Marcado-estabilidad-y-evaluacion-in-vitro-de-inhibidores-de-carboxipeptidasa-II

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE 
MÉXICO 
 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
MARCADO, ESTABILIDAD Y EVALUACIÓN 
IN VITRO DE INHIBIDORES DE CARBOXIPEPTIDASA II 
 
TESIS 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA 
 
 
 
P R E S E N T A 
MONICA JANET MENDOZA FIGUEROA 
 
 
 
 CIUDAD UNIVERSTARIA, CD. MX., 2016 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE: Profesor: FRANCISCO HERNANDEZ LUIS 
VOCAL: Profesor: ELIZABETH REYES LOPEZ 
SECRETARIO: Profesor: BLANCA ELÍ OCAMPO GARCÍA 
1er. SUPLENTE: Profesor: CLAUDIA INES RIVERA CARDENAS 
2° SUPLENTE: Profesor: SARA MARGARITA GARZA AGUILAR 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
LABORATORIO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO DE 
RADIOFÁRMACOS DEL INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES 
NUCLEARES (ININ) 
 
 
ASESOR DEL TEMA: DRA. OCAMPO GARCÍA BLANCA ELÍ 
 
SUPERVISOR TÉCNICO: DRA. SANTOS CUEVAS CLARA LETICIA 
 
SUSTENTANTE: MENDOZA FIGUEROA MONICA JANET 
 
 
 
 
 
 
4 
 
 
 
 
El presente trabajo se desarrolló en las instalaciones del Laboratorio Nacional de 
Investigación y Desarrollo de Radiofármacos del Departamento de Materiales 
Radiactivos de la Gerencia de Aplicaciones Nucleares en la Salud del Instituto 
Nacional de Investigaciones Nucleares, bajo la dirección de la Dra. en C Blanca Elí 
Ocampo García y la supervisión de la Dra. en C Clara Leticia Santos Cuevas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
5 
 
Agradecimientos 
 
A mis padres, Emilia y Liborio por su paciencia, apoyo y cariño, por ser mi refugio, mi 
soporte, por impulsarme, trascender y crecer conmigo. Aunque no suela decírselos, los 
quiero mucho. 
 
A mis hermanos, Joan, Brian y Kevin por soportarme y alegrarme de vez en cuando los 
días. 
 
A la Dra. Guillermina Ferro, por compartir su experiencia y conocimientos. 
 
A la Dra. Lety y la Dra. Blanquita, por su paciencia, por compartir sus conocimientos, y 
apoyo. 
 
Al M en C. Luciano Hernández por apoyarme y orientarme durante mis estudios, por su 
tiempo, confianza y calidez que recibí en su laboratorio. 
 
A mis compañeros del INCan, Vane, Hector, Monse, Manuel, por su apoyo y los buenos 
momentos compartidos. 
 
A mis compañeros Kendra, Jorge, Claudia, Brenda, Fernando, Martín, Abigail, 
Araceli, Judith, Allison, Sandra, Elizabeth, Leonardo, por las experiencias, buenos 
momentos, las risas y consejos compartidos en esta etapa. 
 
Al Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares y a las personas que conforman el 
Laboratorio de Radiofármacos por brindarme su apoyo para la realización de este trabajo. 
 
A los miembros del jurado, por sus aportaciones y observaciones para el enriquecimiento 
del presente trabajo. 
 
 
 
 
 
 
6 
 
Índice general 
 
Abreviaturas 8 
Índice de figuras 9 
Índice de tablas 10 
1. Resumen 11 
2. Introducción 13 
3. Antecedentes 15 
3.1. Medicina nuclear 15 
3.2. Radiofármacos 15 
3.2.1. Clasificación 16 
3.3. Radiomarcado 18 
3.3.1. Marcado directo 19 
3.3.2. Marcado indirecto 19 
3.3.3. Control de calidad para los radiofármacos 20 
3.4. Agente quelante bifuncional 21 
3.5. Lutecio 25 
3.5.1. Química de coordinación de Lu 26 
3.5.2. Lutecio-177 26 
3.5.3. Producción de 177Lu 26 
3.5.4. Aplicaciones de 177Lu 27 
3.6. Tecnecio 27 
3.6.1. Generador de 99Mo / 99mTc 28 
3.6.2. Química del Tecnecio 28 
3.7. Cromatografía 29 
3.7.1. HPLC 29 
3.8. Enzima Glutamato carboxipeptidasa II 30 
3.8.1. Estructura 32 
3.8.2. Expresión 34 
3.8.3. Inhibidores de GCPII 35 
3.8.3.1. Inhibidores basados en fosforo 36 
3.8.3.2. Inhibidores basados en grupo tiol 37 
3.8.3.3. Inhibidores a base de urea 40 
3.9. Modelado molecular 42 
 
 
7 
 
4. Objetivos 43 
5. Metodología 44 
5.5. Cálculo de la energía potencial por Mecánica Molecular 44 
5.6. Identificación radionucleídica por espectrometría gamma 44 
5.7. Caracterización del péptido iPSMA por espectrofotometría FT-IR 44 
5.8. Radiomarcado de inhibidores de la Carboxipeptidasa II 45 
5.8.1. Marcado del conjugado 99mTc-HYNIC-iPSMA 45 
5.8.2. Marcado del conjugado 177Lu-DOTA-iPSMA 46 
5.9. Determinación de la pureza radioquímica por HPLC 47 
5.10. Estabilidad radioquímica 48 
5.11. Estabilidad en suero humano 48 
5.12. Evaluación in vitro de inhibidores de GCPII 48 
5.12.1. Línea celular 48 
5.12.2. Cultivo celular 49 
5.12.3. Internalización y unión no específica 49 
5.13. Análisis estadístico 50 
6. Resultados y análisis de resultados 51 
6.5. Diseño y preparación 51 
6.6. Cálculo de la energía potencial por Mecánica Molecular 53 
6.7. Identificación radionucleídica por espectrometría gamma 53 
6.8. Caracterización del inhibidor iPSMA por espectrofotometría FT-IR 54 
6.9. Radiomarcado de inhibidores de GCPII 58 
6.10. Evaluación de la pureza radioquímica 60 
6.11. Estabilidad en suero humano 65 
6.12. Pruebas in vitro 69 
6.12.1. Captación in vitro 69 
6.12.2. Internalización celular 69 
7. Conclusiones 72 
8. Bibliografía 73 
 
 
 
8 
 
 
Abreviaturas 
 
177Lu Lutecio-177 
99mTc Tecnecio-99 metaestable 
BFCA Agente quelante bifuncional 
Bq Bequerelio 
Ci Curie 
Cpm Cuentas por minuto 
DOTA Ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N, N´, N´´, N´´´-tretraacético 
EDDA Ácido etilendiaminodiacético 
EGFR Receptor del Factor de crecimiento epidérmico 
eV electrón Volt 
FDA Food and Drug Administration 
GCPII Glutamato carboxipeptidasa II 
HER2 Receptor 2 de factor de crecimiento epidérmico humano 
HPLC Cromatografía Líquida de Alta Resolución 
HYNIC Ácido 6-hidrazinilpiridin-3-carboxílico 
MBCDF Línea celular de cáncer de mama ductal F serie M 
MIR Infrarrojo Medio 
PSMA Antígeno Prostático Específico de Membrana 
RE Receptor de estrógenos 
RP Receptor de progesterona 
SAR Relación Estructura-Actividad 
SFB Suero Fetal Bovino 
SUM229PE Línea celular de cáncer de mama derivada de un derrame pleural 
t1/2 Tiempo de vida media 
tR Tiempo de retención 
 
 
 
 
 
9 
 
 
Índice de figuras 
Figura 1.Estructura del ácido 6-hidrazinilpiridin-3-carboxílico (HYNIC) ............................ 22 
Figura 2. Estructura de coligandos EDDA y Tricina ......................................................... 23 
Figura 3. Estructura del ácido 1,4, 7,10-Tetraazaciclododecano-N, N´, N´´, N´´´-
tretraacético (DOTA) ................................................................................................. 24 
Figura 4. Enfoques de conjugación de DOTA con una biomolécula ................................. 25 
Figura 5. Diagrama de la estructura de GCPII ................................................................. 31 
Figura 6.Representación del sitio catalítico de GCPII unido a NAAG ............................... 33 
Figura 7. Diseño de inhibidores de GCPII basados en NAAG .......................................... 36 
Figura 8. Ejemplos representativos de los tres grupos de inhibidores .............................. 38 
Figura 9. Estructura de PSMA-11 y PSMA-617 ................................................................ 41 
Figura 10. Esquema de marcado del inhibidor de GCPII con el radionúclido 99mTc ........ 455 
Figura 11. Esquema de marcado del inhibidor de GCPII con el radionúclido 177Lu ........ 466 
Figura 12. Estructura dela molécula de HYNIC-iPSMA ................................................... 52 
Figura 13. Estructura de la molécula de DOTA-iPSMA .................................................... 52 
Figura 14.Espectro de emisión gamma del fotopico principal de 99mTc ............................ 53 
Figura 15. Espectro de emisión gamma de los fotopicos principales de 177Lu .................. 54 
Figura 16. Espectro FT-IR de HYNIC-iPSMA ................................................................... 55 
Figura 17. Espectro FT-IR de DOTA-iPSMA .................................................................... 56 
Figura 18. Pureza radioquímica de 99mTc-HYNIC-iPSMA ................................................ 61 
Figura 19. Estabilidad de 99mTc-HYNIC-iPSMA. .............................................................. 61 
Figura 20. Pureza radioquímica de 177Lu-DOTA-iPSMA ................................................... 63 
Figura 21. Estabilidad de 177Lu-DOTA-iPSMA .................................................................. 63 
Figura 22. Estabilidad en suero humano de 99mTc-HYNIC-iPSMA................................. 655 
Figura 23. Cromatogramas UV-vis de 99mTc-HYNIC-iPSMA y suero humano .................. 66 
Figura 24. Estabilidad en suero humano de 177Lu-DOTA-iPSMA ..................................... 67 
Figura 25. Cromatogramas UV-vis de 177Lu-DOTA-iPSMA y suero humano. ................. 68 
Figura 26. Internalización de 177Lu-DOTA-iPSMA y 99mTc-HYNIC-iPSMA ....................... 70 
 
 
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10 
 
Índice de tablas 
Tabla 1. Radiofármacos utilizados en medicina nuclear..……………………………… 17 
Tabla 2. Sistema de gradientes utilizado en fase reversa……………………………… 47 
Tabla 3. Asignación de bandas características de vibración IR de HYNIC-iPSMA…. 55 
Tabla 4. Asignación de bandas características de vibración IR de DOTA-iPSMA.… 56 
Tabla 5. Resultados de captación en células de cáncer de mama…………………… 69 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
11 
 
1. Resumen 
La enzima Glutamato carboxipeptidasa II (GCPII) es una proteína transmembrana tipo II 
con un peso molecular aproximado de 90 a 100 kDa. Aunque la función de la GCPII en 
las células del endotelio normal es desconocido, la sobre-expresión en el endotelio 
asociado al tumor hace de la GCPII un blanco molecular adecuado para el diagnóstico y 
tratamiento de muchas formas de cáncer. Se han diseñado diversas moléculas pequeñas 
a base de urea como inhibidores de esta enzima los cuales han tenido impacto clínico. 
Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue radiomarcar inhibidores de la Carboxipeptidasa 
II con 99mTc o 177Lu, evaluar su estabilidad por HPLC y su captación in vitro en células de 
cáncer. 
 
