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I UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO DOCTORADO EN CIENCIAS DE LA PRODUCCIÓN Y DE LA SALUD ANIMAL FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN Estudio de algunos factores endócrinos sobre la reactivación de larvas 2 de Toxocara canis T E S I S QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: DOCTORA EN CIENCIAS PRESENTA: LORENA ELIZABETH CHÁVEZ GÜITRÓN TUTOR PRINCIPAL DR. FERNANDO ALBA HURTADO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES DE CUAUTITLÁN MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR DR. JORGE MORALES MONTOR INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS DRA. PATRICIA RAMÍREZ NOGUERA FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES DE CUAUTITLÁN Cuautitlán Izcalli, Estado de México. Agosto 2016 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. II DEDICATORIAS A mi abuelita Cuquita Por su apoyo, orientación y amor que me brindó, han sido fundamentales en mi vida. A mi papá Güero, en especial una dedicatoria para ti, que has sido y serás siempre para mí un ejemplo a seguir. A mi mamá Por su apoyo y consejos que fueron importantes para la realización de este proyecto. A mi esposo, Dr. Gilberto Parra Gaviño Con amor y gratitud. A mis hijas Ninel y Paulina Por su apoyo y comprensión. A mis hermanos Luz Elena, Lilia Edith y Luis Eduardo, con gratitud por el estímulo que en todo momento me han brindado. III AGRADECIMIENTOS A la Universidad Nacional Autónoma de México, de forma particular a la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán y al Instituto de Investigaciones Biomédicas, por permitirme continuar con mi superación académica. A las autoridades de la Universidad Tecnológica de Tecámac, por el apoyo que me brindaron para la realización de este proyecto. A mi tutor, el Dr. Fernando Alba Hurtado, por la confianza, enseñanzas y consejos que me brindó para el desarrollo de este trabajo. Al Comité Tutoral y Jurado: Dr. Jorge Morales Montor y Dra. Patricia Ramírez Noguera, por abrirme las puertas de su laboratorio, así como por su orientación y valiosos consejos para la realización de este proyecto. A los miembros del jurado: Dr. Romel Hernández Bello y Dra. Yazmín Alcalá Canto, por enriquecer esta tesis con sus comentarios. Al Dr. Marco Antonio Muñoz Guzmán, por sus enseñanzas y apoyo para la culminación de este trabajo. A los Doctores: Karen Nava Castro, Hugo Ramírez Álvarez y Dra. Norma Moreno Mendoza, por el apoyo para la estandarización de algunas técnicas. Al Dr. Roberto Díaz Torres, del Laboratorio de Toxicología y Genética de la Unidad de Investigación de la Facultad de Estudios Superiores de Cuautitlán, por sus aportaciones a este proyecto. Al M. en C. César Cuenca Verde, por el apoyo técnico ofrecido en el Laboratorio de Inmunología y Biología Molecular de Parásitos de la Unidad de Investigación Multidisciplinaria de la FES- Cuautitlán. IV A la Biol. Lorena López Griego, por el apoyo técnico brindado en el Laboratorio de Inmunología del Instituto de Investigaciones Biomédicas. A los compañeros y amigos de los laboratorios de: Inmunología y Biología Molecular de Parásitos de la UIM de la FES-Cuautitlán y de Inmunología del Instituto de Investigaciones Biomédicas por su ayuda y colaboración en este proyecto. A Lucy, Lili, Abraham, Paco y Julián por el apoyo que me brindaron para realizar el proyecto. A mis compañeros del Programa de Posgrado: Ana, Johny y Gaby. A mis amigas de la Universidad Tecnológica de Tecámac: Flor, Lety y Socorro. Al proyecto PAPIIT/UNAM con número IN-222316 que financio este trabajo. V ABREVIATURAS ANOVA Análisis de Varianza Buffer de FACS Flow Citometry Staining Buffer bp Base pair Células NK Células Natural Killer CO2 Dióxido de carbono cm Centímetros d Días DNA Ácido desoxirribonucleico gDNA Ácido desoxirribonucleico genómico ER Receptor para estrógenos ER-α Receptor para estrógenos alfa ERα -+ Células positivas al receptor de estrógenos alfa FSH Hormona Folículo Estimulante GnRH Hormona liberadora de gonadotrofina IGF-1 Factor de crecimiento insulínico tipo I HEPES Ácido 4(2-hidroxietil)-1 piperazine tanosulfúrico IgA Inmunoglobulina A IgG Inmunoglobulina G IFN- Interferón gamma L2 Larva dos LH Hormona Luteinizante MAB Mililitro mm Milímetros ng Nanogramos PBS Buffer fosfato salino PCR Reacción en cadena de la polimerasa P4 Progesterona pg Picogramos P-R Receptor para progesterona P-R+ Células positivas al receptor de progesterona PR-A Receptor para progesterona A PR-B Receptor para progesterona B PR-C Receptor para progesterona C PI Post infección VI PRL Prolactina PRL-R Receptor para prolactina PRL-R+ Células positivas al receptor de progesterona RPMI-1640 Roswell Park Memorial Institute 1640 T. canis Toxocara canis U.V. Ultravioleta 17β-E 17 β-Estradiol µm Micrómetros µL Microlitros VII ÍNDICE Dedicatorias ………………………………………………………………….…………. II Agradecimientos ……………………………………………………………....………... III Abreviaturas ……………………………………………………………….…..……….. V Índice ……………………………………………………………………………………. VIII Índice de Figuras y Cuadros ………………………………………………………...…. IX Resumen ……………………………………………………………………….………... XII Abstract ………………………………………………………………………...……….. XIII Introducción ………………………………………………………………..………..… 1 1. Generalidades de T. canis ............................................................................................ 3 1a. Morfología de T. canis ………..……………………………………………………… 4 1b. Ciclo Biológico ………………………………………………………………………. 9 2. Epidemiología de la Toxocariosis ………………….………………………………... 13 2a. Prevalencia de T. canis ………………………………………………………………. 14 2b. Seroprevalencia de T. canis ………………………………………………………….. 15 Gestación en las perras ………………..………………………………………………. 15 Aspectos hormonales de la infección …..……………………………………………… 16 3. Hormonas de la gestación en perras ………………………………………………... 16 3a. Progesterona …………………………………………………………………………. 16 3b. Receptores de progesterona…………………………..………………………………. 17 3c. Receptores membranales de progesterona …………………………….……..……… 19 4. Prolactina ……………………………………………………………………………… 19 4a. Receptor de prolactina ………………………………………………………….……. 20 5. Estrógenos …………………………………………………………………………….. 23 5a. Receptor de estrógeno clásico ……………………………………………………….. 23 5b. Receptor de estrógenos acoplado a proteínas ………………………………………... 24 Eventos hormonales en la gestación de la perra ……………………………………… 25 Justificación ……..………………………………………………………………..…….. 27 Hipótesis …………………………...…………………………………………….……… 28 Objetivos ……………………...………………………………………………….……... 28 Material y Métodos ……………………………..……………………….……………... 28 Obtención y cultivo de huevos de T. canis ………………………………………………. 29 Obtención y cultivo de larvas de T. canis ……………………………………………….. 29 Diseño Experimental …………………………………………………………………….. 30 Estimulación de las larvas ……………………………………………………………….. 30 Medición de las larvas …………………………………………………………………… 31 Determinación de la viabilidad y motilidad ……………………………………………...33 Citometría de flujo de los receptores para PRL, P4 y 17β-E en larvas de T. canis ……... 34 VIII Inmunolocalización de PRL-R y P-R en larvas de T. canis ……………………………... 35 Amplificación de DNAg de larvas de T. canis que codifica para los PRL-R y P-R …….. 36 Diseño de primers …………………………………………………..……………….…… 36 Obtención del DNAg de larvas de T. canis ……………………………………………… 36 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) …………………………………………… 37 Secuenciación de los amplicones …………………………………………...…………… 38 Análisis estadístico ………………………………………………………………………. 38 Resultados …………………………………………………………………….………… 39 Discusión …………………..……………………………………………………………. 62 Conclusiones ……………………………………………………………………………. 70 Referencias ……………………………………………………………………………… 71 Artículo científico ………………………………………………………………………. 83 IX ÍNDICE DE FIGURAS Y CUADROS Figura 1 Toxocara canis adultos …………………………………………………………………………... 4 Figura 2 A) Hembra y B) Macho adultos de Toxocara canis………………………………………………… 5 Figura 3 Estructura de larva-2 de Toxocara canis……….………………………………………………. 6 Figura 4 Huevo de Toxocara canis………………………………………………………………………... 8 Figura 5 Ciclo biológico de Toxocara canis………………………………………………………………. 12 Figura 6 Organización-estructural de las isoformas del receptor nuclear a progesterona en humanos (A y B)…………………………………………………………………………………… 18 Figura 7 Receptor de prolactina e isoformas. A. Isoformas largas y cortas descritas en ratón. B. Isoformas: la larga, intermedia y corta descritas en humano………………………………. 22 Figura 8 Diagrama que representa la estructura de dominios del receptor a estrógenos alfa…….. 24 Figura 9 Eventos fisiológicos en la gestación de la perra………………………….………………. 25 Figura 10 Medición de una larva de Toxocara canis teñida con lugol…………………………………... 31 Figura 11 Larva de Toxocara canis teñida con Hemalumbre de Mayer…………………………………... 32 Figura 12 Larva de Toxocara canis A) Larva viable, B) Larva muerta………………………………… 33 Figura 13 Fases embrionarias del huevo de Toxocara canis. A) Cigoto, B) Primera división, C) dos Blastómeros D) cuatro Blastómeros, E) Mórula F) Blástula G) Larva completa…………. 47 Figura 14 Aumento vs control (0) de tamaño de larvas de Toxocara canis vs cultivadas en RPMI- 1640 en presencia de diferentes concentraciones de prolactina. A) Estimuladas durante 5 días, B) Estimuladas durante 10 días, C) Estimuladas durante 15 días, D) Estimuladas durante 20 días……………………………………………………………………………………. 47 Figura 15 Aumento vs control (0) de tamaño de larvas de Toxocara canis vs 0 cultivadas en RPMI- 1640 en presencia de diferentes concentraciones de progesterona (P4). A) Estimuladas durante 5 días, B) Estimuladas durante 10 días C) Estimuladas durante 15 días, D) Estimuladas durante 20 días…………………..