN DEL CONTENIDO DE ADN EN LA REGIÓN CON MAYOR 
PRESENCIA DE CÉLULAS EN FASE G1 
 
A partir de la información obtenida de la Figura 10 se realizaron elutriaciones en 
la región de 23-27mL/min; con la particularidad del uso de la bomba peristáltica 
Minipuls, que es una bomba que permite hacer cambios de flujos más precisos 
debido a su control digital electrónicol. Esta característica la hizo ideal para 
colectar (en un intervalo de flujo más estrecho) poblaciones mayoritariamente en 
fase G1. La Figura 11 muestra la evaluación por triplicado del perfil de contenido 
de ADN para poblaciones eluidas a flujos dentro del intervalo 24-27mL/min. El 
análisis de datos del perfil de contenido de ADN es resumido y mostrado en la 
Tabla 8, en el cual se observa que las fracciones colectada a 25 mL/min y a 26 
mL/min fueron las fracciones con mayor porcentaje de células en fase G1, 
79.4±3.3% y 78.4±6.3% respectivamente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
45 
 
 
 
Elutriación 1 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Control 
G1= 34.8%; S=56.9%; G2=7.84% 
Fracción 24 mL/min 
G1= 75.2%; S=18.1%; G2= 2.73% 
Fracción 25 mL/min 
G1= 82.5%; S= 10.6%; G2=4.39% 
Fracción 26 mL/min 
G1= 85.7%; S= 9.12%; G2= 4.14% 
Fracción 27 mL/min 
G1= 58.6%; S=28.0%; G2=11.2% 
N
ú
m
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ro
 d
e
 c
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lu
la
s
 
Unidades relativas de fluorescencia 
N
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ro
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 c
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la
s
 
Unidades relativas de fluorescencia 
N
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N
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N
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lu
la
s
 
Unidades relativas de fluorescencia Unidades relativas de fluorescencia 
Unidades relativas de fluorescencia 
 
46 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Elutriación 2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Control 
G1= 33.7%; S=55.5%; G2= 9.29% 
Fracción 24 mL/min 
G1=69.1%; S= 28.9%; G2= 3.1% 
Fracción 25 mL/min 
G1= 79.9%; S=10.9%; G2= 6.9% 
Fracción 26 mL/min 
G1= 74.1%; S= 12.2%; G2= 12.6% 
Fracción 27 mL/min 
G1=58.9%; S=29.2%; G2=10.6% 
N
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s
 
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la
s
 
N
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 c
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lu
la
s
 
 
47 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8. Análisis de contenido de ADN para Elutriacion 1, Elutriacion 2 y Elutriacion 3, a flujos 
24, 25, 26 y 27 mL/min. Este análisis se llevó a cabo mediante el uso del Software 
 
Figura 8. Análisis de contenido de ADN para Elutriacion 1, Elutriacion 2 y Elutriacion 3, 
a 
Elutriación 3 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Control 
G1= 28.3%; S=38.6%; G2=22.4% 
6% 
Fracción 24mL/min 
G1= 52.0%; S = 32.5%; G2 = 9.34% 
Fracción 25mL/min 
G1= 75.9%; S = 13.9%; G2 = 8.55% 
Fracción 26mL/min 
G1= 59.6%; S = 26.1%; G2 = 10.3% 
 
Fracción 27 mL/min 
G1= 50.6 %; S= 47.4%; G2= 6% 
N
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la
s
 
N
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N
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ro
 d
e
 c
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lu
la
s
 
N
ú
m
e
ro
 d
e
 c
é
lu
la
s
 
N
ú
m
e
ro
 d
e
 c
é
lu
la
s
 
 
48 
 
 
Figura 11. Análisis de contenido de ADN para las elutriaciónes 1, 2 y 3, a flujos de 24, 
25, 26 y 27 mL/min. Dicho