El diseño de las estructuras fue derivado del farmacóforo Glu-Urea-Lys. Para el 
radiomarcado con los radionúclidos 99mTc y 177Lu se utilizaron los agentes quelantes 
bifuncionales HYNIC y DOTA respectivamente, y se realizó a 92°C durante 30 minutos. La 
pureza radioquímica se determinó por HPLC de fase reversa a diferentes tiempos, 
después del marcado. La estabilidad en suero humano y los datos de unión a proteínas 
séricas se obtuvieron a las 1, 3 y 24 h por HPLC de exclusión molecular. La especificidad 
de los inhibidores radiomarcados se analizó con pruebas de captación e internalización 
en dos líneas celulares de cáncer de mama (SUM-229PE y MBCDF-D5). 
 
La pureza radioquímica para los radiofármacos 99mTc-HYNIC-iPSMA y 177Lu-DOTA-iPSMA 
fue de 97.7 ± 2.0 % y 99.7 ± 0.2%, respectivamente. La unión a proteínas fue de 2.9 ± 0.4 
% para 99mTc-HYNIC-iPSMA y 8.2 ± 0.5 % para 177Lu-DOTA-iPSMA, determinada tras la 
incubación en suero humano durante 1 h. Los datos de captación e internalización celular 
en la línea SUM-229PE fue de > 5 % y > 18 % respectivamente para 99mTc-HYNIC-
iPSMA y > 18 % y ~15 % para 177Lu-DOTA-iPSMA, mientras que en la línea MBCDF-D5 la 
captación fue < 2 % y > 20 % sin diferencia significativa entre los radiofármacos ni entre 
grupos de células con receptores bloqueados y no bloqueados (p<0.05). 
 
Los radiofármacos propuestos, basados en GCPII, mostraron una alta pureza y 
estabilidad radioquímica tanto en solución salina como en suero humano, y bajo 
porcentaje de unión a proteínas séricas. El análisis de captación e internalización in vitro 
mostraron especificidad por GCPII sobre-expresada en la línea celular SUM-229PE. Los 
 
 
12 
 
resultados obtenidos en este trabajo sustentan la realización de estudios in vivo para 
evaluar su uso en la detección y tratamiento de diferentes tipos de cáncer en el que 
GCPII está sobre-expresada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
13 
 
2. Introducción 
Desde la década de 1930 la Medicina Nuclear hace uso de diferentes radionúclidos para 
diagnosticar y tratar diferentes enfermedades. El radionúclido ampliamente utilizado con 
fines diagnósticos en medicina nuclear debido a sus características de emisión (fotones 
monoenergéticos), su corto tiempo de vida media (6.02 h), su baja toxicidad, su bajo 
costo, entre otras, es el 99mTc. En contraste uno de los radionúclidos utilizados con fines 
terapéuticos es el 177Lu debido a sus características tales como emisión (partículas beta), 
su facilidad de producción, su obtención con alta actividad específica, su tiempo de vida 
media más larga que resulta en tiempos de residencia en el tumor más largos, etc. (1) 
Los radiofármacos han adquirido gran importancia en la práctica clínica. Un radiofármaco 
contiene una molécula orgánica marcada con un radionúclido que dependiendo de su tipo 
de emisión es utilizado tanto con fines diagnósticos o terapéuticos. Mientras que en un 
radiofármaco de uso diagnóstico la radiación emitida se utiliza como indicador de una 
función fisiológica o para obtener una imagen de su acumulación en un órgano o sitio de 
interés; un radiofármaco de uso terapéutico se utiliza en radioterapia dirigida, que tras su 
acumulación genera citotoxicidad en las células tumorales no permitiendo su 
proliferación.(2) 
Recientemente se ha identificado la enzima Glutamato carboxipeptidasa II (GCPII), una 
glicoproteína integral de membrana tipo 2 que posee un fragmento citoplasmático de 19 
aminoácidos, un solo dominio transmembrana de 24 aminoácidos y una región 
extracelular de 707 aminoácidos. Su expresión se asocia con metástasis, andrógeno 
independencia y progresión de cáncer de próstata, además se encuentra expresada en el 
endotelio de la mayoría de los tumores sólidos diferentes al de próstata, pero no en el 
endotelio normal. (3),(4) 
Aunque el significado de la expresión de GCPII dentro del endotelio es desconocido, la 
especificidad para el endotelio asociado al tumor hace de GCPII un blanco molecular 
adecuado para el diagnóstico y tratamiento de muchas formas de cáncer. (5),(6) 
Durante las dos últimas décadas, se han descrito en la literatura un gran número de 
ligandos selectivos de GCPII marcados con radionúclidos de diferentes tipos y 
propiedades, los cuales han tenido impacto clínico, ya que muestran la capacidad de ser 
utilizados como agentes de diagnóstico y/o terapia de diferentes tipos de cáncer. (3) 
 
 
14 
 
Con base en lo anterior, en el presente trabajo se marcaron dos inhibidores de 
Carboxipeptidasa II (99mTc-HYNIC-iPSMA y 177Lu-DOTA-iPSMA) y se evaluó su 
estabilidad radioquímica y sus propiedades de unión in vitro en células de cáncer de 
mama. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
15 
 
3. Antecedentes 
3.1. Medicina nuclear 
La medicina nuclear surgió en la década de 1930, cuando los investigadores empezaron a 
producir fosforo radiactivo (32P) en la Universidad de Berkeley en California y utilizarlo 
para el tratamientode policitemia rubra vera, una enfermedad mieloproliferativa 
caracterizada por la sobreproducción de glóbulos rojos. En 1946 la introducción del yodo 
radiactivo (131I) como agente para el tratamiento de cáncer de tiroides dio lugar a la 
aplicación exitosa de radionúclidos en la medicina nuclear.(1) 
A principios de la década de 1970, su desarrollo y evolución se acentuó gracias al aporte 
de nuevos instrumentos de detección para el diagnóstico por imagen y a la aparición de 
nuevos radionúclidos. Los radiofármacos empezaron a utilizarse intensamente durante la 
década de 1980, facilitando el desarrollo de nuevos compuestos radiactivos con 
aplicaciones tanto diagnósticas como terapéuticas. La aplicación más importante ha sido 
la obtención de imágenes externas funcionales, debido a que la fuente radiactiva debe 
presentar determinadas propiedades en términos de naturaleza y energía.(7) 
La medicina nuclear es una especialidad médica que emplea técnicas seguras y con un 
alto índice costo/beneficio, para obtener información funcional y anatómica. 
A menudo, permite detectar alteraciones mucho antes de que las enfermedades sean 
clínicamente detectables, lo que repercute significativamente en tratamientos tempranos 
efectivos y pronósticos favorables. 
 
3.2. Radiofármacos 
Un radiofármaco es una molécula orgánica que contiene un átomo radiactivo dentro de su 
estructura y que, por su forma farmacéutica, cantidad y calidad de radiación es usado 
para el diagnóstico y/o el tratamiento de enfermedades humanas cuya aplicación se 
realiza en los servicios de medicina nuclear.(2) 
En general, un radiofármaco está formado por una molécula de soporte que actúa como 
vehículo o sitio de reconocimiento específico y un radionúclido que emite radiación 
permitiendo la detección externa del radiofármaco o la deposición de energía en los sitios 
 
 
16 
 
de tratamiento. La molécula soporte o vehículo aporta al radiofármaco la característica de 
dirigirse hacia un órgano o tejido en específico, por el cual, debido a sus características 
fisicoquímicas o biológicas, presenta una afinidad selectiva. Por lo tanto las moléculas 
utilizadas en los radiofármacos normalmente no tienen ningún efecto farmacológico. Es 
decir, estos no muestran ninguna relación dosis-respuesta difiriendo así de los fármacos 
convencionales. Sin embargo en el caso de radiofármacos terapéuticos la dosis–
respuesta está relacionada con la cantidad de actividad radiactiva el radionúclido utilizado. 
La interacción de manera específica con el sistema biológico, baja toxicidad, excreción 
inalterada en tiempos relativamente cortos, localización selectiva en un órgano para que 
pueda ser evidenciado desde el exterior, son algunas de las propiedades que deben 
poseer los radiofármacos.(8) 
3.2.1. Clasificación 
Los radiofármacos se clasifican de acuerdo a sus aplicaciones médicas. 
3.2.1.1. Radiofármacos para uso diagnóstico 
Un radiofármaco de uso diagnóstico, permite realizar un estudio funcional, metabólico y/o 
morfológico del órgano. El radionúclido utilizado es un emisor de radiación gamma y el 
ligando es una molécula orgánica capaz de unirse de al radionúclido. Constituyen el 80% 
de los radiofármacos utilizados. 
Las características requeridas en un radiofármaco para su uso con fines de diagnóstico 
son: 
a. Proporcionar una dosis mínima de radiación al paciente 
b. La radiación emitida (gamma) debe ser detectada fácilmente y a distancia por los 
equipos de imagen molecular 
c. Tener vida media compatible con el tiempo requerido para rastrear el evento 
biológico estudiado 
d. Ser de administración única 
e. Mantener una energía de emisión preferente de un rayo gamma monocromático 
de entre 100 y 300 keV, y no emitir partículas alfa o beta. 
f. Ser de fácil disponibilidad, ser económico y conservarse sin contaminación. (9),(10) 
 