………………………………………………. 48 Figura 16 Aumento vs control 0 de tamaño de larvas de Toxocara canis vs cultivadas en RPMI-1640 en presencia de diferentes concentraciones de 17-β Estradiol (17β-E). A) Estimuladas durante 5 días, B) Estimuladas durante 10 días C)Estimuladas durante 15 días, D)Estimuladas durante 20 días……………………………………………………………………. 48 Figura 17 Larvas de Toxocara canis, cultivadas con diferentes hormonas en RPMI-1640 y teñidas con Hemalumbre de Mayer. A) Larva cultivada sin adicionar hormonas, B) Larva cultivada con prolactina 40 ng/mL de medio, C) Larva de cultivada con 17β-Estradiol 120 pg/mL de medio. D) Larva cultivada con progesterona 80 ng/mL de medio…………………. 49 Figura 18 Incremento del ancho vs control (0) de larvas de Toxocara canis vs cultivadas con diferentes concentraciones de prolactina (PRL) en RPMI-1640). A) Estimuladas durante 5 días, B) Estimuladas durante 10 días, C) Estimuladas durante 15 días, D) Estimuladas durante 20 días………………………………………………………………………………………. 50 Figura 19 Incremento del ancho vs control (0) de larvas de Toxocara canis vs cultivadas con diferentes concentraciones de progesterona (P4) en RPMI-1640). A) Estimuladas durante 5 días, B) Estimuladas durante 10 días, C) Estimuladas durante 15 días, D) Estimuladas durante 20 días………………………………………………………………………………………. 50 Figura 20 Incremento del ancho vs control (0) de larvas de Toxocara canis cultivadas con diferentes concentraciones de 17-β Estradiol (17β-E) en RPMI-1640). A) Estimuladas durante 5 días, B) Estimuladas durante 10 días, C) Estimuladas durante 15 días, D) Estimuladas durante 20 días………………………………………………………………………………………………... 51 Figura 21 Viabilidad de larvas de Toxocara canis cultivadas en RPMI-1640 con diferentes concentraciones de: A) Prolactina (B) Progesterona (B) y C) 17β-estradiol………………… 52 Figura 22 Diagrama del tamaño y la granularidad de células de larvas de Toxocara canis…………….. 55 X Figura 23 A) Células positivas al receptor de prolactina (PRL-R+) de larvas de Toxocara canis recién obtenidas. B) Células de útero de ratón positivas al PRL-R+ (control positivo)………………. 55 Figura 24 A) Porcentaje de células positivas (media ± error estándar) al receptor de prolactina (PRL-R+) de larvas de Toxocara canis estimuladas con diferentes dosis de prolactina (PRL) durante 10 días. B) Intensidad media de fluorescencia (media ±error estándar) de células de larvas de Toxocara canis, estimuladas con diferentes dosis de PRL…………….. 55 Figura 25 A) Células positivas al receptor de progesterona (P-R+) de larvas de Toxocara canis recién obtenidas. B) Células de útero de ratón positivas al P-R+ (control positivo)……………….... 56 Figura 26 A) Porcentaje de células positivas (media ± error estándar) al receptor de progesterona (P-R+) de larvas de Toxocara canis estimuladas con diferentes dosis de progesterona (P4) durante 10 días. B) Intensidad media de fluorescencia (media ±error estándar) de células de larvas de Toxocara canis, estimuladas con diferentes dosis de P4……………………….. 56 Figura 27 A) Células positivas al receptor de estrógenos alfa (ER-α+) de larvas de Toxocara canis recién obtenidas. B) Células de útero de ratón positivas al ER-α+ (control positivo)………. 57 Figura 28 Inmunolocalización del receptor de prolactina (PRL-R) en las larvas de Toxocara canis mediante microscopía confocal. Las larvas fueron estimuladas con 40 ng/mL de prolactina (PRL) durante 10 días, se incubaron con MAB anti-PRL-R y fueron teñidas con un anticuerpo secundario conjugado con APC. A) Larva de Toxocara canis control negativo (20x). B) Larva de Toxocara canis en la microscopía ultravioleta (40x) C) Merged image de larva de Toxocara canis (40x)………………………………………………………………………. 58 Figura 29 Inmunolocalización del receptor de progesterona (P-R’s) en las larvas de Toxocara canis mediante microscopía confocal (20x). Las larvas fueron estimuladas con 80 ng/mL de progesterona (P4) durante 10 días, se incubaron con anti-P-R y fueron teñidas con un anticuerpo secundario conjugado con Alexa 647. A) Larva de Toxocara canis control negativo. B) Larva de Toxocara canis en la microscopía ultravioleta. C) Merged image de larva de Toxocara canis……………………………………………………………………………. 58 Figura 30 Inmunolocalización del receptor de estrógenos α (ERα’s) en las larvas de Toxocara canis mediante microscopía confocal (20x). Las larvas fueron estimuladas con 120 pg/mL de 17β-estradiol (17β-E) durante 10 días, se incubaron con anti-ERα y fueron teñidas con un anticuerpo secundario conjugado con Alexa 647. A) Larva de Toxocara canis control negativo. B) Larva de Toxocara canis en la microscopia ultravioleta (20x). C) Merged image de larva de Toxocara canis……………………………………………………………….. 58 Figura 31 Electroforesis del amplificado del gen del receptor de progesterona (P-R) en larvas de Toxocara canis. En el carril 1 se encuentra el marcador de peso molecular, carril 2 control negativo y carril 3 y 5 amplificado de DNAg de larvas de Toxocara canis, carriles 7 y 8 amplificado de DNAg de útero de perra (control positivo)……………………………………… 59 Figura 32 Electroforesis del amplificadodel gen del receptor de prolactina (PRL-R) en larvas de Toxocara canis. En el carril 1 se encuentra el marcador de peso molecular, carril 2 control negativo, carril 3 amplificado de DNAg de útero de perra (Control positivo), carriles 4 y 5 amplificado de DNAg de l arvas de Toxocara canis…………………………... 59 Figura 33 Alineamiento de secuencias nucleótidicas de un fragmento del receptor de prolactina (PRL-R) de Toxocara canis comparado con el mismo fragmento de diferentes mamíferos reportados en el Genebank……………………………..………………………………………… 60 Figura 34 Árbol filogenético de las secuencias nucleotídicas del receptor de prolactina (PRL-R), utilizando el método Maximum Parsimony con 1000 Bootstrap como soporte estadístico de la topología……………………………………………………………………………………………. 61 Cuadro 1 Efectos biológicos de la prolactina en diferentes órganos………………………………………. 21 Cuadro 2 Motilidad de larvas de Toxocara canis estimuladas con diferentes dosis de progesterona. 53 XI (media ± error Estándar) por diferentes periodos………………………………………………… Cuadro 3 Motilidad de larvas de Toxocara canis estimuladas con diferentes dosis de prolactina (media ± error Estándar) por diferentes periodos…………………………………………….… 53 Cuadro 4 Motilidad de larvas de Toxocara canis estimuladas con diferentes dosis de 17-β Estradiol (media ± error Estándar) por diferentes periodos………………………………………………… 54 XII RESUMEN En este trabajo, se estudió el efecto in vitro de la progesterona (P4), prolactina (PRL) y estrógenos (17β-E) sobre las larvas de Toxocara canis. Los adultos de este parásito se desarrollan principalmente en el intestino de cachorros. En perras adultas las larvas se enquistan en diferentes órganos y se reactivan durante la segunda mitad de la gestación y se transmiten a los cachorros por vía transplacentaria y lactógenica. La reactivación ocurre principalmente durante la gestación, por lo que los eventos fisiológicos que se presentan en esta etapa se han asociado a la reactivación. Por lo anterior, los objetivos de este trabajo fueron: evaluar el efecto in vitro de la PRL, P4 y 17β-E sobre larvas de T. canis, así como determinar la expresión y localización de los receptores de PRL y P4. Las larvas de T. canis se incubaron con diferentes concentraciones de PRL, P4 y 17β-E durante diferentes periodos de tiempo. Las larvas estimuladas aceleraron su crecimiento, diámetro e incrementaron su motilidad. Por citometría de flujo, se observó que el promedio del porcentaje de células positivas de larvas de T. canis sin estimular a los receptores de PRL, P4 y 17β-E fue de 7.37±0.3, 8.16±0.4 y 7.04±0.3, respectivamente. Por inmunofluorescencia se determinó que las células con receptores de PRL y P4 se localizan en el intestino de la larva. Se amplificó por PCR un fragmento de una longitud de 465 pb de DNAg de larvas. La secuencia de este amplicon mostró 99% de similitud con el fragmento del gen que codifica para el receptor de PRL del perro doméstico. Lo anterior sugiere que las larvas de T. canis están adaptadas a reconocer evolutivamente la PRL, P4 y 17β-E de su hospedador definitivo y esto podría ayudar a explicar la reactivación de las larvas durante la gestación de la perra, lo que no ocurre en la gestación de las hembras de otras especies. XIII ABSTRACT This work, study the in vitro effect of progesterone (P4), prolactin (PRL) and estrogen (17β-E) on the larvae of Toxocara canis. Adults of this parasite are mainly developed in the intestine of puppies. In adult dogs, the larvae encyst in different organs and are reactivated during the second half of pregnancy and are transmitted to the puppies via placental and lactogenic. Reactivation occurs mainly during pregnancy, so the physiological events that occur at this stage have been associated with reactivation. Therefore, the objectives of this study were: to assess the effect in vitro of the PRL, P4 and 17β-E on larvae of T. canis, as well as determine the expression and localization of receptors of PRL and P4. The larvae of T. canis were incubated with various concentrations of PRL, P4 and 17β-E and for different periods of time. The larvae stimulated accelerated its growth, diameter and, increased its motility. By flow cytometry, it was observed that the mean percentage of positive cells of larvae of T. canis unstimulated to PRL, P4 and 17β-E receptors was 7.3±0.3, 8.1±0.4 and 7.0±0.3, respectively. By immunofluorescence was determined that cells with receptors of PRL and P4 are located in the region of the larval intestine. A fragment of a length of 465 larvae DNAg bp was amplified by PCR. The amplicon sequence showed 99% similarity with the fragment of the gene coding for the PRL receptor of the domestic dog. All the above suggests that the larvae of T. canis are evolutionary adapted to recognize PRL, P4 and 17β- E of their definitive host and furthermore might explain the reactivation of the larvae during the gestation of bitches, which does not occur in pregnant females of other species. 1 INTRODUCCIÓN Las relaciones entre parásitos y sus hospederos implican la coevolución y comunicación entre sus complejos sistemas fisiológicos y metabólicos (Aguilar-Díaz et al., 2016). En los mamíferos, las hormonas son sustancias secretadas por células localizadas en glándulas de secreción interna o por células epiteliales e intersticiales cuyo fin es afectar la función de otras células, incluso la de la misma célula que las sintetiza. Las hormonas regulan una gran variedad de funciones dentro del organismo, tales como la diferenciación y activación celular, crecimiento, reproducción, movilización de minerales, balance y aprovechamiento nutricional, respuesta corta y prolongada al estrés, mantenimiento del medio interno del organismo, la respuesta inmunológica dirigida contra agentes patógenos, etc. (Hall and Guyton, 2011). Los parásitos son organismos que viven a expensas de otro y dependen metabólicamente de él. Por estar en estrecho contacto con su hospedero, algunos eventos fisiológicos que ocurren en el mismo tienen efectos en el parásito. Las hormonas y factores de crecimiento del hospedero pueden tener efectos directos e indirectos sobre el establecimiento y proliferación de algunos parásitos (Escobedo et al., 2009; Romano et al., 2015). En otros casos, las hormonas del hospedero regulan funciones vitales del parásito, este fenómeno ha sido llamado transregulación (González and Montor 2004; Escobedo et al., 2005). Algunas hormonas pueden regular parcialmente la respuesta inmune dirigida contra algunos agentes patógenos, esto es evidente en algunas infecciones parasitarias como malaria, esquistosomiosis, toxoplasmosis, cisticercosis, tripanosomiosis y leishmaniosis (Morales-Montor et al., 2004; Escobedo et al., 2009; Vargas-Villavicencio et al., 2009). Se 2 ha demostrado in vivo que los esteroides sexuales (básicamente 17β-E, progesterona y testosterona) pueden tener efecto sobre algunas infecciones parasitarias, los cuales confieren un dimorfismo sexual a la susceptibilidad y/o resistencia de las mismas (Escobedo, et al., 2010, Lockshin, 2001). Por ejemplo, las infecciones provocadas por Toxoplasma gondii, Tritrichomonas foetus, y Taenia crassiceps, ostentan una mayor prevalencia e intensidad en hembras. En machos, por el contrario, las infecciones provocadas por Leishmania sp., Schistosoma sp., Trichinella spiralis, Haemonchus contortus y Taenia solium son más severas (Escobedo-González et al., 2004; Figallová and Prokopic, 1987; Hernández- Bello et al., 2012; Morales-Montor and Tovar-Velasco 2004; Morales-Montor et al., 2004). Otros estudios han mostrado que la mayor susceptibilidad de los ratones machos a infecciones por Plasmodium berghei, Trypanosoma cruzi y Strongyloidesvenezuelensis se revierte cuando se administran fuertes componentes estrogénicos como el estradiol (de Souza et al., 2001; Libonati et al., 2006; Rivero et al., 2002). Por otro lado, la progesterona (P4), que es una hormona antagónica de los estrógenos protege a los ratones de infecciones por Taenia crassiceps (Vargas- Villavicencio et al., 2006). En este contexto, se ha reportado la asociación entre el estado reproductivo del hospedero y el comportamiento de Toxocara canis (Soulsby, 1983; Quiroz, 1984). En este parásito, las larvas pueden permanecer en estado de latencia en los tejidos de perras y reactivarse durante la parte final de la gestación. En T. canis, las larvas que ingiere un perro mayor de 3 meses de edad entran en estado de latencia en diferentes tejidos, donde pueden permanecer durante meses o años. Las larvas latentes presentes en los tejidos de las perras, se reactivan durante la segunda mitad de la gestación y migran desde los tejidos hasta el útero y la glándula mamaria, infectando a sus cachorros (Alba-Hurtado, 3 1991; Schnieder et al., 2011; Webster, 1958; Koutz et al., Scothorn et al., 1965). El mecanismo por el cual las larvas se reactivan en el tejido somático de la perra todavía está en debate. La aplicación de prolactina (PRL) en ratones hembra induce la reactivación de larvas enquistadas de T. canis y la migración de éstas a la glándula mamaria por lo que se ha sugerido que esta hormona es la responsable de la reactivación en la perra (Jin, et al., 2008). Por otro lado, se ha demostrado que las larvas ingresan por vía transplacentaria a los fetos entre los días 40 y 42 de la gestación, que es el momento en el que aumentan los niveles de PRL en la hembra gestante, lo que apoya la sugerencia anterior. Por otro lado, Overgaauw et al., 1988 demostró que los anticuerpos anti-toxocara y de eosinófilos aumentan alrededor del día 20 días de gestación en perras infectadas, lo que se ha asociado a una reactivación de larvas de T. canis enquistadas en sus tejidos. Durante esta etapa de la gestación la hormona que alcanza su mayor concentración es la progesterona (P4). Sin embargo, hasta el momento no se conoce si las larvas se reactivan por estimulación directa de la prolactina y/o otras hormonas relacionadas con la gestación sobre ellas, a través de receptores o si son reactivadas por cambios fisiológicos o tisulares inducidos por las hormonas relacionadas con la gestación, como son la PRL, P4 y estrógenos. Por lo anterior, se ha propuesto que las variaciones hormonales en las perras gestantes pueden estar asociadas a la reactivación larvaria. (Webster 1958; Overgaauw et al., 1998). 1. Generalidades de T. canis Toxocara canis es uno de los nematodos intestinales de mayor importancia en perros de todo el mundo (Schnieder et al., 2011), produce una enfermedad denominada toxocariosis, la cual representa un serio problema de salud pública en muchos países (Barriga, 1988). 4 Esta enfermedad es una zoonosis y se adquiere por la ingestión de huevos larvados de segundo estadío. El riesgo de la infección se presenta con frecuencia por la geofagia, un tipo específico de pica, especialmente en niños que conviven con perros que no han sido desparasitados. Otras formas de adquirir la enfermedad son: la deficiente higiene personal y la ingesta de vegetales crudos provenientes de cultivos contaminados con huevos larvados. También se ha asociado a esta enfermedad con el consumo de carne cruda proveniente de hospederos paraténicos infectados como: pollos, ovejas o conejos (Nagakura et al., 1989; Salem and Schantz, 1992; Sturchler et al., 1990). 1a. Morfología de Toxocara canis Los parásitos adultos de Toxocara canis son helmintos con cuerpo grueso, de forma cilíndrica, de color blanquecino con tonos marrón (Figura 1). En la parte anterior, los parásitos adultos cuentan con 3 labios en la boca, que no sobrepasan la parte anterior y 2 aletas cervicales que le dan la forma característica de punta de flecha. Los machos miden de 4 a 10 cm y terminan de forma enroscada, presentan dos Figura 1. Toxocara canis adultos. Elaboración propia 5 aletas caudales y dos espículas que emergen de su cloaca. Las hembras adultas miden de 5 a 18 cm tienen la parte posterior de forma puntiaguda, la vulva se localiza en el primer tercio de su cuerpo (Figura 2). La forma infectante del parásito es la larva (Figura 3) del segundo estadio (L2). Esta tiene una longitud media de 404 µm (360-434 µm), y el ancho medido a nivel del esófago de 18-21 µm (Nichols 1956; Schacher 1957). Talluri et al., (1986) observaron por microscopía electrónica de transmisión que la larva se encuentra estriada en toda su superficie corporal. La cavidad bucal está rodeada de tres labios desarrollados. Estos están presumiblemente relacionados en el anclaje en los tejidos durante la migración y la obtención de su alimento. En el extremo anterior de la larva se localizan las papilas cefálicas. En la parte ligeramente anterior a los labios se sitúa una cápsula bucal superficial cuyo margen ventral se encuentra formado por una cutícula fina, espinosa y afilada. A B Figura 2. A) Hembra y B) macho adultos Toxocara canis. Elaboración propia. 6 El aparato bucal se continúa con un esófago largo que ocupa un tercio de la longitud total de la larva. El anillo nervioso se localiza en el nivel del primer tercio del esófago, en la parte subterminal del esófago se localizan células excretoras que desembocan en el poro excretor. Talluri et al., 1986 observaron por microscopía electrónica de trasmisión que la cavidad bucal está separada de las cavidades del vestíbulo por medio de tres proyecciones cuniculares. Esta estructura podría prevenir la regurgitación del contenido del tracto alimentario, ya que funcionaría como una válvula que se abre y se cierra, coordinándose con el movimiento del sistema de alimentación. Este mecanismo puede estar soportado por una gruesa capa al principio del esófago formada por unas fibras musculares. Debido a Figura 3. Estructura de larva-2 de Toxocara canis. Tomado de Schacher 1957. 