 
17 
 
3.2.1.2. Radiofármacos para uso terapéutico 
Los radiofármacos de uso terapéutico, utilizan un radionúclido emisor de partículas beta 
(β-), partículas alfa (α) o electrones Auger que tras su administración al paciente la 
radiactividad es acumulada sobre el tejido, deposita su energía en las células 
circundantes y es la que ejerce el efecto terapéutico mediante la inducción de 
citotoxicidad a las células tumorales para detener la proliferación. 
Algunas de las características que debe poseer un radiofármaco para su uso con fines 
terapéutico son: 
a. El emisor de partículas β- debe ser de baja transferencia lineal de energía 
b. Tener alta selectividad para no irradiar las células sanas, mientras que el complejo 
no enlazado sea eliminado de forma rápida e inalterada del organismo 
c. Tener vida media moderadamente larga (horas o días) 
d. Ser seguro para el personal y pacientes que lo utilicen 
e. Contar con una preparación y control de calidad controlados.(10),(11) 
3.2.1.3. Aplicaciones de los radiofármacos 
La medicina nuclear utiliza diferentes tipos de radionúclidos para sus aplicaciones 
diagnósticas y terapéuticas. 
En la Tabla 1 se muestran algunos de los radiofármacos acorde a su utilidad en la 
práctica médica en el área de Medicina Nuclear. (11),(12) 
Tabla 1. Radiofármacos utilizados en Medicina Nuclear 
Radiofármacos para uso diagnóstico Radiofármacos para uso terapéutico 
99mTc 
Imagen ósea, de corazón, cerebro, 
tiroides, pulmones, riñones y 
tumores de diferentes tipos de 
cáncer. 
32P 
Craneofaringioma quística, 
Policitemia vera 
67Ga 
Detección de tumores e 
infecciones 
223Ra Metástasis ósea 
166Ho Diagnóstico de tumores hepáticos 177Lu 
Sinovitis, Radioinmunoterapia, 
Radioterapia dirigida con péptidos de 
reconocimiento específico. 
201Tl 
Detección daño en músculo 
cardiaco 
188Re 
Metástasis ósea, Artritis remautoide, 
Radioinmunoterapia 
18F 
Detección de problemas cardiacos, 
Localización de focos epilépticos, 
Hipermetabolismo tumoral 
90Y 
Metástasis hepáticas, Sinovitis 
villonodular pigmentado, 
Radioinmunoterapia para Linfoma no 
 
 
18 
 
Hodgkin 
123I 
Detección de disfunción adrenal, 
monitoreo de función tiroidea 
131I 
Terapia de cáncer de tiroides 
diferenciado, Radioinmunoterapia 
para Linfoma no Hodgkin 
3.2.1.4. Tipos de radiofármacos 
Primera generación 
Este tipo de radiofármacos simplemente marcaban compuestos químicos que pudieran 
ser captados en un órgano determinado sin un receptor específico, o se administraban 
radiopartículas que fueran captadas aprovechando procesos fisiológicos que se llevan a 
cabo en el cuerpo. 
Segunda generación 
Surgen como resultado del desarrollo de compuestos de coordinación bien 
caracterizados, donde un metal se une a un ligante en una geometría definida. La 
biodistribución de estos complejos era determinada por sus propiedades fisicoquímicas 
tales como carga, peso molecular, geometría espacial y lipofilia. Además emerge el 
concepto de agente quelante bifuncional (BFCA), los cuales son ligantes que además de 
quelar al metal también a través de otro grupo funcional puede unirse a una molécula con 
actividad biológica. 
Tercera generación 
Los radiofármacos diagnósticos de tercera generación se emplean en medicina nuclear 
para obtener imágenes de blancos moleculares específicos, son únicos en su capacidad 
para detectar in vivo sitios bioquímicos específicos tales como receptores y enzimas. Se 
componen de 3 partes: el metal, el agente quelante o ligante bifuncional y una molécula 
con actividad biológica, la cual puede ser una proteína, un fragmento proteico, un péptido, 
ADN, ARN u oligonucleótidos. (13) 
 
3.3. Radiomarcado 
El proceso de marcado de fármacos comenzó desde 1908 con el Dr. Paul Ehrlich, quien 
propuso que los agentes quimioterapéuticos podrían unirse covalentemente a ligantes 
como anticuerpos, los cuales tienen afinidad y especificidad para marcar tejidos que 
presentan tumores malignos. Por lo que varios investigadores han estudiado diferentes19 
 
ligantes y agentes quimioterapéuticos para el desarrollo de bioconjugados, dando inicio a 
los radiofármacos con el uso de isótopos radiactivos y diferentes moléculas que pueden 
ser conjugadas como anticuerpos, péptidos, entre otros. (9) 
Las estrategias disponibles de radiomarcado son: 
3.3.1. Marcado directo 
La unión de radionúclidos a través del marcado directo, solo es posible si los núclidos 
pueden someterse a sustituciones electrofílicas y nucleofílicas. Además, estos 
radionúclidos deben ser capaces de estar unidos con las proteínas en condiciones 
fisiológicas. 
Este método generalmente utiliza un agente reductor para convertir los enlaces disulfuro 
de una proteína en grupos tiol libres, los cuales son capaces de unir al radionúclido de 
manera eficiente a través de un enlace coordinado. Este método se lleva a cabo 
fácilmente, pero se aplica sólo a proteínas o sus fragmentos porque muchos péptidos 
pequeños no tienen enlaces disulfuro, o en algunos casos este es crítico para mantener 
las propiedades biológicas por lo que no puede ser reducido. 
La ventaja principal de este método es que puede producir formulaciones instantáneas, 
para facilitar su uso en la práctica clínica sin tener que realizar procesos de purificación in 
situ. (10,14) 
3.3.2. Marcado indirecto 
De forma general esta estrategia utiliza agentes quelantes bifuncionales que se conjuga 
con el péptido o anticuerpo monoclonal, permitiendo el marcado con un radionúclido. Los 
radionúclidos tienen que unirse al péptido o anticuerpo a través de grupos quelantes que 
poseen una adecuada estereoquímica para unir al radiometal a un grupo funcional de los 
aminoácidos del péptido o anticuerpo mediante un enlace covalente. Al igual que con 
grupos prostéticos, los quelantes tienen que exhibir una alta estabilidad in vivo a fin de 
garantizar la seguridad del paciente pero también obtener buenos resultados terapéuticos 
y de diagnóstico. 
A su vez este tipo de marcaje se puede realizar por pre-conjugación, y post-conjugación. 
Mientras que en la pre-conjugación se emplea un agente quelante bifuncional que forma 
un complejo con el radionúclido y después se conjuga con la biomolécula, en la post-
 
 
20 
 
conjugación, el agente quelante bifuncional se conjuga con la biomolécula, y 
posteriormente es radiomarcado el bioconjugado con el radionúclido. 
Por lo tanto la post-conjugación es el método más utilizado en el desarrollo de 
radiofármacos, ya que no hay pérdida en la actividad biológica de la biomolécula y 
además no requiere de purificación posterior del marcado. (10),(15), (16) 
3.3.3. Control de calidad para los radiofármacos 
Como los radiofármacos son destinados a la administración en humanos, resulta 
necesario que sean sometidos a un estricto control de calidad, que contemple varias 
pruebas específicas y medidas que aseguren la pureza, la potencia, la identidad y la 
eficiencia del radiofármaco. 
Las pruebas de control de calidad se clasifican en: (1) Pruebas biológicas, las cuales 
demuestran la esterilidad, apirogenicidad y la toxicidad del material; y (2) Pruebas 
fisicoquímicas, que aseguran el contenido y la potencia del radiofármaco.(2) 
La pruebas fisicoquímicas indican el nivel de radionúclido, impurezas radioquímicas, pH, 
fuerza ionica, la osmolaridad y el estado físico de la muestra particularmente si es un 
coloidea. 
Las pruebas fisicoquímicas de mayor interés para este trabajo son la determinación de la 
pureza radionucleídica y pureza radioquímica del radiofármaco. La pureza radioquímica 
es el porcentaje de la radiactividad total en la forma química deseada del radionúclido en 
la formulación. 
Las impurezas presentes en la muestra pueden ser causadas por descomposición del 
radiofármaco, por la temperatura, luz, radiólisis o el mismo radionúclido libre y/o 
conjugado con algún componente. 
La pureza radioquímica se determina mediante diversas técnicas, sin embargo las 
principales son la cromatografía en papel, la cromatografía en capa fina y la cromatografía 
de líquidos de alta eficiencia (HPLC). Aunque la técnica de HPLC es la más confiable, la 
técnica más empleada es la cromatografía en papel o capa fina en las instalaciones de 
radiofarmacia hospitalaria. 
Por su parte, la pureza radionucleídica, es el porcentaje de radiactividad total que existe 
en el radiofármaco. Las impurezas pueden ser formadas durante el proceso de 
 
 
21 
 
producción del radiofármaco, ya sea por impurezas presentes en los reactivos o por 
reacciones secundarias de éste, por subproductos de decaimiento o de elementos 
pesados de fisión en el reactor. 
En virtud de que los radionúclidos se diferencian por sus tiempos de vida media, tipo y 
energía de radiación, la pureza radionucleídica se determina por el análisis de una o más 
de estas características. La técnica más utilizada y confiable para su determinación es por 
espectrometría gamma. (2) 
 
3.4. Agente quelante bifuncional 
Como su nombre indica, estas moléculas se componen de dos grupos funcionales que 
sirven para diferentes propósitos; un grupo funcional para la unión a la biomolécula sin 
que se vea afectada su integridad y una parte quelante para la unión al radionúclido sin 
disociación in vivo. 
El uso de agentes bifuncionales ofrece una estrategia para la unión de radionúclidos a las 
macromoléculas. Los quelantes que pueden coordinar metales radiactivos con alta 
estabilidad en condiciones fisiológicas. (17) 
Hay varios requerimientos para considerar a un agente quelante bifuncional. La 
coordinación con el radionúclido debe ser fuerte y formar un complejo relativamente 
estable, que coincida con la naturaleza y estado de oxidación del radionúclido. También 
debe presentar tolerancia a la radiólisis, ya que una dosis alta de radiación debida a la 
presencia del radionúclido no unido a la molécula, puede producir radicales libres 
reactivos, los cuales ocasionan una descomposición considerable del quelato metálico 
durante la distribución del radioconjugado ocasionando que éste sea altamente tóxico. 
Por lo tanto, el agente quelante bifuncional debe formar un complejo con una alta 
estabilidad termodinámica, a pH neutro para mantener intacto el radionúclido bajo 
condiciones fisiológicas así como generar un quelato metálico con la menor cantidad de 
isómeros posibles. Además, el agente quelante bifuncional debe poseer una alta 
hidrofilicidad que ayude a una rápida depuración sanguínea y preferentemente excreción 
renal. (18) 
 
 
22 
 
Los ésteres activos, isotiocinatos, maleimidas, hidrazinas, alfa-haloamidas, entre otros 
son grupos funcionales que pueden estar presentes en un agente quelante bifuncional ya 
que ayudan a la unión covalente de este con la biomolécula. 
3.4.1. HYNIC 
El ácido 6-hidrazinilpiridin-3-carboxílico (HYNIC) (Figura 1) es un eficiente agente 
quelante bifuncional para 99mTc, usado en el marcado de biomoléculas para imagen 
molecular. Su popularidad como agente bifuncional además de permitir el radiomarcado 
con 99mTc a menudo no requiere purificación, incluso cuando se emplean bajas 
concentraciones de la biomolécula para proveer una alta actividad específica.(19) 
N
O OH
NH
NH2 
Figura 1.Estructura del ácido 6-hidrazinilpiridin-3-carboxílico (HYNIC) 
El HYNIC se liga comúnmente a biomoléculas a través de un enlace amida formado por 
la reacción de las cadenas laterales de la amina en la biomolécula con un derivado de 
éster activo de HYNIC, tales como el éster N-hidroxissuccinimida. (20) 
Debido a que el HYNIC solo puede coordinar a un metal a través de 2 grupos donantes (el 
nitrógeno de la piridina y el nitrógeno de la hidrazina) no es capaz de saturar la esfera de 
coordinación octaédrica de 99mTc, por lo tanto, la esfera de coordinación tiene que ser 
completada mediante la adición de coligandos. Algunos de los coligandos comúnmente 
usados se encuentran el ácido etilendiaminodiacético(EDDA), tricina (C6H13NO5), manitol, 
ácido nicotínico, entre otros. (Figura 2) 
 