7 que la capa cuticular que cubre a las proyecciones es más fuerte y gruesa que la cutícula adyacente de la cavidad vestibular, podría ser utilizada como trituradora de alimento. El esófago continúa en un intestino de forma cilíndrica que termina en el ano en la porción subterminal. Este órgano ocupa un tercio de la longitud total de la larva, se divide en cuatro regiones: procorpus (20 µm de longitud de ancho), metacorpus (35µm de longitud y 5 µm de ancho), itsmo, y bulbo terminal (20-25 µm de longitud y 6-10 µm de ancho). La glándula dorsal rodea al esófago y dos subventrales situadas en la parte posterior del esófago. Las células de la glándula dorsal contienen en su citoplasma retículo endoplásmico rugoso y Aparato de Golgi, lo cual indica que éstas intervienen en la secreción de proteínas. La secreción de las células de las glándulas esofágicas posteriores y las células de la glándula dorsal, además de participar en la alimentación, pueden estar relacionadas en la secreción de enzimas histolíticas, las que facilitan la penetración de las larvas a través de los tejidos (Bardon, 1992). En el último tercio de la larva se localiza el primordio genital adherido a la pared intestinal (Nichols, 1956), que es una masa formada por cuatro células que no se separan individualmente (Iglesias 1993). El intestino está constituido por siete células alargadas, su citoplasma contiene gránulos opacos de grasa y aparentemente carece de lumen. Este órgano se encuentra comprimido lateralmente por las columnas excretoras y posteriormente se extiende y ocupa todo el cuerpo de la larva. La última célula intestinal termina 20-30 µm antesdel poro anal (Iglesias 1993). 8 El extremo posterior de la larva es ligeramente asimétrico y digitiforme. Posee también dos alas que aparecen como dos líneas retractiles y que se extienden desde el aparato bucal hasta el poro anal (terminan a unas 20 µm de la parte posterior). También tiene dos pares de papilas, un par se localiza en el extremo anterior al poro excretor y otro par se encuentra cerca del ala lateral detrás de la mitad del cuerpo (Nichols 1956). Los huevos son de color amarillo-blanquecino, miden de 70 a 90 µm de forma esférica a elipsoidal (Figura 4). Presentan un cascaron grueso con fosetas, el cual le brinda una resistencia de tipo química, mecánica y térmica ante las condiciones ambientales. (Alba- Hurtado 2007, Cordero y col, 1999; Quiroz 2004). La fertilización del huevo estimula posteriormente la formación del cascarón, el cual tiene cuatro capas, tres son formadas por el huevo y la cuarta es añadida por las secreciones del útero. La primera capa es la vitelina, seguida por una capa quitinosa y finalmente de una capa de naturaleza lipídica, esta última está formada debajo de la segunda capa por la coalescencia de gránulos refringentes que salen del citoplasma. La cuarta capa se forma por material secretado por la pared del útero. La coloración de los huevos en el útero es Figura 4. Huevo de Toxocara canis. Elaboración propia. 9 incolora; sin embargo, al entrar en contacto en el flujo del contenido intestinal y con la bilis, el huevo se endurece y adquiere una coloración pardo-amarillenta. 1b. Ciclo Biológico Aunque el ciclo biológico de T. canis es directo, son extremadamente complejas las relaciones entre este parásito y sus hospedadores. Esto último tiene que ser considerado ya que el conocimiento de ciclo vital y la biología del parásito son importantes para determinar su epidemiología y comprender los aspectos clínicos de la enfermedad (Alba-Hurtado 1991; Schnieder et al., 2011). El ciclo (Figura 5) se inicia con la eliminación de huevos de T. canis en el excremento de los perros parasitados (principalmente cachorros), estos huevos son resistentes y duraderos en el ambiente. Sin embargo, la exposición a la luz solar y temperatura de 55.5°C por una hora los mata. El desarrollo de la larva infectante requiere de 9 a 11 días a 24°C y de 3 a 5 días a 30°C, en presencia de oxígeno atmosférico y una humedad relativa del 75% (Archelli et al., 2009; Beaver et al., 1986; Olsen, 1974 y 1979). Los perros, humanos u otros hospedadores paraténicos se infectan cuando ingieren huevos larvados, la eclosión ocurre en el duodeno y el segundo estadio larvario atraviesa la pared intestinal; las larvas pasan al flujo linfático o a capilares sanguíneos y por la vena porta llegan al hígado dos días después. Al cuarto día llegan al pulmón viajando por la vena cava, corazón derecho y arteria pulmonar. A partir de este punto, la ruta de migración y desarrollo de las larvas varía dependiendo de que el perro sea joven o adulto, hembra gestante, humano u otra especie animal (Strube 2012; Olsen, 1974). 10 En perros adultos, las larvas de segundo estadío que llegan al pulmón regresan al corazón y se distribuyen por todo el cuerpo, llegando al músculo estriado, hígado, pulmones y riñones, donde permanecen en estado de latencia (Beaver et al., 1986; Soulsby, 1983; Sprent 1958). En cachorros, las larvas abandonan los capilares pulmonares, penetran en los alvéolos y migran por las vías respiratorias hasta la faringe (migración traqueal) en donde son deglutidas. Las larvas viven en el estómago hasta el décimo día post-infección (PI), posteriormente pasan al duodeno, donde se convierten en adultos entre los 19-27 días PI. En este tiempo los parásitos son sexualmente maduros, se aparean y se inicia la producción de huevos fértiles entre 4 y 5 semanas PI (Olsen, 1974; Soulsby 1983). Además de la infestación post-natal por la ingestión de huevos embrionados, los cachorros casi siempre se infectan prenatalmente en condiciones naturales. Bajo la influencia de las hormonas de las hembras en gestación, las larvas somáticas son reactivadas y penetran a los fetos entre los días 42 a 43 de gestación (Douglas y Baker, 1959; Olsen 1974; Schnieder et al., 2011). Esta última condición se ha podido reproducir experimentalmente al aplicar PRL, hidrocortisona y oxitocina. No todas las larvas somáticas se reactivan durante la primera gestación, se ha demostrado que en perras que no vuelven a ingerir huevos larvados son capaces de contaminar a sus cachorros durante 3 gestaciones consecutivas (Soulsby, 1983). Cuando las larvas alcanzan el hígado del feto tiene lugar una muda, transformándose en larvas de tercer estadío, las cuales al nacer los cachorros, aparecen en los pulmones y así permanecen durante la primera semana de vida. La muda del cuarto estadío se produce durante la primera semana, cuando las larvas están en pulmones o posteriormente en el estómago. Hacia el fin de la segunda semana, las larvas mudan al quinto estadio. Posteriormente, experimentan un rápido crecimiento y las 11 formas adultas pueden encontrarse al final de la tercera semana. El periodo de patencia de las infecciones prenatales varía entre los 23 y 40 días después del nacimiento (Clarence, 1988; Soulsby 1983). Hasta ahora sólo se han mencionado las larvas de segundo estadío somático en perros adultos (adquiridas por la ingestión de huevos larvados). Estos perros raramente tienen parásitos adultos en el intestino. Sin embargo, después del parto las larvas somáticas reactivadas pueden llegar al intestino de perras exentas de parásitos adultos. Estos parásitos maduran a los 25 o 26 días post-parto y persisten un promedio de 60 días antes de ser expulsados espontáneamente (Olsen, 1974; Shrand, 1964; Schnieder et al., 2011). La reactivación de las larvas somáticas continúa en la perra lactante y las larvas migran a la glándula mamaria, siendo expulsadas en leche e infestando a la camada. La infestación post-natal de cachorros durante la lactancia es, cuantitativamente, tanto o más importante que la infestación prenatal in utero (Martínez, 1989). Los hospedadores paraténicos, incluyendo los humanos, se infectan por la ingestión de huevos larvados de T. canis, las larvas evaden los alvéolos del pulmón y migran a diversos órganos como hígado, otras partes de pulmón, cerebro y ojo, donde permanecen en estado de latencia por largos periodos (Carvalho and Rocha, 2011; Cypess, et al., 1977; Olsen, 1974; Soulsby 1983). 12 Figura 5. Ciclo biológico de Toxocara canis (Dumenigo, et al., 1993). 13 2. Epidemiología de la Toxocariosis La toxocariosis causada por T. canis es una de las principales enfermedades parasitarias de los perros. Su distribución geográfica es mundial, por su gran incidencia y patogenicidad en el humano es un importante problema de salud pública (Glickman 1986; Magnaval et al., 2001; Schantz and Glickman, 1978; Soulsby, 1983; Uspenskii et al., 2011). Estudios realizados en México y en otros lugares del mundo demuestran la alta incidencia de esta parasitosis. Estos estudios dejan claro que son mucho más afectados por gusanos adultos los cachorros menores de seis meses que los perros adultos (Alba-Hurtado, 1999). Una causa de la alta incidencia de esta parasitosis es el alto poder biótico que presentan estos parásitos, ya que las hembras depositan hasta 200,000 huevos diarios (Mahmoud and Warren, 1977; Shrand, 1964). Los huevos son altamente resistentes a las condiciones medio ambientales y son la fuente de infestación para perros, humanos y otros hospederos paraténicos (Soulsby, 1983). La infestación por Toxocara se presenta en casi todas las crías de perros y gatos. Estos animales, que a menudoviven en los hogares en los que hay niños, expulsan a diario y durante muchos meses cantidades enormes de huevos en las heces, aunque estas heces se pueden desintegrar en un lapso corto, los huevos que contienen se acumulan en el entorno. Cuando están protegidos de la luz solar directa y la desecación, los huevos se desarrollan hasta alcanzar la fase infectante en unas tres semanas y persisten viables en el suelo muchos meses. De este modo el suelo de las zonas en las que defecan los perros y gatos con toxocariosis se considera una fuente de infección constante. Además, debido a la acción de las lluvias es posible que los huevos se transporten a lugares distantes y alcancen grandes 14 concentraciones en algunos puntos. Unos miligramos de tierra recogida de la superficie de estos sitios pueden contener centenares de huevos infectantes, lo que hace posible que un niño que se lleve tierra a la boca ingiera miles de estos huevos y que niños mayores o adultos adquieran infecciones ligeras, al ingerir cantidades imperceptibles de material altamente contaminado. El examen de suelo en parques y campos de juego de distintas ciudades ha demostrado la presencia de huevos infectantes de T. canis, que constituyen una fuente de infección en niños y contribuyen a elevados índices de parasitosis en perros y gatos, así como de otros hospedadores. No solamente los huevos eliminados en las heces y en el suelo contaminado representan un riesgo potencial, sino también los huevos que se encuentran adheridos al pelo de los perros (Roddie et al., 2008; Wolfe and Wright, 2003). Esta fuente de infección no debe ser subestimada ya que actualmente algunas mascotas comparten hogar y camas con sus dueños. 