 
23 
 
NH
NH
O
OH
O
OH O
OH
NH
OH
OH
OH 
Figura 2. Estructura de coligandos EDDA y Tricina 
De los coligandos mencionados, ninguno es ideal. Por ejemplo, la tricina es 
particularmente favorable para la reducción inicial y la formación de complejos de 99mTc, 
pero da lugar a múltiples especies marcadas de estabilidad relativamente baja. Por otro 
lado, el EDDA produce complejos más estables con menos isómeros, pero es menos 
eficiente durante la formación del complejo marcado. Por lo tanto, la elección de estos 
coligandos tiene gran importancia en la cinética y eficacia de la reacción de marcado así 
como para su comportamiento in vivo del producto marcado.(21) 
Diversos autores han reportado que la pureza radioquímica de diferentes radiofármacos 
con 99mTc presenta mejores resultados con el uso combinado de los coligantes 
EDDA/Tricina en comparación con la combinación ácido nicotínico (NA)/Tricina; tal 
resultado se debe a un mayor número de grupos amino que intervienen en la reacción, lo 
que se traduce en mayor rendimiento en la formación del conjugado.(22) 
3.4.2. DOTA 
El agente quelante DOTA (Ácido 1, 4, 7, 10-Tetraazaciclododecano - N, N´, N´´, N´´´-
tretraacético) (Figura 3) es un macrociclo que surgió a partir de 1967, cuando Pederson 
dio a conocer la química de los éteres corona. 
 
 
24 
 
 
Figura 3. Estructura del ácido 1,4, 7,10-Tetraazaciclododecano-N, N´, N´´, N´´´-tretraacético (DOTA) 
Un macrociclo se define como un compuesto cíclico con nueve o más miembros, y con 
tres o más donadores de electrones (enlazantes). Los agentes quelantes macrocíclicos 
son lentos para adoptar la conformación de menor energía necesaria para la quelación de 
lantánidos y esto se refleja en el tiempo tan largo que se necesita para llevar a cabo la 
máxima eficiencia en la reacción. En contraste con los quelantes acíclicos que no poseen 
una conformación forzada para quelar a los lantánidos. A temperatura ambiente, el 
rendimiento de radiomarcado del conjugado DOTA-Biomolécula es muy bajo. Por lo tanto, 
se necesita calentamiento a temperaturas elevadas (> 50 ° C) para el radiomarcado con 
éxito. 
Debido a la estructura de anillo rígido el macrociclo DOTA junto con sus derivados son 
una buena alternativa de uso, sus complejos radiometálicos no muestran una liberación 
del radionúclido bajo condiciones fisiológicas, como lo hace el pentaacetato de 
dietilentriamina (DTPA). Además el DOTA forma complejos estables con una variedad de 
radionúclidos trivalentes tales como 68Ga, 90Y, 177Lu y radionúclidos divalentes como 67Cu 
o 47Ca. (23) 
En general, hay 3 enfoques posibles de conjugación de DOTA con biomoléculas. En el 
primer enfoque la unión ocurre en uno de los átomos de carbono de la cadena principal 
del macrociclo. Esto dará lugar a la formación de los ocho posibles isómeros cuando se 
coordina al metal lantánido. En el segundo enfoque, el enlazador está unido a uno de los 
cuatro grupos acetato quelantes que, de igual manera puede resultar en la formación de 
los ocho posibles isómeros cuando el metal está unido al centro. En ambos casos, la 
conjugación de la biomolécula no conduce a un cambio significativo en la estabilidad y 
 
 
25 
 
Figura 4. Enfoques de conjugación de DOTA con una biomolécula 
cinética del complejo. En el tercer enfoque, la biomolécula se conjuga con uno de los 
cuatro grupos acetato a través de un enlace amida.(15) (Figura 4) 
 
 
 
 
 
 
 
 
3.5. Lutecio 
El lutecio Lu es el último miembro de la serie de los lantánidos, con 71 electrones 
dispuestos en la configuración [Xe] 4f 14 5d 1 6s 2. Es un metal pesado, de color blanco 
plateado, de relativa estabilidad en el aire. El átomo de Lu es el más pequeño de los 
lantánidos, debido a la contracción lantánida la cual explica varias de sus propiedades 
incluyendo, su dureza metálica más alta y densidad. En su estado de oxidación más 
común y estable (3+), presenta orbitales s, p y d vacíos y una capa cerrada de orbitales f. 
Los electrones en el orbital f no son capaces de formar enlaces, ya que se encuentran 
fuertemente unidos debido a la alta carga nuclear efectiva, por lo tanto el Lu3+ se 
comporta como un ácido de Lewis. Debido a que el orbital f está completamente lleno, el 
radio iónico de Lu3+ es el más pequeño entre los lantánidos y, como consecuencia, el 
número de ligandos alrededor de Lu3+ son limitados. El Lu tiene un número de 
coordinación de 6, 7, 8 y 9., el número de coordinación es dictado principalmente por las 
repulsiones recíprocas entre los diversos ligandos sin influencia relevante atribuida a los 
orbitales involucrados en la formación de enlaces (s, p y d). El Lu comúnmente presenta 
un número de coordinación de 6 y una estructura hexaédrica, que es su forma más 
estable.(24),(25) 
Unión C-C a través del 
macrociclo 
Unión C-C a través del 
grupo acetato del 
macrociclo 
Enlace amida C-H a 
través del grupo 
acetato del macrociclo 
 
 
26 
 
3.5.1. Química de coordinación de Lu 
Dado que el estado de oxidación más estable de Lu es 3+, la química de tales cationes 
trivalentes, dura en solución, se caracterizan por la fuerte tendencia a formar complejos 
con átomos donadores duros como O, F y N. El número de coordinación es generalmente 
8 o 9, y los complejos resultantes son termodinámicamente muy estables con los dos 
ligandos de tipo poliaminopolicarboxilatos acíclicos y cíclicos que tienen 8 o 9 átomos 
donantes. Entre estos ligandos, el macrociclo DOTA (ácido 1, 4, 7, 10 – tetraaza 
ciclododecano- N, N´, N´´, N´´´- tetraacético) forma complejos con Lu con alta estabilidad 
termodinámica e inercia cinética. Los complejos DOTA son, en general, cinéticamente 
más inertes que los complejos con DTPA (ácido dietilentriaminopentaacético). La 
estructura molecular del Lu con ligandos macrocíclicos se espera que siga el 
comportamiento general de los lantánidos. Los complejos DOTA reportados de 
Lu 3+ muestran una geometría antiprisma. (26) 
3.5.2. Lutecio-177 
Existen más de 50 radionúclidos de Lu que incluyen 23 isómeros nucleares que varían en 
número de masa de 150 a 184. Entre ellos, el radionúclido 177Lu decae por emisión β- 
(12% 0.176MeV, 9% 0.384MeV, y 79% 0.497MeV, máxima) y emisión γ (6,4% 113 keV y 
11% 208 keV), presenta un grado de penetración en tejido blando de varios milímetros y 
un tiempo de vida media de 6.65 días.(27) 
El interés en 177Lu como radionúclido terapéutico se atribuye a sus características 
nucleares y químicas favorables, que conduce a productos estables con buenas 
características in vivo. Sin embargo, el factor más importante que contribuye al creciente 
interés y el uso de 177 Lu en la medicina nuclear es su facilidad de producción en altos 
niveles de actividad con alta actividad específica en muchos reactores nucleares 
existentes en todo el mundo.(26) 
3.5.3. Producción de 177Lu 
Un método de producción de 177Lu implica la irradiación con neutrones del blanco Iterbio 
isotópicamente enriquecido de 176Yb. 
𝑌𝑏176
(𝑛,𝛾)
→ 𝐿𝑢177 + 𝛽− 
 
 
27 
 
La principal ventaja de esta ruta es que proporciona 177Lu libre del radionúclido 177mLu de 
vida media de 160.44 días como impureza. Sin embargo, esta ruta de producción 
presenta bajos rendimientos. 
De forma alterativa, el 177Lu se puede obtener a través de la irradiación con neutrones del 
blanco natural de Lu2O3 enriquecido de 
176Lu en un reactor nuclear. 
𝐿𝑢176
(𝑛,𝛾)
→ 𝐿𝑢177 
Mediante este método, el 177Lu se puede preparar con alto rendimiento y alta actividad 
específica (> 10 veces respecto a la ruta anterior) a bajo costo lo que favorece la 
viabilidad comercial de este método. Además no requiere procesamiento posterior o 
purificación, resolviendo así el problema de la gestión de residuos radiactivos.(26),(27) 
3.5.4. Aplicaciones de 177Lu 
El 177Lu es utilizadoen radioinmunoterapia cuando es acoplado/quelado a un anticuerpo 
asociado al tumor. La vida media del 177Lu es suficiente para poder marcar biomoléculas y 
permite la distribución en lugares distintos del lugar de preparación del radiofármaco. 
Además tiene las características químicas apropiadas para el marcado de proteínas y 
péptidos con agentes quelantes bifuncionales como DTPA, y sus derivados, o DOTA por 
lo que es utilizado como Lu3+. 
Las principales aplicaciones de 177Lu actualmente incluyen el tratamiento de los tumores 
neuroendocrinos, especialmente para la paliación del dolor óseo de cáncer metastásico, 
la sinvectomía radiactiva, el linfoma no-Hodgkin, y el tratamiento de cáncer de ovario e 
hígado. (28) 
 
3.6. Tecnecio 
El Tecnecio fue descubierto en 1973 por Perrier y Segré en Italia.(29) Su abundancia en la 
tierra es mínima, no se encuentra en el cuerpo humano además no tiene un rol biológico 
específico. (30) 
El Tecnecio-99m (99mTc) es el radionúclido más utilizado en la práctica diagnóstica en 
medicina nuclear. La razón de su uso prominente son sus favorables propiedades físicas, 
químicas y nucleares. Su corto tiempo de vida media de 6.02 h hace que sea óptimo para 
 
 
28 
 
la preparación de radiofármacos, realizar control de calidad y administración en pacientes 
para analizar su acumulación in vivo en el tejido blanco, la ausencia de daño en el tejido 
permite la administración de actividades mayores a 1,110 MBq sin producir dosis de 
radiación significativa al paciente. Además los fotones monoenergéticos de 140 keV son 
fácilmente detectables por los detectores externos que a su vez proporcionan imágenes 
con una alta resolución (fácil colimación). Por otra parte 99mTc es de fácil disponibilidad, se 
puede obtener de manera estéril, libre de pirógenos y como vehículo libre. (9),(17) 
3.6.1. Generador de 99Mo / 99mTc 
Los 4 métodos comúnmente usados para la separación de 99mTc del 99Mo son: (1) la 
cromatografía en columna sobre alúmina ácida, (2) extracción de 99mTc con disolventes 
como metiletilcetona, (3) sublimación de óxidos de 99mTc a partir de compuestos de Mo y 
(4) elución de 99mTc de columnas de gel de molibdato de circonio (99Mo). Sin embargo, el 
generador más comúnmente usado y disponible comercialmente se basa en el sistema de 
alúmina.(30) 
El generador consta básicamente de un cilindro de vidrio en el que, además de otros 
materiales porosos, está contenida una columna de alúmina en la que se encuentra 
absorbido el núclido “padre” (99Mo, de 67 h de vida media). Por el interior del cilindro se 
hace circular una solución estéril y apirógena de NaCl al 0.9 % en agua, que extrae por 
elución al radionúclido “hijo” en forma de pertecnetato (99mTcO4
-).(31) 
El núcleo padre procedente de un reactor de fisión nuclear, se desintegra con emisión 
beta negativa dando lugar a la aparición de 99Tc (14 %) y de 99mTc (86 %). Mediante 
transición isomérica, el último se transforma, con un periodo de 6.02 h en 99mTc. En el 
proceso de transición isomérica del 99mTc, emite radiación gamma característica. 
3.6.2. Química del Tecnecio 
El 99mTc es un metal de transición obtenido por la desintegración radiactiva de Molibdeno-
99 (99Mo). Es de color gris plata y pertenece al grupo VIIB de la tabla periódica. Su 
número atómico es 43 y puede existir en 8 estados de oxidación (-1 a 7+) que resulta de 
la pérdida de un número dado de electrones desde los orbitales 4d y 5s o ganancia de un 
electrón en el orbital 4d. 
El estado de oxidación más alto (7+) de 99mTc tiene poca reactividad, dicho estado de 
oxidación es ocupado por el anión pertecnetato (TcO4
-). Por lo tanto, para la producción 
 
 
29 
 
de biomoléculas marcadas con 99mTc, la reducción al estado de oxidación inferior es 
necesario. Entonces, se requiere de un agente reductor adecuado para la estabilización 
del estado de oxidación más bajo. 
El agente comúnmente utilizado para reducir al 99mTc es el cloruro estanoso (SnCl22H2O) 
con la ganancia de 2 electrones (Tc 7+ a Tc 5+), además presenta baja toxicidad y alto 
rendimiento de radiomarcado. 
 2 99mTcO-4 + 16H+ + 3Sn2+ → 2 99mTc+4 + 3Sn4+ + 8 H2O 
El 99mTc reducido es químicamente reactivo y se combina con una amplia variedad de 
agentes quelantes. Los grupos químicos tales como –COOH, -OH, -NH2 o -SH en los 
compuestos como DTPA, diversas proteínas y otras biomoléculas, donan un par de 
electrones solitarios y forman un enlace covalente de coordinación con el 99mTc reducido. 
(29), (32) 
Existen muchos factores que influyen en el estado de oxidación resultante del Tc, entre 
ellos se encuentra la naturaleza del reductor, las propiedades químicas de coordinación 
del ligando, el pH y la temperatura. Todas las reducciones se llevan a cabo en presencia 
de un ligando ya que puede estabilizar la valencia del 99mTc y minimizar o prevenir las 
subsiguientes reacciones de hidrólisis y oxidación. 
 
3.7. Cromatografía 
La cromatografía es un método utilizado para la separación de los componentes de una 
mezcla, basada en la velocidad de desplazamiento diferencial al ser arrastrados por una 
fase móvil a través de una columna que contiene la fase estacionaria. (33) 
3.7.1. HPLC 
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés) es una 
técnica analítica de separación de componentes no volátiles o térmicamente inestables, 
los cuales son disueltos en un disolvente adecuado y son forzados por medio de altas 
presiones a pasar a través de una columna, consiguiendo así separaciones de gran 
resolución. 
 
 
30 
 
El HPLC puede ser, y ha sido aplicado a casi cualquier muestra, tales como productos 
farmacéuticos, alimentos nutracéuticos, cosméticos, matrices ambientales, muestras 
forenses, y productos químicos industriales. 
3.7.1.1. Técnicas de separación en Cromatografía líquida 
Existen varias técnicas de separación en cromatografía líquida, basados en el tipo de 
equilibrio involucrado, mismo que se determina por el tipo de fase estacionaria utilizado. 
Así la cromatografía puede ser de adsorción, intercambio iónico, exclusión molecular y 
afinidad. 
 Adsorción. En este tipo de cromatografía los componentes se distribuyen entre 
la fase móvil (líquido o gas) y la fase estacionaria (sólido) a través de la 
combinación de los procesos de adsorción y desorción. Este tipo de 
cromatografía puede ser: 
a. Fase normal, es un procedimiento de elución en el que la fase 
estacionaria tiene una polaridad mayor que la fase móvil (no polar) 
b. Fase reversa, procedimiento inverso de elución en fase Normal, en el 
cual la fase móvil es significativamente más polar que la fase 
estacionaria. 
 Intercambio iónico, llevado a cabo a través de materiales de resinas que 
poseen grupos funcionales con carga eléctrica, por lo que la separación ocurre 
 Exclusión molecular, la separación se realiza de acuerdo al tamaño efectivo de 
las moléculas en solución, empleando una columna empacada con partículas 
con poros de un tamaño promedio. 
 Afinidad, este tipo de cromatografía utiliza interacciones altamente especificas 
entre las moléculas de soluto y una molécula unida covalentemente a la fase 
estacionaria. (33),(34) 
 
3.8. Enzima Glutamato carboxipeptidasa II 
La enzima Glutamato carboxipeptidasa II (GCPII) fue originalmente identificada por el 
anticuerpo monoclonal 7E11 (Mab) derivado de la inmunización con una preparación de 
membrana parcialmente purificada de la línea celular de adenocarcinoma de próstata en 
 
 
31 
 
ganglio linfático (LNCaP). Un fragmento de ADNc de 2.65 kb que codifica la proteína 
GCPII se clonó, mapeó y, posteriormente, se asignó al cromosoma 11p11.2. (35), (36) 
El gen de GCPII se compone de 19 exones que abarcan ~ 60 kb de ADN genómico. Este 
gen codifica para una proteína transmembrana tipo II con un peso molecular aproximado 
de 90 a 100 kDa, una cola citoplásmica cortaNH2-terminal (19 aminoácidos), un único 
dominio transmembrana hidrófobo (24 aminoácidos), y un gran dominio extracelular (707 
aminoácidos) en el extremo -COOH. El dominio extracelular incluye los aminoácidos de 
44 a 150 (dominio C), 151-274 (domino D), 275-586 (dominio E) y 587-70 (domino F). 
Mientras que el dominio E se cree que es el dominio catalítico de la enzima, la 
importancia y/o función de los tres dominios restantes se desconoce. Los tres dominios de 
GCPII contribuyen a la formación de la cavidad de unión al sustrato, que consiste en el 
sitio S1 y el sitio activo S1´.(3),(4) (Figura. 6) 
 
Figura 5. Diagrama de la estructura de GCPII. GCPII es una proteína transmembrana tipo II con un dominio 
citoplasmático (CD), una región hidrofóbica transmembrana (TM), y un dominio extracelular (ED).
(36)
 
 
El dominio extracelular de GCPII está glicosilado y representa hasta un 25% del peso 
molecular de la proteína nativa. Regiones dentro de esta parte del dominio presentan 
modestos grados de homología con el receptor de transferrina (TfR) y con los miembros 
de la familia M28 de aminopeptidasas co-catalíticas. Aunque el TfR sólo tiene un sitio 
 
 
32 
 
catalítico vestigial, GCPII es conocida por poseer un papel importante en la progresión y 
la carcinogénesis de la próstata, la neurotransmisión glutamatérgica, y la absorción de 
folato. Cada una de estas diferentes áreas de actividad de investigación conduce a 
diferentes nombres que se dan a GCPII. Debido a su fuerte expresión en la próstata 
(donde su función es desconocida), se nombra como Antigeno Prostático Específico de 
Membrana (PSMA); en el sistema nervioso central, donde se metaboliza el 
neurotransmisor cerebral, N-acetil-aspartil-glutamato (NAAG), se nombra NAALADasa; en 
el intestino delgado proximal su función es la eliminación de glutamatos unidos a gamma 
de folato poli-γ-glutamato, como folato hidrolasa FOLH1, y como una carboxipeptidasa, 
Glutamato carboxipeptidasa II (GCPII).(37) 
En contraste con el dominio extracelular grande, la cola citoplasmática de GCPII se 
compone de sólo 19 aminoácidos. A pesar de su pequeño tamaño, el dominio 
citoplasmático interacciona con numerosas proteínas y tiene un impacto importante en las 
propiedades de localización y moleculares de GCPII. 
3.8.1. Estructura 
La estructura general de GCPII consta de 5946 átomos, de los cuales 686 son residuos 
de aminoácido, 561 átomos de agua, un ion de Ca2+, uno de Cl- y dos de Zn2+. (3) 
Los estudios estructurales reportados establecen que el sitio de unión a GCPII contiene 
dos iones Zn2+ y 2 sitios de unión al sustrato, es decir, un sitio S1 (no farmacofórico) y un 
sitio S1´ (farmacofórico). El sitio activo también contiene en el espacio S1 un ion cloruro 
(Cl-). En las proximidades del espacio S1 reside un túnel en forma de embudo con una 
profundidad de 20 Å aproximadamente y un ancho de 8-9 Å. Del mismo modo, una 
cavidad estrecha está presente cerca del espacio S1´. Por otra parte, ha sido determinado 
que el resto de glutamato de los inhibidores tiene una predisposición para orientarse 
dentro del estrecho espacio S1´ (Ki= 0.46 µM), mientras que el resto de la molécula reside 
en el espacio grande S1.(38) 
La característica más prominente del sitio S1 en GCPII es el "parche de arginina", que 
comprende las argininas 463, 534, y 536, que se asocian con la enzima preferentemente 
con los residuos del ligando P1 cargados negativamente. En comparación con el sitio S1', 
el sitio S1 es más flexible en términos de modificaciones estructurales de los inhibidores 
de GCPII. 
 