2a. Prevalencia de T. canis La prevalencia de T. canis en perros es muy alta, esto es debido a la eficiencia de la transmisión prenatal, la mayoría de los cachorros se recién nacidos se encuentran infectados con este parásito (Maizels, et al., 2006). Muchos estudios demuestran que la prevalencia en perros es del 2.8% hasta más del 80%. Estos resultados dependen de la procedencia de los animales y de los procedimientos de diagnóstico (Cordero y col., 1999; Daryani et al., 2009; Fontanarrosa et al., 2006; Marron et al., 1978; Vélez-Hernández et al., 2009; Quiroz 1984; Torres-Chablé; 2015).Q 15 2b. Seroprevalencia de T. canis La alta seroprevalencia en humanos en diferentes lugares del mundo varia de un 1.6 a un 92.8%. Lo anterior muestra el alto grado de infección por esta parasitosis, sin embargo la mayoría de los casos no se presentan signos clínicas y estos sólo aparecen cuando las larvas se localizan en lugares críticos como cerebro u ojos o cuando se ingieren grandes cantidades de huevos (Alba-Hurtado, 1999; Espinoza et al., 2003; Fernández et al., 2009; Ghadirian et al., 1976; Khalil et al., 1977; Muñoz-Guzmán et al., 2010; Rojekittikhun et al., 2014); Sardarian et al., 2015); Smith et al., 2006; Taylor; 2001). Gestación en las perras Las perras son monoéstricas estacionales, ovulan una o dos veces por año en intervalos de 5 a 12 meses, dependiendo de la raza. Presentan un anestro de 3 a 10 meses y un proestro de 3 a 21 días. El estro es la etapa receptiva de la hembra y dura de 3 a 21 días con un promedio de una semana. Durante la ovulación se liberan ovocitos primarios que maduran después de 1 o más días en el oviducto. La fase lútea de la hembra no gestante tiene una duración de 9 semanas similar a la de las hembras en gestación. La gestación tiene una duración de 57 a 68 días y es dependiente de la secreción de la P4 ovárica, de la hormona luteinizante (LH) y de la prolactina para el soporte luteotrópico (Concannon, 1986). El papel de la hipófisis en el mantenimiento de la gestación no se encuentra bien definido en los caninos. Las concentraciones circulantes de LH permanecen bajas durante la segunda mitad del estro y la primera mitad de la gestación. Se considera que la LH y la 16 PRL son importantes hormonas luteotróficas debido a que la preñez puede terminarse en cualquier momento mediante la hipofisectomía. Las concentraciones de la hormona folículo estimulante (FSH) se incrementan durante la segunda mitad de la gestación. Aspectos hormonales en la infección El papel que juegan las hormonas en la infección y desarrollo de T. canis es uno de los aspectos más interesantes de la relación huésped-parásito. Como se mencionó anteriormente, cuando un perro mayor de tres meses ingiere huevos larvados de T. canis, las larvas se enquistan en sus tejidos y sólo se reactivan en perras gestantes. Fisiológicamente, uno de los eventos más importantes durante la gestación son las variaciones hormonales (Figura 6). Las hormonas podrían tener un efecto directo sobre las larvas o un efecto indirecto sobre el ambiente dentro del huésped donde se encuentran enquistadas. 3. Hormonas de la gestación en perras 3a. Progesterona (P4) La P4 es una hormona esteroidal, que juega un papel central en aspectos reproductivos asociados con el establecimiento y mantenimiento de la gestación. Esta hormona en perras es principalmente producida por los cuerpos lúteos en el ovario, por lo que son esenciales durante la preñez. La P4 promueve la diferenciación del endometrio y la secreción glandular endometrial mantiene la integridad del endometrio y su unión con la placenta. También inhibe las contracciones uterinas (Salehnia and Zavareh 2013). Varios 17 de los efectos que tiene están regulados por receptores intracelulares (Camacho-Arroyo and Rodríguez-Dorantes 2006; Scarpin et al., 2009). La P4 tiene diversas funciones fisiológicas en el sistema nervioso periférico y central, así como en diversos órganos blanco, relacionadas con el metabolismo, desarrollo y reproducción de la hembra (Pluchino et al., 2006). En la glándula mamaria, induce el desarrollo alveolar preparando la glándula para la lactancia. También participa en procesos de regulación de la excitabilidad neuronal, la memoria y el aprendizaje, la proliferación de diferentes tumores y la neuroprotección, participa en la respuesta inmunológica y la ventilación pulmonar (Cabrera-Muñoz et al., 2011; Hernández Ruiz et al., 2011). Además de tener efectos anestésicos (Selye 1941). En hueso regula la masa ósea y previene su pérdida (Canalis and Raisz, 1978). Los efectos fisiológicos de la P4 están mediados con proteínas específicas llamadas receptor para progesterona (P-R), por sus siglas en inglés (Malley et al., 1970), el cual se encuentra localizado en el citoplasma y en el núcleo (Camacho-Arroyo et al., 2006). 3b. Receptores de P4 Los P-R’s son miembros de una familia de transcripción activados por su ligando, que incluye receptores para hormonas tiroideas, hormonas esteroides, ácido retinoico y receptores huérfanos cuyo ligando endógeno no se ha identificado (Levy et al., 1980). El P-R tiene un dominio regulatorio N-terminal, un dominio de unión al ADN, una sección de articulación, y un ligando dominio de unión C-terminal. Una función activadora de la transcripción (TAF) especial, llamada TAF-3, está presente en el receptor de progesterona- 18 B, en un B-segmento aguas arriba en el terminal amino ácido. Este segmento no está presente en el receptor-A (Gadkar-Sable, et al., 2005). El P-R existe como dos proteínas isofórmicas denominadas A (94 kDa) y B (116 kDa) (Figura 6). Ambas isoformas se expresan de un solo gen en roedores y humanos como resultado de la transcripción de dos promotores alternativos y del inicio de la traducción en dos codones AUG diferentes (O’Malley et al., 1970, Misrahi et al., 1993; Kastner et al., 1990). En la figura 6 los números indican la posición del aminoácido en cada proteína. AF-1, AF-2 y AF-3 dominios de activación; LBD sitio de unión al ligando; DBD dominiode unión al DNA; ID dominio inhibitorio; DIM sin las secuencias importantes para la dimerización del receptor. Existe, además de las isoformas A y B; una isoforma C (60 kDa) que tiene un truncamiento N-terminal aún más grande que interrumpe el dominio de unión al DNA (DBD). Por lo tanto, sólo el PR-A y el PR-B contienen los componentes críticos para la función del receptor nuclear, incluyendo el dominio de unión al ligando, de la región bisagra (H), el dominio de unión al ADN y dos de los tres dominios de activación (Hagan et al., 2009). Aunque el PR-C no es un factor de transcripción funcional, actúa inhibiendo la transactivación en el útero del PR-B (Wei et al., 1997) o potencia los efectos Figura 6. Organización-estructural de las isoformas del receptor nuclear a progesterona en humanos (A y B). (Modificado de Mulac-Jericevic et al., 2004) 19 transcripcionales de las otras isoformas de P-R en la glándula mamaria (Condon et al., 2006). 3c. Receptores membranales a P4 (mPRS) Durante varias décadas se ha estudiado la existencia de acciones no genómicas que inician en la membrana celular por hormonas esteroides, como la P4. Esta hormona ejerce algunos de sus efectos mediante dos proteínas recientemente identificadas: los receptores membranales a progesterona (mPRs) y los componentes del receptor membranal a progesterona (PGMRC). Estos receptores han sido identificados en teleósteos, oveja, cerdo, ratón, rata y humano (Dosiou et al., 2008, Thomas et al., 2007; Tokumoto et al., 2006; Zhu et al., 2003). En el humano los mPRs comprenden cinco subtipos: α, β, γ, σ y ε. El mPRαs en el ser humano predomina en tejidos reproductivos, particularmente en placenta, testículos y ovarios, el mPRβs en tejidos neuronales (cerebro y médula espinal) en riñon y tractogastrointestinal. Este patrón de expresión coincide con el que se presenta en otros organismos en los que se han caracterizado estos receptores (Zhu et al., 2003). En cuanto a la expresión de mPRε y σ se expresan en diferentes (Pang et al., 2012) regiones del cerebro humano. En mamíferos, los mPR’s se han relacionado con la regulación de procesos reproductivos, comunicación neuroendocrina, regulación del sistema inmune y procesos patológicos como el cáncer. 