 
33 
 
3.8.1.1. Sitio activo 
Los dos iones zinc de GCPII del sitio activo interaccionan con el β-carboxilato de Asp387, 
además se coordina con las cadenas laterales de His377, Asp453, Glu425 e His553; una 
molécula de agua activada (u OH-) se sitúa simétricamente entre los dos átomos de Zn2+ a 
una distancia de 2.03 y 2.01 Å. Esta molécula de agua desempeña un papel central en la 
hidrólisis de un sustrato y es el residuo de Glu424 que funciona como un transportador de 
protones (H+) durante la escisión del enlace. (3),(39) (Figura 6) 
 
Figura 6.Representación del sitio catalítico de GCPII unido a NAAG.(39) 
 
3.8.1.2. Sitio S1´ 
El sitio S1´de GCPII está definido por los residuos de Phe209, Arg210, Asn257, Gly427, 
Leu428, Gly518, Lys699 y Tyr700. Los residuos de Lys699 y Tyr700 son parte del 
“sensor de glutarato”, sitio responsable del reconocimiento del residuo de glutamato 
presente tanto en un sustrato como en un inhibidor de GCPII. Por otro lado, seis 
moléculas de agua se encuentran presentes en este sitio, donde la sexta molécula de 
 
 
34 
 
agua forma puentes de hidrógeno con los residuos de Tyr552 e His553 y, coordina el 
Zn2+. 
3.8.1.3. Sitio S1 
El sitio S1 es definido por los residuos de Ser454, Glu457, Asp465, Asn519, Gly548, 
Tyr549 y Tyr552 así como del “parche de Argininas”. El parche de argininas (cargado 
positivamente) es responsable de la preferencia de la enzima por residuos de carga 
negativa del resto de la molécula (posición P1). Las posiciones invariables de los grupos 
guanidinio en Arg534 y Arg463 son mantenidos por la interacción con el ion Cl - y un 
enlace de hidrógeno con el γ-carboxilato del residuo de Glu457. Por su parte la Arg536 
adopta dos conformaciones. En la conformación más abundante, el grupo guanidino de 
Arg536 forma dos enlaces de hidrogeno con Ser454. Por lo tanto, el ion Cl- estabiliza las 
posiciones de Arg53 y Arg536 y neutraliza de la carga positiva de sus grupos guanidino. 
(3),(39) 
En la vecindad del sitio S1, hay un segmento altamente flexible llamado “tapa de entrada” 
formado por los residuos Trp514 a Gly548. En su conformación cerrada, la tapa de 
entrada protege completamente el sitio de unión al sustrato de otras moléculas; y cuando 
la tapa de entrada está en su conformación abierta inhibidores más grandes pueden 
unirse. (40) 
3.8.2. Expresión 
La expresión de GCPII en tejidos de diferentes especies se examina por ensayos 
enzimáticos y actividad inmunológica. GCPII es expresado en células epiteliales de 
próstata y sobre-expresada en el 95% de los cánceres de próstata avanzados. La 
expresión de esta enzima se correlaciona con la invasión metastásica, andrógeno 
independencia y la progresión del cáncer de próstata.(41) (42) 
Algunos informes indican también la expresión limitada de GCPII en tejidos extra-
prostáticos, incluyendo los riñones, intestino delgado, sistema nervioso central y 
periférico, también se ha reportado en otros tejidos incluyendo los testículos, los ovarios y 
las glándulas salivales. Sin embargo, los niveles de GCPII en estos tejidos son por lo 
general de dos a tres órdenes de magnitud menor que los observados en la 
próstata.(43),(44) 
 
 
35 
 
Dentro del tejido nervioso, la enzima se expresa en astrocitos (SNC) y las células de 
Shwann (SNP).(45),(46) La distribución de GCPII parece correlacionar con la distribución de 
NAAG, que sirve como neurotransmisor del receptor NMDA y mGluR3 así como forma de 
almacenamiento de glutamato. Por lo tanto, la regulación de la actividad de GCPII 
determina el efecto, excitador o inhibidor, que predomina en el sistema neuronal. Las 
perturbaciones en la actividad de GCPII se observan en los trastornos neurológicos y 
psiquiátricos que implican la desregulación en la neurotransmisión glutamatérgica. (47),(48) 
En el intestino delgado, GCPII se localiza en la membrana del borde en cepillo donde se 
cree que su sustrato primario son los poliglutamil folatos de la dieta, que se escinden por 
GCPII a la forma monoglutamil antes del transporte intestinal. El metabolismo del folato, 
es la principal fuente de varios metabolitos esenciales para la síntesis, reparación y 
metilación del ADN, también podría desempeñar un papel importante en la modulación de 
la susceptibilidad al cáncer. (49) En el riñón, GCPII existe en lacorteza de los túbulos 
contorneados proximales. Esta zona del riñón se cree que está involucrada en el 
procesamiento de péptidos y proteínas para la reabsorción selectiva. Sin embargo, los 
sustratos y la función GCPII en el riñón no es entendida en su totalidad. (50),(51) 
En la próstata, GCPII/PSMA se expresa en células epiteliales prostáticas benignas y 
cancerosas. Se regula positivamente en la enfermedad avanzada, andrógeno 
dependencia y después de la terapia con andrógenos.(5) Además se encuentra expresada 
en el endotelio de la mayoría de los tumores sólidos diferentes al de próstata, pero no en 
el endotelio normal. Aunque el significado de la expresión de GCPII dentro del endotelio 
es desconocido, la especificidad para el endotelio asociado al tumor hace de GCPII un 
blanco potencial interesante para el tratamiento de muchas formas de cáncer. (52),(6) 
3.8.3. Inhibidores de GCPII 
Durante las dos últimas décadas, se ha descrito en la literatura un gran número de 
ligandos selectivos de GCPII marcados con radionúclidos de diferentes tipos y 
propiedades.(27),(53–55) Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal Prostascint ® radiomarcado 
con Iridio-111 (111I), aprobado en 1997 por la FDA (Food and Drug Administration) como 
un agente diagnóstico de imagen. Sin embargo, el desarrollo de anticuerpos 
monoclonales, que se unen de manera específica al dominio extracelular de GCPII, 
presentan varias limitaciones, incluyendo su largo tiempo de vida media en plasma, baja 
permeabilidad al tumor limitando su uso clínico como herramienta de diagnóstico. (56),(57) 
 
 
36 
 
 Los compuestos de molécula pequeña (< 2000 Da) representan actualmente una 
alternativa atractiva a los anticuerpos debido a su afinidad y mejores características 
farmacocinéticas, principalmente rápida depuración de la sangre que resulta en la 
reducción de la actividad de fondo. (58),(59) 
Casi todos los ligandos de GCPII se derivan originalmente del péptido NAAG y tienen una 
estructura general que consiste en un grupo de unión a zinc (ZBG), un linker (L, L'), y un 
resto que contiene un ácido carboxílico diseñado para interactuar con S1', el sitio de 
reconocimiento de glutamato (Figura 7). Algunas series también se extienden al sitio S1 
mediante la adición de otro grupo carboxilato y un resto lipofílico (R) colocado en la 
sección hidrófoba del sitio S1. La inclusión de estas funcionalidades ha dado lugar a 
inhibidores muy potentes de GCPII. (60),(61) 
 
Figura 7. Diseño de inhibidores de GCPII basados en NAAG. Muchos de los inhibidores son basados en la 
estructura de NAAG.
(61)
 
Los inhibidores de GPCII son categorizados de acuerdo con la naturaleza del grupo de 
unión a zinc. Los grupos de unión a zinc más explorados en el diseño de inhibidores de 
GCPII incluyen: (1) inhibidores basados en fosfato, fosfonatos y fosforamidas (por 
ejemplo, 2-PMPA); (2) inhibidores basados en tiol (por ejemplo, 2-MPPA); y (3) inhibidores 
basados en urea (por ejemplo, ZJ43). (60) (Figura 8) 
3.8.3.1. Inhibidores basados en fosforo 
Durante mucho tiempo los compuestos que contienen fosforo tetraédrico se han utilizado 
como imitadores del estado de transición del sitio de escisión del enlace peptídico. Este 
enfoque se ha aplicado con éxito en inhibidores de peptidasas de Zinc incluyendo la 
enzima convertidora de angiotensina (ECA). Desde que GCPII fue clasificada como 
metalopeptidasa de Zinc, una variedad de compuestos a base de fosforo se han evaluado 
como inhibidores de esta enzima.(62) 
 
 
37 
 
La historia de los inhibidores de GCPII se remonta a 1996 con el descubrimiento histórico 
de un potente inhibidor de GCPII basado en el grupo fosfonato (C-PO (OH)2), el ácido 2-
(fosfonometil) pentanodioico (2- PMPA), diseñado y sintetizado por Jackson et al.. A pesar 
de su bajo peso molecular, 2-PMPA es un potente inhibidor de GCPII con un valor de Ki 
de 0.2 nM. (63),(64) 
Posteriormente, extensos estudios de relación estructura-actividad (SAR) se realizaron 
utilizando 2-PMPA como plantilla, y un par de potentes inhibidores de GCPII, como el 
compuesto a base del grupo fosfinato GPI5232, VA-033, y el fenilalquil fosforamidato, 
fueron identificados. No obstante, estos inhibidores muestran menor potencia inhibitoria 
en pruebas in vitro que 2-PMPA. 
Estudios sobre los dos enantiómeros de 2-PMPA demuestran que la potente inhibición de 
GCPII es específico de (S) -2-PMPA, que tiene una configuración absoluta 
correspondiente a L–glutamato. Por lo que la alta potencia de 2-PMPA se puede atribuir a 
la fuerte coordinación del grupo fosfonato a los iones zinc del sitio activo, así como a la 
interacción de la porción glutarato (ácido pentanodioico) del inhibidor con el sitio de 
reconocimiento C-terminal de glutamato de GCPII (sitio S1´). (65) 
A medida que la primera generación de inhibidores de GCPII, los inhibidores a base de 
fósforo jugaron un papel fundamental en los primeros esfuerzos por comprender las 
funciones fisiológicas de GCPII, así como los posibles efectos terapéuticos de su 
inhibición. Sin embargo, la alta polaridad, el bajo perfil farmacocinético de las moléculas 
que contienen fósforo tetraédrico y especialmente su falta de biodisponibilidad oral, limita 
su aplicación clínica. (61), (63), (66) 
3.8.3.2. Inhibidores basados en grupo tiol 
Desde el descubrimiento del captopril, un inhibidor a base del grupo tiol (-SH) de la 
enzima convertidora de angiotensina (ECA), el grupo sulfhidrilo es aplicado a una 
variedad de inhibidores de peptidasas de Zinc. Con su valor pKa en un rango de 8 a 9, el 
grupo tiol es uno de los grupos de unión menos polar a zinc a pH fisiológico al formar una 
fuerte interacción con el átomo de zinc del sitio activo cuando se incorpora en la ubicación 
apropiada. Además, muchos inhibidores de metaloproteasas basados en el grupo tiol 
presentan perfiles farmacocinéticos superiores respecto a los que contienen otros grupos 
de unión a zinc. (61) 
 