4. Prolactina (PRL) La PRL es una hormona poli peptídica (23 kDa) sintetizada y secretada principalmente por células especializadas de la hipófisis, denominadas lactotropos. En 20 menor cantidad se produce en cerebro, endometrio, placenta y sistema inmune. La PRL está relacionada a la hormona del crecimiento y el lactógeno placentario, forman parte de una familia de hormonas que comparten características relacionadas con su estructura, propiedades funcionales y origen genético. Actualmente se conocen más de 300 diferentes funciones de la PRL, las cuales se agrupan en cinco categorías: 1) reproducción, 2) inmunoregulación, 3) osmoregulación, 4) desarrollo y crecimiento y 5) metabolismo de carbohidratos y lípidos. Sus principales funciones son reproducción, crecimiento y la osmoregulación, aunque en los últimos años se ha demostrado que actúa como inmunomodulador ejerciendo un efecto importante en la respuesta de células T y B tanto in vivo como in vitro (Blanco et al., 1999; Bridges, 1990; Freeman et al., 2000; Méndez et al., 2005). Algunos de los efectos biológicos de esta hormona se muestran en el (Cuadro 1). Esta hormona ejerce su efecto biológico a través de su interacción con receptores específicos de membrana que se encuentran ampliamente distribuidos en el organismo. Durante la gestación tiene efecto mamotrópico (crecimiento y desarrollo de la glándula mamaria), en el posparto tiene un efecto lactogénico (síntesis láctea) y galactopoyético (secreción láctea). La PRL suprime la secreción de la hormona luteinizante y la hormona folículo estimulante inhibiendo la ovulación y es el principal soporte para la permanencia del cuerpo lúteo (Onclin and Verstegen 1996). 4a. Receptor de prolactina El receptor de PRL (PRL-R) es una proteína transmembranal que pertenece a la superfamilia de receptores de citocinas tipo I y está distribuido en distintos tejidos y 21 células del sistema inmune como células NK, macrófagos, monocitos, linfocitos T y B, neutrófilos (Bernichtein et al., 2010; Bouchard et al., 1999). Órgano blanco Efectos Referencias Glándula mamaria Regula el desarrollo y crecimiento celular, aumenta la síntesis de proteínas y carbohidratos de la leche, regula el tránsito de IgA a través del epitelio celular. Naylor et al., 2003 Gónadas Regula acciones luteotrópicas y luteolíticas, inhibe la esteroidogénesis, estimula síntesis de receptores para gonadotropinas. Ben-Jonathan et al., 1996. Páncreas, hígado, riñón y sistema inmunológico. Estimula el desarrollo y crecimiento celular. Bole-Feysot et al., 1998 Blanco-Favela et al., 2012 Hipotálamo Disminuye la secreción de GnRH y estimula el recambio de dopamina. Goffin and Kelly 1997 Páncreas Estimula la proliferación, aumenta la actividad de las células β para la producción de insulina. Martín-Pérez, 2010 Ben-Jonathan et al., 1996 Riñón, placenta e intestino Regula el equilibrio hídrico. Martín-Pérez, 2010. Cuadro 1. Efectos biológicos de la prolactina en diferentes órganos. En el humano su gen se encuentra en el cromosoma 5 y codifica para tres diferentes isoformas, una corta, intermedia y larga (Figura 7). En el ratón el gen del PRL-R se localiza en el cromosoma 15 y se conocen 4 isoformas, una larga y 3 cortas (Figura 7). Estas isoformas cuentan con un dominio extracelular y transmembranal idéntico, mientras que el 22 dominio intracelular presenta diferentes tamaños y composiciones, dependiendo de la isoforma del receptor. Las isoformas corta y larga del receptor se expresan de manera diferencial en distintos tejidos, lo que sugiere efectos y activación de rutas de señalización diferentes (Clevenger et al., 1998; Binart et al., 2010). Figura 7. Receptor de prolactina e isoformas. A. Isoformas largas y cortas descritas en ratón. B. Isoformas: la larga, intermedia y corta descritas en humano (Blanco et al., 2012; Freeman et al., 2000). 23 5. Estrógenos Los estrógenos son hormonas sexuales esteroidales, producidas por ovarios, placenta y en menor cantidad por glándulas adrenales y testículos. Los efectos del estradiol inducen proliferación celular, principalmente en endometrio, mama y ovario. Los estrógenos participan en la proliferación y crecimiento celular, en el mantenimiento de las características sexuales secundarias, promueven el desarrollo mamario, en el control de los ciclos estrales-ovulación, durante el embarazo, y colaboran con la relajación del cérvix (Fritsch, et al., 1991; (Concannon and Verstegen, 2005). Además los estrógenos participan en el metabolismo de las lipoproteínas, en el proceso de hemostasis, inducen la liberación de factores relajantes en las células endoteliales y modifican la reactividad de las células de músculo liso en los vasos sanguíneos (Franco et al., 2003). 5a. Receptores de estrógenos clásicos Los efectos inducidos por la presencia de estrógenos están determinados por dos tipos de receptores nucleares, los receptores de estrógenos (ER por sus siglas en inglés) alfa y beta (ERα 595 aa; PM 66-70 kDa y ERβ 530 aa; PM 53-59 kDa) los cuales actúan como factores de transcripción activados por el ligando (Kenny et al., 2008). El receptor de estrógenos alfa forma parte del grupo de receptores a esteroides, éstos se caracterizan por compartir una estructura modular (Fig. 8), conformado por seis dominios los cuales están denotados de la letra A a la letra F. Las regiones A/B están involucradas en las interacciones proteína-proteína. El dominio C participa en la dimerización del receptor y en 24 launión de secuencias específicas de DNA, y el dominio D/E/F o de unión al ligando. (Nilsson, 2001; Ascenzi et al., 2006). 5b. Receptor de estrógenos acoplado a proteínas G (GPR/GPER) Recientemente se identificó un receptor membranal que cuenta con la capacidad de traducir señales rápidas dependientes de estrógenos (Revankar et al., 2005). Este receptor tiene una homología promedio del 26.6% con otros receptores de la familia GPCR, principalmente con los siete dominios transmembranales. Cuenta con sitios potenciales de N-glicosilación localizados en la región amino terminal extracelular, además contiene 11 residuos de cisteína (Carmeci et al., 1997). Este receptor fue nombrado GPR30 y recientemente denominado GPER por sus siglas en inglés (G protein-coupled estrogen receptor) por el International Union of Pharmacology (Alexander et al., 2008). El GPER es una proteína de 375 aminoácidos, traducida por el gen localizado entre las bandas 21 y 22 del cromosoma 7 humano. La expresión del GPER se ha localizado en la membrana celular principalmente en membranas del retículo endoplásmico (Wang et al., 2014). Figura 8. Diagrama que representa la estructura de dominios del receptor a estrógenos alfa. (Modificado de Nilsson 2001). 25 Eventos hormonales en la gestación de la perra La concentración sérica de la P4 (Fig. 9) en el proestro de la perra es baja (0.3-1 ng/mL), durante la ovulación aumenta por encima de 1 ng/mL y continúa aumentando durante los siguientes 15 a 20 días (15-90 ng/mL). Por lo general, después de que la concentración llega a su pico mayor, mantiene una meseta durante 15 a 20 días antes de declinar durante el resto de la gestación. Durante el último tercio de la gestación los niveles disminuyen a concentraciones de 4-16 ng/mL y se mantienen durante 1 o 2 semanas, finalmente de 36 a 48 horas antes del parto los niveles disminuyen a <2 ng/mL (Concannon et al., 1978; Concannon, 2009). En las perras, la concentración sanguínea de la PRL (Figura 9) es baja durante el proceso de proestro y estro (<2 ng/mL), aumenta hacia el día 40 de la gestación (35-40 Figura 9. Eventos fisiológicos en la gestación de la perra. Modificada de Concannon, P.W. 2009 y Romagnoli; 2006 26 ng/mL) y alcanza su pico mayor 1 o 2 días antes del parto (100-120 ng/mL). Este incremento específico de la gestación probablemente sea de origen pituitario, pero existe la posibilidad de que haya una secreción placentaria o uterina de una proteína similar a la PRL. El incremento de las concentraciones de PRL durante la segunda mitad de la gestación coincide con una disminución de la concentración sanguínea de la P4. Después del parto, las concentraciones de PRL disminuyen (1 a 2 días) y posteriormente aumentan en respuesta a la succión de los cachorros (Concannon, 2009; Kooistra and Okkens 2001, 2002; Tsutsui et al., 2007). En las hembras caninas, durante el anestro las concentraciones séricas de estradiol (Figura 9) se mantienen bajas (2-10 pg/mL), en el proestro los niveles se incrementan (50- 100 pg/mL) y durante el pico de LH (ovulación) disminuyen (10-20 pg/mL), posteriormente durante el estro las concentraciones bajan a las mismas concentraciones del anestro (2-10 pg/mL). Estos niveles se mantienen durante la gestación. Previo al parto, las concentraciones séricas se incrementan (20-30 pg/mL) y después del parto los niveles disminuyen a 5-10 pg/mL (Concannon, et al., 1988, Concannon, 2009 y Concannon 2011). 27 JUSTIFICACIÓN Se ha demostrado que algunos eventos neuroinmunoendócrinos del hospedero tienen efecto directo sobre el desarrollo y fisiología de algunos parásitos. En perras adultas las larvas de T. canis se enquistan en sus tejidos y se reactivan durante la segunda mitad de la gestación. Las larvas reactivadas se transmiten por vía transplacentaria al feto o por vía lactogénica a los cachorros recién nacidos (Fülleborn, 1921; Koutz et al., 1966). La reactivación ocurre principalmente en perras gestantes, por lo que los eventos fisiológicos que se presentan en esta etapa se han asociado a la reactivación larvaria. Algunos de los eventos más importantes son las variaciones hormonales, por lo que éstas, se han asociado a la reactivación de las larvas. En el último tercio de la gestación, las hormonas con mayor variación en sus niveles séricos son la PRL, la P4 y los estrógenos. Aunque se ha hipotetizado que la reactivación larvaria está influenciada por dichos cambios hormonales, no se conocen algunos de los efectos biológicos asociados a la exposición del parásito (en diferentes estadios) a las hormonas ni que estas tengan un efecto directo sobre su desarrollo. Por lo anterior, en este trabajo se evaluó el efecto, in vitro, de la PRL, P4 y 17β- E sobre el crecimiento y motilidad de las larvas, así como la expresión y localización de receptores para estas hormonas en larvas de T. canis. 28 HIPÓTESIS Las larvas de T. canis presentan receptores para PRL, P4 y estrógenos y la adición de estas hormonas in vitro, tiene un efecto directo sobre su desarrollo y motilidad. OBJETIVOS Determinar el efecto de la exposición de diferentes concentraciones de PRL, P4 y 17β-E a cultivos de larvas de T. canis, sobre el crecimiento, motilidad y viabilidad larvaria. Detectar y cuantificar, por medio de Citometría de Flujo, la presencia de receptores para PRL, P4 y 17β-E en larvas de T. canis. Determinar, a través de Inmunohistoquímica, la localización de receptores de PRL, P4 y 17β-E en larvas de T. canis. Amplificar y secuenciar un fragmento del gen que codifica para los receptores de PRL y P4 en larvas de T. canis. 29 MATERIAL Y MÉTODOS Obtención y cultivo de huevos de T. canis Se realizaron necropsias a cachorros sacrificados en el antirrábico de Ecatepec, Edo. de México. El intestino delgado de éstos se incidió y se recolectaron gusanos adultos de T. canis. Los gusanos obtenidos se depositaron en un recipiente limpio y se lavaron varias veces con agua. La obtención y cultivo de los huevos se realizó modificando el método de Oshima (1961b). Se realizó una incisión en el tercio superior de las hembras de T. canis para obtener los úteros y posteriormente estos fueron incididos para obtener los huevos. Los restos del parásito fueron eliminados con un colador fino, los huevos fueron lavados y resuspendidos en una solución de formol al 1% y se incubaron en cajas de Petri estériles a una temperatura de 28°C durante 15 días. La embrionación de los huevos fue monitoreada a partir de los 10 días. Obtención de larvas de T. canis Se realizó siguiendo el método desarrollado por De Savigny (1975) y modificado por Muñoz-Guzmán (2010). Transcurridos 15 días de incubación, los huevos se observaron al microscopio para verificar el desarrollo de la larva L2 pasiva que es la fase infectante. Posteriormente, se realizaron tres lavados por centrifugación y resuspensión en PBS (pH 7). El promedio del número de huevos infectantes por mL fue estimado como lo describe Oshima (1961b). Los huevos larvados fueron lavados en una solución de 30 hipoclorito de sodio al 1%, dentro de una campana de flujo laminar, se realizaron cuatro lavados asépticos con medio de cultivo estéril RPMI-1640 buferado con HEPES a un pH de 7.2 con 100 U/µg/mL de Penicilina y Estreptomicina, 2.5 µg/mL de Anfotericina B y glucosa al 1% (Maizels, et al., 1984; Maizels et al., 1987). Posteriormente, los huevos larvados se sometieron a agitación por medio de un agitador magnético durante 10 minutos para producir su eclosión. De la suspensión resultante se separaron las larvas viables de segundo estadio por un método modificado de migración larvaria de Baermann (Bowman et al., 1987). Después de 24horas de incubación a 37ºC en estufa de CO2, se colectaron del fondo del tubo de ensayo las larvas viables. Las larvas recolectadas y resuspendidas en medio de cultivo RPM1-1640 fueron colocadas en cajas de cultivo y se incubaron a 37ºC con 5% de CO2 y 95% de humedad (Bowman et al., 1987). Diseño experimental Estimulación de las larvas Las larvas recolectadas de los aparatos de Baermann se lavaron, por sextuplicado se colocaron 10,000 larvas en 5 mL de medio (RPMI-1640 con las hormonas a evaluar) en cada pozo de placas de cultivo celular (Nunclon Delta SI Multidish 6 wells, Nunc). Las placas se incubaron a 37°C con 5% de CO2 durante 20 días. Las concentraciones de P4 (Sigma, No. Catalogo P7556) en los medios de cultivo, fueron 0 (testigo negativo), 20, 40, 80, 400 y 800 ng/mL de medio; las de 17 β-estradiol (17 β-E) (Sigma, No. Catalogo E4389) fueron 0 (testigo negativo), 2, 10, 45, 120 y 1200 pg/mL de medio y de PRL (Sigma, No. Catalogo SRP4688) de 0 (testigo negativo), 2, 20, 40 y 400 ng/mL de medio. Las larvas se mantuvieron en placas de 6 pozos durante 20 31 días, cada 48 horas se cambió el medio de cultivo adicionado con hormonas recién diluidas. En los días 0, 5, 10 15 y 20 se evaluó al microscopio la viabilidad, motilidad, ancho, longitud de las larvas estimuladas hormonalmente. Medición de larvas Los días 0, 5, 10, 15 y 20 de cultivo, se obtuvieron 100 µl de medio con larvas de cada pozo y se mezclaron con 100 μl de lugol (Hycel) durante 20 minutos (Fig. 10). Posteriormente, se midió la longitud de 30 larvas de cada pozo (180 larvas por concentración/día). Ciento ochenta larvas obtenidas el día cero se procesaron de la misma forma y se midieron. La medición del tamaño se realizó con un microscopio óptico Olimpus BX43, en objetivo de 10x, utilizando un software de procesamiento de imágenes (Image Premiere Plus). A la longitud de cada día experimental de medición le fue sustraída la longitud inicial correspondiente (día 0), el resultado de esta diferencia fue expresado como el aumento de tamaño de la larva en micrómetros (μm). Figura 10. Medición de una larva de Toxocara canis teñida con lugol. 32 Para medir el ancho de las larvas estimuladas se obtuvieron 100 µl de medio con larvas de cada pozo los días 0, 5, 10, 15 y 20 de cultivo, se centrifugaron a 280g, se eliminó el sobrenadante y las larvas sedimentadas se mezclaron con 100 μl de alcohol acido 96º (ácido clorhídrico al 38%). Transcurridas 24 horas, se centrifugaron a 280g y se eliminó el sobrenadante, posteriormente se adicionaron 100 μl de colorante hemalumbre de Mayer (De la Torre, 1975) durante 48 horas. Finalmente se fotografiaron y se midió a la altura del anillo nervioso el ancho de 20 larvas (Fig. 11) por concentración/día. A la longitud de cada día experimental de medición le fue sustraída la longitud inicial correspondiente (día 0), el resultado de esta diferencia fue expresado como el incremento del ancho de la larva en micrómetros. Estas larvas fotografiadas también fueron evaluadas para determinar sus características morfológicas. Figura 11. Larva de Toxocara canis teñida con Hemalumbre de Mayer. 33 La medición de ancho de las larvas se realizó con un microscopio óptico Olimpus BX43, utilizando un software para procesamiento de imágenes (Image-Pro Plus). A la medición del ancho de cada día experimental le fue sustraída la medición del ancho inicial correspondiente (día 0), el resultado de esta diferencia fue expresado como el aumento del ancho de la larva en micrómetros. Determinación de la viabilidad y motilidad El porcentaje de viabilidad se calculó observando 100 larvas por concentración/día en un microscopio óptico Olimpus BX43. Se consideraron larvas vivas, las móviles o aquellas que estando inmóviles conservaban sus estructuras internas sin modificaciones observables (Fig. 12). Se consideraron larvas muertas aquellas inmóviles, con granularidad en su interior o con sus estructuras internas modificadas. Figura 12. Larva de Toxocara canis A) Larva viable, B) Larva muerta. 34 En un microscopio invertido se videograbó directamente de las placas de cultivo el movimiento de treinta larvas de cada concentración/día y la motilidad se evaluó siguiendo los criterios de Kiuchi et al., (1987). Las larvas que movían todo el cuerpo se les asignó un valor de 3, las que tenían movimiento sólo en una parte del cuerpo se les asignó un valor de 2 y las que estaban vivas pero sin movimiento se les asigno un valor de 1. Citometría de flujo de los receptores para PRL, P4 Y 17β-E en larvas de T. canis La citometría de flujo se realizó por triplicado siguiendo la técnica descrita por Nava- Castro et al., (2011). Aproximadamente 2,000 larvas recién eclosionadas o cultivadas durante 10 días en presencia de las diferentes concentraciones de hormonas utilizadas, fueron disgregadas completamente con un micropistilo (Eppendorf, USA). Se fijaron 2 x 10 6 células de larvas en una solución de 2% de para formaldehído en PBS a pH 7.4 por 10 min a 37°C, se permeabilizaron con metanol al 100% por 30 min a 4°C y se lavaron con buffer de FACS (PBS pH 7.4, 2% Suero Fetal Bovino, 0.02% azida sódica). La tinción intracelular se realizó con los siguientes anticuerpos: anti-PR, anti-PRL-R y anti-ERα (Santa Cruz, Biotechnology, USA) por 10 min a 4°C. Como anticuerpos secundarios se utilizaron un anti-IgG de ratón (eBioscience, USA) y anti-IgG de conejo (Molecular, Probes®, USA) acoplados con APC y Alexa 647 respectivamente, incubándose por 10 min a 4°C. Las células se lavaron con buffer de FACS y se mantuvieron hasta su análisis protegidas de la luz. Como control de calibración se utilizaron células de útero de ratón tratadas de la misma manera que las células de T. canis. 