 
38 
 
En la búsqueda de inhibidores de GCPII activos por vía oral, una serie de ácidos 2-
(tioalquilo) pentanodioicos fueron sintetizados y evaluados por un grupo en Guilford 
Pharmaceuticals. Se encontró que la potencia inhibidora de estos compuestos basados 
en el grupo tiol dirigidos a GCPII es dependiente del número de unidades de metileno 
entre el grupo tiol y el ácido pentanodioico. (61),(67) 
2-PMPA y análogos 
2-PMPA (GP15000)
IC50= 0.3 nM
HOOC
P
COOH
OH
COOHO
IC50= 1 nM
OH
P
COOH
O
OH
COOH
R
N P
COOH
COOHO
OH
H
R= H, IC50= 4 nM
R= OMe, IC50= 3 nM
F
F F
F
F
P
COOH
COOH
OH
O
GP15232
IC50= 82 nM
O
P
COOH
COOHO
OH
VA-033
IC50= 12.5 nM
Derivados de tiol e indol 
SH
COOH
COOH
2-MPPA (GP15693)
IC50= 82 nM
R= H, IC50= 18.5 nM
R= OMe, IC50= 12 nM
N
SH
COOH
R
Diseño radional de inhibidores GCPII basado en urea 
AcHN
N COOH
O
H
COOH
COOH
Remplazo NH
por CH2 y eliminación 
de AcNH
N COOH
COOH
H
O
COOH
Adición (CH2)2CO2H
Remplazo C(O)
por P(O)OH
HOOC
P
COOH
COOHCOOH
O
OH
HOOC COOH
COOHCOOH
O
PBDA
IC50= 21.7 nM
Remplazo C(O)
por P(O)OH
HOOC N N COOH
COOHCOOH
H HH
O
H
(s)-Glu-C(O)-(S)-Glu
Ki= 8.0 nM
SAR
HOOC N N COOH
COOH
H HH
O
H
ZJ43
Ki= 0.8 nM
HOOC N N COOH
COOHS
H HH
O
H
CH3
ZJ11
Ki= 1.4 nM
HOOC N N COOH
COOH
H HH
O
H
OH
ZJ17
Ki= 3.0 nM
ZJ38
Ki= 0.9 nM
HOOC N N COOH
COOH
H HH
O
H
NH N
N N
CMBA
IC50= 15 nM IC50= 6 µM
SH COOH
COOH
COOH
COOH
SH
 
Figura 8. Ejemplos representativos de los tres grupos de inhibidores.
(62) 
 
 
 
39 
 
Como uno de los inhibidores de la GCPII de segunda generación, el basado en el grupo 
tiol 2-MPPA (también conocido como GPI5693) fue el primer inhibidor de GCPII reportado 
con biodisponibilidad por vía oral pero con una estabilidad química débil. 
En contraste con los inhibidores a base de fosforo los enantiómeros equipotentes de 2-
MPPA mostraron una eficacia comparable, por lo que la falta deenantioespecificidad se 
puede atribuir al menos de manera parcial a la cadena alquilo del linker, que consta de 3 
unidades de metileno entre el grupo tiol y el carbono quiral. Independientemente de su 
configuración absoluta, el linker flexible podría permitir al grupo tiol obtener el mismo 
grado de interacción con un átomo de zinc del sitio activo, mientras que su grupo glutarato 
interactúa de manera óptima con el sitio de reconocimiento de glutamato de la enzima, lo 
que resulta en una potente inhibición por los dos enantiómeros.(61), (67) 
Como uno de los inhibidores de la GCPII de segunda generación, el basado en el grupo 
tiol 2-MPPA (también conocido como GPI5693) fue el primer inhibidor de GCPII reportado 
con biodisponibilidad por vía oral pero con una estabilidad química débil. En contraste con 
los inhibidores a base de fosforo los enantiómeros equipotentes de 2-MPPA mostraron 
una eficacia comparable, por lo que la falta de enantioespecificidad se puede atribuir al 
menos de manera parcial a la cadena alquilo del linker, que consta de 3 unidades de 
metileno entre el grupo tiol y el carbono quiral. Independientemente de su configuración 
absoluta, el linker flexible podría permitir al grupo tiol obtener el mismo grado de 
interacción con un átomo de zinc del sitio activo, mientras que su grupo glutarato 
interactúa de manera óptima con el sitio de reconocimiento de glutamato de la enzima, lo 
que resulta en una potente inhibición por los dos enantiómeros.(61), (67) 
La mayor lipofilicidad y disminución del número de enlaces rotables hace de algunos 
inhibidores de GCPII basados en tioles, únicos con una biodisponibilidad oral adecuada. 
Además, la GCPII parece más tolerante a los grupos estructuralmente diversos que 
presentan los compuestos basados en tiol. Por ejemplo la introducción de cierta rigidez en 
la estructura de 2-MPPA como, isósteros cíclicos, para conseguir mejoras en la energía de 
Gibbs y en la lipofilia se desarrolló una serie de análogos que contienen un grupo fenilo. 
De este modo, el compuesto CMBA desarrollado presento 6 veces mayor actividad en 
comparación con 2-MPPA.(68) 
Estas características resultan atractivas, aunque existen algunos problemas inherentes a 
esta clase de compuestos. A diferencia de otros grupos de unión a zinc, el grupo tiol es 
 
 
40 
 
relativamente nucleófilo y propensos a la oxidación. Estas propiedades químicas 
comprometen la estabilidad metabólica y aumentan el riesgo de inducir reacciones 
inmunes cuando los conjugados reaccionan con proteínas endógenas.(69) 
3.8.3.3. Inhibidores a base de urea 
Mientras que la incorporación de un resto de urea en un esqueleto peptídico ha sido 
ampliamente utilizado en un esfuerzo para desarrollar peptidomiméticos. Pese a su uso 
limitado como un grupo de unión a zinc, potentes inhibidores de GCPII a base de urea 
fueron descubiertos por un grupo de la Universidad de Georgetown, en los años 2000 y 
evaluados con éxito en diferentes estudios preclínicos. (70) 
Esta clase de compuestos se basa en los análogos del péptido NAAG, en los que el 
enlace amida entre los residuos de ácido aspártico y glutamato y el grupo acetamido ha 
sido eliminado. 
El desarrollo de las nuevas estructuras con dos aminoácidos unidos través de sus grupos 
amino por un enlace de urea, con el razonamiento de que el grupo ureido serviría como 
un sustituto adecuado para el resto de ácido fosfínico (CH2P(O) (OH)CH2) presente en la 
estructura principal del compuesto PBDA. A partir de los datos de inhibición de los 
diferentes isómeros de glutamato-C(O)-glutamato y estudios SAR con otros aminoácidos, 
se propuso que el sitio S1´ tiene baja tolerancia a los cambios estructurales de los 
inhibidores, mientras que el sitio S1 tiene mayor tolerancia a este tipo de cambios. Por lo 
tanto, -para mantener la actividad es necesaria una unidad L de ácido glutámico intacta. A 
partir de (S)-glutamato-C(O)-(S)-glutamato como nueva pista, un número de potentes 
inhibidores, tales como NP ZJ 43, ZJ 11, ZJ 17 y ZJ 38, se descubrieron. (70),(71) 
Como ya se mencionó el sitio S1´ de GCPII tiene mayor afinidad por los análogos de 
glutamato y a glutamato. Al igual que en los inhibidores a base de fosforo, el glutamato 
unido al grupo ureido interacciona con el sitio S1´. El contacto entre el ácido α-carboxílico 
de glutamato con el grupo hidroxilo del residuo de Tyr552 y el grupo guanidinio de 
Arg210, da lugar a puentes de hidrógeno intermoleculares, mientras que el ɣ-carboxilato 
interactúa directamente con las cadenas laterales de los aminoacidos Asn257 y 
Lys699. El oxígeno del carbonilo del grupo ureido es atraído por las cadenas laterales de 
His553 y Tyr552, además interactúa con los iones de zinc y una molécula de agua. El 
grupo ureido se utiliza como una amida-bioisóstera, proporcionando resistencia a la 
hidrólisis del inhibidor por parte de la enzima. (72) 
 
 
41 
 
Una de las características más atractivas de los inhibidores de GCPII a base de urea es 
su facilidad de síntesis y modificación química posterior. Casi todos los inhibidores de esta 
clase se derivaran de aminoácidos naturales y se obtienen en forma enantioméricamente 
pura. 
Como resultado, una amplia variedad de compuestos se han preparado como agentes 
direccionados a GCPII de los cuales 11 están actualmente bajo investigación activa en 
clínicas como candidatos atractivos para tratamiento y/o diagnóstico. Por ejemplo, NAAL-
1, MIP-1404, 99mTc-DUPA, 68Ga-PSMA-11, 68Ga-PSMA-617, 99mTc-MIP-1404 y 18F-DCFBC. 
De los cuales 123I-MIP-1072, 99mTc-MIP-1404 y dos conjugados de imágenes más 
prometedores 68Ga-PSMA-11 y 68Ga-PSMA-617 (Figura 9) se están evaluando 
intensamente en ensayos clínicos de Fase II como nuevas herramientas de diagnóstico 
de pequeñas moléculas dirigidas en particular contra cáncer de próstata.(53),(54),(73–75) 
NH
O OH
NH
O
OH
O
O OH
NH
N
O
NN
N
O
OH
O
OH
O
OH
O
NH
NH
O
PSMA-617
PSMA-11
NH
OOH
NH
O
OH
O
OOH
O
NH
NH
O
OH
N
OOH
N O
OH
OH
OOH
 
Figura 9. Estructura de PSMA-11 y PSMA-617. 
(76)
 
 
El conjugado PSMA-617 representa tres fragmentos estructurales: (1) un fragmento de 
Glu-Urea-Lys, (2) un agente quelante bifuncional DOTA y, (3) un enlazador (linker) que 
integra estos fragmentos. El tercer fragmento (β-naftil alanina) tiene un papel importante 
en la orientación, la actividad biológica y la farmacocinética del inhibidor. (76) 
 
 
42 
 
En resumen, teniendo en cuenta las ventajas mencionadas, la enzima GCPII parece estar 
entre los blancos biológicos más atractivos para el diagnóstico y la administración de 
fármacos específicos de cáncer. Sin embargo, el potencial terapéutico de los inhibidores a 
base de urea en enfermedades neurológicas puede ser limitado debido a su bajo perfil 
farmacocinético y alta polaridad. (77) 
 