35 Todas las muestras fueron analizadas utilizando un equipo FACS Calibur (BD, Biosciences, USA) y los datos fueron analizados con el software FlowJo®. Inmunolocalización de PRL-R y P-R en larvas de T. canis La localización de PRL-R, P-R y ERα en las larvas fue determinada por inmunofluorescencia modificando el método descrito por Ibarra-Coronado et al. (2011). Larvas estimuladas con 40 ng/mL de PRL, 80 ng/mL de P4 y 120 pg/mL de 17β-E durante 10 días, fueron lavadas con PBS a pH 7.4 y se fijaron con paraformaldheído al 4%. Se mantuvieron durante toda la noche en una solución de sacarosa al 30% a 4 º C. Se lavaron con PBS, se mantuvieron en Tritón 100 al 1% por 60 min a 4 º C y se bloquearon toda la noche con albumina 1% en PBS a 4 º C. Las larvas estimuladas con las diferentes hormonas fueron incubadas a 4 º C con los anticuerpos primarios utilizados en la citometría de flujo a una concentración de 1:100. Posteriormente, se incubaron con los mismos anticuerpos secundarios utilizados en la citometría de flujo a una concentración de 1:300. Como control negativo se utilizaron larvas incubadas sólo en presencia del anticuerpo secundario utilizado a la misma dilución. Finalmente, las larvas fueron colocadas en medio de montaje (DAKO) y examinadas en un microscopio confocal Zeiss LSM5 Pascal, las imágenes fueron construidas usando el software Zeiss LSM Imagen Browser. 36 Amplificación de DNAg de larvas de T. canis que codifica para los PRL-R y P-R La amplificación de los genes de los receptores de las hormonas PRL y P4 se efectuó mediante un ensayo de PCR, utilizando oligonucleótidos específicos y el DNA genómico (DNAg) de larvas de T. canis. Diseño de primers Se diseñaron primers para un fragmento del gen que codifica para PRL-R y P-R basados en las regiones más conservadas de genes del perro (NC006586.3), gato (XM003981463), borrego (AF041257), cabra (EU662222.1) y bovino (NM001039726.1) previamente reportadosen el GeneBank para los receptores de estas hormonas. Los primers fueron diseñados utilizando el software Primer3 (Rozen and Skaletsky, 1999). Obtención del DNAg de larvas de T. canis El aislamiento del DNAg a partir de larvas de T. canis y útero de perra, fue realizado utilizando el Kit Wizard® Genomic DNA Purification y siguiendo el protocolo de Borecka et al., (2008). La concentración y pureza de DNAg fue cuantificada por medio de un nanoespectofotómetro (ND-1000, Nanodrop®). 37 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) La amplificación del gen del PRL-R fue a partir del DNAg (240 ng/μl) de larvas de T. canis modificando el método descrito por Jacobs et al., (1997). La reacción de PCR (25 µl) se desarrolló con: 3mM de MgCl2; primer sentido 1 mM; primer antisentido 1 mM; 400 µM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP; 0.625U Taq polimerasa (PCR Master Mix, Promega) y agua libre de nucleasas. Las condiciones de la PCR para el PRL-R fueron: un paso inicial de desnaturalización a 95 º C por 120 s, 35 ciclos de amplificación [95 º C por 30 s (desnaturalización), 48.2 º C por 30s (alineamiento) y 72 º C por 30 s (extensión)] y un paso final de extensión a 72 º C por 5 min en un termociclador (Gene Amp PCR System 2700). Para la amplificación del P-R, se utilizaron 240 ng/µl de DNAg de larvas de T. canis. La amplificación de la región P-R se realizó de igual forma que la descrita anteriormente, solamente con las siguientes condiciones en el ciclo: un paso inicial de desnaturalización a 95 º C por 120 s, 30 ciclos de amplificación [95 º C por 30 s (desnaturalización), 48.2 º C por 30 (alineamiento) y 72 º C por 30 s (extensión)] y un paso final de extensión a 72 º C por 5 min. En cada prueba de PCR se utilizó un control negativo de la PCR y como control positivo DNAg de útero de perra. Los amplicones obtenidos de la PCR fueron separados en geles de agarosa al 2% por 30 minutos y teñidos con GELRED® (Biotium Labs), visualizados con un transiluminador de UV y fotografiados para su estudio. El tamaño del amplicón se determinó comparándolo contra marcadores de referencia (100 pb DNA Ladder, PROMEGA). 38 Secuenciación de los amplicones El amplicón del tamaño esperado del fragmento del gen de PRL-R, fue cortado y purificado con un kit comercial (Favor Prep Gel Purification Mini Kit de FAVORGEN® Biotech Corp) siguiendo las instrucciones del fabricante. El producto purificado fue secuenciado por el método Sanger usando un secuenciador modelo 3130x1 (Genetic analyzer de 16 capilares) en la unidad de Biotecnología y Prototipos de la FES-Iztacala, UNAM. La secuenciación se realizó para ambas cadenas del DNA. Análisis estadístico El análisis de los resultados del aumento de la longitud de la larva, incremento del ancho de la larva, motilidad, porcentaje de células positivas e intensidad de fluorescencia, se realizó por un ANOVA de una sola vía. Las diferencias entre medias fueron determinadas por la prueba de Fisher (software STATISTICA 7.0 para Windows). 39 RESULTADOS Tamaño, diámetro y motilidad de la larva La figura 13 muestra la secuencia de formación del embrión. Se observan las fases embrionarias del huevo de T. canis. A) Cigoto B) primera división C) dos Blastómeros, D) cuatro Blastómeros, E) Mórula, F) Blástula y G) Larva completa. En la figura 14 se presenta el aumento de larvas de T. canis estimuladas con PRL durante diferentes periodos. Las larvas estimuladas durante 5 días presentaron un aumento de tamaño dosis dependiente, las larvas estimuladas con 20 o más ng/mL de PRL tuvieron un mayor aumento de tamaño (p<0.05) que las no estimuladas. El mayor aumento de tamaño se observó a 400 ng/mL de PRL (figura 14A). Las larvas estimuladas a los 10 y 15 días con todas las concentraciones de PRL utilizadas, presentaron mayor aumento de tamaño (p<0.05) que las no estimuladas. No se observaron diferencias entre los grupos tratados a los días 10 y 15 (figuras 14B y 14C). El día 20 no se observaron diferencias (p>0.05) entre ninguno de los grupos cultivados en presencia o ausencia de PRL (14D). En la figura 15 se observa el aumento de tamaño de larvas de T. canis estimuladas con P4 durante diferentes periodos. Las larvas estimuladas durante todos los días del experimento y con todas las concentraciones de P4 utilizadas, presentaron mayor aumento de tamaño (p<0.05) que las no estimuladas. No se observaron diferencias (p>0.05) entre los grupos de larvas tratadas durante 5 días con las diferentes dosis de P4 (Fig. 15A). Las larvas cultivadas en presencia de 40 y 80 ng/mL de P4 durante 10 días presentaron mayor aumento de tamaño que las cultivadas con otras dosis de P4 (Fig. 15B). Las larvas estimuladas durante 15 días con todas las concentraciones de P4 utilizadas, presentaron un mayor aumento de tamaño (p<0.05) que las no estimuladas, el mayor aumento de tamaño 40 se presentó a los 80 ng/mL (figura 15C). Las larvas cultivadas en presencia de 40 y 80 ng de P4 por mL de medio durante 20 días presentaron mayor tamaño que las cultivadas con otras dosis de P4 (figura 15D). En la figura 16 se presenta el aumento de tamaño de larvas de T. canis estimuladas con 17β-E durante diferentes periodos. En general, las larvas estimuladas durante todos los días del experimento y con la mayoría de las concentraciones de 17β-E utilizadas, presentaron mayor aumento de tamaño (p<0.05) que las no estimuladas. No se observaron diferencias (p>0.05) entre los grupos de larvas tratadas durante 5 y 20 días con las diferentes dosis de 17β-E (figuras 16 A y D). Las larvas cultivadas en presencia de 1200 pg de 17β-E por mL de medio durante 10 días presentaron mayor tamaño (p<0.05) que las cultivadas con otras dosis de 17β-E (figura 16B). Las larvas cultivadas en presencia de 45 y 1200 pg de 17β-E por mL de medio durante 15 días presentaron mayor tamaño (p<0.05) que las cultivadas con otras dosis de 17β-E (figura C). No se observaron diferencias morfológicas aparentes entre las larvas cultivadas en presencia de diferentes concentraciones de PRL, P4 y 17β-E. En la figura 17 se muestran ejemplos de larvas de T. canis, cultivadas con diferentes hormonas en RPMI-1640 y teñidas con hemalumbre de Mayer. La figura 18 presenta el incremento del ancho de larvas de T. canis estimuladas con PRL en diferentes periodos. Las larvas estimuladas durante 5 días presentaron un aumento de ancho dosis dependiente, las larvas estimuladas con 20 o más ng/mL de PRL fueron más anchas (p<0.05) que las no estimuladas o las estimuladas con 2 ng/mL. El mayor incremento del ancho de la larva se observó a 400 ng/mL de PRL (figura 18A). 41 Las larvas estimuladas a los 10 días con todas las concentraciones de PRL utilizadas, presentaron incremento mayor en el ancho de la larva (p<0.05) que las no estimuladas, el mayor aumento (p<0.05) se presentó en las larvas del grupo estimulado con 400 ng/mL (figura 18B). El día 15 de estimulación (figura 18C) las larvas tratadas con 20, 40 y 400 ng/mL fueron más anchas que el resto de los grupos (p<0.05). El día 20 las larvas tratadas con 20 y 40 ng/mL fueron más anchas que el resto de los grupos (18D). La figura 19 muestra el incremento del ancho de larvas de T. canis estimuladas con P4 en diferentes periodos. Las larvas estimuladas a los 5 días con 400 ng/mL, presentaron un mayor aumento en el ancho (p<0.05) que las larvas del grupo control y de los grupos estimulados con otras concentraciones. El día 10, 15 y 20 no se observaron diferencias (p>0.05) entre ninguno de los grupos cultivados en presencia o ausencia de P4 (18B, 18C y 18D). La figura 20 presenta el incremento del ancho de larvas de T. canis estimuladas con 17β-E en diferentes periodos. Las larvas estimuladas durante 5 días presentaron un aumento dosis dependiente, las larvas
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