3.9. Modelado molecular 
El modelado molecular es la ciencia o arte de representar las estructuras moleculares y 
simular su comportamiento con ecuaciones de física clásica y química cuántica. La 
mecánica molecular es un formalismo matemático el cual intenta reproducir las 
geometrías moleculares, las energías y otras características por un ajuste de las 
longitudes de enlace, ángulos de enlace y ángulos de torsión a los valores de equilibrio 
que son dependientes del tipo de átomo. Más que utilizar la física cuántica, el método 
aplica las leyes de la física Newtoniana. 
Las ecuaciones y parámetros utilizados para definir la función de energía de una 
molécula se conocen como campos de fuerzas, que proporcionan información acerca de 
la estructura, espectro vibracional y propiedades de las moléculas. 
La formar funcional de cualquier campo de fuerza involucra los términos descritos por las 
fuerzas electrostáticas y de Van der Waals. 
𝐸𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 = 𝐸𝑒𝑠𝑡𝑖𝑟𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑙𝑎𝑐𝑒 + 𝐸𝑡𝑒𝑛𝑠𝑖ó𝑛 𝑎𝑛𝑔𝑢𝑙𝑎𝑟 + 𝐸𝑡𝑒𝑛𝑠𝑖ó𝑛 𝑡𝑜𝑟𝑠𝑖𝑜𝑛𝑎𝑙+ 𝐸𝑣𝑎𝑛 𝑑𝑒𝑟 𝑊𝑎𝑎𝑙𝑠 
La mecánica molecular se utiliza para analizar propiedades moleculares las cuales no 
dependen de efectos electrónicos. Estas incluyen geometrías de enlace, barreras 
rotacionales, espectros vibracionales, calores de formación, y estabilidad relativa de 
confórmeros. Este tipo de cálculos son rápidos y eficientes y es por ello que la mecánica 
molecular puede usarse para examinar sistemas que contienen miles de átomos. (78) 
 
 
 
 
 
 
43 
 
4. Objetivos 
 
Objetivo general 
 
Radiomarcar inhibidores de la Carboxipeptidasa II con 99mTc o 177Lu, evaluar su 
estabilidad radioquímica por HPLC y su captación in vitro en células de cáncer. 
 
Objetivos particulares 
 
 Radiomarcar inhibidores de la carboxipeptidasa con 99mTc utilizando el agente 
bifuncional HYNIC 
 Radiomarcar inhibidores de la carboxipeptidasa con 177Lu utilizando el macrociclo 
DOTA 
 Evaluar la pureza radioquímica por HPLC de fase reversa (RP-HPLC) 
 Evaluar la estabilidad en suero humano de los conjugados por HPLC de exclusión 
molecular 
 Evaluar la expresión, captación específica e internalización de los conjugados en 
dos líneas celulares de cáncer de mama 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
44 
 
5. Metodología 
5.5. Cálculo de la energía potencial por Mecánica Molecular 
La construcción de las moléculas de interés, el proceso de minimización energética y el 
cálculo del calor de formación se realizó utilizando el programa PC/x86 Spartan´10 
Mechanics de Wavefunction, Inc. (Irvine, California, USA). 
Para la construcción de la molécula base (Glu-NH-CO-NH-Lys) y los inhibidores (HYNIC-
iPSMA y DOTA-iPSMA), se tomó en cuenta la valencia, tipo de enlace, carga e 
hibridación. 
Cada molécula minimizada en energía, sirvió como base para obtener el calor de 
formación con la estructura o geometría óptima usando el método MMFF94 (Merck 
Molecular Force Field). 
Se consideró que la molécula es estable si la energía del inhibidor sin marcar es menor o 
igual a la energía de la molécula base (Glu-NH-CO-NH-Lys). 
 
5.6. Identificación radionucleídica por espectrometría gamma 
Se realizó por triplicado la identificación radionucleídica (99mTcO4Na y 
177LuCl3) por 
espectrometría gamma utilizando un Espectrómetro Gamma Beta AT1315. El espectro de 
rayos gamma es característico de cada radionúclido y presenta uno o varios fotopicos de 
emisión con energías determinadas. 
 
5.7. Caracterización del péptido iPSMA por espectrofotometría 
FT-IR 
Se realizó la prueba de identidad de grupos funcionales de los inhibidores HYNIC-iPSMA 
y DOTA-iPSMA (Figuras 13 y 14) con un espectrofotómetro de Infrarrojo por 
Transformada de Fourier (FT-IR) (Perkin Elmer Spectrum 4000), en la región del Infrarrojo 
Medio (MIR, 4000-500 cm-1), la muestra se analizó en estado sólido. 
 
 
 
45 
 
5.8. Radiomarcado de inhibidores de la Carboxipeptidasa II 
5.8.1. Marcado del conjugado 99mTc-HYNIC-iPSMA 
Para marcar el inhibidor de GCPII con 99mTc, en un frasco vial de 2 mL se colocó: 500 µL 
de solución EDDA/Tricina (30 mg de EDDA en 1.5 mL de NaOH 0.1 M / 60 mg de Tricina 
en 1.5 mL de Buffer de fosfatos 0.2 M a pH 7), 40 µL de HYNIC-iPSMA [ 1 mg/ mL], 500 
µL de 99mTcO4
- con una actividad de 1110 MBq y 20 µL de solución de SnCl2 (10 mg /10 
µL HCl conc en 10 mL de agua). La solución se homogeneizó durante 1 minuto, 
posteriormente se incubó en un baño seco a 92°C durante 30 minutos, y se dejó enfriar a 
temperatura ambiente por 10 minutos. (Figura 10) 
A continuación el compuesto radiomarcado se diluyó con 1 mL de solución salina y luego 
se inyectó una muestra en el HPLC para evaluar su pureza radioquímica, con un tR= 11.5 
± 1.0 min para el producto deseado y un tR= 4.5 ± 1.0 min para 
99mTcO4Na.
(2) 
EDDA/Tricina
SnCl
2
92°C
30 min
O
NH
NH
O
NH
O OH
NH
O
OH
O
O OH
NNH
NH2
+
Na
+
TcO4
-
O
NH
NH
O
NH
O OH
NH
O
OH
O
O OH
NNH
N
Tc
3-
N
N
NN
O
O
O
OH
O
OH
O
OH
HYNIC-iPSMA
 
Figura 10. Esquema de marcado del inhibidor de GCPII con el radionúclido 
99m
Tc 
 
 
46 
 
5.8.2. Marcado del conjugado 177Lu-DOTA-iPSMA 
En un frasco vial de 2 mL se colocó: 50 µL de Buffer de acetato 1M pH 5, 40 µL de DOTA-
iPSMA [1 mg/ mL] y 50 µL de 177LuCl3 (dilución 1:10) con una actividad de 40 GBq/mL 
aproximadamente. En seguida se homogeneizó la solución durante 1 minuto. 
Posteriormente la solución se incubó en un baño seco a 92°C por 30 minutos, y se dejó 
enfriar a temperatura ambiente por 10 minutos. (Figura 11) 
A continuación el compuesto radiomarcado se diluyó con 1 mL de solución salina y luego 
se inyectó una muestra en el HPLC para evaluar su pureza radioquímica. En este caso, 
no se han reportado los tiempos de retención para los radiofármacos de 177Lu así como 
para el 177LuCl3. 
LuCl 3
O
NH
NH
O
NH
OOH
NH
O
OH
O
OOH
NH
N
O
NN
N
O
OH
O
OH
O
OH
+
O
NH
NH
O
NH
O OH
NH
O
OH
O
O OH
NH
N
O
N N
N
O
O
O
O
O
OH
Lu
3-
92 °C 
30min 
CH3COOH / CH3COO
- Na+
PSMA-617
 
Figura 11. Esquema de marcado del inhibidor de GCPII con el radionúclido 
177
Lu 
 
 
47 
 
5.9. Determinación de la pureza radioquímica por HPLC 
La pureza radioquímica se realizó por HPLC empleándose un sistema de gradientes en 
fase reversa (RP-HPLC). El sistema cromatográfico estaba constituido por una bomba 
Waters®, un detector UV-vis de arreglo de diodos y un detector de radiactividad de 
centelleo sólido arreglados en línea para obtener los radiocromatogramas. El control del 
equipo se realizó utilizando el programa Empower ™ (Waters®, Milford, MA, USA). La 
separación se llevó a cabo en una columna µbondapak C-18 (Waters® 3.9 x 300 mm) 
Las condiciones comatográficas fueron: 
Volumen de inyección: 20 µL 
Tiempo de corrida: 30 minutos 
Longitud de onda: 200-380 nm 
Temperatura: 25°C 
El sistema de gradientes se corrió con un flujo de 1 mL/min utilizándose como solvente A: 
0.1% de Ácido trifluoroacético (TFA)/acetonitrilo, y como solvente B: 0.1% TFA/Agua.(2) El 
sistema de gradiente realizado se expresa en la Tabla: 
Tabla 2. Sistema de gradientes utilizado en fase reversa 
No. 
Tiempo 
(min) 
Flujo 
(mL/min) 
% Solvente A % Solvente B 
1 0.01 1.00 0.0 100.0 
2 3.00 1.00 0.0 100.0 
3 10.00 1.00 50.0 50.0 
4 20.00 1.00 50.0 50.0 
5 23.00 1.00 70.0 30.0 
6 27.00 1.00 0.0 100.0 
7 30.00 1.00 0.0 100.0 
Se obtuvieron los radiocromatogramas correspondientes, tiempo de retención, área bajo 
la curva y el porcentaje de la pureza radioquímica de cada inyección. En este sistema los 
tiempos de retención para 99mTcO4
- y 177LuCl3 fueron 3-4 min y 4-5 min respectivamente. 
 
 
48 
 
5.10. Estabilidad radioquímica 
Los conjugados radiomarcados 99mTc-HYNIC-iPSMA y 177Lu-DOTA-iPSMA se analizaron 
en el RP-HPLC. Se realizaron inyecciones de las muestras (20 µL) a diferentes tiempos 
tras ser radiomarcados. 
Se obtuvieron los radiocromatogramas correspondientes, tiempo de retención, área bajo 
la curva y el porcentaje de la pureza radioquímica de cada inyección. 
Los radiocromatogramas se normalizaron dividiendo el área de cada pico por el área total 
y se multiplo por 100. 
 
5.11. Estabilidad en suero humano 
Para determinar la estabilidad de los radiofármacos, se diluyó 200 µL de cada compuesto 
radiomarcado con 1 mL de una dilución 1:10 de suero humano recién preparado e 
incubándose a 37°C. Posteriormente, se evaluó la estabilidad por HPLC, tomando 
alícuotas de 20 µL a diferentes tiempos de incubación y se inyectaron en el HPLC de 
exclusión molecular en una columna ProteinPak 300SW, Waters®. 
Las condiciones comatográficas fueron: 
Volumen de inyección: 20 µL 
Tiempo de corrida: 20 minutos 
Longitud de onda: 200-380 nm 
Temperatura: 25°C 
Flujo: 1 mL/ min 
Fase A: PBS 0.1 M 
 
Se obtuvieron los cromatogramas correspondientes, tiempo de retención, el área y el 
porcentaje de la unión a proteínas de cada inyección.